CN104630267B - 利用tale转录抑制子在哺乳动物细胞中模块化构建合成基因线路的试剂盒 - Google Patents
利用tale转录抑制子在哺乳动物细胞中模块化构建合成基因线路的试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明的目的是提供利用TALE转录抑制子在哺乳动物细胞中模块化构建合成基因线路的试剂盒。本发明保护实现两种蛋白可调控式表达的试剂盒，包括具有表达盒甲的重组载体甲、具有表达盒乙的重组载体乙和具有表达盒丙的重组载体丙；表达盒甲包括：反馈元件的编码序列、启动子甲、通过自剪切多肽连接的蛋白甲和TALER蛋白甲的编码基因、靶序列甲(包括shRNA1的靶序列)；表达盒乙包括：反馈元件的编码序列、启动子乙、通过自剪切多肽连接的蛋白乙和TALER蛋白乙的编码基因、靶序列乙(包括shRNA2的靶序列)；表达盒丙包括组成启动子和激活元件的编码序列。将重组载体甲、乙和丙导入宿主细胞，通过加入shRNA1或shRNA2调控蛋白甲和乙表达。
Description
技术领域
本发明涉及利用TALE转录抑制子在哺乳动物细胞中模块化构建合成基因线路。
背景技术
合成的基因线路经过精心设计，依据功能将基因调控装置组装起来，感受、整合、处理细胞内的分子信息，行使一定的功能。各种合成基因线路已发展在细胞内实现可定制、可编程的功能，包括动态行为、开关和记忆、细胞间通讯、适应性、细胞极化、数字和模拟计算和复杂的生物合成途径。这些基因线路中大多数是通过使用有限的基因元件和昂贵、低效的“尝试-错误”的方法构建。因此，为了简化设计和优化对活体细胞进行复杂的操作，研发出一个大规模的、功能定义良好的合成基因元件库和相应的计算模型和模拟方法是很有必要的。
在针对哺乳动物的合成生物学研究领域，工程化的合成转录激活子和抑制子是支持可扩展的基因线路设计的一个重要的目标。目前，构建哺乳动物/真核生物转录抑制子常用的策略是融合一个转录抑制结构域和一个工程化的DNA结合蛋白结构域，比如锌指蛋白、转录激活子类似因子(TALE)蛋白和失活的Cas9(dCas9)核酸酶在RNA引导的CRISPR(簇状周期性间隔短回文重复序列)系统。然而，转录抑制结构域，如Krüppel相关盒(KRAB)转录抑制结构域和mSin相互作用结构域(SID4)通常会导致靶启动子附近的表观遗传学修饰，因而响应时间很慢。因此，这种转录抑制不适用于构建响应快速、可逆的基因线路。
另一种普遍存在于原核生物中的转录抑制模式是通过无功能结构域的空间位阻，而这在真核生物中并不常见，例如，Lac抑制子(LacI)和四环素抑制子(TetR)通过低聚化结合在启动子附近的特异DNA序列，使DNA形成一个环，从而阻止转录起始核心元件在启动子区域的结合)。已有研究表明，在哺乳动物基因调控的环境下，在合成基因线路中把LacI结合位点放置在巨细胞病毒启动子(CMV)或者CAG启动子下游，可以抑制基因表达，虽然抑制效率在哺乳动物表达系统中低于原核表达系统。类似的，在哺乳动物系统中dCas9蛋白不融合任何转录抑制结构域也表现出弱的转录抑制功能。
TALER蛋白由若干个特异性识别DNA的串联“蛋白模块”和两侧的N-末端及C-末端序列组成。每个“蛋白模块”包含33-35个氨基酸残基，第12、13位氨基酸残基是靶向识别的关键位点，被称作重复可变的双连氨基酸残基(RVDs)位点。TALER蛋白上的每个RVD仅能识别一个碱基。TALEN(Transcription Activator-Like Effector Nuclease)是一种人工改造的限制性内切酶，是将TALER蛋白(作为DNA结合域)与限制性内切酶FokⅠ(作为DNA切割域，又称抑制结构域)融合而得到的TALEN融合蛋白。TALEN在细胞中与基因组的靶位点结合，形成二聚体发挥内切酶活性，导致左右TALEN的spacer区域发生双链DNA断裂(DSB，Double-Strand Breaks)，从而诱发DNA损伤修复机制。细胞可以通过非同源性末端接合机制(NHEJ,Non-homologous End Joining)修复DNA。NHEJ修复机制并不精确，极易发生错误(缺失/插入)，从而造成移码突变，因此可以达到基因敲除的目的。
发明内容
本发明的目的是提供利用TALE转录抑制子在哺乳动物细胞中模块化构建合成基因线路。
本发明保护的第一种实现两种蛋白可调控式表达的试剂盒，为如下(a)或(b)：
(a)包括表达盒甲-Ⅰ、表达盒乙-Ⅰ和表达盒丙的试剂盒；
(b)包括具有所述表达盒甲-Ⅰ的重组载体甲-Ⅰ、具有所述表达盒乙-Ⅰ的重组载体乙-Ⅰ和具有所述表达盒丙的重组载体丙的试剂盒；
所述表达盒甲-Ⅰ自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动子甲、通过自剪切多肽的编码基因连接的蛋白甲的编码基因和TALER蛋白甲的编码基因、靶序列甲-Ⅰ；所述靶序列甲-Ⅰ包括1个以上(具体可为4个)shRNA1的靶序列；
所述表达盒乙-Ⅰ自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动子乙、通过自剪切多肽的编码基因连接的蛋白乙的编码基因和TALER蛋白乙的编码基因、靶序列乙-Ⅰ；所述靶序列乙-Ⅰ包括1个以上(具体可为4个)shRNA2的靶序列；
所述表达盒甲-Ⅰ中，所述启动子甲的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白乙的靶点，或，所述启动子甲的上游不具有所述TALER蛋白乙的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白乙的靶点；
所述表达盒乙-Ⅰ中，所述启动子乙的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白甲的靶点，或，所述启动子乙的上游不具有所述TALER蛋白甲的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白甲的靶点；
所述表达盒丙自上游至下游依次包括组成型启动子和激活元件的编码序列；在所述激活元件的刺激下，位于所述反馈元件的编码序列的下游的DNA表达。
将具有所述表达盒甲-Ⅰ的重组载体甲-Ⅰ、具有所述表达盒乙-Ⅰ的重组载体乙-Ⅰ和具有所述表达盒丙的重组载体丙导入宿主细胞，通过加入shRNA1或shRNA2调控所述蛋白甲的表达和所述蛋白乙的表达。
所述表达盒甲-Ⅰ中，所述启动子甲的上游具有1个所述TALER蛋白乙的靶点且其下游具有1-3个所述TALER蛋白乙的靶点；
所述表达盒乙-Ⅰ中，所述启动子乙的上游具有1个所述TALER蛋白甲的靶点且其下游具有1-3个所述TALER蛋白甲的靶点。
所述表达盒甲-Ⅰ中，所述启动子甲上游的TALER蛋白乙的靶点与所述启动子甲下游最邻近的TALER蛋白乙的靶点之间的距离为72-100bp；
所述表达盒乙-Ⅰ中，所述启动子乙上游的TALER蛋白甲的靶点与所述启动子乙下游最邻近的TALER蛋白甲的靶点之间的距离为72-100bp。
本发明保护的第二种实现两种蛋白可调控式表达的试剂盒，为如下(a)或(b)：
(a)包括表达盒甲-Ⅰ、表达盒乙-Ⅰ和表达盒丙的试剂盒；
(b)包括具有所述表达盒甲-Ⅰ的重组载体甲-Ⅰ、具有所述表达盒乙-Ⅰ的重组载体乙-Ⅰ和具有所述表达盒丙的重组载体丙的试剂盒；
所述表达盒甲-Ⅰ自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动子甲、通过自剪切多肽的编码基因连接的蛋白甲的编码基因和TALER蛋白甲的编码基因、靶序列甲-Ⅰ；所述靶序列甲-Ⅰ包括shRNA1-1的靶序列、……、shRNA1-n的靶序列，n为2以上的自然数；
所述表达盒乙-Ⅰ自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动子乙、通过自剪切多肽的编码基因连接的蛋白乙的编码基因和TALER蛋白乙的编码基因、靶序列乙-Ⅰ；所述靶序列乙-Ⅰ包括shRNA2-1的靶序列、……、shRNA2-n的靶序列，n为2以上的自然数；
所述表达盒甲-Ⅰ中，所述启动子甲的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白乙的靶点，或，所述启动子甲的上游不具有所述TALER蛋白乙的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白乙的靶点；
所述表达盒乙-Ⅰ中，所述启动子乙的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白甲的靶点，或，所述启动子乙的上游不具有所述TALER蛋白甲的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白甲的靶点；
所述表达盒丙自上游至下游依次包括组成型启动子和激活元件的编码序列；在所述激活元件的刺激下，位于所述反馈元件的编码序列的下游的DNA表达。
将具有所述表达盒甲-Ⅰ的重组载体甲-Ⅰ、具有所述表达盒乙-Ⅰ的重组载体乙-Ⅰ和具有所述表达盒丙的重组载体丙导入宿主细胞，通过加入shRNA1-1、……、shRNA1-n、shRNA2-1、……或shRNA2-n调控所述蛋白甲的表达和所述蛋白乙的表达。
所述表达盒甲-Ⅰ中，所述启动子甲的上游具有1个所述TALER蛋白乙的靶点且其下游具有1-3个所述TALER蛋白乙的靶点；
所述表达盒乙-Ⅰ中，所述启动子乙的上游具有1个所述TALER蛋白甲的靶点且其下游具有1-3个所述TALER蛋白甲的靶点。
所述表达盒甲-Ⅰ中，所述启动子甲上游的TALER蛋白乙的靶点与所述启动子甲下游最邻近的TALER蛋白乙的靶点之间的距离为72-100bp；
所述表达盒乙-Ⅰ中，所述启动子乙上游的TALER蛋白甲的靶点与所述启动子乙下游最邻近的TALER蛋白甲的靶点之间的距离为72-100bp。
本发明保护的第三种实现两种蛋白可调控式表达的试剂盒，为如下(a)或(b)：
(a)包括表达盒甲-Ⅰ、表达盒乙-Ⅰ、表达盒丙和表达盒丁-Ⅰ的试剂盒；
(b)包括具有所述表达盒甲-Ⅰ的重组载体甲-Ⅰ、具有所述表达盒乙-Ⅰ的重组载体乙-Ⅰ、具有所述表达盒丙的重组载体丙和具有所述表达盒丁-Ⅰ的重组载体丁-Ⅰ的试剂盒；
所述表达盒甲-Ⅰ自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动子甲、通过自剪切多肽的编码基因连接的蛋白甲的编码基因和TALER蛋白甲的编码基因、靶序列甲-Ⅰ；所述靶序列甲-Ⅰ包括shRNA1-1的靶序列、……、shRNA1-n的靶序列，n为2以上的自然数；
所述表达盒乙-Ⅰ自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动子乙、通过自剪切多肽的编码基因连接的蛋白乙的编码基因和TALER蛋白乙的编码基因、靶序列乙-Ⅰ；所述靶序列乙-Ⅰ包括shRNA2-1的靶序列、……、shRNA2-n的靶序列，n为2以上的自然数；
所述表达盒丁-Ⅰ自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动子丁、通过自剪切多肽的编码基因连接的蛋白乙的编码基因和TALER蛋白乙的编码基因、靶序列丁；所述靶序列丁-Ⅰ包括shRNA3-1的靶序列、……、shRNA3-n的靶序列，n为2以上的自然数；
所述表达盒甲-Ⅰ中，所述启动子甲的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白乙的靶点，或，所述启动子甲的上游不具有所述TALER蛋白乙的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白乙的靶点；
所述表达盒乙-Ⅰ中，所述启动子乙的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白甲的靶点，或，所述启动子乙的上游不具有所述TALER蛋白甲的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白甲的靶点；
所述表达盒丁-Ⅰ中，所述启动子丁的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白甲的靶点，或，所述启动子丁的上游不具有所述TALER蛋白甲的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白甲的靶点；
所述表达盒丙自上游至下游依次包括组成型启动子和激活元件的编码序列；在所述激活元件的刺激下，位于所述反馈元件的编码序列的下游的DNA表达。
将具有所述表达盒甲-Ⅰ的重组载体甲-Ⅰ、具有所述表达盒乙-Ⅰ的重组载体乙-Ⅰ、具有所述表达盒丙的重组载体丙和具有所述表达盒丁-Ⅰ的重组载体丁-Ⅰ导入宿主细胞，通过加入shRNA1-1、……、shRNA1-n、shRNA2-1、……、shRNA2-n、shRNA3-1、……或shRNA3-n调控所述蛋白甲的表达和所述蛋白乙的表达。
所述表达盒甲-Ⅰ中，所述启动子甲的上游具有1个所述TALER蛋白乙的靶点且其下游具有1-3个所述TALER蛋白乙的靶点；
所述表达盒乙-Ⅰ中，所述启动子乙的上游具有1个所述TALER蛋白甲的靶点且其下游具有1-3个所述TALER蛋白甲的靶点；
所述表达盒丁-Ⅰ中，所述启动子丁的上游具有1个所述TALER蛋白甲的靶点且其下游具有1-3个所述TALER蛋白甲的靶点。
所述表达盒甲-Ⅰ中，所述启动子甲上游的TALER蛋白乙的靶点与所述启动子甲下游最邻近的TALER蛋白乙的靶点之间的距离为72-100bp；
所述表达盒乙-Ⅰ中，所述启动子乙上游的TALER蛋白甲的靶点与所述启动子乙下游最邻近的TALER蛋白甲的靶点之间的距离为72-100bp；
所述表达盒丁-Ⅰ中，所述启动子丁上游的TALER蛋白甲的靶点与所述启动子丁下游最邻近的TALER蛋白甲的靶点之间的距离为72-100bp。
本发明保护的第一种从混合细胞中分选细胞甲和/或细胞乙的试剂盒，为如下(a)或(b)：
(a)包括表达盒甲-Ⅱ、表达盒乙-Ⅱ和表达盒丙的试剂盒；
(b)包括具有所述表达盒甲-Ⅱ的重组载体甲-Ⅱ、具有所述表达盒乙-Ⅱ的重组载体乙-Ⅱ和具有所述表达盒丙的重组载体丙的试剂盒；
所述表达盒甲-Ⅱ自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动子甲、通过自剪切多肽的编码基因连接的荧光蛋白甲的编码基因和TALER蛋白甲的编码基因、靶序列甲-Ⅱ；所述靶序列甲-Ⅱ包括1个以上(具体可为4个)miRNA1的靶序列；
所述表达盒乙-Ⅱ自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动子乙、通过自剪切多肽的编码基因连接的荧光蛋白乙的编码基因和TALER蛋白乙的编码基因、靶序列乙-Ⅱ；所述靶序列乙-Ⅱ包括1个以上(具体可为4个)miRNA2的靶序列；
所述表达盒甲-Ⅱ中，所述启动子甲的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白乙的靶点，或，所述启动子甲的上游不具有所述TALER蛋白乙的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白乙的靶点；
所述表达盒乙-Ⅱ中，所述启动子乙的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白甲的靶点，或，所述启动子乙的上游不具有所述TALER蛋白甲的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白甲的靶点；
所述表达盒丙自上游至下游依次包括组成型启动子和激活元件的编码序列；在所述激活元件的刺激下，位于所述反馈元件的编码序列的下游的DNA表达；
所述miRNA1为所述细胞甲具有的特定miRNA；所述miRNA2为所述细胞乙具有的特定miRNA；
所述荧光蛋白甲和所述荧光蛋白乙具有不同的荧光颜色。
将具有表达盒甲-Ⅱ的重组载体甲-Ⅱ、具有表达盒乙-Ⅱ的重组载体乙-Ⅱ和具有表达盒丙的重组载体丙导入所述混合细胞，通过检测荧光蛋白甲和/或荧光蛋白乙的强度分选所述细胞甲和/或所述细胞乙。
所述表达盒甲-Ⅱ中，所述启动子甲的上游具有1个所述TALER蛋白乙的靶点且其下游具有1-3个所述TALER蛋白乙的靶点；
所述表达盒乙-Ⅱ中，所述启动子乙的上游具有1个所述TALER蛋白甲的靶点且其下游具有1-3个所述TALER蛋白甲的靶点。
所述表达盒甲-Ⅱ中，所述启动子甲上游的TALER蛋白乙的靶点与所述启动子甲下游最邻近的TALER蛋白乙的靶点之间的距离为72-100bp；
所述表达盒乙-Ⅱ中，所述启动子乙上游的TALER蛋白甲的靶点与所述启动子乙下游最邻近的TALER蛋白甲的靶点之间的距离为72-100bp。
本发明保护的第二种从混合细胞中分选细胞甲和/或细胞乙的试剂盒，为如下(a)或(b)：
(a)包括表达盒甲-Ⅱ、表达盒乙-Ⅱ和表达盒丙的试剂盒；
(b)包括具有所述表达盒甲-Ⅱ的重组载体甲-Ⅱ、具有所述表达盒乙-Ⅱ的重组载体乙-Ⅱ和具有所述表达盒丙的重组载体丙的试剂盒；
所述表达盒甲-Ⅱ自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动子甲、通过自剪切多肽的编码基因连接的荧光蛋白甲的编码基因和TALER蛋白甲的编码基因、靶序列甲-Ⅱ；所述靶序列甲-Ⅱ包括miRNA1-1的靶序列、……、miRNA1-n的靶序列，n为2以上的自然数；
所述表达盒乙-Ⅱ自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动子乙、通过自剪切多肽的编码基因连接的荧光蛋白乙的编码基因和TALER蛋白乙的编码基因、靶序列乙-Ⅱ；所述靶序列乙-Ⅱ包括miRNA2-1的靶序列、……、miRNA2-n的靶序列，n为2以上的自然数；
所述表达盒甲-Ⅱ中，所述启动子甲的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白乙的靶点，或，所述启动子甲的上游不具有所述TALER蛋白乙的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白乙的靶点；
