CN111971388B - 细胞选择和修饰细胞代谢的方法 - Google Patents

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Abstract

本文描述了用于鉴定、选择或培养包含感兴趣的对象核酸序列的细胞的方法和组合物。一般而言，将核酸导入细胞，所述核酸包含编码涉及氨基酸生物合成的酶分子的序列以及对象核酸。然后，细胞在缺少氨基酸的培养基上生长，从而使包含导入的核酸的细胞能够生长。在一些情况中，细胞还包含酶分子的抑制剂以增加选择的严格性。

Description

细胞选择和修饰细胞代谢的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求美国临时专利申请U.S.S.N.62/625,773(提交于2018年2月2日)的优先权及权益，其全部内容通过引用全文纳入本文。
发明领域
本公开涉及用于鉴定、选择或培养包含对象核酸(subject nucleic acid)序列的细胞的方法和组合物。
背景技术
通过将产物的表达与能够合成必需化合物的异位酶的表达结合可以将对于生长所需的必需化合物为营养缺陷型的真核细胞用于表达异源性产物。例如，在没有外部供应的胸苷的情况下，胸苷营养缺陷型突变鼠细胞不能生长(Ayusawa等(1981)Somatic CellGenet.7(5):523-534)。恢复胸苷酸合酶活性的回复体(revertant)能够在胸苷饥饿条件下生长。
哺乳动物细胞表达系统通常用于生产重组生物产物，如治疗生物制剂。然而，由于难以高效生成高效表达大量所需产物的稳定细胞系，大规模生产这类产物与较高的初始成本有关。因此，本领域中需要用于生产这样的细胞的改进的方法和组合物，所述细胞可以用于生产重组生物产物。
发明概述
本文描述了用于鉴定、选择或培养包含感兴趣的对象核酸序列(例如，一种或多种感兴趣的对象核酸序列)的细胞的方法和组合物。一般而言，将核酸导入细胞，所述核酸包含涉及氨基酸生物合成的酶分子编码序列和对象核酸。然后，细胞在缺少氨基酸的培养基上生长，从而使包含导入的核酸的细胞能够生长。在一些情况中，细胞还包含酶分子的抑制剂以增加选择的严格性。设想了除了氨基酸以外的化合物(例如，痕量金属，小分子，核酸或本领域已知的其他代谢产物)的营养缺陷型可以用于本文所述的选择方法。
在一方面中，本公开的特征是鉴定、选择或培养包含对象核酸序列的细胞的方法，所述方法包括：
a)提供包含核酸的细胞，例如，载体，例如，可复制载体或整合载体，其包含：
(i)所述对象核酸序列；和
(ii)核酸序列，当其表达时导致氨基酸合成途径(例如，脯氨酸合成途径)中酶的活性水平升高，例如，编码包含所述活性的酶分子的核酸序列；和
b)在足以允许包含核酸序列的细胞生长的条件下，在氨基酸(例如，脯氨酸)水平不足以支持与活性未升高的细胞相同的细胞的生长的培养基存在的情况下培养包含核酸序列的细胞，
从而鉴定、选择或培养包含异源性核酸序列的细胞。
在一方面中，本公开的特征是鉴定、选择或培养包含对象核酸序列的细胞的方法，所述方法包括：
a)提供包含核酸的细胞，例如，载体，例如，可复制载体，其包含：
(i)所述对象核酸序列；
(ii)核酸序列，当其表达时导致氨基酸合成途径(例如，脯氨酸合成途径)中酶的活性水平升高，例如，编码包含所述活性的酶分子的核酸序列；和
b)在足以允许包含核酸序列的细胞生长的条件下，在氨基酸(例如，脯氨酸)水平不足以支持与活性未升高的对象细胞(subject cell)相同的细胞的生长的培养基存在的情况下培养包含核酸序列的细胞(并且培养基任选地包含酶的抑制剂)，
c)在足以允许包含核酸序列的细胞生长的条件下，在第二氨基酸(例如，酪氨酸)水平不足的第二培养基存在的情况下培养包含核酸序列的细胞，以支持与活性未升高的对象细胞相同的细胞的生长(并且培养基任选地包含第二酶的抑制剂)，
从而鉴定、选择或培养包含异源性核酸序列的细胞。
一方面，本发明的特征是这样的细胞，所述细胞包含异源性脂质代谢修饰剂(LMM)编码序列，所述序列可操作地连接包含来自SV40启动子序列、mCMV启动子序列或PGK启动子序列中任何一个的控制区(例如，启动子序列)的序列。
附图说明
图1是显示哺乳动物脯氨酸合成途径中的限速步骤的示意图。问号指可能的抑制剂，其可以用于抑制谷氨酸转化为谷氨酸5-半醛。
图2是显示带有P5CS和eGFP基因的示例性载体的质粒图的图。
图3A-3B是一系列图表，显示了不同培养基-完全培养基(6mM Glut)，缺乏谷氨酰胺(无Glut)和缺乏脯氨酸(无Pro)中培养的GSKO细胞的生长曲线。图3A显示了活细胞浓度，图3B显示了培养活力。
图4A-4C是一系列图表，显示了包含依那西普(Etanercept)基因(图4A)，谷氨酰胺合成酶(GS)和eGFP基因(图4B)或P5CS和eGFP基因(图4C)的示例性载体的质粒图。
图5A-5D是一系列图表，显示了用图4中所示的示例性载体之一瞬时转染然后在CD-CHO(补充含有6mM L-谷氨酰胺)，无酪氨酸(无Tyr)或无脯氨酸(无Pro)的培养基中培养的细胞培养物的作用。显示了转然后72小时和168小时的活细胞浓度(图5A)，培养活力(图5B)，平均eGFP荧光信号(图5C)和超过预定eGFP荧光强度阈值的细胞百分比(图5D)。误差线表示平均值的标准偏差(n＝3)。
图6A-6C是一系列图表，显示了使用P5CS过表达产生并在脯氨酸不存的情况下培养的细胞库的分析。图6A显示了使用流式细胞术分析获得的柱状图。图6B和6C各自显示了通过共聚焦显微镜产生的荧光图像；显示的通道是DAPI，P5CS:TRITC和eGFP。图6C显示了P5CS生成的库与GSKO宿主之间的比较。
图7是一系列western印迹图像，显示了使用P5CS过表达产生并在脯氨酸不存的情况下培养的细胞库的分析。用于细胞库构建的载体还包含eGFP基因(eGFP)，由SV40启动子驱动表达的SCD1基因(SV40 SCD1)或由mCMV启动子驱动表达的SCD1基因(mCMV SCD1)。进行了western印迹分析以鉴定P5CS、TAT和SCD1(感兴趣的基因)的表达。
图8A-8F是一系列图表，显示了使用P5CS过表达产生并在脯氨酸不存的情况下、在P5CS抑制剂L-氮杂-2-环丁烷羧酸存在的情况下培养的细胞库。以各种不同浓度添加L-氮杂-2-环丁烷羧酸，并将细胞在96深孔板中培养9天。分析这些细胞的细胞生长，如通过活细胞浓度(图8A)和培养活力(图8B)所测量的。还分析了细胞的平均培养荧光(图8C)以及超过预定阈值102(图8D)和103(图8E)的细胞的百分比。图8F显示了在特定时间点收获并通过探针突出显示P5CS、β-肌动蛋白和eGFP蛋白的裂解物的western印迹分析。
图9A-9F是一系列图表，显示了使用P5CS过表达产生并在脯氨酸不存的情况下以及在P5CS抑制剂3,4-脱氢-L-脯氨酸存在的情况下培养的细胞库。以各种不同浓度添加3,4-脱氢-L-脯氨酸，并将细胞在96深孔板中培养9天。分析这些细胞的细胞生长，如通过活细胞浓度(图9A)和培养活力(图9B)所测量的。还分析了细胞的平均培养荧光(图9C)以及超过预定阈值102(图9D)和103(图9E)的细胞的百分比。图9F显示了在特定时间点收获并通过探针突出显示P5CS、β-肌动蛋白和eGFP蛋白的裂解物的western印迹分析。
图10A-10F是一系列图表，显示了使用P5CS过表达产生并在脯氨酸不存的情况下以及在P5CS抑制剂L-4-噻唑烷羧酸存在的情况下培养的细胞库。以各种不同浓度添加L-4-噻唑烷羧酸，并将细胞在96深孔板中培养9天。分析这些细胞的细胞生长，如通过活细胞浓度(图10A)和培养活力(图10B)所测量的。还分析了细胞的平均培养荧光(图10C)以及超过预定阈值102(图10D)和103(图10E)的细胞的百分比。图10F显示了在特定时间点收获并通过探针突出显示P5CS、β-肌动蛋白和eGFP蛋白的裂解物的western印迹分析。
图11A-11E是一系列图表，显示了使用P5CS过表达产生并在脯氨酸不存的情况下、在P5CS抑制剂L-氮杂-2-环丁烷羧酸存在的情况下培养的细胞库的分析。以各种不同浓度添加L-氮杂-2-环丁烷羧酸，并将细胞在静态24深孔板中培养9天。分析这些细胞的细胞生长，如通过活细胞浓度(图11A)和培养活力(图11B)所测量的。还分析了细胞的平均培养荧光(图11C)以及超过预定阈值102(图11D)和103(图11E)的细胞的百分比。
图12A-12E是一系列图表，显示了使用P5CS过表达产生并在脯氨酸不存的情况下以及在P5CS抑制剂3,4-脱氢-L-脯氨酸存在的情况下培养的细胞库的分析。以各种不同浓度添加3,4-脱氢-L-脯氨酸，并将细胞在静态24深孔板中培养9天。分析这些细胞的细胞生长，如通过活细胞浓度(图12A)和培养活力(图12B)所测量的。还分析了细胞的平均培养荧光(图12C)以及超过预定阈值102(图12D)和103(图12E)的细胞的百分比。
图13是显示在指定启动子(SV40，mCMV或PGK启动子)和第二示例性载体控制下使用示例性载体共转染的培养物的回收率(天)的图表，所述示例性载体携带指定脂质代谢修饰剂(LMM)基因(SCD1、SREBF1或SREB411)，所述第二示例性载体携带编码感兴趣的指定重组蛋白(依那西普，色古土珠单抗(Cergutuzumab)，英夫利昔单抗(Infliximab)或cB72.3)的基因。
图14A-14D是显示106/ml细胞下平均活细胞浓度(VCC)的一系列图表，所述细胞经指定LMM基因转染并受控于指定启动子和以及编码依那西普(图14A)，色古土珠单抗(图14B)，英夫利昔单抗(图14C)或cB72.3(图14D)的基因。细胞培养物生长于深孔板，并经由各培养/孔的Celigo细胞计数测量VCC。
图15A-15D是显示减弱分批补料过度生长(abridged fed-batch overgrow，aFOG)期间106/ml细胞下平均活细胞浓度(VCC)的一系列图表。细胞经指定LMM基因转染并受控于指定启动子和编码依那西普(图15A)，色古土珠单抗(图15B)，英夫利昔单抗(图15C)或cB72.3(图15D)的基因。细胞培养物生长于深孔板，并经由各培养/孔的Celigo细胞计数测量VCC。
图16A-16D是一系列图表，显示了在aFOG期间表达LMM基因和感兴趣的基因的细胞培养物的特定生产率的气泡图。细胞经指定LMM基因转染并受控于指定启动子和编码依那西普(图16A)，色古土珠单抗(图16B)，英夫利昔单抗(图16C)或cB72.3(图16D)的基因。培养物生长于深孔板，并经由各培养/孔的Celigo细胞计数测量VCC。使用具有蛋白质A生物传感器的Octet仪器测量生产率。显示的各数据点对应单独的培养；各数据点的直径显示该培养达到的产物浓度。
图17A-17D是一系列图表，显示了在aFOG期间表达LMM基因和感兴趣的基因的细胞培养物的产物浓度的95％置信区间图。细胞经指定LMM基因转染并受控于指定启动子和编码依那西普(图17A)，色古土珠单抗(图17B)，英夫利昔单抗(图17C)或cB72.3(图17D)的基因。使用具有蛋白质A生物传感器的Octet测量生产率。各数据点以p＝0.95的置信区间显示指定培养生产率的平均值。
图18是细胞裂解物的一系列western印迹，所述细胞裂解物来自使用P5CS代谢选择系统分离的SCD1或SREBF1工程改造的CHO细胞和在培养基中不存在脯氨酸中生长的细胞。
图19A-D显示了细胞单位生产率(Qp)相对SREBF1或SCD1工程改造的CHO细胞库的IVC的一系列图表，所述细胞库在用依那西普或英夫利昔单抗的基因以及选择标志物谷氨酰胺合成酶转染后具有不同量的这些脂质代谢修饰(LMM)基因的表达以及重组蛋白分子的分泌表达，这是在谷氨酰胺或脯氨酸不存在的情况下在分批补料条件下于微型生物反应器中评估的。
具体实施方式
定义
除非另外定义，否则，本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。虽然在本发明的实施或测试中可以采用类似于或等同于本文所述的那些方法和材料，但下文描述了合适的方法和材料。本文中述及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都通过引用全文纳入本文。此外，材料、方法和实施例都仅是说明性的，并不意在构成限制。标题、小标题或带编号或字母的元素(例如(a)，(b)，(i)等)仅出于阅读目的而提供。在本文中使用标题或带编号或字母的元素不需要步骤或元素按字母顺序执行，或步骤或元素必须彼此分离。本发明的其它特征、目的和优势将通过说明、附图以及权利要求书得以清楚展现。也应该理解的是，此处使用的术语只是为描述具体实施方式，而不是起限制作用。
本文使用冠词“一个”和“一种”表示一个或一个以上的(即至少一个)该冠词语法上的宾语。在一些实施方式中，冠词“一个”或“一种”指冠词的单个语法宾语。在一些实施方式中，冠词“一个”或“一种”指多个(例如，超过一个，例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个)冠词的语法宾语。例如，“细胞”可以表示一个或超过一个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个)细胞。
当述及可量值如量、时距等时，术语“约”意指涵盖特定值的±/20％或在一些情况中±10％，或在一些情况中±5％，或在一些情况中±1％，或在一些情况中±0.1％的变量，只要变量适合进行所公开的方法中使用。
本文所用术语“多个”表示超过一个(例如，两个或多个)该冠词语法上的宾语。举例来说，“多个细胞”可以表示两个细胞或超过两个细胞。
本文所用术语“内源性”指来自生物体、细胞、组织或系统内部或在其内部天然产生的任何物质。
本文所用术语“异源性”指将任何物质引入生物体、细胞、组织或系统和/或在生物体、细胞、组织或系统的外部产生。因此，“异源性核酸”指被引入生物体、细胞、组织或系统和/或在其之外产生的核酸。在一些实施方式中，异源性核酸的序列不是天然产生的，或者不是天然存在于引入异源性核酸的生物体、细胞、组织或系统之内。在一些实施方式中，异源性核酸的序列可以是天然存在于生物体、细胞、组织或系统(例如，编码细胞中天然存在的酶或LMM的核酸(例如本文所述)，其中核酸在细胞中表达以产生酶或LMM的其他拷贝)。相似地，“异源性多肽”指被引入生物体、细胞、组织或系统和/或在其之外产生的多肽。在一些实施方式中，多肽不是在导入异源性多肽的生物体、细胞、组织或系统(例如，通过由异源性核酸序列表达)内天然产生的，或者天然不存于其中。在一些实施方式中，异源性多肽可以是天然存在于生物体、细胞、组织或系统中(例如，天然存在于细胞中也在细胞外表达的酶或LMM，例如本文所述)。在某些实施方式中，将异源性核酸或多肽引入包含相同多肽或核酸的内源性拷贝的生物体、细胞、组织或系统，从而增加生物体、细胞、组织或系统中多肽或核酸的数量。在某些实施方式中，术语“异源性”指来自一种物种的任何物质，当其被引入来自不同物种的生物体、细胞、组织或系统时。在一些情况中，术语“异源性”和“外源性”可以互换使用。
本文所用术语“酶分子”指具有感兴趣的酶促活性的多肽。酶分子可以与具有感兴趣的酶促活性的酶共有结构相似性(例如，序列同源性)。在一些情况中，酶分子与具有感兴趣的酶促活性的酶共有至少50％氨基酸序列相同性(例如，至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性)。在一些情况中，术语“分子”在与酶的标识符(例如，吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS))一起使用时指具有经标识的酶的酶促活性的多肽。例如，本文所用术语“P5CS分子”指具有P5CS酶促活性的多肽。在一些情况中，P5CS分子与P5CS酶(例如，哺乳动物P5CS)有至少50％氨基酸序列相同性(例如，至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相同性)。
如本文所用，术语“核酸”、“多核苷酸”或“核酸分子”可互换使用并指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)或DNA或RNA的组合，以及其单链或双链形式的聚合物。术语“核酸”包括但不限于基因，cDNA或RNA序列(例如，mRNA)。在一个实施方式中，核酸分子是合成的(例如化学合成的或人工的)或重组的。除非特别限定，否则该术语涵盖包含天然核苷酸的类似物或衍生物的分子，所述天然核苷酸的类似物或衍生物具有与参比核酸相似的结合特性并且以与天然或非天然产生的核苷酸相似的方式代谢。除非另有说明，否则具体核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)，等位基因，直系同源物，SNP和互补序列以及明确指出的序列。具体而言，可通过产生一个或多个选定(或所有)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来获得简并密码子取代形式(Batzer等，Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Rossolini等，Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。如本所用，述及“对象核酸”意指期望被引入或存在于诸如本文所述细胞中的任何感兴趣的核酸，例如，包含诸如本文所述产物的编码序列。
如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指由通过肽键或除肽键以外的方式共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须包含至少两个氨基酸，并且对构成蛋白质或肽序列的最大氨基酸数没有限制。在一个实施方式中，蛋白质可包含多于一个，例如，两个，三个，四个，五个或多于五个的多肽，其中每个多肽通过共价或非共价键/相互作用彼此结合。多肽包括包含通过肽键或通过除肽键以外的方式彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，该术语指两条短链，其在本领域中通常也被称为例如肽、寡肽和寡聚物，也指长链，其在本领域中通常被称为蛋白质，包括很多类型。“多肽”包括例如生物活性片段，基本上同源的多肽，寡肽，同二聚体，异二聚体，多肽的变体，修饰的多肽，衍生物，类似物，融合蛋白等。
如本文所用“产物”是指经由细胞，例如，经修饰或工程改造以产生产物的细胞产生(例如表达)的分子，例如，多肽，例如，蛋白质，例如，糖蛋白，核酸，脂质，糖类，多糖或其任何杂合体。在一个实施方式中，产物是蛋白质或多肽产物。在一个实施方式中，产物包含天然产生的产物。在一个实施方式中，产物包含非天然产生的产物。在一个实施方式中，一部分产物是天然产生的，而另一部分产物是非天然产生的。在一个实施方式中，产物是多肽，例如，重组多肽。在一个实施方式中，产物适合用于诊断或临床前用途。在另一个实施方式中，产物适合用于治疗用途，例如用于治疗疾病。在一些实施方式中，蛋白质是蛋白质产物。在一些实施方式中，产物是本文所述的重组或治疗性蛋白质，例如，表5-8中。
如本文所用，术语“启动子”是指具有来自天然产生或工程改造的启动子的足够序列的序列，从而将编码序列操作性地连接至启动子导致编码序列的表达。例如，巨细胞病毒(CMV)启动子包含CMV启动子的全部或活性片段，例如CMV启动子的全部或活性片段，包括任选的内含子A和/或UTR序列。在一个实施方式中，CMV启动子与天然产生或经工程改造的变体CMV启动子的差异不超过5、10、20、30、50或100个核苷酸。在一个实施方式中，CMV启动子与天然产生或工程改造的变体CMV启动子的核苷酸差异不超过1、5、10或50％。如本文所用，启动子可以是组成型，调节型，阻遏型，强型，弱型或启动子包含的启动子序列的其它特性。在一个实施方式中，启动子可包含编码序列(例如重组、治疗性或阻遏物多肽的编码序列)的序列5'或3'。在一个实施方式中，启动子可包含基因(例如编码重组、治疗性或阻遏物多肽的基因)的一个或多个内含子内的序列。在一个实施方式中，启动子可部分或全部包含在编码序列(例如重组、治疗性或阻遏物多肽的编码序列)的5'或3'序列中。在一个实施方式中，启动子可部分或全部包含在编码序列(例如重组、治疗性或阻遏物多肽的编码序列)内。在一个实施方式中，启动子可以部分或全部包含在基因(例如编码重组、治疗性或阻遏物多肽的基因)的一个或多个内含子内。
如本文所用，术语“操作性地连接”是指产物(例如，多肽)编码核酸序列与控制元件之间的关系，其中，如果多肽编码序列和控制元件以适用于控制元件调节产物(例如，多肽)编码序列表达的方式配置，那么它们操作性地连接。因此，对于不同的控制元件，操作性地连接将相对于控制元件构成产物(例如，多肽)编码序列的不同配置。例如，如果启动子元件和产物(例如，多肽)编码序列彼此相邻并且位于同一核酸上，那么产物(例如，多肽)编码序列可以操作性地连接包含启动子元件的控制元件。在另一个实例中，如果增强子序列和产物(例如，多肽)编码序列在同一核酸上相隔合适数量的碱基或甚至在不同且分开的核酸上，那么产物(例如，多肽)编码序列可以操作性地连接包含远程操作的增强子序列的控制元件。
