CN102482337A - 吡咯啉-5-羧酸还原酶1的突变蛋白 - Google Patents
吡咯啉-5-羧酸还原酶1的突变蛋白 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102482337A CN102482337A CN2010800226864A CN201080022686A CN102482337A CN 102482337 A CN102482337 A CN 102482337A CN 2010800226864 A CN2010800226864 A CN 2010800226864A CN 201080022686 A CN201080022686 A CN 201080022686A CN 102482337 A CN102482337 A CN 102482337A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pycr1
- mutain
- sequence
- nucleic acid
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/44—Oxidoreductases (1)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0026—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5)
- C12N9/0028—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with NAD or NADP as acceptor (1.5.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y105/00—Oxidoreductases acting on the CH-NH group of donors (1.5)
- C12Y105/01—Oxidoreductases acting on the CH-NH group of donors (1.5) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.5.1)
- C12Y105/01002—Pyrroline-5-carboxylate reductase (1.5.1.2)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
- G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/11—Antisense
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
- C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
- C12N2310/3233—Morpholino-type ring
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
- G01N2333/906—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7)
- G01N2333/9065—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5)
- G01N2333/90655—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with NAD or NADP as acceptor (1.5.1) in general
- G01N2333/90661—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with NAD or NADP as acceptor (1.5.1) in general with a definite EC number (1.5.1.-)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/20—Dermatological disorders
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Oncology (AREA)
Abstract
本发明涉及吡咯啉-5-羧酸还原酶1(PYCR1)的突变蛋白,包含编码这些突变蛋白的核苷酸序列的核酸分子,测定在受试者中患上与PYCR1有关的年龄相关疾病的倾向的方法,鉴定能够修饰PYCR1的表达的化合物的方法,和治疗患有与PYCR1有关的年龄相关疾病的受试者的方法。本发明还涉及基因改造的动物和修饰PYCR1基因在动物中的表达的方法。
Description
发明领域
此申请要求在2009年5月26日申请的美国临时申请号61/180,937的优先权利益,为了所有目的将其内容在此以其整体引入作为参考。本发明涉及吡咯啉-5-羧酸还原酶1(PYCR1)的突变蛋白。本发明也涉及测定在受试者中患上与PYCR1有关的年龄相关疾病的倾向的方法,鉴定能够修饰PYCR1的表达的化合物的方法,和治疗患有与PYCR1有关的年龄相关疾病的受试者的方法。本发明还涉及基因改造的动物和修饰PYCR1基因在动物中的表达的方法。
发明背景
皱皮和骨丢失是与衰老有关的典型特征。在一些单成因疾病中,这些变化的过早发生导致患病个体的早衰样外观。作为临床特征,皱皮或皮肤松弛被用作一些有重叠的综合征性疾病的共同特征,这些疾病包括常染色体显性皮肤松弛(ADCL;MIM 123700)、常染色体隐性I型皮肤松弛(ARCL1;MIM 219100)、常染色体隐性II型皮肤松弛(ARCL2;MIM219200,又称皱皮综合征(WSS;MIM 278250))、De Barsy综合征(DBS;MIM 219150)和骨发育异常性老年状皮肤(GO,MIM 231070)。在这些情况下由于广泛的临床重叠经常难以诊断。
发明概述
在第一个方面,本发明提供了PYCR1的突变蛋白,其中在如Swiss-Prot检索号P32322所述的PYCR1的野生型氨基酸序列的序列第4至220位和第222至266位中的至少1个氨基酸残基被突变。
在第二个方面,本发明提供了PYCR1的突变蛋白。突变蛋白包括如Swiss-Prot检索号P32322所述的PYCR1的野生型氨基酸序列的序列第4至266位中的至少1个氨基酸残基的突变,其中所述突变导致突变蛋白与野生型蛋白相比降低的功能或功能的丧失。
在第三个方面,本发明提供了核酸分子。核酸分子包括编码如上所述的突变蛋白的核苷酸序列。
在第四个方面,本发明提供了测定在受试者中患上与吡咯啉-5-羧酸还原酶1(PYCR1)有关的年龄相关疾病的倾向的方法。所述方法包括分析从受试者中得到的核酸样品中编码如上所述的突变蛋白的核苷酸序列的存在,其中所述核酸序列的存在指示受试者患上或有风险患上年龄相关疾病的倾向。
在第五个方面,本发明提供了包含编码如上所述的突变蛋白的核苷酸序列的核酸分子在诊断或测定患上与PYCR1有关的年龄相关疾病的倾向中的用途。
在第六个方面,本发明提供了鉴定能够修饰PYCR1基因的表达的化合物的方法。所述方法包括:使目的化合物接触包含编码吡咯啉-5-羧酸还原酶1(PYCR1)或其功能片段或突变体的核苷酸序列的核酸分子,并测量编码吡咯啉-5-羧酸还原酶1(PYCR1)或其功能片段或突变体的核苷酸序列的表达。
在第七个方面,本发明提供了修饰PYCR1基因在细胞中的表达的方法。所述方法包括将包含编码吡咯啉-5-羧酸还原酶1(PYCR1)或其功能片段或功能突变体的核苷酸序列的核酸分子引入细胞。
在第八个方面,本发明提供了治疗患有与PYCR1有关的年龄相关疾病的或具有患上与PYCR1有关的年龄相关疾病的风险的受试者的方法。所述方法包括将包含编码吡咯啉-5-羧酸还原酶1(PYCR1)或其功能片段或功能突变体的核苷酸序列的核酸分子引入受试者。
在第九个方面,本发明提供了治疗患有与PYCR1有关的年龄相关疾病的或具有患上与PYCR1有关的年龄相关疾病的风险的受试者的方法。所述方法包括对受试者施用能够修饰PYCR1基因表达的化合物。
在第十个方面,本发明提供了基因改造的动物。所述基因改造的动物包含编码吡咯啉-5-羧酸还原酶1(PYCR1)的核酸,其中所述核酸是失活的。
在第十一个方面,本发明提供了修饰PYCR1基因在动物中的表达的方法。所述方法包括对动物施用能够修饰PYCR1基因表达的化合物。
在第十二个方面,本发明提供了鉴定能够修饰PYCR1基因表达的化合物的方法。所述方法包括对如上所述的基因改造的动物施用目的化合物;并测定所述化合物是否能够修饰PYCR1基因的表达。
在第十三个方面,本发明提供了鉴定能够修饰PYCR1基因表达的化合物的方法。所述方法包括提供包含至少一层活动物皮的分离的皮瓣,所述皮瓣被附着在试验动物上;并应用目的化合物使其接触活动物皮。
发明详述
本文描述了与以皱皮、骨质疏松和早衰样外观为特征的多种疾病有关的PYCR1中的突变。在此背景下,发明人检测了在PYCR1基因中导致疾病的突变。PYCR1基因的这些突变是PYCR1的突变蛋白,其中在如Swiss-Prot检索号P32322所述的PYCR1的野生型氨基酸序列的序列第4至220位和第222至266位中的至少1个氨基酸残基被突变(见图6)。在一些实施方案中,突变蛋白可包含如Swiss-Prot检索号P32322所述的PYCR1的野生型氨基酸序列的序列第4至266位中的至少1个氨基酸残基的突变,其中所述突变导致突变蛋白相比于野生型蛋白降低的功能或功能的丧失。
根据本发明描述的突变蛋白可通过任意标准方法鉴定或测定,例如通过纯合性作图,使用从大家族的成员中得到的汇合的DNA样品以鉴定目的染色体基因座或其候选区域。一旦鉴定了染色体基因座的候选区域,可使用常规测序和基因组基因座捕获然后通过高通量测序方法筛选区域中导致疾病的突变。
在一些实施方案中,根据本发明描述的突变蛋白也可来源于单核苷酸多态性(SNP)。术语“SNP”指在个体群中变化的人基因组中特定位置上的单核苷酸多态性。此单核苷酸多态性可为例如在DNA序列中的单个碱基改变,在给定位置上通常具有2个可能的核苷酸之一。如本文使用的,SNP可通过其名称或通过其在特定序列中的位置鉴定。可使用本领域技术人员已知的多种方法产生SNP。根据本发明的SNP可例如来源于表达序列标签(EST)生成项目中的序列数据的比较,特别是如果使用的文库是使用来自不同个体的组织构建的话(Picoult-Newberg L.,等人,Mining SNPsfrom EST databases,Genome Res.9(1999)167-174)。根据本发明的SNP也可来源于如在Altshuler D.等人,An SNP map of human genomegenerated by reduced representation shotgun sequencing,Nature 407(2000)513-516中描述的降低表现度的鸟枪(RRS)法的使用。