所述表达盒乙-Ⅱ中，所述启动子乙的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白甲的靶点，或，所述启动子乙的上游不具有所述TALER蛋白甲的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白甲的靶点；
所述表达盒丙自上游至下游依次包括组成型启动子和激活元件的编码序列；在所述激活元件的刺激下，位于所述反馈元件的编码序列的下游的DNA表达；
所述miRNA1-1、……、miRNA1-n为细胞甲具有的特定miRNA；
所述miRNA2-1、……、miRNA2-n为细胞乙具有的特定miRNA；
所述荧光蛋白甲和所述荧光蛋白乙具有不同的荧光颜色。
将具有表达盒甲-Ⅱ的重组载体甲-Ⅱ、具有表达盒乙-Ⅱ的重组载体乙-Ⅱ和具有表达盒丙的重组载体丙导入所述混合细胞，通过检测荧光蛋白甲和/或荧光蛋白乙的强度分选所述细胞甲和/或所述细胞乙。
所述表达盒甲-Ⅱ中，所述启动子甲的上游具有1个所述TALER蛋白乙的靶点且其下游具有1-3个所述TALER蛋白乙的靶点；
所述表达盒乙-Ⅱ中，所述启动子乙的上游具有1个所述TALER蛋白甲的靶点且其下游具有1-3个所述TALER蛋白甲的靶点。
所述表达盒甲-Ⅱ中，所述启动子甲上游的TALER蛋白乙的靶点与所述启动子甲下游最邻近的TALER蛋白乙的靶点之间的距离为72-100bp；
所述表达盒乙-Ⅱ中，所述启动子乙上游的TALER蛋白甲的靶点与所述启动子乙下游最邻近的TALER蛋白甲的靶点之间的距离为72-100bp。
本发明保护的第三种从混合细胞中分选细胞甲和/或细胞乙的试剂盒，为如下(a)或(b)：
(a)包括表达盒甲-Ⅱ、表达盒乙-Ⅱ、表达盒丙和表达盒丁-Ⅱ的试剂盒；
(b)包括具有所述表达盒甲-Ⅱ的重组载体甲-Ⅱ、具有所述表达盒乙-Ⅱ的重组载体乙-Ⅱ、具有所述表达盒丙的重组载体丙和具有所述表达盒丙-Ⅱ的重组载体丙-Ⅱ的试剂盒；
所述表达盒甲-Ⅱ自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动子甲、通过自剪切多肽的编码基因连接的所述荧光蛋白甲的编码基因和TALER蛋白甲的编码基因、靶序列甲-Ⅱ；所述靶序列甲-Ⅱ包括miRNA1-1的靶序列、……、miRNA1-n的靶序列，n为2以上的自然数；
所述表达盒乙-Ⅱ自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动子乙、通过自剪切多肽的编码基因连接的所述荧光蛋白乙的编码基因和TALER蛋白乙的编码基因、靶序列乙-Ⅱ；所述靶序列乙-Ⅱ包括miRNA2-1的靶序列、……、miRNA2-n的靶序列，n为2以上的自然数；
所述表达盒丁-Ⅱ自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动子乙、通过自剪切多肽的编码基因连接的所述荧光蛋白乙的编码基因和TALER蛋白乙的编码基因、靶序列丁-Ⅱ；所述靶序列丁-Ⅱ包括miRNA3-1的靶序列、……、miRNA3-n的靶序列，n为2以上的自然数；
所述表达盒甲-Ⅱ中，所述启动子甲的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白乙的靶点，或，所述启动子甲的上游不具有所述TALER蛋白乙的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白乙的靶点；
所述表达盒乙-Ⅱ中，所述启动子乙的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白甲的靶点，或，所述启动子乙的上游不具有所述TALER蛋白甲的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白甲的靶点；
所述表达盒丁-Ⅱ中，所述启动子乙的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白甲的靶点，或，所述启动子乙的上游不具有所述TALER蛋白甲的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白甲的靶点；
所述表达盒丙自上游至下游依次包括组成型启动子和激活元件的编码序列；在所述激活元件的刺激下，位于所述反馈元件的编码序列的下游的DNA表达。
所述miRNA1-1、……、miRNA1-n为细胞甲具有的特定miRNA；
所述miRNA2-1、……、miRNA2-n为细胞乙具有的特定miRNA；
所述miRNA3-1、……、miRNA3-n为细胞乙具有的特定miRNA；
所述荧光蛋白甲和所述荧光蛋白乙具有不同的荧光颜色。
将具有表达盒甲-Ⅱ的重组载体甲-Ⅱ、具有表达盒乙-Ⅱ的重组载体乙-Ⅱ、具有表达盒丙的重组载体丙和具有表达盒丁-Ⅱ的重组载体丁-Ⅱ导入所述混合细胞，通过检测荧光蛋白甲和/或荧光蛋白乙的强度分选所述细胞甲和/或所述细胞乙。
所述表达盒甲-Ⅱ中，所述启动子甲的上游具有1个所述TALER蛋白乙的靶点且其下游具有1-3个所述TALER蛋白乙的靶点；
所述表达盒乙-Ⅱ中，所述启动子乙的上游具有1个所述TALER蛋白甲的靶点且其下游具有1-3个所述TALER蛋白甲的靶点；
所述表达盒丁-Ⅱ中，所述启动子乙的上游具有1个所述TALER蛋白甲的靶点且其下游具有1-3个所述TALER蛋白甲的靶点。
所述表达盒甲-Ⅱ中，所述启动子甲上游的TALER蛋白乙的靶点与所述启动子甲下游最邻近的TALER蛋白乙的靶点之间的距离为72-100bp；
所述表达盒乙-Ⅱ中，所述启动子乙上游的TALER蛋白甲的靶点与所述启动子乙下游最邻近的TALER蛋白甲的靶点之间的距离为72-100bp；
所述表达盒丁-Ⅱ中，所述启动子乙上游的TALER蛋白甲的靶点与所述启动子乙下游最邻近的TALER蛋白甲的靶点之间的距离为72-100bp。
所述表达盒甲-Ⅰ或所述表达盒甲-Ⅱ中，所述反馈元件的编码序列具体可为5×UAS序列，所述启动子甲具体可为CMVmini启动子。所述表达盒乙-Ⅰ或所述表达盒乙-Ⅱ中，所述反馈元件的编码序列具体可为5×UAS序列，所述启动子乙具体可为CMVmini启动子。所述表达盒丙中，所述组成型启动子具体可为CAG启动子，所述激活元件的编码序列具体可为Gal4/vp16的编码基因。所述表达盒丁-Ⅰ或所述表达盒丁-Ⅱ中，所述反馈元件的编码序列具体可为5×UAS序列，所述启动子丁具体可为CMVmini启动子。
所述5×UAS序列可为实施例1-6中所涉及到的所有含有5×UAS序列的质粒中的任一所述5×UAS序列。所述CMVmini启动子可为实施例1-6中所涉及到的所有含有CMVmini启动子的质粒中的任一所述CMVmini启动子。所述CAG启动子可为实施例1-6中所涉及到的所有含有CAG启动子的质粒中的任一所述CAG启动子。所述Gal4/vp16的编码基因可为实施例1-6中所涉及到的所有含有Gal4/vp16的编码基因的质粒中的任一所述CAG启动子。
所述TALER蛋白甲的编码基因可为实施例1-6中所涉及到的所有含有TALER蛋白的编码基因的质粒中的任一所述TALER蛋白的编码基因。所述TALER蛋白乙的编码基因可为实施例1-6中所涉及到的所有含有TALER蛋白的编码基因的质粒中的任一所述TALER蛋白的编码基因。所述TALER蛋白甲的靶点可为实施例1-6中所涉及到的所有含有TALER蛋白的靶点序列的质粒中的任一所述TALER蛋白的靶点序列。所述TALER蛋白乙的靶点可为实施例1-6中所涉及到的所有含有TALER蛋白的靶点序列的质粒中的任一所述TALER蛋白的靶点序列。
所述自剪切多肽的编码基因(又称2A连接肽)的编码基因可为实施例1-6中的任一所述质粒中的2A连接肽的编码基因或自剪切多肽的编码基因。
所述荧光蛋白甲具体可为mKate2或EYFP。所述荧光蛋白乙具体可为mKate2或EYFP。所述mKate2的编码基因可为实施例1-6中所涉及到的所有含有mKate2的编码基因的质粒中的任一所述mKate2的编码基因。所述EYFP的编码基因可为实施例1-6中所涉及到的所有含有EYFP的编码基因的质粒中的任一所述EYFP的编码基因。
所述shRNA1的靶序列具体可为shRNA-FF3的靶序列、shRNA-FF4的靶序列、shRNA-FF5的靶序列或shRNA-FF6的靶序列。所述shRNA2的靶序列具体可为shRNA-FF3的靶序列、shRNA-FF4的靶序列、shRNA-FF5的靶序列或shRNA-FF6的靶序列。所述shRNA1-1的靶序列、……、shRNA1-n的靶序列、shRNA2-1的靶序列、……、shRNA2-n的靶序列、shRNA2-1的靶序列、……或shRNA2-n的靶序列具体可为shRNA-FF3的靶序列、shRNA-FF4的靶序列、shRNA-FF5的靶序列或shRNA-FF6的靶序列。所述shRNA-FF3的靶序列具体可为实施例1-6 中任一所述质粒中的shRNA-FF3的靶序列。所述shRNA-FF4的靶序列具体可为实施例1-6中任一所述质粒中的shRNA-FF4的靶序列。所述shRNA-FF5的靶序列具体可为实施例1-6中任一所述质粒中的shRNA-FF5的靶序列。所述shRNA-FF6的靶序列具体可为实施例1-6中任一所述质粒中的shRNA-FF6的靶序列。
所述shRNA1具体可为shRNA-FF3的编码基因编码的RNA、shRNA-FF4的编码基因编码的RNA、shRNA-FF5的编码基因编码的RNA或shRNA-FF6的编码基因编码的RNA。所述shRNA2具体可为shRNA-FF3的编码基因编码的RNA、shRNA-FF4的编码基因编码的RNA、shRNA-FF5的编码基因编码的RNA或shRNA-FF6的编码基因编码的RNA。所述shRNA3具体可为shRNA-FF3的编码基因编码的RNA、shRNA-FF4的编码基因编码的RNA、shRNA-FF5的编码基因编码的RNA或shRNA-FF6的编码基因编码的RNA。所述shRNA-FF3的编码基因可为实施例1-6中任一所述质粒中的shRNA-FF3的编码基因。所述shRNA-FF4的编码基因可为实施例1-6中任一所述质粒中的shRNA-FF4的编码基因。所述shRNA-FF5的编码基因可为实施例1-6中任一所述质粒中的shRNA-FF5的编码基因。所述shRNA-FF6的编码基因可为实施例1-6中任一所述质粒中的shRNA-FF6的编码基因。
所述miRNA1的靶序列具体可为miR21的靶序列、miR18a的靶序列、miR19ab的靶序列或miR191的靶序列。所述miRNA2的靶序列具体可为miR21的靶序列、miR18a的靶序列、miR19ab的靶序列或miR191的靶序列。所述miRNA1-1的靶序列、……、miRNA1-n的靶序列、miRNA2-1的靶序列、……、miRNA2-n的靶序列、miRNA3-1的靶序列、……或miRNA3-n的靶序列具体可为miR21的靶序列、miR18a的靶序列、miR19ab的靶序列或miR191的靶序列。所述miR21的靶序列具体可为实施例1-6中任一所述质粒中的miR21的靶序列。所述miR18a的靶序列具体可为实施例1-6中任一所述质粒中的miR18a的靶序列。所述miR19ab的靶序列具体可为实施例1-6中任一所述质粒中的miR19ab的靶序列。所述miR191的靶序列具体可为实施例1-6中任一所述质粒中的miR191的靶序列。
所述重组载体丙具体可为pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒或pCAG-Gal4/vp16质粒。
所述重组载体甲-Ⅰ具体可为实施例中的pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒、pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER12-4xTarget^FF6质粒、pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF4质粒、pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER21-4xTarget^FF3质粒、pT10+T10x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒、pT10+T10x3+72-mKate2-2A-TALER12-4xTarget^FF6质粒、pT10+T10x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF4质粒、pT10+T10x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF5质粒、pT10+T10x3+72-mKate2-2A-TALER21-4xTarget^FF3质粒、pT12+T12x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒、pT12+T12x3+72-EYFP-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒、pT12+T12x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF4质粒、pT12+T12x3+72-mKate2-2A-TALER21-4xTarget^FF3质粒、pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒、pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER12-4xTarget^FF5质粒、pT14+T14x3+72-mKate2-2A-TALER21-4xTarget^FF3质粒、pT21+T21x3+72-EYFP-2A-TALER14-4xTarget^FF4质粒、pT21+T21x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒、pT21+T21x3+72-EYFP-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒、pT21+T21x3+72-EYFP-2A-TALER12-4xTarget^FF5质粒、pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒或pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF5质粒。
所述重组载体乙-Ⅰ具体可为实施例中的pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒、pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER12-4xTarget^FF6质粒、pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF4质粒、pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER21-4xTarget^FF3质粒、pT10+T10x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒、pT10+T10x3+72-mKate2-2A-TALER12-4xTarget^FF6质粒、pT10+T10x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF4质粒、pT10+T10x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF5质粒、pT10+T10x3+72-mKate2-2A-TALER21-4xTarget^FF3质粒、pT12+T12x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒、pT12+T12x3+72-EYFP-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒、pT12+T12x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF4质粒、pT12+T12x3+72-mKate2-2A-TALER21-4xTarget^FF3质粒、pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒、pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER12-4xTarget^FF5质粒、pT14+T14x3+72-mKate2-2A-TALER21-4xTarget^FF3质粒、pT21+T21x3+72-EYFP-2A-TALER14-4xTarget^FF4质粒、pT21+T21x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒、pT21+T21x3+72-EYFP-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒、pT21+T21x3+72-EYFP-2A-TALER12-4xTarget^FF5质粒、pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒或pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF5质粒。
所述宿主细胞具体可为HEK293细胞、HeLa细胞、HeLa：TagBFP或HEK293：iRFP_shRNA-FF4。
