JP2015527889A - 誘導可能なdna結合タンパク質およびゲノム撹乱ツール、ならびにそれらの適用 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2012年7月25日出願の米国仮特許出願第61/675,778号、2012年11月1日出願の米国仮特許出願第61/721,283号、2012年12月12日出願の米国仮特許出願第61/736,465号、2013年3月15日出願の米国仮特許出願第61/794,458号および2013年6月17日出願の米国仮特許出願第61/835,973号、表題INDUCIBLE DNA BINDING PROTEINS AND GENOME PERTURBATION TOOLS AND APPLICATIONS THEREOFに対する優先権およびその利益を主張する。
本発明は、National Institutes of Healthによって授与されたR01NS073124およびPioneer Award 1DP1MH100706の下で、政府の支持によって行われた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
(i)エネルギー感受性タンパク質またはその断片に連結された、
目的の遺伝子座を標的化するために特異的に順序付けられた少なくとも5つ以上の転写アクチベーター様エフェクター(TALE)モノマーおよび少なくとも1つもしくは複数の半モノマーを含むDNA結合ドメイン、または
少なくとも1つもしくは複数のエフェクタードメインであって、
このエネルギー感受性タンパク質もしくはその断片は、インデューサーエネルギー供給源による誘導の際にコンフォメーション変化を受けて、相互作用パートナーと結合することが可能になる、DNA結合ドメインまたはエフェクタードメイン、ならびに/または
(ii)相互作用パートナーに連結された、
目的の遺伝子座を標的化するために特異的に順序付けられた少なくとも1つもしくは複数のTALEモノマーもしくは半モノマーを含むDNA結合ドメイン、または
少なくとも1つもしくは複数のエフェクタードメインであって、
このエネルギー感受性タンパク質もしくはその断片は、インデューサーエネルギー供給源による誘導の際に相互作用パートナーと結合する、DNA結合ドメインまたはエフェクタードメイン、
を含む。
クルメイト配列およびトラクル配列は、同じプロモーターに作動可能に連結され、同じプロモーターから発現される。
内因性哺乳動物ゲノムからの遺伝子発現を直接モジュレートする能力は、正常な遺伝子機能および疾患機構を解明するために重要である。細胞集団内の遺伝子発現の空間的および時間的制御をさらに精緻化する進歩は、遺伝子モジュレーションの有用性を拡張する潜在性を有する。本出願人らは、イネ白葉枯病菌(Xanthamonas oryze)由来の転写アクチベーター様エフェクター(TALE)を以前に開発して、部位特異的DNA結合タンパク質の迅速な設計および構築を可能にした。本出願人らは、内因性哺乳動物ゲノムにおける光調節される遺伝子発現を可能にするための分子ツールのセットを開発した。この系は、シロイヌナズナ由来の光感受性ダイマー化タンパク質ドメインに連結された操作された人工転写因子からなる。この系は、450nm〜500nmの範囲の光に応答し、哺乳動物細胞において6.2mW/cm2の強度の光での刺激の後に、多能性因子の発現における顕著な増加を誘導することが可能である。本出願人らは、広い範囲の遺伝子の標的化のためのツールを開発している。本出願人らは、遺伝子発現の光媒介性制御のためのツールボックスが、既存の光遺伝学的方法を補完し、脳における特定の遺伝子のタイミング依存的、細胞型依存的および濃度依存的な役割を解明することをさらに助け得る。
正常な遺伝子発現は、注意深く組織化された時間的および空間的成分を有する動的なプロセスであり、その正確さは、生物の正常な発生、恒常性および進歩に必要である。次に、遺伝子または遺伝子のセットの増加、減少または変更された機能のいずれかによる、必要な遺伝子発現パターンの調節不全は、広い種々の病理と関連付けられてきた。時空間的に正確な様式で遺伝子発現をモジュレートすることが可能なテクノロジーは、正常な生物学的プロセスおよび疾患機構を担う遺伝子合図の解明を可能にする。この技術的要求に対処するために、本出願人らは、内因性遺伝子発現の光媒介性制御を提供する、光誘導可能な転写エフェクター(LITE)を開発した。
哺乳動物TALE転写リプレッサーの開発
本出願人らは、哺乳動物TALEリプレッサーアーキテクチャーを開発して、研究者が内因性遺伝子の転写を抑圧できるようにした。TALEリプレッサーは、遺伝子および非コード転写物、例えばmicroRNAの発現を抑圧する潜在力を有し、これらを、特異的遺伝子エレメントの因果的役割を試験するための高度に望ましいツールにしている。哺乳動物細胞においてTALEと共に使用するための適切な抑制ドメインを同定するために、ヒトSOX2遺伝子のプロモーターを標的化するTALEを使用して、候補抑制ドメインのコレクションの転写抑制活性を評価した(図12a)。ある範囲の真核生物宿主種にわたる抑制ドメインを選択して、カエノラブディティス・エレガンス由来のPIE-1抑制ドメイン(PIE-1)(Batchelder, C.ら Transcriptional repression by the Caenorhabditis elegans germ-line protein PIE-1. Genes Dev. 13、202〜212 (1999))、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)由来のUbx遺伝子内のQAドメイン(Ubx-QA)(Tour, E.、Hittinger, C.T.およびMcGinnis, W. Evolutionarily conserved domains required for activation and repression functions of the Drosophila Hox protein Ultrabithorax. Development 132、5271〜5281 (2005))、シロイヌナズナ由来のIAA28抑制ドメイン(IAA28-RD)(4)、mSin相互作用ドメイン(SID)(Ayer, D.E.、Laherty, CD.、Lawrence, Q.A.、Armstrong, A.P.およびEisenman, R.N. Mad proteins contain a dominant transcription repression domain. Mol. Cell. Biol. 16、5772〜5781 (1996))、Tbx3抑制ドメイン(Tbx3-RD)、およびヒト(Homo Sapiens)由来のクルッペル会合ボックス(KRAB)(Margolin, J.F.ら Kruppel-associated boxes are potent transcriptional repression domains. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 91、4509〜4513 (1994))抑制ドメインを含む強力な合成リプレッサーを見出す機会を増加させた。KRABの異なる短縮は、変動するレベルの転写抑制を示すことが知られているので(Margolin, J.F.ら Kruppel-associated boxes are potent transcriptional repression domains. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 91、4509〜4513 (1994))、KRABの3つの異なる短縮を試験した(図12c)。これらの候補TALEリプレッサーを、HEK293FT細胞中で発現させ、2つの広く使用される哺乳動物転写抑制ドメインSID(Ayer, D.E.、Laherty, CD.、Lawrence, Q.A.、Armstrong, A.P.およびEisenman, R.N. Mad proteins contain a dominant transcription repression domain. Mol. Cell. Biol. 16、5772〜5781 (1996))およびKRAB(Margolin, J.F.ら Kruppel-associated boxes are potent transcriptional repression domains. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 91、4509〜4513 (1994))ドメインを保有するTALEは、内因性SOX2発現を抑制することができたが、他のドメインは転写活性に対する影響をほとんど有さなかったことが見出された(図12c)。TALE結合に起因するSOX2転写の起こり得る撹乱について制御するために、いずれのエフェクタードメインも有さないSOX2標的化TALE DNA結合ドメイン単独の発現は、SOX2の転写活性に対して影響を有さなかった(モックまたはGFPの発現と類似)(図12c、ヌル条件)。SIDドメインは、KRABドメインよりも、内因性SOX2遺伝子座の26%高い転写抑制を達成することができたので(図12c)、引き続く研究のためにSIDドメインを使用することを決定した。