只要能达到预期的目的,也可能将突变引入PYCR1的野生型氨基酸序列,例如以得到相比于各自野生型蛋白质,本发明的突变蛋白的降低的或丢失的功能。这些突变可包括例如PYCR1的野生型氨基酸序列的取代、缺失和插入。可能的改变的实例包括保守修饰变化,其中改变是用化学上相似的氨基酸取代氨基酸。提供功能相似的氨基酸的表是本领域熟知的。保守取代的实例是在:1)丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸;2)天冬氨酸和谷氨酸;3)天冬酰胺和谷氨酰胺;4)精氨酸和赖氨酸;5)异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸;和6)苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸之间的取代。在其他实施方案中,也可通过非保守改变修饰PYCR1的氨基酸序列。
在某些实施方案中,PYCR1的野生型氨基酸序列的序列第4,119,179,189,206,251,257和266位上的至少1个氨基酸残基被突变。在此背景下,PYCR1的野生型氨基酸序列的序列第4位上的氨基酸残基的突变可通过移码突变被突变,所述移码突变导致编码PYCR1的野生型氨基酸序列的序列第50位的密码子变为翻译终止密码子。
在其他实施方案中,PYCR1的野生型氨基酸序列的序列第19位的氨基酸残基可被甘氨酸或组氨酸替换。
在一些实施方案中,PYCR1的野生型氨基酸序列的序列第179位的氨基酸残基可被亲水性氨基酸替换。亲水性氨基酸可为例如含有羟基的氨基酸。这些含有羟基的氨基酸的实例包括丝氨酸或苏氨酸。
在一些实施方案中,PYCR1的野生型氨基酸序列的序列第189位的氨基酸残基可被疏水性氨基酸替换。疏水性氨基酸可为例如脂肪族氨基酸。这些脂肪族氨基酸的实例可包括异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸。
在一些实施方案中,PYCR1的野生型氨基酸序列的序列第206位的氨基酸残基可被芳香族氨基酸或正电荷氨基酸替换。芳香族氨基酸的实例可包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。正电荷氨基酸的实例可包括精氨酸或赖氨酸。
在一些实施方案中,PYCR1的野生型氨基酸序列的序列第251位的氨基酸残基可被组氨酸替换。在其他实施方案中,PYCR1的野生型氨基酸序列的序列第257位的氨基酸残基可被亲水性氨基酸替换。此亲水性氨基酸可为例如含有羟基的氨基酸。这些含有羟基的氨基酸的实例可为丝氨酸或苏氨酸。
在一些实施方案中,PYCR1的野生型氨基酸序列的序列第266位的氨基酸残基可被谷氨酰胺或天冬酰胺替换。
为了改进的稳定性、产量、纯化或适用性的目的,根据本发明的突变蛋白的序列也可被修饰。例如,如果希望,可为了这些目的去除对折叠为有功能的三维结构不关键的肽区段。可通过取代半胱氨酸残基去除二硫键或可在另一个位点引入新的二硫键。任选地,也可新引入半胱氨酸残基以通过与其他成分的化学偶联制备,例如,对应的蛋白质缀合物。也可在突变蛋白中构建用于其他配体,例如金属离子的结合位点。
如本文使用的术语“氨基酸残基”指D或L型的氨基酸或指可通过酰胺键掺入多肽的氨基酸模拟物。因此,第89位的正电荷氨基酸残基可为例如在生理条件下为正电荷的天然存在的氨基酸残基,例如精氨酸或赖氨酸或非天然模拟物,例如这样的赖氨酸残基,其α-氨基被烷基化以得到具有永久正电荷的(季)铵盐。
如本文使用的涉及动物或氨基酸序列的术语“野生型”指相对在天然或人工环境中遗传改变的形式在生物或生物品系的天然群体中占优势的表型、基因型或基因。
在本发明的说明性实施方案中,研究了来自22个家族的35位患病个体的临床特征并总结在表1中。这些特征包括先天的皮肤起皱,在手和脚的背部最显著,全身的结缔组织薄弱,手指挛缩,疝气,骨质疏松和由于皮肤松垂和颌发育不全(经常导致下颌前突)而具有早衰样外观的三角形脸(图1a-d)。皮肤的超微结构研究显示与在常染色体隐性皮肤松弛(ARCL)中描述的变化类似的弹性纤维的稀疏和破碎(图1e-h)。通过标准诊断未检测出糖基化异常。在除一例以外的所有案例中观察到不同程度的智力迟钝。在大量患者中有明显的胼胝体发育不全。尽管大部分患病的个体被归为骨发育异常性老年状皮肤(GO)或皱皮综合征,患病较严重的个体也显示儿童期白内障或张力障碍性运动并因此被诊断为De Barsy综合征(DBS)(Al-Gazali,L.I.,等人,Gerodermia osteodysplastica andwrinkly skin syndrome:are they the same?Am J Med Genet 101,213-20(2001);Hamamy,H.,等人,Wrinkly skin syndrome.Clin Exp Dermatol 30,590-2(2005);Nanda,A.等人Gerodermia osteodysplastica/wrinkly skinsyndrome:report of three patients and brief review of the literature.Pediatr Dermatol 25,66-71(2008);和Kunze,J.等人De Barsysyndrome-an autosomal recessive,progeroid syndrome.Eur J Pediatr144,348-54(1985))。
在5个有血缘的家族中的纯合性作图显示在染色体17q25上在rs8065431和rs1046896标记之间的2.8Mb的最小候选区域(图1i)。除了通过测序被排除的P4HB之外,在此区域中的59个基因无一是明显的候选者。因此,在组合了常规测序和基因组基因座捕获之后进行了高通量测序(图1j)。后者鉴定出552个基因组错配,其中8个是导致非同义突变的新SNP(表1)。这样发明人鉴定出PYCR1(编码吡咯啉-5-羧酸还原酶1酶(PYCR1)的基因)的突变蛋白。
在本发明的另一个方面,提供了包含编码根据本发明的突变蛋白的核苷酸序列的核酸分子。如本文使用的术语“核酸”指任意可能构型的任意核酸分子,例如线性化的单链、双链或其组合。这样的核酸实例可包括但不限于DNA分子(例如cDNA或基因组DNA),RNA分子(例如mRNA),反义RNA,短干扰(siRNA),微小RNA(miRNA),使用核苷酸类似物或使用核酸化学生成的DNA或RNA的类似物,cDNA合成DNA,DNA和RNA的共聚物,寡核苷酸,PNA(蛋白质核酸),或其组合。DNA或RNA可为基因组或合成来源并可为单或双链。各个核酸可进一步包含非天然核苷酸类似物和/或与亲和标签或标记连接。
术语“核苷酸”包括天然(天然存在)的核苷酸,其包括选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶的含氮碱基,选自核糖、阿拉伯糖、木糖和吡喃糖,和脱氧核糖的糖(碱基和糖的组合一般被称为“核苷”),和1至3个磷酸基,且其可形成核苷间的磷酸二酯键。“核苷酸”也指核苷酸类似物。这样的类似物可具有糖类似物、碱基类似物和/或核苷间键类似物。另外,也包括展示非标准碱基配对的类似物(见例如美国专利号5,432,272)。这样的核苷酸类似物包括在天然的碱基中化学修饰的核苷酸(“碱基类似物”),在天然的糖中化学修饰的核苷酸(“糖类似物”)和/或在天然的磷酸二酯键或任意其他核苷间键中化学修饰的(“核苷间键类似物”)。在某些实施方案中,一个或多个芳香环包含至少一个氮原子。在某些实施方案中,核苷酸碱基能够与合适的互补核苷酸碱基形成Watson-Crick和/或Hoogsteen氢键。示例性核苷酸碱基及其类似物包括但不限于天然存在的核苷酸碱基,例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶,和天然存在的核苷酸碱基的类似物,例如7-脱氮杂腺嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤、7-脱氮杂-8-氮杂鸟嘌呤、7-脱氮杂-8-氮杂腺嘌呤、N6δ2-异戊烯基腺嘌呤、N2-二甲基鸟嘌呤(dmG)、7-甲基鸟嘌呤(7mG)、肌苷、水粉蕈素、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤、假尿苷、假胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤、2-巯基嘧啶、6-巯基鸟嘌呤、4-巯基胸腺嘧啶、4-巯基尿嘧啶、O6-甲基鸟嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、O4-甲基胸腺嘧啶、5,6-二氢胸腺嘧啶、5,6-二氢尿嘧啶、吡唑并[3,4-D]嘧啶(见例如美国专利号6,143,877和6,127,121)、亚乙烯基腺嘌呤、吲哚例如硝基吲哚和4-甲基吲哚和吡咯例如硝基吡咯。
术语“互补”旨在指在2条不同的DNA或RNA链上的核苷酸/碱基的关系,其中碱基是配对的(鸟嘌呤和胞嘧啶,腺嘌呤和胸腺嘧啶(DNA)或尿嘧啶(RNA))。
在某些实施方案中,根据本发明使用的核酸分子可包含编码本发明的突变蛋白的核苷酸序列,在其他实施方案中,根据本发明使用的核酸可包含吡咯啉-5-羧酸还原酶1(PYCR1)或其功能片段或突变体的核苷酸序列。本文使用的术语PYCR1的“功能突变体”指本发明的突变蛋白以外的变体蛋白,其中基本上保留功能。例如,与所述功能无关的一个或多个氨基酸已被交换。如本文使用的术语“功能片段”指PYCR1的片段,其具有足够的长度以提供其希望的功能。
在此背景下,如本文使用的核酸分子例如DNA可被视为例如“能够表达核酸分子或编码核苷酸序列”或能够“允许核苷酸序列的表达”,如果其包含含有转录和翻译信息的调控核苷酸序列且这样的序列与编码本发明的突变蛋白的核苷酸序列“有效连接”。有效连接是这样的连接,其中调控DNA序列和寻求被表达的DNA序列以允许基因序列表达的方式相连。用于基因序列表达所需要的调控区的精确性质在生物和生物之间可有不同,但大体上应当包括启动子区,在原核生物中其仅包含启动子或包含引导RNA转录起始的启动子以及下述DNA序列,即当其被转录为RNA时将发出合成起始的信号。这样的区域通常将包括位于待表达的核苷酸序列的5’和3’的非编码区且所述非编码区涉及转录和翻译的起始,例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列。
在一些实施方案中,可通过插入或从核苷酸序列中缺失至少一个核苷酸改变本发明的或根据本发明使用的核酸分子。在其他实施方案中,可突变核酸分子的核苷酸序列的至少一个剪接位点。术语“剪接位点”指特定的核酸序列,其能够被真核细胞的剪接机器识别为适合被切割和/或连接至对应的剪接位点。剪接位点允许在前体mRNA转录物中存在的内含子的切除。一般将内含子的5’部分称为供体剪接位点和将对应的3’剪接位点称为受体剪接位点。术语剪接位点包括,例如天然存在的剪接位点、改造的剪接位点。改造的剪接位点可为例如被突变的位点。剪接位点的突变能够控制从不同转录物群中翻译的多肽之间的比例。剪接位点是本领域熟知的且在本发明中可利用任意剪接位点。