利用四环素(Dox)诱导系统，发明人用改造哺乳动物细胞系的方法展示了TALER蛋白对基因表达的抑制调控是可逆的，并且具有相对迅速的动态响应。发明人还开发了一个数学模型，仅基于发明人所测量的TALER各自的输入/输出转移函数，定量预测级联的TALER和由两个相互抑制的TALER构建的TALER开关的稳定状态。此外，发明人展示了闭环结构的TALER开关相比于开环结构的TALER开关对合成的短发夹RNA(shRNA)信号具有更好的灵敏度。最后，发明人在混合细胞群中构建了受细胞特异性microRNA调控的TALER开关，对于两种共培养的癌细胞表现出差异性的输出，显著提升了分类准确性。总体而言，这些实验结果表明，发明人提供了一系列正交的、可逆的TALER元件库，能够作为标准化的基因元件用于在哺乳动物细胞中合成基因线路的模块化组装，并具有可预测可编程的特性。发明人的结果也表明，TALER开关可以应用于有精确的细胞分类需求的体外生物技术，而这与许多生物医学应用有重要联系，如癌症的基因治疗。此外，这些TALER元件也有助于构建合成网络模体，以探索哺乳动物细胞中转录层次和microRNA介导转录后层次相结合调控的设计原则。
工程化构造复杂的基因线路通受到缺少正交和可逆的转录抑制元件阻碍。本文中，发明人展示了在哺乳动物细胞中，快速、工程化构建可逆和正交的TALE抑制子与其相应的启动子，利用空间位阻进行转录抑制。前10个最强的TALER有效的抑制与它们相应的启动子，而对其他9种启动子几乎没有影响。由于TALE的不同的双残基重复单元(RVD)带来的模块化，利用高通量克隆方法，TALER文库可以很容易的构建和扩展。对结构明确的内源基因启动子利用TALER的空间位阻对其转录进行抑制也是可能的。
合成生物学旨在利用工程化的原则的，模块化构建定义清晰的合成基因线路。然而，在哺乳动物细胞中的基因线路，合成其组分、定量描述和预测其功能仍然是很重要的挑战。在发明人的工作中，通过使用多荧光的Dox诱导系统，同时测量了TALER元件的输入和输出水平，并建立了颜色模型，它可以对输入和输出的荧光水平进行标准化。发明人通过基于实验的输入/输出转移函数发现，一些TALER的性质可以用来构建TALER级联和开关，并能够定量预测它们的结果。而且，更准确的预测可能需要更进一步的特性测试与建模。比如，分级分析可能有助于消除瞬时转染时的拷贝数差异。对于种种其它基因线路模体，考虑TALER的动态特性以提升预测的准确性也是很有必要的。
已有人证实，反馈和前馈的模式在协调转录和转录后调控基因表达中起到很重要的作用。然而，对一个核心转录调控模式的研究和理解往往被自然的遗传网络中存在的不希望的相互调控所阻碍。发明人一系列的正交、定义明确的TALER库对于构建一个包含转录和转录后调控的基因线路是一个很有价值的工具。举例来说，发明人证明了闭环TALER开关相比与开环的TALER开关在相应一个shRNA的输入时，有更优越的状态转换。已经表明，可在细胞膜上产生自发极性的3个最小核心模式其中一个模式含有相互抑制调控。类似的，发明人通过添加或去除正、负反馈来评估不同的拓扑结构对TALER开关性能的影响，有助于更好的理解稳定性强的TALER开关的设计原则。
能够感测多个内源性分子信号的基因线路才可以对活细胞进行的复杂操作。RNA干扰提供了合成基因线路和在哺乳动物细胞中的内源性分子输入之间的通道，模块化和可扩展的接口。在本发明中，发明人表明内源microRNA可被用于控制TALER开关的状态，并且TALER开关对于shRNA调控的灵敏度可以通过调整两种组分的比例调整。发明人还表明，两种细胞类型特异的microRNA可以严格控制TALER开关的输出，从而实现在混合的细胞群中精确的进行细胞分类。因此，发明人的研究结果为选择可以感受细胞特异性microRNA的TALER开关的构建提供便利，可以直接从TALER库中选择合适的TALER以满足不同表达水平的需求。此外，TALER开关可以用于模块化构建更复杂的逻辑基因线路，比如通过使用逻辑设计框架，更精确地探测细胞类型特异性microRNA，或者用于可编程的记忆元件来追踪细胞内的事件和信号过程。只要高效的体内细胞递送和基因线路的功能长期稳定等条件得到解决，将来的TALER开关将广泛用于生物医学中。
合成生物学的核心理念是使用标准化的、可互换的基因元件合理地设计与预测，并实现合成基因线路。然而，现有的基因元件库缺乏具有清晰的功能描述，快速的时间响应和正交的调控转录性的抑制子。这限制了在哺乳动物细胞中构建复杂的基因线路。本发明中，发明人构建了TALE(转录激活子类似因子)抑制子蛋白库，共包含26种正交的、可逆的TALE抑制子，并新设计了能够与其结合的合成启动子。通过两者相结合形成对转录起始关键性因子的空间位阻，从而抑制转录。发明人展示了利用输入/输出转移函数可以精确预测TALE转录抑制子(TALER)的级联和开关效应，也展示了通过使用反馈调节，TALER开关在基于microRNA的癌细胞分类上有更好的精确度。发明人构建的正交、可逆的TALER蛋白库，其对于模块化的合成基因线路、可编程的哺乳动物细胞操作是一个很有价值工具，并且有助于解释转录层次和microRNA介导转录后层次相结合调控的设计原则。
附图说明
图1为TALER蛋白的作用机理示意图。
图2为pCMV-TALERx质粒、pTx+Tx+质粒和pEF1a-TagBFP-2A质粒的作用机理示意图。
图3为实施例1的步骤一的结果。
图4为实施例2的步骤二的结果。
图5为实施例2的步骤一的结果。
图6为实施例2的步骤二的结果。
图7为实施例2的步骤三的结果。
图8为实施例2的步骤四的结果。
图9为实施例3的步骤一的结果。
图10为实施例3的步骤二的结果。
图11为实施例4的步骤一的结果。
图12为实施例4的步骤二的结果。
图13为实施例5的步骤一的结果。
图14和图15为实施例5的步骤二的结果。
图16为实施例6的步骤一的结果。
图17至图20为实施例6的步骤二的结果。
图21为进一步扩展的基因线路。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的定量试验，均设置三次重复，结果取平均值。HEK293细胞：Invitrogen公司。TALER蛋白的作用机理示意图见图1。
实施例1和实施例2中用质粒转染细胞的方式：取24孔板，每孔接种0.5mL HEK293细胞悬液(含6×104个HEK293细胞)，培养24小时后，更换新的DMEM培养基，然后进行质粒转染。
实施例1、TALER蛋白的功能验证和特异性分析
pCMV-TALERx质粒、pTx+Tx+质粒和pEF1a-TagBFP-2A质粒的作用机理示意图见图2。在pEF1a启动子的作用下，TagBFP和Gal4/vp16被表达(TagBFP和Gal4/vp16之间的2A连接肽为自剪接肽，所以TagBFP可以代表Gal4/vp16的表达量)。Gal4/vp16激活5×UAS序列，从而激活CMVmini启动子的转录起始，mKate2被表达。在CMV启动子的作用下，EYFP和TALER1蛋白被表达(EYFP和TALER1蛋白之间的2A连接肽为自剪接肽，所以EYFP可以代表TALER1蛋白的表达量)。TALER1蛋白结合T1序列，通过空间位阻发挥转录抑制作用，两个T1序列之间的CMVmini启动子失活，从而mKate2被抑制表达。
pCMV-TALER1质粒如序列1所示。序列1中，自5’末端第1-589位核苷酸为CMV启动子，第603-1319位核苷酸为EYFP(增强型黄色荧光蛋白)的编码基因，第1326-1379位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第1389-4220位核苷酸为TALER1蛋白的编码基因，第4227-4259位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pT1+T1+质粒如序列27所示。序列27中，自5’末端第4275-4367位核苷酸为5×UAS序列，第4383-4396位核苷酸为T1序列(TALER1蛋白的靶点序列)，第4403-4462位核苷酸为CMVmini启动子，第4469-4482位核苷酸为T1序列，第4532-5237位核苷酸为mKate2(远红荧光蛋白)的编码基因。
pEF1a-TagBFP-2A质粒如序列53所示。序列53中，自5’末端第4250-5423位核苷酸为pEF1a(启动子)，第5488-6177位核苷酸为TagBFP(蓝色荧光蛋白)的编码基因，第6178-6243位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第6250-6933位核苷酸为Gal4/vp16(融合转录因子)的编码基因。
pCMV-TALER2质粒如序列2所示。序列2中，第1-589位核苷酸为CMV启动子，第603-1319位核苷酸为EYFP的编码基因，第1326-1379位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第1389-4220位核苷酸为TALER2蛋白的编码基因，第4227-4259位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER4质粒如序列3所示。序列3中，第1713-2301位核苷酸为CMV启动子，第2315-3031位核苷酸为EYFP的编码基因，第3038-3091位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第3101-5932位核苷酸为TALER4蛋白的编码基因，第5939-5971位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER5质粒如序列4所示。序列4中，第5842-6430位核苷酸为CMV启动子，第6444-7160位核苷酸为EYFP的编码基因，第7167-7220位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第7230-2387位核苷酸为TALER5蛋白的编码基因，第2394-2426位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER9质粒如序列5所示。序列5中，第6148-6736位核苷酸为CMV启动子，第6750-7466位核苷酸为EYFP的编码基因，第7473-7526位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第7536-2693位核苷酸为TALER9蛋白的编码基因，第2700-2732位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER10质粒如序列6所示。序列6中，第1792-2380位核苷酸为CMV启动子，第2394-3110位核苷酸为EYFP的编码基因，第3117-3170位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第3180-6623位核苷酸为TALER10蛋白的编码基因，第6630-6662位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER11质粒如序列7所示。序列7中，第1766-2354位核苷酸为CMV启动子，第2368-3084位核苷酸为EYFP的编码基因，第3091-3144位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第3154-6597位核苷酸为TALER11蛋白的编码基因，第6604-6636位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER12质粒如序列8所示。序列8中，第1705-2293位核苷酸为CMV启动子，第2307-3023位核苷酸为EYFP的编码基因，第3030-3083位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第3093-6332位核苷酸为TALER12蛋白的编码基因，第6339-6371位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER13质粒如序列9所示。序列9中，第1687-2275位核苷酸为CMV启动子，第2289-3005位核苷酸为EYFP的编码基因，第3012-3065位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第3075-6212位核苷酸为TALER13蛋白的编码基因，第6219-6251位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER14质粒如序列10所示。序列10中，第1764-2352位核苷酸为CMV启动子，第2366-3082位核苷酸为EYFP的编码基因，第3089-3142位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第3152-6289位核苷酸为TALER14蛋白的编码基因，第6296-6328位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER15质粒如序列11所示。序列11中，第1-589位核苷酸为CMV启动子，第603-1319位核苷酸为EYFP的编码基因，第1326-1379位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第1394-4597位核苷酸为TALER15蛋白的编码基因，第4605-4637位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER16质粒如序列12所示。序列12中，第1-589位核苷酸为CMV启动子，第603-1319位核苷酸为EYFP的编码基因，第1326-1379位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第1394-4597位核苷酸为TALER16蛋白的编码基因，第4605-4637位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER17质粒如序列13所示。序列13中，第1-589位核苷酸为CMV启动子，第603-1319位核苷酸为EYFP的编码基因，第1326-1379位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第1394-4597位核苷酸为TALER17蛋白的编码基因，第4605-4637位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER18质粒如序列14所示。序列14中，第1-589位核苷酸为CMV启动子，第603-1319位核苷酸为EYFP的编码基因，第1326-1379位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第1394-4597位核苷酸为TALER18蛋白的编码基因，第4605-4637位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER19质粒如序列15所示。序列15中，第1711-2299位核苷酸为CMV启动子，第2313-3029位核苷酸为EYFP的编码基因，第3036-3089位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第3099-6440位核苷酸为TALER19蛋白的编码基因，第6447-6479位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER20质粒如序列16所示。序列16中，第1-589位核苷酸为CMV启动子，第603-1319位核苷酸为EYFP的编码基因，第1326-1379位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第1394-4597位核苷酸为TALER20蛋白的编码基因，第4605-4637位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER21质粒如序列17所示。序列17中，第1616-2204位核苷酸为CMV启动子，第2218-2934位核苷酸为EYFP的编码基因，第2941-2994位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第3004-6345位核苷酸为TALER21蛋白的编码基因，第6352-6384位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER22质粒如序列18所示。序列18中，第1-589位核苷酸为CMV启动子，第603-1319位核苷酸为EYFP的编码基因，第1326-1379位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第1394-3985位核苷酸为TALER22蛋白的编码基因，第3993-4025位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER23质粒如序列19所示。序列19中，第1-589位核苷酸为CMV启动子，第603-1319位核苷酸为EYFP的编码基因，第1326-1379位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第1394-3985位核苷酸为TALER23蛋白的编码基因，第3993-4025位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER24质粒如序列20所示。序列20中，第1-589位核苷酸为CMV启动子，第603-1319位核苷酸为EYFP的编码基因，第1326-1379位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第1394-3985位核苷酸为TALER24蛋白的编码基因，第3993-4025位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER26质粒如序列21所示。