本文中所用术语“控制元件”指适于调节(例如，增加或减少)编码序列(例如基因)表达的核酸。控制元件可包含启动子序列，增强子序列或启动子和增强子序列两者。控制元件可以包含连续的核酸序列，不连续的核酸序列(被其它编码或非编码核酸序列打断的序列)或两者。单个控制元件可以包含在单个核酸或多于一个核酸上。在一个实施方式中，控制元件可包含编码序列(例如重组、治疗性或阻遏物多肽的编码序列)的序列5'或3'。在一个实施方式中，控制元件可包含基因(例如编码重组、治疗性或阻遏物多肽的基因)的一个或多个内含子中的序列。在一个实施方式中，控制元件可部分或全部包含在编码序列(例如重组、治疗性或阻遏物多肽的编码序列)的5'或3'序列中。在一个实施方式中，控制元件可部分或全部包含在编码序列(例如重组、治疗性或阻遏物多肽的编码序列)内。在一个实施方式中，控制元件可以部分或全部包含在基因(例如编码重组、治疗性或阻遏物多肽的基因)的一个或多个内含子内。在一个实施方式中，单个控制元件可包含核酸序列，该核酸序列i)在基因(例如，编码重组、治疗性或阻遏物多肽的基因)的近端(例如，邻近于或包含在其中)，或ii)在基因(例如，编码重组、治疗性或阻遏物多肽的基因)的远端(例如，被10或更多，100或更多，1000或更多或10,000或更多的碱基隔开，或置于不同且分开的核酸上)。
本文所用“脂质代谢修饰剂(Lipid metabolism modifier)”或“LMM”指调节例如增加或降低下述一种或多种内容的分子，基因产物，多肽或酶：脂质代谢途径中所涉及的组分的表达(例如，转录或翻译)；脂质代谢途径中所涉及的组分例如基因产物的活性(例如，酶促活性)；细胞中存在的脂质的水平或量；脂筏的水平或量或脂筏的形成速率；细胞膜例如质膜或细胞器膜的流动性，渗透性或厚度；饱和脂质向不饱和脂质的转换或不饱和脂质向饱和脂质的转换；细胞中饱和脂质或不饱和脂质如单不饱和脂质的水平或量；脂质组合物，以获得对ER的活性具有有利影响的有利脂质组合物；ER的扩增；高尔基体的扩增；分泌性小泡或分泌性小泡形成的水平或数量；分泌的水平或速率；膜受体的活化或失活(例如，ATR(参见例如，含有多不饱和脂肪酸残基的细胞膜磷脂酰胆碱的增加通过ATR的活化诱导p53的磷酸化(The increase of cell-membranous phosphatidylcholines containingpolyunsaturated fatty acid residues induces phosphorylation of p53 throughactivation of ATR).Zhang XH,Zhao C,Ma ZA.J Cell Sci.2007年12月1日；120(Pt 23):4134-43PMID:18032786；ATR(共济失调毛细血管扩张突变和Rad3相关激酶)在哺乳动物细胞中被轻度低温激活并随后激活p53(ATR(ataxia telangiectasia mutated-and Rad3-related kinase)is activated by mild hypothermia in mammalian cells andsubsequently activates p53).Roobol A,Roobol J,Carden MJ,Bastide A,Willis AE,Dunn WB,Goodacre R,Smales CM.Biochem J.2011年4月15日；435(2):499-508.doi:10.1042/BJ20101303.PMID:21284603)和SREPB(参见例如，Int J Biol Sci.2016 Mar 21；12(5):569-79.doi:10.7150/ijbs.14027.eCollection 2016.低密度脂蛋白受体途径的异常调节涉及脂质紊乱介导的器官损伤(Dysregulation of the Low-Density LipoproteinReceptor Pathway Is Involved in Lipid Disorder-Mediated Organ Injury).ZhangY,Ma KL,Ruan XZ,Liu BC)；和其他受体，参见例如，Biochim Biophys Acta.2016年3月17日.pii:S1388-1981(16)30071-3.doi:10.1016/j.bbalip.2016.03.019；和/或未折叠蛋白质反应(UPR)。在一个实施方式中，LMM包含多肽。在一个实施方式中，LMM包含转录调节剂，例如，转录因子。在一个实施方式中，LMM包含SREBF1或其功能片段(例如，SREBF-410)。在一个实施方式中，LMM包含酶。在一个实施方式中，LMM包含SCD1或其功能片段。
鉴定、选择或培养细胞的方法
在一个方面中，本公开的发明涉及鉴定、选择和/或培养细胞的方法。在一些实施方式中，所述方法包括：
a)提供包含核酸的细胞，例如，载体，例如，可复制载体或整合载体，其包含：
(i)所述对象核酸序列；和
(ii)核酸序列，当其表达时导致氨基酸合成途径中酶的活性水平升高，例如，编码包含所述活性的酶分子的核酸序列；和
b)在足以允许包含核酸序列的细胞生长的条件下，在氨基酸水平不足以支持与活性未升高的细胞相同的细胞的生长的培养基存在的情况下培养包含核酸序列的细胞，
从而鉴定、选择或培养包含异源性核酸序列的细胞。
在一些实施方式中，酶分子催化氨基酸生物合成途径的限速步骤。在其它实施方式中，酶分子催化氨基酸生物合成途径的非限速步骤。在实施方式中，氨基酸是脯氨酸，酪氨酸或色氨酸。
在一些实施方式中，细胞还包含酶分子活性的抑制剂。抑制剂可以用于通过降低或防止内源性酶分子的活性来增加选择过程的严格性，例如，使得不摄取包含对象核酸序列的核酸的细胞表现出降低的或不可检测的内源性酶分子活性水平。表现出降低的或不可检测的内源酶分子活性水平的细胞可能无法在缺少外部供应合成需要酶分子活性的氨基酸(例如，脯氨酸，酪氨酸或色氨酸)的情况下生长和/或存活。在一些实施方式中，抑制剂结合酶分子，例如，其结合并抑制酶分子。在实施方式中，抑制剂是酶分子的变构抑制剂。在实施方式中，抑制剂是酶分子的竞争性抑制剂。在一些实施方式中，抑制剂抑制酶分子的转录或翻译，例如，酶分子的内源性转录或翻译。在一些实施方式中，抑制剂抑制脯氨酸、酪氨酸或色氨酸生物合成途径中的酶分子。在实施方式中，抑制剂抑制吡咯啉-5-羧酸合酶(P5CS)分子的活性。在实施方式中，抑制剂抑制P5CS的活性。在一些实施方式中，抑制剂是脯氨酸类似物。在实施方式中，抑制剂是L-氮杂-2-环丁烷羧酸，3,4-脱氢-L-脯氨酸，或L-4-噻唑烷羧酸。
在一些实施方式中，该方法还包括一个或多个其他培养步骤。在一些实施方式中，一个或多个其他培养步骤包括在第二培养基(例如，与第一培养步骤中所用相同的培养基组合物或者与第一培养步骤中所用不同的培养基)存在的情况下培养细胞。在实施方式中，第一培养步骤利用包含第一氨基酸(例如，脯氨酸)水平不足(例如，缺少)的培养基，而第二培养步骤利用包含第二氨基酸(例如，酪氨酸或色氨酸)水平不足(例如，缺少)的培养基。在实施方式中，只有当细胞进一步包含感兴趣的对象核酸时，细胞包含拯救第一氨基酸产生的酶分子和/或拯救第二氨基酸产生的酶分子。设想了该方法可以扩展到其他培养步骤，各步骤涉及包含氨基酸(例如，与第一或第二培养基缺少的氨基酸相同或不同的氨基酸)水平不足(例如，缺少)的培养基以及包含能够挽救氨基酸(例如，与第一或第二培养基缺少的氨基酸相同或不同的氨基酸)产生的酶分子的细胞。在实施方式中，其他培养步骤中使用的培养基包含其他培养步骤中所用培养物缺少的氨基酸的抑制剂。在一些实施方式中，培养步骤可以同时进行，例如，使用包含多种氨基酸水平不足(例如，缺少)的培养基。在一些实施方式中，仅一部分培养步骤包括使用酶分子的抑制剂。例如，第一培养步骤可以包括使用酶分子的抑制剂，然后是不包括使用酶分子的抑制剂的培养步骤。
在一些实施方式中，该方法可用于生产包含异源性核酸的细胞，例如，能够用于产生产物例如多肽产物例如抗体的细胞。
酶分子及其抑制剂
通常，本发明的特征在于通过选择氨基酸生物合成中所涉及的酶分子的表达来选择将引入核酸的细胞的方法和组合物。可以将酶分子与对象核酸一起引入细胞。例如，可以将核酸引入细胞，所述细胞包含对象核酸以及编码酶分子的基因，从而使酶分子在细胞中表达。在一些实施方式中，包含对象核酸的细胞相较于缺少对象核酸的细胞表现出酶分子活性升高。在一些实施方式中，酶分子活性的水平相对于可以在缺少对象核酸的细胞中检测到的酶分子活性增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、500％、1000％或更多。在一些实施方式中，活性升高的细胞可以比缺少对象核酸的细胞更快速地生长。在一些实施方式中，细胞包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000、5000、10,000或更多个编码酶的核酸的拷贝。在实施方式中，活性升高的细胞在缺少氨基酸的培养基上的生长比缺少对象核酸的细胞快至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、5000或10,000倍。然后细胞可以在缺少氨基酸的培养基上生长，以选择已经摄取对象核酸的细胞。在一些实施方式中，选择包括选择在缺少氨基酸的培养基上表现出生长的一种或多种细胞。
酶分子抑制剂
在一些实施方式中，本文所述的细胞可以进一步包含由引入细胞中的核酸(例如，对象核酸或第二核酸)所表达的酶分子的抑制剂。例如，抑制剂可以用于降低或阻断由细胞内源性产生的酶分子的活性，和/或降低或阻断回复体细胞的生长，从而起到增加例如本文所述选择方法的严格性的作用。在一些实施方式中，细胞中抑制剂的水平足以降低内源性酶分子活性至小于缺少抑制剂的细胞中观测到的活性的约0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、25％、30％、40％或50％。在一些实施方式中，基于在缺少氨基酸的培养基中的生长选择的细胞的小于约0.001％、0.01％、0.1％、1％、5％或10％不包含对象核酸。在一些实施方式中，细胞中酶分子和抑制剂分子的比例是约1:1000、1:500、1:250、1:200、1:100、1:90、1:80、1:70、1:60、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1、200:1、250:1、500:1或1000:1。
例如，抑制剂可以是氨基酸或其类似物，多肽，核酸，或小分子。在一些实施方式中，抑制剂是通过酶分子参与的生物合成途径所产生的氨基酸的类似物。在一些实施方式中，抑制剂是抗体分子(例如，抗体或抗体片段，例如，如本文所述)，融合蛋白，激素，细胞因子，生长因子，酶，糖蛋白，脂蛋白，报告蛋白，治疗性肽，适配体，或所述这些任何一种的结构和/或功能片段或杂合体。在一些实施方式中，抑制剂是反义RNA、siRNA、tRNA、核糖体RNA、微小RNA、piRNA、snoRNA、snRNA、exRNA、scaRNA或长非编码RNA。
可以用于本文所述组合物和方法的酶分子和其抑制剂的非限制性示例包括表1中所列出的那些。
表1：氨基酸生物合成中涉及的示例性酶分子及其示例性抑制剂
Figure GDA0002731541300000151
Figure GDA0002731541300000161
Figure GDA0002731541300000171
Figure GDA0002731541300000181
Figure GDA0002731541300000191
在一些实施方式中，抑制剂抑制氨基酸例如脯氨酸、酪氨酸或色氨酸生物合成途径中的酶分子。在一些实施方式中，抑制剂抑制酶分子，所述酶分子催化氨基酸生物合成途径的限速步骤。
在一些实施方式中，抑制剂抑制脯氨酸生物合成途径中的酶分子，例如，催化脯氨酸生物合成途径中限速步骤的酶分子。在实施方式中，抑制剂抑制吡咯啉-5-羧酸合酶(P5CS)分子的活性。在实施方式中，抑制剂抑制P5CS的活性。在实施方式中，抑制剂是脯氨酸或脯氨酸类似物。在实施方式中，抑制剂是L-氮杂-2-环丁烷羧酸，3,4-脱氢-L-脯氨酸或L-4-噻唑烷羧酸。
在一些实施方式中，抑制剂抑制酪氨酸生物合成途径中的酶分子，例如，催化酪氨酸生物合成途径中限速步骤的酶分子。在实施方式中，抑制剂是酪氨酸类似物。
在一些实施方式中，抑制剂抑制色氨酸生物合成途径中的酶分子，例如，催化色氨酸生物合成途径中限速步骤的酶分子。在实施方式中，抑制剂是色氨酸类似物。
脂质代谢修饰剂
本公开的特征在于用于产生包含异源性核酸的细胞的方法和组合物。在一些情况中，细胞还包括脂质代谢修饰剂(LMM)，其通常受控于启动子，能够调节细胞中的脂质代谢。在实施方式中，LMM包含全局调节剂，其影响脂质代谢所涉及的途径或过程的多个方面，例如，从头脂肪生成，脂肪酸再酯化，脂肪酸饱和或去饱和，脂肪酸延长和磷脂生物合成途径。例如，全局调节剂在一种或多种脂质代谢途径或过程的上游，从而使全局调节剂影响脂质代谢的多种，例如，两种或更多种下游过程或下游组件。在一个实施方式中，全局调节剂是转录因子，其可以激活不同脂质代谢过程或途径中所涉及的超过一种(例如，两种或更多种)靶基因的表达。因此，不希望受任何理论的束缚，相比使用仅调节脂质代谢单个靶标或其他组件的下游效应子，本文所述全局调节剂的使用可以导致细胞生产能力、稳健性和存活更大的增加。虽然不希望受到任何理论的束缚，但是据信多种脂质代谢途径的全局或更广泛的调节通过影响涉及改善细胞生产能力、产物质量和稳健性的更多过程增加了细胞的生产能力。
本文所述脂质代谢途径指与脂质或脂质相关分子的合成、降解、转化或修饰相关的过程。脂质分子包括但不限于，脂肪酸，甘油脂，甘油磷脂，磷脂，糖脂，鞘脂和固醇脂，例如，胆固醇和聚酮化合物。脂质代谢途径的实例包括但不限于：从头脂肪生成，脂肪酸再酯化，脂肪酸饱和，脂肪酸去饱和，脂肪酸延长和磷脂生物合成。在一个实施方式中，本文所述方法提供了细胞，其包含调节脂质代谢的修饰。调节脂质代谢的修饰可以是增加或降低脂质代谢所涉及组分的表达的试剂。在一个实施方式中，调节脂质代谢的修饰包括编码脂质代谢调节剂(LMM)的外源性核酸。在这类实施方式中，通过本文所述任何核酸递送方法或技术，例如，转导或转染，将编码LMM的外源性核酸引入细胞。
在一些实施方式中，本文所述方法提供了细胞，其包含调节脂质代谢的一种或多种修饰，例如，一、两、三、四、五、六、七、八、九或十种修饰。在其中细胞包含两种或更多种调节脂质代谢的修饰的实施方式中，调节脂质代谢的各种修饰包含编码LMM的外源性核酸。在一个实施方式中，编码LMM的两种或更多种外源性核酸可以各自位于同一核酸分子内，或置于两个或更多个不同的核酸分子上。在细胞包含编码LMM的两种或多种核酸序列的实施方式中，LMM彼此不同，例如，编码不同的多肽序列或具有不同的功能。在一些实施方式中，细胞中表达了多种不同的异源性LMM(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多种LMM，例如，如本文所述)。在某些实施方式中，细胞天然表达一种或多种异源性LMM。在某些实施方式中，细胞天然不表达一种或多种异源性LMM。
在一个实施方式中，调节脂质代谢的修饰增加或降低一种或多种脂质代谢途径中涉及的组分的表达或活性。在一些实施方式中，细胞脂质代谢的调节导致细胞中脂质空间分布的改变，例如，细胞膜(例如，脂质筏中)，细胞器(例如，内质网，高尔基体，核，溶酶体，过氧化物酶体，液泡和/或线粒体)，外来体，液滴或包含脂质的细胞的任何其他区域或区室中脂质的空间分布。在其中调节脂质代谢的修饰导致表达(例如，转录或翻译)增加或脂质代谢途径组分活性增加的实施方式中，组分是脂质代谢途径的正调节剂。在其中调节脂质代谢的修饰导致表达(例如，转录、翻译、更新和/或降解)降低或脂质代谢途径组分活性降低的实施方式中，组分是脂质代谢途径的负调节剂。本领域已知用于定量脂质代谢途径基因的表达(例如，转录和/或翻译)的试验，并且包括定量编码该基因的mRNA的量；或定量基因产物或多肽的量；基于PCR的试验，例如，定量实时PCR，northern印迹；或微阵列。用于定量脂质代谢途径的组分(例如，脂质代谢途径的酶)的活性的试验将对于脂质代谢途径的特定组分具有特异性。
在其中细胞脂质代谢的调节导致细胞中脂质水平或数量增加的实施方式中，可以增加细胞中脂质的总水平或总量。在一些实施方式中，细胞脂质代谢的调节导致细胞中脂质空间分布的改变，例如，细胞膜(例如，脂质筏中)，细胞器(例如，内质网，高尔基体，核，溶酶体，过氧化物酶体，液泡和/或线粒体)，外来体，液滴或包含脂质的细胞的任何其他区域或区室中脂质的空间分布。在一个实施方式中，调节脂质代谢的修饰导致细胞存活增加。在一个实施方式中，调节脂质代谢的修饰导致培养活力增加。在一个实施方式中，调节脂质代谢的修饰导致细胞增殖增加。在一个实施方式中，调节脂质代谢的修饰导致生产能力增加，例如，生产产物的量、数量或产率，或者生产速率。在一个实施方式中，调节脂质代谢的修饰导致产物质量增加，例如，聚合、糖基化状态或异质性、片段化、适当折叠或组装、翻译后修饰或二硫键错配。
在一个实施方式中，LMM在细胞中过表达，例如，通过引入编码LMM的异源性核酸(例如，源自细胞外部的核酸，例如，包含编码LMM的基因的核酸构建体)或通过通过引入启动子元件或其他调控转录元件来增加表达。在一些实施方式中，细胞包含在细胞中过表达的LMM的内源性拷贝。在一些实施方式中，细胞不包含在细胞中过表达的LMM的内源性拷贝。在另一实施方式中，抑制或降低LMM的表达或活性，例如，通过引入LMM的抑制剂或外源性抑制性核酸，例如RNA干扰剂。抑制性核酸的示例包括靶向LMM的短干扰RNA(siRNA)和短发夹RNA(shRNA)，例如，编码LMM的mRNA。在一个实施方式中，通过改变调节LMM活性或表达的翻译后修饰或其他内源性调节机制来增加或降低LMM的活性或表达。通过翻译后修饰的调控包括但不限于，磷酸化，SUMO化，泛素化，乙酰化，甲基化或糖基化可以增加或降低LMM表达或活性。例如，可通过调节修饰LMM的酶或分子或LMM的修饰来实现翻译后修饰的调控，从而使翻译后修饰不可以发生或更频繁地或组成性地发生。LMM的调控还可包括调节内源性调节机制，其可增加或减少LMM表达或活性，例如，增加或减少一种或多种下述内容：miRNA调节，蛋白质切割，特异性同种型的表达，可变剪接和降解。在一个实施方式中，LMM调节(例如，增加或减少)脂质代谢途径组分的表达(例如，转录)或活性。在另一实施方式中，LMM调节(例如，增加或减少)脂质或脂质相关分子的合成，降解，延长或结构构象(例如，饱和或去饱和，或酯化)。脂质代谢途径的示例性LMM和/或组分列于但不限于表2中所列的那些。
表2：脂质代谢途径及其组分/基因产物
Figure GDA0002731541300000221
Figure GDA0002731541300000231
在实施方式中，LMM包含与脂质代谢途径中所涉及的组分(例如基因产物)(例如，表2中所提供的)至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列相同性或同源性；或者与脂质代谢途径中所涉及的组分(例如基因产物)(例如，表2中所提供的)的氨基酸序列相差1、2或3或更多个氨基酸残基，但是不超过50、40、30、20、15或10个氨基酸残基。
在实施方式中，LMM包含脂质代谢途径中所涉及的组分的功能片段，例如，表2中所提供的。本文所述LMM的功能片段可以包含LMM的一个或多个功能结构域。例如，作为转录因子的LMM的功能片段包含DNA结合结构域和反式激活结构域。例如，作为酶的LMM的功能片段包含具有酶促活性的结构域。本文所述LMM的功能片段保留全长LMM的功能活性，例如，至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的功能活性。本领域技术人员可以通过实验确定LMM的功能片段，或者可以使用基于功能性结构域序列同源性的算法预测。示例性的LMM在下文进一步描述。
在本文所述方法的任何实施方式中，LMM可以是转录调节剂。在实施方式中，LMM是转录因子或转录激活剂，其结合DNA或在结合DNA的复合物中关联，并且招募RNA聚合酶或在招募RNA聚合酶的复合物中关联，所述RNA聚合酶用于脂质代谢中所涉及的一种或多种基因产物的转录。在实施方案中，LMM结合固醇结合元件和/或E-box启动子序列。在实施方式中，LMM包含固醇调节元件结合因子1(SREBF1)或固醇调节元件结合因子2(SREBF2)或其功能片段或同种型。
在一些实施方式中，LMM包含全局转录激活剂或转录因子。在实施方式中，LMM能够调节脂质代谢途径的两种或更多种(例如，二，三，四，五，六或更多种)组分的转录，例如，如表3或表4中所提供的。在实施方式中，LMM能够调节两种或更多种脂质代谢途径的一种或更多种(例如，一、二，三，四或五或更多种)组分的转录，例如，表2中所提供的组分和途径。
