CN111529694A - 人吡咯林-5-羧酸还原酶作为制备治疗皮肤创伤药物的应用 - Google Patents

人吡咯林-5-羧酸还原酶作为制备治疗皮肤创伤药物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开人吡咯林‑5‑羧酸还原酶作为制备治疗皮肤创伤药物的应用，本发明通过建立大鼠皮肤创伤模型，采用人吡咯林‑5‑羧酸还原酶(P5CR)进行治疗证实，P5CR治疗组大鼠愈合率加快，创缘组织炎症浸润程度较轻，转化生长因子‑β1(transforming growth factor‑β1，TGF‑β1)表达高峰较早出现，说明P5CR在大鼠皮肤组织创伤愈合及修复过程中发生作用，因此人吡咯林‑5‑羧酸还原酶可作为制备治疗皮肤创伤的药物。

Description

人吡咯林-5-羧酸还原酶作为制备治疗皮肤创伤药物的应用
技术领域
本发明涉及一种药物的应用，具体涉及人吡咯林-5-羧酸还原酶作为制备治疗皮肤创伤药物的应用。
背景技术
创伤愈合是物种之间的一种保守进化的过程，包含空间和时间的交错，由三个互相重叠的阶段组成：炎症期、增殖期和重塑期[SeifertAW,2012；7(4):e32875，RichardsonR,2013Jun；133(6):1655-65]。炎症期以血小板聚集、凝血和白细胞迁移为特征；增殖期的特征是再上皮化、血管生成、纤维增生和伤口收缩；最后，重塑期发生在损伤后一个月的时间内，在此期间伴随胶原和基质蛋白的产生，真皮对损伤作出反应，然后恢复到其损伤前表型[KirsnerRS,1993Oct；11(4):629-40]。
吡咯啉-5-羧酸还原酶(P5CR)是普遍存在于原核和真核生物中的一种重要看家蛋白，是脯氨酸代谢途径的关键酶，可以将脯氨酸、鸟氨酸、精氨酸和谷氨酸的中间代谢产物5-吡咯啉羧酸(P5C)还原成为脯氨酸(Proline)，从而参与了脯氨酸生物合成的最后一步反应[MengZ,LouZ,2006Sep；49(1):83-7]。P5CR不仅参与脯氨酸的合成，近年来研究表明其还可以诱导胶原的合成。脯氨酸是胶原蛋白的主要成分之一，胶原蛋白构成胶原纤维，而胶原纤维在皮肤中的分布最为广泛。因此P5CR可以通过调节脯氨酸和胶原的合成而在皮肤代谢中起到重要作用。目前研究已经证实P5CR的缺陷可以导致一种罕见的皮肤病，称为皮肤松弛症，致病的患者有早产儿特征[Reversade B,2009Sep；41(9):1016-21]。目前，尚未有将P5CR直接用于皮肤创伤愈合中的相关研究的报道。如果将P5CR用于皮肤创伤愈合的治疗，将具有广阔的应用前景。
研究发现P5CR是谷氨酸转化为脯氨酸过程中的重要辅酶，而转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)可以上调脯氨酸从头合成途径中所有酶的表达[Hamanaka RB,2019Nov；61(5):597-606]。这表明TGF-β可以通过调节P5CR的表达而影响脯氨酸的合成，进而在胶原蛋白的合成中发挥重要作用。转化生长因子-β1(TGF-β1)是TGF-β超家族成员之一，研究表明TGFβ1可以促进伤口愈合。TGFβ1不但可以刺激细胞外基质(ECM)的产生，而且还可以促进成纤维细胞中纤连蛋白和胶原的合成，从而促进损伤的修复[Roberts AB,1993；8(1):1-9]。另外，TGFβ1还可以抑制新合成胶原的降解[McAnultyRJ,1991Jan31；1091(2):231-5]。
发明内容