序列21中，第1679-2267位核苷酸为CMV启动子，第2281-2997位核苷酸为EYFP的编码基因，第3004-3057位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第3064-6009位核苷酸为TALER26蛋白的编码基因，第6024-6045位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER29质粒如序列22所示。序列22中，第1638-2226位核苷酸为CMV启动子，第2240-2956位核苷酸为EYFP的编码基因，第2963-3016位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第3023-5560位核苷酸为TALER29蛋白的编码基因，第5575-5596位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER30质粒如序列23所示。序列23中，第1838-2426位核苷酸为CMV启动子，第2440-3156位核苷酸为EYFP的编码基因，第3163-3216位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第3223-5760位核苷酸为TALER30蛋白的编码基因，第5775-5796位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER31质粒如序列24所示。序列24中，第3403-3991位核苷酸为CMV启动子，第4005-4721位核苷酸为EYFP的编码基因，第4728-4781位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第4788-7325位核苷酸为TALER31蛋白的编码基因，第7340-7361位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER32质粒如序列25所示。序列25中，第1691-2279位核苷酸为CMV启动子，第2293-3009位核苷酸为EYFP的编码基因，第3016-3069位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第3076-5613位核苷酸为TALER32蛋白的编码基因，第5628-5649位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER35如序列26所示。序列26中，第1607-2195位核苷酸为CMV启动子，第2209-2925位核苷酸为EYFP的编码基因，第2932-2985位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第2992-5529位核苷酸为TALER35蛋白的编码基因，第5544-5565位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pT2+T2+质粒如序列28所示。序列28中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-190位核苷酸为T2序列(TALER2蛋白的靶点序列)，第197-256位核苷酸为CMVmini启动子，第263-276位核苷酸为T2序列，第355-1073位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT4+T4+质粒如序列29所示。序列29中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-190位核苷酸为T4序列(TALER4蛋白的靶点序列)，第197-256位核苷酸为CMVmini启动子，第263-276位核苷酸为T4序列，第355-1073位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT5+T5+质粒如序列30所示。序列30中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-194位核苷酸为T5序列(TALER5蛋白的靶点序列)，第201-260位核苷酸为CMVmini启动子，第267-284位核苷酸为T5序列，第363-1081位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT9+T9+质粒如序列31所示。序列31中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-197位核苷酸为T9序列(TALER9蛋白的靶点序列)，第204-263位核苷酸为CMVmini启动子，第270-290位核苷酸为T9序列，第369-1087位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT10+T10+质粒如序列32所示。序列32中，自5’末端第7069-7161位核苷酸为5×UAS序列，第7177-7196位核苷酸为T10序列(TALER10蛋白的靶点序列)，第7203-7262位核苷酸为CMVmini启动子，第7269-7288位核苷酸为T10序列，第78-796位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT11+T11+质粒如序列33所示。序列33中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-196位核苷酸为T11序列(TALER11蛋白的靶点序列)，第203-262位核苷酸为CMVmini启动子，第269-288位核苷酸为T11序列，第367-1085位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT12+T12+质粒如序列34所示。序列34中，自5’末端第7069-7161位核苷酸为5×UAS序列，第7177-7194位核苷酸为T12序列(TALER12蛋白的靶点序列)，第7201-7260位核苷酸为CMVmini启动子，第7267-7284位核苷酸为T12序列，第78-796位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT13+T13+质粒如序列35所示。序列35中，自5’末端第7069-7161位核苷酸为5×UAS序列，第7177-7193位核苷酸为T13序列(TALER13蛋白的靶点序列)，第7200-7259位核苷酸为CMVmini启动子，第7266-7282位核苷酸为T13序列，第78-796位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT14+T14+质粒如序列36所示。序列36中，自5’末端第7069-7161位核苷酸为5×UAS序列，第7177-7193位核苷酸为T14序列(TALER14蛋白的靶点序列)，第7200-7259位核苷酸为CMVmini启动子，第7266-7282位核苷酸为T14序列，第78-796位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT15+T15+质粒如序列37所示。序列37中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-201位核苷酸为T15序列(TALER15蛋白的靶点序列)，第208-267位核苷酸为CMVmini启动子，第274-298位核苷酸为T15序列，第377-1095位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT16+T16+质粒如序列38所示。序列38中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-201位核苷酸为T16序列(TALER16蛋白的靶点序列)，第208-267位核苷酸为CMVmini启动子，第274-298位核苷酸为T16序列，第377-1095位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT17+T17+质粒如序列39所示。序列39中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-201位核苷酸为T17序列(TALER17蛋白的靶点序列)，第208-267位核苷酸为CMVmini启动子，第274-298位核苷酸为T17序列，第377-1095位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT18+T18+质粒如序列40所示。序列40中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-201位核苷酸为T18序列(TALER18蛋白的靶点序列)，第208-267位核苷酸为CMVmini启动子，第274-298位核苷酸为T18序列，第377-1095位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT19+T19+质粒如序列41所示。序列41中，自5’末端第7069-7161位核苷酸为5×UAS序列，第7177-7195位核苷酸为T19序列(TALER19蛋白的靶点序列)，第7202-7261位核苷酸为CMVmini启动子，第7268-7286位核苷酸为T19序列，第78-796位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT20+T20+质粒如序列42所示。序列42中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-201位核苷酸为T20序列(TALER20蛋白的靶点序列)，第208-267位核苷酸为CMVmini启动子，第274-298位核苷酸为T20序列，第377-1095位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT21+T21+质粒如序列43所示。序列43中，自5’末端第7069-7161位核苷酸为5×UAS序列，第7177-7195位核苷酸为T21序列(TALER21蛋白的靶点序列)，第7202-7261位核苷酸为CMVmini启动子，第7268-7286位核苷酸为T21序列，第78-796位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT22+T22+质粒如序列44所示。序列44中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-195位核苷酸为T22序列(TALER22蛋白的靶点序列)，第202-261位核苷酸为CMVmini启动子，第268-286位核苷酸为T22序列，第365-1083位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT23+T23+质粒如序列45所示。序列45中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-195位核苷酸为T23序列(TALER23蛋白的靶点序列)，第202-261位核苷酸为CMVmini启动子，第268-286位核苷酸为T23序列，第365-1083位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT24+T24+质粒如序列46所示。序列46中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-195位核苷酸为T24序列(TALER24蛋白的靶点序列)，第202-261位核苷酸为CMVmini启动子，第268-286位核苷酸为T24序列，第365-1083位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT26+T26+质粒如序列47所示。序列47中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-194位核苷酸为T26序列(TALER26蛋白的靶点序列)，第201-260位核苷酸为CMVmini启动子，第267-284位核苷酸为T26序列，第363-1081位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT29+T29+质粒如序列48所示。序列48中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-190位核苷酸为T29序列(TALER29蛋白的靶点序列)，第197-256位核苷酸为CMVmini启动子，第263-276位核苷酸为T29序列，第355-1073位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT30+T30+质粒如序列49所示。序列49中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-190位核苷酸为T30序列(TALER30蛋白的靶点序列)，第197-256位核苷酸为CMVmini启动子，第263-276位核苷酸为T30序列，第355-1073位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT31+T31+质粒如序列50所示。序列50中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-189位核苷酸为T31序列(TALER31蛋白的靶点序列)，第196-255位核苷酸为CMVmini启动子，第262-274位核苷酸为T31序列，第353-1071位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT32+T32+质粒如序列51所示。序列51中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-190位核苷酸为T32序列(TALER32蛋白的靶点序列)，第197-256位核苷酸为CMVmini启动子，第263-276位核苷酸为T32序列，第355-1073位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT35+T35+质粒如序列52所示。序列52中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-190位核苷酸为T35序列(TALER35蛋白的靶点序列)，第197-256位核苷酸为CMVmini启动子，第263-276位核苷酸为T35序列，第355-1073位核苷酸为mKate2的编码基因。
一、实验一
将pCMV-TALER1质粒、pT1+T1+质粒和pEF1a-TagBFP-2A质粒共转染HEK293细胞(每孔转染200ng pCMV-TALER1质粒、50ng pT1+T1+质粒和30ng pEF1a-TagBFP-2A质粒)，转染48小时后进行流式细胞术分析，检测EYFP的荧光强度、mKate2的荧光强度和TagBFP的荧光强度。设置不加入pCMV-TALER1质粒的对照处理。抑制倍数＝对照组mKate2荧光强度校正值÷实验组mKate2荧光强度校正值。抑制百分比＝(对照组mKate2荧光强度校正值-实验组mKate2 荧光强度校正值)÷对照组mKate2荧光强度校正值。mKate2荧光强度校正值＝mKate2的荧光强度/TagBFP的荧光强度。