固醇调节元件结合因子1(SREBF1)是一种全局转录激活剂，其通过结合存在于靶基因启动子区域的固醇调节元件(SRE)和E-box启动子序列(Hagen,Rodriguez-Cuenca等2010)上调脂肪生成，脂肪酸再酯化，脂肪酸去饱和延长和磷脂生物合成中所涉及的基因的转录。SREBF1基因自身的转录通过在基因启动子区域中的其他转录调节元件中存在固醇调节元件(SRE)进行内源性调节。最重要的是，多种翻译后调节机制，包括磷酸化，泛素化，SUMO化，乙酰化，脂肪酸介导的修饰和蛋白水解处理，构成了固定在SREBF1周围的紧密控制但适应性强的稳态系统。
在一些实施方式中，LMM包含酶。在实施方式中，LMM包含将饱和脂肪酸转化为不饱和脂肪酸的酶。在实施方式中，LMM包含这样的酶，其将饱和脂肪酸转化为单不饱和脂肪酸，例如，具有一个双键的脂肪酸。在实施方式中，LMM包含这样的酶，其将饱和脂肪酸转化为多不饱和脂肪酸，例如，具有超过一个，例如2、3、4、5或更多个双键的脂肪酸。在实施方式中，LMM包含硬脂酰CoA去饱和酶1(SCD1)，硬脂酰CoA去饱和酶2(SCD2)，硬脂酰CoA去饱和酶3(SCD3)，硬脂酰CoA去饱和酶4(SCD4)，硬脂酰CoA去饱和酶5(SCD5)，或其功能片段。
在一些实施方式中，如本文所述存在于细胞的LMM受控于启动子。理想地，启动子与LMM基因匹配以使细胞生产LMM最大化。可以用于调节LMM表达的启动子的非限制性示例包括SV40、mCMV和PGK启动子。表3显示了启动子和LMM基因的组合的非限制性示例，例如，它们可以用于例如本文所述任何方法或组合物(例如，细胞)。设想了这些组合各自可以存在于包含(例如，诸如根据本文所述方法被引入细胞中的)P5CS的细胞中。
表3：示例性启动子-LMM组合
启动子 脂质代谢调节剂
SV40 SCD1(小鼠)
SV40 SCD1(CHO)
SV40 SREBF1(CHO)
SV40 SREB411(CHO)
mCMV SCD1(小鼠)
mCMV SCD1(CHO)
mCMV SREBF1(CHO)
mCMV SREB411(CHO)
hCMV SCD1(小鼠)
hCMV SCD1(CHO)
hCMV SREBF1(CHO)
hCMV SREB411(CHO)
PGK SCD1(小鼠)
PGK SCD1(CHO)
PGK SREBF1(CHO)
PGK SREB411(CHO)
本文所述的任何启动子-LMM组合可以与编码酶分子的基因进一步组合，例如，在本文所述的任何细胞、核酸或其他组合物中。例如，本文所述的任何启动子-LMM组合可以存在于进一步包含这样核酸的细胞中，所述核酸编码P5CS分子并且包含本文所述对象核酸。此外，本文所述的任何启动子-LMM组合可以与氨基酸生物合成酶分子的抑制剂(例如，也存在于细胞中的酶分子)一起存在于细胞中。例如，本文所述的任何启动子-LMM组合可以存在于这样的细胞中，所述细胞进一步包含(i)编码P5CS分子且包含本文所述对象核酸的核酸，和(ii)P5CS抑制剂，例如，L-氮杂-2-环丁烷羧酸，3,4-脱氢-L-脯氨酸或L-4-噻唑烷羧酸。表4显示了启动子-LMM-P5CS抑制剂组合的非限制性示例，例如，它们可以用于例如本文所述任何方法或组合物(例如，细胞)。设想了这些组合各自可以存在于包含(例如，诸如根据本文所述方法被引入细胞中的)P5CS的细胞中。
表4：示例性启动子-LMM-P5CS抑制剂组合(例如，在包含P5CS的细胞中，如本文所述)
Figure GDA0002731541300000261
Figure GDA0002731541300000271
细胞和细胞培养
一方面，本公开涉及用于评估、分类、鉴定、选择或制备产生产物(例如本文所述的重组或治疗性多肽或核酸分子)的细胞或细胞系的方法。在另一方面，本公开涉及用于评估、分类、鉴定、选择或制备具有改善的(例如增加的)生产率和产物质量的细胞或细胞系的方法和组合物。通常，本文所述方法可以用于生产包含核酸构建体(例如，整合进入基因组的载体或异源性核酸)的细胞或细胞系，所述核酸构建体包含(i)编码感兴趣的产物的对象核酸序列和(ii)编码参与氨基酸生物合成途径的酶分子的核酸序列，其中所述细胞或细胞系并不内源性表达酶分子。
在实施方式中，细胞是哺乳动物细胞。在其他实施方式中，细胞是除哺乳动物细胞之外的细胞。在一个实施方式中，细胞来自小鼠，大鼠，中国仓鼠，叙利亚仓鼠，猴，猿，狗，马，雪貂或猫。在实施方式中，细胞是哺乳动物细胞，例如，人细胞或啮齿动物细胞，例如仓鼠细胞、小鼠细胞或大鼠细胞。在另一实施方式中，细胞来自鸭、鹦鹉、鱼、昆虫、植物、真菌或酵母。
在实施方式中，细胞是中华仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一个实施方式中，细胞是CHO-K1细胞，CHOK1SV细胞，DG44 CHO细胞，DUXB11 CHO细胞，CHO-S，CHO GS敲除细胞，CHOK1SVFUT8敲除细胞，CHOZN或CHO衍生的细胞。CHO GS敲除细胞(例如，GSKO细胞)是例如CHO-K1SVGS敲除细胞(隆萨生物制剂公司)。CHO FUT8敲除细胞是例如
Figure GDA0002731541300000281
CHOK1SV FUT8敲除(隆萨生物有限公司(Lonza Biologics,Inc.))。
在实施方式中，细胞是HeLa，HEK293，HT1080，H9，HepG2，MCF7，Jurkat，NIH3T3，PC12，PER.C6，BHK(小仓鼠肾细胞)，VERO，SP2/0，NS0，YB2/0，Y0，EB66，C127，L细胞，COS，例如COS1和COS7，QC1-3，CHOK1，CHOK1SV，PotelligentTM(CHOK1SV FUT8-KO)，CHO GS敲除，XceedTM(CHOK1SV GS-KO)，CHOS，CHO DG44，CHO DXB11和CHOZN或从中衍生的任何细胞。
在实施方式中，真核细胞是干细胞。例如，干细胞可以是：多能干细胞，包括胚胎干细胞(ESC)，成年干细胞，诱导性多能干细胞(iPSC)，组织特异性干细胞(例如造血干细胞)和间充质干细胞(MSC)。
在实施方式中，细胞是本文所述的任何细胞的分化形式。在一个实施方式中，所述细胞是源自培养的任何原代细胞的细胞。
在实施方式中，细胞是肝细胞，例如人肝细胞、动物肝细胞或非实质细胞。例如，细胞可以是可铺板(plateable)的代谢合格的人肝细胞，可铺板的诱导合格的人肝细胞，可铺板的Qualyst Transporter CertifiedTM人肝细胞，悬浮合格的人肝细胞(包括10供体和20供体汇集的肝细胞)，人肝枯氏细胞(Kupffer cell)，人肝星状细胞，狗肝细胞(包括单一和汇集的比格尔(Beagle)肝细胞)，小鼠肝细胞(包括CD-1和C57BI/6肝细胞)，大鼠肝细胞(包括Sprague-Dawley、Wistar Han和Wistar肝细胞)，猴肝细胞(包括食蟹猴(Cynomolgus)或恒河猴(Rhesus monkey)肝细胞)，猫肝细胞(包括短毛家猫肝细胞)和兔肝细胞(包括新西兰白兔肝细胞)。示例性的肝细胞可购自三角研究实验室公司(Triangle Research Labs,LLC),6Davis Drive研究三角园，北加利福尼亚，USA 27709。
在一些实施方式中，细胞包含谷氨酰胺合成酶(GS)的敲除。在实施方式中，细胞不包含功能性GS基因。在实施方式中，细胞不包含GS基因。在实施方式中，细胞中的GS基因包含使基因不能够编码功能性GS蛋白的突变。
在实施方式中，该真核细胞是低等真核细胞，例如，酵母细胞(例如毕赤酵母属(Pichia genus)(例如毕赤酵母(Pichia pastoris)，甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)，克氏毕赤酵母(Pichia kluyveri)和安氏毕赤酵母(Pichia angusta))，康呷塔乐属(Komagataella genus)(例如巴斯德康呷塔乐酵母(Komagataella pastoris)，必氏康呷塔乐酵母(Komagataella pseudopastoris)或帕氏呷塔乐酵母(Komagataellaphaffii))，酿酒酵母属(Saccharomyces genus)(例如出芽酵母酿酒酵母(Saccharomycescerevisae)，酿酒酵母(cerevisiae)，克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum))，克鲁维酵母属(Kluyveromyces genus)(例如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)，马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus))，假丝酵母属(Candida genus)(例如产朊假丝酵母(Candida utilis)，可可假丝酵母(Candidacacaoi)，博伊丁假丝酵母(Candida boidinii))，地霉属(Geotrichum genus)(例如发酵地霉(geotrichum fermentans))，多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)，解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。优选的是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)种。巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株的示例是X33、GS115、KM71、KM71H；和CBS7435。
在实施方式中，真核细胞是真菌细胞(例如，曲霉种(Aspergillus sp.)(例如，黑曲霉(A.niger)、烟曲霉(A.fumigatus)、米曲霉(A.orzyae)、构巢曲霉(A.nidula))、枝顶孢种(Acremonium sp.)(例如嗜热支顶孢(A.thermophilum))、毛壳菌种(Chaetomium sp.)(例如嗜热毛壳菌(C.thermophilum))、金孢子菌种(Chrysosporium sp.)(例如嗜热金孢子菌(C.thermophile))、虫草种(Cordyceps sp.)(例如蛹虫草(C.militaris))、棒囊壳种(Corynascus sp.)、栉霉种(Ctenomyces sp.)、镰刀菌种(Fusarium sp.)(例如尖孢镰刀菌(F.oxysporum))、小丛壳种(Glomerella sp.)(例如禾生小丛壳菌(G.graminicola))、肉座菌种(Hypocrea sp.)(例如红褐肉座菌(H.jecorina))、巨座壳种(Magnaporthe sp.)(例如奥载巨座壳菌(M.orzyae))、毁丝霉种(Myceliophthora sp.)(例如嗜热毁丝霉(M.thermophile))、丛赤壳种(Nectria sp.)(例如红球丛赤壳菌(N.heamatococca))、脉孢菌种(Neurospora sp.)(例如粗糙脉孢霉(N.crassa))、青霉种(Penicillium sp.)、孢子丝菌种(Sporotrichum sp.)(例如嗜热孢子丝菌(S.thermophile))、梭孢壳种(Thielaviasp.)(例如疣革菌(T.terrestris)、异梭孢壳霉(T.heterothallica))、木霉种(Trichoderma sp.)(例如里氏木霉(T.reesei))或轮枝孢种(Verticillium sp.)(例如大丽轮枝菌(V.dahlia)))。
在实施方式中，真核细胞是昆虫细胞(例如，Sf9，MimicTMSf9，Sf21，High FiveTM(BT1-TN-5B1-4)，或BT1-Ea88细胞)，藻类细胞(例如，双眉藻种(Amphora sp.)，硅藻种(Bacillariophyceae sp.)，杜氏藻种(Dunaliella sp.)，小球藻种(Chlorella sp.)，衣藻种(Chlamydomonas sp.)，蓝绿藻种(Cyanophyta sp.)(蓝藻细菌)，微拟球藻种(Nannochloropsis sp.)，螺旋藻种(Spirulina sp.)或棕鞭藻种(Ochromonas sp.))或植物细胞(例如，来自单子叶植物(例如，玉米、水稻、小麦或狗尾草(Setaria sp.))，或来自双子叶植物(例如，木薯，土豆，大豆，番茄，烟草，紫花苜蓿，小立碗藓(Physcomitrellapatens)或拟南芥(Arabidopsis sp.))。
在实施方式中，所述细胞是细菌或原核细胞。
在实施方式中，原核细胞是革兰氏阳性细胞，例如芽孢杆菌种(Bacillus sp.)，链霉菌种(Streptomyces sp.)，链球菌种(Streptococcus sp.)，葡萄球菌种(Staphylococcus sp.)或乳酸菌种(Lactobacillus sp.)。可用的芽孢杆菌种(Bacillussp.)是，例如，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)，地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)，纳豆芽孢杆菌(B.natto)，或巨大芽胞杆菌(B.megaterium)。在一些实施方式中，细胞是枯草芽孢杆菌，例如枯草芽孢杆菌3NA和枯草芽孢杆菌168。芽孢杆菌种可获自，例如，芽孢杆菌遗传贮藏中心(Bacillus Genetic Stock Center)，生物科学556公司(Biological Sciences 556)，俄亥俄州哥伦布西第12大道484号43210-1214。
在实施方式中，原核细胞是革兰氏阴性细胞，例如沙门氏菌种(Salmonella sp.)或大肠杆菌(Escherichia coli)，例如TG1，TG2，W3110，DH1，DHB4，DH5a，HMS 174，HMS174(DE3)，NM533，C600，HB101，JM109，MC4100，XL1-Blue和Origami，以及衍生自大肠杆菌B菌株，例如BL-21或BL21(DE3)，或BL21(DE3)pLysS，所有这些都是市售可得的。
合适的宿主细胞是可购得的，例如购自培养物保藏中心如DSMZ(DeutscheSammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH，布伦瑞克，德国)或美国典型培养物保藏中心(ATCC)。
在实施方式中，细胞是本文所述的任何一种细胞，其包含异源性核酸，例如，编码重组多肽(例如，选自表5-8的重组多肽)的对象核酸。
可以根据本领域已知的任何方法培养本文所述的细胞。在一些实施方式中，培养基缺少氨基酸(例如，表1中所列出的一种或多种氨基酸)。在实施方式中，培养基缺少如果细胞已经摄取对象核酸可以拯救其生物合成的氨基酸。在实施方式中，细胞培养按分批培养，分批进料培养，减弱分批补料过度生长(aFOG)，灌注培养或连续培养进行。在实施方式中，所述细胞培养是悬浮培养。在一个实施方式中，将细胞或细胞培养物置于体内以表达重组多肽，例如，置于模型生物体或人对象中。
在一个实施方式中，培养基不含血清。无血清、无蛋白质和化学成分明确的无动物成分(CDACF)培养基市售可得，例如可来自隆萨生物公司(Lonza Biologics)。
在一些实施方式中，可以向培养基添加脂质添加剂(例如，包含胆固醇、油酸、亚油酸或其组合)。
哺乳动物细胞系的合适培养基和培养方法是本领域熟知的，例如，美国专利号5,816,038所述。例如，用于实验室烧瓶或低密度细胞培养且满足特定细胞类型需求的标准细胞培养基的实例为：洛斯维帕克纪念研究所(Roswell Park Memorial Institute，RPMI)1640培养基(Morre,G.，美国医学会杂志(Journal of the American MedicalAssociation)，199，第519页，1967年)，L-15培养基(Leibovitz,A.等人，Amer.J.ofHygiene，78,1p.173ff,1963)，杜贝克改良的Eagle培养基(Dulbecco's modified Eagle'smedium，DMEM)，伊戈尔最低限度必需培养基(Eagle's minimal essential medium，MEM)，汉姆的F12培养基(Ham's F12 medium)(Ham，R.等人，Proc.Natl.Acad.Sc.53,p288ff.1965)或Iscoves修饰的缺少白蛋白、转铁蛋白和卵磷脂的DMEM(Iscoves等人，J.Exp.med.1,p.923ff.,1978)。例如，汉姆的F10或F12培养基是专门为CHO细胞培养而设计的。在EP-481 791中描述了其它特别适合CHO细胞培养的培养基。已知这种培养基可以补充胎牛血清(FBS，也称为胎牛血清FCS)，后者提供了大量激素和生长因子的天然来源。如今，哺乳动物细胞的细胞培养是科学教科书和手册中详细描述的例行操作，例如，其详细包括：例如，R.Ian Fresney，《动物细胞的培养》(Culture of Animal cells)，手册，第4版，Wiley-Liss/N.Y.，2000年。可以配制本文所述的任何细胞培养基以缺少特定氨基酸(例如，表1中所列出的氨基酸)，例如，如果细胞已经摄取对象核酸，那么可以拯救其生物合成的氨基酸。
其他合适的培养方法是技术人员已知的，并且可能取决于重组多肽产物和所利用的宿主细胞。确定或优化适于细胞表达的重组或治疗性多肽的表达和生产的条件在普通技术人员的技术范围内。
用于对细胞进行遗传修饰或基因工程以表达所需多肽或蛋白质的方法是本领域众所周知的，包括例如转染、转导(例如病毒转导)或电穿孔例如核酸(例如，载体)进入细胞。用于将核酸(例如本文所述的异源性核酸或载体)引入宿主细胞的物理方法的示例包括但不限于，磷酸钙沉淀、脂转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法为本领域所熟知。参见例如，Sambrook等,2012,《分子克隆：实验室手册(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL)》，第1-4卷，冷泉港出版社(Cold SpringHarbor Press)，纽约州)。用于将核酸(例如本文所述的异源性核酸或载体)引入宿主细胞的化学手段的示例包括但不限于，胶体分散系统，例如大分子复合物，纳米胶囊，微球，珠粒和脂质基系统，包括水包油乳液，胶束，混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送载剂的示例性胶体系统是脂质体(例如，人造膜囊泡)。现有技术的核酸靶向递送的其他方法是可用的，例如用靶向纳米颗粒的多核苷酸递送或其他合适的亚微米大小的递送系统。
核酸
本文还提供核酸，例如编码产物(例如本文所述的重组多肽)的对象核酸。可以使用本领域已知的重组方法来获得编码所需重组多肽的核酸序列，例如，通过从表达所需核酸序列的细胞中筛选库，例如，基因，通过使用标准技术，通过从已知包含相同序列的载体中获得核酸序列，或直接从包含其的细胞和组织中分离出来。或者，可以合成产生编码重组多肽的核酸，而不是克隆。重组DNA技术和工艺在本领域中是非常先进且成熟的。因此，熟悉本文所述重组多肽氨基酸序列的普通技术人员可以容易地设想或产生编码重组多肽的核酸序列。
重组多肽的表达通常通过将编码重组多肽或其部分的核酸操作性地连接至启动子，并将该构建体掺入表达载体中来实现。载体可适合于复制和整合真核细胞或原核细胞。典型的克隆载体包含其他调控元件，例如转录和翻译终止子、起始序列和可用于调控所需核酸序列表达的启动子。
在实施方式中，产物，例如异源性治疗性多肽，包含多条多肽链，例如含有重链和轻链的抗体或抗体片段。编码多条多肽链的核酸序列可以排列在一起(例如，每条多肽链编码序列排列在同一核酸上)或分开排列(例如，每条多肽链编码序列排列在不同核酸上)。编码包含多条多肽链的异源治疗性多肽的序列可以操作性地连接至单个控制元件，例如第一控制元件，或不同、分开的控制元件(例如，每个多肽链编码序列操作性地连接至其自身的第一控制元件)。在其中编码包含多条多肽链的异源治疗性多肽的序列与不同、分开的控制元件操作性地连接的一个实施方式中，一个或多个(例如，一个，两个，三个，四个，五个，六个或全部)控制元件在第一条件下可具有第一活性水平，而在第二条件下可具有第二活性水平，并且一个或多个(例如，一个，两个，三个，四个，五个，六个或更多)控制元件可以是组成型的。