哺乳動物TALE転写アクチベーターおよびヌクレアーゼの開発
カスタム化したTALEは、転写モジュレーションおよびゲノム編集を含む広範な種々のゲノム操作適用に使用され得る。本明細書で、本出願人らは、階層的ライゲーション手順を使用したカスタムTALE転写因子(TALE-TF)およびヌクレアーゼ(TALEN)の迅速な構築のためのツールボックスを記載している。このツールボックスは、1週間以内のカスタムTALE-TFおよびTALENの手頃かつ迅速な効率を促進し、複数の標的についてTALEを並行して構築するために、容易にスケールアップされ得る。本出願人らは、それぞれ定量的逆転写PCRおよびSurveyorヌクレアーゼを使用して、哺乳動物細胞におけるカスタムTALE-TFおよびTALENの活性を試験するための詳細もまた提供している。このTALEツールボックスは、広範な生物学的適用を可能にする。TALEは、細菌コロニー形成を促進するために宿主植物における遺伝子転写をモジュレートするために、ザントモナス属種によって使用される天然の細菌エフェクタータンパク質である(Boch, J.およびBonas, U. Xanthomonas AvrBs3 family-type III effectors: discovery and function. Annu. Rev. Phytopathol. 48、419〜436 (2010)ならびにBogdanove, A. J.、Schornack, S.およびLahaye, T. TAL effectors: finding plant genes for disease and defense. Curr. Opin. Plant Biol. 13、394〜401 (2010))。このタンパク質の中心領域は、DNAの認識および結合に必要とされる34aaの配列(モノマーと呼ぶ)のタンデムリピートを含む(Romer, P.ら Plant pathogen recognition mediated by promoter activation of the pepper Bs3 resistance gene. Science 318、645〜648 (2007);Kay, S.、Hahn, S.、Marois, E.、Hause, G.およびBonas, U. A bacterial effector acts as a plant transcription factor and induces a cell size regulator. Science 318、648〜651 (2007);Kay, S.、Hahn, S.、Marois, E.、Wieduwild, R.およびBonas, U. Detailed analysis of the DNA recognition motifs of the Xanthomonas type III effectors AvrBs3 and AvrBs3Deltarepl6. Plant J. 59、859〜871 (2009)ならびにRomer, P.ら Recognition of AvrBs3-like proteins is mediated by specific binding to promoters of matching pepper Bs3 alleles. Plant Physiol. 150、1697〜1712 (2009))(図8)。天然に存在するTALEは、1.5〜33.5の範囲の可変性の数のモノマーを有することが見出されている(Boch, J.およびBonas, U. Xanthomonas AvrBs3 family-type III effectors: discovery and function. Annu. Rev. Phytopathol. 48、419〜436 (2010))。各モノマーの配列は高度に保存されているが、これらは、リピート可変二残基(RVD、12番目および13番目の位置)と称される2つの位置において主に異なる。最近の報告は、これら2つの残基の正体が、各TALEリピートのヌクレオチド結合特異性を決定すること、および単純な暗号が各RVDの標的塩基を特定すること(NI=A、HD=C、NG=T、NN=GまたはA)を見出している(Boch, J.ら Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors. Science 326、1509〜1512 (2009)ならびにMoscou, M.J.およびBogdanove, A.J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science 326、1501 (2009))。従って、各モノマーは、1つのヌクレオチドを標的化し、TALE中のモノマーの直鎖状配列は、5'から3'の配向で標的DNA配列を特定する。植物ゲノム内の天然のTALE結合部位は通常、TALEの非反復N末端内の潜在性シグナルによっておそらくは特定されるチミンで始まる(Boch, J.ら Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors. Science 326、1509〜1512 (2009)ならびにMoscou, M.J.およびBogdanove, A.J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science 326、1501 (2009))。タンデムリピートDNA結合ドメインは通常、半分長のリピート(0.5リピート、図8)で終わる。従って、標的化されるDNA配列の長さは、完全リピートモノマーの数プラス2と等しい。
図17は、LITE機能性に対するクリプトクロム2ヘテロダイマー配向の影響を示す。2つのバージョンのニューロゲニン2(Neurog2)LITEを合成して、クリプトクロム2フォトリアーゼ相同性領域(CRY2PHR)/カルシウムおよびインテグリン結合タンパク質1(CIB1)ダイマー配向の影響を調査した。1つのバージョンでは、CIB1ドメインを、TALE(Neurog2)ドメインのC末端に融合させ、CRY2PHRドメインを、VP64ドメインのN末端に融合させた。逆のバージョンでは、CRY2PHRドメインを、TALE(Neurog2)ドメインのC末端に融合させ、CIB1ドメインを、VP64ドメインのN末端に融合させた。各セットのプラスミドを、Neuro2a細胞においてトランスフェクトし、刺激し(466nm、5mW/cm2、15秒当たり1秒のパルス、12時間)、その後qPCR分析のために回収した。刺激したLITEおよび未刺激のLITEのNeurog2発現レベルを、刺激したGFPコントロールサンプルからのNeurog2レベルに対して標準化した。TALE-CRY2PHR/CIB1-VP64 LITEは、上昇した基底活性およびより高い光誘導性のNeurog2発現を示し、より高い絶対的活性化が必要とされる状況に対するその適切性を示唆した。TALE-CIB1/CRY2PHR-VP64 LITEの比較的光誘導可能な活性は、その対応物よりも低く、より低い基底活性は、最少のベースライン活性化を必要とする適用におけるその有用性を示唆した。さらに、TALE-CIB1構築物は、TALE-CRY2PHR構築物と比較してサイズがより小さく、ウイルスパッケージングなどの適用にとって潜在的に有益である。
NESエレメントを使用することで改善された設計
エストロゲンレセプターT2(ERT2)は、漏出の問題を有している。ERT2ドメインは、4-ヒドロキシテストステロン(4OHT)の非存在下であっても核に進入し、TALによる標的遺伝子の活性化の背景レベルをもたらす。NES(核外輸送シグナル)は、生細胞の細胞質にタンパク質を標的化するペプチドシグナルである。既存の構築物にNESを付加することによって、本出願人らは、4OHTの非存在下での核中へのERT2-TALタンパク質の進入を防止することを目的とし、ERT2ドメインの「漏出」に起因する背景活性化レベルを低下させる。
CRISPR/Cas系を使用した多重ゲノム操作
