KR20210030949A - 내인성 단백질의 수준을 감소시켜 생물학적 생성물의 생산을 개선하는 방법 - Google Patents

내인성 단백질의 수준을 감소시켜 생물학적 생성물의 생산을 개선하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 비-필수 내인성 단백질의 수준을 감소시킴에 의해 세포 또는 세포주에 의해 생산된 생성물, 예를 들어, 단백질의 양을 증가시키기 위한 방법, 세포 또는 세포주 및 조성물을 특징으로 한다.

Description

내인성 단백질의 수준을 감소시켜 생물학적 생성물의 생산을 개선하는 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 미국 가출원 U.S.S.N. 62/697,480 (2018년 7월 13일 출원)에 대한 우선권과 그 이익을 주장하고, 그 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
발명의 분야
본 개시내용은 배양된 세포에서 발현되는 생성물, 예를 들어, 폴리펩타이드의 수율을 증가시키기 위해 숙주 세포 발현을 변형하기 위한 방법 및 조성물에 대한 것이다.
재조합 치료 단백질과 같은 세포 생성물은 일반적으로 세포 발현 시스템, 예를 들어, 포유동물 세포 발현 시스템에서 발현된다. 수백 가지의 시장 승인된 바이오 의약품이 포유동물 세포주에서 발현된다. 그러나, 이의 생산과 관련된 높은 비용은 전반적인 건강 비용을 증가시키는데 기여한다.
따라서, 배양된 세포에서 발현되는 생성물, 예를 들어, 폴리펩타이드의 수율을 위한 방법을 개발하고 생성할 필요가 있다.
개요
본 개시내용은 생성물, 예를 들어, 재조합 폴리펩타이드를 생산할 수 있는 세포, 예를 들어, 생산 세포에서 하나 이상의 내인성 단백질, 예를 들어, 비필수, 중복 및/또는 분비된 내인성 단백질의 수준을 감소시키는 것은 생성물의 수율을 증가시킬 것이다는 발견에 부분적으로 기초한다.
일 양태에서, 본 발명은 세포, 예를 들어, 생산 세포에서 생성물, 예를 들어, 재조합 폴리펩타이드를 제조하는 방법에 대한 것으로서, 상기 방법은
세포, 예를 들어, 생산 세포에서 내인성 단백질의 수준을 감소시키고,
이에 의해 생성물을 제조하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 세포, 예를 들어, 생산 세포에서 생성물, 예를 들어, 재조합 폴리펩타이드를 제조하는 방법에 대한 것으로서, 상기 방법은:
세포, 예를 들어, 생산 세포를 제공하고,
세포, 예를 들어, 생산 세포에서 내인성 단백질의 수준을 감소시키고, 그리고
생성물, 예를 들어, 재조합 폴리펩타이드를 생산하기에 적합한 조건하에서 세포를 배양하고,
이에 의해 생성물을 제조하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 생성물, 예를 들어, 재조합 폴리펩타이드를 생산할 수 있는 세포, 예를 들어, 생산 세포에 대한 것이며, 여기서 세포, 예를 들어, 생산 세포는 내인성 단백질을 인코딩하는 유전자 또는 상기 내인성 단백질을 인코딩하는 유전자에 작동 가능하게 결합된 조절 핵산 서열, 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서의 사본에 대한 결실, 치환 또는 삽입 돌연변이를 포함하며, 예를 들어, 여기서, 돌연변이는 내인성 단백질의 발현 수준을 감소시킨다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 생성물, 예를 들어, 재조합 폴리펩타이드를 생산할 수 있는 세포, 예를 들어, 생산 세포에 대한 것이며, 여기서 세포는 예를 들어, 내인성 단백질 또는 이에 작동 가능하게 연결된 조절 요소, 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서를 인코딩하는 핵산, 예를 들어, mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 방법 또는 세포에 의해 생성된 생성물, 예를 들어, 재조합 폴리펩타이드에 대한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 생성물, 예를 들어, 재조합 폴리펩타이드를 포함하는 약학적 조성물에 대한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 표 E5로부터 선택된 내인성 단백질을 인코딩하는 핵산, 예를 들어, mRNA에 결합할 수 있는 siRNA에 대한 것이다.
실시형태에서, 생성물, 예를 들어, 폴리펩타이드는 표 1 및 2에 제공된 폴리펩타이드 또는 그의 변이체 중 하나이다.
실시형태에서, 생성물은 폴리펩타이드이다. 실시형태에서, 상기 폴리펩타이드는 항체, 예를 들어, 모노클로날 항체, 예를 들어, IgG1 항체 또는 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드이다. 실시형태에서, 항체-인코딩된 폴리뉴클레오타이드에서 하나 이상의 시스테인은 다른 아미노산으로 대체된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 시스테인은 하나 이상의 세린 잔기로 대체된다.
일 양태에서, 본 개시내용은 세포, 예를 들어, 재조합 숙주 세포, 예를 들어, 생산 세포에서 본 명세서에 기재된 생성물을 생산하는 방법을 특징으로 한다. 실시형태에서, 생성물은 폴리펩타이드, 예를 들어, 재조합 폴리펩타이드이다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법 또는 조성물을 사용하여 생산될 수 있는 생성물의 예는 재조합 생성물, 또는 적어도 하나의 부분 또는 모이어티(moiety)가 유전 공학의 결과인 생성물을 포함한다. 본 명세서에 기재된 재조합 생성물은 진단 또는 치료 목적에 유용하다. 일 실시형태에서, 생성물은 폴리펩타이드, 예컨대 항체 분자 (예를 들어, 이중특이적 또는 다중포맷 항체 분자), 융합 단백질 또는 단백질-접합체를 포함한다. 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은, 예를 들어, 대량으로 또는 상업적 또는 치료 용도에 충분한 품질로 생산하기 어려운 생성물, 예컨대, 차세대 생물학적 제제 (예를 들어, 융합 단백질, 이중특이적 또는 다중포맷 항체 분자, 다량체 단백질 및 글리코실화 단백질)에 대해 특히 유용할 수 있다. 일 실시형태에서, 예를 들어, 생성물을 생산하기 위한 본 명세서에 기재된 세포는 생성물을 발현한다. 일 실시형태에서, 상기 세포는 본 명세서에 기재된 생성물, 예를 들어, 표 1, 2, 3 또는 4로부터 선택된 폴리펩타이드를 인코딩하는 외인성 핵산을 포함한다. 생성물의 추가 예는 "생성물"로 표제된 부분에 기재되어 있다.
본 명세서에 기재된 방법은 또한 온도를 낮추지 않은 세포와 비교하여 생성물의 품질을 개선할 수 있다. 생성물의 품질에서의 개선은 다음 중 하나 이상에 의해 특성화되어 질 수 있다: 해리 (예를 들어, 폴리펩타이드의 덜 활성인 형태로의 해리 감소); 응집 (예를 들어, 응집체 또는 응집에서의 감소); 적절한 접힘 또는 조립 (예를 들어, 잘못 접히거나 펼쳐진 생성물; 또는 부분적으로 조립 또는 분해된 생성물에서의 감소); 번역-후 변형 (예를 들어, 글리코실화 이질성, 더 높은 비율의 원하는 또는 미리 결정된 번역-후 변형에서의 증가 또는 감소); 단편화 (예를 들어, 단편화에서의 감소); 디설파이드 결합 스크램블링(scrambling) (예를 들어, 디설파이드 결합 스크램블링으로 인한 원하지 않는 이소형 또는 구조에서의 감소). 일 실시형태에서, 생성물, 예를 들어, 재조합 폴리펩타이드의 품질은, 예를 들어, 온도를 낮추지 않은 세포에서 생산된 생성물의 품질과 비교하여 1-배, 2-배, 5-배, 10-배, 20-배, 50-배, 100-배 증가된다.
실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 생성물을 생산하는 방법은 폴리펩타이드의 안정성 또는 활성을 향상시키기 위해 하나 이상의 추가 단계로 수행될 수 있다. 여기에는 ER 처리 능력 (ER 확장) 또는 분비를 향상시키는 생산 세포에 변형을 도입하는 단계; 세포 또는 세포의 후손으로부터, 또는 세포 또는 세포의 후손에 의해 조절된 배지로부터 생성물을 얻는 단계; 생성물을 적어도 하나의 세포 또는 배지 구성성분으로부터 분리하는 단계; 및/또는 예를 들어, 활성 또는 구조적 모이어티의 존재에 대해 생성물을 분석하는 단계가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 일 실시형태에서, 본 방법은 PD1, BiP, ERO, 또는 XBP1을 인코딩하는 핵산을 도입함에 의해 ER 처리 능력 (또는 ER 확장)을 개선하는 단계를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 본 방법은 예를 들어, SNARE 구성성분을 인코딩하는 핵산을 도입함에 의해 분비 경로에 관여하는 SNARE 기구 또는 다른 기구를 조절함에 의해 분비 능력 또는 분비의 속도를 개선하기 위한 추가 단계를 추가로 포함한다.
생성물
본 명세서에 기재된 방법에 적합한 생성물은 폴리펩타이드, 예를 들어, 재조합 단백질; 핵산 분자, 예를 들어, DNA 또는 RNA 분자; 다량체 단백질 또는 복합체; 지질-캡슐화 입자, 예를 들어, 바이러스-유사 입자, 소포 또는 엑소좀; 또는 다른 분자를 포함한다. 실시형태에서, 생성물은 폴리펩타이드, 예를 들어, 재조합 폴리펩타이드이다. 예를 들어, 재조합 폴리펩타이드는 단백질 또는 복합 및/또는 비-천연 구조를 갖는 단백질, 예컨대 차세대 생물학적 제제, 예를 들어, 이중특이적 항체 분자, 융합 단백질 또는 글리코실화 단백질을 발현하기 어려울 수 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법에서, 생성물을 생산하는 방법은 생성물, 예를 들어, 폴리펩타이드, 예를 들어, 재조합 폴리펩타이드를 인코딩하는 외인성 핵산을 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 조성물, 제제, 생물 반응기 또는 방법에서, 생성물, 예를 들어, 재조합 폴리펩타이드는 치료적 폴리펩타이드 또는 항체 분자, 예를 들어, 항체 또는 이의 항체 단편이다. 일 실시형태에서, 항체 분자는 모노클로날 항체이다. 일 실시형태에서, 항체 분자는 이중특이적 항체 분자, 예를 들어, BiTE (이중특이적 T 세포 인게이저), DART (이중 친화성 재-표적화 또는 재지향된 T 세포)이다.
일 실시형태에서, 생성물, 예를 들어, 재조합 폴리펩타이드는 표 1, 표 2, 표 3 또는 표 4로부터 선택된다.
실시형태에서, 생성물은 세포에 의해 안정적으로 발현된다. 일 실시형태에서, 생성물, 예를 들어, 재조합 폴리펩타이드을 인코딩하는 외인성 핵산은 세포의 염색체 게놈 안으로 통합된다. 대안적으로, 생성물은 세포에 의해 일시적으로 발현된다. 일 실시형태에서, 생성물, 예를 들어, 재조합 폴리펩타이드를 인코딩하는 외인성 핵산은 세포의 염색체 게놈 내로 통합되지 않는다.
숙주 세포
본 명세서에 기재된 생성물을 생산하기 위한 세포, 예를 들어, 재조합 세포, 예를 들어, 생산 세포, 이러한 세포를 조작하는 방법 및 상기 세포를 사용하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
본 명세서에 기재된 임의의 조성물, 제제 또는 방법에서, 세포는 진핵 세포이다. 일 실시형태에서, 세포는 포유동물 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 조류 세포 또는 식물 세포이다. 일 실시형태에서, 세포는 설치류 세포이다. 일 실시형태에서, 세포는 CHO 세포이다. CHO 세포의 예는 CHOK1, CHOK1SV, 포텔리전트 (Potelligent) CHOK1SV, CHO GS 녹아웃, CHOK1SV GS-KO, CHOS, CHO DG44, CHO DXB11, CHOZN 또는 CHO-유래 세포를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본 명세서에 기재된 임의의 조성물, 제제 또는 방법에서, 세포는 HeLa, HEK293, H9, HepG2, MCF7, Jurkat, NIH3T3, PC12, PER.C6, BHK, VERO, SP2/0, NS0, YB2/0, EB66, C127, L 세포, COS, 예를 들어, COS1 및 COS7, QC1-3, CHOK1, CHOK1SV, 포텔리전트 CHOK1SV, CHO GS 녹아웃, CHOK1SV GS-KO, CHOS, CHO DG44, CHO DXB11, 및 CHOZN으로 구성된 군으로부터 선택된다.
한 실시형태에서, 세포는 포유동물 세포, 예를 들어, 곤충, 식물, 효모 또는 조류 세포 이외의 진핵 세포이다. 일 실시형태에서, 세포는 원핵 세포이다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법 또는 세포, 예를 들어, 생산 세포에서, 세포는 생성물, 예를 들어, 재조합 생성물, 예를 들어, 이중특이적 항체, 융합 단백질, 또는 글리코실화된 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 차세대 생물학적 제제를 발현하거나 포함한다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법 또는 세포, 예를 들어, 생산 세포에서, 세포는 CHOK1, CHOK1SV, 포텔리전트 CHOK1SV, CHO GS 녹아웃, CHOK1SV GS-KO, CHOS, CHO DG44, CHO DXB11, CHOZN 또는 CHO-유래 세포로 구성된 군으로부터 선택된 CHO 세포이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 아래에 기재된다. 본 명세서에 언급된 모든 공보, 특허 출원, 특허 및 기타 참고문헌은 그 전체가 참고로 포함된다. 부가하여, 재료, 방법 및 예는 예시일 뿐이고 제한하려는 의도가 아니다. (a), (b), (i) 등과 같은 제목, 부제목 또는 숫자 또는 문자 요소는 단지 읽기 쉽도록 표시된다. 이 문서에서 제목이나 숫자 또는 문자 요소의 사용은 단계 또는 요소를 알파벳 순서로 수행하거나 단계 또는 요소가 반드시 서로 분리되어야 하는 것을 요하지는 않는다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 상세한 설명 및 도면으로부터, 그리고 청구범위로부터 명백해질 것이다.
도 1a는 gRNA를 결여한 벡터로 형질감염된 CHO 세포에 비해 선택된 비-필수, 중복 및/또는 분비된 내인성 단백질이 녹아웃된 CHO 세포주에서 Mab의 세포-특이적 생산성의 그래프를 도시한다.
그림 1b는 FACS-분류된 풀에서 추출된 게놈 DNA의 TIDE 분석에 의해 측정된 유전자 인델 (indel) 성공의 그래프를 도시한다.
본 개시내용은 생성물을 생산할 수 있는 세포, 예를 들어, 생산 세포에서 내인성 단백질, 예를 들어, 비-필수, 중복 및/또는 분비된 내인성 단백질의 수준을 감소시킴에 의해 생성물, 예를 들어 폴리펩타이드의 더 높은 수율을 얻기 위한 방법 및 조성물을 특징으로 한다. 본 명세서에 기재된 방법 및 상기 방법에 사용된 세포는 현재 생산 방법 및/또는 세포로부터 수득된 수율 및 품질과 비교하여 개선된 품질을 나타낸다. 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 또한 현재 재조합 생성물을 생산하는 데 사용되는 세포 발현 시스템과 비교하여 개선된 생산성, 생성물 품질, 견고성 및/또는 배양 생존력을 갖는 조작된 세포 또는 세포주와 함께 사용할 수 있다.
본 방법은 차세대 생물학적 제제를 생산하는 데 적합하다. 이들 방법이 환자에게 계속해서 치료적 유용성을 확보함에 따라, 치료적 사용을 위한 높은 등급의 품질을 가진 다량의 차세대 생물학적 생성물에 대한 수요는 물론 생산 세포주의 효율적인 생산 수단과 효율적인 개발에 대한 수요가 증가할 것이다. 더욱이, 많은 차세대 생물학적 제제는 당업계에 공지된 통상적인 발현 기술을 사용하여 통상적인 세포주에서 발현 및 생산하기 어렵다. 현재의 방법은 이들 생성물을 대량으로 그리고 임상적 사용에 필요한 높은 등급의 품질로 생산하기에 충분하지 않다. 내인성 단백질의 수준을 감소시키는 것을 포함하는 본 명세서에 기재된 방법은 이들 장애물을 극복하고 생성물 수율을 증가시키기 위해 다른 방법과 조합될 수 있다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 및/또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 물질 및 방법이 본 명세서에 기재되어 있다. 본 발명을 설명하고 청구함에 있어서, 정의가 제공되어 지는 다음 용어는 정의되어 지는 방식에 따라 사용될 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어는 단지 특정 실시형태를 설명하기 위한 것이며 제한하려는 의도가 아님을 또한 이해해야 한다.
관사 "a" 및 "an"은 관사의 문법적 대상 중 하나 또는 하나 이상 (즉, 적어도 하나)을 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 예를 들어, "세포"는 하나의 세포 또는 하나 이상의 세포를 의미할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "내인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템으로부터 또는 그 내부에 자연적으로 생성된 임의의 물질을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 "외인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템에 도입되거나 그의 외부에 생성된 임의의 물질을 지칭한다. 따라서, "외인성 핵산"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템에 도입되거나 그의 외부에서 생성되는 핵산을 지칭한다. 실시형태에서, 외인성 핵산의 서열은 외인성 핵산이 도입되는 유기체, 세포, 조직 또는 시스템 내부에서 자연적으로 생성되지 않거나 자연적으로 발견될 수 없다. 실시형태에서, 비-천연 발생 생성물 또는 비-천연 발생인 부분을 함유하는 생성물은 본 명세서에 기재된 숙주 세포와 관련하여 외인성 물질이다.
본 명세서에 사용된 "이종성"은 다른 종으로부터 유기체, 세포, 조직 또는 시스템에 도입될 때 한 종으로부터의 임의의 물질을 지칭한다. 실시형태에서, 이종성 물질은 또한 하나 또는 다수의 종으로부터의 부분 또는 비-천연 발생하는 부분을 포함하는 물질을 포괄한다. 예를 들어, 융합 단백질의 일부는 인간이고, 융합 단백질의 일부는 박테리아이고, 융합 단백질의 일부는 비-천연 발생하는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산, 및 핵산이 인간 세포에 도입되는, 실시형태에서, 핵산은 이종성 핵산이다.
본원에서 상호 교환적으로 사용되는 "펩타이드", "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 펩타이드 결합에 의해 또는 펩타이드 결합 이외의 수단에 의해 공유적으로 연결된 아미노산 잔기로 구성된 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩타이드는 적어도 2개의 아미노산을 함유해야 하고 단백질 또는 펩타이드의 서열을 포함할 수 있는 최대 아미노산의 수에는 제한이 없다. 일 실시형태에서, 단백질은 1개 초과, 예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 초과의 폴리펩타이드를 포함할 수 있으며, 여기서 각 폴리펩타이드는 공유 또는 비-공유 결합/상호작용에 의해 다른 폴리펩타이드와 결합된다. 폴리펩타이드는 펩타이드 결합에 의해 또는 펩타이드 결합 이외의 수단에 의해 서로 결합된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩타이드 또는 단백질을 포함한다. 본 명세서에 사용된 용어는 예를 들어 당업계에서 일반적으로 펩타이드, 올리고펩타이드 및 올리고머로도 지칭되는 단쇄 및 당업계에서 일반적으로 단백질로 지칭되는 장쇄 둘 모두를 지칭하며, 이들 중에는 많은 유형이 있다. "폴리펩타이드"는, 예를 들어, 생물학적으로 활성인 단편, 실질적으로 상동성 폴리펩타이드, 올리고펩타이드, 동종이량체, 이종이량체, 폴리펩타이드의 변이체, 변형된 폴리펩타이드, 유도체, 유사체, 융합 단백질 등을 포함한다.
"재조합 생성물"은 세포 또는 무-세포 시스템에 의해 생산될 수 있는 생성물을 지칭한다. 생성물은 분자, 핵산, 폴리펩타이드 (예를 들어, SS 폴리펩타이드) 또는 이의 임의의 하이브리드일 수 있다. 재조합 생성물은 생성물의 적어도 하나의 구성성분 또는 생성물의 생산 또는 발현을 제어하는 서열의 적어도 하나의 뉴클레오타이드가 유전 공학에 의해 형성된 것이다. 재조합 생성물을 생성하기 위해 본 명세서에 사용된 유전 공학 또는 재조합 생성물을 인코딩하는 작제물은 당업계에 공지된 재조합 DNA 발현 기술 (예를 들어, 분자 생물학의 현행 프로토콜에 기재된 바와 같음); 부위-지향, 스캐닝 또는 무작위 돌연변이 유발; CRISPR 전략; 및 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 전략을 포함한다. 일 실시형태에서, 재조합 생성물은 재조합 폴리펩타이드이다. 일 실시형태에서, 재조합 생성물은 천연 발생 생성물이다. 일 실시형태에서, 재조합 생성물은 비-천연 발생 생성물, 예를 들어, 합성 생성물이다. 일 실시형태에서, 재조합 생성물의 일부는 천연 발생인 반면, 재조합 생성물의 다른 부분은 비-천연 발생이다. 또 다른 실시형태에서, 재조합 생성물의 제1 부분은 하나의 천연 발생 분자인 반면, 재조합 생성물의 다른 부분은 제1 부분과 다른 또 다른 천연 발생 분자이다.
"재조합 폴리펩타이드"는 본 명세서에 기재된 세포에 의해 생산될 수 있는 폴리펩타이드를 지칭한다. 재조합 폴리펩타이드는 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열의 적어도 하나의 뉴클레오티드, 또는 폴리펩타이드의 발현을 제어하는 서열의 적어도 하나의 뉴클레오티드가 (세포 또는 전구 세포의) 유전 공학 또는 조작에 의해 형성된 것이다. 예를 들어, 적어도 하나의 뉴클레오티드가 변경되었고, 예를 들어, 그것은 세포에 도입되었거나 유전적으로 조작된 재배열의 생성물이다. 실시형태에서, 재조합 폴리펩타이드의 서열은 폴리펩타이드 또는 단백질의 천연 또는 비-천연 발생 이소형과 다르지 않다. 실시형태에서, 재조합 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 폴리펩타이드 또는 단백질의 천연 발생 또는 비-천연 이소형의 서열과 상이하다. 실시형태에서, 재조합 폴리펩타이드 및 세포는 동일한 종으로부터 유래된다. 실시형태에서, 재조합 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 세포의 내인성 게놈에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드와 동일하거나 실질적으로 동일하거나, 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 이하로 상이하다. 실시형태에서, 재조합 폴리펩타이드 및 세포는 동일한 종으로부터 유래되며, 예를 들어, 재조합 폴리펩타이드는 인간 폴리펩타이드이고 세포는 인간 세포이다. 실시형태에서, 재조합 폴리펩타이드 및 세포는 상이한 종으로부터 유래하고, 예를 들어, 재조합 폴리펩타이드는 인간 폴리펩타이드이고 세포는 비인간, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, CHO, 다른 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물, 곰팡이 또는 박테리아 세포이다. 실시형태에서, 재조합 폴리펩타이드는 세포에 대해 외인성이며, 즉, 세포는 제1 종에서 유래하고 재조합 폴리펩타이드는 제2 종에서 유래한다. 일 실시형태에서, 폴리펩타이드는 합성 폴리펩타이드이다. 일 실시형태에서, 폴리펩타이드는 비-천연 발생원으로부터 유래된다. 실시형태에서, 재조합 폴리펩타이드는 인간 폴리펩타이드 또는 단백질의 천연 또는 비-천연 발생 이소형과 아미노산 서열이 다르지 않은 인간 폴리펩타이드 또는 단백질이다. 실시형태에서, 재조합 폴리펩타이드는 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15 또는 20개 이하의 아미노산 잔기에서 인간 폴리펩타이드 또는 단백질의 천연 또는 비-천연 이소형과 상이하다. 실시형태에서, 재조합 폴리펩타이드는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 또는 15% 이하의 그 아미노산 잔기에서 인간 폴리펩타이드의 천연 발생 이소형과 상이하다. 재조합 폴리펩타이드의 일부가 인간 폴리펩타이드의 천연 또는 비-천연 이소형의 일부로부터 유래된 서열을 포함하는 실시형태에서, 재조합 폴리펩타이드의 일부는 천연 또는 비-천연 이소형의 상응하는 부분과 그 아미노산 잔기 중 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15 또는 20개 아미노산 잔기 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10% 또는 15% 이하로 상이하다.