可以将重组多肽编码核酸序列克隆到许多类型的载体中。例如，可以将核酸克隆到载体中，该载体包括但不限于：质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体包括：表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。在一些实施方式中，表达载体可以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术是本领域众所周知的，并且描述于例如Sambrook等，2012，《分子克隆：实验室手册(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL)》，第1-4卷，纽约州冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)，以及其它病毒学和分子学生物学手册。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒，腺病毒，腺相关病毒，疱疹病毒和慢病毒。一般而言，合适的载体包含在至少一种生物体中起作用的复制起点，包含启动子元件和任选增强子元件的控制元件，方便的限制性核酸内切酶位点以及一种或多种选择性标志物(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。源自病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为其允许转基因的长期、稳定整合及其在子细胞中的繁殖。
载体还可以包括：例如，促进分泌的信号序列，聚腺苷酸化信号和转录终止子(例如来自牛生长激素(BGH)基因)，允许原核生物复制和游离基因复制的元件(例如SV40起点和ColE1或本领域中其它已知的那些)和/或允许选择的元件，例如选择标志物或报道基因。
设想的载体可以包含适合插入编码多肽(例如，外源治疗性多肽或阻遏物多肽)的序列的插入位点。插入位点可包含限制性核酸内切酶位点。
插入位点可包含重组靶位点，其中所述重组靶位点位于编码多肽(例如外源治疗性多肽或阻遏物多肽)的序列的侧面。在一个实施方式中，重组靶位点是lox位点。在重组靶位点是lox位点的情况下，宿主细胞需要Cre重组酶的存在和表达以实现交换或重组事件。
在实施方式中，包含编码本文所述产物(例如，多肽，例如，重组多肽)的核酸序列的载体还包含编码选择标志物的核酸序列。在实施方式中，选择标志物包括谷氨酰胺合成酶(GS)；二氢叶酸还原酶(DHFR)，例如，赋予甲氨蝶呤(MTX)抗性的酶；脯氨酸，或抗生素标志物，例如赋予诸如下述抗生素抗性的酶：潮霉素、新霉素(G418)、博来霉素、嘌呤霉素或杀稻瘟素。在实施方式中，选择标志物包括Selexis选择系统(例如，商购自Selexis SA公司的SUREtechnology PlatformTM和Selexis Genetic ElementsTM)或Catalant选择系统或与之兼容。
在实施方式中，包含本文所述重组产物编码核酸序列的载体包含选择标志物，所述选择标志物可用于鉴定包含编码本文所述重组产物的核酸的一种或多种细胞。在一实施方式中，如本文所述，选择标志物可用于鉴定一种或多种细胞，所述一种或多种细胞包括将重组产物编码核酸序列整合到基因组中。已经整合了重组蛋白编码核酸序列的一种或多种细胞的鉴定可用于选择和工程化稳定表达该产物的细胞或细胞系。
产物
本文提供了用于鉴定、选择或培养能够产生高产量的产物例如多肽(例如，治疗性多肽)的细胞或细胞系的方法和组合物。本公开所涵盖的产物包括但不限于，可以由细胞产生，例如，在其中表达的分子，核酸(例如，非编码核酸，例如，非编码RNA分子，例如，反义RNA，siRNA，tRNA，核糖体RNA，微小RNA，piRNA，snoRNA，snRNA，exRNA，scaRNA或长非编码RNA，例如，Xist或HOTAIR)，多肽(例如，重组和/或治疗性多肽)或其杂交体。在一些实施方式中，细胞进行工程改造或修饰以产生产物。这样的修饰包括引入控制或导致产物生成的分子。例如，通过引入编码多肽例(如重组多肽)的异源性核酸来修饰细胞，并且在适合于例如多肽(例如重组多肽)的产生(如表达和分泌)的条件下培养细胞。在另一个实例中，细胞通过引入异源性核酸来修饰，所述外源核酸控制(例如，增加)由细胞内源表达的多肽的表达，从而使细胞产生的该多肽水平或量高于未修饰细胞中内源产生的水平或量。在实施方式中，通过本文所述的方法鉴定、选择或产生的细胞或细胞系产生可用于治疗医学病症、紊乱或疾病的产物，例如重组多肽。医学病症、紊乱或疾病的示例包括但不限于：代谢疾病或紊乱(例如，代谢酶缺乏症)，内分泌病症(例如，激素缺乏症)，止血，血栓形成，造血功能紊乱，肺部疾病，胃肠道疾病疾病，免疫调节(例如，免疫缺陷)，不育，移植，癌症和感染性疾病。
多肽
在一些实施方式中，产物是多肽，例如，重组多肽。在一些实施方式中，多肽产物可以用于本文所述的任何组合物(例如，细胞)和方法。在一些实施方式中，通过这样的细胞生产多肽，所述细胞生长于包含抑制剂的培养基，例如，酶分子的抑制剂，例如，如本文所述。在一些实施方式中，通过包含LMM(例如，如本文所述)的细胞生产多肽。在实施方式中，LMM在启动子(例如，本文所述)的控制下表达。在一些实施方式中，通过生长于包含LMM(例如，如本文所述)的培养基中的细胞生产多肽。
在实施方式中，多肽是异源性多肽，例如，异源性蛋白质，例如，细胞不天然表达的蛋白质。多肽可以是治疗性蛋白质或诊断性蛋白质，例如，能够用于药物筛选。治疗性或诊断性蛋白质可以是抗体分子，例如抗体或抗体片段，融合蛋白，激素，细胞因子，生长因子，酶，糖蛋白，脂蛋白，报告蛋白，治疗性肽，适配体或所述这些任何一种的结构和/或功能片段或杂合体。在实施方式中，产物，例如异源性治疗性多肽，包含多条多肽链，例如含有重链和轻链的抗体或抗体片段。
在一些实施方式中，产物例如重组多肽是抗体分子。本文涵盖的产物是可用于成像技术的诊断性抗体分子，例如，单克隆抗体或其抗体片段，以及适合于给予对象的治疗性抗体分子，例如，能够用于治疗疾病或紊乱。抗体分子是源自与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列。在一个实施方式中，抗体分子是全长抗体或抗体片段。抗体和多形式蛋白质(multiformat protein)可以是多克隆或单克隆，多链或单链或完整免疫球蛋白，并且可源自天然来源或重组来源。抗体可以是免疫球蛋白分子的四聚体。在一个实施方式中，抗体是单克隆抗体。抗体可以是人抗体或人源化抗体。在一个实施方式中，抗体是IgA，IgG，IgD或IgE抗体。在一个实施方式中，抗体是IgG1，IgG2，IgG3或IgG4抗体。
“抗体片段”指完整抗体或其重组变体的至少部分，并且指完整抗体的抗原结合结构域(例如抗原决定性可变区域)，其使该抗体片段足以识别和特异性结合靶标，例如抗原。抗体片段的示例包括但不限于Fab，Fab'，F(ab')2和Fv片段，scFv抗体片段，线性抗体，单域抗体，如sdAb(VL或VH)，骆驼科动物VHH结构域和由抗体片段形成的多特异性抗体，所述抗体片段例如是包含通过铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段，以及抗体的分离的CDR或其它表位结合片段。抗原结合片段也可被纳入单结构域抗体，最大抗体(maxibody)，迷你抗体(minibody)，纳米抗体，内抗体(intrabody)，双抗体，三抗体，四抗体，v-NAR和双-scFv(参见例如，Hollinger和Hudson,Nature Biotechnology 23:1126-1136,2005)。抗原结合片段也可基于多肽例如III型纤连蛋白(Fn3)移植到支架中(参见描述纤连蛋白多肽迷你抗体的美国专利号6,703,199)。
在实施方式中，多肽(例如，由细胞和/或根据本文描述的方法产生的)是例如BOTOX，B型肉毒毒素(Myobloc)，肉毒毒素制剂(Neurobloc)，益普生肉毒杆菌素(Dysport)(或肉毒杆菌神经毒素的其他血清型)，葡糖苷酶α(alglucosidaseα)，达托霉素(daptomycin)，YH-16，绒毛膜促性腺激素α，非格司亭(filgrastim)，西曲瑞克(cetrorelix)，白介素-2，阿地白介素(aldesleukin)，特斯莱素(teceleulin)，地尼白介素(denileukin diftitox)，干扰素α-n3(injection)，干扰素α-nl，DL-8234，干扰素，三得利蛋白(Suntory)(γ-1a)，干扰素γ，胸腺素α1，他索纳明(tasonermin)，DigiFab，ViperaTAb，EchiTAb，CroFab，奈西立肽(nesiritide)，阿巴西普(abatacept)，阿法赛特(alefacept)，Rebif，伊托特肽α(eptoterminalfa)，特立帕肽(teriparatide)，降钙素(calcitonin)，依那西普(etanercept)，血红蛋白谷氨酸250(牛)，多去科肽α(drotrecoginα)，胶原酶，卡培立肽(carperitide)，重组人表皮生长因子，DWP401，达贝泊汀α(darbepoetinα)，依泊汀(epoetin)Ω，依泊汀β，依泊汀α，地西卢定(desirudin)，来匹卢定(lepirudin)，比伐卢定(bivalirudin)，诺那凝血素α(nonacogα)，莫诺宁(Mononine)，依他凝血素α(eptacogα)(活化的)，重组因子VIII+VWF，浓缩的重组抗血友病因子(Recombinate)，重组因子VIII，因子VIII(重组)，阿芬酸(Alphnmate)，辛凝血素α(octocogα)，因子VIII，帕利夫明(palifermin)，印地激酶(Indikinase)，替奈普酶(tenecteplase)，阿替普酶(alteplase)，帕米特普酶(pamiteplase)，瑞替普酶(reteplase)，那替普酶(nateplase)，孟替普酶(monteplase)，促滤泡素α，rFSH，hpFSH，米卡芬净(micafungin)，培非格司亭(pegfilgrastim)，来格司亭(lenograstim)，那托司亭(nartograstim)，舍莫瑞林(sermorelin)，胰高血糖素，艾塞那肽(exenatide)，普兰林肽(pramlintide)，伊米苷酶(iniglucerase)，加硫酶(galsulfase)，留可曲平(Leucotropin)，莫拉司亭(molgramostirn)，乙酸曲普瑞林，组氨瑞林(histrelin)(Hydron)，德舍瑞林(deslorelin)，组氨瑞林(histrelin)，那法瑞林(nafarelin)，亮丙瑞林(leuprolide)(ATRIGEL)，亮丙瑞林(DUROS)，戈舍瑞林(goserelin)，尤得盼(Eutropin)，生长激素，美卡舍明(mecasermin)，恩夫韦替(enlfavirtide)，Org-33408，甘精胰岛素，赖谷胰岛素，胰岛素(吸入的)，赖脯胰岛素，德特米胰岛素(insulin deternir)，胰岛素(RapidMist)，美卡舍明瑞法巴特(mecasermin rinfabate)，阿那白滞素(anakinra)，西莫白介素(celmoleukin)，99mTc-阿普西肽，髓体(Myeloid)，倍他塞隆，乙酸格拉替雷(glatiramer)，格旁(Gepon)，沙格司亭(sargramostim)，奥普瑞白介素(oprelvekin)，人白细胞来源的α干扰素，倍尔来福(Bilive)，胰岛素(重组)，重组人胰岛素，门冬胰岛素，美卡舍明(mecasenin)，罗扰素-A(Roferon-A)，干扰素-α2，阿法飞龙(Alfaferone)，奥氟康-1(alfercon-1)干扰素，干扰素α，Avonex重组人促黄体激素，链道酶α(dornaseα)，曲弗明(trafermin)，齐考诺肽(ziconotide)，他替瑞林(taltirelin)，地博特明α(diboterminalfa)，阿托西班(atosiban)，贝卡普勒明(becaplermin)，依替巴肽(eptifibatide)，扎马拉(Zemaira)，CTC-111，夏伐克-B(Shanvac-B)，奥曲肽，兰瑞肽(lanreotide)，安瑟斯替(ancestirn)，半乳糖苷酶(agalsidase)β，半乳糖苷酶α，拉罗尼酶(laronidase)，蓝铜胜肽(prezatide Copper acetate)，拉布立酶(rasburicase)，兰尼单抗(ranibizumab)，干扰素γ-1b(Actimmune)，PEG-内含子，曲可明(Tricomin)，重组人甲状旁腺激素(PTH)1-84，依泊汀Δ，转基因抗凝血酶III，格兰蒂曲平(Granditropin)，透明质酸酶(Vitrase)，重组氧化气体递送室，干扰素-α，GEM-21S，伐普肽(vapreotide)，艾度硫酸酯酶(idursulfase)，奥马曲拉(omnapatrilat)，重组血清白蛋白，赛妥珠单抗(certolizumab pegol)，羧肽酶(glucarpidase)，人重组C1酯酶抑制剂，拉诺普酶(lanoteplase)，重组人生长激素，恩夫韦地(enfuvirtide)，VGV-1，干扰素(α)，芦西纳坦(lucinactant)，阿维帕地尔(aviptadil)，艾替班特(icatibant)，艾卡拉肽(ecallantide)，奥米加南(omiganan)，奥罗格拉布(Aurograb)，乙酸培西加南(pexigananacetate)，ADI-PEG-20，LDI-200，地加瑞克(degarelix)，星区德林(cintredelinbesudotox)，Favld，MDX-1379，ISAtx-247，利拉鲁肽(liraglutide)，特立帕肽(teriparatide)，替法可近(tifacogin)，AA4500，T4N5脂质体乳液，卡妥索单抗(catumaxomab)，DWP413，ART-123，克里萨林(Chrysalin)，去氨普酶(desmoteplase)，安地普酶(amediplase)，克里夫力α(corifollitropinα)，TH-9507，替度鲁肽(teduglutide)，戴麦德(Diamyd)，DWP-412，生长激素，重组G-CSF，胰岛素，胰岛素(Technosphere)，胰岛素(AERx)，RGN-303，DiaPep277，干扰素β，干扰素α-n3，贝拉西普(belatacept)，经皮胰岛素补丁，AMG-531，MBP-8298，Xerecept，奥培巴康(opebacan)，AIDSVAX，GV-1001，LymphoScan，豹蛙酶(ranpirnase)，利普散(Lipoxysan)，卢苏普肽(lusupultide)，MP52，西普鲁塞-T(sipuleucel-T)，CTP-37，印瑟吉(Insegia)，维特斯朋(vitespen)，人凝血酶，凝血酶，TransMID，蛇毒纤溶酶(alfimeprase)，普瑞凯希(Puricase)，特利加压素(terlipressin)，EUR-1008M，重组FGF-I，BDM-E，罗替格普肽(rotigaptide)，ETC-216，P-113，MBI-594AN，耐久霉素，SCV-07，OPI-45，内皮抑素(Endostatin)，血管抑素(Angiostatin)，ABT-510，包曼-伯克型抑制剂(Bowman Birk Inhibitor)，XMP-629，99mTc-Hynic-膜联蛋白V，卡哈拉德F(kahalalide F)，CTCE-9908，替维瑞克(teverelix)，奥匝瑞里(ozarelix)，若尼德鑫(rornidepsin)，BAY-504798，白介素4，PRX-321，佩斯坎(Pepscan)，波塔德金(iboctadekin)，rh乳铁蛋白(rhlactoferrin)，TRU-015，IL-21，ATN-161，西仑吉肽(cilengitide)，白蛋白干扰素(Albuferon)，Biphasix，IRX-2，Ω干扰素，PCK-3145，CAP-232，帕瑞肽(pasireotide)，huN901-DMI，SB-249553，Oncovax-CL，OncoVax-P，BLP-25，CerVax-16，MART-1，gp100，酪氨酸酶(tyrosinase)，奈米非肽(nemifitide)，rAAT，CGRP，派森那赛(pegsunercept)，胸腺素β4，普立肽(plitidepsin)，GTP-200，雷莫拉宁(ramoplanin)，GRASPA，OBI-1，AC-100，鲑降钙素(salmon calcitonin)(eligen)，艾沙瑞林(examorelin)，卡莫瑞林(capromorelin)，卡德法(Cardeva)，维拉弗明(velafermin)，131I-TM-601，KK-220，T-10，乌拉立肽(ularitide)，地来司他(depelestat)，赫马肽(hematide)，克里萨林(Chrysalin)，rNAPc2，重组因子V111(PEG化脂质体)，bFGF，PEG化重组葡萄球菌激酶变体，V-10153，SonoLysis Prolyse，NeuroVax，CZEN-002，rGLP-1，BIM-51077，LY-548806，艾塞那肽(exenatide)(控释，Medisorb)，AVE-0010，GA-GCB，阿伏瑞林(avorelin)，ACM-9604，醋酸利那洛特(linaclotid eacetate)，CETi-1，赫莫斯盘(Hemospan)，VAL，快速作用胰岛素(可注射，Viadel)，胰岛素(eligen)，重组甲硫氨酰基人瘦素，匹揣金那(pitrakinra)，多可因(Multikine)，RG-1068，MM-093，NBI-6024，AT-001，PI-0824，Org-39141，Cpn10，他乳铁蛋白(talactoferrin)，rEV-131，rEV-131，重组人胰岛素，RPI-78M，奥普瑞白介素(oprelvekin)，CYT-99007CTLA4-Ig，DTY-001，伐拉司特(valategrast)，干扰素α-n3，IRX-3，RDP-58，Tauferon，胆汁盐刺激脂肪酶，莫里酶((Merispase)，阿兰磷酸酶(alaline phosphatase)，EP-2104R，美拉诺坦-II(Melanotan-II)，布雷莫来肽(bremelanotide)，ATL-104，重组人微胞浆素(microplasmin)，AX-200，SEMAX，ACV-1，Xen-2174，CJC-1008，强啡肽(dynorphin)A，SI-6603，LAB GHRH，AER-002，BGC-728，ALTU-135，重组神经氨酸苷酶，Vacc-5q，Vacc-4x，Tat类毒素，YSPSL，CHS-13340，PTH(1-34)(Novasome)，奥斯布尔-C(Ostabolin-C)，PTH类似物，MBRI-93.02，MTB72F，MVA-Ag85A，FARA04，BA-210，重组瘟疫FIV，AG-702，OxSODrol，rBetV1，Der-p1/Der-p2/Der-p7，PR1太抗原，突变ras疫苗，HPV-16E7脂肽疫苗，拉贝林(labyrinthin)，WT1-肽，IDD-5，CDX-110，明曲斯(Pentrys)，诺雷林(Norelin)，CytoFab，P-9808，VT-111，艾罗卡肽(icrocaptide)，替柏明(telbermin)，芦平曲韦(rupintrivir)，雷替库罗(reticulose)，rGRF，HA，α-半乳糖苷酶A，ACE-011，ALTU-140，CGX-1160，血管紧缩素(angiotensin)，D-4F，ETC-642，APP-018，rhMBL，SCV-07，DRF-7295，ABT-828，ErbB2-特异性免疫毒素，DT3SSIL-3，TST-10088，PRO-1762，Combotox，肠促胰酶肽-B/胃泌激素-受体结合肽，111In-hEGF，AE-37，曲妥珠单抗-DM1(trasnizumab-DM1)，拮抗剂G，IL-12，PM-02734，IMP-321，rhIGF-BP3，BLX-883，CUV-1647，基于L-19的ra，Re-188-P-2045，AMG-386，DC/1540/KLH，VX-001，AVE-9633，AC-9301，NY-ESO-1(肽)，NA17.A2肽，CBP-501，重组人乳铁蛋白，FX-06，AP-214，WAP-8294A，ACP-HIP，SUN-11031，肽YY[3-36]，FGLL，阿塞西普(atacicept)，BR3-Fc，BN-003，BA-058，人甲状旁腺激素1-34，F-18-CCR1，AT-1100，JPD-003，PTH(7-34)(Novasome)，耐久霉素(duramycin)，CAB-2，CTCE-0214，糖PEG化红细胞生成素(GlycoPEGylatederythropoietin)，EPO-Fc，CNTO-528，AMG-114，JR-013，因子XIII，氨基康定(aminocandin)，PN-951，716155，SUN-E7001，TH-0318，BAY-73-7977，替维瑞克(teverelix)，EP-51216，hGH，OGP-I，西夫韦肽(sifuvirtide)，TV4710，ALG-889，Org-41259，rhCC10，F-991，胸腺五肽(thymopentin)，r(m)CRP，肝管选择性(hepatoselective)胰岛素，苏靶林(subalin)，L19-IL-2融合蛋白，弹力素(elafin)，NMK-150，ALTU-139，EN-122004，rhTPO，促血小板生成素受体激动剂，AL-108，AL-208，神经生长因子拮抗剂，SLV-317，CGX-1007，INNO-105，特立帕肽(teriparatide)(eligen)，GEM-OS1，AC-162352，PRX-302，LFn-p24融合体，EP-1043，gpE1，gpE2，MF-59，hPTH(1-34)，768974，SYN-101，PGN-0052，阿维库明(aviscumnine)，BIM-23190，多表位酪氨酸酶肽，恩卡斯替母(enkastim)，APC-8024，GI-5005，ACC-001，TTS-CD3，血管靶向TNF，去氨加压素(desmopressin)，奥那西普(onercept)和TP-9201。