用pCMV-TALER2质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT2+T2+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER4质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT4+T4+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER5质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT5+T5+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER9质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT9+T9+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER10质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT10+T10+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER11质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT11+T11+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER12质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT12+T12+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER13质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT13+T13+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER14质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT14+T14+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER15质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT15+T15+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER16质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT16+T16+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER17质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT17+T17+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER18质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT18+T18+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER19质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT19+T19+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER20质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT20+T20+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER21质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT21+T21+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER22质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT22+T22+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER23质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT23+T23+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER24质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT24+T24+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER26质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT26+T26+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER29质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT29+T29+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER30质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT30+T30+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER31质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT31+T31+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER32质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT32+T32+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER35质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT35+T35+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。
抑制倍数结果和抑制百分比结果见图3(柱形图代表抑制倍数，点状图代表抑制百分比)和表1。26个TALER蛋白中的23个都表现出大于90％的转录抑制效果，其中16个TALER蛋白具有大于100倍的转录抑制效果。结果表明：在哺乳动物细胞中，TALER蛋白(即没有抑制结构域的TALEN融合蛋白)也可以通过空间位阻发挥高效的转录抑制作用。
表1 抑制倍数结果和抑制百分比结果
二、实验二
在实验一的基础上，通过测定前十个最强抑制效果的TALER蛋白对验证模块(Tx-CMVmini启动子-Tx-mKate2基因)的转录抑制作用来检测正交性。
举例如下：将pCMV-TALER1质粒、pT35+T35+质粒和pEF1a-TagBFP-2A质粒共转染HEK293细胞(每孔转染200ng pCMV-TALER1质粒、50ng pT1+T1+质粒和30ng pEF1a-TagBFP-2A质粒)，转染48小时后进行流式细胞术分析，检测EYFP的荧光强度、mKate2的荧光强度和TagBFP的荧光强度。设置不加入pCMV-TALER1质粒的对照处理。
结果见图4(图4中的101直至10-2.5代表mKate2的荧光强度/TagBFP的荧光强度)和表2。被测试的所有TALER蛋白对其相应的靶点之间的启动子都表现出较强的抑制作用而对其他靶点之间的启动子的影响不大。比如，TALER1蛋白、TALER9蛋白、TALER10蛋白、TALER12蛋白、TALER14蛋白和TALER21蛋白，对它们相应靶点之间的启动子和其他靶点之间启动子相比，抑制倍数强100倍以上。
表2 图4的结果(mKate2的荧光强度/TagBFP的荧光强度)
实施例2、进一步延展性研究
pEF1a-TagBFP-2A质粒即实施例1中的pEF1a-TagBFP-2A质粒。
pCMV-TALER1质粒即实施例1中的pCMV-TALER1质粒。
pCMV-TALER2质粒即实施例1中的pCMV-TALER2质粒。
pCMV-TALER4质粒即实施例1中的pCMV-TALER4质粒。
pCMV-TALER5质粒即实施例1中的pCMV-TALER5质粒。
pCMV-TALER32质粒即实施例1中的pCMV-TALER32质粒。
pT1+T1+72-DsRed质粒如序列54所示。序列54中，自5’末端第2441-2533位核苷酸为5×UAS序列，第2549-2562位核苷酸为T1序列(TALER1蛋白的靶点序列)，第2569-2628位核苷酸为CMVmini启动子，第2635-2648位核苷酸为T1序列，第2668-3345位核苷酸为DsRed(红色荧光蛋白)的编码基因。
pT1+T2+72-DsRed质粒如序列55所示。序列55中，自5’末端第2441-2533位核苷酸为5×UAS序列，第2549-2562位核苷酸为T1序列，第2569-2628位核苷酸为CMVmini启动子，第2635-2648位核苷酸为T2序列(TALER2蛋白的靶点序列)，第2668-3345位核苷酸为DsRed的编码基因。
pT2+T1+72-DsRed质粒如序列56所示。序列56中，自5’末端第2441-2533位核苷酸为5×UAS序列，第2549-2562位核苷酸为T2序列，第2569-2628位核苷酸为CMVmini启动子，第2635-2648位核苷酸为T1序列，第2668-3345位核苷酸为DsRed的编码基因。
pT2+T2+72-DsRed质粒如序列57所示。序列57中，自5’末端第2441-2533位核苷酸为5×UAS序列，第2549-2562位核苷酸为T2序列，第2569-2628位核苷酸为CMVmini启动子，第2635-2648位核苷酸为T2序列，第2668-3345位核苷酸为DsRed的编码基因。
pT1+T1+72-mKate2质粒如序列58所示。序列58中，自5’末端第4275-4367位核苷酸为5×UAS序列，第4383-4396位核苷酸为T1序列，第4403-4462位核苷酸为CMVmini启动子，第4469-4482位核苷酸为T1序列，第4532-5237位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT1+T1+78-mKate2质粒如序列59所示。序列59中，自5’末端第7161-7253位核苷酸为5×UAS序列，第7269-7282位核苷酸为T1序列，第6-65位核苷酸为CMVmini启动子，第78-91位核苷酸为T1序列，第170-888位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT1+T1+83-mKate2质粒如序列60所示。序列60中，自5’末端第7166-7258位核苷酸为5×UAS序列，第7274-7287位核苷酸为T1序列，第6-65位核苷酸为CMVmini启动子，第83-96位核苷酸为T1序列，第175-893位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT1+T1+89-mKate2质粒如序列61所示。序列61中，自5’末端第7172-7264位核苷酸为5×UAS序列，第7280-7293位核苷酸为T1序列，第6-65位核苷酸为CMVmini启动子，第89-102位核苷酸为T1序列，第181-899位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT1+T1+94-mKate2质粒如序列62所示。序列62中，自5’末端第7177-7269位核苷酸为5×UAS序列，第7285-7298位核苷酸为T1序列，第6-65位核苷酸为CMVmini启动子，第94-107位核苷酸为T1序列，第186-904位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT1+T1+100-mKate2质粒如序列63所示。序列63中，自5’末端第7203-7295位核苷酸为5×UAS序列，第6-19位核苷酸为T1序列，第26-85位核苷酸为CMVmini启动子，第120-133位核苷酸为T1序列，第212-930位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT2+T2+72-mKate2质粒如序列64所示。序列64中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-190位核苷酸为T2序列，第197-256位核苷酸为CMVmini启动子，第263-276位核苷酸为T2序列，第355-1073位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT2+T2x3+72-mKate2质粒如序列65所示。序列65中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-190位核苷酸为T2序列，第197-256位核苷酸为CMVmini启动子，第263-276位核苷酸为T2序列，第279-292位核苷酸为T2序列，第295-308位核苷酸为T2序列，第388-1106位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT4+T4+72-mKate2质粒如序列66所示。序列66中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-190位核苷酸为T4序列(TALER4蛋白的靶点序列)，第197-256位核苷酸为CMVmini启动子，第263-276位核苷酸为T4序列，第355-1073位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT4+T4x3+72-mKate2质粒如序列67所示。序列67中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-190位核苷酸为T4序列，第197-256位核苷酸为CMVmini启动子，第263-276位核苷酸为T4序列，第277-290位核苷酸为T4序列，第291-304位核苷酸为T4序列，第383-1101位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT5+T5+72-mKate2质粒如序列68所示。序列68中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-194位核苷酸为T5序列(TALER5蛋白的靶点序列)，第201-260位核苷酸为CMVmini启动子，第267-284位核苷酸为T5序列，第363-1081位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT5+T5x3+72-mKate2质粒如序列69所示。序列69中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-194位核苷酸为T5序列，第201-260位核苷酸为CMVmini启动子，第267-284位核苷酸为T5序列，第285-302位核苷酸为T5序列，第303-320位核苷酸为T5序列，第399-1117位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT32+T32+72-mKate2质粒如序列70所示。序列70中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-190位核苷酸为T32序列(TALER32蛋白的靶点序列)，第197-256位核苷酸为CMVmini启动子，第263-276位核苷酸为T32序列，第355-1073位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT32+T32x3+72-mKate2如序列71所示。序列71中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-190位核苷酸为T32序列，第197-256位核苷酸为CMVmini启动子，第263-276位核苷酸为T32序列，第277-290位核苷酸为T32序列，第291-304位核苷酸为T32序列，第383-1101位核苷酸为mKate2的编码基因。
一、实验一
将pCMV-TALER1质粒、pT1+T1+72-DsRed质粒和pEF1a-TagBFP-2A质粒共转染HEK293细胞(每孔转染200ng pCMV-TALER1质粒、50ng pT1+T1+72-DsRed质粒和30ngpEF1a-TagBFP-2A质粒)，转染48小时后进行流式细胞术分析，检测EYFP的荧光强度、DsRed的荧光强度和TagBFP的荧光强度。设置不加入pCMV-TALER1质粒的对照处理。
分别用pT1+T2+72-DsRed质粒、pT2+T1+72-DsRed质粒或pT2+T2+72-DsRed质粒代替pT1+T1+72-DsRed质粒进行上述步骤。
抑制倍数结果和抑制百分比结果见图5和表3。结果表明，TALER蛋白的3’结合位点对于强的抑制能力所必需的，而5'结合位点的抑制效果要弱得多，当两个结合位点都存在时有更强的抑制效果。
表3 抑制倍数结果和抑制百分比结果
二、实验二
将pCMV-TALER1质粒、pT1+T1+72-mKate2质粒和pEF1a-TagBFP-2A质粒共转染HEK293细胞(每孔转染200ng pCMV-TALER1质粒、50ng pT1+T1+72-mKate2质粒和30ngpEF1a-TagBFP-2A质粒)，转染48小时后进行流式细胞术分析，检测EYFP的荧光强度、mKate2的荧光强度和TagBFP的荧光强度。设置不加入pCMV-TALER1质粒的对照处理。
分别用pT1+T1+78-mKate2质粒、pT1+T1+83-mKate2质粒、pT1+T1+89-mKate2质粒、pT1+T1+94-mKate2质粒或pT1+T1+100-mKate2质粒代替pT1+T1+72-mKate2质粒进行上述步骤。
抑制倍数结果和抑制百分比结果见图6和表4。TALER蛋白没有周期性的抑制行为，当TALER结合位点越接近miniCMV启动子时有越强的抑制效果。
表4 抑制倍数结果和抑制百分比结果
三、实验三
将pCMV-TALER2质粒、pT2+T2+72-mKate2质粒(或T2+T2x3+72-mKate2质粒)和pEF1a-TagBFP-2A质粒共转染HEK293细胞(每孔转染200ng pCMV-TALER2质粒、50ng pT2+T2+72-mKate2质粒或T2+T2x3+72-mKate2质粒、30ng pEF1a-TagBFP-2A质粒)，转染48小时后进行流式细胞术分析，检测EYFP的荧光强度、mKate2的荧光强度和TagBFP的荧光强度。设置不加入pCMV-TALER2质粒的对照处理。
分别用pCMV-TALER4质粒代替pCMV-TALER2质粒、用pT4+T4+72-mKate2质粒代替pT2+T2+72-mKate2质粒(或用pT4+T4x3+72-mKate2质粒代替T2+T2x3+72-mKate2质粒)进行上述步骤。