在一些实施方案中,核酸分子可被包含在载体例如表达载体中。这样的载体能够整合如上所述的核酸并可包含编码限制性切割位点的序列,该序列以5’或/和3’方向连接编码本发明的突变蛋白或PYCR1或其功能片段或突变体的核酸。所述载体也可包含来源于与用于表达的载体相容的物种的复制位点和控制序列。在此背景下,术语“载体”涉及可被引入,例如转染进细胞和在细胞基因组内或独立复制的单或双链环状核酸分子。在用限制酶处理下,环状双链核酸分子可被切割和因此被线性化。各种核酸载体、限制酶和限制酶切割的核苷酸序列的知识是本领域技术人员容易获得的。
通过用限制酶切割载体并将2个片段连接在一起可将编码本发明的突变蛋白或PYCR1或其功能片段或突变体的核酸分子插入载体。在本发明中可使用本领域技术人员已知的适用于基因克隆的任意载体。这些载体的实例可包括但不限于pUC18,pUC19,BR322,pBR325,pBR327和pBR328。编码本发明的突变蛋白或PYCR1或其功能片段或突变体的核酸和/或各自的载体可被包含在能够表达所述核酸的宿主细胞中。本文公开的宿主细胞也可包含如上定义的核酸。如本文使用的宿主细胞包括可用作表达系统以产生重组蛋白质特别是如上所述的突变蛋白或PYCR或其功能片段或突变体的任意宿主细胞。示例性宿主细胞为原核宿主细胞,例如但不限于大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium);和真核宿主细胞,包括哺乳动物、鸟类、真菌和昆虫细胞。将载体引入宿主细胞的多种方法是本领域技术人员已知的,例如转化、转染、电穿孔和生物射弹法。
本发明也提供了包含编码本发明的突变蛋白的核苷酸序列的核酸分子,其用于诊断或测定患上与PYCR1有关的年龄相关疾病的倾向。年龄相关疾病可为(但不限于)皮肤松弛(皱皮综合征)、De Barsy综合征和骨发育异常性老年状皮肤。
在另一个方面,本发明提供了测定在受试者中患上与吡咯啉-5-羧酸还原酶1(PYCR1)有关的年龄相关疾病的倾向的方法。所述方法包括分析从受试者中得到的核酸样品中编码本发明的突变蛋白的核苷酸序列的存在,其中所述核酸序列的存在指示受试者患上或有风险患上年龄相关疾病的倾向。
本发明也提供了鉴定能够修饰PYCR1基因的表达的化合物的方法。所述方法包括使目的化合物接触包含编码PYCR1或其功能片段或突变体的核苷酸序列的核酸分子。所述方法还包括测量编码PYCR1或其功能片段或功能突变体的核苷酸序列的表达。之后,可将测量结果与未加入目的化合物的对照测量的结果相比较。
本发明也提供了基因改造的动物。基因改造的动物包括编码PYCR1基因的核酸,其中所述核酸是失活的。在一些实施方案中,核酸导致PYCR1基因的功能丧失。可通过本领域熟知的遗传方法失活编码PYCR1基因的核酸。例如可通过使用基因敲除或基因敲低方法、吗啉代反义寡聚物或其他已知的可导致PYCR1基因的功能丧失的方法失活所述核酸。术语“动物”可包括所有脊椎动物,包括人。其可也包括在所有发育阶段中的个体动物,包括胚胎和胎儿阶段的动物。为了得到根据本发明的基因改造的动物,可使用基因工程技术例如重组DNA技术改造动物的遗传物质。可通过例如将相关DNA加入现有的生物基因组,例如质粒,产生重组DNA,以为了特定目的编码或改变不同的性状。这样的动物的实例可包括但不限于爪蟾、鱼、两栖动物、爬行动物和鸟。在本发明中使用的基因改造的动物也可为哺乳动物,在一些实施方案中,哺乳动物可包括人、啮齿动物、犬类、有蹄类、猫科动物、兔科和猕猴。啮齿动物的实例包括但不限于小鼠、大鼠、松鼠、花栗鼠、囊地鼠、箭猪、海狸、仓鼠、沙鼠、豚鼠、南美栗鼠、草原土拨鼠和土拨鼠。犬类的实例包括但不限于狗、狼、北美小狼和豺。有蹄类的实例包括但不限于马、驴、斑马、绵羊、猪、山羊、骆驼、长颈鹿和驼鹿。猫科动物的实例包括但不限于猫、狞猫、美洲狮、猎豹和豹。兔科的实例包括但不限于兔、野兔和长耳大野兔。猕猴的实例包括恒河猴。
在另一个方面,本发明提供了鉴定能够修饰PYCR1基因表达的化合物的方法。所述方法包括对如本文描述的动物或基因改造的动物施用目的化合物。所述方法还包括测定目的化合物是否能够修饰PYCR1基因的表达。
只要根据本发明使用的目的化合物能够修饰PYCR1基因的表达,可将所述化合物配制成任意形式。例如可将化合物配制成药物组合物或化妆品组合物的形式。化妆品组合物的实例包括凝胶、软膏、乳膏、洗剂、精华素(serum)、糊剂、肥皂、气溶胶、可溶性片剂、粉末、棒状物(sticks)、水基或油基悬浮剂和乳剂。
在此背景下,可在基因或蛋白质水平修饰PYCR1的表达。当各个蛋白质的基因表达/活性/量相比对照水平提高或降低例如约10%、约25%、约50%、约75%、约100%或更高时,认为基因表达水平或蛋白质水平的量是被“修饰的”或“调节的”。备选地,当基因表达/或活性/蛋白质水平相比对照水平提高或降低例如至少约0.1,至少约0.2,至少约1,至少约2,至少约5、或至少约10或更多倍时,认为表达水平或活性水平或蛋白质水平/量被“提高”或“降低”。因此,在一些实施方案中,在本发明的方法中使用的目的化合物可例如提高或降低PYCR1基因的表达。
因此本发明的另一个方面是提供修饰PYCR1基因在细胞中表达的方法。所述方法包括将包含编码吡咯啉-5-羧酸还原酶1(PYCR1)或其功能片段或功能突变体的核苷酸序列的核酸分子引入细胞。在本发明的本方法中可使用任意细胞。在一些实施方案中,细胞从宿主生物中获得或来源于宿主生物,宿主生物可为任意生物。细胞可以例如活组织或血样的样品形式从各个宿主生物直接采集,例如分离。其也可为已经从宿主生物获得的,例如分离的,和然后被培养、生长、转化或暴露于选定的处理。在一些实施方案中,根据本发明使用的细胞可被包含在宿主生物中。其可例如在血液中或组织中,包括在宿主生物的器官中存在。宿主生物可为任意生物,例如微生物,动物,例如鱼、两栖动物、爬行动物、鸟类、哺乳动物,包括啮齿动物物种,无脊椎动物物种,例如包括例如青蛙、蟾蜍、火蜥蜴或蝾螈的滑体亚纲,或植物,细胞来源于所述宿主生物的或从其获得,包括分离、纯化或富集,或细胞包含在宿主生物中。哺乳动物的实例包括但不限于大鼠、小鼠、兔、松鼠、田鼠、鸭嘴兽、鸡、奶牛、山羊、绵羊、猪、狗、欧洲盘羊、豚鼠、仓鼠、黑猩猩、恒河猴、猕猴或人。
本发明也提供了修饰PYCR1基因在动物(包括上述动物)中表达的方法。所述方法包括对动物施用能够修饰PYCR1基因的表达的化合物。所述化合物在一些实施方案中包括能够修饰PYCR1基因表达的核酸分子。这样的核酸分子的实例如上所述并包括反义RNA、短干扰(siRNA)、微小RNA(miRNA)、肽核酸(PNA)及其组合。
本发明的另一个方面是提供治疗患有与PYCR1有关的年龄相关疾病的或有风险患上与PYCR1有关的年龄相关疾病的受试者的方法。在一些实施方案中,所述方法包括将包含编码PYCR1或其功能片段或功能突变体的核苷酸序列的核酸分子引入受试者。在其他实施方案中,所述方法也可包括施用能够修饰PYCR1基因表达的化合物。一个单独的用途可为例如制造用于此目的的药物或药物组合物。因此,本发明的方法包括如上定义的核酸或化合物的用途,包括在制造药物中的用途。可使用本文描述的本发明的方法鉴定能够修饰PYCR1表达的化合物。在此背景下,本发明的或根据本发明使用的方法可在体内或体外进行。
术语“施用”涉及将目的化合物、根据本发明的核酸或其各个药物组合物掺入生物的一个或多个细胞或组织。各个化合物、核酸或其药物组合物的示例性施用途径包括口服、经皮和胃肠外递送。合适的施用途径可包括例如贮库制剂、口服、直肠、黏膜、静脉内、髓内注射以及鞘内、直接心室内、腹膜内、鼻内或眼内注射。
在说明性实施方案中,鉴定了8个错义突变、1个移码突变、5个剪接位点突变和包含外显子5的外显子-内含子边界的22bp的1个缺失(表1,图6)。这些突变中的5个是经常出现的,尽管患病个体没有共同的种族背景。为了检查PYCR1蛋白质的表达,从渊源者和其未患病的兄弟姐妹中分离了皮肤成纤维细胞(图2)。在具有纯合剪接位点突变的患者(SJ)和具有错义和移码突变的复合杂合患者(DI)的成纤维细胞中检测到显著降低的PYCR1蛋白水平(图2a)。错义突变p.Gly206Trp和p.Arg251His导致相比对照细胞蛋白质水平的降低(图2a)。PYCR1蛋白,经常被描述为在细胞质中与线粒体基质蛋白Δ1-吡咯啉-5-羧酸合酶(P5CS)共定位,P5CS也属于脯氨酸代谢途径(图2b-f)。因此可推断PYCR1是线粒体蛋白且本文描述的突变导致功能丧失。
在另一个说明性实施方案中,在小鼠组织中的PYCR1表达分析显示在2个受影响最严重的组织骨和皮肤中mRNA水平最高(图7b)。在人中存在PYCR1的2个旁系同源物,高度相似的PYCR2和关系最远的PYCR1。在具有PYCR1突变的个体的成纤维细胞中未观察到PYCR2或P5CS的显著表达变化(图7a)。由于PYCR1在脯氨酸的从头合成中催化必需和最终步骤,研究了患病个体是否展示脯氨酸不足的问题。在患病个体中血清脯氨酸水平轻微降低,但在正常范围内(图8a)。同样地,培养的皮肤成纤维细胞未显示降低的脯氨酸水平(图8b)或在不合脯氨酸的培养基中降低的增殖率(图8c)的迹象,反驳了脯氨酸营养缺陷型的存在。
在另一个说明性实施方案中,基于PYCR1的线粒体定位更详细检查了线粒体网络。超微结构分析显示线粒体及其嵴的异常形态学(图3a,b)。这些差异在氧化胁迫下加剧(图3c-e)。对细胞培养基加入H2O2导致患病个体细胞中丝状线粒体网络的塌陷,而在对照细胞的线粒体中观察到几乎无变化(图3f)。在正常培养条件下患者和对照成纤维细胞在其凋亡水平上显示无差异。然而在短暂暴露于H2O2后,检测到当与对照相比时患者的成纤维细胞中的细胞死亡提高了5倍。这暗示PYCR1涉及细胞对氧化胁迫的应答。
在另一个说明性实施方案中,研究了PYCR1在胚胎发生中的功能,因为在PYCR1中具有突变的患者在出生时就患病。PYCR1在进化中始终保守,在细菌、植物、昆虫和脊椎动物中发现PYCR1直系同源物(图4a)。为了在爪蟾胚胎中建立疾病模型,设计了针对根据本发明的Pycr1的吗啉代(MO)。Pycr1耗尽的胚胎未显示明显的发育缺陷,直到早期蝌蚪阶段。到阶段30,Pycr1吗啉突变体(morphant)胚胎不能发育出眼睛和尾芽(图4c,d)。据显示此表型为细胞自主的,因为仅在腹部或背部卵裂球中注射分别阻止眼睛和尾巴的发育(图4e-i)。皮肤改变变得明显并且后来在游泳蝌蚪阶段发育为外胚层水肿(图4j,i)。组织学皮肤切片显示上皮的解体和增大的细胞和核(图4k,m)。显微注射人PYCR1 mRNA部分挽救了在Pycr1吗啉突变体中观察到的表型而模拟K215-D319Ddel突变的人PYCR1 mRNA没有效果(图9)。同样地,在斑马鱼中Pycr1和Pycr2的吗啉代介导的敲除导致类似的皮肤表型(图11a,b),其可被人野生型PYCR1 mRNA的注射挽救(图11d,e)。Pycr1吗啉突变体没有可见的循环的红血球(图10a,b)。此贫血可追溯到在阶段25时原始造血作用的标记物Scl表达的丧失(图5e,f)。