在一些实施方式中，多肽(例如，通过细胞和/或根据本文所述方法产生的)是阿达木单抗(adalimumab)(HUMIRA)，英利昔单抗(infliximab)(REMICADETM)，利妥昔单抗(rituximab)(RITUXANTM/MAB THERATM)依那西普(etanercept)(ENBRELTM)，贝伐单抗(bevacizumab)(AVASTINTM)，曲妥珠单抗(trastuzumab)(HERCEPTINTM)，派革利革斯丁(pegrilgrastim)(NEULASTATM)，或任何其它合适的多肽，包括生物类似物和生物改良剂。
其他合适的多肽(例如，通过细胞和/或根据本文所述方法产生的)包括但不限于下表5以及US2016/0097074的表1中所列的那些。
表5：示例性多肽
Figure GDA0002731541300000411
Figure GDA0002731541300000421
Figure GDA0002731541300000431
Figure GDA0002731541300000432
在实施方式中，多肽(例如，通过细胞和/或根据本文所述方法产生的)是如表6所示的激素、血液凝固/凝结因子、细胞因子/生长因子、抗体分子、融合蛋白、蛋白疫苗或肽。
表6：示例性产物
Figure GDA0002731541300000441
Figure GDA0002731541300000451
Figure GDA0002731541300000461
在实施方式中，多肽(例如，通过细胞和/或根据本文所述方法产生的)是多特异性蛋白质，例如，双特异性抗体。在实施方式中，多特异性蛋白质如表7所示。
表7：示例性双特异性形式
Figure GDA0002731541300000462
Figure GDA0002731541300000471
Figure GDA0002731541300000481
Figure GDA0002731541300000491
Figure GDA0002731541300000501
Figure GDA0002731541300000511
在实施方式中，多肽(例如，通过细胞和/或根据本文所述方法产生的)是表8中所列出的一种。
表8
Figure GDA0002731541300000512
表8
Figure GDA0002731541300000521
表8
Figure GDA0002731541300000531
表8
Figure GDA0002731541300000541
表8
Figure GDA0002731541300000551
表8
Figure GDA0002731541300000561
在实施方式中，多肽(例如，通过细胞和/或根据本文所述方法产生的)是由癌细胞所表达的抗原。在一些实施方式中，重组或治疗性多肽是肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。在一些实施方式中，重组或治疗性多肽选自HER2，CD20，9-O-乙酰基-GD3，βhCG，A33抗原，CA19-9标志物，CA-125标志物，钙网蛋白，碳酸酐酶IX(MN/CA IX)，CCR5，CCR8，CD19，CD22，CD25，CD27，CD30，CD33，CD38，CD44v6，CD63，CD70，CC123，CD138，癌胚抗原(CEA；CD66e)，桥粒芯蛋白4，E-钙粘蛋白新表位，内皮唾液酸蛋白，肝配蛋白A2(EphA2)，表皮生长因子受体(EGFR)，上皮细胞粘附分子(EpCAM)，ErbB2，胎儿乙酰胆碱受体，成纤维细胞活化抗原(FAP)，岩藻糖基GM1，GD2，GD3，GM2，神经节苷脂GD3，Globo H，糖蛋白100，HER2/neu，HER3，HER4，胰岛素样生长因子受体1，Lewis-Y，LG，Ly-6，黑色素瘤特异性软骨素硫酸盐蛋白聚糖(MCSCP)，间皮素，MUCl，MUC2，MUC3，MUC4，MUC5AC，MUC5B，MUC7，MUC166，穆勒抑制性物质(MIS)受体II型，浆细胞抗原，多聚SA，PSCA，PSMA，音猬因子(SHH)，SAS，STEAP，sTn抗原，TNF-α前体及其组合。
在一些实施方式中，多肽(例如，通过细胞和/或根据本文所述方法产生的)是活化受体，并且选自2B4(CD244)，α4β1整联蛋白，β2整联蛋白，CD2，CD16，CD27，CD38，CD96，CD100，CD160，CD137，CEACAM1(CD66)，CRTAM，CS1(CD319)，DNAM-1(CD226)，GITR(TNFRSF18)，活化形式的KIR，NKG2C，NKG2D，NKG2E，一种或多种天然细胞毒性受体，NTB-A，PEN-5及其组合，任选地其中β2整联蛋白包含CD11a-CD 18，CD11b-CD 18或CD11c-CD 18，任选地其中KIR的活化形式包括KlR2DS1，KIR2DS4或KIR-S，并且任选地其中天然细胞毒性受体包括NKp30，NKp44，NKp46或NKp80。
在一些实施方式中，多肽(例如，通过细胞和/或根据本文所述方法产生的)是抑制型受体，并且选自KIR，ILT2/LIR-1/CD85j，抑制型形式的KIR，KLRG1，LAIR-1，NKG2A，NKR-P1A，Siglec-3，Siglec-7，Siglec-9及其组合，任选地其中抑制型形式的KIR包括KIR2DL1，KIR2DL2，KIR2DL3，KIR3DL1，KIR3DL2或KIR-L。
在一些实施方式中，多肽(例如，通过细胞和/或根据本文所述方法产生的)是活化受体，并且选自：CD3、CD2(LFA2、OX34)、CD5、CD27(TNFRSF7)、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD40L、CD84(SLAMF5)、CD137(4-1BB)、CD226、CD229(Ly9、SLAMF3)、CD244(2B4、SLAMF4)、CD319(CRACC、BLAME)、CD352(Lyl08、NTBA、SLAMF6)、CRTAM(CD355)、DR3(TNFRSF25)、GITR(CD357)、HVEM(CD270)、ICOS、LIGHT、LTβR(TNFRSF3)、OX40(CD134)、NKG2D、SLAM(CD150、SLAMF1)、TCRα、TCRβ、TCRδγ、TIM1(HAVCR、KIM1)及其组合。
在一些实施方式中，多肽(例如，通过细胞和/或根据本文所述方法产生的)是抑制型受体，并且选自PD-1(CD279)，2B4(CD244，SLAMF4)，B71(CD80)，B7Hl(CD274，PD-L1)，BTLA(CD272)，CD160(BY55，NK28)，CD352(Ly108，NTBA，SLAMF6)，CD358(DR6)，CTLA-4(CD152)，LAG3，LAIR1，PD-1H(VISTA)，TIGIT(VSIG9，VSTM3)，TIM2(TIMD2)，TIM3(HAVCR2，KIM3)及其组合。
其它示例性多肽(例如，通过细胞和/或根据本文所述方法产生的)包括但不限于Leader等“蛋白质治疗剂：概述和药理学分类(Protein therapeutics:a summary andpharmacological classification)”,Nature Reviews Drug Discovery,2008,7:21-39(通过引用纳入本文)的表1-10中所述的任何蛋白质；或本文所述重组多肽的任何偶联物，变体，类似物或功能片段。
其他重组蛋白(例如，通过细胞和/或根据本文所述方法产生的)产品包括非抗体支架或替代性蛋白支架，例如但不限于：DARPin、亲和体和模拟抗体蛋白(adnectin)。可以将该非抗体支架或替代性蛋白支架进行工程化以鉴定一种或两种或更多种(例如1、2、3、4或5种或更多种)不同的靶或抗原或与之结合。
应用
本文所公开的鉴定、选择和/或培养细胞的方法可以用于生成能够用于产生多种产物的细胞，评估多种细胞系，或者评估用于生物反应器或处理容器或罐的多种细胞系的产生，或者，更通常地，与任何进料来源。本文所述的组合物和方法适用于培养任何所需的细胞系，包括例如原核和/或真核细胞系。此外，在一些实施方式中，本文所述组合物和方法适用于培养悬浮细胞或锚定依赖性(贴壁)细胞，并且适用于构造用于生产药物和生物制药产品(例如多肽产品，核酸产物(例如DNA或RNA)，或细胞和/或病毒，例如用于细胞和/或病毒治疗的那些)的生产操作。
在一些实施方式中，细胞表达或产生产物，如重组治疗或诊断产物。如下更加详细的描述，细胞产生的产物的实例包括但不限于抗体分子(例如，单克隆抗体，双特异性抗体)，抗体模拟物(特异性结合抗原的多肽分子，但是与抗体诸如DARP素、亲和体、阿迪连接素(adnectin)或IgNAR结构上不相关的抗原)，融合蛋白(例如，Fc融合蛋白，嵌合细胞因子)，或其它重组蛋白(例如，糖基化蛋白，酶，激素)，病毒治疗(例如，基因疗法和病毒免疫疗法的病毒载体，抗癌溶瘤细胞)，细胞治疗(例如，多能干细胞，间充质干细胞和成体干细胞)，疫苗或脂质包封的颗粒(例如，外来体，病毒样颗粒)，RNA(例如，siRNA)或DNA(例如，质粒DNA)，抗生素或氨基酸。在实施方式中，本文所述组合物和方法可用于生产生物仿制药。
如本文所述，在实施方式中，本文所述的组合物和方法允许产生真核细胞，例如，哺乳动物细胞或低等真核细胞，例如酵母细胞或丝状真菌细胞，或原核细胞，如革兰氏阳性或革兰氏阴性细胞和/或真核或原核细胞的产物，例如，蛋白质，肽，抗生素，氨基酸，核酸(如DNA或RNA)，由真核细胞以大规模方式合成。除非本文另有说明，否则本文所述的组合物和方法可以包括任何所需体积或生产产量，包括但不限于实验室规模产量，半工业规模产量和完整生产规模产量。
此外，除非在本文中另外说明，本文所述组合物和方法可以与任何合适的反应器联用，包括但不限于，搅拌槽，空运，纤维，微纤维，中空纤维，陶瓷基质，流化床，固定床和/或喷射床生物反应器。本文所用的“反应器”可包括发酵罐或发酵单元，或任何其它反应容器，并且术语“反应器”与“发酵罐”可以互换使用。例如，在一些方面中，生物反应器单元可以进行下述一项或多项或全部：营养物和/或碳源的进料，注入合适的气体(例如，氧气)，发酵或细胞培养基的入口和出口流动，气相和液相的分离，维持温度，维持氧气和CO2水平，维持pH水平，搅拌(例如，混合)和/或清洁/消毒。示例性反应器单元，如发酵单元，在单元内可以包含多个反应器，例如，单元在各单元中可以具有1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100或更多个生物反应器，和/或设备可以包含在设备内具有单个或多个反应器的多个单元。在各种实施方式中，生物反应器可以适用于批次，半批次、分批补料、灌注和/或连续发酵过程。可以使用任何合适的反应器直径。在实施方式中，生物反应器可以具有约100mL至约50,000L的体积。非限制性的实例包括100mL、250mL、500mL、750mL、1升、2升、3升、4升、5升、6升、7升、8升、9升、10升、15升、20升、25升、30升、40升、50升、60升、70升、80升、90升、100升、150升、200升、250升、300升、350升、400升、450升、500升、550升、600升、650升、700升、750升、800升、850升、900升、950升、1000升、1500升、2000升、2500升、3000升、3500升、4000升、4500升、5000升、6000升、7000升、8000升、9000升、10,000升、15,000升、20,000升和/或50,000升的体积。另外，合适的反应器可以是多用途、单用途、一次性或非一次性的，并且可以由任何合适的材料形成，包括金属合金，例如不锈钢(例如316L或任何其他合适的不锈钢)以及因康镍合金(Inconel)、塑料和/或玻璃。在一些实施方式中，合适的反应器可以是圆形的，例如，圆柱形的。在一些实施方式中，合适的反应器可以是方形的，例如，矩形的。在一情况下，方形反应器可提供优于圆形反应器的有点，例如易于使用(例如，由技术人员进行装载和设置)、反应器内容物的更大混合和均质性以及较低的占地面积。
在实施方式中并且除非本文另外说明，本文所述的组合物和方法可以与并未另外提及的任何合适的单元操作和/或器材联用，如用于分离、纯化和/或分离这些产物的操作和/或器材。可以使用任何合适的设备和环境，如传统的粘贴建立设备，模块化，流动和临时设备，或任何其它合适的结构，设备和/或布置。例如，在一些实施方式中，可以使用模块化无尘室。另外，除非另有说明，本文所述组合物和方法可以容纳在单个位置或设施中和/或在其中进行，或者可替代性地容纳在单独或多个位置和/或设施中和/或在其中进行。
作为非限制性实例且非限制，美国公开号2013/0280797；美国公开第号2012/0077429；美国公开号2011/0280797；美国公开号2009/0305626；和美国专利号8,298,054；美国专利号7,629,167；和美国专利号No.5,656,491描述了可能合适用于与本文所述组合物和方法联用的示例性设施、设备和/或系统，所述文献通过引用全文纳入本文。
本文所述组合物和方法可以利用广谱的细胞。在一些实施方式中，所述细胞是真核细胞，例如，哺乳动物细胞。哺乳动物细胞可以是，例如，人或啮齿动物或牛细胞系或细胞株。该细胞、细胞系或细胞株的实例为：例如，小鼠骨髓瘤(NSO)细胞系，中华仓鼠卵巢(CHO)细胞系，HT1080，H9，HepG2，MCF7，MDBK Jurkat，NIH3T3，PC12，BHK(幼仓鼠肾细胞)，VERO，SP2/0，YB2/0，Y0，C127，L细胞，COS，例如COS1和COS7，QC1-3，HEK-293，VERO，PER.C6，Hela，EB1，EB2，EB3，溶瘤或杂交瘤细胞系。优选哺乳动物细胞是CHO细胞系。在一个实施方式中，细胞是CHO细胞。在一个实施方式中，细胞是CHO-K1细胞、CHO-K1 SV细胞、DG44 CHO细胞、DUXB11 CHO细胞、CHOS细胞、CHO GS敲除细胞、CHO FUT8 GS敲除细胞、CHOZN细胞、或CHO-衍生细胞。CHO GS敲除细胞(例如，GSKO细胞)是，例如，CHO-K1SV GS敲除细胞。CHO FUT8敲除细胞是例如
Figure GDA0002731541300000601
CHOK1 SV(隆萨生物有限公司)。真核细胞也可以是禽细胞、细胞系或细胞株，例如，
Figure GDA0002731541300000602
细胞，EB14，EB24，EB26，EB66或EBv13。
在一个实施方式中，所述真核细胞是干细胞。例如，干细胞可以是：多能干细胞，包括胚胎干细胞(ESC)，成年干细胞，诱导性多能干细胞(iPSC)，组织特异性干细胞(例如，造血干细胞)和间充质干细胞(MSC)。
在一实施方式中，细胞是本文所述的任何细胞的分化形式。在一个实施方式中，细胞是源自培养的任何原代细胞的细胞。
在实施方式中，细胞是肝细胞，例如人肝细胞、动物肝细胞或非实质细胞。例如，细胞可以是可铺板(plateable)的代谢合格的人肝细胞，可铺板的诱导合格的人肝细胞，可铺板的Qualyst Transporter CertifiedTM人肝细胞，悬浮合格的人肝细胞(包括10供体和20供体汇集的肝细胞)，人肝枯氏细胞(kupffer cell)，人肝星状细胞，狗肝细胞(包括单一和汇集的比格尔(Beagle)肝细胞)，小鼠肝细胞(包括CD-1和C57BI/6肝细胞)，大鼠肝细胞(包括Sprague-Dawley、Wistar Han和Wistar肝细胞)，猴肝细胞(包括食蟹猴(Cynomolgus)或恒河猴(Rhesus monkey)肝细胞)，猫肝细胞(包括短毛家猫肝细胞)和兔肝细胞(包括新西兰白兔肝细胞)。示例性的肝细胞可购自三角研究实验室公司(Triangle Research Labs,LLC),6Davis Drive研究三角园，北加利福尼亚，USA 27709。
在一个实施方式中，该真核细胞是低等真核细胞，例如，酵母细胞(例如毕赤酵母属(Pichia genus)(例如毕赤酵母(Pichia pastoris)，甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)，克氏毕赤酵母(Pichia kluyveri)和安氏毕赤酵母(Pichia angusta))，康呷塔乐属(Komagataella genus)(例如巴斯德康呷塔乐酵母(Komagataella pastoris)，必氏康呷塔乐酵母(Komagataella pseudopastoris)或帕氏呷塔乐酵母(Komagataellaphaffii))，酿酒酵母属(Saccharomyces genus)(例如出芽酵母酿酒酵母(Saccharomycescerevisae)，酿酒酵母(cerevisiae)，克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum))，克鲁维酵母属(Kluyveromyces genus)(例如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)，马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus))，假丝酵母属(Candida genus)(例如产朊假丝酵母(Candida utilis)，可可假丝酵母(Candidacacaoi)，博伊丁假丝酵母(Candida boidinii))，地霉属(Geotrichum genus)(例如发酵地霉(geotrichum fermentans))，多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)，解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。优选的是毕赤酵母种类。毕赤酵母菌株的实例是X33、GS115、KM71、KM71H；和CBS7435。
在一个实施方案中，真核细胞是真菌细胞(例如曲霉菌属(Aspergillus)(例如黑曲霉(A.niger)，烟曲霉(A.fumigatus)，米曲霉(A.orzyae)，红蛋曲霉(A.nidula))，支顶孢属(Acremonium)(例如嗜热支顶孢(A.thermophilum))，毛壳菌属(Chaetomium)(例如嗜热毛壳菌(C.thermophilum))，金孢菌属(Chrysosporium)(例如嗜热金孢菌(C.thermophile))，冬虫夏草属(Cordyceps)(例如蛹虫草菌(C.militaris))，棒囊壳属(Corynascus)、栉霉属(Ctenomyces)、镰刀菌属(Fusarium)(例如尖孢镰刀菌(F.oxysporum))，小丛壳属(Glomerella)(例如禾生小丛壳(G.graminicola))，肉座菌属(Hypocrea)(例如丝状真菌红褐肉座菌(H.jecorina))，稻瘟病菌属(Magnaporthe)(例如稻瘟病菌(M.orzyae))，毁丝霉属(Myceliophthora)(例如嗜热毁丝霉属(M.thermophile))，丛赤壳属(Nectria)(例如红球丛赤壳菌(N.heamatococca))，脉孢霉属(Neurospora)(例如粗糙脉孢菌(N.crassa)，青霉菌属(Penicillium)，侧孢霉属(Sporotrichum)(例如嗜热侧孢霉(S.thermophile))，棱孢壳属(Thielavia)(例如太瑞斯梭孢壳霉(T.terrestris)、异梭孢壳霉(T.heterothallica)，木霉属(Trichoderma)(例如里氏木霉(T.reesei))或轮枝孢属(Verticillium)(例如大丽花轮枝孢(V.dahlia))。
在一个实施方式中，真核细胞是昆虫细胞(例如，Sf9，MimicTMSf9，Sf21，HighFiveTM(BT1-TN-5B1-4)或BT1-Ea88细胞)，藻类细胞(例如，双眉藻属，硅藻纲(bacillariophyceae)，杜氏藻属，小球藻属，衣藻属，蓝藻属(蓝细菌)，微拟球藻，螺旋藻或棕鞭草(Ochromonas))，或植物细胞(例如来自单子叶植物(例如玉米，水稻，小麦或狗尾草)或来自双子叶植物(例如木薯，马铃薯，大豆，番茄，烟草，苜蓿，小立碗藓或拟南芥)的细胞。