本发明的目的是提供了人吡咯林-5-羧酸还原酶作为制备治疗皮肤创伤药物的应用，具体为P5CR在创伤愈合的早期阶段可以促进的TGFβ1表达。
具体采用了以下设计结构及设计方案：
人吡咯林-5-羧酸还原酶作为制备治疗皮肤创伤药物的应用，本发明中所述的P5CR的制备方法如下：
(5)将P5CR置冰上20分钟，常温下放置1小时，30摄氏度温箱30分钟。
(6)缓冲液(20mMCAPS,0.5Msodium chloride,PH9.4)：常温下放置3-4小时，30摄氏度温箱30分钟。
(7)用缓冲液将P5CR稀释至终浓度0.0125mg/ml，配好后置于4摄氏度冰箱保存。
(8)还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)放于冰上化冻，常温下放置半小时，加入缓冲液稀释的P5CR中(按P5CR：NADPH＝100:1的比例加入)，配好后置于4摄氏度冰箱保存。
本发明中所述的皮肤创伤模型的建立方法如下：
(6)将36只12周龄(200～250g)的雄性清洁级Spargue-Dawley(SD)大鼠随机分为2组。
(7)实验前一天将2组大鼠后背部剃毛，然后采用8％硫化钠溶液脱毛，脱毛范围为背部两侧4cm，24小时后确认脱毛区域无损伤。
(8)实验时大鼠用3％戊巴比妥钠(50mg/Kg)腹腔注射麻醉。
(9)麻醉起效后，用70％乙醇消毒两遍，取一厚纱布，中间剪一大小2.5*2.5cm的孔，纱布浸水后置于脱毛区，沿孔在大鼠两侧背部对称部位各制造一2.5*2.5cm大小的全层皮肤创面。
(10)造模后大鼠单笼喂养，自由进食、饮水。
本发明的优点是：谷氨酸是脯氨酸合成的重要前体。谷氨酸先在吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)的作用下转化为吡咯啉-5-羧酸(P5C)，然后P5C又在P5CR的作用下转化为脯氨酸(胶原蛋白重要组成成分之一)。因而P5CR可以通过促进胶原蛋白的合成而促进皮肤创伤的愈合。本发明采用P5CR制备获得的治疗皮肤创伤模型的药物与常规的生理盐水治疗方式，以及采用P5CR制备获得的治疗皮肤创伤模型的药物与外用重组牛碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)治疗方式相比，证实采用人吡咯林-5-羧酸还原酶(P5CR)进行治疗后，大鼠愈合率加快，创缘组织炎症浸润程度较轻。
附图说明
图1为吡咯林-5-羧酸还原酶和外用重组牛碱性成纤维细胞生长因子治疗组大鼠创伤模型构建及皮肤创伤愈合情况，
其中：P5CR--吡咯林-5-羧酸还原酶治疗组；bFGF--外用重组牛碱性成纤维细胞生长因子治疗组；
图2为吡咯林-5-羧酸还原酶和生理盐水治疗组大鼠创伤模型构建及皮肤创伤愈合情况，
其中：P5CR--吡咯林-5-羧酸还原酶治疗组；NS--生理盐水治疗组；
图3为吡咯林-5-羧酸还原酶和外用重组牛碱性成纤维细胞生长因子治疗组大鼠伤口愈合率的比较，
其中：P5CR--吡咯林-5-羧酸还原酶治疗组；bFGF--外用重组牛碱性成纤维细胞生长因子治疗组；
图4为吡咯林-5-羧酸还原酶和生理盐水治疗组大鼠伤口愈合率的比较，
其中：P5CR--吡咯林-5-羧酸还原酶治疗组；NS--生理盐水治疗组；
图5为吡咯林-5-羧酸还原酶和外用重组牛碱性成纤维细胞生长因子治疗组大鼠皮肤创伤组织切片HE染色(第1、3、5、7、14天，×400)，
其中：P5CR--吡咯林-5-羧酸还原酶治疗组；bFGF--外用重组牛碱性成纤维细胞生长因子治疗组
图6为吡咯林-5-羧酸还原酶和生理盐水治疗组大鼠皮肤创伤组织切片HE染色(第1、3、5、7、14天，×400)，