原因となる遺伝子バリアントおよびエレメントの機能的解明は、正確なゲノム編集テクノロジーを必要とする。II型原核生物CRISPR(クラスター化された、規則的に間隔が空いた短い回文型リピート)適応免疫系は、RNAガイドされた部位特異的DNA切断を促進することが示されている。本出願人らは、2つの異なるII型CRISPR系を操作し、Cas9ヌクレアーゼが、ヒトおよびマウスの細胞中の内因性ゲノム遺伝子座における正確な切断を誘導するために、短いRNAによって指向され得ることを実証している。Cas9はまた、最少の変異原活性を有する相同性指向修復を促進するためのニッキング酵素に変換され得る。最後に、複数のガイド配列が、哺乳動物ゲノム内のいくつかの部位の同時編集を可能にするために、単一のCRISPRアレイ中にコード化され得、CRISPRテクノロジーの容易なプログラム可能性および広い適用可能性を実証する。
CRISPR/Cas系を使用する多重ゲノム操作:補足材料
細胞培養およびトランスフェクション。ヒト胚性腎臓(HEK)細胞株293FT(Life Technologies社)を、10%胎仔ウシ血清(HyClone社)、2mM GlutaMAX(Life Technologies社)、100U/mLペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で、37℃で5%CO2インキュベーションで維持した。マウスneuro2A(N2A)細胞株(ATCC)を、5%胎仔ウシ血清(HyClone社)、2mM GlutaMAX(Life Technologies社)、100U/mLペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシンを補充したDMEMで37℃で5%CO2で維持した。
>U6-短いtracrRNA(化膿レンサ球菌SF370)
AAV構築物のクローニング(構築)
AAV-プロモーター-TALE-エフェクター骨格の構築。AAV-プロモーター-TALE-エフェクターの構築のために、骨格を、標準的なサブクローニング方法によってクローニングした。具体的には、このベクターは、抗生物質耐性遺伝子、例えばアンピシリン耐性、およびプロモーター-TALE-エフェクター挿入物に隣接する2つのAAV逆位末端反復(itr's)を含んだ(配列、以下を参照のこと)。プロモーター(hSyn)、エフェクタードメイン(この実施例ではVP64、SID4XまたはCIB1)/2つのIIS型制限部位(この例ではBsaI)を有するスペーサーを含むTALE遺伝子のN末端およびC末端部分を、このベクター中にサブクローニングした。サブクローニングを達成するために、各DNA成分を、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅し、次いで、特異的制限酵素で消化して、一致するDNA粘着末端を創出した。このベクターを、DNA制限酵素で同様に消化した。全てのDNA断片を、引き続いて、リガーゼ酵素を使用して、一致する末端においてアニーリングさせ、一緒に融合させた。
左側AAV ITR
内因性哺乳動物転写の光学制御
内因性哺乳動物ゲノムの転写を直接モジュレートする能力は、正常な遺伝子機能および疾患機構を解明するために重要である。本明細書で、本出願人らは、光誘導可能な転写エフェクター(LITE)、シロイヌナズナ由来の光感受性クリプトクロム2タンパク質およびその相互作用パートナーCIB1と共にカスタム化可能なTALE DNA結合ドメインを組み込むツーハイブリッドシステムの開発を記載する。LITEは数分以内に活性化され得、内因性哺乳動物遺伝子発現の可逆的な二方向性調節ならびに標的化されたエピジェネティッククロマチン修飾を媒介する。本出願人らは、初代マウスニューロンにおいて、ならびに覚醒した挙動するマウスの脳にin vivoで、この系を適用した。このLITE系は、内因性細胞プロセスの光遺伝学的制御の新規モードを確立し、遺伝的およびエピジェネティック調節の因果的役割の直接的試験を可能にする。
-switchable protein interaction. Nature 461、997〜1001、doi: 10.1038/nature08446 (2009);Yazawa, M.、Sadaghiani, A. M.、Hsueh, B.およびDolmetsch, R. E. Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nature biotechnology 27、941〜945、doi: 10.1038/nbt.1569 (2009)、Kennedy, M. J.ら Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature methods 7、973〜975、doi: 10.1038/nmeth.1524 (2010);Shimizu-Sato, S.、Huq, E.、Tepperman, J. M.およびQuail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature biotechnology 20、1041〜1044、doi: 10.1038/nbt734 (2002)ならびにLiu, H.ら Photoexcited CRY2 interacts with CIB1 to regulate transcription and floral initiation in Arabidopsis. Science 322、1535〜1539、doi: 10.1126/science.1163927 (2008))。他の光遺伝学的ツールと同様に、LITEは、ウイルスベクター中にパッケージングされ得、特異的細胞集団を探索するために遺伝的に標的化され得る。本出願人らは、初代ニューロンにおける、ならびにin vivoのマウス脳におけるこの系の適用を実証する。
at will: specific regulation of the erbB-2/HER-2 promoter by using polydactyl zinc finger proteins constructed from modular building blocks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95、14628〜14633 (1998))-が、遺伝子転写を抑制するその効能を強化し得ると推論した。実際、TALE-SID4X構築物は、293FT細胞においてTALE-SIDの2倍効率的であり(図54Aおよび図54B)、ニューロンにおける効率的な遺伝子抑制もまた媒介した(図54Cおよび図54D)。
実施例10に関する補足情報:内因性哺乳動物転写の光学制御
光刺激(Photostimulation)ハードウェア-in vitro。in vitro光刺激実験を、特注のLED光刺激(Photostimulation)デバイスを使用して実施した。全ての電子エレメントを、カスタムプリント回路基板(ExpressPCB社)上に実装した。ピーク466nmを有する青色LED(モデル番号:YSL-R542B5C-A11、China Young Sun LED Technology社;SparkFun Electronics社によって「LED-Super Bright Blue」COM-00529として配布される)を、Corning 24ウェルプレートのウェルとアラインさせて3つの群において配置した。LED電流の流れを、25mA DynaOhmドライバー(LEDdymanics社#4006-025)によって調節した。LEDアレイのカラムを、Arduino UNOマイクロコントローラー基板を介して、TTLコントロール(Fairchild Semiconductor PN2222BU-ND)によってアドレス指定した。光アウトプットを、パルス幅のモジュレーションを介してモジュレートした。光アウトプットを、Thorlabs PM100DパワーメーターおよびS120VC光ダイオード検出器を利用して、アレイの上80mmの距離から測定した。換気のための空間を提供し、光照射野の均一性を最大化するために、80mmの高さの換気スペーサーを、LEDアレイと24ウェルサンプルプレートとの間に配置した。送風機(Evercool EC5015M12CA)を、スペーサーユニットの一方の壁に沿って取り付け、反対の壁を、ギャップを備えて製造して、気流の増加を可能にした。
以下のArduinoスクリプトを使用して、光刺激された24ウェルプレートの各4ウェルカラムの個々の制御を可能にした。
内因性哺乳動物転写の光学制御