在一些实施方式中，培养的细胞用于产生蛋白质(例如，抗体，例如，单克隆抗体)和/或重组蛋白质，用于治疗用途。在一些实施方式中，培养的细胞产生肽、氨基酸、脂肪酸或其他有用的生化中间体或代谢产物。例如，在一些实施方式中，可以产生分子量为约4000道尔顿(dalton)至大于约140,000道尔顿的分子。在一些实施方式中，这些分子可以具有一定范围的复杂性，并且可以包括翻译后修饰，其包括糖基化。
多个实施方式
例如，本发明可以定义为下述任意编号段落。
1.一种鉴定、选择或培养包含对象核酸序列的细胞的方法，所述方法包括：
a)提供包含以下的细胞：异源性核酸，例如，载体，例如，可复制载体或整合载体，其包含：
(i)所述对象核酸序列；和
(ii)核酸序列，当其表达时导致氨基酸合成途径(例如，脯氨酸合成途径)中酶的活性水平升高，例如，编码包含所述活性的酶分子的核酸序列；和
b)在足以允许包含所述核酸序列的细胞生长的条件下，在氨基酸(例如，脯氨酸)水平不足以支持与活性未升高的细胞相同的细胞的生长的培养基存在的情况下培养包含所述核酸序列的细胞，
从而鉴定、选择或培养包含所述异源性核酸序列的细胞。
2.如实施方式1所述的方法，其中，所述异源性核酸包括载体。
3.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述异源性核酸包括可复制载体，例如，自我可复制(self-replicable)载体。
4.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述异源性核酸包括整合载体。
5.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述培养基还包含所述酶活性的抑制剂。
6.如实施方式5所述的方法，其中，所述抑制剂是氨基酸。
7.如实施方式5所述的方法，其中，所述抑制剂不是氨基酸。
8.如前述实施方式中任一项所述的方法，其包括鉴定包含异源性核酸序列的细胞。
9.如前述实施方式中任一项所述的方法，其包括选择包含异源性核酸序列的细胞。
10.如前述实施方式中任一项所述的方法，其包括培养包含异源性核酸序列的细胞。
11.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述异源性核酸包括多个载体(例如，其中所述对象核酸以及导致酶活性水平升高的核酸包含在多个载体中，例如，在不同的载体上)。
12.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述异源性核酸包括多个整合载体(例如，其中所述对象核酸以及导致酶活性水平升高的核酸包含在多个整合载体中，例如，在不同的载体上)。
13.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述异源性核酸序列包括多个自我复制(self-replicating)载体(例如，其中所述对象核酸以及导致酶活性水平升高的核酸包含在多个自我复制载体中，例如，在不同的载体上)。
14.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述异源性核酸被整合到所述细胞的基因组中，例如，染色体基因组。
15.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述氨基酸包括天然产生的氨基酸。
16.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述氨基酸包括表1中所列的氨基酸。
17.如实施方式16所述的方法，其中，所述氨基酸是丙氨酸。
18.如实施方式16所述的方法，其中，所述氨基酸是亮氨酸。
19.如实施方式16所述的方法，其中，所述氨基酸是异亮氨酸。
20.如实施方式16所述的方法，其中，所述氨基酸是甲硫氨酸。
21.如实施方式16所述的方法，其中，所述氨基酸是缬氨酸。
22.如实施方式16所述的方法，其中，所述氨基酸是苯丙氨酸。
23.如实施方式16所述的方法，其中，所述氨基酸是天冬酰胺。
24.如实施方式16所述的方法，其中，所述氨基酸是半胱氨酸。
25.如实施方式16所述的方法，其中，所述氨基酸是谷氨酰胺。
26.如实施方式16所述的方法，其中，所述氨基酸是丝氨酸。
27.如实施方式16所述的方法，其中，所述氨基酸是苏氨酸。
28.如实施方式16所述的方法，其中，所述氨基酸是天冬氨酸。
29.如实施方式16所述的方法，其中，所述氨基酸是谷氨酸。
30.如实施方式16所述的方法，其中，所述氨基酸是精氨酸。
31.如实施方式16所述的方法，其中，所述氨基酸是组氨酸。
32.如实施方式16所述的方法，其中，所述氨基酸是赖氨酸。
33.如实施方式16所述的方法，其中，所述氨基酸是甘氨酸。
34.如实施方式1-16中任一项所述的方法，其中，所述氨基酸选自脯氨酸，酪氨酸和色氨酸。
35.如实施方式34所述的方法，其中，所述氨基酸是脯氨酸。
36.如实施方式34所述的方法，其中，所述氨基酸是酪氨酸。
37.如实施方式34所述的方法，其中，所述氨基酸是色氨酸。
38.如实施方式5-37中任一项所述的方法，其中，所述抑制剂结合所述酶，例如，其结合并抑制所述酶。
39.如实施方式5-38中任一项所述的方法，其中，所述抑制剂抑制所述酶的转录。
40.如实施方式5-39中任一项所述的方法，其中，所述抑制剂抑制所述酶的翻译。
41.如实施方式5-40中任一项所述的方法，其中，所述抑制剂包括核酸，例如，RNA，例如，反义或siRNA。
42.如实施方式5-41中任一项所述的方法，其中，所述抑制剂包括适配体。
43.如实施方式5-42中任一项所述的方法，其中，所述抑制剂包括小分子。
44.如实施方式5-43中任一项所述的方法，其中，所述抑制剂是所述酶的底物的类似物。
45.如实施方式5-44中任一项所述的方法，其中，所述抑制剂是所述氨基酸的类似物，例如，脯氨酸、酪氨酸或色氨酸的类似物。
46.如实施方式5-45中任一项所述的方法，其中，所述抑制剂包括竞争性抑制剂。
47.如实施方式5-46中任一项所述的方法，其中，所述抑制剂抑制用于合成氨基酸的限速酶，例如，所述抑制剂抑制用于在培养基上合成氨基酸的限速酶。
48.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述氨基酸包括脯氨酸。
49.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述酶包括吡咯啉-5-羧酸合酶(P5CS)分子。
50.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述异源性核酸序列包含编码P5CS分子的序列。
51.如实施方式5-50中任一项所述的方法，其中，所述抑制剂是所述酶的底物，或其类似物、变体或衍生物。
52.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述抑制剂是脯氨酸的类似物，例如，L-氮杂-2-环丁烷羧酸，3,4-脱氢-L-脯氨酸，或L-4-噻唑烷羧酸。
53.如实施方式5-52中任一项所述的方法，其中，所述氨基酸包括脯氨酸并且所述酶和抑制剂选自表1。
54.如实施方式5-16、34或38-47中任一项所述的方法，其中，所述氨基酸包括酪氨酸并且所述酶和/或抑制剂选自表1。
55.如实施方式5-16、34、38-47或54中任一项所述的方法，其中，所述异源性核酸序列包含序列，所述序列编码多肽和/或酪氨酸生物合成酶的抑制剂。
56.如实施方式54或55所述的方法，其中，所述抑制剂是所述酶的底物的类似物。
57.如实施方式5-16、34、38-47或54-56中任一项所述的方法，其中，所述抑制剂是酪氨酸的类似物。
58.如实施方式5-16、34、38-47或54-57中任一项所述的方法，其中，所述氨基酸包括酪氨酸并且所述酶和抑制剂选自表1。
59.如实施方式5-16、34或38-47中任一项所述的方法，其中，所述氨基酸包括色氨酸并且所述酶和/或抑制剂选自表1。
60.如实施方式5-16、34、38-47或59中任一项所述的方法，其中，所述异源性核酸序列包含序列，所述序列编码多肽和/或色氨酸生物合成酶的抑制剂。
61.如实施方式59或60所述的方法，其中，所述抑制剂是所述酶的底物的类似物。
62.如实施方式5-16、34、38-47或59-61中任一项所述的方法，其中，所述抑制剂是色氨酸的类似物。
63.如实施方式5-16、34、38-47或59-62中任一项所述的方法，其中，所述氨基酸包括色氨酸并且所述酶和抑制剂选自表1。
64.如前述实施方式中任一项所述的方法，其包括共同培养酶活性未升高的细胞和活性升高的细胞。
65.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述活性升高的细胞比活性未升高的细胞更快地生长，例如，快约2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、75、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10,000倍。
66.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，至少约0.01、0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50百分比选定的细胞(例如，基于生长选择)缺少所述核酸。
67.如前述实施方式中任一项所述的方法，还包括选择表现出生长的细胞。
68.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述细胞包括真核细胞。
69.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述细胞包括动物细胞。
70.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述细胞包括哺乳动物细胞。
71.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述细胞包括啮齿动物细胞。
72.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述细胞包括CHO细胞。
73.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述细胞包括GSKO CHO细胞。
74.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，编码所述酶的序列的内源性拷贝已失活，例如，在结构或控制区域包含缺失。
75.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，编码第二氨基酸合成酶的序列的内源性拷贝已失活，例如，在结构或控制区域包含缺失。
76.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，编码GS的序列的内源性拷贝已失活，例如，在结构或控制区域包含缺失。
77.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述对象核酸序列编码肽分子。
78.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述对象核酸序列是异源性的。
79.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述异源性肽分子选自表5-8中的任一项。
80.如前述实施方式中任一项所述的方法，其包括选择在所述培养基上生长的细胞。
81.如实施方式80所述的方法，其中，所述培养基包含抑制剂。
82.如前述实施方式中任一项所述的方法，其包括：
1)选择在所述培养基上生长的细胞；和
2)在第二组培养条件下培养所述细胞，例如，在第二培养基上，例如，使选定的细胞经历第二选择。
83.如实施方式82所述的方法，其中：
1)中所述培养基包含所述抑制剂；和
2)中所述第二培养基包含所述抑制剂。
84.如前述实施方式中任一项所述的方法，其包括：
1)选择在所述培养基上生长的细胞；和
2)在第二组培养条件下培养所述细胞，例如，在第二培养基上，例如，使选定的细胞经历第二选择。
其中，1)和2)之一的培养基中所述抑制剂的浓度大于1)和2)中另一培养基中所述抑制剂的浓度。
85.如实施方式84所述的方法，其中：
1)中所述抑制剂的浓度大于2)中所述抑制剂的浓度。
86.如实施方式84所述的方法，其中，1)中所述抑制剂的浓度大于2)中所述抑制剂的浓度。
87.如实施方式84-86中任一项所述的方法，其包括：
其中具有较低浓度所述抑制剂的步骤中的所述培养基基本上不含抑制剂。
88.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，(ii)中所述核酸序列可操作地连接控制序列，例如，启动子。
89.如实施方式88所述的方法，其中，所述控制序列包含选自下述的序列：SV40，mCMV，hCMV，或PGK启动子，或其变体。
90.如实施方式88所述的方法，其中，所述控制序列控制LMM的表达。
91.如实施方式90所述的方法，其中，所述控制序列和LMM如表3任一行所列。
92.如实施方式90所述的方法，其中，所述控制序列包含SV40启动子，并且所述LMM是鼠SCD1。
93.如实施方式90所述的方法，其中，所述控制序列包含SV40启动子，并且所述LMM是SCD1，例如，CHO SCD1。
94.如实施方式90所述的方法，其中，所述控制序列包含SV40启动子，并且所述LMM是SREBF1，例如，CHO SREBF1。
95.如实施方式90所述的方法，其中，所述控制序列包含SV40启动子，并且所述LMM是SREB411，例如，CHO SREB411。
96.如实施方式90所述的方法，其中，所述控制序列包含mCMV启动子，并且所述LMM是鼠SCD1。
97.如实施方式90所述的方法，其中，所述控制序列包含mCMV启动子，并且所述LMM是SCD1，例如，CHO SCD1。
98.如实施方式90所述的方法，其中，所述控制序列包含mCMV启动子，并且所述LMM是SREBF1，例如，CHO SREBF1。
99.如实施方式90所述的方法，其中，所述控制序列包含mCMV启动子，并且所述LMM是SREB411，例如，CHO SREB411。
100.如实施方式90所述的方法，其中，所述控制序列包含hCMV启动子，并且所述LMM是鼠SCD1。
101.如实施方式90所述的方法，其中，所述控制序列包含hCMV启动子，并且所述LMM是SCD1，例如，CHO SCD1。
102.如实施方式90所述的方法，其中，所述控制序列包含hCMV启动子，并且所述LMM是SREBF1，例如，CHO SREBF1。
103.如实施方式90所述的方法，其中，所述控制序列包含hCMV启动子，并且所述LMM是SREB411，例如，CHO SREB411。
104.如实施方式90所述的方法，其中，所述控制序列包含PGK启动子，并且所述LMM是鼠SCD1。
105.如实施方式90所述的方法，其中，所述控制序列包含PGK启动子，并且所述LMM是SCD1，例如，CHO SCD1。
106.如实施方式90所述的方法，其中，所述控制序列包含PGK启动子，并且所述LMM是SREBF1，例如，CHO SREBF1。
107.如实施方式90所述的方法，其中，所述控制序列包含PGK启动子，并且所述LMM是SREB411，例如，CHO SREB411。
108.如实施方式88所述的方法，其中，所述控制序列控制LMM的表达，并且所述培养基包含所述酶活性的抑制剂。
109.如实施方式108所述的方法，其中，所述控制序列、LMM和抑制剂(例如，P5CS抑制剂)如表4任一行所列。
110.如实施方式88-109中任一项所述的方法，其中，所述培养基包含L-氮杂-2-环丁烷羧酸。
111.如实施方式88-110中任一项所述的方法，其中，所述培养基包含3,4-脱氢-L-脯氨酸。
112.如实施方式88-111中任一项所述的方法，其中，所述培养基包含L-4-噻唑烷羧酸。
113.如前述实施方式中任一项所述的方法，还包括回收所述对象核酸序列的产物。
114.如前述实施方式中任一项所述的方法，其包括由培养基回收所述产物。
115.如前述实施方式中任一项所述的方法，其包括由所述细胞回收所述产物。
116.如前述实施方式中任一项所述的方法，其包括：
i)选择在所述培养基上生长的细胞；
ii)在第二组培养条件下培养所述细胞，例如，在第二培养基上，例如，使选定的细胞经历第二选择；和
iii)由所述细胞或第二培养基回收产物。
117.一种鉴定、选择或培养包含对象核酸序列的细胞的方法，所述方法包括：
a)提供包含核酸的细胞，例如，载体，例如，可复制载体，其包含：
(i)所述对象核酸序列；
(ii)核酸序列，当其表达时导致氨基酸合成途径(例如，脯氨酸合成途径)中酶的活性水平升高，例如，编码包含所述活性的酶分子的核酸序列；和
b)在足以允许包含所述核酸序列的细胞生长的条件下，在氨基酸(例如，脯氨酸)水平不足以支持与活性未升高的对象细胞相同的细胞的生长的第一培养基存在的情况下培养包含所述核酸序列的细胞(并且所述第一培养基任选地包含所述酶的抑制剂)，
c)在足以允许包含所述核酸序列的细胞生长的条件下，在第二氨基酸(例如，酪氨酸)水平不足以支持与活性未升高的对象细胞相同的细胞的生长的第二培养基存在的情况下培养包含所述核酸序列的细胞(并且所述第二培养基任选地包含所述第二酶的抑制剂)，
从而鉴定、选择或培养包含所述异源性核酸序列的细胞。
118.如实施方式117所述的方法，其中，步骤b在启动步骤c之前启动。
119.如实施方式117或118所述的方法，其中，步骤b在步骤c之前进行。
120.如实施方式117或118所述的方法，其中，步骤b和步骤c同时进行。
121.如实施方式117-120中任一项所述的方法，其中，步骤b和步骤c在相同的培养基中进行。
122.如实施方式117-121中任一项所述的方法，其中，步骤b和步骤c在相同的容器中进行。
123.如实施方式117-122中任一项所述的方法，其中，步骤b的所述选择和步骤c的所述选择在相同的培养基中进行，并且所述培养基：
(a)所述氨基酸(例如，脯氨酸)水平不足以支持与活性未升高的对象细胞相同的细胞的生长；和
(b)所述第二氨基酸(例如，酪氨酸)水平不足以支持与所述第二酶活性未升高的对象细胞相同的细胞的生长。
124.如实施方式117-123中任一项所述的方法，其中，所述细胞还包含：
(iii)核酸序列，当其表达时导致氨基酸合成途径中第二酶的活性水平升高，例如，编码包含所述活性的酶分子的核酸序列。
125.如实施方式117-124中任一项所述的方法，其中，将所述细胞在具有所述酶活性的抑制剂的培养基上培养。
126.如实施方式117-125中任一项所述的方法，其中，将所述细胞在具有所述第二酶活性的抑制剂的培养基上培养。
127.如实施方式117-126中任一项所述的方法，其中，所述第二酶与(ii)中所述酶处于相同的途径，例如，所述脯氨酸合成途径。
128.如实施方式127所述的方法，其中：
所述第二酶处于相同氨基酸的合成途径中，例如，编码包含所述活性的酶分子的核酸序列；和
b)中所述培养基还包含：
iv)所述第二酶活性的抑制剂。
129.如实施方式117-128中任一项所述的方法，其中，所述第二酶处于与(ii)中所述酶不同的途径，例如，所述酶处于脯氨酸合成途径而所述第二酶处于除了脯氨酸以外的途径，例如，酪氨酸或色氨酸途径。
130.如实施方式129所述的方法，其中：
所述第二酶处于第二氨基酸的合成途径中，例如，编码包含所述活性的酶分子的核酸序列。
b)中所述培养基还包含：
iii)所述第二氨基酸(例如，除了脯氨酸以外的氨基酸)水平不足以支持与活性未升高的对象细胞相同的细胞的生长；和
iv)所述第二酶活性的抑制剂。
131.一种细胞，其包含异源性脂质代谢修饰剂(LMM)编码序列，所述序列可操作地连接包含来自SV40启动子序列、mCMV启动子序列或PGK启动子序列中任何一个的控制区(例如，启动子序列)的序列。
132.如实施方式131所述的细胞，其中，所述LMM调控表2中所列出的途径。
133.如实施方式131或132所述的细胞，其中，所述LMM包含硬脂酰-CoA去饱和酶-1(SCD1)。
134.如实施方式131或132所述的细胞，其中，所述LMM包含固醇调节元件结合转录因子1(SREBF1)。
135.如实施方式131或132所述的细胞，其中，所述LMM包含SREBF1的截短同种型(例如，缺少调节结构域的SREBF1的截短同种型，例如，SREB411)。
136.如前述实施方式中任一项所述的细胞，其中，所述异源性脂质代谢修饰剂(LMM)编码序列置于载体中。
137.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述载体还包含可选择标志物(例如，标志物)编码序列，当其存在时允许指定培养基上的存活或生长。
138.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述载体还包含可选择标志物编码序列，当其存在时允许缺少营养物(例如，氨基酸)的培养基上的存活或生长。