其中：P5CR--吡咯林-5-羧酸还原酶治疗组；NS--生理盐水治疗组；
图7为吡咯林-5-羧酸还原酶和外用重组牛碱性成纤维细胞生长因子治疗组大鼠皮肤创伤组织切片免疫组化染色，
其中：P5CR--吡咯林-5-羧酸还原酶治疗组；bFGF--外用重组牛碱性成纤维细胞生长因子治疗组
图8为吡咯林-5-羧酸还原酶和生理盐水治疗组大鼠皮肤创伤组织切片免疫组化染色，
其中：P5CR--吡咯林-5-羧酸还原酶治疗组；NS--生理盐水治疗组；
图9为P5CR、bFGF、NS的创缘组织的MMP-1Western blot；
图10为P5CR、bFGF、NS的创缘组织的MMP-1Western blot的定量分析。
具体实施方式
下面结合附图以及具体的实施例对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明。
实施例
(一)分别采用P5CR、生理盐水、bFGF治疗皮肤创伤
(1)一组大鼠一侧创面局部外用P5CR(100μL/次)，另一侧创面局部外用生理盐水(100μL/次)，随机选择创面给药，作为P5CR治疗组和生理盐水治疗组。
(2)另一组大鼠一侧创面局部外用bFGF(100μL/次)，另一侧创面局部外用bFGF(100μL/次)，随机选择创面给药。
(3)2组大鼠分别于创伤后每天外用药物，一日一次，共14天。
(3)每天观察伤口创面表皮肉芽组织的生长情况，以及上皮组织的生长愈合情况，并拍照记录，记录的P5CR治疗组和生理盐水治疗组大鼠创伤模型构建及皮肤创伤愈合情况以及P5CR治疗组和bFGF治疗组大鼠创伤模型构建及皮肤创伤愈合情况分别如说明书附图1、图2所示，其中在说明书附图1中，左侧代表P5CR治疗的伤口。右侧代表bFGF治疗的伤口。“0-14”代表从创伤后开始至创伤后的第14天；从图1中可以看出，在创伤愈合过程中，二者治疗的创口愈合情况大致相同，伤后2天皮肤上皮细胞增殖活跃,所剩创面不规则；伤后4天创面已基本完成再上皮化；伤后5天创面有薄层上皮覆盖；伤后7天至11天创面周围明显上皮化,面积明显缩小,创面表面干痂；伤后12天痂皮脱落，痂下肉芽新鲜,呈颗粒状，上皮化明显。创面在伤后14d基本完全愈合,上皮表面有稀疏的细绒毛,愈合部位比正常皮肤处稍凹陷。
在说明书附图2中，左侧代表P5CR治疗的伤口，右侧代表NS治疗的伤口，“0-14”代表从创伤后开始至创伤后的第14天；从图2可以看到，伤后2天皮肤上皮细胞开始增殖,创面不规则，采用P5CR治疗的创口面积较NS治疗的创口面积明显缩小；伤后4天二者治疗的创面已基本完成再上皮化，但P5CR治疗的创口面积仍要小一些；伤后5天创面有薄层上皮覆盖；伤后7天至10天二者治疗的创面都出现明显上皮化,创口表面干痂，但P5CR治疗的创口面积缩小明显；伤后11天二者治疗后的创面痂皮脱落，痂下肉芽新鲜,呈颗粒状，上皮化明显，但P5CR治疗的创面痂皮脱落完全，而NS治疗的创面仍有痂皮覆盖。伤后14天P5CR治疗的创面基本完全愈合,但NS治疗的创面仍见少量痂皮覆盖。
(二)计算创伤面积
由于皮肤组织具有弹性，在创伤愈合过程中伤口会呈现椭圆形，因此我们利用椭圆面积计算公式计算创伤面积。椭圆面积计算：面积S＝πab/4，a代表长轴测量数据，b代表短轴测量数据。长轴和短轴长度的测定采用游标卡尺进行测量。分别于创伤模型建立后的第0至14天进行测量；根据创伤愈合率公式计算创伤愈合率。