初代マウス皮質ニューロンにおいて転写をモジュレートすることについて、AAV媒介性TALE送達の効力を試験するために、本出願人らは、3つのマウス神経伝達物質レセプターの遺伝子座:それぞれmGluR5、NMDAサブユニット2AおよびmGluR2をコードするGrm5、Grin2aおよびGrm2を標的化する6つのTALE-DNA結合ドメインを構築した(図58)。標的部位のアクセス可能性の可能性を増加させるために、本出願人らは、UCSCゲノムブラウザからのマウス皮質DNaseI感受性データを使用して、推定オープンクロマチン領域を同定した。各標的遺伝子のプロモーター中のDNaseI感受性領域は、TALE結合配列の選択のためのガイドを提供した(図46)。各TALEについて、本出願人らは、転写アクチベーターとしてVP64を使用したか、またはリプレッサーとしてmSin3相互作用ドメイン(SID)の4倍タンデムリピート(Beerli, R.R.、Segal, D.J.、Dreier, B.およびBarbas, C.F., 3rd Toward controlling gene expression at will: specific regulation of the erbB-2/HER-2 promoter by using polydactyl zinc finger proteins constructed from modular building blocks. Proc Natl Acad Sci U S A 95、14628〜14633 (1998)ならびにAyer, D.E.、Laherty, CD.、Lawrence, Q.A.、Armstrong, A.P.およびEisenman, R.N. Mad proteins contain a dominant transcription repression domain. Molecular and Cellular Biology 16、5772〜5781(1996))を使用した。本出願人らは、TALEに融合した単一のSIDが、293FT細胞において標的遺伝子を効率的に下方調節したことを以前に示している(Cong, L.、Zhou, R.、Kuo, Y.-c.、Cunniff, M.およびZhang, F. Comprehensive interrogation of natural TALE DNA-binding modules and transcriptional repressor domains. Nat Commun 3、968 (2012))。このTALEリプレッサーをさらに改善することを望んで、本出願人らは、SIDの4つのリピート-VP64の首尾よい4倍VP16リピートアーキテクチャーと類似(Beerli, R. R.、Segal, D. J.、Dreier, B.およびBarbas, C. F., 3rd. Toward controlling gene expression at will: specific regulation of the erbB-2/HER-2 promoter by using polydactyl zinc finger proteins constructed from modular building blocks. Proc Natl Acad Sci U S A 95、14628〜14633 (1998))-が、その抑制活性を強化し得ると推論した。これは、実際に、TALE-SID4X構築物が、293FT細胞においてTALE-SIDよりも約2倍抑制を増強した場合にあてはまった(図54)。
誘導可能なレンチウイルスCas9
レンチウイルス調製。pCasES10(これはレンチウイルス移行プラスミド骨格を含む)をクローニングした後、低継代(p=5)のHEK293FTを、50%コンフルエンスになるようにT-75フラスコ中に播種し、次の日、10%胎仔ウシ血清を含み抗生物質なしのDMEM中でトランスフェクトした。20時間後、培地をOptiMEM(無血清)培地に交換し、トランスフェクションを4時間後に実施した。細胞を、10μgのレンチウイルス移行プラスミド(pCasES10)および以下のパッケージングプラスミド:5μgのpMD2.G(VSV-g偽型)および7.5μgのpsPAX2(gag/pol/rev/tat)でトランスフェクトした。トランスフェクションを、カチオン性脂質送達剤(50μLのLipofectamine 2000および100μlのPlus試薬)を用いて、4mL OptiMEMにおいて実施した。6時間後、培地を、10%胎仔ウシ血清を含む抗生物質なしのDMEMに交換した。
(a)ゲノム遺伝子座を、デオキシリボ核酸(DNA)結合ポリペプチドを含む天然に存在しないまたは操作された組成物と接触させる工程であって、このデオキシリボ核酸(DNA)結合ポリペプチドは、以下:
(i)エネルギー感受性タンパク質またはその断片に連結された、
目的のゲノム遺伝子座を標的化するために特異的に順序付けられた少なくとも5つ以上の転写アクチベーター様エフェクター(TALE)モノマーおよび少なくとも1つもしくは複数の半モノマーを含むDNA結合ドメイン、または
少なくとも1つもしくは複数のエフェクタードメインであって、
エネルギー感受性タンパク質もしくはその断片が、エネルギー供給源による誘導の際にコンフォメーション変化を受けて、相互作用パートナーと結合することが可能になる、DNA結合ドメインまたはエフェクタードメイン、ならびに/または
(ii)相互作用パートナーに連結された、
目的のゲノム遺伝子座を標的化するために特異的に順序付けられた少なくとも1つもしくは複数のTALEモノマーもしくは半モノマーを含むDNA結合ドメイン、または
少なくとも1つもしくは複数のエフェクタードメインであって、
エネルギー感受性タンパク質もしくはその断片が、エネルギー供給源による誘導の際に相互作用パートナーと結合する、DNA結合ドメインまたはエフェクタードメイン、
を含む、工程;
(b)エネルギー供給源を適用する工程;ならびに
(c)ゲノム遺伝子座の発現が変更されていることを決定する工程、
を含む、方法。
X1〜11は、11個連続するアミノ酸の鎖であり、
X12X13は、リピート可変二残基(RVD)であり、
X14〜33または34または35は、21、22または23個連続するアミノ酸の鎖であり、
zは、少なくとも5〜40であり、
少なくとも1つのRVDは、NI、HD、NG、NN、KN、RN、NH、NQ、SS、SN、NK、KH、RH、HH、HI、KI、RI、SI、KG、HG、RG、SD、ND、KD、RD、YG、HN、NV、NS、HA、S*、N*、KA、H*、RA、NAおよびNCからなる群から選択され、(*)は、X13におけるアミノ酸が存在しないことを意味する、
段落1から11のいずれか1つに記載の方法。
X14〜34もしくはX14〜35のうち少なくとも1つが、図9の配列(X1〜11-X14〜34もしくはX1〜11-X14〜35)中のアミノ酸12〜32もしくは12〜33として示された21もしくは22個連続するアミノ酸の配列である、
段落12に記載の方法。
Aの認識のためのRVDがSIである;または
Tの認識のためのRVDがKGもしくはRGである;および
Cの認識のためのRVDがSDもしくはRDである、
段落15に記載の方法。
X1〜4における[LTLD]もしくは[LTLA]もしくは[LTQV]、または
位置X30〜33もしくはX31〜34もしくはX32〜35における[EQHG]もしくは[RDHG]、
のうち少なくとも1つが存在する、段落12に記載の方法。
C末端キャップ領域もしくはその断片が、野生型C末端キャップ領域の68個連続するアミノ酸を含む、あるいは
N末端キャップ領域もしくはその断片が、野生型N末端キャップ領域の136個連続するアミノ酸を含み、C末端キャップ領域もしくはその断片が、野生型C末端キャップ領域の183個連続するアミノ酸を含む、
段落1から17のいずれか1つに記載の方法。
(a)ゲノム遺伝子座を、DNA結合ポリペプチドを含む天然に存在しないまたは操作された組成物と接触させる工程であって、このDNA結合ポリペプチドは、以下:
(i)エネルギー感受性タンパク質またはその断片に連結された、
目的のゲノム遺伝子座を標的化するために特異的に順序付けられた少なくとも5つ以上の転写アクチベーター様エフェクター(TALE)モノマーおよび少なくとも1つもしくは複数の半モノマーを含むDNA結合ドメイン、または
少なくとも1つもしくは複数のエフェクタードメインであって、
エネルギー感受性タンパク質もしくはその断片が、エネルギー供給源による誘導の際にコンフォメーション変化を受けて、相互作用パートナーと結合することが可能になる、DNA結合ドメインまたはエフェクタードメイン、ならびに/または
(ii)相互作用パートナーに連結された、
目的のゲノム遺伝子座を標的化するために特異的に順序付けられた少なくとも1つもしくは複数のTALEモノマーもしくは半モノマーを含むDNA結合ドメイン、または
少なくとも1つもしくは複数のエフェクタードメインであって、
エネルギー感受性タンパク質もしくはその断片が、エネルギー供給源による誘導の際に相互作用パートナーと結合する、DNA結合ドメインまたはエフェクタードメイン、
を含む、工程;
(b)エネルギー供給源を適用する工程;ならびに
(c)ゲノム遺伝子座の発現が抑制されていることを決定する工程、
を含む、方法。
X1〜11は、11個連続するアミノ酸の鎖であり、
X12X13は、リピート可変二残基(RVD)であり、
X14〜33または34または35は、21、22または23個連続するアミノ酸の鎖であり、
zは、少なくとも5〜40であり、