在阶段25-30,皮肤发育不全伴随凋亡细胞数目的显著增加(图5a-d,g)。由于在PYCR1吗啉突变体中观察到的皮肤缺陷可能是由贫血导致,在野生型和注射Pycr1-MO的胚胎中进行了联体生活(图10c)。在联体生活后由于共享的血液循环Pycr1吗啉突变体中外胚层水肿的程度有所降低,但皮肤发育不全、凋亡和生长障碍没有被挽救(图5g-i)。可以推断Pycr1在爪蟾的血液形成和皮肤发育中发挥独立的作用。在青蛙中观察到的贫血可能反映了Pycr1在此缺乏Pycr2基因的物种中发挥的双重作用。在人中,Pycr2在血细胞中的作用已被详细记载24-25。总之上述结果表明PYCR1中的功能丧失突变危害线粒体功能,这导致在胚胎形成中的凋亡和在成人期中一般不能活跃。
PYCR1属于催化1-吡咯啉-5-羧酸(P5C)转化为L-脯氨酸的NAD(P)结合Rossmann-折叠结构域超家族。若干遗传疾病已与脯氨酸代谢途径相联系10。更值得注意地是,在P5CS中的突变导致智力低下、关节活动过度和皮肤松弛(OMIM 612652)的状况11-13。如在本文描述的患者中的情况,P5CS缺陷不是由降低的血清脯氨酸水平所一致表征的11,12。此外,来自这些患者的成纤维细胞未展示用于描述P5CS缺陷的增殖缺陷13。PYCR1相关疾病的表型和皮肤松弛的其他形式有重叠,以前曾在诊断WSS、GO或DBS中描述过此组群患病患者的事实反映了这一点5,6,8,9,14,15。尽管GO不导致智力损伤,但是ARCL2经常包括轻度或中度智力迟钝和大脑异常16。在ARCL2中已鉴定出编码定位至内体和高尔基体的V-ATP酶复合体的a2亚基的ATP6V0A2中的突变。在GO中鉴定出在另一个囊泡高尔基体蛋白GORAB中的突变。表型的相似性暗示了在这些病症中共同的但尚未确定的致病机理。有趣的是,在具有ATP6V0A2缺陷的ARCL2患者的成纤维细胞中也观察到凋亡的增加。
在有氧代谢中可能有害的活性氧类别(ROS)的产生已变成衰老研究的主要焦点18。ROS最初被视为氧化磷酸化的有害副产物,但最近发现其对氧化还原依赖的信号转导过程的重要性18,19。实际上,脯氨酸已经涉及ROS水平的调节20,21。此外,PYCR1和-2可能涉及在细胞质中和线粒体中调节NAD(P)H/NAD(P)+比例。在神经退化疾病中已描述线粒体的破裂损害细胞功能23。此外,线粒体融合中的变化可触发衰老24。尽管PYCR1对线粒体功能和完整性的精确作用仍有待确定,其在其他物种例如酵母、拟南芥和果蝇中的直向同源物与胁迫抵抗有关联的事实暗示人PYCR1也可能通过维持可快速代谢的脯氨酸储备和减少进入线粒体的当量提供对抗胁迫的适应性保护25。
总之,导致PYCR1功能的丧失的PYCR1中的突变是常染色体隐性皮肤松弛的主要原因,引起与骨发育异常性老年状皮肤、2型ARCL和3型ARCL有重叠的表型。病理生理学基础是损伤的线粒体功能,通过凋亡的增加导致发育缺陷。本发明人强调的线粒体功能在衰老过程中的重要性可帮助发展新的用于一般年龄相关疾病的治疗策略27。这些治疗策略可包括新的药物或化妆品应用以治疗年龄相关疾病或防止衰老的影响,例如皮肤起皱。作为说明性实例,可生成使用实验动物的筛选测定以筛选新的化妆品化合物或药物组合物。实验动物的实例可包括裸小鼠,其中将携带PYCR1基因突变的活人皮肤移植物移植到裸小鼠上。
在一个方面,本发明也提供了鉴定能够修饰PYCR1基因表达的化合物的方法。所述方法包括提供包含至少一层活动物皮的分离的皮瓣,将所述皮瓣附着在试验动物上,如例如在美国专利号4,677,968中描述的。所述方法还包括对活动物皮应用目的化合物。
在此背景下,为了筛选能够修饰PYCR1基因表达的化合物,可将目的化合物直接应用在移植在裸小鼠上的活人皮上。根据此方法使用的化合物可为任意形式,包括如上所述的药物或化妆品组合物。
在一些实施方案中,皮瓣可包括表达本发明的突变蛋白的细胞。所述细胞可包括例如成纤维细胞。皮瓣可在一个表面上包含一层活人皮和在另一个表面上包含活动物皮。皮瓣可由可附着在试验动物上的分离的脉管系统供给。活动物皮可为和试验动物相同或不同的物种。动物可为人或啮齿动物,包括例如无胸腺的啮齿动物。
总之,上述筛选测定可提供鉴定和分析化妆品或药物组合物接触活人皮的效果。可通过直接表面应用在皮肤上检测目的化合物。可研究活人皮应答不同化合物的行为和效果。
实施例
以下非限制性实施例也说明了上述方法且不应被视为限制本发明的范围。
基因分型和连锁分析。在参与者知情同意和当地伦理委员会(Ethikkommission der Charite)同意之后,从22个家族获得DNA样品。使用Affymetrix GeneChipHuman Mapping 250K Arrays(Affymetrix,Santa Clara,CA),我们在8个家族中进行了基因组范围的连锁分析。通过GeneChipDNA分析软件(GDAS v2.0,Affymetrix)调入基因型。通过对X染色体上的杂合SNP的计数,我们验证了样品的性别。在GraphicalRelationship Representation程序的帮助下评估了关系错误。应用PedCheck程序检测孟德尔误差并从数据集中去除具有这些误差的SNP数据。通过使用MERLIN程序鉴定了非孟德尔误差并删除相关样品的不太可能的表型28。使用MERLIN进行了同时使用所有染色体基因型的非参数连锁分析。通过GENEHUNTER 2.1程序的修改版本,通过逐步使用具有110或200个SNP的集合的滑动窗口,进行了参数连锁分析。使用GENEHUNTER 2.1重建了单元型并使用HaploPainter用图表显示29。
突变分析。从GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/)和Ensembl(http://www.ensembl.org)数据库获得位置候选基因。通过使用每个外显子两侧的引物直接测序DNA分析基因。引物序列是基于每个基因的参考序列。用于PYCR1突变筛选的引物序列在补充的表1中提供。使用BigDye Terminator循环测序试剂盒(Applied Biosystems,Foster City,CA)进行序列分析,并在3730DNA分析仪(Applied Biosystems,Foster City,CA)上电泳产物。
基因组基因座捕获。简单地说,设计了定制的阵列(Agilent 244K)以靶向基因座17q25中72,048,357和78,774,742之间(排除高度重复区)存在的基因的每个外显子序列。遵照Illumina文库生成实验方案版本2.3制备了DNA文库并根据Agilent CGH 244K阵列实验方案将其与定制的阵列杂交,然后洗涤、洗脱和扩增。每个样品通过Illumina流动池的一个通道并通过Illumina基因组分析仪(GA)使用标准的制造商的实验方案测序。通过制造商提供的GA Pipeline版本1.0处理图像数据并将所有序列与人参考基因组(UCSC build 18,http://genome.ucsc.edu)通过类似Blat的快速精确搜索工具(BFAST,https://secure.genome.ucla.edu/index.php/BFAST,N.Homer等人,在准备中)比对。
过滤了出现2次或更多次的错配,其中在100%的时间中观察到突变(纯合的),且其不与已知的dbSNP129条目错配有重复。在此工作中使用开源SeqWare项目,其提供了用于跟踪样品的LIMS工具(SeqWareLIMS)和用于序列分析的流程(pipeline)(SeqWarePipeline)(http://seqware.sourceforge.net)。
细胞培养。在补充10%的胎牛血清(FCS)(Lonza)、1%的超谷氨酰胺(Ultraglutamine)(Lonza)和1%的青霉素/链霉素(Lonza)的DMEM(Lonza)中在5%CO2和37℃下培养人皮肤成纤维细胞。
定量PCR。使用Trizol(Invitrogen)法从P4小鼠的器官中分离RNA。使用Revert Aid试剂盒(Fermentas)和随机六聚物逆转录1μg RNA。使用SYBR绿(Applied Biosystems)进行定量PCR。在补充的表1中提供了引物。
蛋白质印迹分析。使用用于哺乳动物细胞的线粒体分离试剂盒(ThermoScientific)得到原代皮肤成纤维细胞的全细胞裂解液的线粒体和细胞质级分,并通过在SDS聚丙烯酰胺凝胶中的电泳解析。对于蛋白质印迹分析,使用以下抗体标记PVDF膜:1∶1000的抗肌动蛋白A5060(Sigma)和1∶500的兔抗PYCR1(Proteintech)。
免疫荧光分析。对于免疫荧光,在磷酸缓冲盐水(PBS)中洗涤细胞3次。在4%(重量/体积)的溶于1xPBS中的多聚甲醛中固定细胞10分钟并用0.4%(体积/体积)的Triton-X100(在3%的溶于1xPBS的BSA中)在4℃渗透10分钟。在3%BSA中在4℃下过夜孵育1∶500的针对PYCR1的特异性抗体(兔抗PYCR1(Proteintech))和1∶300的P5CS(小鼠抗P5CS(Abnova))。为了显色,应用抗小鼠IgG Alexa Fluor 555(Invitrogen,Molecular Probes)和抗兔IgG Alexa Fluor 488(Invitrogen,MolecularProbes)缀合物。用DAPI染色DNA并用Fluoromount(Scientific Services)封片细胞。使用LSM 510meta(Carl Zeiss,Germany)用63倍的Plan Apochromat油浸物镜收集图像。
线粒体形态学。在用过氧化氢(neoLab)处理后研究了线粒体网络的形态学。将细胞培养至50%汇合。在正常培养基中用每种物质进行了处理。对细胞加载100nM Mito Tracker Red CM-H2XRos(Invitrogen)。
将细胞与500μM H2O2孵育5分钟。在4%(重量/体积)的溶于1xPBS中的多聚甲醛中在4℃固定细胞10分钟。用DAPI染色DNA并用Fluoromount(Scientific Services)封片细胞。使用BX60 Olympus显微镜随机收集每个样品的图像并测定线粒体形态学。
凋亡测定。对于在过氧化氢(neoLab)处理后的凋亡测量,将细胞与200μM H2O2在不存在FCS下孵育1小时。在胁迫期之后将培养基更换为具有0.4%FCS的正常培养基并在正常条件下另外培养细胞24小时。使用补充5mM L-脯氨酸(Sigma-Adrich)的培养基进行了相同的实验。在4%(重量/体积)的溶于1xPBS中的多聚甲醛中固定细胞10分钟并用0.1%(体积/体积)的Triton-X100(在溶于1xPBS的3%的BSA中)在冰上渗透2分钟。对于凋亡测定,根据制造商的说明书进行了TUNEL测定(Roche)。在4%(重量/体积)的溶于1xPBS中的多聚甲醛中在4℃固定细胞10分钟。用DAPI染色DNA并用Fluoromount(Scientific Services)封片细胞。随机收集图片。每个实验进行3次。每次测定分析了超过2000个细胞。