计算公式：创伤愈合率(％)＝(S1-Sn)/S1，S1指第一天的创伤面积，Sn指第n天的创伤面积，如说明书附图3-4所示，分别为P5CR治疗组和生理盐水治疗组大鼠伤口愈合率的比较和P5CR治疗组和bFGF治疗组大鼠伤口愈合率的比较，如说明书附图3、图4所示，横坐标代表时间，即从创伤的第1天至第14天，纵坐标代表创伤愈合率，由图3中可以看出，大鼠在创伤后的第1天，P5CR治疗和bFGF治疗的伤口愈合速率差别不大；在创伤后第2天至第6天，bFGF治疗的伤口愈合率要高于P5CR治疗的伤口愈合率；在创伤后的第7天至第14天，P5CR治疗和bFGF治疗的伤口愈合速率差别不大；由图4中可看出，大鼠在创伤后的第1天至第11天，P5CR治疗的伤口愈合率要高于NS治疗的伤口愈合率；在创伤后的创伤后第12天至第14天，P5CR治疗和NS疗的伤口愈合速率差别不大。
(三)建立创伤TGFβ1表达
分别于创伤形成后的第1、3、5、7、14天于各组随机取大鼠3只，3％戊巴比妥钠(50mg/Kg)腹腔注射麻醉后，沿原创口处切取周围0.5cm范围以内正常皮肤全层，包括表皮、真皮、皮下组织，将得到的大鼠皮肤在滤纸上铺展开，修剪后得到一带有创口及创周的近圆形皮肤组织。取材后将标本放入新鲜配置的10％中性福尔马林溶液中固定，用于免疫组化检测，另一部分置于冻存管内立即放入液氮中冻存并保存于-80℃冰箱中用于TGF-β1的测定。
(四)皮肤组织切处的制备与染色
分别于给药后的1、3、5、7、14天，取创伤愈合处皮肤组织固定，做皮肤组织石蜡切片，观察伤口愈合后炎性细胞浸润情况。
1.石蜡切片制备
(1)固定：将皮肤组织在10％中性福尔马林溶液中，室温浸泡24小时，然后置于4℃冰箱过夜；
(2)水洗：用蒸馏水冲洗已经固定的组织约30分钟；
(3)脱水：将蒸馏水冲洗后的组织标本依次放入75％乙醇4小时，80％乙醇4小时，95％乙醇Ⅰ2小时，95％乙醇Ⅱ2小时，100％乙醇Ⅰ70分钟，100％乙醇Ⅱ110分钟；
(4)透明：将组织块先放入二甲苯与乙醇等体积的混合液中10分钟，再置于纯二甲苯中进行透明，共两次，每次20分钟，使酒精完全脱除；
(5)浸腊：将组织放入滤纸中，然后放入溶有石蜡的烧杯中，将其置于60℃恒温箱中；
(6)包埋：将熔化的石蜡趁热倒入准备好的包埋模具，然后用加温的镊子将浸有石蜡的组织放入，待完全凝固后将其修整成相同大小的蜡块，并用序号标记；
(7)切片：将蜡块置于切片机上，调节蜡块与刀片至合适位置并固定好，调整切片机上的切片厚度为5μm，然后切片，每个标本取10张切片，切下的薄片放到加热的水中烫平，再将切片铺于载玻片上，然后将载玻片放入60℃的烤箱中烤片，石蜡切片用于HE染色及免疫组化。
2.HE染色
(1)将组织切片置于60℃烤箱中45-60分钟；
(2)脱蜡：将烤好的组织切片置入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各10分钟脱蜡；
(3)脱水：依次通过100％乙醇l分钟，100％乙醇l分钟，95％乙醇l分钟，90％乙醇l分钟，85％乙醇l分钟，自来水洗2分钟；
(4)将脱水组织切片浸入苏木精染液中5分钟，然后用自来水冲洗l分钟；
(5)用1％盐酸酒精分化5秒，再用自来水洗l分钟；
(6)用1％自来水返蓝30秒，再用自来水洗l分钟；
(7)浸入伊红染液3-5分钟，然后再用自来水洗30秒；
脱水：85％乙醇20秒，90％乙醇30秒，95％乙醇Ⅰ1分钟，95％乙醇Ⅱ1分
(8)钟，100％乙醇Ⅰ2分钟，100％乙醇Ⅱ2分钟；
(9)透明：二甲苯Ⅰ2分钟，二甲苯Ⅱ2分钟；
(10)封片：片子晾干后，用中性树胶封片。