139.如实施方式138所述的细胞，其中，所述营养物是氨基酸，例如，选自表1中所列的氨基酸。
140.如实施方式139所述的细胞，其中，所述营养物包含脯氨酸。
141.如实施方式137-140中任一项所述的方法，其中，所述标志物包含吡咯啉-5-羧酸合酶(P5CS)分子。
142.如实施方式138-141中任一项所述的细胞，其中，所述营养物包含酪氨酸。
143.如实施方式138-142中任一项所述的细胞，其中，所述营养物包含色氨酸。
144.如实施方式131-143中任一项所述的细胞，其中，所述标志物选自表1。
145.如实施方式137-144中任一项所述的细胞，其中，所述标志物包含谷氨酰胺合成酶。
146.如前述实施方式131-145中任一项所述的细胞，其中，所述LMM编码序列可操作地连接SV40启动子序列编码序列。
147.如前述实施方式131-145中任一项所述的细胞，其中，所述LMM编码序列可操作地连接mCMV启动子序列编码序列。
148.如前述实施方式131-145中任一项所述的细胞，其中，所述LMM编码序列可操作地连接PGK启动子序列编码序列。
149.如实施方式131-148中任一项所述的细胞，其中，所述LMM是SCD1。
150.如实施方式149所述的细胞，其中，所述LMM是鼠SCD1。
151.如实施方式149所述的细胞，其中，所述LMM是CHO SCD1。
152.如实施方式131-148中任一项所述的细胞，其中，所述LMM是SREBF1。
153.如实施方式131-148中任一项所述的细胞，其中，所述LMM是CHO SREBF1。
154.如实施方式131-148中任一项所述的细胞，其中，所述LMM是SREB411。
155.如实施方式131-148中任一项所述的细胞，其中，所述LMM是CHO SREB411。
156.如实施方式131-148中任一项所述的细胞，其中，所述LMM包含硬脂酰-CoA去饱和酶-1(SCD1)，并且所述启动子包含SV40启动子序列。
157.如实施方式131-148中任一项所述的细胞，其中，所述LMM包含硬脂酰-CoA去饱和酶-1(SCD1)，并且所述启动子包含mCMV启动子序列。
158.如实施方式131-148中任一项所述的细胞，其中，所述LMM包含硬脂酰-CoA去饱和酶-1(SCD1)，并且所述启动子包含PGK启动子序列。
159.如实施方式131-148中任一项所述的细胞，其中，所述LMM包含固醇调节元件结合转录因子1(SREBF1)，并且所述启动子包含SV40启动子序列。
160.如实施方式131-148中任一项所述的细胞，其中，所述LMM包含固醇调节元件结合转录因子1(SREBF1)，并且所述启动子包含mCMV启动子序列。
161.如实施方式131-148中任一项所述的细胞，其中，所述LMM包含固醇调节元件结合转录因子1(SREBF1)，并且所述启动子包含PGK启动子序列。
162.如实施方式131-148中任一项所述的细胞，其中，所述LMM包含SREB411，并且所述启动子包含SV40启动子序列。
163.如实施方式131-148中任一项所述的细胞，其中，所述LMM包含SREB411，并且所述启动子包含mCMV启动子序列。
164.如实施方式131-148中任一项所述的细胞，其中，所述LMM包含固醇SREB411，并且所述启动子包含PGK启动子序列。
165.如实施方式131-148中任一项所述的细胞，其中，所述培养基包含表1或4中所列的抑制剂。
166.如实施方式131-148中任一项所述的细胞，其中，所述培养基包含P5CS抑制剂。
167.如实施方式166所述的细胞，其中，所述P5CS抑制剂是L-氮杂-2-环丁烷羧酸。
168.如实施方式166所述的细胞，其中，所述P5CS抑制剂是3,4-脱氢-L-脯氨酸。
169.如实施方式166所述的细胞，其中，所述P5CS抑制剂是L-4-噻唑烷羧酸。
实施例
实施例1：研究吡咯啉-5-羧酸合酶表达和抑制剂用于脯氨酸代谢哺乳动物选择系统
吡咯啉-5-羧酸合酶(P5CS)是限速酶，负责由谷氨酸合成脯氨酸。图1显示了该途径的简化图示。因为脯氨酸代谢对于细胞存活是构成整体所必需的，所以在没有脯氨酸的培养基中培养的细胞应当无法存活。或者，具有充足的P5CS表达并因此能够由谷氨酸高效生成脯氨酸的这些细胞应该能够使细胞在这些条件下存活，从而促进所需细胞的适当选择。
为了评估该假设，首先合成并克隆带有P5CS基因的载体，从而生成包含感兴趣的基因和eGFP报道基因的构建体(图2)。转染后，该载体应该诱导P5CS表达水平超过CHO细胞中内源性观察到的水平，从而允许高脯氨酸合成速率，并因此在通常存于培养基中的外部脯氨酸不存在的情况下促进细胞存活。从理论上讲，由于转染构建体表达大量P5CS的细胞也应当表达eGFP基因。
虽然在脯氨酸不存在的情况下P5CS的过表达可能足以选择细胞，但是该酶的抑制剂可能会改善该系统的严格性。脯氨酸本身是P5CS的有效抑制剂，因为其是CHO细胞中内源性反馈回路的部分。鉴定用于该系统的抑制剂包括脯氨酸类似物。本文显示的是P5CS体外活性有效抑制剂的示例性抑制剂。
脯氨酸不存在情况下的细胞生长
在一个实验中，在脯氨酸不存在的情况下培养经工程改造以敲除内源性谷氨酰胺合成酶表达的细胞(GSKO细胞)，以确定其对生长的影响。将GSKO细胞以0.2x106个细胞/ml接种在125ml锥形瓶中20ml的总培养体积。使用具有L-谷氨酰胺(6mM Glut)或不具L-谷氨酰胺(无Glut)的CD-CHO或在不含脯氨酸(无Pro)但含有6mM L-谷氨酰胺的CM76培养基中培养细胞。使用ViCell仪器每24小时测量活细胞计数和培养活力。
在没有脯氨酸的情况下培养时，GSKO细胞无法生长(图3)。然而，在没有L-谷氨酰胺的情况下培养的细胞显示出培养活力随着时间降低。这是可以预期的，因为这些细胞已经工程改造以敲除谷氨酰胺合成酶(谷氨酰胺生产中的限速酶)的内源性表达。
脯氨酸不存在情况下培养的细胞的回复率
确定在无脯氨酸培养基中孵育的培养物中产生的回复细胞的数量，以评估利用脯氨酸代谢于选择系统的适用性。简言之，将隆萨公司(Lonza)的GSKO细胞以1,000或5,000个细胞/孔接种到96孔板中含有6mM L-谷氨酰胺的CD-CHO，不含L-谷氨酰胺的CD-CHO或含有6mM L-谷氨酰胺且不含脯氨酸的CM76中，从而使培养体积等于200μl/孔。在各种培养基中接种了总共30块板，其中以1,000个细胞/孔培养15个板，并且以5,000个细胞/孔培养15个板。使用11天后观测的显微镜鉴定回复菌落。
11天后，接种到含有6mM L-谷氨酰胺的CD CHO的孔100％汇合，然后在不存在L-谷氨酰胺的培养基中培养时未观察到回复菌落。在脯氨酸不存在的情况下培养的总共8.64x106个细胞中，观测到15个回复菌落，其中在以5,000个细胞/孔接种的板中观察到13个，并在以1,000个细胞/孔接种的板中观察到2个菌落。
P5CS过表达以选择表达感兴趣基因的细胞
上文证明从培养基排除脯氨酸导致缺少GSKO细胞的生长。假定内源性脯氨酸合成中的限速酶吡咯啉-5-羧酸合酶(P5CS)的过表达足以在外源脯氨酸不存在的情况下恢复生长，从而提供了一种高效的选择系统。为了评估该假设，使用带有P5CS基因的质粒转染细胞以促进其过表达，并在脯氨酸不存在的情况下培养。简言之，构建质粒以包括谷氨酰胺合成酶(GS)或P5CS以及eGFP报告物基因。还包括这样的对照载体，其不包含任何“选择”基因或报告物；它仅包含依那西普基因以诱导与该实验中包括的其他质粒相似的细胞负荷。所用载体的示意图如图4所示。通过电穿孔将构建的质粒瞬时转染到GSKO细胞中并在不同的培养基中培养；CD-CHO，不含酪氨酸的CM76培养基或不含脯氨酸的CM76培养基(它们所有已补充以包括6mM L-谷氨酰胺的最终浓度)。总培养体积为20ml(最初以0.2x 106个细胞/ml接种)，在125ml Erlenmeyer烧瓶中，37℃以140rpm摇晃，并在转染后72和168小时通过流式细胞仪采集样品用于计数和分析。
图5显示了使用图4中概述的载体瞬时转染并随后在特定培养基中培养的GSKO细胞转染后获得的数据。相较于在CD-CHO中培养的细胞，无论引入何种质粒，在无酪氨酸或无脯氨酸的培养基中培养的细胞在转染后72小时显示出生长速率降低(图5A)。该观测与上文概述的模式一致。然而，相较于使用任何其他载体，在无脯氨酸的培养基中用含P5CS载体转染后168小时观测到活细胞浓度增加。此外，该载体的引入并不导致在无酪氨酸培养基中获得的活细胞数量增加，这表明P5CS能够特异性地补偿外源性脯氨酸的缺失。
虽然在活细胞浓度上存在可观察到的差异，但是在不同培养基中培养后，培养活力通常未受显著影响(图5B)。值得注意的是，使用含P5CS构建体转染，然后培养72小时比在相同培养基中培养的其他转染所获得的值要低。这可能是由于这些细胞承受了额外的细胞负荷，所述额外的细胞负荷是由于脯氨酸合成增加以及缺少可用酪氨酸所致。在168小时的时间点未观测到这种趋势。在168小时的时间点，CD-CHO中培养的细胞的活力通常较低，但是这可能是由于这些细胞的典型生长情况，与其他培养基中培养的不遵循典型生长趋势的细胞相反，预计在该时间点处于衰亡期。
使用流式细胞术的分析表明，将使用含P5CS质粒转染并随后在无脯氨酸培养基中培养组合在两个时间点测量的条件中导致最高平均荧光(图5C)。通常，在脯氨酸不存在的情况下培养的细胞比在外源性酪氨酸不存在的情况下培养的细胞具有更高的平均荧光值，并且在瞬时质粒上包含P5CS并随后在无酪氨酸培养基中培养比包括GS时具有更高的平均荧光值，这表明P5CS的过表达对增加eGFP表达有广泛的影响。然而，显然P5CS过表达的组合对随后在无脯氨酸培养基中培养的细胞具有更深远的影响，这通过平均荧光值的大幅增加证实，并通过在超过预定荧光强度阈值的细胞百分比中观测到的大幅增加的值而强化(图5D)。
这些数据共同支持这样的假设，即在脯氨酸不存在情况下培养GSKO细胞时观测到的停滞细胞生长可以通过P5CS基因的过表达来恢复。此外，就总体表达以及在瞬时群体中表达报告物基于的百分比而言，这可以对报告物基因的表达产生显著影响。
生成表达感兴趣基因的稳定细胞库
为了评估脯氨酸/P5CS系统生成重组细胞库的能力，将包含P5CS基因和感兴趣基因的载体转染到细胞中，然后在脯氨酸不存在的情况下培养，以试图生成重组细胞库。简言之，用20μg质粒对1x 107个隆萨公司的GSKO细胞进行电穿孔，该质粒首先使用PvuI限制酶(NEB)进行线性化，然后使用乙酸钠和乙醇沉淀纯化。所用构建体包含用于评估的P5CS基因作为选择标志物以及eGFP作为报告物基因。在脯氨酸不存在但补充L-谷氨酰胺以达到6mM最终浓度的情况下于CM76培养基中转染。然后将细胞在T75烧瓶中25ml该培养基中培养10天，然后转移至10ml悬浮培养物中，也在不存在脯氨酸的培养基中。使用流式细胞仪分析所得库。首先将细胞样品以1,000rpm离心5分钟，然后重悬于500μl PBS中。然后将样品加载至FACScaliburTM(BD生物科学公司(BD biosciences)的探针上，并测量与细胞计数有关的荧光强度。使用E-1扩增器测量前向散射(FSC)，并将侧面散射(SSC)设置为465，而FL1记录473处的细胞；所有设置转换为对数。为了促进悬浮细胞的粘附，首先将盖玻片浸没在多聚-L-赖氨酸中并在室温下孵育15分钟。然后去除盖玻片，并在无菌环境中干燥，然后转移至24孔板。将细胞在37℃培养过夜，以促进细胞与盖玻片的粘附，然后吸出培养基并添加250μl4％多聚甲醛的PBS，并在37℃孵育20分钟以固定细胞。随后进行两次1ml PBS洗涤，然后添加250μl 0.1％曲通X100的PBS，并在室温下孵育5分钟以使细胞透化。通过每孔添加250μl3％BSA的PBS封闭固定且透化的细胞，并在室温下孵育30分钟。将其吸出并将盖玻片从孔中取出，将其正面朝下放在预先制备的100μl PBS滴液上，并另外重复3次。盖玻片通过将边缘接触组织干燥，并转移至25μl适当的一抗的液滴。将其在4℃下孵育过夜。适当的二抗在PBS中的3％BSA中相应地稀释。将盖玻片正面朝下放置在100μl 0.1％吐温的PBS液滴中，放置5分钟。然后将它们转移至新鲜液滴四次，并在最后两次转移之间放置10分钟。然后将它们置于25μl二抗滴液中，放置2小时，然后在4℃避光放置。使用5个连续100μl液滴进行5次最终洗涤。在需要DAPI染色的情况下，在第二和第三PBS液滴之间将盖玻片分别转移至50μl的10mg/ml的DAPI液滴中，。最后，使用ProLong Gold防褪色固定剂(赛默飞世尔公司(ThermoScientific))将细胞固定在载玻片上并放置过夜至凝固(set)。使用蔡司(Zeiss)共焦显微镜收集图像。校准流式细胞仪，从而使宿主细胞的荧光强度值不超过101，因此超过该预定阈值的那些细胞被认为表达了eGFP
图6A示出了使用流式细胞术获自使用基于P5CS的选择系统生成的库的直方图。因为许多细胞的荧光强度高于101阈值，所以很明显，P5CS选择系统能够选择表达感兴趣基因的细胞。然而，存在荧光强度值低于101的细胞群，这表明库中仍存在未表达细胞。增加系统的严格性可能很重要。图6B显示了使用荧光镜检获得的合成库的图像。该图像支持图6中所示数据，因为细胞群存在不同eGFP表达水平并且并非存在的所有细胞都必须表达eGFP报道物基因。
图6B和6C两者显示了P5CS基因的表达模式。这些图像显示了点状斑点，其与线粒体中P5CS的定位一致，这在文献中已有报道。此外，图6C显示了P5CS/eGFP库与GSKO宿主之间的比较。图像显示了所选库具有比宿主更高的P5CS表达水平，但是这种观察结果并不只限于表达eGFP报告物基因的细胞。因为证明部分宿主细胞在脯氨酸不存在的情况下能够回复，所以不包含转染的载体的细胞有可能能够在概述的选择过程中存活，无需P5CS的过度表达。也许脯氨酸的缺失也会选择内源性表达足够P5CS的细胞。
通过对取自细胞库裂解物样品进行的western印迹分析检查了使用P5CS系统构建的细胞库。用于生成这些库的载体都包含P5CS的基因和eGFP或SCD1之一(由SV40或mCMV启动子驱动)，如所标记，并且使用仅包含P5CS的载体构建了对照样品。GSKO细胞通过电穿孔使用上述线性化载体转染，然后在脯氨酸不存在的情况下培养两周，然后转移到悬浮培养物中。如图7所示，相较于eGFP和零对照相比，来自所得细胞库裂解物的western印迹显示SCD1在相关细胞库(SV40 SCD1和mCMV SCD1)中过表达，表明P5CS系统适用于细胞系构建过程。此外，也转染了缺少P5CS基因的对照载体，但是所得细胞在脯氨酸不存在的情况下不生长，表明P5CS的过表达对于其存活而言至关重要。
P5CS抑制剂存在的情况下生长的细胞库
96深孔板中生长的细胞库
当在缺少脯氨酸但补充有不同浓度P5CS抑制剂L-氮杂-2-环丁烷羧酸的培养基中培养时，数据获自使用P5CS/eGFP载体(如上所述)构建的细胞库。细胞在96深孔板中培养，并以0.2x 106个细胞/ml的密度接种到悬浮液中。活细胞数(图8A)，培养物活力(图8B)，平均荧光(图8C)，表达超过102预定荧光阈值的细胞(图8D)和表达超过103预定荧光阈值的细胞(图8E)全部在24、96、168和216小时培养时确定。虽然抑制剂浓度的增加导致细胞生长较慢，但是也观察到了较高的平均荧光，这表明添加抑制剂能够从现有多克隆群体中富集eGFP表达。图8F显示了取自相同时间点的裂解物样品的western印迹分析。探针探测印迹以突出显示P5CS、β-肌动蛋白和eGFP。
当在缺少脯氨酸但补充有不同浓度P5CS抑制剂3,4-脱氢-L-脯氨酸的培养基中培养时，数据获自使用P5CS/eGFP载体(如上所述)构建的细胞库。细胞在96深孔板中培养，并以0.2x 106个细胞/ml的密度接种到悬浮液中。活细胞数(图9A)，培养物活力(图9B)，平均荧光(图9C)，表达超过102预定荧光阈值的细胞(图9D)和表达超过103预定荧光阈值的细胞(图9E)全部在24、96、168和216小时培养时确定。虽然抑制剂浓度的增加导致细胞生长较慢，但是也观察到了较高的平均荧光，这表明添加抑制剂能够从现有多克隆群体中富集eGFP表达。图9F显示了取自相同时间点的裂解物样品的western印迹分析。探针探测印迹以突出显示P5CS、β-肌动蛋白和eGFP。
当在缺少脯氨酸但补充有不同浓度P5CS抑制剂L-4-噻唑烷羧酸的培养基中培养时，数据获自使用P5CS/eGFP载体(如上所述)构建的细胞库。细胞在96深孔板中培养，并以0.2x 106个细胞/ml的密度接种到悬浮液中。活细胞数(图10A)，培养物活力(图10B)，平均荧光(图10C)，表达超过102预定荧光阈值的细胞(图10D)和表达超过103预定荧光阈值的细胞(图10E)全部在24、96、168和216小时培养时确定。虽然抑制剂浓度的增加导致细胞生长较慢，但是也观察到了较高的平均荧光，这表明添加抑制剂能够从现有多克隆群体中富集eGFP表达。图10F显示了取自相同时间点的裂解物样品的western印迹分析。探针探测印迹以突出显示P5CS、β-肌动蛋白和eGFP。
24孔板中生长的细胞库
当在缺少脯氨酸但补充有不同浓度P5CS抑制剂L-氮杂-2-环丁烷羧酸的培养基中培养时，数据获自使用P5CS/eGFP载体(如上所述)构建的细胞库。细胞在静态24孔板中培养，并最初以0.2x 106个细胞/ml的密度接种。活细胞数(图11A)，培养物活力(图11B)，平均荧光(图11C)，表达超过102预定荧光阈值的细胞(图11D)和表达超过103预定荧光阈值的细胞(图11E)全部在24、96、168和216小时培养时确定。虽然抑制剂浓度的增加导致细胞生长较慢，但是也观察到了较高的平均荧光，这表明添加抑制剂能够从现有多克隆群体中富集eGFP表达。
当在缺少脯氨酸但补充有不同浓度P5CS抑制剂3,4-脱氢-L-脯氨酸的培养基中培养时，数据获自使用P5CS/eGFP载体(如上所述)构建的细胞库。细胞在静态24孔板中培养，并最初以0.2x 106个细胞/ml的密度接种。活细胞数(图12A)，培养物活力(图12B)，平均荧光(图12C)，表达超过102预定荧光阈值的细胞(图12D)和表达超过103预定荧光阈值的细胞(图12E)全部在24、96、168和216小时培养时确定。虽然抑制剂浓度的增加导致细胞生长较慢，但是也观察到了较高的平均荧光，这表明添加抑制剂能够从现有多克隆群体中富集eGFP表达。
实施例2：脂质代谢修饰剂用于改善抗体的宿主细胞产生
已经证明操作下述内容改善CHOK1SV GS-KO宿主产生以及复杂蛋白质和标准mAb的产物质量：脂质代谢修饰剂(LMM)硬脂酰-CoA-去饱和酶1(SCD1)，固醇调节元件结合转录因子1(SREBF1)和截短的SREBF1同种型SREB411，其包含迁移到细胞核的SREBF1部分且缺少SREBF1的调控结构域。
假设如果这些LMM的表达在CHOK1SV GS-KO宿主中以工业cGMP方式进行修饰，这将导致产物效价和质量的显著改善。目标是将所需LMM基因插入现有细胞系中，或者是能够用完整的商业GS选择系统创建表达LLM基因之一的新宿主细胞系。
为了达到这个目标并测试表达水平的假设，必须确定哪种LMM基因最适用。为此，产生了多种载体(表9)：表达重组蛋白和GS选择标志物的4种载体(A-D)，和表达特异性启动子+LMM基因组合的10种(1-10)。
表9：用于生成将包含重组分子并过表达LMM的细胞库概念验证的载体。
载体 选择 重组分子
A 谷氨酰胺合成酶 B72.3
B 谷氨酰胺合成酶 英利昔单抗
C 谷氨酰胺合成酶 色古土珠单抗
D 谷氨酰胺合成酶 依那西普
载体 启动子 脂质代谢修饰剂(LMM)
1 SV40 SCD1
2 SV40 SREBF1(CHO)
3 SV40 SREB411(CHO)
4 mCMV SCD1
5 mCMV SREBF1(CHO)
6 mCMV SREB411(CHO)
7 PGK SCD1
8 PGK SREBF1(CHO)
9 PGK SREB411(CHO)
10 mCMV N/A
然后通过共转染一种重组分子载体加上一种启动子+LMM基因载体来筛选这些载体的所有组合。按照标准方案，使用4D-Nulcofector(隆萨公司)进行转染；各条件将产生96个重复培养物(共转染)。然后将评估这些转染细胞的复制库在分批补料条件下培养和重组蛋白生产过程中的细胞生长。然后将对这些数据进行分析，以确定哪些启动子+LMM组合将成为对于进一步分析和/或细胞系构建的合适候选。
GSKO细胞的生长和转染
GS-KO CHO细胞在CD-CHO+6mM L-谷氨酰胺中培养。每隔4天，对培养物进行传代培养；使用Vicell-XR机器对0.6ml各种亲本培养物进行计数，记录各培养物的50张图像。将子代培养物以0.2×106个活细胞/ml接种；然后用5％CO2对培养物进行充气并在36.5℃，140rpm下孵育。
在传代培养第2天或第3天，使用ViCell-XR对GS-KO细胞进行计数；然后取等于2×107个活细胞/ml的体积，并以100g旋转10分钟。离心后，通过移液将上清液丢弃，并将沉淀重悬于200μl SF溶液(由4D-nucleofector试剂盒提供)。然后将转染所需的载体以一定体积添加到200μl细胞/SF悬浮液中，以使各载体为6ug(LMM载体和重组蛋白)。然后将DNA/细胞/SF悬浮液等分为两份，然后移液到4D Nucleofector比色皿中，并小心不要在比色皿中形成任何气泡。添加到比色皿的体积取决于添加DNA载体后的总体积(通常在103-108μl之间)。