增殖测定。为了评估增殖率,将2.5x104个细胞接种在盖玻片上。将细胞在含有10μM溴脱氧尿嘧啶(BrdU)(Roche)的培养基中孵育8小时。在24、48和72小时后在4%(重量/体积)的溶于1xPBS中的多聚甲醛中固定细胞10分钟,并然后在3N HCL中在室温孵育10分钟。用0.1%(体积/体积)的Triton-X100(在3%的溶于1xPBS的BSA中)在4℃渗透细胞30分钟。在室温孵育1∶500的针对BrdU的特异性抗体(G3G4)1小时。为了显色,应用抗小鼠IgG Alexa Fluor 488(Invitrogen,Molecular Probes)缀合物。用DAPI染色DNA并用Fluoromount(Scientific Services)封片细胞。在含有10%透析过的FCS的培养基中和在补充5mM L-脯氨酸(Sigma-Adrich)的培养基中也进行了实验。
吗啉代寡聚物和RNA注射。用于爪蟾Pycr1的25-bp吗啉代(MO)反义寡聚物从Gene Tools处获得并由以下序列组成:5′-AGCTCCTATGAAGCCCACACTCATG-3′。根据制造商的说明在无菌水中重悬MO至1mM的浓度。在二至四细胞阶段用4nl(33ng MO/注射)以放射状注射胚胎4次。在四细胞阶段以每个卵裂球200pg使用合成的人PYCR1 cDNA的加帽mRNA用于挽救实验。对于斑马鱼实验,针对斑马鱼Pycr1和斑马鱼Pycr2的MO从Gene Tools处获得:DrPycr1-MO5′-CAGCTCCGATAAATCCCACACTCAT-3′和DrPycr2-MO5′-CCGCTCCAATGAAGCCCACACTCAT-3′。在单细胞阶段用4nl(33ng MO/注射)或2nl每种MO(当共同注射时)注射胚胎。通过共同注射20pg或200pg人PYCR1加帽mRNA进行挽救实验,人PYCR1加帽mRNA使用SP6试剂盒(Ambion)体外转录得到。
胚胎学方法。受精、注射、整体原位杂交和TUNEL的实验方案可在http://www.reversade.com-a.googlepages.com/protocols30处找到。通过在黑暗中用溶于0.1X Barth的吖啶橙(2μg/ml)孵育蝌蚪30分钟进行活胚胎上的细胞死亡分析。在用0.1X Barth多次洗涤后,用Leica DFC 300FX照相机在荧光(480nm)下捕获胚胎图像。在阶段22时,在切开小切口后通过腹部外胚层加入去绒毛膜胚胎上进行联体生活。在1X Barth中培养联体生活胚胎直到痊愈并转移至1X Steinberg溶液。使用配备来自Leica的ICD照相机的立体显微镜M205FA在连续的焦平面上捕获胚胎图像。然后使用Photoshop CS3将图像合并为单张图片。
产生用于皮肤移植的试验动物。为了在试验动物上得到分离的皮瓣,在裸小鼠的主题区的三侧切开切口。在切割前,通过腹膜内氯胺酮麻醉裸小鼠。从表1中提及的家族患者处得到人皮用于移植至裸小鼠。人皮移植物与在裸小鼠上产生的皮瓣具有大约相同的大小和结构。人皮移植物或者立即使用,或在含10%牛血清的RPMI-1640中于4℃储存至多约72小时或直到用于移植。为了将人皮移植物移植到裸小鼠上,用外科手术将人皮移植物附着在裸小鼠的分离的皮瓣区的皮下表面。在适当的地方缝合皮瓣和人皮移植物,产生在皮层之间夹有脉管系统的夹层结构,从而使基本上所有离开皮瓣的血液流经分离的脉管系统。一旦人皮和裸小鼠的患病皮肤区长在一起形成整合的皮瓣,形成血管的皮瓣通过皮下通道移动到小鼠背侧,并在适当的地方缝合用于检测。为了防止对人皮移植物的排斥,为小鼠提供25mg/kg/天剂量的环孢霉素皮下注射。
检索码。Genbank Refseq DNA:智人(Homo sapiens)PYCR1同种型A NM_006907.2,智人PYCR1同种型B NM_153824.1,光滑爪蟾(Xenopus laevis)PYCR1 NM_001091619,斑马鱼(Danio rerio)PYCR1BC095354;斑马鱼PYCR2 BC060905。
描述本发明的说明性实施例
图1具有PYCR1相关常染色体隐性早衰样de Barsy综合征的患者的表型特征。(a)具有典型的三角形脸的来自家族DI的患病的9个月龄女婴,(b)在来自家族DT的6岁患病男童中的类似的脸部外观。(c)来自家族TP的最初被诊断为皱皮综合征的7岁患病女童。注意典型的脸部完全形态,包括凸颌,(d)在来自家族HB的患病个体中手背处的皮肤起皱和典型的内收的拇指。(e-h)来自家族DI的患病个体的皮肤活检中发现的情况。(e,f)Weigert染色显示,和对照相比在网状真皮中稀疏、变薄和破碎的弹性纤维,比例尺100μm。(g,h)超微结构分析证实,和对照相比在来自家族DI的患病个体中显著减少的弹性纤维(箭头)大小和纤维状和无定形成分二者的减少,比例尺500nm。(i)纯合性作图得到在染色体17q25上在rs8065431和rs1046896标记物之间的2.8Mb的最小候选区。仅显示了4个信息量最多的系谱。(j)基因组捕获然后是最小候选区(从72.05扩展至78.77Mb)的下一代测序。在来自家族GO的患者中7次测序出胞嘧啶至胸腺嘧啶的序列变化。此碱基变化导致在PYCR1基因编码的蛋白质中的单个p.Arg119His突变。
图2PYCR1突变的效果,(a)在来自对照和患者的原代皮肤成纤维细胞中的PYCR1蛋白质表达的蛋白质印迹分析。ACTIN用作上样对照。注意PYCR1表达在患病个体DI和SJ中的缺乏,而EU和TP显示了显著的降低,(b-f)在皮肤成纤维细胞中PYCR1和P5CS的免疫荧光检测,(b)在对照成纤维细胞中PYCR1和线粒体基质蛋白P5CS共定位。在来自患者DI(e)和SJ(d)的成纤维细胞中检测不到PYCR1的免疫染色信号。相比之下,在来自TP(c)和EU(d)的成纤维细胞中,在线粒体中的PYCR1染色和对照相比强度减少。注意在DI、SJ和TP中异常的线粒体网络。比例尺20μm。
图3PYCR1的丧失导致对氧化胁迫的提高的敏感性。(a,b)线粒体形态学的超微结构分析。尽管(a)在对照成纤维细胞中线粒体具有正常排列的嵴,但是(b)在来自患病个体DI的成纤维细胞中线粒体显示了剧烈改变的嵴和减少的直径,比例尺:1μm。(c,d)在氧化胁迫下线粒体形态的改变。加入500μM H2O2至细胞培养基10分钟导致来自家族SJ的患病个体的成纤维细胞中线粒体网络的坍塌(d),在对照细胞中管状线粒体网络大部分保持完整(c),比例尺:20μm。(e)在氧化胁迫下对线粒体形态学改变的定量。在没有氧化胁迫时(灰色条)大多数对照(n=2)和患者(n=4)细胞展示管状线粒体。观察到仅少数具有破碎的或中间形态的细胞。相比之下,在氧化胁迫下(黑色条),在患者细胞中具有破碎的线粒体的细胞数比在对照中的增加得更多。将来自2个独立实验的数据平均。(f)在氧化胁迫后24小时通过TUNEL定量凋亡细胞死亡。来自对照(n=2)和患病个体(n=4)的成纤维细胞在正常培养条件下(对照)在凋亡率中没有差异。与200μM H2O2孵育10分钟后24小时在来自患病个体的细胞中观察到凋亡的5倍增加(p=0.026)。将数字相对对照实验中的对照细胞归一化(n=1)。
图4Pycr1爪蟾吗啉突变体的表型。(a)从细菌、植物、昆虫到脊椎动物,PYCR1在进化上是保守的。(b)用于爪蟾Pycr1的翻译阻断吗啉代寡聚物的设计。(c)在阶段30时的对照胚胎。(d)在四细胞阶段在每个卵裂球中注射的Pycr1吗啉突变体不能长出尾巴并具有发育不全的眼睛,(e)背部MO注射损伤眼睛但不损伤尾巴的发育,(f)腹部MO注射损害尾巴但不损伤眼睛的发育,提示Pycr1是细胞自主所必须的。白色箭头指向皮肤皱纹,其在阶段40时发育为外胚层水肿。(g)用前脑/中脑标记物Otx2和体节标记物MyoD染色的阶段23的对照蝌蚪。(h)Pycr1的背部耗尽影响Otx2标记的背前部结构但不影响MyoD标记的腹后部结构。(i)Pycr1的腹部耗尽影响MyoD标记的腹后部结构但不影响Otx2标记的背前部结构。(j)在游泳蝌蚪阶段的对照胚胎。(l)Pycr1MO注射的胚胎经历严重的生长迟缓并在整个身体上展示大的外胚层水肿,(k)在阶段45时的对照胚胎的组织学皮肤切片显示由外侧周皮和内侧知觉层组成的双层表皮,(m)具有增大的细胞、核和细胞突出的表皮的瓦解的构造。
图5在Pycr1吗啉突变体中的皮肤发育不全伴随自发的凋亡并且不依赖于贫血,(a)在阶段30时的对照胚胎。(a′)(a)中显示的胚胎的吖啶橙背景染色,(b)仅由腹部MO注射造成的Pycr1吗啉突变体。(b’)(b)中显示的胚胎中垂死细胞的吖啶橙标记(深绿)。注意仅胚胎的腹后部一半(来源于注射的腹部卵裂球)正经历凋亡。(c)在阶段33时的蝌蚪中的TUNEL染色指示少量凋亡细胞(插图:在阶段25时的对照)。(d)Pycr1吗啉突变体在阶段33时相比对照具有显著增加的垂死细胞数(插图:阶段25)。(e)在阶段25时的Scl表达标记了对照胚胎的腹部外胚层中原始造血作用的位点。(f)在遭受贫血的Pycr1吗啉突变体中缺乏Scl表达(补充图5)。(g)在阶段22时在Pycr1耗尽的蝌蚪(顶部)和对照(底部)之间进行的联体生活不能挽救凋亡(插图:阶段33)、生长迟缓和皮肤缺陷,尽管共享血液循环(补充图5)。(h)组织学染色显示Pycr1联体生活吗啉突变体胚胎的表皮相比对照依然是无组织的,(i)在阶段45时的联体生活的对照蝌蚪表皮的组织学切片显示正常的皮肤构造。
图9通过过表达人野生型Pycr1 mRNA而不是突变体Pycr1K215-D319del mRNA部分挽救Pycr1吗啉突变体表型。(a)在阶段42时的对照蝌蚪。(b)Pycr1耗尽的蝌蚪,(c)注射了800pg野生型人Pycr1的合成的mRNA的蝌蚪。(d)注射了800pg野生型人Pycr1的合成的mRNA的Pycr1耗尽的蝌蚪,注意相对b被挽救的生长迟缓。(e)注射800pg突变体K215-D319del人PYCR1合成的mRNA没有效果,(f)注射800pg突变体K215-D319del人PYCR1的合成的mRNA没有挽救Pycr1耗尽的蝌蚪的生长迟缓。
图10联体生活减轻了在Pycr1吗啉突变体中的血液缺陷,(a)在阶段30时在对照蝌蚪中循环的红血球和搏动的心脏的动画。(b)在阶段30时在Pycr1吗啉突变体中搏动的心脏的动画,尽管缺乏循环的红血球,(c)在阶段45时在联体生活胚胎中Pycr1吗啉突变体(顶部)和对照蝌蚪(底部)之间的共享的血液循环的动画。