如说明书附图5-6所示，分别为P5CR治疗组和生理盐水治疗组大鼠皮肤创伤组织切片HE染色和P5CR治疗组和bFGF治疗组大鼠皮肤创伤组织切片HE染色，“1、3、5、7、14”代表创伤后第1、3、5、7、14天。由图5中可以看出，采用P5CR治疗治疗的伤口：伤后第1天可见炎性细胞浸润，伤后第3天炎性细胞浸润增多，伤后第5天仍有炎性细胞浸润，但比第3天炎性细胞浸润减少，伤后第5天、第7天和第14天炎性浸润情况差别不大。bFGF治疗的伤口：伤后第1天可见炎性细胞浸润，伤后第3天炎性细胞浸润增多，伤后第5天仍有炎性细胞浸润，但比第3天炎性细胞浸润减少，伤后第5天、第7天和第14天炎性浸润情况差别不大。
由图5中可以看出，采用P5CR治疗治疗的伤口：伤后第1天可见炎性细胞浸润，伤后第3天炎性细胞浸润增多，伤后第5天仍有炎性细胞浸润，但比第3天炎性细胞浸润减少，伤后第5天、第7天和第14天炎性浸润情况差别不大。NS的伤口：伤后第1天可见大量炎性细胞浸润，伤后第3天仍见大量炎性细胞浸润增多，伤后第5天炎性细胞浸润减少，但比第3天炎性细胞浸润减少，伤后第5天、第7天和第14天炎性浸润情况差别不大。
3.免疫组化染色
(1)脱蜡和水化：石蜡切片60℃烘烤4小时后经二甲苯2次脱蜡，脱蜡结束后采用高浓度至低浓度梯度乙醇将切片水化处理；
(2)酒精梯度后切片采用PBS液冲液(pH＝7.4)3次，每次5分钟；
(3)抗原修复：将柠檬酸盐缓冲液(pH＝6.0)置于容器内，微波加热至沸腾，再将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中档微波处理10分钟，造成组织脱片，加热修复完成后，室温静置30分钟，待缓冲液冷却后取出玻片；
(4)PBS缓冲液3次，每次5分钟；
(5)甩去PBS缓冲液擦干，滴加3％过氧化氢溶液完全覆盖切片，室温孵育10分钟，过氧化氢溶液目的为阻断组织内源性过氧化物酶活性。
(6)滴加适量羊血清覆盖切片，用来封闭组织上带电荷基团。室温下孵育20分钟。
(7)滴加一抗：擦去血清，每张切片滴加适量的TGFβ1一抗(1:500)，准备封口膜，覆盖在一次抗体和封闭液上，避免直接贴到载玻片上，给组织和一抗留有充足的接触空间，室温放置30分钟后将切片放入湿盒，4℃冰箱过夜。
(8)第二日取出切片，室温放置30分钟，再置于37℃水浴箱放置30分钟，用PBS缓冲液冲洗3次，每次5分钟，洗掉未结合的一抗。
(9)滴加二抗：甩去PBS缓冲液后擦干切片。每张切片滴加适量二抗(1:1000)，以覆盖切片为合适。放入湿盒置37℃水浴箱避光孵育20分钟。
(10)用PBS缓冲液冲洗3次，每次5分钟。
(11)甩去PBS液，檫干切片。DAB显色5-10分钟。
(12)将切片由低浓度到高浓度梯度酒精脱水，每浓度2分钟，60℃烤箱中烘烤10分钟，干燥后中性树胶封片。
如说明书附图7-8所示，分别为P5CR治疗组和生理盐水治疗组大鼠皮肤创伤组织切片免疫组化染色和P5CR治疗组和bFGF治疗组大鼠皮肤创伤组织切片免疫组化染色，“1、3、5、7、14”代表创伤后第1、3、5、7、14天。由图7可以看出，在P5CR治疗的伤口中TGFβ1在伤后的第1、3、5天表达增加，第7、14天仍有表达；在bFGF治疗的伤口中，TGFβ1在伤后的第1、3、5天表达增加，第7、14天仍有表达。由图8中可以看出，在P5CR治疗的伤口中，TGFβ1在伤后的第1、3、5天表达增加，第7、14天仍有表达；在NS治疗的伤口中，TGFβ1在伤后第1天有表达，第3天开始表达增多，持续至第14天。
4.蛋白质印迹法(WesternBlot)
4.1液氮法提取皮肤组织总蛋白