산소화 수준 및 산소화의 수준은 상호 교환적으로 사용되고, 본원에서 사용되는 바와 같이, 예를 들어, 배양물에서 액체 또는 기체의 부피에서 용존 산소 수준을 지칭한다. 산소화 수준은 용존 산소 팽창력 (DOT)의 단위로, 예를 들어, 공기 포화율 (예를 들어, 공기 중 산소 수준의 백분율)의 관점에서 설명될 수 있다.
본 명세서에 사용된 생산 배양물은 성장 배지 및 세포 (예를 들어, 적어도 하나의 세포), 예를 들어, 재조합 세포, 예를 들어, 생성물, 예를 들어, 단백질 (예를 들어, 재조합 폴리펩타이드)을 발현하는 재조합 숙주 세포, 세포 인자, 예를 들어, 효소 및 대사산물의 혼합물을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 생산 배양물은 세포 성장/분할 특징을 포함하는 하나 이상의 배양 단계 (예를 들어, 순차적 및/또는 중첩 배양 단계)를 통해 진행된다. 일부 실시형태에서, 생산 배양물의 처리는 생산 배양물이 상이한 단계를 통해 진행됨에 따라 본 명세서에 기재된 바와 같이 변경된다. 본 명세서에 사용된 생산 단계는 접종 시에 시작하고 특정 기준 (예를 들어, 공정 종료 또는 기간, 예를 들어, 10-30일, 예를 들어, 15-20일)에 도달할 때 또는 특정 세포 생존력 기준 (예를 들어, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 또는 10% 미만 생존력, 예를 들어, 50% 미만 생존력)에 도달할 때 종료하는 생산 배양물의 단계를 지칭한다. 생산 단계는 세포 성장 및/또는 분열이 지수적인 지수 성장 단계를 포함할 수 있다. 생산 단계는 세포 성장 및/또는 분열이 성장 곡선의 선형 단계에 있는, 예를 들어, 세포 성장 및/또는 분열의 속도가 지수 성장 단계에 비해 감소되는, 지수 성장 단계에 이어지는 후-성장 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 생산 단계의 완료는 생산 배양물로부터 생산 혼합물을 생산한다. 일부 실시형태에서, 생산 상청액으로부터 세포의 분리, 예를 들어, 수확, 및 추가 분리 또는 정제 단계, 예를 들어, 후-수확 단계는 생산 단계의 종료에 이어지는 단계이다.
본 명세서에 사용된 생산 혼합물은 생성물, 예를 들어, 재조합 폴리펩타이드, 성장 배지 및 세포 (예를 들어, 적어도 하나의 세포), 예를 들어, 재조합 세포, 예를 들어, 생성물을 발현할 수 있는 재조합 숙주 세포의 혼합물을 지칭한다. 생산 세포는 생성물, 예를 들어, 재조합 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 숙주 세포이다.
본 명세서에서 사용된 작동 가능하게 결합된 것은 용기 간의 상관관계를 기술한다. 실시형태에서, 배양 배지 또는 생산 배양물은 작동 가능하게 결합된 용기 사이에서 전달될 수 있다. 실시형태에서, 작동 가능하게 결합된 용기 사이의 배양물의 흐름은 제어된 방식으로, 예를 들어, 펌프, 필터, 센서, 배양 조건을 유지하거나 변경하기 위한 수단, 및/또는 액체의 흐름을 모니터링하기 위한 수단을 사용하여 발생한다.
본 명세서에 사용된 작동 가능하게 연결된 것은 제1 핵산 서열, 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서 서열과 제2 핵산 서열, 예를 들어 단백질을 인코딩하는 서열 사이의 상관관계를 기술하며, 여기서 제1 핵산 서열은, 예를 들어, 전사, 후성유전적 변형 및/또는 염색체 토폴로지에 영향을 미침으로써 제2 핵산 서열에 영향을 미칠 수 있다. 일부 실시형태에서, 작동 가능하게 연결된 것은 2개의 핵산 서열이 동일한 핵산 분자에 포함된다는 것을 의미한다. 추가 실시형태에서, 작동 가능하게 연결된 것은 2개의 핵산 서열이 동일한 핵산 분자 상에서 서로 근접해 있는, 예를 들어, 서로 1000, 500, 100, 50 또는 10개 염기쌍 내에 있거나 또는 서로 직접적으로 인접한 것을 추가로 의미할 수 있다. 실시형태에서, 단백질을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터 또는 인핸서 서열은, 예를 들어, 전사를 수행할 수 있는 세포 또는 무 세포 시스템에서 단백질을 인코딩하는 서열의 전사를 촉진할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 포함할 수 있거나 또는 본 개시내용의 생물반응기는 상이한 단계에 걸쳐 상이한 온도에서 생산 배양물, 생산 배양물의 세포, 또는 생산 배양물로부터의 상청액을 유지할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 T배양물은 생산 배양물의 세포가, 예를 들어, 성장 배지에서, 접종 시작부터 생산 단계의 종료까지 성장하여 단백질이 생산되는 생산 배양물을 생산하는 온도이다. 일부 실시형태에서, T배양물은 30℃-38℃이다. 본 명세서에 사용된 T생산은 후-지수적 성장 단계 이후에 생산 배양물이 냉각되는 첫 번째 온도이다. 일부 실시형태에서, T생산은 35℃, 34℃, 33℃, 32℃, 31℃ 또는 30℃ 미만, 예를 들어, 30℃-33℃이다. 본 명세서에 사용된 T수확은 생산 배양물이 수확 (예를 들어, 상청액에서 세포의 분리) 전에 냉각되는 두 번째 온도이다. 일부 실시형태에서, T수확은 29℃, 28℃, 27℃, 26℃, 25℃, 24℃, 23℃, 22℃, 21℃, 20℃, 19℃, 18℃, 17℃, 16℃, 15℃, 14℃, 13℃, 12℃, 11℃, 10℃, 9℃, 8℃, 7℃, 6℃, 5℃ 또는 4℃이다. 일 실시형태에서, T수확은 12℃-18℃, 예를 들어, 15℃이다. 일 실시형태에서, T수확은 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 10℃, 11℃, 12℃, 13℃, 14℃, 15℃, 16℃, 17℃, 18℃, 19℃, 20℃, 21℃, 22℃, 23℃ 또는 24℃ 미만이다. 일 실시형태에서, T수확은 15℃±3℃이다.
본 명세서에서 사용되는 용어로서 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 가이드 RNA (gRNA) 분자와 상호 작용할 수 있고, gRNA 분자와 협력하여 원래 위치로 돌아가거나 또는 표적 도메인 및 PAM 서열을 포함하는 부위에 국소화될 수 있는 분자 또는 폴리펩타이드를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 이들 용어로서 Cas9 분자 및 Cas9 폴리펩타이드는 천연 발생 Cas9 분자 및 참조 서열, 예를 들어, 가장 유사한 천연 발생 Cas9 분자 또는 서열과, 예를 들어, 적어도 하나의 아미노산 잔기에 의해 상이한 조작, 변경 또는 변형된 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드를 포함한다. 예시적인 Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드 서열은 그 전체로 본 명세서에 참조로 포함된 WO2015/157070에서 찾아 볼 수 있다. Cas9 분자 또는 Cas9 폴리펩타이드는 DNA 절단 및 닉킹 (nicking) 활성을 갖는 Cas9 분자를 포함한다.
본 명세서에 인용된 각각 및 모든 특허, 특허 출원 및 공보의 개시내용은 그 전체로 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 발명이 특정 양태를 참조하여 개시되었지만, 본 발명의 다른 양태 및 변형이 본 발명의 진정한 사상 및 범주를 벗어나지 않고 당업계의 통상인에 의해 고안될 수 있음이 명백하다. 첨부된 청구범위는 이러한 모든 양태 및 균등한 변형을 포함하는 것으로 해석되도록 의도된다.
내인성 단백질의 수준 감소
본 개시내용은 부분적으로 세포, 예를 들어, 생산 세포에서 생성물, 예를 들어, 재조합 폴리펩타이드를 제조하는 방법에 대한 것이며, 여기서 상기 방법은 세포, 예를 들어, 생산 세포에서 하나 이상의 내인성 단백질의 수준을 감소시키는 것을 포함한다. 이론에 얽매이기를 바라지 않으면서, 하나 이상의 생산 세포 특성 (예를 들어, 특정 생성물 생산 속도 (qP), 성장 속도, 생성물 수율 및/또는 생존 세포 농도)은 하나 이상의 내인성 단백질의 수준을 감소시킴에 의해 개선될 수 있다고 생각된다. 내인성 단백질은 소포체 또는 골지에서 공간 및/또는 자원 (예를 들어, 번역, 후-번역 처리 및 분비 공간/자원)을 소비하여, 생산 세포가 생성물, 예를 들어, 재조합 폴리펩타이드를 생산하는 데 이용할 수 있는 능력을 낮출 수 있다. 내인성 단백질은 세포, 예를 들어, 생산 세포에 대한 기능성의 관점에서 서로 더욱 중복될 수 있거나, 생물 제조의 인공적 환경, 예를 들어, 생물반응기 및 세포 배양에서 세포 생존력 또는 성장에 불필요할 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포, 예를 들어, 생산 세포에서 하나 이상의 내인성 단백질의 수준을 감소시키는 것은 하나 이상의 내인성 단백질의 수준을 하나 이상의 내인성 단백질 수준이 감소하지 않은 유사한 세포에 비해 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100% 만큼 감소시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포, 예를 들어, 생산 세포에서 하나 이상의 내인성 단백질의 수준을 감소시키는 것은 세포, 예를 들어, 생산 세포로부터의 하나 이상의 내인성 단백질의 본질적으로 모두, 예를 들어, 모두를 제거하는 것을 포함한다. 하나 이상의 내인성 단백질의 수준은, 예를 들어, Porter, A. J., 등 (2010). "Strategies for selecting recombinant CHO cell lines for cGMP manufacturing: realizing the potential in bioreactors." Biotechnol Prog 26(5): 1446-1454에 기술된 방법에 의해 평가될 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포, 예를 들어, 생산 세포에서 하나 이상의 내인성 단백질의 수준을 감소시키는 것은 qP를 개선한다. 본 명세서에서 사용된 qP는 특정 생성물 생산 속도를 지칭한다. 일부 실시형태에서, qP는 단위 시간당 단위 생산 세포당 생성물의 단위 (예를 들어, 그램 또는 생존 세포 계수)를 갖는다. 일부 실시형태에서, qP는 하나 이상의 내인성 단백질의 수준이 감소되지 않은 유사한 세포, 예를 들어, 생산 세포의 qP의 적어도 1.05x (즉, 1.05배), 1.06x, 1.07x, 1.08x, 1.09x, 1.1x, 1.12x, 1.13x, 1.14x, 1.15x, 1.16x, 1.17x, 1.18x, 1.19x, 1.2x, 1.25x, 1.3x, 1.35x, 1.4x, 1.45x, 1.5x, 1.55x, 1.6x, 1.65x, 1.7x, 1.75x, 1.8 x, 1.85x, 1.9x, 1.95x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x 또는 10x까지 개선, 예를 들어, 증가된다. 일부 실시형태에서, qP는 하나 이상의 내인성 단백질의 수준이 감소되지 않은 유사한 세포, 예를 들어, 생산 세포에 비해 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 또는 70% 만큼 개선, 예를 들어, 증가된다. qP는, 예를 들어, ELISA 또는 정량 크로마토그래피 (예를 들어, 단백질 A HPLC)에 의해 분비된 단백질 생성물의 정량화에 의해 평가될 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포, 예를 들어, 생산 세포에서 하나 이상의 내인성 단백질의 수준을 감소시키는 것은 세포 성장, 예를 들어, 세포가 성장 및/또는 분열하는 속도를 개선한다. 일부 실시형태에서, 세포 성장은 하나 이상의 내인성 단백질의 수준이 감소되지 않은 유사한 세포, 예를 들어, 생산 세포의 세포 성장을 적어도 1.05x (즉, 1.05배), 1.06x, 1.07x, 1.08x, 1.09x, 1.1x, 1.12x, 1.13x, 1.14x, 1.15x, 1.16x, 1.17x, 1.18x, 1.19x, 1.2x, 1.25x, 1.3x, 1.35x, 1.4x, 1.45x, 1.5x, 1.55x, 1.6x, 1.65x, 1.7x, 1.75x, 1.8x, 1.85x, 1.9x, 1.95x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 또는 10x까지 개선, 예를 들어, 증가된다. 일부 실시형태에서, 세포 성장은 하나 이상의 내인성 단백질의 수준이 감소되지 않은 유사한 세포, 예를 들어, 생산 세포에 비해 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 또는 70% 만큼 개선, 예를 들어, 증가된다. 세포 성장은, 예를 들어, 자동화된 트리판 블루 배제 분석 (예를 들어, Beckman coulter Vi-CELL XR 사용)을 사용하여 생존 세포 농도의 시간적 측정에 의해 평가될 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포, 예를 들어, 생산 세포에서 하나 이상의 내인성 단백질의 수준을 감소시키는 것은 생성물 수율, 예를 들어, 배양물이 생산하는 생성물의 양을 개선한다. 일부 실시형태에서, 세포 성장은 하나 이상의 내인성 단백질의 수준이 감소되지 않은 유사한 세포, 예를 들어, 생산 세포의 생성물 수율을 적어도 1.05x (즉, 1.05배), 1.06x, 1.07x, 1.08x, 1.09x, 1.1x, 1.12x, 1.13x, 1.14x, 1.15x, 1.16x, 1.17x, 1.18x, 1.19x, 1.2x, 1.25x, 1.3x, 1.35x, 1.4x, 1.45x, 1.5x, 1.55x, 1.6x, 1.65x, 1.7x, 1.75x, 1.8x, 1.85x, 1.9x, 1.95x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 또는 10x까지 개선된다. 일부 실시형태에서, 생성물 수율은 하나 이상의 내인성 단백질의 수준이 감소되지 않은 유사한 세포, 예를 들어, 생산 세포에 비해 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 또는 70% 만큼 개선된다. 생성물 수율은, 예를 들어, ELISA 또는 정량적 크로마토그래피 (예를 들어, 단백질 A HPLC)에 의해 분비된 단백질 생성물의 정량화에 의해 평가될 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포, 예를 들어, 생산 세포에서 하나 이상의 내인성 단백질의 수준을 감소시키는 것은 qP 및 세포 성장을 개선한다. 일부 실시형태에서, 세포, 예를 들어, 생산 세포에서 하나 이상의 내인성 단백질의 수준을 감소시키는 것은 qP 및 생성물 수율을 개선한다. 일부 실시형태에서, 세포, 예를 들어, 생산 세포에서 하나 이상의 내인성 단백질의 수준을 감소시키는 것은 생성물 수율 및 세포 성장을 개선한다. 일부 실시형태에서, 세포, 예를 들어, 생산 세포에서 하나 이상의 내인성 단백질의 수준을 감소시키는 것은 qP, 생성물 수율 및 세포 성장을 개선한다.
내인성 단백질
본 명세서에 기재된 방법에서 수준이 감소될 수 있는 내인성 단백질은 그 수준이 감소되지 않을 수 있는 다른 내인성 단백질, 및/또는 분비된 단백질과 기능적으로 중복되는 (예를 들어, 세포 성장 및/또는 생존력에 대해, 예를 들어, 생물제조 환경에서) 비-필수적인 것들을 포함한다. 본 명세서에서의 개시내용 및 당해 기술의 상태에 기초하여, 숙련자는 최소한의 실험으로 세포, 예를 들어, CHO 세포의 내인성 단백질이 비-필수적인, 중복된, 및/또는 분비된 단백질인지 인식할 수 있을 것이다.
일부 실시형태에서, 수준이 감소될 수 있는 내인성 단백질은, 예를 들어, 실시예 1의 방법에 의해 결정된 바와 같이 적어도 매우 높은 수준에서 발현되는 단백질이다. 일부 실시형태에서, 수준이 감소될 수 있는 내인성 단백질은, 예를 들어, 실시예 1의 방법에 의해 결정된 바와 같이 적어도 높은 수준에서 발현되는 단백질이다. 일부 실시형태에서, 수준이 감소될 수 있는 내인성 단백질은, 예를 들어, 실시예 1의 방법에 의해 결정된 바와 같이 적어도 중간 수준에서 발현되는 단백질이다.
일부 실시형태에서, 수준이 감소될 수 있는 내인성 단백질은, 예를 들어, 단백질 기능 데이터베이스, 예를 들어, 실시예 1의 PANTHER 데이터베이스에서 중복성, 비-필수성 또는 분비와 관련된 기능과 연관된 단백질이다. 일부 실시형태에서, 수준이 감소될 수 있는 내인성 단백질은 표 E1에 나열된 기능적 키워드 또는 실질적으로 유사한 기능적 연관성과 연관된다. 일부 실시형태에서 수준이 감소될 수 있는 내인성 단백질은 면역 기능, 질환 내성, 세포 통신 및/또는 분비와 연관된 단백질이다.
일부 실시형태에서, 수준이 감소될 수 있는 내인성 단백질은, 예를 들어, 실시예 1의 방법에 의해 결정된 바와 같이 적어도 매우 높은 수준에서 발현되고, 단백질 기능 데이터베이스, 예를 들어, 실시예 1의 PANTHER 데이터베이스에서 중복성, 비-필수성 또는 분비와 관련된 기능과 연관된, 예를 들어, 표 E1의 키워드와 연관된 단백질이다. 일부 실시형태에서, 수준이 감소될 수 있는 내인성 단백질은, 예를 들어, 실시예 1의 방법에 의해 결정된 바와 같이 적어도 높은 수준에서 발현되고, 단백질 기능 데이터베이스, 예를 들어, 실시예 1의 PANTHER 데이터베이스에서 중복성, 비-필수성 또는 분비와 관련된 기능과 연관된, 예를 들어, 표 E1의 키워드와 연관된 단백질이다. 일부 실시형태에서, 수준이 감소될 수 있는 내인성 단백질은, 예를 들어, 실시예 1의 방법에 의해 결정된 바와 같이 적어도 중간 수준에서 발현되고, 단백질 기능 데이터베이스, 예를 들어, 실시예 1의 PANTHER 데이터베이스에서 중복성, 비-필수성 또는 분비와 관련된 기능과 연관된, 예를 들어, 표 E1의 키워드와 연관된 단백질이다.
일부 실시형태에서, 수준이 감소될 수 있는 내인성 단백질은 필수 기능, 예를 들어, 세포 성장, 생존력 또는 생성물 생산에 필수적이거나 매우 필요한 기능과 연관된 단백질이 아니다. 일부 실시형태에서, 수준이 감소될 수 있는 내인성 단백질은, 예를 들어, 단백질 기능 데이터베이스, 예를 들어, 실시예 1의 PANTHER 데이터베이스에서 필수적인 기능과 연관된 단백질이 아니다. 일부 실시형태에서, 수준이 감소될 수 있는 내인성 단백질은 표 E2에 열거된 기능적 키워드 또는 실질적으로 유사한 기능적 연관과 연관되지 않다. 일부 실시형태에서, 수준이 감소될 수 있는 내인성 단백질은 세포 대사, 미토콘드리아 기능, 세포 구조, DNA 복제, 세포 분열, 체크포인트 억제/계대, 전사, 번역, 후-번역 변형, 단백질 접힘, 또는 열 충격 반응과 연관된 단백질이 아니다.
수준이 감소될 수 있는 예시적인 내인성 단백질 (및/또는 상기 내인성 단백질을 인코딩하는 유전자)은 표 E5에 열거되어 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 하나 초과의 내인성 단백질의 수준을 감소시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 일, 이, 삼, 사, 오, 육, 칠, 팔, 구, 십 또는 초과 (예를 들어, 이십 이상)의 내인성 단백질 (및 선택적으로 최대 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2개의 내인성 단백질)의 수준을 감소시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 2개 또는 3개의 내인성 단백질, 예를 들어, 표 E6의 조합으로부터 선택된 내인성 단백질의 조합의 수준을 감소시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 2개 또는 3개의 내인성 단백질, 예를 들어, 표 E5에 열거된 것들로부터 선택된 내인성 단백질의 조합의 수준을 감소시키는 것을 포함한다.
내인성 단백질의 수준을 감소시키는 방법
본 개시내용은 부분적으로 세포, 예를 들어, 생산 세포에서 생성물, 예를 들어, 재조합 폴리펩타이드를 제조하는 방법에 대한 것이며, 여기서 상기 방법은 세포, 예를 들어, 생산 세포에서 하나 이상의 내인성 단백질의 수준을 감소시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포, 예를 들어, 생산 세포에서 내인성 단백질의 수준을 감소시키는 것은 내인성 단백질을 인코딩하는 유전자의 카피를 제거하는 것, 예를 들어, 녹아웃시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포, 예를 들어, 생산 세포에서 내인성 단백질의 수준을 감소시키는 것은 세포의 게놈으로부터 내인성 단백질을 인코딩하는 유전자의 모든 (예를 들어, 둘 모두) 카피를 제거하는 것, 예를 들어, 녹아웃시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포, 예를 들어, 생산 세포에서 내인성 단백질의 수준을 감소시키는 것은 내인성 단백질을 인코딩하는 유전자에 작동 가능하게 결합된 조절 핵산 서열, 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서를 제거하는 것, 예를 들어, 녹아웃시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포, 예를 들어, 생산 세포에서 내인성 단백질의 수준을 감소시키는 것은 내인성 단백질을 인코딩하는 유전자에 작동 가능하게 결합된 조절 핵산 서열, 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서의 모든 (예를 들어, 둘 모두) 카피를 제거하는 것, 예를 들어, 녹아웃시키는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제거하는 것, 예를 들어, 녹아웃시키는 것은 내인성 단백질을 인코딩하는 유전자에 또는 내인성 단백질을 인코딩하는 유전자에 작동 가능하게 결합된 조절 핵산 서열, 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서에 결실, 치환 또는 삽입 돌연변이를 도입하는 것을 포함하며, 예를 들어, 상기 돌연변이는 내인성 단백질의 발현의 수준을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 제거하는 것, 예를 들어, 녹아웃시키는 것은 내인성 단백질을 인코딩하는 유전자에서 또는 내인성 단백질을 인코딩하는 유전자에 작동 가능하게 결합된 조절 핵산 서열, 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 초과의 염기쌍의 결실 또는 삽입을 도입하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제거하는 것, 예를 들어, 녹아웃시키는 것은 내인성 단백질을 인코딩하는 유전자 또는 상기 내인성 단백질을 인코딩하는 유전자에 작동 가능하게 결합된 조절 핵산 서열, 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서에서 상이한 염기쌍에 대해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 9, 10 또는 그 초과의 염기쌍을 치환하는 것 (예를 들어, 염기전이 또는 염기교차 돌연변이)을 포함한다.