图11在斑马鱼中敲低Pycr1和Pycr2导致畸形、表皮萎缩和增加的凋亡。(a-h)在阶段24h时注射了20pg人PYCR1 mRNA的对照、Pycr1吗啉突变体、Pycr2吗啉突变体、Pycr1+2吗啉突变体和Pycr1+2吗啉突变体斑马鱼。(f-h)在阶段48h时注射了20pg人PYCR1 mRNA的对照、Pycr1+2吗啉突变体和Pycr1+2吗啉突变体斑马鱼。注意吗啉突变体鱼的减少的长度、异常弯曲的尾巴和卵黄囊周围的表皮的松散。当Pycr1和Pycr2同时被敲低时表型的严重程度增加。在用20pg人PYCR1 mRNA挽救吗啉突变体表型后仅观察到轻微的变化。(i,j)在Pycr1+2吗啉突变体中的真皮萎缩。在48小时大的对照鱼中(i)双层表皮围绕卵黄囊。在Pycr1+2吗啉突变体中此表皮是萎缩的。Goldner三色染色,(k-m)在阶段24h时凋亡细胞的吖啶橙染色。注意在吗啉突变体中凋亡细胞数的显著增加和共注射人PYCR1 mRNA后表型的几乎完全逆转。(n-p)尾巴中凋亡细胞的吖啶染色,较高的放大倍数。
图12显示了PYCR1基因的氨基酸序列(Swiss Prot检索号P32322)。
在此说明书中对以前出版的文献的列表或讨论没有必要被视为承认所述文献是现有技术的一部分或是一般的普通知识。所有列出的文献以其整体引入本文作为参考。
已在本文中宽泛地和一般地描述了本发明。在所述一般公开范围内的每个较狭义的种类和亚属组也构成本发明的部分。这包括本发明的一般性描述以及从属中去除任一主题的条件或否定性限制,不管去除的内容是否在本文中特别引用。
其他实施方案在以下权利要求范围内。另外,当依照马库什组描述本发明的特征或方面时,本领域技术人员将承认因此也依照马库什组的任意单个成员或成员的亚组描述本发明。
在本说明书中引用了以下参考文献
1.Kielty,CM.Elastic fibres in health and disease.Expert Rev Mol Med 8,1-23(2006).
2.Zhang,M.C.et al.Cutis laxa arising from frameshift mutations in exon 30 of theelastin gene(ELN).J Biol Chem 274,981-6(1999).
3.Megarbane,H.et al.An Autosomal-Recessive Form of Cutis Laxa Is Due toHomozygous Elastin Mutations,and the Phenotype May Be Modified by aHeterozygous Fibulin 5 Polymorphism.J Invest Dermatol(2009).
4.Hucthagowder,V.et al.Fibulin-4:a novel gene for an autosomal recessive cutislaxa syndrome.Am J Hum Genet 78,1075-80(2006).
5.Loeys,B.et al.Homozygosity for a missense mutation in fibulin-5(FBLN5)results in a severe form of cutis laxa.Hum Mol Genet 11,2113-8(2002).
6.Hennies,H.C.et al.Gerodermia osteodysplastica is caused by mutations inSCYL1BP1,a Rab-6 interacting golgin.Nat Genet 40,1410-2(2008).
7.Kornak,U.et al.Impaired glycosylation and cutis laxa caused by mutations in thevesicular H+-ATPase subunit ATP6V0A2.Nat Genet 40,32-4(2008).
8.de Barsy,A.M.,Moens,E.& Dierckx,L.Dwarfism,oligophrenia anddegeneration of the elastic tissue in skin and cornea.A new syndrome?HelvPaediatr Acta 23,305-13(1968).
9.Van Maldergem,L.et al.Cobblestone-like brain dvsgenesis and alteredglycosylation in congenital cutis laxa,Debre type.Neurology 71,1602-8(2008).
10.Kivuva,E.C.,Parker,M.J.,Cohen,M.C.,Wagner,B.E.& Sobey,G.De Barsysyndrome:a review of the phenotype.Clin Dysmorphol 17,99-107(2008).
11.Al-Gazali,L.I.,Sztriha,L.,Skaff,F.& Haas,D.Gerodermia osteodysplastica andwrinkly skin syndrome:are they the same?Am J Med Genet 101,213-20(2001).
12.Hamamy,H.,Masri,A.& Ajlouni,K.Wrinkly skin syndrome.Clin ExpDermatol 30,590-2(2005).
13.Nanda,A.et al.Gerodermia osteodysplastica/wrinkly skin syndrome:report ofthree patients and brief review of the literature.Pediatr Dermatol 25,66-71(2008).
14.Kunze,J.et al.De Barsy syndrome--an autosomal recessive,progeroid syndrome.Eur J Pediatr 144,348-54(1985).
15.Rajab,A.et al.Geroderma Osteodysplasticum and Wrinkly Skin Syndrome in 22patients from Oman.Am J Med Genet(in press)(2008).
16.Guerra,D.et al.The De Barsy syndrome.J Cutan Pathol 31,616-24(2004).
17.Martin,G.M.Genetic modulation of senescent phenotypes in Homo sapiens.Cell120,523-32(2005).
18.Mitsubuchi,H.,Nakamura,K.,Matsumoto,S.& Endo,F.Inborn errors of prolinemetabolism.J Nutr 138,2016S-2020S(2008).
19.Baumgartner,M.R.et al.Delta1-pyrroline-5-carboxylate synthase deficiency:neurodegeneration,cataracts and connective tissue manifestations combined withhyperammonaemia and reduced ornithine,citrulline,arginine and proline.Eur JPediatr 164,31-6(2005).
20.Bicknell,L.S.et al.A missense mutation in ALDH18A1,encoding Delta1-pyrroline-5-carboxylate synthase(P5CS),causes an autosomal recessiveneurocutaneous syndrome.Eur J Hum Genet 16,1176-86(2008).
21.Baumgartner,M.R.et al.Hypera mmonemia with reduced ornithine,citrulline,arginine and proline:a new inborn error caused by a mutation in the geneencoding delta(1)-pyrroline-5-carboxylate synthase.Hum Mol Genet 9,2853-8(2000).
22.Hucthagowder,V.et al.Loss-of-Function Mutations in ATP6V0A2 ImpairVesicular Trafficking,Tropoelastin Secretion,and Cell Survival.Hum Mol Genet(2009).
23.Krishnan,N.,Dickman,M.B.& Becker,D.F.Proline modulates the intracellularredox environment and protects mammalian cells against oxidative stress.FreeRadic Biol Med 44,671-81(2008).
24.Phang,J.M.,Pandhare,J.& Liu,Y.The metabolism of proline asmicroenvironmental stress substrate.J Nutr 138,2008S-2015S(2008).
25.Hagedorn,C.H.& Phang,J.M.Transfer of reducing equivalents intomitochondria by the interconversions of proline and delta 1-pyrroline-5-carboxylate.Arch Biochem Biophys 225,95-101(1983).
26.Meng,Z.et al.Crystal structure of human pyrroline-5-carboxylate reductase.JMol Biol 359,1364-77(2006).
27.Balaban,R.S.,Nemoto,S.& Finkel,T.Mitochondria,oxidants,and aging.Cell120,483-95(2005).
28.Abecasis,G.R.,Cherny,S.S.,Cookson,W.O.& Cardon,L.R.Merlin--rapidanalysis of dense genetic maps using sparse gene flow trees.Nat Genet 30,97-101(2002)
29.Thiele,H.& Nurnberg,P.HaploPainter:a tool for drawing pedigrees withcomplex haplotypes.Bioinformatics 21,1730-2(2005).