然后将比色皿置于4D-nuclefector中，并使用脉冲代码DU158进行脉冲处理。如果两个脉冲均失败(在显示屏上以红色“–”表示)，那么取出2x107个细胞的新体积，然后重新开始该方法。当脉冲通过时(在显示屏上以绿色“+”表示)，将约500μl的预热的(37℃)40ml转染培养基(40ml CD-CHO，0.4ml SP4、0.04ml浓缩(x1000)酚红))移液到比色皿中，然后将完整体积的培养物转移到40ml转染培养基中；然后将牧场(pasture)移液管用于使用转染培养基“冲洗”来自比色皿的所有残留细胞。然后将转染细胞培养物转移到两个96孔板中(各孔100μl培养物)，并在36.5℃，10％CO2下过夜孵育。
转染后第1天，向转染培养物的各个板添加每孔100μl的转染培养基+100μM MSX。然后将板/培养物在36.5℃、10％CO2下孵育6天。转染后第7天，从各转染培养物板的每孔/培养物小心地移出150μl，并将新鲜-转染培养基+50μM MSX添加到各孔/培养基。然后监测培养物转染后的恢复。
从转染后约10天开始观察到转染后的细胞恢复。这是通过观察转染培养基的颜色以及使用克隆镜通过目测检查各孔的融合来完成的。当细胞生长时，孔底将变得不透明，并且转染培养基中的酚红在乳酸产生时会变黄，这被用作细胞生长的指标。一旦认为>75％的培养物的融合度>75-80％，那么认为板中的培养物待回收并转移到深孔板中。
如图13所示，除了色古土珠单抗外，重组蛋白之间的回收率似乎相似。这可能是由于色古土珠单抗结构的性质所致；它具有连接至抗体结构Fc区的IL-2(白介素2)分子。这种IL-2有可能抑制转染细胞的生长速率；可能是在色古土珠单抗分子由细胞分泌后，因其对细胞的分子作用。也可能是由于构建mAB-IL-2限制了细胞资源，而这会减慢了恢复速率。
深孔板中转染细胞库的生长
一旦培养物恢复后，通过吹打混合各孔以使沉淀在底部的细胞悬浮。一旦将细胞悬浮于培养物中，将150μl转移至DWP中的150μl新鲜培养基(CD CHO，1％SP4、50μM MSX)中。然后将具有细胞培养物的深孔板在36.5℃、5％CO2、200rpm和90％湿度下孵育。
根据培养物的生长速度，在第4、5或6天进行第一次DWP传代培养。通过Celigo计数细胞；然后将细胞以0.5x106个活细胞/ml的浓度接种到300μl的CM66+50μl MMSX中。然后将子代DWP于36.5℃，5％CO2，200rpm和90％湿度下孵育。然后，进行4天的传代培养。使用Celigo系统对单个培养物/孔进行计数；然后将整个条件的计数平均，以产生图14中的结果。在第一次传代培养中，将培养基从转染培养基改变为生长培养基，并且在传代培养3中，将生长培养基改变为生产培养基，以开始进行减弱分批补料过度生长(aFOG)。
14A-14D显示了深孔板培养物中所有回收的转染细胞的平均活细胞浓度(VCC)。依那西普+mCMV SREB411和依那西普+mCMV SREBF1(图14A)的恢复速率比其他条件慢。出于实际原因，决定对其他条件再进行一次传代培养，以允许所有条件同时进入aFOG。这样做的原因是，记录依那西普+LMM条件的额外传代培养。
通常，整个条件下培养物的平均VCC似乎在第三次传代培养周围趋于稳定/均衡，所有条件下，将平均VCC归为一组。
转染库的减弱分批补料过度生长
为了评估LMM细胞库的生产率，将库放入分批补料过度生长以模拟生物反应器规模的条件。简言之，在DWP中进行第三传代培养后，使用Celigo计数细胞，然后以0.3x106个活细胞/ml的浓度接种到300μl CM71中。将细胞于36.5℃，5％CO2，200rpm和90％湿度下孵育12天。在第4天和第8天，进料培养物并通过Celigo计数细胞浓度。在第12天，将板在300rpm下离心10分钟；将200μl上清液收集到无菌96孔板中。剩余的细胞沉淀上清液用200μl PBS洗涤，并以500rpm离心10分钟；然后除去尽可能多的PBS洗涤液(约200μl)，并将细胞沉淀转移至-20℃。将收集的上清液以3000rpm离心，然后将180μl转移至新的96孔板中。然后将收集的上清液在4℃过夜保存，第二天通过Octet仪器进行分析。
将细胞以比常规传代培养低的细胞密度(0.3x106 VCC/ml：aFOG；0.5x106VCC/ml：传代培养)接种到生产培养基中，所述生产培养基与传代培养生长培养基非常相似，因此，由于培养基变化而引起的生长概况的任何变化应该是最小的(图15A-15D)。在进料和收获的同一天进行VCC的测量；这样可以粗略地概述生产过程期间各条件生长概况。该方法提供的生长数据有限，因此有可能错过某些条件下的生长峰值。这些丢失的数据将影响IVC(培养物中每小时每毫升活细胞浓度的时间积分)和Qp(单位生产率，pg/细胞/h)的计算；因为所有培养物和条件都有相同的限制，所以可以认为数据具有可比性。
依那西普和英夫利昔单抗中多种条件的生长概况表明VCC在第4天和第8天之间达到峰值。SREBF1的表达可能会延迟第4天后培养物的生长。这通过SV40/PGK条件的生长表明。
各时间点的差异很可能是由于经计数的培养物各自为转染细胞的库；因此，两个载体的拷贝数将变化，并且这将影响细胞生长。通过在各种条件下使用96个单独培养物并取平均值实现了差异的缓解。预期如下：如果启动子、LMM基因和重组蛋白的组合具有显著影响，那么整个条件变化都会发生转移。
测量aFOG后的产物浓度
使用蛋白A生物传感器在Octet中测量产物浓度。Octet能够以96孔形式探针探测单个孔，虽然对于板标准和对照需要两列；因此，每次Octet运行，最多可以测量80个样品。制备的标准介于100-5mg/L之间，板间对照稀释至25mg/L，并将各库收集到的上清液在CDCHO中稀释以适应所产生的标准曲线。
样品要求Octet传感器的最低浓度以对与蛋白A生物传感器结合的产物进行定量。各种条件下可定量的培养物数量不同；表10中列出了定量的培养物总数。这些数据表明，在所有重组蛋白质条件下的一些LMM基因条件中，可定量的培养物总数发生了变化，即SV40SREB411在所有重组蛋白质条件显示出可定量的培养物数量减少；而SV40 SREBF1条件显示可定量培养数量相等或提高。
表11：对于各种条件的启动子+LMM基因+重组分子(cB72.3；Infl：英夫利昔单抗；Cerg：色古土珠单抗；Etan：依那西普)使用Octet和蛋白A生物传感器定量的培养物数量(n)、平均生产率的标准偏差和平均生产率(mg/L)
Figure GDA0002731541300000921
因为使用了转染细胞的库，可以预期的是各种转染载体的拷贝数以及各库中各种细胞的固有生产率都将有所不同。各种条件产生最多80个细胞库，以减轻这种变异性，并给出各种条件下细胞生长和生产率更准确的描述。可定量的重复数量在14-80个库之间变化。
单位生产率的计算
一旦收集了所有蛋白A和生长数据，然后就有可能计算各培养物的单位生产率。这可以这样实现：通过计算每个细胞每小时的象形图(Qp)，以及培养物中每小时每毫升的活细胞浓度的时间积分(IVC)，所述IVC通过求解各培养物生长曲线下面积来计算。然后，可以在Qp相对IVC的气泡图中表示这些数据，其中各气泡(数据点)通过气泡的直径显示产物效价。所得图表可见于图16A-16D。
针对各RPLC(重组蛋白质+启动子+LMM条件)的平均值分析了表11中所示的平均生产率数据的95％置信区间；这些数据示于表12中，并且所得结果间隔示于表13中。
表12：使用蛋白A生物传感器测量的生产率数据的统计分析以给出平均生产率周围的95％置信区间。
Figure GDA0002731541300000931
表13：针对重组蛋白质+启动子+LMM条件各自的平均生产率95％置信区间计算的最终值。
Figure GDA0002731541300000932
然后，针对各种重组蛋白质转染绘制表13中所示数据，如图17A-17D所示。
讨论
通过同时考虑单位生产率图和95％置信区间图(CIP)，有可能鉴定在这些条件下显示出重组蛋白质表达改善的启动子+LMM组合。
依那西普
这些数据表明，平均而言，PGK+SREBF1条件确实会增加依那西普效价。有80个转染细胞库的平均值观察到了这一点。
色古珠单抗
SV40+SREB411条件在95％CIP中显示出效价增加。
英利昔单抗
当与依那西普和cB72.3条件相比较时，英夫利昔单抗的可测量培养物的数量通常较少。
PGK/SV40+SREBF1显示出英夫利昔单抗效价增加。在英夫利昔单抗气泡图中，超过Qp＝1的大多数数据点似乎来自这些条件。虽然PGK+SREBF1条件的平均效价更高，但是PGK+SREBF1条件的IVC低于SV40+SREBF1条件，这也可以通过比较Qp＝1以上数据点的数量看出。这两个条件也表明可测量重复的数量增加，这表明在表达英夫利昔单抗时，以这些水平表达SREBF1确实增加了细胞的生存能力。
cB72.3
cB72.3重组蛋白是标准单克隆抗体，并且相较于本文所讨论的其他重组蛋白，细胞更易于表达。
95％CIP表明在这些条件下增加SERBF1的表达可能会增加最终效价。SV40/PGK+SREBF1条件显示出效价显著增加。PGK+SCD1条件也显示出效价增加。cB72.3气泡图显示SV40+SREBF1数据趋向于更高的Qp和更低的IVC，而对于PGK+SREBF1条件则相反。SCD1条件似乎在Qp＝0.5-3和ICV＝500-1250之间分组。控制条件趋向于较低的Qp以及较高的IVC。
启动子和LMM组合选择
证明SV40/PGK+SREBF1组合改善了转染了它们的培养物的Qp或IVC以及产物效价。可能需要使用强启动子如hCMV或mCMV探索小鼠和CHO序列对于SCD1之间的差异。预期启动子的这些组合将改善产物效价。
实施例3：应用吡咯啉-5-羧酸合酶脯氨酸代谢选择系统生成稳定LMM工程改造的GS-KO CHO细胞库
通过上述实施例，已经证明操作下述内容改善CHOK1SV GS-KO宿主产生以及复杂蛋白质和标准mAb的产物质量：脂质代谢修饰剂(LMM)硬脂酰-CoA-去饱和酶1(SCD1)，固醇调节元件结合转录因子1(SREBF1)和截短的SREBF1同种型SREB411，其包含迁移到细胞核的SREBF1部分且缺少SREBF1的调控结构域。因此，利用P5CS脯氨酸代谢选择生成稳定表达LMM的修饰GS-KO CHO细胞库，在不同启动子的控制下过表达SCD1或SREBF1。
使用P5CS选择系统或PGK SCD1(小鼠)或SV40 SREBF1在隆萨公司专有化学定义的无蛋白缺少脯氨酸的培养基中，通过电穿孔使用PGK SCD1(CHO)或PGK SREBF1转染GS-KOCHO宿主。然后将转染细胞接种到三个96孔板中(各孔100μl培养物)，并在36.5℃，10％CO2下孵育。转染后第7天，从各转染培养物板的每孔/培养物移出150μl，并将缺少脯氨酸的新鲜培养基添加到各孔/培养基。然后监测培养物转染后的恢复和生长。从转染后约14天开始观察到转染后的细胞恢复。一旦认为>75％的培养物的融合度>75-80％，那么认为板中的培养物待回收并转移到96深孔板中。
在96深孔板中传代培养后，收集细胞沉淀物样品，生成蛋白质裂解物，并通过Western印迹分析靶LMM(SCD1或SREBF1)的表达，并以P5CS表达和β-肌动蛋白作为对照。根据结果分析，将各孔中的细胞库相对于彼此和对照分类为表达“高”、“中”或“低”量靶LMM。然后将“最高”的10个表达细胞的孔合并以生成“高”表达细胞库，将“中”表达上分布的10-15个孔汇集以生成“中”表达LMM库，并将“低”表达上分布的10-15个孔合并以生成“低”表达LMM库。在中和低库的情况中，从三个板分别获得孔。然后将这些LMM工程改造的细胞库扩展到摇瓶中，并在不含脯氨酸的隆萨公司专有培养基中生长。然后收集细胞裂解物以评估工程改造的细胞库中的LMM和P5CS表达。
图18显示了生成的细胞库的Western印迹分析，证实了宿主对照GS-KO CHO细胞系中没有P5CS表达或非常低，以及不同LMM库中相似量的P5CS表达。这证实了P5CS选择系统导致表达P5CS酶的细胞的分离。微管蛋白用作加载对照。如图18所示，相较于低PGK SCD1 CHO库，中和高PGK SCD1 CHO库中SCD1量增加，然而相较于低PGK SREBF1库，中和高PGK SREBF1库中细胞中工程改造的前体SREBF1分子增加。对PGK SCD1小鼠和SV40 SREBF1工程改造的细胞进行了相似观测。因此，图18显示了基于偶联LMM表达的P5CS的脯氨酸代谢选择系统成功地分离了表达P5CS的细胞，并且在缺少脯氨酸的培养基中生长出增加的LMM数量。
然后用重组生物治疗剂(依那西普或英夫利昔单抗)和GS的载体转染不同的LMM表达库，如上述实施例2中所述进行转染，然后在96孔板中不含脯氨酸和谷氨酰胺的培养基中回收。从转染后约14天开始观察到转染后的细胞恢复。一旦认为>75％的培养物的融合度>75-80％，那么认为板中的培养物待回收并转移到深孔板中。随后将细胞传代培养，并使用Octet仪器评估效价，然后将来自各LMM工程改造的转染库的最高的10孔合并并在摇瓶中生长。然后在分批补料培养条件下于微型生物反应器中评估它们的生产率和生长特性。
图19A-19D显示了Qp相对积分活细胞浓度(IVC)(IVC，培养物中每小时每毫升的活细胞浓度的时间积分和Qp，单位生产率，pg/细胞/h)的图，针对各LMM工程改造的库，随后用重组分子将其转染，并在培养的第9天，一式两份，在补料分批条件下，于ambrTM15微型生物反应器中评估生产率和生长。
图19A的图例(顶部)为(从上至下)：Cont.E1，Cont.E2，SV40-SBF1Hi E1，SV40-SBF1HiE2，SV40-SBF1MiE1，SV40-SBF1MiE2，SV40-SBF1LoE1，SV40-SBF1LoE2。y轴(底部)从0开始并一直到0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.6，标记为Qp(pg/细胞/h)。x轴(左侧)从0开始并一直到500、1000、1500、2000、2500、3000和3500，标记为IVC(106个细胞.h/ml)。图19A的图例(底部)为(从上至下)：Cont.I1，Cont.I2，SV40-SBF1Hi I1*，SV40-SBF1HiI2，SV40-SBF1MiI1*，SV40-SBF1LoI1，SV40-SBF1LoI2。y轴(底部)从0开始并一直到0.05、0.1、0.15、0.2、0.25和0.3，标记为Qp(pg/细胞/h)。x轴(左侧)从0开始并一直到500、1000、1500、2000、2500、3000、3500和4000，标记为IVC(106个细胞.h/ml)。图19B的图例(顶部)为(从上至下)：Cont.E1，Cont.E2，PGK-SBF1Hi E1，PGK-SBF1HiE2，PGK-SBF1MiE1**，PGK-SBF1MiE2，PGK-SBF1LoE1，PGK-SBF1LoE2。y轴(底部)从0开始并一直到0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6和0.7，标记为Qp(pg/细胞/h)。x轴(左侧)从0开始并一直到500、1000、1500、2000、2500、3000和3500，标记为IVC(106个细胞.h/ml)。图19B的图例(底部)为(从上至下)：Cont.I1，Cont.I2，PGK-SBF1Hi I2，PGK-SBF1HiI1，PGK-SBF1MiI1，PGK-SBF1LoI2，PGK-SBF1LoI1，PGK-SBF1MiI2。y轴(底部)从-0.05开始并一直到0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3和0.35，标记为Qp(pg/细胞/h)。x轴(左侧)从0开始并一直到500、1000、1500、2000、2500、3000、3500和4000，标记为IVC(106个细胞.h/ml)。图19C的图例(顶部)为(从上至下)：Cont.E1，Cont.E2，PGK-MSCDHiE1，PGK-mSCDHiE2，PGK-mSCDMiE1，PGK-mSCDMiE2，PGK-mSCDLoE1，PGK-mSCDLoE2。y轴(底部)从0开始并一直到0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.6，并标记为Qp(pg/细胞/h)。x轴(左侧)从0开始并一直到500、1000、1500、2000、2500、3000和3500，标记为IVC(106个细胞.h/ml)。图19C的图例(底部)为(从上至下)：Cont.I1，Cont.I2，PGK-mSCDMi I2*-，PGK-mSCDLoI2，PGK-mSCDHiI1。y轴(底部)从0开始并一直到0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35和0.4，标记为Qp(pg/细胞/h)。x轴(左侧)从0开始并一直到500、1000、1500、2000、2500、3000、3500和4000，标记为IVC(106个细胞.h/ml)。图19D的图例(顶部)为(从上至下)：Cont.E1，Cont.E2，PGK-SCDHi E1，PGK-SCDHiE2，PGK-SCDMiE1，PGK-SCDMiE2，PGK-SCDLoE1，PGK-SCDLoE2。y轴(底部)从0开始并一直到0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4和0.45，标记为Qp(pg/细胞/h)。x轴(左侧)从0开始并一直到500、1000、1500、2000、2500、3000、3500和4000，标记为IVC(106个细胞.h/ml)。图19D的图例(底部)为(从上至下)：Cont.I1，Cont.I2，PGK-SCDMiI1*，PGK-SCDMi I2，PGK-SCDHiI1，PGK-SCDHiI2，PGK-SCDLoI1，PGK-SCDLoI2。y轴(底部)从0开始并一直到0.05、0.1、0.15、0.2、0.25和0.3，标记为Qp(pg/细胞/h)。x轴(左侧)从0开始并一直到500、1000、1500、2000、2500、3000、3500和4000，标记为IVC(106个细胞.h/ml)。
对照细胞的IVC(黑圈，图19，非LMM工程该造的)通常是最高的，但是，当表达些模型难以表达蛋白质时，在各种情况中存在具有高于对照的Qp和与对照相似的IVC的多个LMM库(“*”表示在第12天收获的容器，“**”表示在第14天收获的)。这与这样的观点相一致，即使用P5CS选择方法生产和培养的LMM工程改造的细胞在相似条件下在产生难以表达的蛋白质时，可以具有增加的Qp，以及与非LMM工程改造的细胞相当的IVC。
***
本文引用的各专利、专利申请和出版物的公开内容通过引用其全文方式纳入本文。尽管已经参考特定方面公开了本发明，但是显然，本领域的其它技术人员可在不脱离本发明的真实精神和范围的情况下设计出本发明的其它方面和变化形式。所附权利要求旨在解释为包括所有这样的方面和等同变化形式。

Claims (12)

1.一种鉴定、选择或培养包含对象核酸序列的细胞的方法，所述方法包括：
a)提供包含异源性脂质代谢修饰剂LMM基因和异源性核酸的细胞，所述异源性核酸包含：
(i)所述对象核酸序列；和
(ii)编码吡咯啉-5-羧酸合酶P5CS分子的核酸序列；和
b)在足以允许包含核酸序列的细胞生长的条件下，在脯氨酸水平不足以支持不具有编码P5CS分子的核酸序列的相同细胞生长的培养基存在的情况下培养包含核酸序列的细胞，其中所述培养基还包含P5CS活性的抑制剂，
从而鉴定、选择或培养包含所述异源性核酸序列的细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述异源性核酸是载体。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述抑制剂是脯氨酸类似物。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述抑制剂是L-氮杂-2-环丁烷羧酸，3,4-脱氢-L-脯氨酸，或L-4-噻唑烷羧酸。
5.如权利要求1所述的方法，其包括选择包含所述异源性核酸序列的细胞。
6.如权利要求1所述的方法，其中，所述异源性核酸被整合到所述细胞的基因组中。
7.如权利要求1所述的方法，还包括选择表现出生长的细胞。
8.如权利要求1所述的方法，其中，所述细胞是哺乳动物细胞。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述细胞是CHO细胞。
10.如权利要求1所述的方法，其中，编码所述酶的序列的内源性拷贝已失活。
11.如权利要求1所述的方法，其中，所述对象核酸序列编码异源性多肽分子。
12.如权利要求1所述的方法，其包括由所述细胞或培养基回收产物。
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