예를 들어, 내인성 단백질을 인코딩하는 유전자의 판독 프레임을 파괴하는 삽입 돌연변이 또는 내인성 단백질을 인코딩하는 유전자의 시작 코돈을 변경하는 치환 돌연변이 둘 모두는 내인성 단백질의 수준을 감소시키는 제거하는 것, 예를 들어, 녹아웃시키는 것의 예일 수 있다. 추가의 예로서, 제거하는 것, 예를 들어, 녹아웃시키는 것은 내인성 단백질을 인코딩하는 유전자에 작동 가능하게 연결된 프로모터 또는 프로모터의 일부를 결실하는 방식으로 마커 (예를 들어, 항생제 내성, 영양요구 완화 또는 형광 마커 인코딩하는 유전자)의 삽입을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제거하는 것, 예를 들어, 녹아웃시키는 것은 내인성 단백질을 인코딩하는 유전자의 카피로부터 내인성 단백질의 생산의 완전한 손실을 초래한다. 다른 실시형태에서, 제거하는 것, 예를 들어, 녹아웃시키는 것은 내인성 단백질, 예를 들어, 기능성 내인성 단백질의 보다 낮은 수준의 생산을 초래한다. 다른 실시형태에서, 제거하는 것, 예를 들어, 녹아웃시키는 것은 절단된, 덜-기능성, 비-기능성, 잘못 접혀진 및/또는 분해-경향 중 하나 이상인 내인성 단백질의 변이체의 생산을 초래한다.
내인성 단백질을 인코딩하는 유전자 또는 상기 유전자에 작동 가능하게 연결된 조절 요소의 카피를 제거하는 것, 예를 들어, 녹아웃시키는 것은 당업계에 공지된 임의의 유전자 편집 시스템에 의해 달성될 수 있다. 예시적인 유전자 편집 시스템은 클러스터된 조절 간격 짧은 회문구조 반복 (CRISPR) 시스템, 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 및 전사 활성화제-유사 이펙터-기반 뉴클레아제 (TALEN)를 포함한다. ZFN, TALEN 및 CRISPR-기반 방법은, 예를 들어, Guan 등, Application of CRISPR-Cas system in gene therapy: Pre-clinical progress in animal model. DNA Repair 2016 July 30 [Epub ahead of print]; Zheng 등, Precise gene deletion and replacement using the CRISPR/Cas9 system in human cells. BioTechniques, Vol. 57, No. 3, September 2014, pp. 115-124에 기술되어 있다. 당업자는 세포, 예를 들어, 생산 세포에서 게놈을 편집 (예를 들어, 유전자를 녹아웃시키는 것)하기 위한 이들 및 다른 옵션을 인식할 것이다.
일부 실시형태에서, 내인성 단백질을 인코딩하는 유전자 또는 상기 유전자에 작동 가능하게 연결된 조절 요소의 카피를 제거하는 것, 예를 들어, 녹아웃시키는 것은 내인성 단백질 인코딩 유전자 또는 상기 내인성 단백질을 인코딩하는 유전자에 작동 가능하게 결합된 조절 핵산 서열, 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서에 특이적인, RNA (예를 들어, gRNA, sgRNA, 및/또는 tracrRNA)와 조합하여, CRISPR-Cas9 분자, 예를 들어, Cas9 분자를 사용하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포, 예를 들어, 생산 세포에서 내인성 단백질의 수준을 감소시키는 것은 세포에서 녹다운과 같이, 내인성 단백질을 인코딩하는 mRNA 전사의 수준을 감소시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 녹다운과 같이, 내인성 단백질을 인코딩하는 mRNA 전사의 수준을 감소시키는 것은 예를 들어, 내인성 단백질 또는 이에 작동 가능하게 연결된 조절 핵산 서열, 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서를 인코딩하는 핵산, 예를 들어, mRNA에 결합할 수 있는 siRNA를 사용하는 것을 포함한다. 당업자는 siRNA를 설계하고 세포에 전달하기 위한 도구 및 기술을 알고 있을 것이다. 이러한 도구 및/또는 기술은 Dharmacon Horizon siDesign 도구, InvivoGen siRNA Wizard, GenScript siRNA 작제물(Construct) 서비스, IDT Custom Dicer-Substrate siRNA, Sigma-Aldrich siRNA 디자인 서비스 또는 www.rnaiweb.com/RNAi/siRNA_Design/에 의해 교시된 것들을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시형태에서, 녹다운과 같이, 내인성 단백질을 인코딩하는 mRNA 전사의 수준을 감소시키는 것은 세포에서 내인성 단백질을 인코딩하는 mRNA 전사의 수준에서 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100%의 감소를 초래한다.
생성물
세포, 예를 들어, 생산 세포에서 내인성 단백질의 수준을 감소시킴에 의해 생성물을 높은 수율로 생산하고/하거나 생성물 품질을 개선 (예를 들어, 생산된 생성물, 예를 들어, 재조합 폴리펩타이드의 수준을 증가)하기 위한 방법, 세포 또는 세포주 및 조성물이 본 명세서에서 제공된다. 본 명세서에 기재된 생성물은 폴리펩타이드, 예를 들어, 재조합 단백질, 다량체 단백질 또는 복합체; 지질-캡슐화 입자, 예를 들어, 바이러스-유사 입자, 소포 또는 엑소좀; 또는 기타 분자를 포함한다. 실시형태에서, 생성물은 폴리펩타이드, 예를 들어, 재조합 폴리펩타이드이다. 실시형태에서, 생성물은 엑소좀이다. 예를 들어, 재조합 폴리펩타이드는 차세대 생물학적 제제, 예를 들어, 이중특이적 항체 분자, 융합 단백질 또는 글리코실화 단백질과 같은, 단백질 또는 복합체 및/또는 비-천연 구조를 갖는 단백질을 발현하기 어려운 것일 수 있다.
실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법 또는 조성물에 의해 생성된 세포 또는 세포주는 의학적 병태, 장애 또는 질환의 치료에 유용한 생성물, 예를 들어, 재조합 폴리펩타이드를 생산한다. 의학적 병태, 장애 또는 질환의 예는 대사 질환 또는 장애 (예를 들어, 대사 효소 결핍), 내분비 장애 (예를 들어, 호르몬 결핍), 지혈 조절 장애, 혈전증, 조혈 장애, 폐 장애, 위장-장 장애, 자가면역 질환, 면역-조절 장애 (예를 들어, 면역 결핍), 불임, 이식, 암 및 전염성 질환을 포함하나 이에 제한되지는 않다.
실시형태에서, 생성물은 외인성 단백질, 예를 들어, 세포에 의해 천연적으로 발현되지 않는 단백질이다. 일 실시형태에서, 단백질은 한 종에서 유래한 반면 세포는 다른 종에서 유래한다. 다른 실시형태에서, 단백질은 비-천연 발생 단백질이다.
다른 실시형태에서, 생성물은 세포에 의해 내인성으로 발현되는 단백질이다. 일 실시형태에서, 생성물은 내인성 또는 천연 수준에서 세포에 의해 내인성으로 발현되는 단백질이다. 본 명세서에 기재된 본 방법 및 조성물은 내인성 생성물, 예를 들어, 세포에 의해 천연적으로 생성되는 천연 발생 생성물의 생산 및 품질을 증가시키기 위해 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 생성물, 예를 들어, 단백질을 인코딩하는 외인성 핵산이 세포에 도입되고 세포에 의해 발현된다. 또 다른 실시형태에서, 세포에 의해 내인성으로 발현되는 생성물의 발현을 증가시키는 외인성 핵산이 세포 내로 도입된다. 예를 들어, 외인성 핵산은 세포의 내인성 생성물의 발현을 제어하는 프로모터를 활성화하는 서열을 포함한다.
재조합 생성물은, 예를 들어, 약물 스크리닝에 유용한 치료 생성물 또는 진단 생성물일 수 있다. 치료 또는 진단 생성물은 항체 분자, 예를 들어, 항체 또는 항체 단편, 융합 단백질, 호르몬, 사이토카인, 성장 인자, 효소, 당단백질, 지단백질, 리포터 단백질, 치료적 펩타이드, 또는 이들 중 임의의 것의 구조적 및/또는 기능적 단편 또는 하이브리드를 포함하나 이에 제한되지는 않다. 다른 실시형태에서, 치료 또는 진단 생성물은 합성 폴리펩타이드이며, 예를 들어, 전체 폴리펩타이드 또는 그의 일부는 임의의 천연 발생 폴리펩타이드, 예를 들어, 상기 기재된 천연 발생 폴리펩타이드로부터 유래되지 않거나 여기에 임의의 서열 또는 구조적 유사성을 갖는다.
일 실시형태에서, 재조합 생성물은 항체 분자이다. 일 실시형태에서, 재조합 생성물은 치료적 항체 분자이다. 또 다른 실시형태에서, 재조합 생성물은 진단적 항체 분자, 예를 들어, 영상화 기술 또는 진단 시험에 유용한 모노클로날 항체이다.
본 명세서에 사용된 항체 분자는 항원과 특이적으로 결합하는 면역 글로불린 분자로부터 유래된 단백질 또는 폴리펩타이드 서열이다. 일 실시형태에서, 항체 분자는 전장 항체 또는 항체 단편이다. 항체 및 다중 포맷 단백질은 폴리클로날 또는 모노클로날, 다중 또는 단일 사슬 또는 온전한 면역 글로불린일 수 있고, 천연 공급원 또는 재조합 공급원에서 유래할 수 있다. 항체는 면역 글로불린 분자의 사량체일 수 있다. 실시형태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 항체는 인간 또는 인간화 항체일 수 있다. 일 실시형태에서, 항체는 IgA, IgG, IgD 또는 IgE 항체이다. 일 실시형태에서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체이다.
"항체 단편"은 온전한 항체 또는 이의 재조합 변이체의 적어도 일부분을 지칭하고, 항원 결합 도메인, 예를 들어, 온전한 항체의 항원 결정 가변 영역을 지칭하며, 이는 항원과 같은 표적에 대한 항체 단편의 인식 및 특이적 결합을 부여하기에 충분하다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, scFv 항체 단편, 선형 항체, 단일 도메인 항체 예컨대 sdAb (VL 또는 VH 중 어느 하나), 낙타류 VHH 도메인, 및 힌지 영역에서 디설파이드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편, 및 항체의 분리된 CDR 또는 다른 에피토프 결합 단편을 포함하는 이가 단편과 같은 항체 단편으로부터 형성된 다중-특이적 항체를 포함하지만 이에 제한되지는 않다. 항원 결합 단편은 또한 단일 도메인 항체, 맥시바디, 미니바디, 나노바디, 인트라바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR 및 비스-scFv 안으로 혼입될 수 있다 (예를 들어, Hollinger 및 Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005 참고). 항원 결합 단편은 또한 피브로넥틴 유형 III (Fn3)과 같은 폴리펩타이드를 기반으로 하는 스캐폴드 안으로 이식될 수 있다 (피브로넥틴 폴리펩타이드 미니바디를 기술하는, 미국 특허 번호: 6,703,199 참고).
실시형태에서, 폴리펩타이드는, 예를 들어, BOTOX, 미요블록 (Myobloc), 뉴로블록 (Neurobloc), 디스포트 (Dysport) (또는 보툴리눔 신경독의 다른 혈청형), 알글루코시다제 알파, 답토마이신, YH-16, 융모성선자극호르몬 알파, 필그라스팀, 시트로렐릭스, 인터류킨-2, 알데스류킨, 테셀렐린, 데닐류킨 디프티톡스, 인터페론 알파-n3 (주사), 인터페론 알파-nl, DL-8234, 인터페론, 선토리 (Suntory) (감마-1a), 인터페론 감마, 티모신 알파 1, 타소너민, DigiFab, ViperaTAb, EchiTAb, CroFab, 네시리타이드, 아바타셉트, 알레파셉트, 레비프, 엡토테르미날파, 테리파라타이드, 칼시토닌, 에타너셉트, 헤모글로빈 글루타머 250 (소), 드로트레코긴 알파, 콜라게나아제, 카페리티드, 재조합 인간 표피 성장 인자, DWP401, 다베포에틴 알파, 에포에틴 오메가, 에포에틴 베타, 에포에틴 알파, 데시루딘, 레피루딘, 비발리루딘, 노나코그 알파, 모노닌 (Mononine), 엡타코그 알파 (활성화됨), 재조합 인자 VIII + VWF, 리콤비네이트 (Recombinate), 재조합 인자 VIII, 인자 VIII (재조합), 알픈메이트 (Alphnmate), 옥토코그 알파, 인자 VIII, 팔리퍼민, 인디키나아제, 테넥테플라제, 알테플라제, 파미테플라제, 레테플라제, 네이트플라제, 몬테플라제, 폴리트로핀 알파, rFSH, hpFSH, 미카펑긴, 페그필그라스팀, 레노그라스팀, 나르토그라스팀, 세스모렐린, 글루카곤, 엑제나타이드, 프람린티드, 이니글루세라제, 갈설파제, 류코트로핀, 몰그라모스티른, 트립토렐린 아세테이트, 히스트렐린 (Hydron), 데스로렐린, 히스트렐린, 나파렐린, 류프롤리드 (ATRIGEL), 류프롤리드 (DUROS), 고세렐린, 유트로핀, 소마트로핀, 메카세르민, 에늘파비르타이드, Org-33408, 인슐린 글라진, 인슐린 글루리신, 인슐린 (흡입), 인슐린 리스프로, 인슐린 디터니르, 인슐린 (RapidMist), 메카세르민 린파베이트, 아나킨라, 셀몰류킨, 99 mTc-아프시타이드, 미엘로피즈, 베타세론, 글라티라머 아세테이트, 게폰 (Gepon), 사르그라모스팀, 오프렐벡킨, 인간 백혈구 유래 알파 인터페론, 빌리브 (Bilive), 인슐린 (재조합), 재조합 인간 인슐린, 인슐린 아스파트, 메카세닌, 로페론-A, 인터페론-알파 2, 알파페론, 인터페론 알파콘 -1, 인터페론 알파, 아보넥스의 재조합 인간 황체 형성 호르몬, 도르나아제 알파, 트라페르민, 지코노타이드, 탈티렐린, 디보말파, 아토시반, 베카플러민, 엡티피바타이드, 제마이라, CTC-111, 산백-B, 옥트레오타이드, 란레오타이드, 안세스티른, 아갈시다아제 베타, 아갈시다아제 알파, 라로니다제, 프레자타이드 쿠퍼 아세테이트, 라스부리카제, 라니비주맙, 악팀뮨, PEG-인트론, 트리코민, 재조합 인간 부갑상선 호르몬 (PTH) 1-84, 에포에틴 델타, 트랜스제닉 안티트롬빈 III, 그랜디트로핀, 비트라제, 재조합 인슐린, 인터페론-알파, GEM-21S, 바프레오타이드, 이두르설파제, 옴나파트릴라트, 재조합 혈청 알부민, 세르톨리주맙 페골, 글루카피다제, 인간 재조합 C1 에스테라제 억제제, 라노테프라제, 재조합 인간 성장 호르몬, 엔푸비르타이드, VGV-1, 인터페론 (알파), 루시낙탄트, 아비프타딜, 이카디반트, 에칼란타이드, 오미가난, 오우로그랩, 펙시가난아세테이트, ADI-PEG-20, LDI-200, 데가렐릭스, 신트레델린베수도톡스, Favld, MDX-1379, ISAtx-247, 리라글루타이드, 테리파라타이드, 티파코긴, AA4500, T4N5 리포솜 로션, 카투막소맙, DWP413, ART-123, 크리살린, 데스모테플라제, 아메디플라제, 코리폴리트로핀알파, TH-9507, 테두글루타이드, 디아미드, DWP-412, 성장 호르몬, 재조합 G-CSF, 인슐린, 인슐린 (Technosphere), 인슐린 (AERx), RGN-303, DiaPep277, 인터페론 베타, 인터페론 알파-n3, 벨라타셉트, 경피 인슐린 패치, AMG-531, MBP-8298, 제레셉트, 오페바칸, AIDSVAX, GV-1001, 림포스캔 (LymphoScan), 란피르나제, 리폭시산, 루수펄타이드, MP52, 시펄류셀-T, CTP-37, 인세기아, 비테스펜, 인간 트롬빈, 트롬빈, TransMID, 알피베프라제, 퓨리카제, 터리프레신, EUR-1008M, 재조합 FGF-I, BDM-E, 토기갭타이드, ETC-216, P-113, MBI-594AN, 듀라마이신, SCV-07, OPI-45, 엔도스타틴, 안지오스타틴, ABT-510, 보우만 버크 억제제, XMP-629, 99 mTc-Hynic-안넥신 V, 카할랄리드 F, CTCE-9908, 테베렐릭스, 오자렐릭스, 로니뎁신, BAY-504798, 인터류킨4, PRX-321, 펩스칸, 이옥타데킨, 르락토페린 (rhlactoferrin), TRU-015, IL-21, ATN-161, 실렌지타이드, 알부페론, 비파식스, IRX-2, 오메가 인터페론, PCK-3145, CAP-232, 파시레오타이드, huN901-DMI, SB-249553, Oncovax-CL, OncoVax-P, BLP-25, CerVax-16, MART-1, gp100, 티로시나아제, 네미피타이드, rAAT, CGRP, 페그수너셉트, 티모신베타4, 플리티뎁신, GTP-200, 라모플라닌, GRASPA, OBI-1, AC-100, 살몬 칼시토닌 (엘리겐), 이그재모렐린, 카프로모렐린, 카르데바, 벨라페르민, 131I-TM-601, KK-220, T-10, 우라리타이드, 데펠레스탯트, 헤마타이드, 크리살린, rNAPc2, 재조합 인자 V111 (PEG화 리포솜), bFGF, PEG화 재조합 스타필로키나제 변이체, V-10153, SonoLysis 프롤리제, NeuroVax, CZEN-002, rGLP-1, BIM-51077, LY-548806, 엑제나타이드 (제어 방출, Medisorb), AVE-0010, GA-GCB, 아보렐린, ACM-9604, 리낙로티드 이아세테이트, CETi-1, 헤모스판, VAL, 속효성 인슐린 (주사 가능, Viadel), 인슐린 (엘리겐), 재조합 메티오닐 인간 렙틴, 피트라킨라, 멀티킨, RG-1068, MM-093, NBI-6024, AT-001, PI-0824, Org-39141, Cpn10, 탈락토페린, rEV-131, rEV-131, 재조합 인간 인슐린, RPI-78M, 오르렐벡킨, CYT-99007 CTLA4-Ig, DTY-001, 발라테그라스트, 인터페론 알파-n3, IRX-3, RDP-58, 타우페론, 담즙 염 자극 리파제, 메리스파제, 알라린 포스파타제, EP-2104R, 멜라노탄-II, 브레멜라노타이드, ATL-104, 재조합 인간 마이크로플라스민, AX-200, SEMAX, ACV-1, Xen-2174, CJC-1008, 디노르핀 A, SI-6603, LAB GHRH, AER-002, BGC-728, ALTU-135, 재조합 뉴라미다제, Vacc-5q, Vacc-4x, Tat Toxoid, YSPSL, CHS-13340, PTH(1-34) (Novasome), Ostabolin-C, PTH 유사체, MBRI-93.02, MTB72F, MVA-Ag85A, FARA04, BA-210, 재조합 플라크 FIV, AG-702, OxSODrol, rBetV1, Der-p1/Der-p2/Der-p7, PR1 펩타이드 항원, 돌연변이 ras 백신, HPV-16 E7 리포펩타이드 백신, 라비린틴, WT1-펩타이드, IDD-5, CDX-110, 펜트리스, 노렐린, CytoFab, P-9808, VT-111, 이크로캅타이드,, 텔버민,, 루핀트리비르, 레티큘로제, rGRF, HA, 알파-갈락도시다제 A, ACE-011, ALTU-140, CGX-1160, 안지오텐신, D-4F, ETC-642, APP-018, rhMBL, SCV-07, DRF-7295, ABT-828, ErbB2-특이적 면역독소, DT3SSIL-3, TST-10088, PRO-1762, 콤보톡스, 콜레시스토키닌-B/가스트린-수용체 결합 펩타이드, 111In-hEGF, AE-37, 트란스니주맙-DM1, 길항제 G, IL-12, PM-02734, IMP-321, rhIGF-BP3, BLX-883, CUV-1647, L-19 기반 ra, Re-188-P-2045, AMG-386, DC/1540/KLH, VX-001, AVE-9633, AC-9301, NY-ESO-1 (펩타이드), NA17.A2 펩타이드, CBP-501, 재조합 인간 락토페린, FX-06, AP-214, WAP-8294A, ACP-HIP, SUN-11031, 펩타이드 YY [3-36], FGLL, 아타시셉트, BR3-Fc, BN-003, BA-058, 인간 부갑상선 호르몬 1-34, F-18-CCR1, AT-1100, JPD-003, PTH(7-34) (Novasome), 듀라마이신, CAB-2, CTCE-0214, GlycoPEG화 에리스로포이에틴, EPO-Fc, CNTO-528, AMG-114, JR-013, 인자 XIII, 아미노칸딘, PN-951, 716155, SUN-E7001, TH-0318, BAY-73-7977, 테베렐릭스, EP-51216, hGH, OGP-I, 시푸비르타이드, TV4710, ALG-889, Org-41259, rhCC10, F-991, 티모펜틴, r(m)CRP, 간선택성 인슐린, 서브알린, L19-IL-2 융합 단백질, 엘라핀, NMK-150, ALTU-139, EN-122004, rhTPO, 트롬보포이에틴 수용체 작용제, AL-108, AL-208, 신경 성장 인자 길항제, SLV-317, CGX-1007, INNO-105, 테리파라타이드 (엘리겐), GEM-OS1, AC-162352, PRX-302, LFn-p24 융합, EP-1043, gpE1, gpE2, MF-59, hPTH(1-34), 768974, SYN-101, PGN-0052, 아비스큠나인, BIM-23190, 다중-에피토프 티로시나제 펩타이드, 엔카스팀, APC-8024, GI-5005, ACC-001, TTS-CD3, 혈관-표적화 TNF, 데스모프레신, 오너셉트, 및 TP-9201이다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 아달리무맙 (HUMIRA), 인플릭시맙 (REMICADE™), 리툭시맙 (RITUXAN™/MAB THERA™) 에타너셉트 (ENBREL™), 베바시주맙 (AVASTIN™), 트라스투주맙 (HERCEPTIN™), 페그릴그라스팀 (NEULASTA™), 또는 바이오시밀러 및 바이오베터를 포함하는 임의의 다른 적합한 폴리펩타이드이다.
다른 적합한 폴리펩타이드는 아래 및 US2016/0097074의 표 1에 열거된 것들이다:
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
실시형태에서, 폴리펩타이드는 표 2에 나타낸 바와 같은 호르몬, 혈액 응고/응집 인자, 사이토카인/성장 인자, 항체 분자, 융합 단백질, 단백질 백신 또는 펩타이드이다.
본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 생산될 수 있는 예시적인 재조합 생성물은 하기 표에 제공된 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
표 2. 예시적인 생성물
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
실시형태에서, 단백질은 다중특이적 단백질, 예를 들어, 표 3에 나타낸 바와 같은 이중특이적 항체이다.
표 3: 이중특이적 포맷
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
실시형태에서, 생성물은 표 4에 열거된 폴리펩타이드이다.