分别用pCMV-TALER5质粒代替pCMV-TALER2质粒、用pT5+T5+72-mKate2质粒代替pT2+T2+72-mKate2质粒(或用pT5+T5x3+72-mKate2质粒代替T2+T2x3+72-mKate2质粒)进行上述步骤。
分别用pCMV-TALER32质粒代替pCMV-TALER2质粒、用pT32+T32+72-mKate2质粒代替pT2+T2+72-mKate2质粒(或用pT32+T32x3+72-mKate2质粒代替T2+T2x3+72-mKate2质粒)进行上述步骤。
抑制倍数结果和抑制百分比结果见图7和表5。与在miniCMV启动子下游具有1个靶点相比，在miniCMV启动子下游具有3个靶点时，TALER蛋白表现出更强的抑制效果。在一些高效的TALER中，额外的结合位点出乎意料的导致了抑制效果的轻微减弱。发明人注意到，抑制能力强的TALER蛋白被额外的结合位点所带来的额外的抑制能力显著的低，但启动子的本底表达也会因miniCMV启动子和报告基因之间的插入序列而降低。这些结果表明，可通过平衡启动子的本底表达水平和TALER对miniCMV启动子的抑制能力来优化转录抑制能力。
表5 抑制倍数结果和抑制百分比结果
四、实验四
合成序列表的序列72所示的质粒。序列72中，自5’末端第4766-5033位核苷酸为强力霉素反应元件TRE(其中第4766-4961位核苷酸为tetO，第4976-5033位核苷酸为CMVmini启动子)，第5113-8250位核苷酸为TALER14蛋白的编码基因，第9306-9549位核苷酸为cHS4core，第9625-9868位核苷酸为cHS4core，第9987-10079位核苷酸为5×UAS序列，第10095-10111位核苷酸为T14序列(TALER14蛋白的靶点序列)，第10118-10177位核苷酸为CMVmini启动子，第10184-10200位核苷酸为T14序列，第10201-10217位核苷酸为T14序列，第10218-10234位核苷酸为T14序列，第10313-11031位核苷酸为mKate2的编码基因，第11979-12222位核苷酸为cHS4core，第12298-12541位核苷酸为cHS4core，第12658-12925位核苷酸为强力霉素反应元件TRE(其中第112658-12853位核苷酸为tetO，第12868-12925位核苷酸为CMVmini启动子)，第12982-13701位核苷酸为EYFP的编码基因，第14612-14855位核苷酸为cHS4core，第14931-15174位核苷酸为cHS4core，第15292-16465位核苷酸为pEF1a(启动子)，第16539-17219位核苷酸为Gal4/vp16的编码基因，第17220-17285位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第17292-17996位核苷酸为rtTA的编码基因。序列72所示的质粒的元件示意图见图8A。
将序列72所示的质粒导入HEK293细胞，得到重组细胞。在没有强力霉素(DOX)存在时，在pEF1a作用下Gal4/vp16和rtTA被表达，Gal4/vp16结合到5×UAS序列上，从而激活CMVmini启动子的转录起始，mKate2被表达。加入强力霉素后，强力霉素与和rtTA结合，激活强力霉素反应元件TRE，TALER14蛋白和EYFP被表达，TALER14蛋白结合T14序列，通过空间位阻发挥转录抑制作用，T14序列之间的CMVmini启动子失活，从而mKate2被抑制表达。用EYFP的表达水平来估计TALER14蛋白在Dox诱导下的表达，而mKate2的表达水平水平变化反映了TALER14对两个T14序列之间的CMVmini启动子的抑制作用。
先在有Dox的环境中培养重组细胞，直至mKate2表达被最大限度抑制，然后换成不含Dox的培养基。在去除Dox3天后，EYFP表达水平下降到最大值的16％，而mKate2表达水平几乎恢复到无Dox诱导的对照组的水平。接着在第8天加入Dox诱导，使得mKate2表达水平再次被抑制，第16天再次换成不含Dox的培养基，仍然可以恢复mKate2表达水平。具体结果见图8B和图8C。以上结果表明，TALER蛋白可以实现快速、可逆的转录抑制功能。
实施例3、模块化构建TALER蛋白级联的基因线路
pCAG-rtTA-2A-Gal4/vp16质粒如序列73所示。序列73中，自5’末端第4253-4930位核苷酸为CAG启动子，第6004-6747位核苷酸为rtTA的编码基因，第6748-6813位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第6820-7503位核苷酸为Gal4/vp16的编码基因。
pT14+T14+72-mKate2质粒如序列74所示。序列74中，自5’末端第4275-4367位核苷酸为5×UAS序列，第4383-4399位核苷酸为T14序列(TALER14蛋白的靶点序列)，第4406-4465位核苷酸为CMVmini启动子，第4472-4488位核苷酸为T14序列，第4538-5243位核苷酸为mKate2的编码基因。pT14+T14+72-mKate2质粒上具有两个TALER14蛋白的结合位点(pT14BS2)。
pT14+T14x3+72-mKate2质粒如序列75所示。序列75中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-193位核苷酸为T14序列，第200-259位核苷酸为CMVmini启动子，第266-282位核苷酸为T14序列，283-299位核苷酸为T14序列，第300-316位核苷酸为T14序列，第395-1113位核苷酸为mKate2的编码基因。pT14+T14x3+72-mKate2质粒上具有四个TALER14蛋白的结合位点(pT14BS4)。
pT21+T21+72-mKate2质粒如序列76所示。序列76中，自5’末端第4275-4367位核苷酸为5×UAS序列，第4383-4401位核苷酸为T21序列(TALER21蛋白的靶点序列)，第4408-4467位核苷酸为CMVmini启动子，第4474-4492位核苷酸为T21序列，第4542-5247位核苷酸为mKate2的编码基因。pT21+T21+72-mKate2质粒上具有两个TALER21蛋白的结合位点(pT21BS2)。
pT21+T21x3+72-mKate2质粒如序列77所示。序列77中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-195位核苷酸为T21序列，第202-261位核苷酸为CMVmini启动子，第268-286位核苷酸为T21序列，第287-305位核苷酸为T21序列，第306-324位核苷酸为位核苷酸为T21序列，第403-1121位核苷酸为mKate2的编码基因。pT21+T21x3+72-mKate2质粒上具有四个TALER21蛋白的结合位点(pT21BS4)。
pTRE-EBFP2质粒如序列78所示。序列78中，自5’末端第4250-4555位核苷酸为强力霉素反应元件TRE(其中第4250-4482位核苷酸为tetO，第4496-4555位核苷酸为CMVmini启动子)，第4661-5380核苷酸为EBFP2(加强型蓝色荧光素蛋白)的编码基因。
pTRE-TALER14-4xT质粒如序列79所示。序列79中，自5’末端第67-334位核苷酸为强力霉素反应元件TRE(其中第67-262位核苷酸为tetO，第277-334位核苷酸为CMVmini启动子)，第423-3560位核苷酸为TALER14蛋白的编码基因。
pTRE-TALER21-4xT质粒如序列80所示。序列80中，自5’末端第67-334位核苷酸为强力霉素反应元件TRE(其中第67-262位核苷酸为tetO，第277-334位核苷酸为CMVmini启动子)，第423-3764位核苷酸为TALER21蛋白的编码基因。
pT14+T14+72_TALER21质粒如序列81所示。序列81中，自5’末端第4275-4367位核苷酸为5×UAS序列，第4383-4399位核苷酸为T14序列，第4406-4465位核苷酸为CMVmini启动子，第4472-4488位核苷酸为T14序列，第4574-7915位核苷酸为TALER21蛋白的编码基因。
pT14+T14x3+72_TALER21质粒如序列82所示。序列82中，自5’末端第4275-4367位核苷酸为5×UAS序列，第4383-4399位核苷酸为T14序列，第4406-4465位核苷酸为CMVmini启动子，第4472-4488位核苷酸为T14序列，第4489-4505位核苷酸为T14序列，第4506-4522位核苷酸为T14序列，第4608-7949位核苷酸为TALER21蛋白的编码基因。
pT21+T21+72_TALER14质粒如序列83所示。序列83中，自5’末端第4275-4367位核苷酸为5×UAS序列，第4383-4401位核苷酸为T21序列，第4408-4467位核苷酸为CMVmini启动子，第4474-4492位核苷酸为T21序列，第4578-7715位核苷酸为TALER14蛋白的编码基因。
pT21+T21x3+72_TALER14质粒如序列84所示。序列84中，自5’末端第4275-4367位核苷酸为5×UAS序列，第4383-4401位核苷酸为T21序列，第4408-4467位核苷酸为CMVmini启动子，第4474-4492位核苷酸为T21序列，第4493-4511位核苷酸为T21序列，第4512-4530位核苷酸为T21序列，第4616-7753位核苷酸为TALER14蛋白的编码基因。
pCAG-EYFP质粒如序列85所示。序列85中，自5’末端第3320-3997位核苷酸为CAG启动子，第5064-5783位核苷酸为EYFP(加强型黄色荧光素蛋白)的编码基因。
一、实验一
有了正交性好、抑制效果强的TALER蛋白工具，发明人刻画了TALER蛋白的剂量反应(流程示意图见9A)。
在没有强力霉素(DOX)存在时，在CAG启动子的作用下Gal4/vp16和rtTA被表达，Gal4/vp16结合到5×UAS序列上，从而激活CMVmini启动子(CMVmini启动子的上游具有1个Tx，下游具有1个或3个Tx；Tx用T14或T21举例)的转录起始，mKate2被表达。加入强力霉素后，强力霉素与和rtTA结合，激活强力霉素反应元件TRE，TALER蛋白(TALER蛋白用TALER14蛋白或TALER21蛋白举例)和EBFP2被表达，TALER蛋白结合Tx序列，通过空间位阻发挥转录抑制作用，Tx序列之间的CMVmini启动子失活，从而mKate2被抑制表达。用EBFP2的表达水平来估计TALER蛋白在DOX诱导下的表达水平，而mKate2的表达水平变化反映了TALER蛋白对Tx序列之间的CMVmini启动子的抑制作用。
将pCAG-rtTA-2A-Gal4/vp16质粒、pTRE-EBFP2质粒、pTRE-TALER14-4xT质粒、pT14+T14+72-mKate2质粒和pCAG-EYFP质粒共转染HEK293细胞(每孔转染100ng pCAG-rtTA-2A-Gal4/vp16质粒、50ng pTRE-EBFP2质粒、50ng pTRE-TALER14-4xT质粒、100ng pT14+T14+72-mKate2质粒和50ng pCAG-EYFP质粒)，转染同时在细胞培养体系中加入DOX(使DOX浓度为0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500或1000ng/mL；设置不加入DOX的空白对照，用0ng/mL表示)，转染48小时后进行流式细胞术分析，检测mKate2的荧光强度、EBFP2的荧光强度和EYFP的荧光强度。
质粒转染细胞的方式：取24孔板，每孔接种0.5mL HEK293细胞悬液(含6×104个HEK293细胞)，培养24小时后，更换新的DMEM培养基，然后进行质粒转染。
用pT14+T14x3+72-mKate2质粒代替pT14+T14+72-mKate2质粒进行上述步骤。
用pT21+T21+72-mKate2质粒代替pT14+T14+72-mKate2质粒、且用pTRE-TALER21-4xT质粒代替pTRE-TALER14-4xT质粒进行上述步骤。
用pT21+T21x3+72-mKate2质粒代替pT14+T14+72-mKate2质粒、且用pTRE-TALER21-4xT质粒代替pTRE-TALER14-4xT质粒进行上述步骤。
mKate2的荧光强度/EYFP的荧光强度＝校正后的mKate2的荧光强度。
EBFP2的荧光强度/EYFP的荧光强度＝校正后的EBFP2的荧光强度。
校正后的mKate2的荧光强度和校正后的EBFP2的荧光强度的结果见图9B(从左向右的点代表DOX浓度依次增加；最大变化倍数为mKate2最大水平与最小水平之比)。在CMVmini启动子的下游，三联结合位点能提高TALER蛋白的抑制效率。
使用希尔方程拟合的转移方程曲线见图9C，它提供了对TALER启动子响应不同浓度的TALER蛋白的输出特性精细的刻画。n(pTxBS2)或n(pTxBS4)代表希尔系数。粗线区域代表实验观测的输入范围。细线区域代表拟合的希尔方程推测的转移方程曲线。希尔系数的范围为0.67至1.15，表明TALER蛋白与相应启动子的结合没有很强的协同效应。
二、实验二
发明人使用TALER蛋白作为构建模块，开发并研究了复合基因线路。串连两个TALER蛋白/启动子对，成为一个TALER级联(结构示意图见图10A)，下一个TALER蛋白的启动子的输入对应上一个TALER蛋白的输出。当第一个TALER蛋白不表达的时候，第二个TALER蛋白抑制报告基因(mKate2基因)的输出。当DOX诱导第一个TALER蛋白表达，它可以抑制第二个TALER蛋白的表达，从而解除其对mKate2的抑制，提高mKate2的表达水平。
将pCAG-rtTA-2A-Gal4/vp16质粒、pTRE-EBFP2质粒、pTRE-TALER14-4xT质粒、pT14+T14+72_TALER21质粒、pT21+T21+72-mKate2质粒和pCAG-EYFP质粒共转染HEK293细胞(每孔转染100ng pCAG-rtTA-2A-Gal4/vp16质粒、50ng pTRE-EBFP2质粒、50ng pTRE-TALER14-4xT质粒、50ng T14+T14+72_TALER21质粒、100ng pT21+T21+72-mKate2质粒和50ng pCAG-EYFP质粒)，转染同时在细胞培养体系中加入DOX(使DOX浓度为0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500或1000ng/mL；设置不加入DOX的空白对照，用0ng/mL表示)，转染48小时后进行流式细胞术分析，检测mKate2的荧光强度、EBFP2的荧光强度和EYFP的荧光强度。质粒转染细胞的方式：取24孔板，每孔接种0.5mL HEK293细胞悬液(含6×104个HEK293细胞)，培养24小时后，更换新的DMEM培养基，然后进行质粒转染。
用pT14+T14x3+72_TALER21质粒代替pT14+T14+72_TALER21质粒进行上述步骤。
用pT21+T21x3+72-mKate2质粒代替pT21+T21+72-mKate2质粒进行上述步骤。
用pT14+T14x3+72_TALER21质粒代替pT14+T14+72_TALER21质粒、且用pT21+T21x3+72-mKate2质粒代替pT21+T21+72-mKate2质粒进行上述步骤。
用pT21+T21+72_TALER14质粒代替pT14+T14+72_TALER21质粒、且用pT14+T14+72-mKate2质粒代替pT21+T21+72-mKate2质粒进行上述步骤。
用pT21+T21x3+72_TALER14质粒代替pT14+T14+72_TALER21质粒、且用pT14+T14+72-mKate2质粒代替pT21+T21+72-mKate2质粒进行上述步骤。
用pT21+T21+72_TALER14质粒代替pT14+T14+72_TALER21质粒、且用pT14+T14x3+72-mKate2质粒代替pT21+T21+72-mKate2质粒进行上述步骤。
用pT21+T21x3+72_TALER14质粒代替pT14+T14+72_TALER21质粒、且用pT14+T14x3+72-mKate2质粒代替pT21+T21+72-mKate2质粒进行上述步骤。
mKate2的荧光强度/EYFP的荧光强度＝校正后的mKate2的荧光强度。
EBFP2的荧光强度/EYFP的荧光强度＝校正后的EBFP2的荧光强度。
校正后的mKate2的荧光强度和校正后的EBFP2的荧光强度的结果见图10B(从左向右的点代表DOX浓度依次增加；最大变化倍数为mKate2最大水平与最小水平之比；每种级联方式的命名方式均为“第一级TALER名称-第二级TALER名称”)。用TALER14蛋白和TALER21蛋白/启动子所构建的所有8个可能的级联，包含2个结合位点(pTxBS2)或4个结合位点(pTxBS4)，报告基因(mKate2基因)的表达水平随DOX浓度的增加而增加。报告基因的输出最大值和最小值的差异倍数从3倍到92倍不等，这展示了这些级联具有一定的动态范围，这个动态范围是由TALER蛋白模块决定的。
为了测试对TALER模块的预测能力，建立了一个颜色模型，这个模型能够将EBFP2的信号值转换成mKate2的信号值，反之亦然(图11A)。接着发明人针对每个级联，用它的两个TALER模块的转移函数建立了计算模型(图10C)。观测的结果和预测的结果的相关性的拟合优度为0.81。这些结果有力的表明了发明人有能力构建模块化TALER级联的组装和定量预测输出的促进倍数。
实施例4、模型的建立
发明人使用Rainbow Calibration Particles将相应荧光单位量转化为标准化单位量。比如，使用微粒的EYFP荧光均值的峰值与其绝对MEFL单位量在对数域建立MEFL与EYFP间的线性关系。MEBFP与TagBFP或EBFP2、MECY与mKate2或DsRed、MEAPCY7与iRFP间也通过相似的方式建立线性关系。通过Matlab(MathWorks)中改进的流式细胞数据读取与可视化工具，使用校正后的数据绘制散点图。