30.Hensey,C.& Gautier,J.Programmed cell death during Xenopus development:aspatio-temporal analysis.Dev Biol 203,36-48(1998).
31.Picoult-Newberg L.,et al,Mining SNPs from EST databases,Genome Res.9(1999)167-174
32.Altshuler D.et al.,An SNP map of human genome generated by reducedrepresentation shotgun sequencing,Nature 407(2000)513-516.
33.US Patent No.5,432,272
34.US Patent No.6,143,877
35.US Patent No.6,127,121
36.US Patent No.4,677,968
Claims (68)
1.吡咯啉-5-羧酸还原酶1(PYCR1)的突变蛋白,其中在如Swiss-Prot检索号P32322所示的PYCR1的野生型氨基酸序列的序列第4至220位和第222至266位中的至少1个氨基酸残基被突变。
2.PYCR1的突变蛋白,其包含如Swiss-Prot检索号P32322所示的PYCR1的野生型氨基酸序列的序列第4至266位中的至少1个氨基酸残基的突变,其中所述突变导致该突变蛋白相比于野生型蛋白降低的功能或功能的丧失。
3.根据权利要求1或2的突变蛋白,其中在序列第4、119、179、189、206、251、257和266位的至少1个氨基酸残基被突变。
4.根据权利要求3的突变蛋白,其中在序列第4位的氨基酸残基的突变是移码突变,所述移码突变导致编码PYCR1的野生型氨基酸序列的序列第50位的密码子为翻译终止密码子。
5.根据权利要求3的突变蛋白,其中在序列第119位的氨基酸残基被甘氨酸或组氨酸替换。
6.根据权利要求3的突变蛋白,其中在序列第179位的氨基酸残基被亲水性氨基酸替换。
7.根据权利要求6的突变蛋白,其中所述亲水性氨基酸是含有羟基的氨基酸。
8.根据权利要求7的突变蛋白,其中含有羟基的氨基酸是丝氨酸或苏氨酸。
9.根据权利要求3的突变蛋白,其中在序列第189位的氨基酸残基被疏水性氨基酸替换。
10.根据权利要求9的突变蛋白,其中所述疏水性氨基酸是脂肪族氨基酸。
11.根据权利要求10的突变蛋白,其中所述脂肪族氨基酸选自异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸。
12.根据权利要求3的突变蛋白,其中在序列第206位的氨基酸残基被芳香族氨基酸替换。
13.根据权利要求12的突变蛋白,其中所述芳香族氨基酸选自苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。
14.根据权利要求3的突变蛋白,其中在序列第206位的氨基酸残基被正电荷氨基酸替换。
15.根据权利要求14的突变蛋白,其中所述正电荷氨基酸是精氨酸或赖氨酸。
16.根据权利要求3的突变蛋白,其中在序列第251位的氨基酸残基被组氨酸替换。
17.根据权利要求3的突变蛋白,其中在序列第257位的氨基酸残基被亲水性氨基酸替换。
18.根据权利要求17的突变蛋白,其中所述亲水性氨基酸是含有羟基的氨基酸。
19.根据权利要求18的突变蛋白,其中所述含有羟基的氨基酸是丝氨酸或苏氨酸。
20.根据权利要求3的突变蛋白,其中在序列第266位的氨基酸残基被谷氨酰胺或天冬酰胺替换。
21.根据权利要求1至20中任一项的突变蛋白,其中在如Swiss-Prot检索号P32322所示的PYCR1的野生型氨基酸序列的至少1个氨基酸残基的突变是单核苷酸多态性(SNP)或选自取代、缺失、插入及其组合。
22.包含编码根据权利要求1至21中任一项的突变蛋白的核苷酸序列的核酸分子。
23.根据权利要求22的核酸分子,其中在所述核苷酸序列上插入或缺失至少一个核苷酸。
24.根据权利要求22或23的核酸分子,其中所述核苷酸序列的至少一个剪接位点被突变。
25.测定受试者中具有与吡咯啉-5-羧酸还原酶1(PYCR1)有关的年龄相关疾病的倾向的方法,所述方法包括分析从受试者得到的核酸样品中编码根据权利要求1至21中任一项的突变蛋白的核苷酸序列的存在,其中所述核苷酸序列的存在指示受试者患上或有风险患上年龄相关疾病的倾向。
26.根据权利要求25的方法,其中所述年龄相关疾病选自皮肤松弛(皱皮综合征)、De Barsy综合征和骨发育异常性老年状皮肤。
27.包含编码根据权利要求1至21中任一项的突变蛋白的核苷酸序列的核酸分子在诊断或测定患上与PYCR1有关的年龄相关疾病的倾向中的用途。
28.根据权利要求27的用途,其中所述年龄相关疾病选自皮肤松弛(皱皮综合征)、De Barsy综合征和骨发育异常性老年状皮肤。
29.鉴定能够修饰PYCR1基因表达的化合物的方法,所述方法包括:
a.使目的化合物接触包含编码吡咯啉-5-羧酸还原酶1(PYCR1)或其功能片段或突变体的核苷酸序列的核酸分子,和
b.测量编码吡咯啉-5-羧酸还原酶1(PYCR1)或其功能片段或功能突变体的核苷酸序列的表达。
30.根据权利要求29的方法,其还包括:
将从步骤(b)得到的测量结果与未加入目的化合物的对照测量相比较。
31.根据权利要求29或30的方法,其中所述化合物增加PYCR1基因的表达。
32.修饰PYCR1基因在细胞中的表达的方法,所述方法包括将包含编码吡咯啉-5-羧酸还原酶1(PYCR1)或其功能片段或功能突变体的核苷酸序列的核酸分子引入细胞。
33.根据权利要求32的方法,其中所述PYCR1基因的表达提高。
34.根据权利要求32或33的方法,其中所述细胞被包含在哺乳动物中。
35.根据权利要求34的方法,其中所述哺乳动物是人或啮齿动物。
36.根据权利要求32至35中任一项的方法,其中所述核酸分子与调控序列有效连接以允许所述核酸分子表达。
37.根据权利要求36的方法,其中所述调控序列包含启动子序列。
38.根据权利要求36或37的方法,其中所述核酸分子被包含在载体中。
39.治疗患有与PYCR1有关的年龄相关疾病或具有患上与PYCR1有关的年龄相关疾病的风险的受试者的方法,所述方法包括将包含编码吡咯啉-5-羧酸还原酶1(PYCR1)或其功能片段或功能突变体的核苷酸序列的核酸分子引入受试者。
40.治疗患有与PYCR1有关的年龄相关疾病或具有患上与PYCR1有关的年龄相关疾病的风险的受试者的方法,所述方法包括对受试者施用能够修饰PYCR1基因表达的化合物。
41.权利要求40的方法,其中所述化合物已通过权利要求29的方法鉴定。
42.基因改造的动物,其中所述基因改造的动物包含编码吡咯啉-5-羧酸还原酶1(PYCR1)的核酸,并且其中所述核酸是失活的。
43.根据权利要求42的基因改造的动物,其中所述失活的核酸导致PYCR1的功能丧失。
44.根据权利要求42或43的基因改造的动物,其中所述动物是爪蟾或鱼。
45.根据权利要求42至44中任一项的基因改造的动物,其中所述动物是哺乳动物。
46.根据权利要求45的基因改造的动物,其中所述哺乳动物是人或啮齿动物。
47.修饰PYCR1基因在动物中表达的方法,所述方法包括对动物施用能够修饰PYCR1基因表达的化合物。
48.根据权利要求47的方法,其中所述化合物包含能够修饰PYCR1基因表达的核酸分子。
49.根据权利要求48的方法,其中所述核酸分子选自反义RNA、短干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、肽核酸(PNA)及其组合。
50.鉴定能够修饰PYCR1基因表达的化合物的方法,所述方法包括:
a.对根据权利要求42至46中任一项的动物施用目的化合物;和
b.测定所述化合物是否能够修饰PYCR1基因的表达。
51.根据权利要求50的方法,其中所述化合物增加PYCR1基因的表达。
52.根据权利要求50或51的方法,其中将所述化合物以化妆品组合物的形式配制。
53.鉴定能够修饰PYCR1基因表达的化合物的方法,所述方法包括:
a.提供包含至少一层活动物皮的分离的皮瓣,所述皮瓣被附着在试验动物上;和
b.对该活动物皮应用目的化合物。
54.根据权利要求53的方法,其中所述皮瓣包括表达如权利要求1至21任一项中定义的突变蛋白的细胞。
55.根据权利要求54的方法,其中所述细胞是成纤维细胞。
56.根据权利要求53至55中任一项的方法,其中所述皮瓣还包含一层活动物皮。
57.根据权利要求53至56中任一项的方法,其中所述皮瓣在一个表面包含活人皮并且在另一个表面包含活动物皮。
58.根据权利要求53至57中任一项的方法,其中所述皮瓣由分离的脉管系统供给。
59.根据权利要求58的方法,其中所述分离的脉管系统附着在试验动物上。
60.根据权利要求59的方法,其进一步包括从分离的脉管系统中取出至少一个血液样品,其中分析取出的血液含量。
61.根据权利要求53至59任一项的方法,其进一步包括从所述皮瓣得到DNA样品以测量PYCR1基因的表达。
62.根据权利要求53至61任一项的方法,其中所述活动物皮与试验动物是相同或不同的物种。
63.根据权利要求62的方法,其中所述试验动物是哺乳动物。
64.根据权利要求63的方法,其中所述哺乳动物是人或啮齿动物。
65.根据权利要求64的方法,其中所述啮齿动物选自小鼠、大鼠、松鼠、花栗鼠、囊地鼠、箭猪、海狸、仓鼠、沙鼠、豚鼠、南美栗鼠、草原土拨鼠和土拨鼠。
66.根据权利要求65的方法,其中所述啮齿动物是无胸腺的。
67.根据权利要求53至66中任一项的方法,其中将所述目的化合物配制为化妆品组合物的形式。
68.根据权利要求67的方法,其中所述化妆品组合物选自凝胶、软膏、乳膏、洗剂、精华素、糊剂、肥皂、气溶胶、可溶性片剂、粉末、棒状物、水基或油基悬浮剂和乳剂。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US18093709P | 2009-05-26 | 2009-05-26 | |
US61/180,937 | 2009-05-26 | ||
PCT/IB2010/001239 WO2010136877A1 (en) | 2009-05-26 | 2010-05-26 | Muteins of the pyrroline-5-carboxylate reductase 1 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102482337A true CN102482337A (zh) | 2012-05-30 |
Family
ID=43222201
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2010800226864A Pending CN102482337A (zh) | 2009-05-26 | 2010-05-26 | 吡咯啉-5-羧酸还原酶1的突变蛋白 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US20120144511A1 (zh) |
EP (1) | EP2435470A4 (zh) |
JP (1) | JP2012527883A (zh) |
KR (1) | KR20120058453A (zh) |
CN (1) | CN102482337A (zh) |
SG (2) | SG174447A1 (zh) |
WO (1) | WO2010136877A1 (zh) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110538179A (zh) * | 2018-05-29 | 2019-12-06 | 余时沧 | Yg1702在制备aldh18a1特异性抑制剂中的应用 |
CN111789776A (zh) * | 2020-08-03 | 2020-10-20 | 西安英创生物技术有限公司 | Pycr1蛋白在制备抗氧化抗皱面膜中的应用及抗氧化抗皱面膜 |
CN111971388A (zh) * | 2018-02-02 | 2020-11-20 | 隆萨有限公司 | 细胞选择和修饰细胞代谢的方法 |
CN113604444A (zh) * | 2021-07-27 | 2021-11-05 | 华东理工大学 | 一种催化活性提高的羧酸还原酶突变体及其编码基因、基因工程菌以及应用 |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2539452B1 (en) * | 2010-02-22 | 2016-07-27 | CuRNA, Inc. | Treatment of pyrroline-5-carboxylate reductase 1 (pycr1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to pycr1 |
CN111529694A (zh) * | 2020-05-11 | 2020-08-14 | 昆明医科大学第一附属医院 | 人吡咯林-5-羧酸还原酶作为制备治疗皮肤创伤药物的应用 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4677968A (en) * | 1986-01-14 | 1987-07-07 | University Of Utah Research Foundation | Methods of testing the reaction of various substances on living human skin |
US20020081691A1 (en) * | 1998-06-18 | 2002-06-27 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Delta 1-pyrroline-5-carboxylate reductase homolog |
WO2002099043A2 (en) * | 2001-06-05 | 2002-12-12 | Exelixis, Inc. | P5CRS AS MODIFIERS OF THE p53 PATHWAY AND METHODS OF USE |
WO2004087992A2 (fr) * | 2003-03-28 | 2004-10-14 | Arkema | Procede de formation d'un revetement d'oxydes metalliques sur un substrat electroconducteur, cathode activee en resultant et son utilisation pour l'electrolyse de solutions aqueuses de chlorures de metaux alcalins. |