少なくとも1つのRVDは、NI、HD、NG、NN、KN、RN、NH、NQ、SS、SN、NK、KH、RH、HH、HI、KI、RI、SI、KG、HG、RG、SD、ND、KD、RD、YG、HN、NV、NS、HA、S*、N*、KA、H*、RA、NAおよびNCからなる群から選択され、(*)は、X13におけるアミノ酸が存在しないことを意味する、
段落20から31のいずれか1つに記載の方法。
X14〜34もしくはX14〜35のうち少なくとも1つが、図9の配列(X1〜11-X14〜34もしくはX1〜11-X14〜35)中のアミノ酸12〜32もしくは12〜33として示された21もしくは22個連続するアミノ酸の配列である、
段落32に記載の方法。
C末端キャップ領域もしくはその断片が、野生型C末端キャップ領域の68個連続するアミノ酸を含む、あるいは
N末端キャップ領域もしくはその断片が、野生型N末端キャップ領域の136個連続するアミノ酸を含み、C末端キャップ領域もしくはその断片が、野生型C末端キャップ領域の183個連続するアミノ酸を含む、
段落20から34のいずれか1つに記載の方法。
(a)ゲノム遺伝子座を、DNA結合ポリペプチドを含む天然に存在しないまたは操作された組成物と接触させる工程であって、このDNA結合ポリペプチドは、以下:
(i)エネルギー感受性タンパク質またはその断片に連結された、
目的のゲノム遺伝子座を標的化するために特異的に順序付けられた少なくとも5つ以上のTALEモノマーおよび少なくとも1つもしくは複数の半モノマーを含むDNA結合ドメイン、または
少なくとも1つもしくは複数のアクチベータードメインであって、
エネルギー感受性タンパク質もしくはその断片が、エネルギー供給源による誘導の際にコンフォメーション変化を受けて、相互作用パートナーと結合することが可能になる、DNA結合ドメインまたはアクチベータードメイン、ならびに
(ii)相互作用パートナーに連結された、
目的のゲノム遺伝子座を標的化するために特異的に順序付けられた少なくとも1つもしくは複数のTALEモノマーもしくは半モノマーを含むDNA結合ドメイン、または
少なくとも1つもしくは複数のアクチベータードメインであって、
エネルギー感受性タンパク質もしくはその断片が、エネルギー供給源による誘導の際に相互作用パートナーと結合する、DNA結合ドメインまたはアクチベータードメイン、
を含む、工程;
(b)エネルギー供給源を適用する工程;ならびに
(c)ゲノム遺伝子座の発現が活性化されていることを決定する工程、
を含む、方法。
X1〜11は、11個連続するアミノ酸の鎖であり、
X12X13は、リピート可変二残基(RVD)であり、
X14〜33または34または35は、21、22または23個連続するアミノ酸の鎖であり、
zは、少なくとも5〜40であり、
少なくとも1つのRVDは、NI、HD、NG、NN、KN、RN、NH、NQ、SS、SN、NK、KH、RH、HH、HI、KI、RI、SI、KG、HG、RG、SD、ND、KD、RD、YG、HN、NV、NS、HA、S*、N*、KA、H*、RA、NAおよびNCからなる群から選択され、(*)は、X13におけるアミノ酸が存在しないことを意味する、
段落40から49のいずれか1つに記載の方法。
X14〜34もしくはX14〜35のうち少なくとも1つが、図9の配列(X1〜11-X14〜34もしくはX1〜11-X14〜35)中のアミノ酸12〜32もしくは12〜33として示された21もしくは22個連続するアミノ酸の配列である、
段落50に記載の方法。
C末端キャップ領域もしくはその断片が、野生型C末端キャップ領域の68個連続するアミノ酸を含む、あるいは
N末端キャップ領域もしくはその断片が、野生型N末端キャップ領域の136個連続するアミノ酸を含み、C末端キャップ領域もしくはその断片が、野生型C末端キャップ領域の183個連続するアミノ酸を含む、
段落40から52のいずれか1つに記載の方法。
(i)エネルギー感受性タンパク質またはその断片に連結された、
少なくとも1つもしくは複数のTALEモノマーもしくは半モノマーを含むDNA結合ドメイン、または
少なくとも1つもしくは複数のエフェクタードメインであって、
エネルギー感受性タンパク質もしくはその断片が、エネルギー供給源による誘導の際にコンフォメーション変化を受けて、相互作用パートナーと結合することが可能になる、DNA結合ドメインまたはエフェクタードメイン、ならびに/または
(ii)相互作用パートナーに連結された、
少なくとも1つもしくは複数のTALEモノマーもしくは半モノマーを含むDNA結合ドメイン、または
少なくとも1つもしくは複数のエフェクタードメインであって、
エネルギー感受性タンパク質もしくはその断片が、エネルギー供給源による誘導の際に相互作用パートナーと結合する、DNA結合ドメインまたはエフェクタードメイン、
を含み;
このポリペプチドは、このポリペプチドがゲノム遺伝子座のDNAに優先的に結合するようにコドン最適化された核酸分子によってコードされ、かかるコドン最適化された核酸分子から翻訳され、
このポリペプチドが、エネルギー供給源の適用の際にゲノム遺伝子座の発現を変更する、組成物。
X1〜11は、11個連続するアミノ酸の鎖であり、
X12X13は、リピート可変二残基(RVD)であり、
X14〜33または34または35は、21、22または23個連続するアミノ酸の鎖であり、
zは、少なくとも5〜40であり、
少なくとも1つのRVDは、NI、HD、NG、NN、KN、RN、NH、NQ、SS、SN、NK、KH、RH、HH、HI、KI、RI、SI、KG、HG、RG、SD、ND、KD、RD、YG、HN、NV、NS、HA、S*、N*、KA、H*、RA、NAおよびNCからなる群から選択され、(*)は、X13におけるアミノ酸が存在しないことを意味する、
段落59から69のいずれか1つに記載の組成物。
X14〜34もしくはX14〜35のうち少なくとも1つが、図9の配列(X1〜11-X14〜34もしくはX1〜11-X14〜35)中のアミノ酸12〜32もしくは12〜33として示された21もしくは22個連続するアミノ酸の配列である、
段落70に記載の組成物。
Aの認識のためのRVDがSIである;または
Tの認識のためのRVDがKGもしくはRGである;および
Cの認識のためのRVDがSDもしくはRDである、
段落73に記載の組成物。
X1〜4における[LTLD]もしくは[LTLA]もしくは[LTQV]、または
位置X30〜33もしくはX31〜34もしくはX32〜35における[EQHG]もしくは[RDHG]、
のうち少なくとも1つが存在する、段落70に記載の組成物。
C末端キャップ領域もしくはその断片が、野生型C末端キャップ領域の68個連続するアミノ酸を含む、あるいは
N末端キャップ領域もしくはその断片が、野生型N末端キャップ領域の136個連続するアミノ酸を含み、C末端キャップ領域もしくはその断片が、野生型C末端キャップ領域の183個連続するアミノ酸を含む、
段落59から75のいずれか1つに記載の組成物。
(i)エネルギー感受性タンパク質またはその断片に連結された、
少なくとも1つもしくは複数のTALEモノマーもしくは半モノマーを含むDNA結合ドメイン、または
少なくとも1つもしくは複数のリプレッサードメインであって、
エネルギー感受性タンパク質もしくはその断片が、エネルギー供給源による誘導の際にコンフォメーション変化を受けて、相互作用パートナーと結合することが可能になる、DNA結合ドメインまたはリプレッサードメイン、ならびに/または
(ii)相互作用パートナーに連結された、
少なくとも1つもしくは複数のTALEモノマーもしくは半モノマーを含むDNA結合ドメイン、または
少なくとも1つもしくは複数のリプレッサードメインであって、
エネルギー感受性タンパク質もしくはその断片が、エネルギー供給源による誘導の際に相互作用パートナーと結合する、DNA結合ドメインまたはリプレッサードメイン、
を含み;
このポリペプチドは、このポリペプチドがゲノム遺伝子座のDNAに優先的に結合するようにコドン最適化された核酸分子によってコードされ、かかるコドン最適化された核酸分子から発現され、
このポリペプチドが、エネルギー供給源の適用の際にゲノム遺伝子座の発現を抑制する、組成物。
X1〜11は、11個連続するアミノ酸の鎖であり、
X12X13は、リピート可変二残基(RVD)であり、
X14〜33または34または35は、21、22または23個連続するアミノ酸の鎖であり、
zは、少なくとも5〜40であり、
少なくとも1つのRVDは、NI、HD、NG、NN、KN、RN、NH、NQ、SS、SN、NK、KH、RH、HH、HI、KI、RI、SI、KG、HG、RG、SD、ND、KD、RD、YG、HN、NV、NS、HA、S*、N*、KA、H*、RA、NAおよびNCからなる群から選択され、(*)は、X13におけるアミノ酸が存在しないことを意味する、
段落78から89のいずれか1つに記載の組成物。