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 암 세포에 의해 발현되는 항원이다. 일부 실시형태에서 재조합 또는 치료적 폴리펩타이드는 종양-관련 항원 또는 종양-특이적 항원이다. 일부 실시형태에서, 재조합 또는 치료적 폴리펩타이드는 HER2, CD20, 9-O-아세틸-GD3, βhCG, A33 항원, CA19-9 마커, CA-125 마커, 칼레티쿨린, 탄산 탈수효소 IX (MN/CA IX), CCR5, CCR8, CD19, CD22, CD25, CD27, CD30, CD33, CD38, CD44v6, CD63, CD70, CC123, CD138, 암종 배아 항원 (CEA; CD66e), 데스모글레인 4, E-카드헤린 네오에피토프, 엔도시알린, 에프린 A2 (EphA2), 표피 성장 인자 수용체 (EGFR), 상피 세포 부착 분자 (EpCAM), ErbB2, 태아 아세틸콜린 수용체, 섬유아세포 활성화 항원 (FAP), 푸코실 GM1, GD2, GD3, GM2, 강글리오사이드 GD3, Globo H, 당단백질 100, HER2/neu, HER3, HER4, 인슐린-유사 성장 인자 수용체 1, Lewis-Y, LG, Ly-6, 흑색종-특이적 콘드로이틴-설페이트 프로테오글리칸 (MCSCP), 메조텔린, MUCl, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC7, MUC16, 뮬러리안 억제 물질 (MIS) 수용체 유형 II, 형질 세포 항원, 폴리 SA, PSCA, PSMA, 소닉 헤지혹 (SHH), SAS, STEAP, sTn 항원, TNF-알파 전구체 및 이의 조합으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 활성화 수용체이고 2B4 (CD244), α4β1 인테그린, β2 인테그린, CD2, CD16, CD27, CD38, CD96, CD100, CD160, CD137, CEACAM1 (CD66), CRTAM, CSl (CD319), DNAM-1 (CD226), GITR (TNFRSF18), KIR의 활성화 형태, NKG2C, NKG2D, NKG2E, 하나 이상의 천연 세포독성 수용체, NTB-A, PEN-5 및 이의 조합으로부터 선택되고, 선택적으로 β2 인테그린은 CD11a-CD 18, CD11 b-CD 18 또는 CD11c-CD 18을 포함하고, 선택적으로 KIR의 활성화 형태는 K1R2DS1, KIR2DS4 또는 KIR-S를 포함하고, 선택적으로 천연 세포독성 수용체는 NKp30, NKp44, NKp46 또는 NKp80을 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 억제 수용체이고 KIR, ILT2/LIR-1/CD85j, KIR의 억제 형태, KLRG1, LAIR-1, NKG2A, NKR-P1A, Siglec-3, Siglec-7, Siglec-9, 및 이의 조합에서 선택되며, 선택적으로 KIR의 억제 형태는 KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR3DL1, KIR3DL2, 또는 KIR-L을 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 활성화 수용체이고 CD3, CD2 (LFA2, OX34), CD5, CD27 (TNFRSF7), CD28, CD30 (TNFRSF8), CD40L, CD84 (SLAMF5), CD137 (4-1BB), CD226, CD229 (Ly9, SLAMF3), CD244 (2B4, SLAMF4), CD319 (CRACC, BLAME), CD352 (Lyl08, NTBA, SLAMF6), CRTAM (CD355), DR3 (TNFRSF25), GITR (CD357), HVEM (CD270), ICOS, LIGHT, LTβR (TNFRSF3), OX40 (CD134), NKG2D, SLAM (CD150, SLAMF1), TCRα, TCRβ, TCRδγ, TIM1 (HAVCR, KIM1), 및 이의 조합으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 억제 수용체이고 PD-1 (CD279), 2B4 (CD244, SLAMF4), B71 (CD80), B7Hl (CD274, PD-L1), BTLA (CD272), CD160 (BY55, NK28), CD352 (Ly108, NTBA, SLAMF6), CD358 (DR6), CTLA-4 (CD152), LAG3, LAIR1, PD-1H (VISTA), TIGIT (VSIG9, VSTM3), TIM2 (TIMD2), TIM3 (HAVCR2, KIM3), 및 이의 조합으로부터 선택된다.
다른 예시적인 단백질은 Leader 등, "Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification", Nature Reviews Drug Discovery, 2008, 7:21-39 (본 명세서에 포함됨)의 표 1-10에 기술된 임의의 단백질; 또는 본 명세서에 기재된 재조합 폴리펩타이드의 임의의 접합체, 변이체, 유사체 또는 기능적 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
다른 재조합 단백질 생성물은 비-항체 스캐폴드 또는 대체 단백질 스캐폴드, 예컨대, 비제한적으로: DARPin, 아피바디 및 애드넥틴을 포함한다. 이러한 비-항체 스캐폴드 또는 대체 단백질 스캐폴드는 하나 또는 둘 이상, 예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5 또는 그 초과의 상이한 표적 또는 항원을 인식하거나 결합하도록 조작될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 생성물, 예를 들어, 폴리펩타이드, 예를 들어, 재조합 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터는 선택 마커를 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 선택 가능한 마커는 글루타민 합성효소 (GS); 디하이드로폴레이트 환원효소 (DHFR), 예를 들어, 메토트렉세이트 (MTX)에 대한 내성을 부여하는 효소; 프롤린, 또는 항생제 마커, 예를 들어, 하이그로마이신, 네오마이신 (G418), 제오신, 퓨로마이신 또는 블라스티시딘과 같은 항생제에 대한 내성을 부여하는 효소를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 선택 마커는 Selexis 선택 시스템 (예를 들어, Selexis SA로부터 상업적으로 이용가능한, SUREtechnology Platform™ 및 Selexis Genetic Elements™) 또는 Catalant Biologics GPEx® 세포주 개발 기술을 포함하거나 이와 호환된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 재조합 생성물을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터는 본 명세서에 기재된 재조합 생성물을 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포 또는 세포를 식별하는데 유용한 선택 마커를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 선택 마커는 본 명세서에 기재된 바와 같이, 재조합 생성물을 인코딩하는 핵산 서열의 게놈 안으로의 합체를 포함하는 세포 또는 세포들을 확인하는데 유용하다. 재조합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 합체한 세포 또는 세포들의 확인은 생성물을 안정적으로 발현하는 세포 또는 세포주의 선택 및 조작에 유용할 수 있다.
일 실시형태에서, 생성물은 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개 이하의 아미노산 잔기에서 표 1-4로부터의 폴리펩타이드와 상이하다. 다른 실시형태에서, 생성물은 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 또는 15% 이하의 아미노산 잔기에서 표 2 또는 3으로부터의 폴리펩타이드와 상이하다. 동일성 퍼센트를 결정하는 방법은 위에서 논의되었다.
다른 재조합 생성물은 비-항체 스캐폴드 또는 대체 단백질 스캐폴드, 예컨대, 비제한적으로: DARPin, 아피바디 및 애드넥틴을 포함한다.
다른 예시적인 치료 또는 진단 단백질은 Leader 등, "Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification", Nature Reviews Drug Discovery, 2008, 7:21-39의 표 1-10에 기술되고, Walsh, "Biopharmaceutical benchmarks 2014", Nature Biotechnology, 2014, 32:992-1000 (각각 본 명세서에 참조로 포함됨)에 기술된 바와 같은 임의의 단백질; 또는 본 명세서에 기재된 재조합 폴리펩타이드의 임의의 접합체, 변이체, 유사체 또는 기능적 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
생산 적용
본 명세서에 개시된 방법 및 세포 또는 세포주는 다양한 생성물을 생산하고, 다양한 세포주를 평가하거나, 생물 반응기 또는 처리 용기 또는 탱크에서, 보다 일반적으로 공급원과 함께 사용하기 위한 다양한 세포주의 생산을 평가하는 데 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 장치, 설비 및 방법은 원핵 및/또는 진핵 세포주를 포함하는 임의의 원하는 세포주를 배양하는 데 적합하다. 더욱이, 실시형태에서, 장치, 설비 및 방법은 현탁 세포 또는 고정-의존성 (부착) 세포를 배양하는 데 적합하고 약학적 및 생물약학적 생성물-예컨대 폴리펩타이드 생성물 또는 세포 및/또는 바이러스 예컨대 세포 및/또는 바이러스 치료에 사용되는 것의 생산을 위해 구성된 생산 작업에 적합하다.
언급된 바와 같이, 실시형태에서, 장치, 설비 및 방법은 진핵 세포, 예를 들어, 포유동물 세포 또는 하부 진핵 세포 예컨대, 예를 들어, 효모 세포 또는 사상 진균 세포, 또는 원핵 세포 예컨대 그람-양성 또는 그람-음성 세포 및/또는 진핵 또는 원핵 세포의 생성물, 예를 들어, 진핵 세포에 의해 합성된 단백질, 펩타이드, 항생제, 아미노산의 생산을 대규모 방식으로 허용한다. 본원에서 달리 언급되지 않는 한, 장치, 설비 및 방법은 벤치-규모, 파일럿-규모 및 전체 생산 규모 용량을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 원하는 부피 또는 생산 용량을 포함할 수 있다.
더욱이 본 명세서에서 달리 언급되지 않는 한, 장치, 설비 및 방법은 교반 탱크, 공수, 섬유, 마이크로섬유, 중공 섬유, 세라믹 매트릭스, 유동층, 고정층 및/또는 또는 스파우트 베드 생물 반응기를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 적합한 반응기(들)를 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 "반응기" 또는 "생물 반응기"는 발효조 또는 발효 단위, 또는 임의의 다른 반응 용기를 포함할 수 있고, 용어 "반응기" 및 "생물 반응기"는 "발효조"와 상호 교환적으로 사용된다. 예를 들어, 일부 양태에서, 생물 반응기 단위는 다음 중 하나 이상 또는 모두를 수행할 수 있다: 영양분 및/또는 탄소 공급원의 공급, 적합한 가스 (예를 들어, 산소)의 주입, 발효 또는 세포 배양 배지의 유입 및 유출 흐름, 기체 및 액체 상의 분리, 온도의 유지, 산소 및 CO2 수준의 유지, pH 수준의 유지, 교반 (예를 들어, 진탕) 및/또는 세정/살균. 발효 단위와 같은 예시적인 반응기 단위는 단위 내에 다수의 반응기를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단위는 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개 이상의 생물 반응기를 각 단위에 가질 수 있고/있거나 설비는 설비 내에 단일 또는 다수의 반응기를 갖는 다수의 단위를 포함할 수 있다. 다양한 실시형태에서, 생물 반응기는 배치, 반 공급-배치, 공급-배치, 관류 및/또는 연속 발효 공정에 적합할 수 있다. 적절한 반응기 직경을 사용할 수 있다. 실시형태에서, 생물 반응기는 약 100 mL 내지 약 50,000 L의 부피를 가질 수 있다. 비-제한적인 예는 100 mL, 250 mL, 500 mL, 750 mL, 1 리터, 2 리터, 3 리터, 4 리터, 5 리터, 6 리터, 7 리터, 8 리터, 9 리터, 10 리터, 15 리터, 20 리터, 25 리터, 30 리터, 40 리터, 50 리터, 60 리터, 70 리터, 80 리터, 90 리터, 100 리터, 150 리터, 200 리터, 250 리터, 300 리터, 350 리터, 400 리터, 450 리터, 500 리터, 550 리터, 600 리터, 650 리터, 700 리터, 750 리터, 800 리터, 850 리터, 900 리터, 950 리터, 1000 리터, 1500 리터, 2000 리터, 2500 리터, 3000 리터, 3500 리터, 4000 리터, 4500 리터, 5000 리터, 6000 리터, 7000 리터, 8000 리터, 9000 리터, 10,000 리터, 15,000 리터, 20,000 리터, 및/또는 50,000 리터의 부피를 포함한다. 또한 적합한 반응기는 다중-사용, 단일-사용, 일회용 또는 비-일회용일 수 있으며 금속 합금 예컨대 스테인리스 강 (예를 들어, 316L 또는 기타 적합한 스테인리스 강) 및 인코넬, 플라스틱, 및/또는 유리를 포함한 임의의 적합한 재료로 형성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 적합한 반응기는 원형, 예를 들어, 원통형일 수 있다. 일부 실시형태에서, 적합한 반응기는 정사각형, 예를 들어, 직사각형일 수 있다. 정사각형 반응기는 경우에 따라 사용 용이성 (예를 들어, 숙련된 사람에 의한 장입 및 설정), 반응기 내용물의 더 큰 혼합 및 균질성, 보다 적은 바닥 면적과 같은 원형 반응기에 비해 이점을 제공할 수 있다.
실시형태에서 그리고 본원에서 달리 언급되지 않는 한, 제제를 제조하는 방법과 함께 사용하기 위해 본 명세서에 기재된 장치, 설비 및 방법은 또한 이러한 생성물의 분리, 정제 및 단리를 위한 작업 및/또는 장비와 같이 달리 언급되지 않은 임의의 적합한 조작 작업 및/또는 장비를 포함할 수 있다. 통상의 스틱-형 설비, 모듈식, 이동식 및 임시 설비 또는 기타 적절한 건설, 설비 및/또는 레이아웃과 같은 임의의 적절한 설비 및 환경이 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 모듈식 청정실이 사용될 수 있다. 추가적으로 그리고 달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에 기재된 장치, 시스템 및 방법은 단일 위치 또는 설비에서 수용 및/또는 수행될 수 있거나 대안적으로 별도 또는 여러 위치 및/또는 설비에서 수용 및/또는 수행될 수 있다.
비-제한적인 예로서 그리고 제한없이, 그 전체 내용이 참조로 본 명세서에 포함되는, 미국 공개 번호 2013/0280797; 2012/0077429; 2011/0280797; 2009/0305626; 및 미국 특허 번호 8,298,054; 7,629,167; 및 5,656,491은 적합할 수 있는 예시적인 설비, 장비 및/또는 시스템을 기술한다.
생물 반응기 설정 및 조건
일 양태에서, 본 개시내용의 생물 반응기 또는 본 개시내용의 방법에 의해 이용되는 생물 반응기는 단일-사용 생물 반응기이다.
단일-사용 생물 반응기는 생물공정 용기, 쉘, 적어도 하나의 교반기, 적어도 하나의 스파저, 스파저(들) 및 헤드스페이스 오버레이를 위한 적어도 하나의 가스 필터 입구 포트, 적어도 하나의 충전 포트, 적어도 하나의 수확 포트, 적어도 하나의 샘플 포트 및 적어도 하나의 프로브를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 개시내용은 생물공정 용기를 포함하는 생물 반응기에 대한 것이다. 생물공정 용기는 액체 불투과성 및 유연한 형상-적합 재료로 만들어진다. 예를 들어, 생물공정 용기는 다층 필름과 같은 유연성 필름으로 제작될 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 필름은 친수성 표면을 형성하도록 변형된 저밀도 폴리에틸렌과 같은 폴리에틸렌 폴리머로 구성된다. 친수성 표면은 생물 반응기 내의 세포 배양물과 접촉하기 위한 것이며 젖음성을 향상시킨다. 일 실시형태에서, 폴리에틸렌 폴리머는 조사, 광 또는 플라즈마 유도, 또는 산화에 적용됨에 의해 개질된다.
생물공정 용기는 상부, 하부 및 그 사이에 적어도 하나의 측벽을 가질 수 있다. 생물공정 챔버는 배양 배지를 수용하기 위한 중공의 인클로저를 한정할 수 있다. 중공의 인클로저는 100 mL, 250 mL, 500 mL, 750 mL, 1 리터, 2 리터, 3 리터, 4 리터, 5 리터, 6 리터, 7 리터, 8 리터, 9 리터, 10 리터, 15 리터, 20 리터, 25 리터, 30 리터, 40 리터, 50 리터, 60 리터, 70 리터, 80 리터, 90 리터, 100 리터, 150 리터, 200 리터, 250 리터, 300 리터, 350 리터, 400 리터, 450 리터, 500 리터, 550 리터, 600 리터, 650 리터, 700 리터, 750 리터, 800 리터, 850 리터, 900 리터, 950 리터, 1000 리터, 1500 리터, 2000 리터, 2500 리터, 3000 리터, 3500 리터, 4000 리터, 4500 리터, 5000 리터, 6000 리터, 7000 리터, 8000 리터, 9000 리터, 10,000 리터, 15,000 리터, 20,000 리터 및/또는 50,000 리터와 같은 임의의 적절한 부피를 가질 수 있다.
생물 반응기는 생물공정 용기의 중공의 인클로저(enclosure)에 물질을 공급하기 위한 적어도 하나의 입구 포트를 포함할 수 있다. 적어도 하나의 교반기에 결합된 회전 가능한 샤프트를 포함하는 혼합 장치는 생물공정 용기의 중공의 인클로저 안으로 연장할 수 있다. 일 실시형태에서, 회전 가능한 샤프트는 접힐 수 있다. 예를 들어, 회전 가능한 샤프트는 회전 가능한 샤프트를 향해 접을 수 있거나 접혀질 수 있는 친수성 폴리머 재료로 만들어진 적어도 하나의 임펠러를 포함할 수 있다.
생물 반응기는 또한 생물공정 용기의 측벽에 인접하여 종 방향으로 연장하도록 구성된 적어도 하나의 배플(baffle)을 포함할 수 있다. 배플은 혼합 장치에 의해 배양 배지를 혼합하는 동안 중공의 인클로저에서 유체 흐름에 영향을 주기에 충분한 양으로 측벽으로부터 방사상 안쪽으로 연장되는 형상을 가질 수 있다. 배플은 접을 수 있고/있거나 접혀질 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 배플은 팽창 가능한 유체 블래더를 한정할 수 있어 배플이 팽창 및 수축될 수 있게 한다. 배플은 생물공정 용기와 통합될 수 있어 배플이 유연한 형상-적합 재료로 형성된다는 것을 의미한다. 대안으로, 배플은 생물공정 용기에서 분리될 수 있다. 배플은 중공의 인클로저 내부에 배치되도록 구성될 수 있거나 중공의 인클로저 외부에 배치될 수 있다. 중공의 인클로저 외부에 배치될 때 생물공정 용기의 측벽은 배플의 형상에 따른다. 예를 들어, 일 실시형태에서 배플은 외부 금속성 쉘에 제거 가능하게 부착될 수 있다. 생물공정 용기는 배플의 형상에 맞게 금속성 쉘에 배치될 수 있다. 일 실시형태에서, 생물 반응기는 생물공정 용기의 중공의 인클로저의 원주 주위에 이격된 약 2개 내지 약 6개의 배플을 포함할 수 있다.
한 실시형태에서, 생물공정 용기는 직경을 갖고 하나 이상의 배플은 생물공정 용기의 직경의 약 5% 내지 약 15%와 같이, 약 3% 내지 약 20%의 거리만큼 방사상으로 내측으로 연장한다.
생물 반응기는 적어도 하나의 스파저를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 스파저는 세로 부분 및 측면 부분을 갖는 가스 튜브를 포함하는 밸러스트 스파저를 포함할 수 있다. 세로 부분은 생물공정 용기의 중공의 인클로저 안으로 수직으로 연장할 수 있다. 한편, 측면 부분은 교반기 아래의 세로 부분의 단부에 위치할 수 있다. 측면 부분은 생물공정 용기 내에 함유된 배양 배지 안으로 가스를 방출하기 위한 복수의 구멍을 한정할 수 있다. 일 실시형태에서, 복수의 구멍이 천공된다. 측면 부분은 임의의 적절한 형상을 가질 수 있다. 일 실시형태에서, 측면 부분은 샤프트를 안정화시키기 위해 혼합 장치의 회전 가능한 샤프트와 계합하도록 구성될 수 있다. 회전 가능한 샤프트는 측면 부분을 통해 연장될 수 있거나 측면 부분에 형성된 샤프트 수용 부재 내에 수용될 수 있다.
일 실시형태에서, 생물 반응기는 제1 표면 아래 스파저(sparger) 및 제2 표면 위 스파저를 포함한다. 표면 아래 스파저에서 복수의 구멍은 표면 위 스파저 상의 복수의 구멍보다 크거나 작을 수 있다. 일 실시형태에서, 복수의 구멍이 천공된다.
일 실시형태에서, 생물 반응기는 생물공정 용기 안으로 유체를 공급하기 위해 중공의 인클로저 안으로 연장되는 적어도 하나의 공급 라인을 포함할 수 있다. 공급 라인은 교반기에 인접하게 위치된 표면 아래 유체 출구를 포함할 수 있다. 유체 출구는 단지 유체가 유체 출구에서 흘러나오도록 허용하고 반대 방향으로 유체 흐름을 방지하는 유체 제어 장치와 연관될 수 있다. 예를 들어, 유체 제어 장치는 일-방향 밸브를 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, 생물 반응기는 생물공정 용기의 상단에 위치한 공급 라인을 포함할 수 있다. 공급 라인은 생물공정 용기에 상주하는 배양 배지의 부피보다 높이 위치한 표면 위 유체 배출을 포함할 수 있다. 표면 위 유체 배출은 유체 배출을 통해 유동하는 유체가 생물공정 용기 내에 함유된 배양 배지와 직접 접촉하도록 위치될 수 있다. 일 실시형태에서, 교반기는 회전될 때 원주를 형성할 수 있고 공급 라인의 표면 위 유체 배출은 유체 배출을 통해 유동하는 유체가 원주 내에서 배양 배지와 접촉하도록 교반기의 원주 위에 위치될 수 있다.
생물 반응기는 중공의 인클로저 내에 함유된 배양 배지의 질량을 표시하기 위해 로드 셀과 작동 관련하여 배치될 수 있다. 생물공정 용기의 바닥은 배수를 용이하게 하기 위해 돔-형상을 가질 수 있다. 예를 들어, 생물공정 용기는 생물공정 용기의 바닥에 위치한 배수 라인을 포함할 수 있다. 유체 수집 장치는 생물공정 용기의 중공의 인클로저와 배수 라인 사이에 위치할 수 있다. 유체 수집 장치는 생물공정 용기로부터 배수 라인으로 유체의 와류 흐름을 유도하도록 구성된 형상을 가질 수 있다. 일 실시형태에서, 배수 라인은 중공의 인클로저의 부피에 비례하는 단면적을 갖는다. 예를 들어, 예시적인 목적을 위해, 배수 라인은 중공의 인클로저의 부피 리터당 약 0.4 ㎟ 내지 약 0.6 ㎟와 같은, 약 0.3 ㎟ 내지 약 0.7 ㎟의 단면적을 가질 수 있다.
일 실시형태에서, 생물공정 용기는 생물공정 용기에 유체를 공급하기 위한 복수의 공급 라인에 연결하기 위한 복수의 포트를 포함할 수 있다. 각 포트 및 해당 공급 라인은 사용자가 공급 라인을 각각의 포트에 연결하는 데 도움이 되는 매칭 표시기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 매칭 표시기는 각각의 포트 및 해당 공급 라인이 색상-코딩되도록 색상을 포함할 수 있다. 매칭 표시는 또한 공급 라인과 해당 포트, 및 스파저와 해당 커넥터에 적용될 수 있다.
일 실시형태에서, 생물공정 용기는 범용 커넥터를 포함하는 포트를 포함할 수 있다. 포트는 제1 단부와 제2 단부를 가질 수 있다. 제1 단부는 각각의 공급 라인에 재연결 가능한 부착부를 형성하기 위한 것일 수 있다. 각 공급 라인은 해당 포트로부터 상류에 위치한 유체 필터를 포함할 수 있다.
본 개시내용은 또한 생물 반응기 시스템에 대한 것이다. 생물 반응기 시스템은 액체 불투과성 및 유연한 형상-적합 재료로 만들어진 생물공정 용기를 포함할 수 있다. 생물공정 용기는 상부, 하부 및 그 사이에 적어도 하나의 측벽을 가질 수 있다. 생물공정 챔버는 배양 배지를 수용하기 위한 중공의 인클로저를 한정할 수 있다. 생물공정 용기는 또한 재료를 중공의 인클로저로 공급하기 위한 복수의 입구 포트를 포함할 수 있다. 유체를 배출하기 위해 생물공정 용기의 바닥에 배수 라인을 배치할 수 있다. 혼합 장치는 생물공정 용기의 중공의 인클로저 안으로 연장할 수 있고 적어도 하나의 교반기에 결합된 회전 가능한 샤프트를 포함할 수 있다.