向研钵内倒入液氮使研钵及配套的杵预冷，将建立创伤TGFβ1表达中放入冻存管中皮肤组织取出，立即放入到液氮预冷的研钵中，用杵将组织研磨至粉末状，加入配置好的适当量裂解液，待冷冻后，用杵继续研磨至粉末，然后用金属刮勺收集至冻存管中。常温下待破碎组织和裂解液的混合液融化后，置于冰上，用超声振荡仪探头深入混合液中，超声振荡5秒然后停止5s，如此反复五次。放入4℃离心机中，10000g离心10min。
4.2 BCA蛋白定量
采用BCA蛋白浓度测定试剂盒
(1)配制标准液：将标准品采用裂解液作倍比稀释，蛋白浓度为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml，配制完毕后将标准品按浓度低到高对应各加20μl到96孔板的蛋白标准品孔中；
(2)配制BCA工作液：按50体积BCA试剂A加入1体积的BCA试剂B配制适量BCA工作液，充分混匀，室温24小时内稳定；
(3)将样品稀释50倍，各加20μl到96孔板的样品孔中；
(4)每孔加入200μl BCA工作液，37℃放置30分钟，盖上盖后，37℃下孵育30分钟；
(5)取出96孔板，冷却至室温，在560nm处使用酶标仪读数，测定值减去1孔的空白值，得到吸光度值制作标准曲线，计算出样品的蛋白浓度。
4.3 Westeern blotting实验
4.3.1 SDS-PAGE凝胶的配制
(1)制胶:根据目的蛋白分子量的大小配制不同浓度的分离胶。
(2)样品准备：首先计算上样体积，然后按样品：上样buffer＝4：1的比例加入上样bufer混匀，95℃金属浴10min。
(3)加样：依次加入预染Marker、待分析样品。
(4)SDS-PAGE(10％)：加样完毕，选择50V恒压进行电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿到达两胶交界处，更换至120V恒压电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳。
4.3.2转膜
(1)切除浓缩胶：将电泳完毕的胶(已去除浓缩胶)完整的放在盛有转膜液的玻璃皿中。
(2)剪膜和滤纸：按胶的尺寸剪膜和滤纸，滤纸浸入盛有转膜液的玻璃皿中10秒钟，膜放入盛有甲醇的玻璃皿中10秒钟，然后将两者都放入盛有去离子水的玻璃皿中3分钟，进一步放入盛有电转液的玻璃皿中3分钟。
(3)向转膜槽中倒入部分转膜液，将海绵浸入。从正极到负极按如下顺序排列：正极-海绵-三层滤纸-PVDF膜-凝胶-三层滤纸-海绵-负极。卡紧转膜板，转膜槽中倒满转膜液，将转膜板浸入转膜槽中，注意正负极要正确。将转膜槽置于冰盒中，插上电源，设定恒流200mA转膜60min。
(4)膜的封闭：放入5％BSA封闭液内，摇床震动，70转/分钟，室温封闭1小时。
4.3.3一抗孵育
(1)配制一抗：按相应抗体的效价加入一抗稀释液，一抗稀释液按PBS(ml)：BSA(g)＝20：1配制。(本次试验：anti-TGFβ1antibody,1:1000，rabbit；anti-β-actin antibody,1:2000，rabbit)
(2)一抗孵育：将封闭后的膜放入杂交盒中，加入一抗约20ml，4℃摇床(70转/分钟)过夜孵育。
(3)用PBST洗涤膜10分钟x3次。
4.3.4ECL显色
(1)配制ECL工作液：在避光的容器中按A液：B液＝1：1的比例配制。
(2)将ECL工作液覆盖到膜表面，放置1～2分钟后在全自动成像分析系统中曝光，分析。