X14〜34もしくはX14〜35のうち少なくとも1つが、図9の配列(X1〜11-X14〜34もしくはX1〜11-X14〜35)中のアミノ酸12〜32もしくは12〜33として示された21もしくは22個連続するアミノ酸の配列である、
段落90に記載の組成物。
C末端キャップ領域もしくはその断片が、野生型C末端キャップ領域の68個連続するアミノ酸を含む、あるいは
N末端キャップ領域もしくはその断片が、野生型N末端キャップ領域の136個連続するアミノ酸を含み、C末端キャップ領域もしくはその断片が、野生型C末端キャップ領域の183個連続するアミノ酸を含む、
段落78から92のいずれか1つに記載の組成物。
(i)エネルギー感受性タンパク質またはその断片に連結された、
目的のゲノム遺伝子座を標的化するために特異的に順序付けられた少なくとも5つ以上の転写アクチベーター様エフェクター(TALE)モノマーおよび少なくとも1つもしくは複数の半モノマーを含むDNA結合ドメイン、または
少なくとも1つもしくは複数のエフェクタードメインであって、
エネルギー感受性タンパク質もしくはその断片が、エネルギー供給源による誘導の際にコンフォメーション変化を受けて、相互作用パートナーと結合することが可能になる、DNA結合ドメインまたはエフェクタードメイン、ならびに/または
(ii)相互作用パートナーに連結された、
目的のゲノム遺伝子座を標的化するために特異的に順序付けられた少なくとも1つもしくは複数のTALEモノマーもしくは半モノマーを含むDNA結合ドメイン、または
少なくとも1つもしくは複数のエフェクタードメインであって、
エネルギー感受性タンパク質もしくはその断片が、エネルギー供給源による誘導の際に相互作用パートナーと結合する、DNA結合ドメインまたはエフェクタードメイン、
を含み;
このポリペプチドは、このポリペプチドがゲノム遺伝子座のDNAに優先的に結合するようにコドン最適化された核酸分子によってコードされ、かかるコドン最適化された核酸分子から発現され、
このポリペプチドが、エネルギー供給源の適用の際にゲノム遺伝子座の発現を活性化する、組成物。
X1〜11は、11個連続するアミノ酸の鎖であり、
X12X13は、リピート可変二残基(RVD)であり、
X14〜33または34または35は、21、22または23個連続するアミノ酸の鎖であり、
zは、少なくとも5〜40であり、
少なくとも1つのRVDは、NI、HD、NG、NN、KN、RN、NH、NQ、SS、SN、NK、KH、RH、HH、HI、KI、RI、SI、KG、HG、RG、SD、ND、KD、RD、YG、HN、NV、NS、HA、S*、N*、KA、H*、RA、NAおよびNCからなる群から選択され、(*)は、X13におけるアミノ酸が存在しないことを意味する、
段落98から107のいずれか1つに記載の組成物。
X14〜34もしくはX14〜35のうち少なくとも1つが、図9の配列(X1〜11-X14〜34もしくはX1〜11-X14〜35)中のアミノ酸12〜32もしくは12〜33として示された21もしくは22個連続するアミノ酸の配列である、
段落108に記載の組成物。
C末端キャップ領域もしくはその断片が、野生型C末端キャップ領域の68個連続するアミノ酸を含む、あるいは
N末端キャップ領域もしくはその断片が、野生型N末端キャップ領域の136個連続するアミノ酸を含み、C末端キャップ領域もしくはその断片が、野生型C末端キャップ領域の183個連続するアミノ酸を含む、
段落98から110のいずれか1つに記載の組成物。
(a)ゲノム遺伝子座を、DNA結合ポリペプチドを含む天然に存在しないまたは操作された組成物と接触させる工程であって、このDNA結合ポリペプチドは、以下:
(i)エネルギー感受性タンパク質またはその断片に連結された、
目的のゲノム遺伝子座を標的化するために特異的に順序付けられた少なくとも5つ以上の転写アクチベーター様エフェクター(TALE)モノマーおよび少なくとも1つもしくは複数の半モノマーを含むDNA結合ドメイン、または
少なくとも1つもしくは複数のエフェクタードメインであって、
エネルギー感受性タンパク質もしくはその断片が、エネルギー供給源による誘導の際にコンフォメーション変化を受けて、相互作用パートナーと結合することが可能になる、DNA結合ドメインまたはエフェクタードメイン、ならびに/または
(ii)相互作用パートナーに連結された、
目的のゲノム遺伝子座を標的化するために特異的に順序付けられた少なくとも1つもしくは複数のTALEモノマーもしくは半モノマーを含むDNA結合ドメイン、または
少なくとも1つもしくは複数のエフェクタードメインであって、
エネルギー感受性タンパク質もしくはその断片が、エネルギー供給源による誘導の際に相互作用パートナーと結合する、DNA結合ドメインまたはエフェクタードメイン、
を含む、工程;
(b)エネルギー供給源を適用する工程;ならびに
(c)ゲノム遺伝子座の発現が変更されていることを決定する工程、
を含む、方法。
(i)エネルギー感受性タンパク質またはその断片に連結された、
目的のゲノム遺伝子座を標的化するために特異的に順序付けられた少なくとも5つ以上の転写アクチベーター様エフェクター(TALE)モノマーおよび少なくとも1つもしくは複数の半モノマーを含むDNA結合ドメイン、または
少なくとも1つもしくは複数のエフェクタードメインであって、
エネルギー感受性タンパク質もしくはその断片が、エネルギー供給源による誘導の際にコンフォメーション変化を受けて、相互作用パートナーと結合することが可能になる、DNA結合ドメインまたはエフェクタードメイン、ならびに/または
(ii)相互作用パートナーに連結された、
目的のゲノム遺伝子座を標的化するために特異的に順序付けられた少なくとも1つもしくは複数のTALEモノマーもしくは半モノマーを含むDNA結合ドメイン、または
少なくとも1つもしくは複数のエフェクタードメインであって、
エネルギー感受性タンパク質もしくはその断片が、エネルギー供給源による誘導の際に相互作用パートナーと結合する、DNA結合ドメインまたはエフェクタードメイン、
を含み;
このポリペプチドは、ゲノム遺伝子座のDNAに優先的に結合し、
このポリペプチドは、エネルギー供給源の適用の際にゲノム遺伝子座の発現を変更する、組成物。
(a)ゲノム遺伝子座を、デオキシリボ核酸(DNA)結合ポリペプチドを含む天然に存在しないまたは操作された組成物と接触させる工程;
(b)インデューサー供給源を適用する工程;および
(c)ゲノム遺伝子座の発現の撹乱が生じたことを決定する工程、
を含む、方法。
(i)エネルギー感受性タンパク質またはその断片に連結された、目的のゲノム遺伝子座を標的化するために特異的に順序付けられた少なくとも5つ以上の転写アクチベーター様エフェクター(TALE)モノマーおよび少なくとも1つもしくは複数の半モノマーを含むDNA結合ドメイン、または少なくとも1つもしくは複数のエフェクタードメインであって、エネルギー感受性タンパク質もしくはその断片が、エネルギー供給源による誘導の際にコンフォメーション変化を受けて、相互作用パートナーと結合することが可能になる、DNA結合ドメインまたはエフェクタードメイン、ならびに/または
(ii)相互作用パートナーに連結された、目的のゲノム遺伝子座を標的化するために特異的に順序付けられた少なくとも1つもしくは複数のTALEモノマーもしくは半モノマーを含むDNA結合ドメイン、または少なくとも1つもしくは複数のエフェクタードメインであって、エネルギー感受性タンパク質もしくはその断片が、エネルギー供給源による誘導の際に相互作用パートナーと結合する、DNA結合ドメインまたはエフェクタードメイン、
を含む、段落126から130のいずれか1つに記載の方法。
(a)ゲノム遺伝子座を、1つまたは複数のベクターを含むベクター系と接触させる工程であって、このベクターは、
I.CRISPR/Cas系キメラRNA(chiRNA)ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された第1の調節エレメントであって、このポリヌクレオチド配列は、
(a)真核生物細胞において標的配列にハイブリダイズすることが可能なガイド配列、
(b)トラクルメイト配列、および
(c)トラクル配列、
を含む、第1の調節エレメント、ならびに
II.少なくとも1つまたは複数の核局在化配列を含むCRISPR酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に連結された第2の調節誘導可能エレメント、
を含み、
(a)、(b)および(c)は、5'から3'の配向で配置され、
成分IおよびIIは、その系の同じまたは異なるベクター上に位置付けられており、
転写される場合、このトラクルメイト配列は、トラクル配列とハイブリダイズし、ガイド配列は、標的配列へのCRISPR複合体の配列特異的結合を指向し、
このCRISPR複合体は、(1)標的配列とハイブリダイズしたガイド配列、および(2)トラクル配列とハイブリダイズしたトラクルメイト配列、と複合体化したCRISPR酵素を含み、