생물 반응기 시스템은 중공의 인클로저 내의 적어도 하나의 매개변수를 모니터링하기 위해 생물공정 용기와 작동 연관으로 적어도 하나의 센서를 추가로 포함할 수 있다. 적어도 하나의 센서는 pH 센서, 용존 이산화탄소 센서, 용존 산소 센서, 산화환원 센서, 로드 셀, 온도 센서 또는 회전속도계를 포함할 수 있다. 제어기는 적어도 하나의 센서와 통신하는 위치로 될 수 있다. 제어기는 적어도 하나의 센서로부터 정보를 수신하고 정보에 기초하여, 미리 설정된 한계 내에서 중공의 인클로저 내에 함유된 배양 배지의 적어도 하나의 매개 변수를 유지하기 위해 생물공정 용기의 중공의 인클로저 안으로 유체 공급으로부터의 유체의 유속을 변화시키기 위한 유체 공급 장치를 제어하도록 구성될 수 있다.
예를 들어, 일 실시형태에서, 생물 반응기 시스템은 생물공정 용기와 유체 연통하는 이산화탄소 가스 공급 및 생물공정 용기와 또한 유체 연통하는 액체 알칼리 공급을 포함할 수 있다. 적어도 하나의 센서는 pH 센서를 포함할 수 있고 제어기는 pH를 선택적으로 낮추기 위해 이산화탄소 가스 공급으로부터 이산화탄소 가스의 양을 추가하거나 pH를 선택적으로 증가시키기 위해 액체 알칼리 공급으로부터 알칼리의 양을 추가함에 의해 미리 설정된 한계 내에서 배양 배지의 pH 수준을 조절하도록 구성될 수 있다. 일 실시형태에서, 시스템은 제어기와 통신하는 제1 pH 센서 및 제2 pH 센서 둘 모두를 포함할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 생물 반응기 시스템은 산소 가스 공급을 포함할 수 있고 적어도 하나의 센서는 용존 산소 센서를 포함할 수 있다. 제어기는 용존 산소 센서로부터 수신된 정보를 기반으로 산소 가스 공급으로부터 배양 배지로 산소 가스의 양을 주기적으로 추가함에 의해 미리 설정된 한계 내에서 배양 배지 내의 용존 산소 수준을 조절할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 생물 반응기 시스템은 이산화탄소 가스 공급을 포함할 수 있고, 여기서 적어도 하나의 센서는 용존 이산화탄소 센서를 포함한다. 제어기는 용존 이산화탄소 센서로부터 수신된 정보에 기초하여 이산화탄소 가스 공급으로부터 배양 배지로 이산화탄소 가스의 양을 주기적으로 추가함에 의해 미리 설정된 한계 내에서 배양 배지 내의 용존 이산화탄소 수준을 조절하도록 구성될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 생물 반응기 시스템은 생물공정 용기를 둘러싸는 열 재킷을 포함할 수 있다. 열 재킷은 가열된 유체 또는 냉각된 유체 중 적어도 하나와 유체 연통할 수 있다. 생물 반응기 시스템은 생물공정 용기 내에 함유된 배양 배지의 온도를 감지하기 위한 온도 센서를 더 포함할 수 있다. 온도 센서는 제어기와 통신할 수 있다. 제어기는 온도 센서로부터 정보를 수신하고, 이 정보에 기초하여 미리 설정된 온도 한계 내로 배양 배지를 유지하기 위해 생물공정 용기에 함유된 배양 배지의 온도를 높이거나 낮추기 위해 열 재킷 안으로 유체의 흐름을 제어하도록 구성될 수 있다.
다른 실시형태에서, 생물 반응기 시스템은 적어도 하나의 교반기에 결합된 회전 가능한 샤프트의 회전 속도를 모니터링하기 위한 회전속도계를 추가로 포함할 수 있다. 회전속도계는 제어기와 통신할 수 있다. 제어기는 샤프트를 회전시키는 모터와 통신할 수 있다. 제어기는 회전속도계로부터 수신된 정보에 기초하여 미리 결정된 속도로 샤프트를 회전시키는 방식으로 모터를 제어하도록 구성될 수 있다.
제어기는 하나 이상의 마이크로프로세서를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 제어기는 생물 반응기 내의 다수의 매개변수를 제어하기 위해 다수의 센서로부터 정보를 수신하도록 구성될 수 있다.
일 실시형태에서, 전술한 센서 중 하나 이상은 생물공정 용기에 통합될 수 있고 생물공정 용기와 함께 일회용일 수 있다.
본 개시내용은 또한 액체 불투과성 및 유연성 형상-적합 재료로 제조된 생물공정 용기를 포함하는 생물 반응기에 대한 것이다. 생물공정 용기는 상부, 하부 및 그 사이에 적어도 하나의 측벽을 가질 수 있다. 생물공정 챔버는 배양 배지를 수용하기 위한 중공의 인클로저를 한정할 수 있다. 생물공정 용기 안으로 유체를 공급하기 위해 적어도 하나의 공급 라인이 중공의 인클로저 안으로 연장할 수 있다.
일 실시형태에서, 공급 라인은 교반기에 인접하게 위치된 표면 아래 유체 출구를 포함한다. 유체 출구는 단지 유체가 유체 출구에서 흘러나오도록 허용하고 반대 방향으로 유체 흐름을 방지하는 유체 제어 장치와 연관될 수 있다.
대안적인 실시형태에서, 공급 라인은 생물공정 용기에 상주하는 배양 배지의 부피 위에 위치한 표면 위 유체 배출을 포함할 수 있다. 표면 위 유체 배출은 유체 배출을 통해 유동하는 유체가 측벽과 접촉하지 않고 생물공정 용기 내에 함유된 배양 배지와 직접 접촉하도록 위치할 수 있다.
한 실시형태에서, 생물 반응기는 표면 아래 유체 배출을 포함하는 제1 공급 라인 및 표면 위 유체 배출을 포함하는 제2 공급 라인을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 생물 반응기는 표면 위 유체 배출을 갖는 공급 라인을 약 1 내지 약 5개, 예컨대 약 2 내지 약 3개를 함유할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 본 개시내용은 단일 사용 생물 반응기를 생산하는 방법에 대한 것이다. 본 방법은 액체 불투과성 및 유연한 형상-적합 재료로부터 생물공정 용기를 구성하는 단계를 포함한다. 상부, 하부 및 그 사이에 적어도 하나의 측벽을 갖는 생물공정 용기. 생물공정 챔버는 배양 배지를 수용하기 위한 중공의 인클로저를 한정한다. 중공의 인클로저는 약 1-250 밀리리터, 250 밀리리터 내지 50 리터, 50 내지 800 리터 또는 800-200,000 리터의 부피를 가질 수 있다. 생물공정 용기는 생물공정 용기의 중공의 인클로저 안으로 재료를 공급하기 위한 복수의 입구 포트를 포함한다. 각각의 입구 포트는 직경을 갖는다.
혼합 장치는 중공의 인클로저 안으로 삽입된다. 혼합 장치는 적어도 하나의 교반기에 결합된 회전 가능한 샤프트를 포함한다. 적어도 하나의 스파저는 또한 생물공정 용기의 중공의 인클로저 안으로 삽입된다. 스파저는 세로 부분과 측면 부분을 갖는 가스 튜브를 포함한다. 세로 부분은 중공 인클로저 안으로 수직으로 연장한다. 측면 부분은 교반기 아래의 세로 방향 부분의 말단에 위치된다. 측면 부분은 생물공정 용기 내에 함유된 배양 배지 안으로 가스를 방출하기 위한 복수의 구멍을 한정한다. 복수의 구멍은 직경을 갖는다.
배수 라인은 생물공정 용기의 바닥에 연결된다. 배수 라인은 단면적을 갖는다.
본 개시내용에 따르면, 입구 포트의 직경, 스파저 상의 복수의 구멍의 직경, 및 배수 라인의 단면적은 중공의 인클로저의 부피에 비례한다. 예를 들어, 배수 라인은 중공의 인클로저의 부피의 리터당 약 0.3 ㎟ 내지 약 0.7 ㎟의 단면적을 가질 수 있다.
본 개시내용은 또한 액체 불투과성 및 유연성 형상-적합 재료로 제조된 생물공정 용기를 포함하는 생물 반응기에 대한 것이다. 생물공정 챔버는 배양 배지를 수용하기 위한 중공의 인클로저를 한정할 수 있고 적어도 하나의 입구 포트를 포함할 수 있다. 복수의 교반기에 결합된 회전 가능한 샤프트를 포함하는 혼합 장치는 생물공정 용기의 중공의 인클로저 안으로 연장할 수 있다.
본 개시내용에 따르면, 생물 반응기는 생물공정 용기의 중공의 인클로저와 유체 연통하는 []세포 보유 챔버를 추가로 포함할 수 있다. 여액 출구는 세포 보유 챔버와 유체 연통으로 배치될 수 있다. 여액 출구는 액체에 대해서는 투과성이지만 배양 배지에 함유된 생물학적 물질에 대해서는 불투과성인 바이오필터를 포함한다. 여액 출구는 세포 보유 챔버로부터의 액체를 지속적으로 또는 주기적으로 제거하기 위한 것이다. 흐름 조절기는 관류 공정을 수행하기 위해 생물공정 용기의 중공의 인클로저와 세포 보유 챔버 사이에서 배양 배지의 흐름을 번갈아 가도록 구성된다.
예를 들어, 유량 조절기는 가압 가스 공급원 및 진공 공급원과 통신할 수 있다. 유동 조절기는 생물공정 용기의 중공의 인클로저와 세포 보유 챔버 사이에서 앞뒤로 유체를 재순환하기 위해 세포 보유 챔버에 함유된 유체에 대안적으로 진공 또는 가스 압력을 적용하도록 구성될 수 있다.
일 실시형태에서, 흐름 조절기는 세포 보유 챔버에 함유된 유체에 압력을 가하는 것과 흡입력을 가하는 것 사이를 교대로 하는 왕복운동 다이어프램을 포함할 수 있다.
본 개시내용은 또한 액체 불투과성 및 유연성 형상-적합 재료로 제조된 생물공정 용기를 포함하는 생물 반응기에 대한 것이다. 생물공정 용기는 배양 배지를 수용하기 위한 중공의 인클로저를 한정한다. 적어도 하나의 교반기에 결합된 회전 가능한 샤프트를 포함하는 혼합 장치는 생물공정 용기의 중공의 인클로저 안으로 연장할 수 있다. 본 개시내용에 따르면, 교반기는 회전 샤프트 상으로 접힐 수 있다. 예를 들어, 교반기는 적어도 하나의 블레이드 요소를 포함하는 임펠러를 포함할 수 있다. 블레이드 요소는 회전 가능한 샤프트 쪽으로 접힐 수 있다. 일 실시형태에서, 회전 가능한 샤프트는 제1 임펠러 및 제2 임펠러에 결합되고 두 임펠러는 접을 수 있는 적어도 하나의 블레이드 요소를 포함할 수 있다. 고정 링을 샤프트 상에 배치할 수 있다. 유지 링은 교반기를 혼합 동안 직립 위치 또는 눕힌 위치 및 접힌 위치에 각각 유지하기 위한 교반기 결합 위치 및 교반기 결합해제 위치를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 회전 가능한 샤프트는 샤프트 슬리브에 의해 둘러싸인 금속성 보강 로드를 포함한다. 스테인리스 스틸로 제조될 수 있는 금속성 보강 로드는 함께 부착된 다수의 조각으로 만들어 질 수 있다. 보강 로드의 상단은 모터와 자기적으로 계합하기 위한 자기 부재를 포함할 수 있다. 샤프트 슬리브는 폴리머 재료로 구성될 수 있다. 샤프트 상의 교반기는 친수성 폴리머와 같은 폴리머 재료로도 제작될 수 있다. 예를 들어, 샤프트 슬리브 및 교반기는 조사, 광 또는 플라즈마 유도, 또는 산화를 받아 변형된 폴리에틸렌 폴리머를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 단일 사용 생물 반응기 시스템은 단일 사용 세포 배양 생물공정 용기 ("SUB"), SUB가 작동 중에 유지되는 재사용 가능한 쉘, 및 SUB의 작동 및 관련 하위-시스템과 프로세스를 제어하는 제어기를 포함한다. 관련 하위-시스템은 교반 시스템, 배플 시스템, 스파저 시스템, 공급 시스템, 수확 시스템, 모니터링 시스템, 제어 시스템 및 충전 시스템을 포함한다.
한 실시형태에서, SUB의 세포 배양 접촉 및 공정 유체 접촉 표면 각각에는 바람직하게는 동물 유래 성분이 없다.
본 개시내용의 일 양태에 따르면, 단일-사용 생물 반응기가 제공된다. 단일-사용 생물 반응기는 생물공정 용기, 쉘, 적어도 하나의 교반기, 적어도 하나의 스파저, 스파저(들) 및 헤드스페이스 오버레이를 위한 적어도 하나의 가스 필터 입구 포트, 적어도 하나의 충전 포트, 적어도 하나의 수확 포트, 적어도 하나의 샘플 포트 및 적어도 하나의 프로브를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 단일 사용 생물 반응기는 또한 단일 사용 생물 반응기 (SUB) 시스템과 함께 사용될 수 있다. 시스템은 단일 사용 및 일회용인 유연한 생물 반응기 생물공정 용기, 유연한 생물 반응기 생물공정 용기를 고정하도록 구성된 SUB 쉘, 교반기, 스파저, 복수의 포트 및 SUB 시스템이 유사한 크기의 스테인리스 강 생물 반응기에서 생산될 수 있는 생체물질에 해당하는 생체물질을 생성하도록 SUB 시스템과 연관된 복수의 매개변수를 제어하도록 구성된 적어도 하나의 제어기를 포함할 수 있다.
본 개시내용에 따르면, 회전 가능한 샤프트는 상부 임펠러 및 하부 임펠러에 결합될 수 있다. 상부 임펠러와 하부 임펠러 둘 모두는 폴리머 재료로 제작될 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서 임펠러는 3-D 인쇄될 수 있다. 상부 임펠러와 하부 임펠러 둘 모두는 친수성 표면을 한정할 수 있다. 예를 들어, 임펠러를 형성하는 데 사용되는 폴리머 물질은 친수성 폴리머를 포함할 수 있거나 표면에 친수성을 부여하기 위해 표면 개질된 폴리머를 포함할 수 있다.
예를 들어, 일 실시형태에서, 상부 임펠러 및 하부 임펠러는 폴리에틸렌 또는 폴리프로필렌과 같은 폴리올레핀 폴리머로 제조된다. 일 실시형태에서, 저밀도 폴리에틸렌이 사용될 수 있다. 저밀도 폴리에틸렌은 조사, 광 또는 플라즈마 유도 또는 산화를 거쳐 친수성 표면을 형성하도록 변형될 수 있다.
상부 임펠러는 수중익 임펠러를 포함할 수 있다. 반면 하부 임펠러는 4개의 피치-블레이드된 고강도 임펠러를 포함할 수 있다. 임펠러 대 탱크 직경 비는 약 0.44 내지 약 0.46과 같이, 약 0.35 내지 약 0.55일 수 있다. 상부 임펠러 및 하부 임펠러는 약 0.1 내지 약 0.9의 전력 수 (Np)를 가질 수 있고 약 0.4 내지 약 0.9의 유동 수 (Nq)를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 생물 반응기는, 그 내용이 전체로 본 명세서에 참고로 포함된, 미국 특허 9,670,446에 기재된 바와 같은 생물 반응기이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 생물 반응기는 미국 특허 9,670,446에 기재된 생물 반응기의 일부 또는 특징을 포함한다.
일 실시형태에서, 생물 반응기는 수확 용기, 예를 들어, 수확 용기에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 수확 용기는, 예를 들어, 배양물의 적절한 산소처리를 보장하기 위해 배양물과 가스를 혼합하는 수단 (예를 들어, 배양물을 폭기하는 것)을 포함할 수 있다. 실시형태에서, 수확 용기는 수확 용기에, 예를 들어, 생물 반응기)로부터 침착된 상청액, 및 기체, 예를 들어, 공기, 산소 또는 공기와 산소의 혼합물을 포함하는 헤드-스페이스을 포함한다. 실시형태에서, 수확 용기는 헤드스페이스 가스, 예를 들어, 공기 또는 산소 또는 공기와 산소 가스 혼합물로 배양 상층액을 산소화하기 위해 표면 통기를 사용한다. 표면 통기는 J-튜브 입구 포트로부터 수확 용기 벽 아래로 그리고 헤드스페이스와 접촉하는 상청액 액체 표면으로부터 계단식 또는 유동하는 상청액을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이동 또는 계단식은 배양물의 산소처리 수준에서의 증가를 초래한다.
수확 용기는 적어도 하나의 믹서, 헤드스페이스 오버레이를 위한 적어도 하나의 가스 필터 입구 포트, 용기 벽을 향한 내부 J-튜브를 갖는 적어도 하나의 충전 포트, 적어도 하나의 수확 포트, 적어도 하나의 샘플 포트, 적어도 하나의 온도 프로브, 적어도 하나의 산화환원 프로브, 적어도 하나의 DOT 프로브, 및 적어도 하나의 pH 프로브, 적어도 하나의 온도 제어, 적어도 하나의 가스 흐름, 예를 들어, 적어도 하나의 공기 흐름 제어 및 하나 이상의 O2 흐름 제어를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 수확 용기는 40% 공기 포화도 초과 내지 500% 공기 포화도 이하의 범위에서 DOT를 유지하는 공기/O2의 헤드 스페이스 가스 혼합물을 포함한다.
일 실시형태에서, 생물 반응기 또는 수확 용기는 산화 환원 프로브, 예를 들어, 인-라인 산화환원 프로브, 예를 들어, Mettler Toledo 인-라인 산화환원 프로브를 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 배양물 또는 배양물이나 배양물 상층액의 세포에서 산화환원 전위를 제공 또는 유지하기 위해 티오레독신 또는 글루타티온/글루타레독신 시스템의 성분을 제공, 예를 들어, 추가 또는 조절, 예를 들어, 활성/풍부도를 증가 또는 감소시킬 수 있는 생물 반응기 또는 수확 용기를 포함한다. 티오레독신 및 글루타티온/글루타레독신 시스템 및 이의 성분은 당업계에 공지되어있다. 예를 들어, Holmgren 등 Biochem Soc Trans. 2005 Dec;33(Pt 6):1375-7; Nordberg 및 Arner. Free Radic Biol Med. 2001 Dec 1;31(11):1287-312; Ghezzi P. Biochem Soc Trans. 2005 Dec;33(Pt 6):1378-81; Ivarsson 등 Diabetes. 2005 Jul;54(7):2132-42; Sen, CK. Biochem Pharmacol 55 (11), 1747-1758. 1998 Jun 01; 및 May 등 J Biol Chem. 1997 Sep 5;272(36):22607-10을 참고하며, 그 내용은 그 전체로 본 명세서에 참고로 포함된다.
일 실시형태에서, 방법은 GILT (감마-인터페론-유도성 리소좀 티올 환원효소)를 제공, 예를 들어, 추가 또는 조절, 예를 들어, 활성/풍부도를 증가 또는 감소시킬 수 있는 생물 반응기 또는 수확 용기를 포함한다. 예를 들어, Rausch 및 Hastings. Mol Immunol. 2015 Dec;68(2 Pt A):124-8. doi: 10.1016/j.molimm.2015.06.008. Epub 2015 Jun 23; 및 Hastings 및 Cresswell. Antioxid Redox Signal. 2011 Aug 1; 15(3): 657-668을 참고하며, 그 내용은 그 전체로 본 명세서에 참고로 포함된다. 일 실시형태에서, 방법은 아스코르브 산, 디하이드로아스코르브 산, 또는 아스코르브 산이나 디하이드로아스코르브 산 변형 성분을 성장 배양물에 제공, 예를 들어, 첨가할 수 있는 생물 반응기 또는 수확 용기를 포함한다. 아스코르브 산 및 디하이드로아스코르브 산의 산화환원 전위 조절 특성은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Winkler 등 Free Radic Biol Med. 1994 Oct; 17 (4): 333-49을 참고하며, 이것은 그 전체로 본 명세서에 참고로 포함된다.
한 실시형태에서, 방법은 생산 배양물에 세포내 작용제를 제공할 수 있는, 예를 들어, 산화환원 전위-지시 표지, 예를 들어, 산화환원-민감성 염료 또는 분자 프로브를 첨가할 수 있는 생물 반응기를 포함한다. 이러한 산화환원 전위-지시 표지는 배양물 또는 배양물 내 세포의 산화환원 전위를 모니터링하는 데 유용할 수 있다. 산화환원 전위-지시 표지는 2,2'-비피리딘 (Ru 복합체), 니트로페난트롤린 (Fe 복합체), N-페닐란트라닐산, 1,10-페난트롤린 철 (II) 설페이트 복합체 (페로인), N-에톡시크리소이딘, 2,2'-비피리딘 (Fe 착물), 5,6-디메틸페난트롤린 (Fe 착물), o-디아니시딘, 소디움 디페닐아민 설포네이트, 디페닐벤지딘, 디페닐아민, 바이올로겐, 소디움 2,6-디브로모페놀-인도페놀, 소디움 2,6-디클로로페놀-인도페놀, 소디움 o-크레졸 인도페놀, 티오닌 (로트 바이올렛), 메틸렌 블루, 인디고테트라술폰산, 인디고트리술폰산, 인디고 카민 (인디고디설폰산), 인디고모노 설폰산, 페노사프라닌, 사프라닌, 뉴트럴 레드, 본 명세서에 포함된 임의의 문헌에 개시된 표지 및, 그 전체로 본 명세서에 참조로 포함된, Schwarzlander M 등, Antioxid Redox Signal. 2016 May 1;24(13):680-712에 개시된 표지를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
또 다른 실시형태에서, 방법은 생성 배양물에 세포외 작용제, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 전이 상태 금속 이온인, 대사산물을 제공할 수 있는 생물 반응기 또는 수확 용기를 포함한다.
일부 실시형태에서, 생물 반응기 또는 본 개시내용의 방법에 사용하기 위한 생물 반응기는 다음 원리에 따라 설정될 수 있다:
-생산 배양물을 수확하는 동안 생물 반응기의 기능적 설정은 생물 반응기에서 나오는 배양물이 잘 산소처리되고 후속 처리 단계로 용존 산소를 운반하는 것을 보장하는데 중요하다. 일단 세포 배양이 목표 온도에 도달하여 수확 단계를 시작하면 생산 배양의 산소처리를 방해할 가능성이 있는 모든 공정 제어가 억제되게 보장한다. 여기에는 활성화된 경우 살포된 질소 가스 흐름의 억제, 활성화된 경우 주문형 CO2 가스 흐름 제어의 억제, 활성화된 경우 주문형 알칼리 제어의 억제, 및 활성화된 경우 공급 적용의 억제가 포함될 수 있다.