WO2007131293A1 (en) * | 2006-05-16 | 2007-11-22 | Proteome Systems Limited | Methods of diagnosis and treatment of m. tuberculosis infection and reagents therefor vi |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5432272A (en) | 1990-10-09 | 1995-07-11 | Benner; Steven A. | Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases |
US6143877A (en) | 1997-04-30 | 2000-11-07 | Epoch Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides including pyrazolo[3,4-D]pyrimidine bases, bound in double stranded nucleic acids |
US6127121A (en) | 1998-04-03 | 2000-10-03 | Epoch Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides containing pyrazolo[3,4-D]pyrimidines for hybridization and mismatch discrimination |
AU2003299792A1 (en) * | 2003-02-27 | 2004-09-28 | Paradigm Genetics, Inc. | Methods for the identification of inhibitors of pyrroline-5-carboxylate reductase as antibiotics |
-
2010
- 2010-05-26 US US13/322,750 patent/US20120144511A1/en not_active Abandoned
- 2010-05-26 SG SG2011067220A patent/SG174447A1/en unknown
- 2010-05-26 EP EP10780124.3A patent/EP2435470A4/en not_active Withdrawn
- 2010-05-26 SG SG10201402634SA patent/SG10201402634SA/en unknown
- 2010-05-26 WO PCT/IB2010/001239 patent/WO2010136877A1/en active Application Filing
- 2010-05-26 CN CN2010800226864A patent/CN102482337A/zh active Pending
- 2010-05-26 KR KR1020117026377A patent/KR20120058453A/ko not_active Application Discontinuation
- 2010-05-26 JP JP2012512465A patent/JP2012527883A/ja active Pending
-
2014
- 2014-12-24 US US14/583,083 patent/US9862986B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2017
- 2017-11-21 US US15/820,364 patent/US20180105860A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4677968A (en) * | 1986-01-14 | 1987-07-07 | University Of Utah Research Foundation | Methods of testing the reaction of various substances on living human skin |
US20020081691A1 (en) * | 1998-06-18 | 2002-06-27 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Delta 1-pyrroline-5-carboxylate reductase homolog |
WO2002099043A2 (en) * | 2001-06-05 | 2002-12-12 | Exelixis, Inc. | P5CRS AS MODIFIERS OF THE p53 PATHWAY AND METHODS OF USE |
WO2004087992A2 (fr) * | 2003-03-28 | 2004-10-14 | Arkema | Procede de formation d'un revetement d'oxydes metalliques sur un substrat electroconducteur, cathode activee en resultant et son utilisation pour l'electrolyse de solutions aqueuses de chlorures de metaux alcalins. |
WO2007131293A1 (en) * | 2006-05-16 | 2007-11-22 | Proteome Systems Limited | Methods of diagnosis and treatment of m. tuberculosis infection and reagents therefor vi |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
MATTHIAS R.BAUMGARTNER, ET AL.: "Hyperammonemia with reduced ornithine, citrulline, arginine and proline: a new inborn error caused by a mutation in the gene encoding 1-pyrroline-5-carboxylate synthase", 《HUMAN MOLECULAR GENETICS》, vol. 9, no. 19, 30 November 2000 (2000-11-30), pages 2853 - 2858, XP008157396, DOI: doi:i10.1093/hmg/9.19.2853 * |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111971388A (zh) * | 2018-02-02 | 2020-11-20 | 隆萨有限公司 | 细胞选择和修饰细胞代谢的方法 |
CN111971388B (zh) * | 2018-02-02 | 2023-01-31 | 隆萨有限公司 | 细胞选择和修饰细胞代谢的方法 |
CN110538179A (zh) * | 2018-05-29 | 2019-12-06 | 余时沧 | Yg1702在制备aldh18a1特异性抑制剂中的应用 |
CN110538179B (zh) * | 2018-05-29 | 2021-08-17 | 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院 | Yg1702在制备aldh18a1特异性抑制剂中的应用 |
CN111789776A (zh) * | 2020-08-03 | 2020-10-20 | 西安英创生物技术有限公司 | Pycr1蛋白在制备抗氧化抗皱面膜中的应用及抗氧化抗皱面膜 |
CN113604444A (zh) * | 2021-07-27 | 2021-11-05 | 华东理工大学 | 一种催化活性提高的羧酸还原酶突变体及其编码基因、基因工程菌以及应用 |
CN113604444B (zh) * | 2021-07-27 | 2023-07-14 | 华东理工大学 | 一种催化活性提高的羧酸还原酶突变体及其编码基因、基因工程菌以及应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20120144511A1 (en) | 2012-06-07 |
US9862986B2 (en) | 2018-01-09 |
EP2435470A4 (en) | 2013-05-29 |
JP2012527883A (ja) | 2012-11-12 |
US20150240285A1 (en) | 2015-08-27 |
WO2010136877A1 (en) | 2010-12-02 |
SG174447A1 (en) | 2011-10-28 |
KR20120058453A (ko) | 2012-06-07 |
SG10201402634SA (en) | 2014-09-26 |
US20180105860A1 (en) | 2018-04-19 |
EP2435470A1 (en) | 2012-04-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Welz et al. | BMAL1-driven tissue clocks respond independently to light to maintain homeostasis | |
Verri et al. | Molecular and functional characterisation of the zebrafish (Danio rerio) PEPT1‐type peptide transporter 1 | |
Gerido et al. | Connexin disorders of the ear, skin, and lens | |
Ehrlich et al. | Differential evolution of the epidermal keratin cytoskeleton in terrestrial and aquatic mammals | |
Stefanini et al. | Trichothiodystrophy: from basic mechanisms to clinical implications | |
CN104039960B (zh) | 用于治疗和诊断与五羟色胺‑、肾上腺素‑、去甲肾上腺素‑、谷氨酸‑和促肾上腺皮质素释放激素相关的病症的微rna和包含微rna的组合物 | |
JP2019501657A (ja) | 生体外培養工程中の体細胞の複製能拡張法 | |
US20180105860A1 (en) | Muteins of the pyrroline-5-carboxylate reductase 1 | |
US20130034527A1 (en) | Mitochondrial enhancement of cells | |
Li et al. | SUMO1-activating enzyme subunit 1 is essential for the survival of hematopoietic stem/progenitor cells in zebrafish | |
Hinman et al. | Zebrafish mbnl mutants model physical and molecular phenotypes of myotonic dystrophy | |
Weber et al. | Activation of Pax7-positive cells in a non-contractile tissue contributes to regeneration of myogenic tissues in the electric fish S. macrurus | |
Han et al. | Transcriptome profiling of developing ovine fat tail tissue reveals an important role for MTFP1 in regulation of adipogenesis | |
Bayle et al. | Hyperphenylalaninemia and impaired glucose tolerance in mice lacking the bifunctional DCoH gene | |
US20110212081A1 (en) | Krüppel-like factors and fat regulation | |
O'Connor et al. | AGO HITS-CLIP reveals distinct miRNA regulation of white and brown adipose tissue identity | |
WO2016034095A1 (zh) | 在骨形成中发挥调控作用的应力敏感性microRNA | |
CN109810981A (zh) | 多聚核苷酸及其在心血管疾病诊断和治疗中的应用 | |
KR20200121316A (ko) | Icam-1 마커 및 이의 응용 | |
Feng et al. | Uterine transcriptome analysis reveals mechanism underlying the ultrastructure differences of eggshell in young and aged laying hens | |
Morgan | Understanding the role of HACD enzymes and very long chain fatty acids in muscle development and disease | |
KR102352161B1 (ko) | Tonsl 유전자를 이용한 스포나스트림 이형성증의 진단 마커 | |
Yao | The Role of Mitochondrial Plasticity for Intermittent Fasting Mediated Longevity | |
Sotiropoulou | Is the Proline Metabolic Pathway Driving Human Skin Ageing? | |
Xia et al. | Organoid Xenograft Model of Polycystic Kidney Disease Reveals Context-Dependent Cross-Talk Between Primary Cilium and Autophagy in Cystogenesis: TH-OR65 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120530 |