CRISPR酵素をコードする酵素コード配列は、異種機能的ドメインをさらにコードする、
工程;
(b)インデューサー供給源を適用する工程;ならびに
(c)ゲノム遺伝子座の発現の撹乱が生じたことを決定する工程、
を含む、方法。
Claims (61)
- 少なくとも1つのスイッチを含む、天然に存在しないまたは操作されたTALEまたはCRISPR-Cas系であって、前記TALEまたはCRISPR-Cas系の活性が、前記スイッチに関する少なくとも1つのインデューサーエネルギー供給源との接触によって制御される、系。
- 前記TALEまたはCRISPR-Cas系の少なくとも1つのスイッチまたは活性に関する制御が、活性化、増強、終結または抑制される、請求項1に記載の系。
- 前記少なくとも1つのインデューサーエネルギー供給源との接触が、第1の効果および第2の効果を生じる、請求項1または2に記載の系。
- 前記第1の効果が、核内輸送、核外輸送、二次的成分(例えばエフェクター分子)のリクルート、(タンパク質、DNAまたはRNAの)コンフォメーション変化、切断、カーゴ(例えば、ケージド分子または補因子)の放出、会合または解離のうち1つまたは複数である、請求項3に記載の系。
- 前記第2の効果が、前記TALEまたはCRISPR-Cas系の少なくとも1つのスイッチまたは活性に関する制御の活性化、増強、終結または抑制のうち1つまたは複数である、請求項3に記載の系。
- 前記第1の効果および前記第2の効果がカスケードで生じる、請求項3から5のいずれか一項に記載の系。
- 前記TALEまたはCRISPR-Cas系が、少なくとも1つの核局在化シグナル(NLS)、核外輸送シグナル(NES)、機能的ドメイン、フレキシブルリンカー、変異、欠失、変更または短縮をさらに含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の系。
- 前記NLS、前記NESまたは前記機能的ドメインのうち1つまたは複数が、条件的に活性化または不活性化される、請求項7に記載の系。
- 前記変異が、転写因子相同性領域中の変異、DNA結合ドメイン中の変異(例えば、塩基性ヘリックスループヘリックスの塩基性残基の変異)、内因性NLS中の変異または内因性NES中の変異のうち1つまたは複数である、請求項7に記載の系。
- 前記インデューサーエネルギー供給源が、熱、超音波、電磁気エネルギーまたは化学物質である、請求項1から9のいずれか一項に記載の系。
- 前記インデューサーエネルギー供給源が、抗生物質、小分子、ホルモン、ホルモン誘導体、ステロイドまたはステロイド誘導体である、請求項1から10のいずれか一項に記載の系。
- 前記インデューサーエネルギー供給源が、アブシジン酸(ABA)、ドキシサイクリン(DOX)、クメート、ラパマイシン、4-ヒドロキシタモキシフェン(4OHT)、エストロゲンまたはエクジソンである、請求項1から11のいずれか一項に記載の系。
- 前記少なくとも1つのスイッチが、抗生物質ベースの誘導可能な系、電磁気エネルギーベースの誘導可能な系、小分子ベースの誘導可能な系、核レセプターベースの誘導可能な系およびホルモンベースの誘導可能な系からなる群から選択される、請求項1から12のいずれか一項に記載の系。
- 前記少なくとも1つのスイッチが、テトラサイクリン(Tet)/DOX誘導可能な系、光誘導可能な系、ABA誘導可能な系、クメートリプレッサー/オペレーター系、4OHT/エストロゲン誘導可能な系、エクジソンベースの誘導可能な系およびFKBP12/FRAP(FKBP12-ラパマイシン複合体)誘導可能な系からなる群から選択される、請求項1から13のいずれか一項に記載の系。
- 前記インデューサーエネルギー供給源が電磁気エネルギーである、請求項10に記載の系。
- 前記電磁気エネルギーが可視光の成分である、請求項15に記載の系。
- 可視光の前記成分が、450nm〜700nmの範囲の波長を有する、請求項16に記載の系。
- 可視光の前記成分が、450nm〜500nmの範囲の波長を有する、請求項17に記載の系。
- 可視光の前記成分が青色光である、請求項18に記載の系。
- 前記青色光が、少なくとも0.2mW/cm2の強度を有する、請求項19に記載の系。
- 前記青色光が、少なくとも4mW/cm2の強度を有する、請求項19に記載の系。
- 可視光の前記成分が、620〜700nmの範囲の波長を有する、請求項17に記載の系。
- 可視光の前記成分が赤色光である、請求項22に記載の系。
- 前記少なくとも1つの機能的ドメインが、以下:トランスポザーゼドメイン、インテグラーゼドメイン、リコンビナーゼドメイン、リゾルバーゼドメイン、インベルターゼドメイン、プロテアーゼドメイン、DNAメチルトランスフェラーゼドメイン、DNAヒドロキシメチラーゼドメイン、DNAデメチラーゼドメイン、ヒストンアセチラーゼドメイン、ヒストンデアセチラーゼドメイン、ヌクレアーゼドメイン、リプレッサードメイン、アクチベータードメイン、核局在化シグナルドメイン、転写-調節タンパク質(または転写複合体リクルート)ドメイン、細胞取り込み活性関連ドメイン、核酸結合ドメイン、抗体提示ドメイン、ヒストン修飾酵素、ヒストン修飾酵素のリクルーター;ヒストン修飾酵素のインヒビター、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデメチラーゼ、ヒストンキナーゼ、ヒストンホスファターゼ、ヒストンリボシラーゼ、ヒストンデリボシラーゼ、ヒストンユビキチナーゼ、ヒストンデユビキチナーゼ、ヒストンビオチナーゼおよびヒストンテイルプロテアーゼからなる群から選択される、請求項7に記載の系。
- 目的のゲノム遺伝子座またはエピゲノム遺伝子座を撹乱するための、請求項1から24のいずれか一項に記載の系の使用。
- 医薬化合物の調製のための、請求項1から24のいずれか一項に記載の系の使用。
- 天然に存在しないまたは操作されたTALEまたはCRISPR-Cas系を制御する方法であって、少なくとも1つのスイッチを含む前記TALEまたはCRISPR-Cas系を提供する工程を含み、前記TALEまたはCRISPR-Cas系の活性が、前記スイッチに関する少なくとも1つのインデューサーエネルギー供給源との接触によって制御される、方法。
- 前記TALEまたはCRISPR-Cas系の少なくとも1つのスイッチまたは活性に関する制御が、活性化、増強、終結または抑制される、請求項27に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのインデューサーエネルギー供給源との接触が、第1の効果および第2の効果を生じる、請求項27または28に記載の方法。
- 前記第1の効果が、核内輸送、核外輸送、二次的成分(例えばエフェクター分子)のリクルート、(タンパク質、DNAまたはRNAの)コンフォメーション変化、切断、カーゴ(例えば、ケージド分子または補因子)の放出、会合または解離のうち1つまたは複数である、請求項29に記載の方法。
- 前記第2の効果が、前記TALEまたはCRISPR-Cas系の少なくとも1つのスイッチまたは活性に関する制御の活性化、増強、終結または抑制のうち1つまたは複数である、請求項29に記載の方法。
- 前記第1の効果および前記第2の効果がカスケードで生じる、請求項29から31のいずれか一項に記載の方法。
- 前記TALEまたはCRISPR-Cas系が、少なくとも1つの核局在化シグナル(NLS)、核外輸送シグナル(NES)、機能的ドメイン、フレキシブルリンカー、変異、欠失、変更または短縮をさらに含む、請求項27から32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記NLS、前記NESまたは前記機能的ドメインのうち1つまたは複数が、条件的に活性化または不活性化される、請求項33に記載の方法。
- 前記変異が、転写因子相同性領域中の変異、DNA結合ドメイン中の変異(例えば、塩基性ヘリックスループヘリックスの塩基性残基の変異)、内因性NLS中の変異または内因性NES中の変異のうち1つまたは複数である、請求項33に記載の方法。