-질소 살포 가스 흐름은 일반적으로 산소에 대한 세포 수요가 낮을 때 용존 산소 분압 (DOT)을 설정 점으로 제어하기 위해 밸러스트로 사용되지만, 그러나 생산 단계의 과정 동안 활발하게 흐름을 유지할 수 있다. 질소는 또한 이들 용기에서 혼합을 유지하기 위해 운반 밸러스트로 공수 생물 반응기에서 사용된다. 그러나 질소 살포 가스가 사용되는 경우 수확 단계 동안 생산 배양을 통기하기 위해 사용되는 살포된 가스의 산소 조성이 희석되는 것을 방지하는 것이 억제되어야 하는데 이는 이것이 배양물에서 용존 산소, DOT가 100% 공기 포화도 (단지 공기 살포만 사용되는 경우) 또는 예상된 최대 DOT (공기와 산소의 혼합이 사용되는 경우)에 도달하는 것을 방지할 것이기 때문이다. 따라서 살포된 질소는 주어진 공기만 살포하거나 공기-산소 혼합물의 살포에 대해 예상되는 최대 용존 산소 농도를 제한한다. CO2 가스 흐름은 공정 pH가 제어 범위 이상으로 상승하는 것에 반응하여 생산 배양물 안으로 살포된다. CO2 가스 흐름 살포가 활성화되면 살포 가스의 산소 조성도 희석되어 차례로 주어진 공기 단독의 살포 또는 공기-산소 혼합물의 살포에 대해 예상되는 최대 용존 산소 농도를 제한한다. 따라서 생산 배양물의 수확 동안 그것의 비활성화는 폭기성 살포 가스의 희석을 방지한다.
-생산 배양물의 배양 도중 엄격한 pH 조절을 위해 공정 pH가 조절 범위 이하로 떨어지면 생산 배양물에 알칼리 용액의 부가가 요구된다. 그러나 지속적으로 작동 부피가 감소하고 알칼리 용액의 과도한 투여에 기인하여 생산 배양물이 수확되는 동안 알칼리 용액의 적용으로는 세포 손상 및 세포 사멸의 더 큰 잠재적 위험이 있다. 생산 배양물 안으로 공급의 적용은 배양물이 활성적으로 성장하고 대사되는 동안에 필요하다. 그러나 수확하는 동안 지속적으로 감소하는 작동 부피는 생물 반응기의 혼합 거동에 영향을 미치고, 공급의 비-생리적 특성 (높은 삼투압 및 높거나 낮은 pH) 및 잘 섞이지 않은 용기에서 만들어진 미세-환경에 기인하여 공급 용액의 적용으로 더 큰 세포 손상 및 세포 사멸을 초래한다.
-일단 생산 배양물이 목표 온도에 도달하여 수확 단계를 시작하면 생산 배양물의 산소화를 촉진할 가능성이 있는 모든 공정 제어가 활성화되는 것을 보장한다. 여기에는 활성화되지 않은 경우 살포된 공기 및/또는 산소 가스 흐름의 활성화, 활성화, 활성화되지 않은 경우 헤드-스페이스 공기 및/또는 산소 흐름의 활성화, 및 마지막으로 활성화되지 않은 경우 헤드-스페이스 압력의 활성화가 포함될 수 있다. 주문형 공기 및/또는 산소 살포 흐름은 생산 배양물이 성장을 멈추거나 또는 수확 준비 상태에서 냉각되면 매우 낮아지거나 심지어 중단될 수 있다. 다양한 연속적인 고정 유속에서 공기 및 산소 살포의 지속된 적용은 생산 배양물을 산소처리하고 생산 배양물이 용존 산소를 세포 정화 필터 하우징 또는 원심분리 안으로 그리고 생물 반응기와 필터 하우징 또는 원심분리기 사이 및 필터 하우징 또는 원심분리와 상층액 수집 용기 (예를 들어, 수확 용기) 사이 경로로 운반하도록 보장하는 데 중요하다. 헤드-스페이스 또는 오버레이 폭기는 전형적으로 생산 배양물의 배양 중에 활성화되고 생물 반응기 헤드-스페이스가 대사 CO2 가스의 지속적으로 제거되는 것을 보장한다. 수확 동안 생산 배양물의 지속된 오버레이 폭기는 살포 가스로 달성되는 것보다 더 느리지만 배양물의 표면 산소처리를 촉진하고 그러나 생산 배양물이 생물 반응기에서 배출되는 동안 거품의 생성을 방지한다.
-헤드-스페이스 압력으로 작동할 수 있고 생산 배양물의 배양 동안 압력을 사용하여 액체상 (배양)으로 기체의 더 큰 용해도를 돕거나 용기의 무균 경계를 넘어 환경 오염물질의 침입을 방지하기 위해 생물 반응기 내에서 양압을 유지하는 생물 반응기 경우 그것이 수확 동안 유지되는 것이 추천된다. 실제로 수확이 압력에 의해 구동되는 경우, 생물 반응기를 가압하는 데 사용되는 가스가 공기이거나 공기와 산소의 혼합된 혼합물이면 배양물 산소처리에 도움이 될 것이다. 그러나 수확이 펌프에 의해 구동되는 경우 헤드-스페이스 압력은 전형적으로 사용되지 않는다. 이러한 상황에서 공기 또는 공기/산소 가스 혼합물과 함께 헤드-스페이스 압력의 사용은 배양물 산소처리를 돕고 배양물이 수확 작업 동안 필요한 작업의 규모에 의존하여 필요한 빠른 속도로 흐를 때 펌프 헤드의 흡입 헤드 업스트림 하에서 수확 튜빙이 붕괴되는 것을 방지하는 데 유용하다.
-단일 사용 생물 반응기의 경우, 높은 유속에서 펌프 헤드의 상류에서 생성된 흡입 하에서 붕괴되는 것을 방지하기 위해 내부 보어 크기 및 벽 강도와 관련된 수확 라인의 설계는 수확 유속이 튜브 폐색을 통해 방해받지 않도록 보장하는 데 중요하다. 튜브 폐색의 영향은 수확 유속을 제한할 뿐만 아니라 더 큰 세포 사멸과 세포 용해를 촉진하고 배양물로부터 용존 산소의 탈기를 촉진할 수 있다. 튜브 폐색 영향은 저산소/무산소 환경에 세포와 생성물을 노출시킬 가능성이 있어 보다 느린 유속에서 하우징 내 체류 시간을 늘리고, 수축된 개구를 통해 더 큰 세포 사멸 및 세포 용해를 통해 세포내 인자의 방출을 촉진하고 흡입 구역 내에서 가스를 제거하고 배양물에 의해 필터 하우징 안으로 운반되는 용존 산소의 양을 낮춤에 의해 배양물에서 용존 산소를 제거한다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 생성물 안정성에 대한 이들 부정적인 영향을 피한다.
수확 튜빙의 내부 직경과 사용되는 펌프의 선택은 심층 필터 또는 심층 필터에 결합된 원심분리에 의한 세포 정화 단계에 대한 공정 용적 처리량 (필터 면적당 공정 상층액의 리터, L/㎡)을 달성하는 데 필요한 유속을 얻기 위해 선택된다. 수확 라인의 구조 재료는 펌프 헤드의 상류에서 생성된 흡입 헤드에서 붕괴되는 것을 견딜 수 있는 강성을 가져야 한다. 일반적으로 사용되는 백금-경화 실리콘 또는 C-플렉스 이외의 재료가 수확 튜빙의 구축에 사용되는 것이 제안된다. 편조 튜빙의 사용은 일반적으로 사용되는 재료의 대안으로 고려될 수 있다.
-일부 실시형태에서, 방법은 필터 정화 단계 동안 필터의 오염 및 막힘을 방지하기 위해 심층 필터 영역의 최적화하고 이에 의해 필터 하우징 내에서 세포 배양의 체류 시간을 최소화할 수 있는 생물 반응기가 배양물이 상층액으로 통과되기 전에 필터 하우징으로 유입되어 잔류하는 동안 생산 배양물의 산소처리 및 생물 반응기에서 수행되는 용존 산소가 고갈되지 않도록 보장하는 필수 단계인 것을 포함한다. 또한, 유속은 정화 단계 (필터 하우징)와 c 상청액 수집 용기 (예를 들어, 수확 용기) 사이의 상청액의 체류 시간을 최소화하기 위해 적절하게 되어야한다.
세포 정화 필터 (1차, 2차 및 3차) 영역은 1차 또는 1단계 필터의 2차 또는 2단계 및 3차 또는 3단계 필터 다운스트림의 성능에 영향을 미치는 정도로 필터에 걸쳐서 플럭스 (L/m2/h) 또는 여액 품질 (미립자의 해결을 통함)의 손실 없이 필요한 공정 용적 처리량이 충족되는 것을 보장하도록 최적화된다. 또한, 최적의 세포 정화를 위해 선택된 필터 영역 및 필터 유형은 필터 오염 및 임박한 필터 막힘을 나타내는 상이한 필터 단계들 사이의 더 높은 압력 차이를 피해야 한다. 따라서 상이한 직렬로 결합된 필터에 걸친 플럭스에서의 감소는 필터 하우징 내의 증가된 체류 시간을 초래하고 필터 하우징 내의 상층액에서 용존 산소의 더 많은 소비/고갈로 이어져 상층액의 저산소증을 유발할 것으로 예상된다. 1차 단계 필터와 2차 단계 필터 사이에 더 높은 압력 차의 축적은 더 높은 세포 용해를 촉진하고 활성화될 때 생성물을 불안정하게 만드는 세포 인자의 방출을 촉진하는 만큼 또한 문제가 된다.
-일부 실시형태에서, 방법은 세포가 없는 상청액이 잘 통기되고 혼합된 수확 용기 (강철 또는 단일-사용)에서 수집되도록 보장할 수 있는 생물 반응기를 포함한다. 수확 용기는 다음을 통해 우수한 표면 산소처리를 촉진하는 것을 보장하도록 설계된다: 여액이 용기 벽 아래로 단계화되도록 하는 용기 벽쪽으로 향하는 내부 노즐을 설계함에 의해 수집된 여액을 용기 벽 상으로 충돌시키는 것 및/또는 여액을 수집하기 전에 공기 또는 임의의 주어진 공기와 산소의 혼합으로 구성된 기체성 환경으로 수확 용기를 채워 수집된 여액의 산소처리를 >40% 공기 포화도 및 ≤ 500% 공기 포화도보다 크게 촉진하는 능력.
일 실시형태에서, 수확 용기는 스테인리스 강 수확 용기이다. 상층액 수집 방법과 수확 용기의 설계는 수확 단계 동안에 생성물을 보호하기 위한 접근방식의 마지막 요소이다. 현재 수확된 상청액은 수집된 상청액을 지속적으로 혼합하기 위해 믹서를 갖는 재킷이 있는 스테인리스 강 용기에 수집된다. 수확된 상층액은 상층액의 흐름을 용기의 벽 상으로 향하게 하여 벽을 따라 계단식으로 내려가 탱크의 바닥에 수집되는, 내부 'J' 튜브를 갖는 헤드스페이스 포트를 통해 수확 용기 안으로 배출된다. 부가적으로, 이들 스테인리스 강 용기는 용기 멸균 경계를 통해 환경 오염물질의 침입을 방지하기 위해 현장에서 증기 멸균된 후 용기를 대기압 이상으로 가압유지하도록 멸균 공기로 채워진다. 이들 용기에 수집된 수확 상층액은 가압된 공기의 분위기하에서 용기 벽 아래로 계단식으로 내려가면서 산소처리되는 것으로 가정된다. 상청액의 추가 산소처리는 수집된 상청액 위의 헤드스페이스와의 표면 접촉을 통해 발생한다.
다른 실시형태에서, 수확 용기는 단일 사용 수확 용기이다. 단일 사용 상층액 수확 용기는 감마-조사 및 비워진 백이다. 상층액 수집 동안에 백은 수집된 상층액 위에 형성되는 기체성 헤드스페이스 없이 진공을 채우고 대체한다. 이들 백은 교반기를 갖지 않으므로 수집된 상층액은 혼합될 수 없고 백은 수집된 상층액을 가열하거나 냉각할 수 없는 재킷이 없는 플라스틱 또는 스테인리스 강의 쉘 안으로 설치된다. 백에 상층액이 채워지면 최대 14일 동안 +5℃ 저장소로 옮겨진다. 정제 공정은 수확 직후 또는 보유 기간 14일 이내에 1차 포획 단계로 시작할 수 있다.
생산 배양물의 산소처리가 수확 단계 동안에 40% 초과의 공기 포화도에서 500% 미만의 공기 포화도의 범위에서 DOT에서 유지되도록 보장하는 접근방식은 정화 단계 안으로 그리고 이를 통해 운반되는 예상되는 용존 산소를 생산 배양물에 '장입'하여 상청액이 수집될 때 생성물 해리를 촉진할 수 있는 세포 인자의 활성화를 방지하기에 충분한 용존 산소를 갖도록 하는 것을 의도한다. 수확 용기는 수확된 상청액이 최대 14일 동안 +5℃ 보관 상태를 유지하면서 양호한 산소처리 상태를 계속 유지하는 것을 보장하도록 설계되었다. 이는 상층액이 수집되고 +5℃ 보관 상태를, 예를 들어, 표면 통기에 의해 유지하는 동안 계속해서 산소처리하는 것을 보장하는 용기 설계에 의해 달성된다. 일 실시형태에서, 수확 용기 디자인은 다음 특징을 포함한다:
-용기 또는 단일-사용된 백은 수집된 상층액이 표면 통기를 통해 산소처리되도록 하는 충분한 축 방향 벌크 혼합을 제공하는 교반기/혼합기를 갖는다.
-용기 또는 단일 사용 백 쉘은 용기 내용물의 온도가, 예를 들어, 실온에서 4시간 이내에 +5℃에 도달하고 유사한 지속기간 내에 +5℃에서 실온으로 가열할 수 있도록 적절한 크기의 열-순환기로 재킷이 씌워진다.
-용기 또는 단일 사용 백 쉘에는 적절한 크기의 공기 및 산소 가스 질량 유량 제어기가 장착되어 공기, 산소 또는 산소-풍부한 가스로 헤드스페이스 폭기를 허용한다.
-용기 또는 단일 사용 백 및 쉘에는 오버레이 가스 필터 (작동 규모에 적합한 유속에서의 공기 및 산소 가스에 적합 및 작동의 규모에 적합한 유속에서의 공기 및 산소 가스에 적합한 배출 가스 배기 필터가 장착되어, 상층액 여액의 산소처리를 상층액 여액 수집 동안 및 일단 수집 완료된 후 >40% 공기 포화도 및 ≤500% 공기 포화도보다 크게 촉진하기 위해 공기 또는 임의의 주어진 공기와 산소의 혼합물로 구성된 가스성 환경으로 상층액 여액 수집 전에 수확 용기를 채우기 위해 헤드스페이스를 가로질러 공기와 산소의 연속 흐름을 허용한다.
-용기 또는 단일 사용 백 및 쉘에는 압력 센서 및 안전 인터록이 장착되어 압력이 작동 및 용기 설계에 대한 안전 한계를 초과하는 경우 헤드스페이스 가스를 차단한다.
-용기 또는 단일 사용 백 및 쉘에는 pH, DOT, 산화환원 및 온도에 대한 공정 센서 포트가 장착되어 있다. 용기 또는 백 내의 프로브 위치는 작동의 규모에 적합한 가장 낮은 작동 부피에서 모니터링하는 것을 허용한다.
-용기 또는 단일 사용 백에는 내부 노즐이 장착된 포트와 함께 용기의 상단에 추가 포트가 장착되어 있어 용기 벽으로 액체의 흐름을 유도하고 액체가 용기 벽 아래로 단계적으로 되도록 촉진한다.
세포 및 세포 배양물
일 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 바와 같은 생성물, 예를 들어, 재조합 생성물을 생산하는 세포 또는 세포주를 조작하거나 제조하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 또 다른 양태에서, 본 개시내용은 개선된, 예를 들어, 감소된 해리, 증가된 생산성 및/또는 생성물 품질을 갖는 세포 또는 세포주를 조작하거나 제조하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
실시형태에서, 세포는 포유동물 또는 비-포유동물 세포, 예를 들어, 곤충 세포, 효모 세포, 진균 세포, 식물 세포, 고세균 세포, 예를 들어, 고세균 종으로부터의 세포 또는 박테리아 세포이다. 실시형태에서, 세포는 인간, 마우스, 랫트, 차이니즈 햄스터, 시리아 햄스터, 원숭이, 유인원, 개, 오리, 말, 앵무새, 흰족제비(ferret), 어류 또는 고양이 유래이다. 실시형태에서, 세포는 동물 세포이다. 실시형태에서, 세포는 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포 또는 설치류 세포, 예를 들어, 햄스터 세포, 마우스 세포 또는 랫트 세포이다. 실시형태에서, 세포는 원핵 세포, 예를 들어, 박테리아 세포이다. 실시형태에서, 세포는 악티노박테리아의 종, 예를 들어, 미코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis)이다).
일 실시형태에서, 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포이다. 일 실시형태에서, 세포는 CHO-K1 세포, CHO-K1 SV 세포, DG44 CHO 세포, DUXB11 CHO 세포, CHOS, CHO GS 녹-아웃 세포, CHO FUT8 GS 녹-아웃 세포이고, CHOZN, 또는 CHO-유래 세포이다. CHO GS 녹-아웃 세포 (예를 들어, GSKO 세포)는, 예를 들어, CHO-K1 SV GS 녹아웃 세포이다. CHO FUT8 녹아웃 세포는, 예를 들어, Potelligent® CHOK1 SV (Lonza Biologics, Inc.)이다.
다른 실시형태에서, 세포는 HeLa, HEK293, HT1080, H9, HepG2, MCF7, 저캣, NIH3T3, PC12, PER.C6, BHK (베이비 햄스터 신장 세포), VERO, SP2/0, NS0, YB2/0, Y0, EB66, C127, L 세포, COS, 예를 들어, COS1 및 COS7, QC1-3, CHO-K1, CHOK1SV, 포텔리전트 CHOK1SV, CHO GS 녹아웃, CHOK1SV GS-KO, CHOS, CHO DG44, CHO DUXB11 및 CHOZN, 또는 그로부터 유래된 임의의 세포이다. 일 실시형태에서, 세포는 줄기 세포이다. 일 실시형태에서, 세포는 본 명세서에 기재된 임의의 세포의 분화된 형태이다. 일 실시형태에서, 세포는 배양 중인 임의의 1차 세포로부터 유래된 세포이다.
실시형태에서, 세포는 생성물, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 생성물을 생산하는 본 명세서에 기재된 세포 중 임의의 하나이다. 실시형태에서, 세포는 재조합 폴리펩타이드를 인코딩하는 외인성 핵산을 포함하는, 예를 들어, 재조합 폴리펩타이드, 예를 들어, 표 2 또는 3으로부터 선택된 재조합 폴리펩타이드를 발현하는 본 명세서에 기재된 세포 중 임의의 하나이다.
실시형태에서, 세포 배양 (예를 들어, 생산 배양)은 배치 배양, 유가 배양, 연신 및 충전 배양, 또는 연속 배양으로서 수행된다. 실시형태에서, 세포 배양은 부착성 배양이다. 실시형태에서, 세포 배양은 현탁 배양이다. 일 실시형태에서, 세포 또는 세포 배양물은 재조합 폴리펩타이드의 발현을 위해 생체내에 배치되고, 예를 들어, 모델 유기체 또는 인간 대상체에 배치된다.
예를 들어, 방법은 대규모 생물 반응기, 예를 들어, 적어도 2개의 임펠러를 갖는 생물 반응기, 대규모 생물 반응기 시스템 및 포유동물 세포의 대규모 배양 및 증식을 위한 방법에서 수행된다. 실시형태에서, 생물 반응기는 2011/0312087에 기재된 생물 반응기이다.
실시형태에서, 세포는 USSN 62/242,758에 개시된 바와 같이 생물 반응기에서 배양되며, 그 내용은 그 전체가 본 명세서에 포함된다. 적어도 하나의 생물 반응기, 다른 세포 배양-관련 장비 및 이의 임의의 조합을 포함하는 시스템을 제어하기 위한 시스템 및 방법이 개시되어 있다. 예를 들어, 생물 반응기 제어를 위한 시스템 및 방법은 다수의 생물 반응기 및 발효, 수확용 장비, 미세 여과 및 정제용 장비 (예를 들어, 액체 크로마토그래피 스키드 시스템), 완충제 제제, 배지 제제 등과 같은 다른 유형의 배양-관련 장비를 제어하는 것을 포함할 수 있다. 복수의 생물 반응기 및 기타 유형의 배양-관련 장비가 플랜트 내에 위치될 수 있고, 이러한 장비의 제어는 플랜트-와이드 제어 시스템 ("PWCS")으로 알려질 수 있다.
실시형태에서, 방법은 적어도 하나의 단일-사용 일회용 기술, 예를 들어, USSN 62/246,478에 기술된 것을 사용하여 배치 및 연속적 제조 둘 모두를 제공하는 제조 설비에서 수행되며, 그 내용은 그 전체로 본 명세서에 포함된다. 실시형태에서, 제조 설비는 활성인 약학적 성분 ("API")의 생산을 위한 것이다.
냉각은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 더 큰 반응기는 전형적으로 자동온도조절로 제어되거나 또는 온도-제어된 물이 통과하여 배양 온도를 제어하는 워터 재킷을 가질 것이다. 실시형태에서, 공정 냉각수 공급은 실질적이고 빠른 냉각을 얻기 위해 재킷 안으로 전달된다. 실시형태에서, 열을 제거하기 위해 냉장 단위가 사용된다.
냉각은 배양 (즉, 세포의 수를 증가시키거나 세포 배양으로부터 원하는 생성물의 생산을 유도함)하거나 생산 단계의 말기에 생산 배양물을 냉각할 때 또는 세포를 수확할 때 하나 이상의 원하는 시간에 수행될 수 있다. 유기체가 성장하는 최적의 온도가 다르기 때문에, 냉각 온도는 냉각 단계 이전 단계 또는 단계들의 상대적으로 높은 온도에 기초하여 선택될 것이다. 실시형태에서, 배양된 세포의 냉각은 세포의 산소 소비의 속도를 감소시켜 수확 스트림이 수확하는 과정을 통해 산소처리된 상태를 유지하도록 수행된다.
포유동물 세포주의 경우 배양 공정 온도 전이는 일반적으로 27-35℃ (예를 들어, 27, 28, 29, 30, 31 또는 32, 33, 34 또는 35℃)이다. 일부 실시형태에서, 온도는 지수 성장 단계 후 30-33℃로 감소된다. 이론에 얽매이지 않고, 생산 단계 후 온도를 12-18℃, 예를 들어, 15℃로 낮추면 산소 소비의 특정 비율이 10배 감소한다고 여겨진다.
실시형태에서, 배양 배지는 혈청이 없다.
포유동물 세포주에 대한 다른 적합한 배지 및 배양 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,633,162에 기재된 바와 같이 당업계에 잘 알려져 있다. 실험실 플라스크 또는 저밀도 세포 배양을 위한 표준 세포 배양 배지와 특정 세포 유형의 요구에 맞게 조정된 것의 예는 예를 들어: Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 배지 (Morre, G., The Journal of the American Medical Association, 199, p. 519 f. 1967), L-15 배지 (Leibovitz, A. 등, Amer. J. of Hygiene, 78, 1p. 173 ff, 1963), 둘베코의 변형 이글 배지 (DMEM), 이글 최소 필수 배지 (MEM), 함의 F12 배지 (Ham, R. 등, Proc. Natl. Acad. Sc.53, p288 ff. 1965) 또는 알부민, 트랜스페린 및 레시틴을 결한 이스코브의 변형 DMEM (Iscoves 등, J. Exp. med. 1, p. 923 ff., 1978)이다. 예를 들어, 함의 F10 또는 F12 배지는 CHO 세포 배양을 위해 특별히 설계되었다. CHO 세포 배양에 특별히 적합한 다른 배지는 EP-481 791에 기술되어 있다. 다른 적합한 배양 방법은 숙련가에게 알려져 있으며 사용되는 재조합 폴리펩타이드 생성물 및 숙주 세포에 따라 달라질 수 있다. 세포에 의해 발현되는 생성물, 예를 들어, 재조합 폴리펩타이드의 발현 및 생산에 적합한 조건을 결정하거나 최적화하는 것은 통상의 기술자의 기술 내에 있다.