如说明书附图9-10所示，分别为P5CR、bFGF、NS的创缘组织的MMP-1Westernblot和P5CR、bFGF、NS的创缘组织的MMP-1Westernblot的定量分析，图9中，“C1、C3、C5、C7、C14”代表NS治疗后的第1、3、5、7、14天，“F1、F3、F5、F7、F14”代表bFGF治疗后的第1、3、5、7、14天，“P1、P3、P5、P7、P14”代表P5CR治疗后的第1、3、5、7、14天；图10中，在创伤后的第1天和第3天，P5CR和bFGF治疗组创缘组织中MMP-1的表达水平要高于NS治疗组(P<0.05)。在创伤后的第5、7、14天，三个治疗组之间创缘组织中MMP-1的表达水平比较无统计学差异(P>0.05)。“*”代表p<0.05vs.NS。在创伤后的第1天和第3天，与NS治疗组相比，P5CR和bFGF治疗组中创缘组织中MMP-1的表达水平明显升高(P<0.05)。在创伤后的第5、7、14天，创缘组织中MMP-1表达水平在三个治疗组之间相比无统计学差异(P>0.05)。
综上所述，P5CR能促进大鼠皮肤创口的愈合。在皮肤创伤愈合的早期及中期阶段，采用P5CR治疗的伤口愈合率要高于生理盐水治疗的伤口愈合率，但是低于bFGF治疗的伤口愈合率。创伤后，在创伤边缘组织出现炎性细胞浸润，通过研究我们观察到采用P5CR治疗的创缘组织较生理盐水治疗的创缘组织炎症反应要轻。TGF-β1有增加I型胶原、III型胶原以及纤维连接蛋白的沉积、促进瘢痕形成的作用。本实验结果显示：与生理盐水治疗的创面相比，采用P5CR治疗的创伤边缘组织中TGF-β1的表达高峰时间较早出现，表明P5CR有促进伤口愈合的作用。本研究结果,一定程度上证实了P5CR有促进伤口愈合和修复的作用，为其在创伤治疗方面的应用提供了实验依据。
本发明的保护范围不仅仅局限于上述实施例，上述实施例只是为了帮助解释和说明本发明，而不是对本发明的保护范围进行限制，只要设计与本发明的设计相同或者是只要是等同替换的都落在本发明所要求保护的范围之内。

Claims (3)

1.人吡咯林-5-羧酸还原酶作为制备治疗皮肤创伤药物的应用。
2.根据权利要求1所述的人吡咯林-5-羧酸还原酶作为制备治疗皮肤创伤药物的应用，其特征在于：所述的人吡咯林-5-羧酸还原酶(P5CR)的制备方法如下：
(1)将P5CR置冰上20分钟，常温下放置1小时，30摄氏度温箱30分钟。
(2)缓冲液(20mMCAPS,0.5Msodium chloride,PH9.4)：常温下放置3-4小时，30摄氏度温箱30分钟。
(3)用缓冲液将P5CR稀释至终浓度0.0125mg/ml，配好后置于4摄氏度冰箱保存。
(4)还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)放于冰上化冻，常温下放置半小时，加入缓冲液稀释的P5CR中(按P5CR：NADPH＝100:1的比例加入)，配好后置于4摄氏度冰箱保存。
3.根据权利要求1所述的人吡咯林-5-羧酸还原酶作为制备治疗皮肤创伤药物的应用，其特征在于：所述的皮肤创伤模型的建立方法如下：
(1)将36只12周龄(200～250g)的雄性清洁级Spargue-Dawley(SD)大鼠随机分为2组。
(2)实验前一天将2组大鼠后背部剃毛，然后采用8％硫化钠溶液脱毛，脱毛范围为背部两侧4cm，24小时后确认脱毛区域无损伤。
(3)实验时大鼠用3％戊巴比妥钠(50mg/Kg)腹腔注射麻醉。
(4)麻醉起效后，用70％乙醇消毒两遍，取一厚纱布，中间剪一大小2.5*2.5cm的孔，纱布浸水后置于脱毛区，沿孔在大鼠两侧背部对称部位各制造一2.5*2.5cm大小的全层皮肤创面。
(5)造模后大鼠单笼喂养，自由进食、饮水。
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