- 前記インデューサーエネルギー供給源が、熱、超音波、電磁気エネルギーまたは化学物質である、請求項27から35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記インデューサーエネルギー供給源が、抗生物質、小分子、ホルモン、ホルモン誘導体、ステロイドまたはステロイド誘導体である、請求項27から36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記インデューサーエネルギー供給源が、アブシジン酸(ABA)、ドキシサイクリン(DOX)、クメート、ラパマイシン、4-ヒドロキシタモキシフェン(4OHT)、エストロゲンまたはエクジソンである、請求項27から37のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのスイッチが、抗生物質ベースの誘導可能な系、電磁気エネルギーベースの誘導可能な系、小分子ベースの誘導可能な系、核レセプターベースの誘導可能な系およびホルモンベースの誘導可能な系からなる群から選択される、請求項27から38のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのスイッチが、テトラサイクリン(Tet)/DOX誘導可能な系、光誘導可能な系、ABA誘導可能な系、クメートリプレッサー/オペレーター系、4OHT/エストロゲン誘導可能な系、エクジソンベースの誘導可能な系およびFKBP12/FRAP(FKBP12-ラパマイシン複合体)誘導可能な系からなる群から選択される、請求項27から39のいずれか一項に記載の方法。
- 前記インデューサーエネルギー供給源が電磁気エネルギーである、請求項36に記載の方法。
- 前記電磁気エネルギーが可視光の成分である、請求項41に記載の方法。
- 可視光の前記成分が、450nm〜700nmの範囲の波長を有する、請求項42に記載の方法。
- 可視光の前記成分が、450nm〜500nmの範囲の波長を有する、請求項43に記載の方法。
- 可視光の前記成分が青色光である、請求項44に記載の方法。
- 前記青色光が、少なくとも0.2mW/cm2の強度を有する、請求項45に記載の方法。
- 前記青色光が、少なくとも4mW/cm2の強度を有する、請求項45に記載の方法。
- 可視光の前記成分が、620〜700nmの範囲の波長を有する、請求項43に記載の方法。
- 可視光の前記成分が赤色光である、請求項48に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの機能的ドメインが、以下:トランスポザーゼドメイン、インテグラーゼドメイン、リコンビナーゼドメイン、リゾルバーゼドメイン、インベルターゼドメイン、プロテアーゼドメイン、DNAメチルトランスフェラーゼドメイン、DNAヒドロキシメチラーゼドメイン、DNAデメチラーゼドメイン、ヒストンアセチラーゼドメイン、ヒストンデアセチラーゼドメイン、ヌクレアーゼドメイン、リプレッサードメイン、アクチベータードメイン、核局在化シグナルドメイン、転写-調節タンパク質(または転写複合体リクルート)ドメイン、細胞取り込み活性関連ドメイン、核酸結合ドメイン、抗体提示ドメイン、ヒストン修飾酵素、ヒストン修飾酵素のリクルーター;ヒストン修飾酵素のインヒビター、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデメチラーゼ、ヒストンキナーゼ、ヒストンホスファターゼ、ヒストンリボシラーゼ、ヒストンデリボシラーゼ、ヒストンユビキチナーゼ、ヒストンデユビキチナーゼ、ヒストンビオチナーゼおよびヒストンテイルプロテアーゼからなる群から選択される、請求項33に記載の方法。
- 前記TALE系がDNA結合ポリペプチドを含み、前記DNA結合ポリペプチドが、以下:
(i)エネルギー感受性タンパク質またはその断片に連結された、
目的の遺伝子座を標的化するために特異的に順序付けられた少なくとも5つ以上の転写アクチベーター様エフェクター(TALE)モノマーおよび少なくとも1つもしくは複数の半モノマーを含むDNA結合ドメイン、または
少なくとも1つもしくは複数のエフェクタードメインであって、
前記エネルギー感受性タンパク質もしくはその断片が、インデューサーエネルギー供給源による誘導の際にコンフォメーション変化を受けて、相互作用パートナーと結合することが可能になる、DNA結合ドメインまたはエフェクタードメイン、ならびに/または
(ii)相互作用パートナーに連結された、
目的の遺伝子座を標的化するために特異的に順序付けられた少なくとも1つもしくは複数のTALEモノマーもしくは半モノマーを含むDNA結合ドメイン、または
少なくとも1つもしくは複数のエフェクタードメインであって、
前記エネルギー感受性タンパク質もしくはその断片が、前記インデューサーエネルギー供給源による誘導の際に相互作用パートナーと結合する、DNA結合ドメインまたはエフェクタードメイン、
を含む、請求項1から50のいずれか一項に記載の系または方法。 - 前記DNA結合ポリペプチドが、
(a)N末端キャップ領域
(b)目的の前記遺伝子座を標的化するために特異的に順序付けられた少なくとも5〜40の転写アクチベーター様エフェクター(TALE)モノマーおよび少なくとも1つまたは複数の半モノマーを含む、DNA結合ドメイン、ならびに
(c)C末端キャップ領域、
を含み、
(a)、(b)および(c)が、所定のN末端からC末端の配向で配置され、
前記ゲノム遺伝子座が標的DNA配列5'-T0N1N2....NzNz+1-3'を含み、式中、T0およびN=A、G、TまたはCであり、
前記標的DNA配列が前記DNA結合ドメインと結合し、前記DNA結合ドメインは、(X1〜11-X12X13-X14〜33または34または35)zを含み、式中、
X1〜11は、11個連続するアミノ酸の鎖であり、
X12X13は、リピート可変二残基(RVD)であり、
X14〜33または34または35は、21、22または23個連続するアミノ酸の鎖であり、
zは、少なくとも5〜40であり、
前記ポリペプチドは、前記ポリペプチドが目的の前記遺伝子座のDNAに優先的に結合するようにコドン最適化された核酸分子によってコードされ、前記コドン最適化された核酸分子から翻訳される、
請求項51に記載の系または方法。 - 前記N末端キャップ領域もしくはその断片が、野生型N末端キャップ領域の147個連続するアミノ酸を含む、または
前記C末端キャップ領域もしくはその断片が、野生型C末端キャップ領域の68個連続するアミノ酸を含む、または
前記N末端キャップ領域もしくはその断片が、野生型N末端キャップ領域の136個連続するアミノ酸を含み、前記C末端キャップ領域もしくはその断片が、野生型C末端キャップ領域の183個連続するアミノ酸を含む、
請求項52に記載の系または方法。 - 少なくとも1つのRVDが、(a)グアニン(G)の認識のためのHH、KH、NH、NK、NQ、RH、RN、SS、NN、SN、KN;(b)アデニン(A)の認識のためのNI、KI、RI、HI、SI;(c)チミン(T)の認識のためのNG、HG、KG、RG;(d)シトシン(C)の認識のためのRD、SD、HD、ND、KD、YG;(e)AまたはGの認識のためのNV、HN;および(f)AまたはTまたはGまたはCの認識のためのH*、HA、KA、N*、NA、NC、NS、RA、S*からなる群から選択され、(*)は、X13におけるアミノ酸が存在しないことを意味する、
請求項52に記載の系または方法。 - 少なくとも1つのRVDが、(a)グアニン(G)の認識のためのHH、KH、NH、NK、NQ、RH、RN、SS;(b)アデニン(A)の認識のためのSI;(c)チミン(T)の認識のためのHG、KG、RG;(d)シトシン(C)の認識のためのRD、SD;(e)AまたはGの認識のためのNV、HN;および(f)AまたはTまたはGまたはCの認識のためのH*、HA、KA、N*、NA、NC、NS、RA、S*からなる群から選択され、(*)は、X13におけるアミノ酸が存在しないことを意味する、
請求項54に記載の系または方法。 - Gの認識のための前記RVDがRN、NH、RHもしくはKHである;または
Aの認識のための前記RVDがSIである;または
Tの認識のための前記RVDがKGもしくはRGである;および
Cの認識のための前記RVDがSDもしくはRDである、
請求項55に記載の系または方法。 - 以下:
X1〜4における[LTLD]もしくは[LTLA]もしくは[LTQV]、または
位置X30〜33もしくはX31〜34もしくはX32〜35における[EQHG]もしくは[RDHG]、
のうち少なくとも1つが存在する、
請求項52に記載の系または方法。 - 前記TALE系が、AAVまたはレンチウイルスベクター中にパッケージングされている、請求項51から57のいずれか一項に記載の系または方法。
- 前記CRISPR系が、以下:
a)目的の遺伝子座を標的化するCRISPR-Cas系ガイドRNAに作動可能に連結された第1の調節エレメント、
b)Casタンパク質に作動可能に連結された第2の調節誘導可能エレメント、
を含むベクター系を含み、
成分(a)および(b)が、前記系の同じまたは異なるベクター上に位置付けられ、
前記ガイドRNAが、目的の前記遺伝子座のDNAを標的化し、前記Casタンパク質および前記ガイドRNAが、天然には一緒に存在しない、請求項1から50のいずれか一項に記載の系または方法。 - 前記Casタンパク質がCas9酵素である、請求項59に記載の系または方法。
- 前記ベクターが、AAVまたはレンチウイルスである、請求項59または60に記載の系または方法。
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