생산되거나 분비되는, 예를 들어, 배양 배지로 분비되는 생성물의 양, 수준 또는 수량을 정량화하기 위한 분석은 브래드포드 (Bradford) 단백질 분석, SDS-PAGE 분석, 면역 블랏팅, 예를 들어, 웨스턴 블랏 및 자동화된 수단, 예를 들어, 나노드롭 장치를 사용하는 것과 같은 단백질 정량 분석을 포함한다. 증가된 단백질 생산을 측정하는 다른 방법은 당업계의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, ELISA (Smales 등 2004 Biotechnology Bioengineering 88:474-488)에 의해 조직 배양 배지에서 농도를 측정함에 의해 재조합 단백질 생산에서의 증가가 소-규모로 결정될 수 있다. 또한 ForteBio Octet에 의해 정량적으로, 예를 들어 배지에서 재조합 모노클로날 항체 (mAb) 농도의 높은 처리량 결정 (Mason 등 2012 Biotechnology Progress 28:846-855) 또는 단백질 A HPLC에 의해 대-규모로 (Stansfield 등 2007 Biotechnology Bioengineering 97:410-424) 결정될 수 있다. 생성물, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 재조합 폴리펩타이드의 생산을 결정하기 위한 다른 방법은 세포 내 생성물, 특히 재조합 폴리펩타이드의 특정 생산 속도 (qP) 및/또는 생존 세포 농도의 시간 적분 (IVC)을 지칭할 수 있다. 실시형태에서, 생산을 결정하는 방법은 qP 및 IVC를 결정하는 조합을 포함한다. 배양 배지에서 폴리펩타이드의 농도로 정의되는 재조합 폴리펩타이드 생산 또는 생산성은 Porter 등 (Porter 등 2010 Biotechnology Progress 26:1446-1455)에 따라 계산된 이들 두 매개변수 (qP 및 IVC)의 함수이다. 단백질 생산을 측정하는 방법은 또한 본 명세서에 제공된 실시예에서 더 자세히 설명된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 개선된 생성물 품질을 갖는 세포를 생산한다. 일 실시형태에서, 생성물의 품질의 개선은, 예를 들어, 더 낮은 온도에 노출되지 않은 세포에 의해 생산된 생성물의 양, 수준 또는 수량과 비교하여, 예를 들어 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 생성물 품질에서의 증가; 또는 1-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 10-배, 20-배, 50-배, 또는 100-배 이상의 생성물 품질에서의 증가를 초래한다. 생성물 품질에서의 이러한 증가는, 예를 들어, 다음 중 하나 이상에 의해 예시될 수 있다:
i) 디설파이드 결합 스크램블링에서의 증가 또는 감소 (예를 들어, 항체 분자 생성물에 대해, 예를 들어, 증가 또는 감소된 디설파이드 결합 스크램블링에 대한 결과로서 원하는 이소형 또는 구조의 증가 또는 감소).
ii) 비-응집된 생성물의 양 또는 수량에서의 증가 (또는 응집된 생성물의 양 또는 수량의 감소)
iii) 적절하게 접히거나 조립된 생성물의 양 또는 수량의 증가 (또는 잘못 접힘, 펼침, 부분적으로 조립되거나 또는 비-조립된 생성물의 양 또는 수량의 감소) 또는 적절하게 접거나 조립된 생성물 대 펼침, 잘못 접힘, 부분적으로 조립되거나 또는 비-조립된 생성물의 비율에서의 증가;
iv) 전장 생성물의 양 또는 수량에서의 증가 (또는 생성물의 단편화에서의 감소)
v) 원하는 후-번역 수정에서의 증가 (또는 수정되지 않았거나 잘못 수정된 생성물에서의 감소);
vi) 글리칸 이질성에서의 증가 또는 감소 (예를 들어, 글리코실화된 생성물의 경우);
vii) 기능성 생성물의 양 또는 수량에서의 증가 (또는 비기능성 또는 기능장애 생성물의 양 또는 수량에서의 감소), 또는 기능성 대 비기능성 또는 기능장애 생성물의 비율에서의 증가; 및/또는
본 명세서에 기재된 바와 같이 생성된 세포 또는 세포주의 생성물 품질, 예를 들어, 생성물 품질의 개선을 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일 실시형태에서, 발현된 재조합 폴리펩타이드 생성물의 1차 서열의 충실도를 결정하는 방법, 예를 들어, 질량 분석법이 당업계에 공지되어 있다. 적절하게 접힌 생성물, 예를 들어, 발현된 재조합 폴리펩타이드의 양 또는 농도에서의 증가는 원형 이색성 또는 발현된 재조합 폴리펩타이드의 고유 형광을 평가하여 결정될 수 있다. 기능성 생성물의 양 또는 농도에서의 증가는 재조합 생성물, 예를 들어, 재조합 폴리펩타이드의 동정성에 따라 다양한 기능성 분석을 사용하여 시험될 수 있다. 예를 들어, 항체는 ELISA 또는 기타 면역친화성 분석으로 시험될 수 있다. 생성물 품질에서 증가를 결정하는, 예를 들어, 응집, 후-번역 변형, 디설파이드 결합 스크램블링을 결정하는 다른 방법은 크기 배제 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피, 동적 광 산란 (DLS) 접근법 및 단백질 전기영동 (PAGE) 방법에 의해 평가될 수 있다.
일부 실시형태에서, 생성물의 발현, 예를 들어, 생성물의 전사, 번역 및/또는 분비, 또는 생성물의 품질, 예를 들어, 1차 서열의 적절한 접힘 및/또는 충실도를 개선하기 위해 추가 단계가 수행될 수 있다. 이러한 추가 단계는 생성물 발현 또는 생성물 품질을 개선하는 제제를 도입하는 것을 포함한다. 실시형태에서, 생성물 발현 또는 생성물 품질을 개선하는 제제는 소분자, 폴리펩타이드, 또는 단백질 접힘을 개선하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산, 예를 들어, 샤페론 단백질일 수 있다. 실시형태에서, 단백질 접힘을 돕는 제제는 샤페론 단백질, 예를 들어, BiP, PD1 또는 ERO1을 인코딩하는 핵산을 포함한다 (Chakravarthi & Bulleid 2004; Borth 등 2005; Davis 등 2000). 생성물의 수율과 품질을 개선하기 위한 다른 추가 단계는 XBP1 및 ATF6 (Tigges & Fussenegger 2006; Cain 등 2013; Ku 등 2008)과 같은 전사 인자의 과발현과 칼넥신 및 칼레티큘린 (Chung 등 2004)과 같은 렉틴 결합 샤페론 단백질의 과발현을 포함한다. 본 명세서에 기재된 단백질 접힘, 생성물 품질 및 생산 수율을 보조하거나 개선하는 제제의 과발현은 제제를 인코딩하는 외인성 핵산의 도입에 의해 달성될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 생성물 발현 또는 생성물 품질을 개선하는 제제는, 예를 들어, DMSO와 같이, 생성물의 발현 또는 생성물의 품질을 증가시키기 위해 세포 배양물에 첨가될 수 있는 소분자이다. 일 실시형태에서, 세포를 더 낮은 온도, 예를 들어, 세포가 정상적으로 성장하는 온도보다 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃ 또는 10℃ 더 낮은 온도로 유지하는 것은 생성물의 해리를 줄이거나 제거함에 의하여 생성물의 품질을 개선할 수 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법은 생산성이 높거나 고품질 생성물을 생산하는 세포를 동정하기 위한 추가의 선택 단계를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, FAC 선택은 원하는 특성, 예를 들어, 단백질 접힘 단백질, 예를 들어, 샤페론의 더 높은 발현을 갖는 특정 세포를 선택하는 데 이용될 수 있다.
일 양태에서, 본 개시내용은 재조합 폴리펩타이드 생성물을 회수 또는 수거하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 재조합 폴리펩타이드가 세포로부터 분비되는 실시형태에서, 방법은 세포, 세포 모집단 또는 세포가 배양된 배양 배지로부터 재조합 폴리펩타이드를 회수, 수집 또는 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 재조합 폴리펩타이드가 세포 내에 있는 실시형태에서, 재조합 폴리펩타이드 생성물의 정제는 임의의 다음: 숙주 세포 단백질, 숙주 세포 핵산, 숙주 세포 지질, 및/또는 숙주 세포로부터의 기타 파편 중 하나 이상으로부터 세포에 의해 생성된 재조합 폴리펩타이드의 분리를 포함한다.
실시형태에서, 본 명세서에 기재된 공정은 실질적으로 순수한 단백질 생성물을 제공한다. 본 명세서에 사용된, "실질적으로 순수한"은 발열성 물질이 실질적으로 없고, 핵산이 실질적으로 없고, 및/또는 내인성 세포 단백질 효소 및 숙주 세포로부터의 성분, 예컨대 중합효소, 리보솜 단백질 및 샤페론 단백질이 실질적으로 없음을 의미한다. 실질적으로 순수한 단백질 생성물은, 예를 들어, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 숙주 세포로부터 오염된 내인성 단백질, 핵산 또는 기타 거대 분자를 함유한다.
생성물, 예를 들어, 재조합 폴리펩타이드의 회수 및 정제를 위한 방법은 당업계에 잘 확립되어있다. 재조합 폴리펩타이드 생성물을 회수하기 위해, 물리적 또는 화학적 또는 물리-화학적 방법이 사용된다. 물리적 또는 화학적 또는 물리-화학적 방법은 여과 방법, 원심분리 방법, 초원심분리 방법, 추출 방법, 동결건조 방법, 침전 방법, 크로마토그래피 방법 또는 이의 둘 이상의 방법의 조합일 수 있다. 실시형태에서, 크로마토그래피 방법은 크기-배제 크로마토그래피 (또는 겔 여과), 이온 교환 크로마토그래피, 예를 들어, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및/또는 다중모드 크로마토그래피 중 하나 이상을 포함한다.
실시형태에서, 온도에서의 감소는 pH, 티오레독신 억제제, 예를 들어, 금속 이온을 감소시키면서 온도를 감소시키는 것과 조합된다. 실시형태에서, 조합 처리는 상술한 바와 같이 생물 반응기에서 수행된다.
실시예
본 발명은 하기 실시예를 참조하여 더욱 상세하게 설명된다. 이들 실시예는 단지 설명 목적으로 제공되며 달리 명시하지 않는 한 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 따라서, 본 발명은 결코 다음의 실시예로 제한되는 것으로 해석되어서는 안되고, 오히려 본 명세서에 제공된 교시의 결과로 명백해지는 임의의 그리고 모든 변형을 포괄하는 것으로 해석되어야 한다.
추가 설명 없이, 당업자는 전술한 설명 및 다음의 예시적인 실시예를 사용하여 본 발명의 화합물을 제조하고 이용할 수 있고 청구된 방법을 실행할 수 있다고 여겨진다. 다음의 작업 실시예는 본 발명의 다양한 양태를 구체적으로 지적하고, 어떤 방식으로든 본 개시내용의 나머지 부분을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1. 디클러터링을 위한 비-필수, 중복 및/또는 분비 내인성 단백질 후보의 배경 및 식별
차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포는 바이오 의약품의 세대를 위한 세계의 주요 생산 섀시이다 (Walsh, 2014). 이들 세포를 부착성 세포주에서 고정된 세포로 개발한 다음 과발현 및 합성 요소를 활용하여 세포를 조작하여 역가, 성장률 및 세포-특이적 재조합 단백질 생산률 (qP)을 높이기 위해 막대한 양의 시간, 노력 및 돈이 소비되지만, 세포 섀시와 게놈은 이를 차이니즈 햄스터 조상의 것으로 효과적으로 유지한다. 이 때문에 세포는 종종 완전히 인공적인 환경보다는 차이니즈 햄스터 내에 존재하는 것처럼 행동한다. 이것은 다수의 기능적으로 보이는 과다한 유전자가 여전히 암호화되고 이후에 세포주에 의해 발현되는 단백질에 의해 예시된다. CHO 게놈에서 성공적으로 녹 다운되거나 녹 아웃되어, 향상된 세포 또는 생성물 특성으로 이어지는 유전자의 문헌의 예가 있다. 이것은 향상된 특정 생산성에 대한 Cers2 및 Tbc1D20 (Pieper 등, 2017), Fut8 (푸코실화를 제거하기 위함) Bak 및 Bax (세포자멸사에 대한 더 큰 저항성을 위함) (Grav 등, 2015)뿐만 아니라 내인성 CHO 글루타민 합성효소의 제거 (Bebbington 등, 1992; Cockett, Bebbington, & Yarranton, 1990)를 포함한다. CHO에 대한 최근 게놈 서열 (Lewis 등, 2013; Xu 등, 2011)과 게놈 편집 기술의 급속한 발전 (Cong, Ran, Cox, Lin, & Barretto, 2013; Ran 등, 2013)을 수반한, 개별 유전자의 녹다운 또는 녹아웃에 의해 나타난 약속은 CHO 유전자 코드 내의 중복 요소의 더 큰 스크리닝에 대한 기회를 제시했다.
'Omics-수준 데이터는 생물정보학 도구 및 문헌 분석의 짝과 조합하여 양적 전사체학 및 단백질체학의 형태로 활용되어 후 번역 수정 (PTM) 및 분비 기구뿐만 아니라 소포체 (ER) 공간에 대한 표적 mAb와 경쟁할 것으로 예측되는 고농도 비-필수 단백질을 합리적으로 식별하였다. 이 전략은 주로 CHO 세포주에 대한 생물 반응기 실험에서 얻은 Lonza RNA-seq 데이터의 분석을 기반으로 한다. 샘플을 4, 7 및 9일차에 취하여 추출하고 CHOK1GS (Ensembl 수탁 번호: CHOK1GS_HDv1) 게놈 서열에 대해 RNA-seq 분석을 수행했다. 제공된 각 유전자에 대한 일백만당 전사 (TPM) 값을 사용하여 각 유전자 양의 측정이 총 세포 전사체 풀의 일부로 표현되었다. 자동 유전자 ID 할당은 각각 4, 7 및 9일차에 대해 총 전사체 풀 활성 유전자의 77.5%, 77.7% 및 77.6%에 대한 ID를 생성했다. 수동 할당은 유전자 ID를 전사체 풀의 18.4%, 17.8% 및 18.3%로 추가했다. 이것은 각각 4, 7, 9일차에 대해 총 13773, 14433 및 14660 유전자 ID를 생성했다; 이들 할당은 각각 4, 7 및 9일차에 대해 총 전사체 풀의 95.7%, 95.4% 및 95.8%에 대한 ID를 나타낸다. 그런 다음 정의된 임계값을 도입하여 유전자 전사체를 다양한 풍부 수준으로 분류하는 데 도움을 주었다 (Ramskold 등 (2009) PLoS Comput. Biol. 2009 Dec;5(12):e1000598. doi: 10.1371/journal.pcbi.1000598에 기초함):
· 발현되지 않은 유전자 (매핑된 일백만 판독당 엑손 모델의 킬로베이스당 단편 (FPKM) <0.3) (TPM <0.4)
· 낮게 발현된 유전자 (0.3≤FPKM<3) (0.4≤ TPM <4)
· 중간 발현된 유전자 (3≤FPKM<30) (4≤ TPM <40)
· 높게 발현된 유전자 (30≤FPKM<100) (40≤ TPM <133.33)
· 매우 높게 발현된 유전자 (FPKM≥100) ( TPM ≥133.33)
전체 3개 시험 일 (4, 7, 및 9)에 걸쳐 매우 높은 풍부 유전자 기준을 일관되게 충족한 유전자만 전달되었다 (879개 유전자). 이들 유전자는 그 다음 분석이 수행되어 지는 유기체로 사용된 머스 머스큘러스 (Mus musculus) 데이터베이스와 함께 PANTHER 분류 시스템 (http://www.pantherdb.org/)을 통과했다. 처음에는 기능 중복성으로 인해 관심 있는 것으로 간주되는 키워드를 함유하는 유전자만 추가 분석을 위해 강조표시되었다 (표 E1). 이에 이어서, 기능적으로 중요하거나 매우 필요한 키워드의 목록이 생성되었다 (표 E2). 이들 키워드를 함유하는 임의의 유전자는 추가의 분석에서 순차적으로 제거되었으며 표 E1 및 E2 둘 모두의 키워드를 함유하는 유전자의 경우 유전자가 CHO 세포의 기능에 이들이 얼마나 중요한 것으로 나타나는지에 대한 증거를 고려하여 심층 분석되었다. 정의된 기준을 통해 유전자를 필터링한 후, 76개 표적 (모든 이소형이 고려된 경우 112개)이 남았다.
그런 다음 4가지 상이한 도구를 이용하여 생물정보학적 분석을 수행하여 분비 단백질로서 본 발명자들의 기준에 더욱 적합한 유전자를 연마했다. 사용된 프로그램은 다음과 같았다:
· SignalP 4.1 ― (디폴트 설정 ― 진핵생물)-
http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/
· TargetP 1.1 ― (디폴트 설정 ― 비-식물)-
http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/
· SecretomeP 2.0 ― (포유동물로 변경된 설정) -
http://www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP/
· TMHMM 2.0 ― (디폴트 설정)-http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/
추가―omics 수준 데이터는 CHO 세포주의 지수 및 정지 단계 세포의 정량적 세포내 단백질체 분석을 사용하여 생성되었다. 총 단백질 바이오매스를 자세히 설명하는 데이터 (단백질의 평균 복제 수 및 그 분자량의 고려)가 표적 단백질에 대해 존재할 때 기록되었다.
CHO 세포 배양의 배지 내에 존재하는 세포외 단백질의 정량적 단백질체 분석에 대한 이전에 발표된 데이터 ((Kumar 등 2015 J Proteome Res. 2015 Nov 6;14(11):4687-703. doi: 10.1021/acs.jproteome.5b00588; Park 등 2017 Sci Rep. 2017 Mar 10;7:44246. doi: 10.1038/srep44246.)를 이용하여 공통의 중복 세포외 숙주 세포 (HC) 단백질을 시도하고 확인했다. 이전에 정의된 목록으로부터 표적 단백질이 존재하는지 여부와 존재하는 경우, 높은 수준, 중간 수준 또는 낮은 수준 (표 E3에서 정의된 기준) (NSAF - 정규화된 스펙트럼 풍부 인자, NSC - 정규화된 스펙트럼 계수)에 대한 상세한 사항이 기록되었다.
요약된 파이프라인은 하기에 나타나있다:
1. 생물 반응기에서 배양물 전체에 걸쳐 모든 매우 높은 전사체
2. 모두 적어도 하나의 강조표시된 키워드를 함유 (표 E1).
3. 개별 평가가 완료된 지점 2와 충돌하지 않는 한 모든 필수 키워드 제거 (표 E2)
4. 다수의 생물정보학적 도구에 의해 분비 단백질로 예측된 모두
5. Lonza IC 단백질체에 대해 시도된 매칭
6. 이전에 발표된 CHO EC 풍부도 데이터에 시도된 일치
7. 머스 머스큘러스 유니포트 데이터를 이용하여 글리코사이트 및 글리코사이트/AA의 시도된 식별
8. 정의된 기준에 따라 순위 매김 (표 E4).
추가 a-priori 표적 세트는 위에서 정의된 대부분의 기준과 일치하지만 기능하는 CHO 세포 발현 시스템에 매우 중요한 것으로 나타난 두 개의 음성 표적 (클러스테린 ― Clu 및 14-3-3 단백질 엡실론-YWHAE)과 함께 이들의 인식된 중복성에 기인하여 선택되었다 (피브로넥틴 ― Fn1 및 헤파린 설페이트 프로테오글리칸 ― HSPG2). 시험하기 위한 20개 표적의 최종 목록은 표 E5에 나타나있다.
실시예 2: 내인성 단백질의 녹아웃 및 생성물의 수율 증가
지정된 유전자, 예를 들어, 내인성 단백질, 예를 들어, 세포외, 분비 및/또는 중복 단백질을 인코딩하는 유전자 (예를 들어, 실시예 1에서 결정된 유전자, 예를 들어, 표 E5)의 매우 특이적인 표적 녹다운은 Cas9 뉴클레아제의 사용을 통하여 수행되었고 재조합 단백질 생산에 미치는 영향이 평가되었다. 향상된 특이성 Cas9 (eCas9 1.1) (Slaymaker 등, 2016)를 활용하여 GFP에 융합된 2A 펩타이드는 Cas9 뉴클레아제 활성을 가진 세포의 높은 처리량 분리를 허용하여 잠재적으로 다중송신된 게놈 편집을 허용한다 (Lonowski 등 2017 Nat Protoc. 2017 Mar;12(3):581-603. doi: 10.1038/nprot.2016.165).
내인성 단백질, 예를 들어, 세포외, 분비 및/또는 중복 단백질을 인코딩하는 유전자를 성공적으로 녹아웃함에 의해 중복, 경쟁 단백질 (예를 들어, 생성물 (즉, 생성물을 인코딩하는 mRNA)과 번역 및 ER/골지 자원에 대해 경쟁하는 단백질 (예를 들어, 단백질을 인코딩하는 mRNA))을 결하는 최소 CHO 게놈이 생성될 수 있다. 이는 경쟁력 있는 바이오 의약품의 생산에 필요한 높은 역가 및 성장률의 요구에 더 적합한 향상된 성장 및 생산 특성으로 보다 간소화된 게놈 및 프로테옴을 생성하는 데 도움이 될 것이다.
일부 실시형태에서, CHO 게놈으로부터 기능적으로 중복된 분비 유전자의 녹아웃은 성장 속도 및 발현 능력을 향상시킬 수 있는 향상된 세포주를 생성할 것이다.
표 E5에서 확인된 유전자 녹아웃 표적을 처음 스크리닝하기 위해, 각 유전자 표적은 상기에 언급된 Cas9-GFP 뉴클레아제뿐만 아니라 구성적 U6 프로모터로부터 발현된 유전자 표적-특이적 가이드 RNA(들) 둘 모두를 인코딩하는 플라스미드 (pX458)로 일시적 형질감염에 의해 IgG4 Mab-생성 클론 GS-CHOK1SV 세포주에서 개별적으로 녹아웃되었다. 형질감염 48시간 후 형질감염된 세포의 이종성 풀을 FACS에 의해 높은 GFP 발현 (높은 Cas9 뉴클레아제 활성에 대한 프록시)에 대해 분류하고, ≥0.5 x 10^6 생존 세포로 선택하며 추가 배양을 위해 풀링하고, 이어서 성장, Mab 생산성 및 유전자 녹아웃 성공에 대해 평가했다.
구체적으로, IgG4 Mab를 만드는 GS-CHOK1V 세포주는 1) CMV 프로모터에서 발현된 Cas9-GFP 뉴클레아제 융합 단백질, 및 2) 구성적 U6 프로모터에서 발현되는, 그것의 게놈에서의 표적 유전자에 특이적인 가이드 RNA(들)를 함유하는 플라스미드 (pX458)로 일시적으로 형질감염되었다. 형질감염 48시간 후 형질감염제 풀을 FACS에 의해 높은 GFP 발현에 대해 분류하며, ≥0.5 x 10^6 세포로 수집하고 새 플라스크에 모았다. 72시간 후 세포 배양물을 원심 분리하고 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 새로운 플라스크 내에서 0.2 x 10^6 생존 세포/mL의 최종 농도로 재현탁하였으며, 이어서 ≥5일 동안 성장시킨 후 ValitaTITER (Valitacell, 아일랜드 더불린 소재)에 의해 Mab 역가를 측정하고 세포 계수를 자동화된 세포 카운팅 (ViCell― Beckman Coulter, 영국 하이위컴 소재)에 의해 결정하였다. 표시된 표적 유전자에 특이적인 gRNA를 함유하는 pX458 벡터로 형질감염된 GS-CHOK1SV 세포의 FACS-분류된 풀의 qP에서의 백분율 변화를 계산하였다. 모든 데이터 포인트는 Cas9-GFP 뉴클레아제 융합 단백질을 발현하지만 gRNA가 없는 pX458로 형질감염된 대조군 GS-CHOK1SV 세포에 비하여 표현된다.
gRNA에 의해 유전자 Lamb1, Mfge8, Sbsn, C1S, C1R, Nid1, Dcn, B2M 및 Clu에 대한 Cas9-GFP 뉴클레아제의 표적화는 gRNA가 없는 pX458 벡터로 형질감염된 대조군 GS-CHOK1SV 세포에 비하여 GS-CHOK1SV 세포의 FACS-분류된 풀의 중간 평균 qP를 증가시켰다 (도 1a).
특정 유전자에 표적화된 Cas9-GFP 유전자 편집의 성공 여부를 결정하기 위해, FACS-분류된 세포에서 게놈 DNA를 추출하고 TIDE 분석에 의해 평가했다 (Brinkman 등 2014, Nucleic Acids Res. 2014 Dec 16;42(22):e168. doi: 10.1093/nar/gku936). 결과는, ≥60 내지 90%의 범위인, 이 방법에 의해 달성된 높은 비율의 표적화된 유전자 인델을 입증하여 (도 1b), 표현형 판독값 (즉, 관찰된 qP의 증가)이 풀에서 유전자 편집의 기능임을 강력하게 시사하였다.
실시예 3: 내인성 표적의 다중-유전자 녹아웃 및 생성물의 수율에서의 증가.
실시예 2에 제시된 데이터는 부분적으로 세포에서 비-필수, 중복 및/또는 분비된 내인성 단백질을 인코딩하는 여러 내인성 유전자가 개별적으로 녹아웃되어 CHO 세포주로부터 Mab의 수율을 증가시킬 수 있음을 시사한다. 세포 분비 장치를 통과하는 내인성 단백질의 수가 매우 높기 때문에, 이 전략을 사용하여 얻은 qP에서의 증가를 최대화하기 위해 필수, 중복 및/또는 분비 내인성 단백질을 인코딩하는 다수의 유전자를 제거해야 할 필요가 있을 가능성이 높다. 이를 테스트하기 위해, 유전자는 Lamb1, Mfge8, Sbsn, C1S, C1R, Nid1, Dcn, B2M 및 Clu를 표적으로 하며, 이는 개별적으로 녹아웃되었을 때 qP에서 가장 높은 증가와 상관관계가 있고 (도 1), 실시예 1 및 2의 기술을 사용하지만 (표 E6), 동일한 CHO 염색체에 위치한 표적의 조합 (C1S 및 C1R, Mfge8 및 Nid1, Dcn 및 Clu)을 피하는 GS-CHOK1SV 세포주 내에서 무작위, 삼중 조합으로 녹아웃되어, 대규모 게놈 재조합의 위험을 감소시킨다. 삼중으로 조합했을 때, 예를 들어, C1S, Dcn 및 Lamb1에 대한 평균 역가 및 qP에서의 실질적인 증가와 상관관계가 있는 유전자 표적의 일부 조합은 gRNA가 없는 pX458 벡터로 형질감염된 대조군 GS-CHOK1SV 세포와 비교하여, 삼중 녹아웃 풀에서 조합될 때 역가에서 25% 및 qP에서 28%의 평균 증가를 입증했다 (표 E7).
실시예 4: 표
표 E1 ― PANTHER 할당 키워드 ― 추가 분석을 위해 강조표시된 유전자
Figure pct00024
표 E2 ― PANTHER 할당 키워드 ― 추가 분석으로부터 제거된 유전자
Figure pct00025
표 E3 ― Kumar et al (2015) 및 Park et al ( 2017)에서 풍부 수준에 대한 기준
Figure pct00026
표 E4 ― 표적 순위에 고려되는 최종 기준
Figure pct00027
표 E5 ― 표적 게놈 ID
Figure pct00028
Figure pct00029
표 E6 ― 녹아웃 유전자의 랜덤 삼중 조합
Figure pct00030
표 E7 표적 유전자의 랜덤, 삼중 조합에 특이적인 gRNA를 함유하는 pX458에 의해 형질 감염된 FACS -분류 풀의 Mab 역가 , qP 및 성장 (생존 세포 밀도의 통합, IVCD)에서의 백분율 변화. 모든 값은 gRNA가 없는 pX458로 형질감염된 대조군 세포에 비하여 명시된다.
Figure pct00031
실시예 5: 참고문헌
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등가물
당업자는 단지 일상적인 실험을 사용하여 본 명세서에 기술된 본 발명의 특정한 실시형태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 다음의 청구항에 포괄되도록 의도된다.
본 발명은 열거된 청구항 중 하나 이상으로부터의 하나 이상의 제한, 요소, 절 및 설명 용어가 다른 청구항에 도입되는 모든 변형, 조합 및 순열을 포함한다. 예를 들어, 마쿠쉬 그룹 형식 또는 대안으로 요소가 목록으로 표시되는 경우, 요소의 각 하위 그룹도 공개되고 모든 요소(들)가 그룹에서 제거될 수 있다.
일반적으로, 본 발명 또는 본 발명의 측면이 특정 요소 및/또는 특징을 포함하는 것으로 언급되는 경우, 본 발명의 특정 실시형태 또는 본 발명의 양태는 이러한 요소 및/또는 기능으로 구성되거나, 또는 본질적으로 구성된다는 것을 이해해야 한다. 용어 "포함하는" 및 "함유하는"은 개방적이며 추가 요소 또는 단계의 포함을 허용하도록 의도된다는 점에 또한 유의한다. 범위가 제공되는 경우, 종점이 포함된다. 더욱이, 달리 표시되거나 당업자의 문맥 및 이해로부터 달리 명백하지 않는 한, 범위로 표현된 값은, 문맥상 달리 명시되지 않는 한, 범위 하한 단위의 10분의 1까지 본 발명의 다른 실시형태에서 언급된 범위 내의 임의의 특정 값 또는 하위-범위를 가정할 수 있다.

Claims (63)

  1. 세포, 예를 들어, 생산 세포에서 생성물, 예를 들어, 재조합 폴리펩타이드를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
    상기 세포, 예를 들어, 생산 세포에서 내인성 단백질의 수준을 감소시키는 단계를 포함하고,
    이에 의해 상기 생성물을 제조하는, 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 세포는 생산 세포인, 방법.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 생성물, 예를 들어, 재조합 폴리펩타이드를 생산하기에 적합한 조건하에서 상기 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, 세포, 예를 들어, 생산 세포를 제공하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  5. 세포, 예를 들어, 생산 세포에서 생성물, 예를 들어, 재조합 폴리펩타이드를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
    세포, 예를 들어, 생산 세포를 제공하는 단계,
    상기 세포, 예를 들어, 생산 세포에서 내인성 단백질의 수준을 감소시키는 단계, 및
    상기 생성물, 예를 들어, 재조합 폴리펩타이드를 생산하기에 적합한 조건하에서 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하고,
    이에 의해 생성물을 제조하는, 방법.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서, 생성물을 수확하는 단계, 예를 들어, 생산 혼합물로부터 상기 생성물을 분리하는 단계 및/또는, 예를 들어, 본 명세서에 기술되거나 당업계에 공지된 방법에 의해 생성물의 정제된 제제를 제공하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  7. 세포, 예를 들어, 생산 세포를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
    상기 세포, 예를 들어, 생산 세포에서 내인성 단백질의 수준을 감소시키되,
    여기서 상기 세포, 예를 들어, 생산 세포는 생성물, 예를 들어, 재조합 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 것인 단계를 포함하는, 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 세포, 예를 들어, 생산 세포를 제공하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  9. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내인성 단백질은 비-필수 단백질 (예를 들어, 상기 단백질의 수준 감소 또는 완전한 손실이 세포 생존성 또는 생성물 생산에 유의하게 해로운 영향을 미치지 않음)인, 방법.
  10. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내인성 단백질은 세포외 단백질인, 방법.
  11. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내인성 단백질은 분비 단백질인, 방법.
  12. 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내인성 단백질은 골지 장치에 국재화되는, 방법.
  13. 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내인성 단백질은 소포체 (ER)에 국재화되는, 방법.
  14. 청구항 1 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내인성 단백질은 중복(redundant) 단백질 (예를 들어, 단백질의 기능성 또는 활성이 상기 세포에 존재하는 다른 내인성 단백질의 기능성 또는 활성과 유의하게 (예를 들어, 부분적으로 또는 완전히) 중첩됨)인, 방법.
  15. 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내인성 단백질은 실시예 1의 방법에 의해, 예를 들어, 표 E1의 키워드와의 연관, 표 E2의 키워드와의 비-연관에 의해 동정 및/또는 선택되고/되거나, 분비 단백질인 것으로 예측되는, 방법.
  16. 청구항 1 내지 청구항 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내인성 단백질은 표 E5로부터 선택되는, 방법.
  17. 청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 있어서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과 (예를 들어, 20개 또는 그 초과)의 내인성 단백질의 수준이 감소되는, 방법.
  18. 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 있어서, 표 E6에 열거된 유전자 조합 중 1, 2 또는 3개 유전자에 의해 인코딩된 내인성 단백질의 수준이 감소되는, 방법.
  19. 청구항 1 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 있어서, 세포에서 내인성 단백질의 수준을 감소시키는 단계는 세포의 게놈으로부터 내인성 단백질을 인코딩하는 유전자의 카피 또는 내인성 단백질을 인코딩하는 유전자에 작동 가능하게 결합된 조절 핵산 서열, 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서를 제거, 예를 들어, 녹아웃시키는 단계를 포함하는, 방법.
  20. 청구항 1 내지 청구항 19 중 어느 한 항에 있어서, 세포에서 내인성 단백질의 수준을 감소시키는 단계는 세포의 게놈으로부터 내인성 단백질을 인코딩하는 유전자의 카피 또는 내인성 단백질을 인코딩하는 유전자에 작동 가능하게 결합된 조절 핵산 서열, 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서를 모두 (예를 들어, 둘 모두) 제거, 예를 들어, 녹아웃시키는 단계를 포함하는, 방법.
  21. 청구항 19 또는 청구항 20에 있어서, 제거, 예를 들어, 녹아웃시키는 단계는 내인성 단백질을 인코딩하는 유전자 또는 상기 내인성 단백질을 인코딩하는 유전자에 작동 가능하게 결합된 조절 핵산 서열, 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서에 결실, 치환 또는 삽입 돌연변이를 도입하는 단계를 포함하며, 예를 들어, 상기 돌연변이는 내인성 단백질의 발현 수준을 감소시키는 것인, 방법.
  22. 청구항 21에 있어서, 제거, 예를 들어, 녹아웃시키는 단계는 내인성 단백질을 인코딩하는 유전자에서 또는 내인성 단백질을 인코딩하는 유전자에 작동 가능하게 결합된 조절 핵산 서열, 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 9, 10개 또는 그 초과의 염기쌍의 결실 또는 삽입을 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
  23. 청구항 21에 있어서, 제거, 예를 들어, 녹아웃시키는 단계는 내인성 단백질을 인코딩하는 유전자에서 또는 내인성 단백질을 인코딩하는 유전자에 작동 가능하게 결합된 조절 핵산 서열, 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 염기쌍이 상이한 염기쌍을 대체하는 단계 (예를 들어, 전이 또는 전좌 돌연변이)를 포함하는, 방법.
  24. 청구항 19 내지 청구항 23 중 어느 한 항에 있어서, 제거, 예를 들어, 녹아웃시키는 단계는 내인성 단백질 인코딩 유전자 또는 상기 내인성 단백질을 인코딩하는 유전자에 작동 가능하게 결합된 조절 핵산 서열, 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서에 특이적인, CRISPR-Cas9 분자, 예를 들어, Cas9 분자를 RNA (예를 들어, gRNA, sgRNA 및/또는 tracrRNA)와 조합하여 사용하는 단계를 포함하는, 방법.
  25. 청구항 24에 있어서, CRISPR-Cas9 분자를 사용하는 단계는
    세포에서 내인성 단백질 인코딩 유전자 또는 상기 내인성 단백질을 인코딩하는 유전자에 작동 가능하게 결합된 조절 핵산 서열, 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서에 특이적인, CRISPR-Cas9 분자 (예를 들어, Cas9 분자), 및 RNA (예를 들어, gRNA, sgRNA 및/또는 tracrRNA)를 제공하는 단계; 또는
    세포에서 내인성 단백질 인코딩 유전자 또는 상기 내인성 단백질을 인코딩하는 유전자에 작동 가능하게 결합된 조절 핵산 서열, 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서에 특이적인 CRISPR-Cas9 분자 (예를 들어, Cas9 분자)를 인코딩하는 핵산, 및 RNA (예를 들어, gRNA, sgRNA 및/또는 tracrRNA)를 제공하는 단계를 포함하는, 방법.
  26. 청구항 1 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 있어서, 세포에서 내인성 단백질의 수준을 감소시키는 단계는 내인성 단백질을 인코딩하는 핵산, 예를 들어, mRNA 또는 이에 작동 가능하게 연결된 조절 핵산 서열, 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서에 결합할 수 있는, 예를 들어, siRNA를 사용하는 단계를 포함하는, 방법.
  27. 청구항 26에 있어서, siRNA를 사용하는 단계는
    세포에서 siRNA를 제공하는 단계, 또는
    세포에서 siRNA를 인코딩하는 핵산을 제공하는 단계를 포함하는, 방법.
  28. 청구항 26 또는 청구항 27에 있어서, siRNA는 Dharmacon Horizon siDesign 도구(tool), InvivoGen siRNA Wizard, GenScript siRNA 작제물 서비스, IDT Custom Dicer-Substrate siRNA, Sigma-Aldrich siRNA 디자인 서비스 또는 www.rnaiweb.com/RNAi/siRNA_Design/에 의해 교시된 것으로부터 선택된 또는 이와 동등한 방법에 의해 설계, 선택 또는 생성되는, 방법.
  29. 생성물, 예를 들어, 재조합 폴리펩타이드를 생산할 수 있는 세포, 예를 들어, 생산 세포로서, 상기 세포, 예를 들어, 생산 세포는 내인성 단백질을 인코딩하는 유전자의 카피 또는 상기 내인성 단백질을 인코딩하는 유전자에 작동 가능하게 결합된 조절 핵산 서열, 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서에 결실, 치환 또는 삽입 돌연변이를 포함하며, 예를 들어, 상기 돌연변이는 내인성 단백질의 발현 수준을 감소시키는 것인, 세포.
  30. 청구항 29에 있어서, 상기 세포는 내인성 단백질을 인코딩하는 유전자의 카피 또는 상기 내인성 단백질을 인코딩하는 유전자에 작동 가능하게 결합된 조절 핵산 서열, 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서 모두 (예를 들어, 둘 모두)에 결실, 치환 또는 삽입 돌연변이를 포함하며, 예를 들어, 상기 돌연변이는 상기 내인성 단백질의 발현 수준을 감소시키는 것인, 세포.
  31. 청구항 29 또는 청구항 30에 있어서, 상기 세포는 상기 내인성 단백질을 인코딩하는 유전자의 기능적 카피 또는 상기 내인성 단백질을 인코딩하는 유전자에 작동 가능하게 결합된 조절 핵산 서열, 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서를 포함하지 않는, 세포.
  32. 생성물, 예를 들어, 재조합 폴리펩타이드를 생산할 수 있는 세포, 예를 들어, 생산 세포로서, 상기 세포는 내인성 단백질을 인코딩하는 핵산, 예를 들어, mRNA 또는 이에 작동 가능하게 연결된 조절 요소, 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서에 결합할 수 있는, 예를 들어, siRNA를 포함하는, 세포.
  33. 청구항 29 내지 청구항 32 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내인성 단백질은 비-필수 단백질 (예를 들어, 단백질의 수준 감소 또는 완전 손실이 세포 생존성 또는 생성물 생산에 유의하게 해로운 영향을 미치지 않음)인, 세포.
  34. 청구항 29 내지 청구항 32 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내인성 단백질은 세포외 단백질인, 세포.
  35. 청구항 29 내지 청구항 32 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내인성 단백질은 분비 단백질인, 세포.
  36. 청구항 29 내지 청구항 32 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내인성 단백질은 중복 단백질 (예를 들어, 단백질의 기능성 또는 활성이 세포에 존재하는 다른 내인성 단백질의 기능성 또는 활성과 유의하게 (예를 들어, 부분적으로 또는 완전히) 중첩됨)인, 세포.
  37. 청구항 29 내지 청구항 32 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내인성 단백질은 표 E5로부터 선택되는, 세포.
  38. 청구항 29 내지 청구항 37 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 제2 내인성 단백질을 인코딩하는 유전자의 카피 또는 상기 제2 내인성 단백질을 인코딩하는 유전자에 작동 가능하게 결합된 조절 핵산 서열, 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서에 결실, 치환 또는 삽입 돌연변이를 추가로 포함하며, 예를 들어, 상기 돌연변이는 상기 제2 내인성 단백질의 발현 수준을 감소시키는 것인, 세포.
  39. 청구항 38에 있어서, 상기 제2 내인성 단백질은 표 E5로부터 선택되는, 세포.
  40. 청구항 38 또는 청구항 39에 있어서, 상기 세포는 제3 내인성 단백질을 인코딩하는 유전자의 카피 또는 상기 제3 내인성 단백질을 인코딩하는 유전자에 작동 가능하게 결합된 조절 핵산 서열, 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서에 결실, 치환 또는 삽입 돌연변이를 추가로 포함하며, 예를 들어, 상기 돌연변이는 상기 제3 내인성 단백질의 발현 수준을 감소시키는 것인, 세포.
  41. 청구항 40에 있어서, 상기 제3 내인성 단백질이 표 E5로부터 선택되는, 세포.
  42. 청구항 38 내지 청구항 41 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2, 또는 제1, 제2 및 제3 내인성 단백질은 표 E6에 열거된 유전자 조합 중 2개 또는 3개 유전자에 의해 인코딩되는, 세포.
  43. 청구항 29 내지 청구항 42 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내인성 단백질은 골지 장치에 국재화된, 세포.
  44. 청구항 29 내지 청구항 42 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내인성 단백질은 소포체 (ER)에 국재화된, 세포.
  45. 청구항 1 내지 44 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포, 예를 들어, 생산 세포는 CHO-K1 세포, CHO-K1 SV 세포, DG44 CHO 세포, DUXB11 CHO 세포, CHOS, CHO GS 녹-아웃 세포 (예를 들어, CHO-K1SV GS 녹아웃 세포), CHO FUT8 GS 녹-아웃 세포 (예를 들어, Potelligent® CHOK1 SV), CHOZN 또는 CHO-유래 세포인, 방법 또는 세포.
  46. 청구항 1 내지 44 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포, 예를 들어, 생산 세포는 CHO-GSKO 세포, CHO Xceed™ 세포 CHO GS 녹-아웃 세포 (예를 들어, GS-CHO 세포), CHO-K1SV™ GS 녹아웃 세포, 또는 Potelligent® CHOK1 SV인, 방법 또는 세포.
  47. 청구항 1 내지 44 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포, 예를 들어, 생산 세포는 HeIa, HEK293, HT1080, H9, HepG2, MCF7, 저캣, NIH3T3, PC12, PER.C6, BHK (베이비 햄스터 신장 세포), VERO, SP2/0, NS0, YB2/0, Y0, EB66, C127, L 세포, COS, 예를 들어, COS1 및 COS7, QC1-3, CHOK1, CHOK1SV, 포텔리전트 CHOK1SV, CHO GS 녹아웃, CHOK1SV GS-KO, CHOS, CHO DG44, CHO DXB11 또는 CHOZN, 또는 이들로부터 유래된 임의의 세포인, 방법 또는 세포.
  48. 청구항 1 내지 청구항 47 중 어느 한 항의 방법 또는 세포에 의해 생산된 생성물, 예를 들어, 재조합 폴리펩타이드.
  49. 청구항 48의 생성물, 예를 들어, 재조합 폴리펩타이드를 포함하는 약학적 조성물.
  50. 청구항 49에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함하는, 약학적 조성물.
  51. 청구항 1 내지 청구항 47 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생성물, 예를 들어, 재조합 폴리펩타이드는 이중특이적 항체를 포함하는, 방법 또는 세포.
  52. 청구항 1 내지 청구항 47 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생성물, 예를 들어, 재조합 폴리펩타이드는 표 1, 표 2, 표 3 또는 표 4에 열거된 단백질인, 방법 또는 세포.
  53. 청구항 1 내지 청구항 47 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생성물은 항체, 예를 들어, 모노클로날 항체, 예를 들어, IgG1 항체인, 방법 또는 세포.
  54. 청구항 1 내지 청구항 47 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포, 예를 들어, 생산 세포는 포유동물 세포, 예를 들어, 마우스, 랫트, 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO) 세포, 시리아 햄스터, 원숭이, 유인원, 개, 말, 흰족제비 또는 고양이 세포로부터 유래되는, 방법 또는 세포.
  55. 청구항 1 내지 청구항 47 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포, 예를 들어, 생산 세포는 비-포유동물 세포, 예를 들어, 오리, 앵무새, 어류, 곤충, 식물, 진균, 효모, 박테리아. 예를 들어 대장균, 예를 들어, 고세균 (Archaebacteria) 또는 방선균 (Actinobacteria)으로부터 유래된 세포로부터 유래되는, 방법 또는 세포.
  56. 청구항 1 내지 청구항 47 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포, 예를 들어, 생산 세포는 줄기 세포인, 방법 또는 세포.
  57. 청구항 1 내지 청구항 47 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포, 예를 들어, 생산 세포는 본 명세서에 기재된 임의의 세포의 분화된 형태인, 방법 또는 세포.
  58. 청구항 1 내지 청구항 47 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포, 예를 들어, 생산 세포는 배양 중인 임의의 1차 세포로부터 유래된 세포인, 방법 또는 세포.
  59. 청구항 1 내지 청구항 47 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포, 예를 들어, 생산 세포는 CHOK1SV, GS-KO, 또는 DUX-B11 세포인, 방법 또는 세포.
  60. 청구항 1 내지 청구항 59 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 생물 반응기, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 생물 반응기에서 사용하기에 적합하거나, 또는 상기 세포는 생물 반응기, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 생물 반응기에서 배양/성장할 수 있는, 방법 또는 세포.
  61. 표 E5로부터 선택된 내인성 단백질을 인코딩하는 핵산, 예를 들어, mRNA에 결합할 수 있는 siRNA.
  62. 청구항 61에 있어서, 상기 siRNA는 Dharmacon Horizon siDesign 도구, InvivoGen siRNA Wizard, GenScript siRNA 작제물 서비스, IDT Custom Dicer-Substrate siRNA, Sigma-Aldrich siRNA 디자인 서비스 또는 www.rnaiweb.com/RNAi/siRNA_Design/에 의해 교시된 것으로부터 선택된 또는 이와 동등한 방법에 의해 설계, 선택 또는 생성되는, siRNA.
  63. 청구항 61 또는 청구항 62에 있어서, 청구항 1 내지 청구항 47 또는 청구항 51 내지 청구항 60 중 어느 한 항의 방법 또는 세포에서 사용하기 위한 siRNA.
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