为了补偿不同样品间转染效率的差异，发明人将一种组成性表达的报告荧光使用转染的内参，并使用如下公式计算标准化的荧光值(NFL)：
上式中，mean(FL)表示检测细胞群体中MECY、MEFL或MEBFP的均值。mean(Control)表示检测细胞群体中组成性表达的报告荧光的均值。然后发明人使用如下公式计算抑制百分比与抑制倍数：
pCAG-EYFP质粒即实施例3中的pCAG-EYFP质粒。
pTRE-EBFP2质粒即实施例3中的pTRE-EBFP2质粒。
pT21+T21x3+72-mKate2质粒即实施例3中的pT21+T21x3+72-mKate2质粒。
pT14+T14x3+72-mKate2质粒即实施例3中的pT14+T14x3+72-mKate2质粒。
pCAG-TagBFP质粒如序列86所示。序列86中，自5’末端第4253-4930位核苷酸为CAG启动子，第6008-6700位核苷酸为TagBFP(单体蓝色荧光素蛋白)的编码基因。
pTRE-mKate2质粒如序列87所示。序列87中，自5’末端第4250-4555位核苷酸为强力霉素反应元件TRE(其中第4250-4482位核苷酸为tetO，第4496-4555位核苷酸为CMVmini启动子)，第4664-5369位核苷酸为mKate2的编码基因。
pEF1a-rtTA-2A-Hyg质粒如序列88所示。序列88中，自5’末端第6207-7380位核苷酸为pEF1a(启动子)，第7441-8184位核苷酸为rtTA的编码基因，第8185-8250位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第8263-9288位核苷酸为Hyg基因(潮霉素抗性基因)。
pTRE-EYFP-2A-TALER14质粒如序列89所示。序列89中，自5’末端第4250-4555位核苷酸为强力霉素反应元件TRE(其中第4250-4482位核苷酸为tetO，第4496-4555位核苷酸为CMVmini启动子)，第4676-5392位核苷酸为EYFP的编码基因，第5399-5452位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第5462-8599位核苷酸为TALER14蛋白的编码基因。
pTRE-mKate2-2A-TALER14质粒如序列90所示。序列90中，自5’末端第4250-4555位核苷酸为强力霉素反应元件TRE(其中第4250-4482位核苷酸为tetO，第4496-4555位核苷酸为CMVmini启动子)，第4679-5371位核苷酸为mKate2的编码基因，第5378-5431位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第5441-8578位核苷酸为TALER14蛋白的编码基因。
pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒如序列91所示。序列91中，自5’末端第4253-5962位核苷酸为CAG启动子，第6016-6696位核苷酸为Gal4/vp16的编码基因，第6697-6762位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第6769-7458位核苷酸为TagBFP的编码基因，第7460-7518位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第7519-7917位核苷酸为Bla的编码基因。
pT9+T9x3+72-mKate2质粒如序列92所示。序列92中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-197位核苷酸为T9序列(TALER9蛋白的靶点序列)，第204-263位核苷酸为CMVmini启动子，第270-290位核苷酸为T9序列，第291-311位核苷酸为T9序列，第312-332位核苷酸为T9序列，第411-1129位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT10+T10x3+72-mKate2质粒如序列93所示。序列93中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-196位核苷酸为T10序列(TALER10蛋白的靶点序列)，第203-262位核苷酸为CMVmini启动子，第269-288位核苷酸为T10序列，第289-308位核苷酸为T10序列，第309-328位核苷酸为T10序列，第407-1125位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT12+T12x3+72-mKate2质粒如序列94所示。序列94中，自5’末端第4275-4367位核苷酸为5×UAS序列，第4383-4400位核苷酸为T12序列(TALER12蛋白的靶点序列)，第4407-4466位核苷酸为CMVmini启动子，第4473-4490位核苷酸为T12序列，第4491-4508位核苷酸为T12序列，第4509-4526位核苷酸为T12序列，第4576-5281位核苷酸为mKate2的编码基因。
pTRE-EYFP-2A-TALER9质粒如序列95所示。序列95中，自5’末端第4250-4555位核苷酸为强力霉素反应元件TRE(其中第4250-4482位核苷酸为tetO，第4496-4555位核苷酸为CMVmini启动子)，第4676-5392位核苷酸为EYFP的编码基因，第5399-5452位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第5462-9007位核苷酸为TALER9蛋白的编码基因。
pTRE-EYFP-2A-TALER10质粒如序列96所示。序列96中，自5’末端第4250-4555位核苷酸为强力霉素反应元件TRE(其中第4250-4482位核苷酸为tetO，第4496-4555位核苷酸为CMVmini启动子)，第4676-5392位核苷酸为EYFP的编码基因，第5399-5452位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第5462-8905位核苷酸为TALER10蛋白的编码基因。
pTRE-EYFP-2A-TALER12质粒如序列97所示。序列97中，自5’末端第4250-4555位核苷酸为强力霉素反应元件TRE(其中第4250-4482位核苷酸为tetO，第4496-4555位核苷酸为CMVmini启动子)，第4676-5392位核苷酸为EYFP的编码基因，第5399-5452位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第5462-8701位核苷酸为TALER12蛋白的编码基因。
pTRE-EYFP-2A-TALER21质粒如序列98所示。序列98中，自5’末端第4250-4555位核苷酸为强力霉素反应元件TRE(其中第4250-4482位核苷酸为tetO，第4496-4555位核苷酸为CMVmini启动子)，第4676-5392位核苷酸为EYFP的编码基因，第5399-5452位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第5468-8803位核苷酸为TALER21蛋白的编码基因。
一、实验一
为了建立模型以描述在TALER模块的输入或输出中使用的不同荧光蛋白间的相互映射关系，发明人使用DOX诱导系统检测了带有或不带有2A连接肽的报告荧光强度(图11)，并对EYFP之于EBFP2或EYFP之于mKate2使用标准化的荧光值在对数域建立了相应的线性回归模型，从而实现不同报告荧光单位量间的互相转化。
将pEF1a-rtTA-2A-Hyg质粒、pCAG-EYFP质粒、pTRE-EBFP2质粒和pTRE-mKate2质粒共转染HEK293细胞(每孔转染100ng pEF1a-rtTA-2A-Hyg质粒、100ng pCAG-EYFP质粒、100ng pTRE-EBFP2质粒和100ng pTRE-mKate2质粒)，转染同时在细胞培养体系中加入DOX(使DOX浓度为0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500或1000ng/mL；设置不加入DOX的空白对照，用0ng/mL表示)，转染48小时后进行流式细胞术分析，检测mKate2的荧光强度、EBFP2的荧光强度和EYFP的荧光强度。质粒转染细胞的方式：取24孔板，每孔接种0.5mL HEK293细胞悬液(含6×104个HEK293细胞)，培养24小时后，更换新的DMEM培养基，然后进行质粒转染。用于构建EBFP2和mKate2转换模型的基因线路如图11A所示。图11C为校正后的EBFP2与mKate2之间的相互关系，其线性回归方程标注于图表上方。
将pEF1a-rtTA-2A-Hyg质粒、pCAG-TagBFP质粒、pTRE-EYFP-2A-TALER14质粒和pTRE-mKate2-2A-TALER14质粒共转染HEK293细胞(每孔转染100ng pEF1a-rtTA-2A-Hyg质粒、100ng pCAG-TagBFP质粒、100ng pTRE-EYFP-2A-TALER14质粒和100ng pTRE-mKate2-2A-TALER14质粒)，转染同时在细胞培养体系中加入DOX(使DOX浓度为0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500或1000ng/mL；设置不加入DOX的空白对照，用0ng/mL表示)，转染48小时后进行流式细胞术分析，检测mKate2的荧光强度、TagBFP的荧光强度和EYFP的荧光强度。质粒转染细胞的方式：取24孔板，每孔接种0.5mL HEK293细胞悬液(含6×104个HEK293细胞)，培养24小时后，更换新的DMEM培养基，然后进行质粒转染。用于构建EYFP和mKate2标准化模型的基因线路如图11B所示。图11D为校正后的EYFP与mKate2之间的相互关系，其线性回归方程标注于图表上方。
二、实验二
使用了类似的Dox诱导系统来检测TALER的转移方程曲线。
将pEF1a-rtTA-2A-Hyg质粒、pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、pTRE-EYFP-2A-TALER9质粒和pT9+T9x3+72-mKate2质粒共转染HEK293细胞(每孔转染100ngpEF1a-rtTA-2A-Hyg质粒、100ng pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、100ng pTRE-EYFP-2A-TALER9质粒和100ngpT9+T9x3+72-mKate2质粒)，转染同时在细胞培养体系中加入DOX(使DOX浓度为0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500或1000ng/mL；设置不加入DOX的空白对照，用0ng/mL表示)，转染48小时后进行流式细胞术分析，检测mKate2的荧光强度、TagBFP的荧光强度和EYFP的荧光强度。质粒转染细胞的方式：取24孔板，每孔接种0.5mL HEK293细胞悬液(含6×104个HEK293细胞)，培养24小时后，更换新的DMEM培养基，然后进行质粒转染。
用pTRE-EYFP-2A-TALER10质粒代替pTRE-EYFP-2A-TALER9质粒、且用pT10+T10x3+72-mKate2质粒代替pT9+T9x3+72-mKate2质粒，进行上述步骤。
用pTRE-EYFP-2A-TALER12质粒代替pTRE-EYFP-2A-TALER9质粒、且用pT12+T12x3+72-mKate2质粒代替pT9+T9x3+72-mKate2质粒，进行上述步骤。
用pTRE-EYFP-2A-TALER14质粒代替pTRE-EYFP-2A-TALER9质粒、且用pT14+T14x3+72-mKate2质粒代替pT9+T9x3+72-mKate2质粒，进行上述步骤。
用pTRE-EYFP-2A-TALER21质粒代替pTRE-EYFP-2A-TALER9质粒、且用pT21+T21x3+72-mKate2质粒代替pT9+T9x3+72-mKate2质粒，进行上述步骤。
用于转移函数曲线分析的基因线路如图12A所示(末端为箭头的指示线表示正调控作用，末端为短线的指示线表示负调控作用)。
转移函数曲线上观测到的数据点如图12B所示。所有报告荧光均经过Rainbowbeads校正。EBFP2与mKate2均以TagBFP为内参进行标准化处理。通过图11所示的线性回归方程，mKate2数值上转化为EYFP。
使用希尔方程拟合的转移函数曲线如图12C所示。n(TALERx)表示希尔系数，其范围为0.51至1.56。粗线区域代表实验观测的输入范围。细线区域代表拟合的希尔方程推测的转移函数曲线。
基于检测时TALER的输入与输出到达稳态的假设，使用校正并标准化后的荧光强度建立了如下希尔方程模型：
上式中，B表示输出的荧光强度，A表示代表TALER浓度的输入的荧光强度，β2代表TALER启动子的最大生产速率，β2代表TALER启动子的泄漏生产速率，k代表抑制比50％时的输入浓度，n代表希尔系数，γ代表衰减速率。
对于级联式作用倍数预测，首先通过线性插值将每种TALER的输入与输出标准化为MEBFP，接着将第一级TALER的输出作为第二级TALER的输入。然后在实验检测所得第一级TALER输入范围对基因线路进入仿真，并通过第二级TALER输出计算最大变化倍数。
在零变位分析中，在一张图上绘制一对TALER的转移方程曲线，并将第二种TALER的转移方程曲线沿y＝x对角线翻转，等价于对调了其输入与输出。由于坐标轴均为标准化单位，两条转移方程曲线的交点即为这一对TALER组成开关后的预测平衡态。
实施例5、受合成的shRNA控制的TALER开关的模块化组装
pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒即为实施例4中的pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒。
pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒如序列99所示。序列99中，自5’末端第4275-4367位核苷酸为5×UAS序列，第4383-4403位核苷酸为T9序列(TALER9蛋白的靶点序列)，第4410-4469位核苷酸为CMVmini启动子，第4476-4496位核苷酸为T9序列，第4497-4517位核苷酸为T9序列，第4518-4538位核苷酸为T9序列，第4600-5295位核苷酸为mKate2的编码基因，第5302-5355位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第5365-8808位核苷酸为TALER10蛋白的编码基因，第8887-8908位核苷酸为shRNA-FF4的靶序列Target^FF4，第8909-8930位核苷酸为shRNA-FF4的靶序列Target^FF4，第8931-8952位核苷酸为shRNA-FF4的靶序列Target^FF4，第8959-8980位核苷酸为shRNA-FF4的靶序列Target^FF4。
pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER12-4xTarget^FF6质粒如序列100所示。序列100中，自5’末端第4275-4367位核苷酸为5×UAS序列，第4383-4403位核苷酸为T9序列(TALER9蛋白的靶点序列)，第4410-4469位核苷酸为CMVmini启动子，第4476-4496位核苷酸为T9序列，第4497-4517位核苷酸为T9序列，第4518-4538位核苷酸为T9序列，第4600-5295 位核苷酸为mKate2的编码基因，第5302-5355位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第5365-8604位核苷酸为TALER12蛋白的编码基因，第8689-8710位核苷酸为shRNA-FF6的靶序列Target^FF6，第8715-8736位核苷酸为shRNA-FF6的靶序列Target^FF6，第8715-8731位核苷酸为shRNA-FF6的靶序列Target^FF6，第8741-8762位核苷酸为shRNA-FF6的靶序列Target^FF6，第8767-8788位核苷酸为shRNA-FF6的靶序列Target^FF6。
pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF4质粒如序列101所示。序列101中，自5’末端第4275-4367位核苷酸为5×UAS序列，第4383-4403位核苷酸为T9序列(TALER9蛋白的靶点序列)，第4410-4469位核苷酸为CMVmini启动子，第4476-4496位核苷酸为T9序列，第4497-4517位核苷酸为T9序列，第4518-4538位核苷酸为T9序列，第4603-5295位核苷酸为mKate2的编码基因，第5302-5355位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第5365-8502位核苷酸为TALER14蛋白的编码基因，第8593-8614位核苷酸为shRNA-FF4的靶序列Target^FF4，第8615-8636位核苷酸为shRNA-FF4的靶序列Target^FF4，第8637-8658位核苷酸为shRNA-FF4的靶序列Target^FF4，第8665-8686位核苷酸为shRNA-FF4的靶序列Target^FF4。
pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER21-4xTarget^FF3质粒如序列102所示。序列102中，自5’末端第4275-4367位核苷酸为5×UAS序列，第4383-4403位核苷酸为T9序列(TALER9蛋白的靶点序列)，第4410-4469位核苷酸为CMVmini启动子，第4476-4496位核苷酸为T9序列，第4497-4517位核苷酸为T9序列，第4518-4538位核苷酸为T9序列，第4600-5295位核苷酸为mKate2的编码基因，第5302-5355位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第5365-8706位核苷酸为TALER21蛋白的编码基因，第8794-8814位核苷酸为shRNA-FF3的靶序列Target^FF3，第8820-8840位核苷酸为shRNA-FF3的靶序列Target^FF3，第8846-8866位核苷酸为shRNA-FF3的靶序列Target^FF3，第8872-8892位核苷酸为shRNA-FF3的靶序列Target^FF3。
pT10+T10x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒如序列103所示。序列103中，自5’末端第4275-4367位核苷酸为5×UAS序列，第4383-4402位核苷酸为T10序列(TALER10蛋白的靶点序列)，第4409-4468位核苷酸为CMVmini启动子，第4475-4494位核苷酸为T10序列，第4495-4514位核苷酸为T10序列，第4515-4534位核苷酸为T10序列，第4596-5312位核苷酸为EYFP的编码基因，第5319-5372位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第5382-8927位核苷酸为TALER9蛋白的编码基因，第9017-9038位核苷酸为shRNA-FF5的靶序列Target^FF5，第9039-9060位核苷酸为shRNA-FF5的靶序列Target^FF5，第9061-9082位核苷酸为shRNA-FF5的靶序列Target^FF5，第9083-9104位核苷酸为shRNA5的靶序列Target^FF5。
pT10+T10x3+72-mKate2-2A-TALER12-4xTarget^FF6质粒如序列104所示。序列104中，自5’末端第4275-4367位核苷酸为5×UAS序列，第4383-4402位核苷酸为T10序列(TALER10蛋白的靶点序列)，第4409-4468位核苷酸为CMVmini启动子，第4475-4494位核苷酸为T10序列，第4495-4514位核苷酸为T10序列，第4515-4534位核苷酸为T10序列，第4596-5291位核苷酸为mKate2的编码基因，第5298-5351位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第5361-8600位核苷酸为TALER12蛋白的编码基因，第8685-8706位核苷酸为shRNA-FF6的靶序列Target^FF6，第8711-8732位核苷酸为shRNA-FF6的靶序列Target^FF6，第8711-8727位核苷酸为shRNA-FF6的靶序列Target^FF6，第8737-8758位核苷酸为shRNA-FF6的靶序列Target^FF6，第8763-8784位核苷酸为shRNA-FF6的靶序列Target^FF6。
pT10+T10x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF4质粒如序列105所示。序列105中，自5’末端第4275-4367位核苷酸为5×UAS序列，第4383-4402位核苷酸为T10序列(TALER10蛋白的靶点序列)，第4409-4468位核苷酸为CMVmini启动子，第4475-4494位核苷酸为T10序列，第4495-4514位核苷酸为T10序列，第4515-4534位核苷酸为T10序列，第4599-5291位核苷酸为mKate2的编码基因，第5298-5351位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第5361-8498位核苷酸为TALER14蛋白的编码基因，第8589-8610位核苷酸为shRNA-FF4的靶序列Target^FF4，第8611-8632位核苷酸为shRNA-FF4的靶序列Target^FF4，第8633-8654位核苷酸为shRNA-FF4的靶序列Target^FF4，第8661-8682位核苷酸为shRNA-FF4的靶序列Target^FF4。
pT10+T10x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF5质粒如序列106所示。序列106中，自5’末端第4275-4367位核苷酸为5×UAS序列，第4383-4402位核苷酸为T10序列(TALER10蛋白的靶点序列)，第4409-4468位核苷酸为CMVmini启动子，第4475-4494位核苷酸为T10序列，第4495-4514位核苷酸为T10序列，第4515-4534位核苷酸为T10序列，第4599-5291位核苷酸为mKate2的编码基因，第5298-5351位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第5361-8498位核苷酸为TALER14蛋白的编码基因，第8589-8610位核苷酸为shRNA-FF5的靶序列Target^FF5，第8611-8632位核苷酸为shRNA-FF5的靶序列Target^FF5，第8633-8654位核苷酸为shRNA-FF5的靶序列Target^FF5，第8655-8676位核苷酸为shRNA-FF5的靶序列Target^FF5。
pT10+T10x3+72-mKate2-2A-TALER21-4xTarget^FF3质粒如序列107所示。序列107中，自5’末端第4275-4367位核苷酸为5×UAS序列，第4383-4402位核苷酸为T10序列(TALER10蛋白的靶点序列)，第4409-4468位核苷酸为CMVmini启动子，第4475-4494位核苷酸为T10序列，第4495-4514位核苷酸为T10序列，第4515-4534位核苷酸为T10序列，第4599-5291位核苷酸为mKate2的编码基因，第5298-5351位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第5361-8702位核苷酸为TALER21蛋白的编码基因，第8790-8810位核苷酸为shRNA-FF3的靶序列Target^FF3，第8816-8836位核苷酸为shRNA-FF3的靶序列Target^FF3，第8842-8862位核苷酸为shRNA-FF3的靶序列Target^FF3，第8868-8888位核苷酸为shRNA-FF3的靶序列Target^FF3。
pT12+T12x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒如序列108所示。序列108中，自5’末端第4275-4367位核苷酸为5×UAS序列，第4383-4400位核苷酸为T12序列(TALER12蛋白的靶点序列)，第4407-4466位核苷酸为CMVmini启动子，第4473-4490位核苷酸为T12序列，第4491-4508位核苷酸为T12序列，第4509-4526位核苷酸为T12序列，第4588-5304位核苷酸为EYFP的编码基因，第5311-5364位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第5374-8919位核苷酸为TALER9蛋白的编码基因，第9009-9030位核苷酸为shRNA-FF5的靶序列Target^FF5，第9031-9052位核苷酸为shRNA-FF5的靶序列Target^FF5，第9053-9074位核苷酸为shRNA-FF5的靶序列Target^FF5，第9075-9096位核苷酸为shRNA-FF5的靶序列Target^FF5。
pT12+T12x3+72-EYFP-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒如序列109所示。序列109中，自5’末端第4275-4367位核苷酸为5×UAS序列，第4383-4400位核苷酸为T12序列(TALER12蛋白的靶点序列)，第4407-4466位核苷酸为CMVmini启动子，第4473-4490位核苷酸为T12 序列，第4491-4508位核苷酸为T12序列，第4509-4526位核苷酸为T12序列，第4588-5304位核苷酸为EYFP的编码基因，第5311-5364位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第5374-8817位核苷酸为TALER10蛋白的编码基因，第8896-8917位核苷酸为shRNA-FF4的靶序列Target^FF4，第8918-8939位核苷酸为shRNA-FF4的靶序列Target^FF4，第8940-8961位核苷酸为shRNA-FF4的靶序列Target^FF4，第8968-8989位核苷酸为shRNA-FF4的靶序列Target^FF4。
pT12+T12x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF4质粒如序列110所示。序列110中，自5’末端第4275-4367位核苷酸为5×UAS序列，第4383-4400位核苷酸为T12序列(TALER12蛋白的靶点序列)，第4407-4466位核苷酸为CMVmini启动子，第4473-4490位核苷酸为T12序列，第4491-4508位核苷酸为T12序列，第4509-4526位核苷酸为T12序列，第4591-5283位核苷酸为mKate2的编码基因，第5290-5343位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第5353-8490位核苷酸为TALER14蛋白的编码基因，第8581-8602位核苷酸为shRNA-FF4的靶序列Target^FF4，第8603-8624位核苷酸为shRNA-FF4的靶序列Target^FF4，第8625-8646位核苷酸为shRNA-FF4的靶序列Target^FF4，第8653-8674位核苷酸为shRNA-FF4的靶序列Target^FF4。
pT12+T12x3+72-mKate2-2A-TALER21-4xTarget^FF3质粒如序列111所示。序列111中，自5’末端第4275-4367位核苷酸为5×UAS序列，第4383-4400位核苷酸为T12序列(TALER12蛋白的靶点序列)，第4407-4466位核苷酸为CMVmini启动子，第4473-4490位核苷酸为T12序列，第4491-4508位核苷酸为T12序列，第4509-4526位核苷酸为T12序列，第4588-5283位核苷酸为mKate2的编码基因，第5290-5343位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第5353-8694位核苷酸为TALER21蛋白的编码基因，第8782-8802位核苷酸为shRNA-FF3的靶序列Target^FF3，第8808-8828位核苷酸为shRNA-FF3的靶序列Target^FF3，第8834-8854位核苷酸为shRNA-FF3的靶序列Target^FF3，第8860-8880位核苷酸为shRNA-FF3的靶序列Target^FF3。
pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒如序列112所示。序列112中，自5’末端第4275-4367位核苷酸为5×UAS序列，第4383-4399位核苷酸为T14序列(TALER14蛋白的靶点序列)，第4406-4465位核苷酸为CMVmini启动子，第4472-4488位核苷酸为T14序列，第4489-4505位核苷酸为T14序列，第4506-4522位核苷酸为T14序列，第4584-5300位核苷酸为EYFP的编码基因，第5307-5360位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第5370-8915位核苷酸为TALER9蛋白的编码基因，第9005-9026位核苷酸为shRNA-FF5的靶序列Target^FF5，第9027-9048位核苷酸为shRNA-FF5的靶序列Target^FF5，第9049-9070位核苷酸为shRNA-FF5的靶序列Target^FF5，第9071-9092位核苷酸为shRNA-FF5的靶序列Target^FF5。
pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER12-4xTarget^FF5质粒如序列113所示。序列113中，自5’末端第4275-4367位核苷酸为5×UAS序列，第4383-4399位核苷酸为T14序列(TALER14蛋白的靶点序列)，第4406-4465位核苷酸为CMVmini启动子，第4472-4488位核苷酸为T14序列，第4489-4505位核苷酸为T14序列，第4506-4522位核苷酸为T14序列，第4584-5300位核苷酸为EYFP的编码基因，第5307-5360位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第5370-8609位核苷酸为TALER12蛋白的编码基因，第8699-8720位核苷酸为shRNA-FF5的靶序列Target^FF5，第8721-8742位核苷酸为shRNA-FF5的靶序列Target^FF5，第8743-8764位核苷酸为shRNA-FF5的靶序列Target^FF5，第8765-8786位核苷酸为shRNA-FF5的靶序列Target^FF5。
pT14+T14x3+72-mKate2-2A-TALER21-4xTarget^FF3质粒如序列114所示。序列114中，自5’末端第4275-4367位核苷酸为5×UAS序列，第4383-4399位核苷酸为T14序列(TALER14蛋白的靶点序列)，第4406-4465位核苷酸为CMVmini启动子，第4472-4488位核苷酸为T14序列，第4489-4505位核苷酸为T14序列，第4506-4522位核苷酸为T14序列，第4584-5279位核苷酸为mKate2的编码基因，第5286-5339位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第5349-8690位核苷酸为TALER21蛋白的编码基因，第8778-8798位核苷酸为shRNA-FF3的靶序列Target^FF3，第8804-8824位核苷酸为shRNA-FF3的靶序列Target^FF3，第8830-8850位核苷酸为shRNA-FF3的靶序列Target^FF3，第8856-8876位核苷酸为shRNA-FF3的靶序列Target^FF3。
pT21+T21x3+72-EYFP-2A-TALER14-4xTarget^FF4质粒如序列115所示。序列115中，自5’末端第4275-4367位核苷酸为5×UAS序列，第4383-4401位核苷酸为T21序列(TALER21蛋白的靶点序列)，第4408-4467位核苷酸为CMVmini启动子，第4474-4492位核苷酸为T21序列，第4493-4511位核苷酸为T21序列，第4512-4530位核苷酸为T21序列，第4592-5308位核苷酸为EYFP的编码基因，第5315-5368位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第5378-8515位核苷酸为TALER14蛋白的编码基因，第8606-8627位核苷酸为shRNA-FF4的靶序列Target^FF4，第8628-8649位核苷酸为shRNA-FF4的靶序列Target^FF4，第8650-8671位核苷酸为shRNA-FF4的靶序列Target^FF4，第8678-8699位核苷酸为shRNA-FF4的靶序列Target^FF4。
pT21+T21x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒如序列116所示。序列116中，自5’末端第4275-4367位核苷酸为5×UAS序列，第4383-4401位核苷酸为T21序列(TALER21蛋白的靶点序列)，第4408-4467位核苷酸为CMVmini启动子，第4474-4490位核苷酸为T21序列，第4491-4509位核苷酸为T21序列，第4510-4530位核苷酸为T21序列，第4592-5308位核苷酸为EYFP的编码基因，第5315-5368位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第5378-8923位核苷酸为TALER9蛋白的编码基因，第9013-9034位核苷酸为shRNA-FF5的靶序列Target^FF5，第9035-9056位核苷酸为shRNA-FF5的靶序列Target^FF5，第9057-9078位核苷酸为shRNA-FF5的靶序列Target^FF5，第9079-9100位核苷酸为shRNA-FF5的靶序列Target^FF5。
pT21+T21x3+72-EYFP-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒如序列117所示。序列117中，自5’末端第4275-4367位核苷酸为5×UAS序列，第4383-4401位核苷酸为T21序列(TALER21蛋白的靶点序列)，第4408-4467位核苷酸为CMVmini启动子，第4474-4492位核苷酸为T21序列，第4493-4511位核苷酸为T21序列，第4512-4530位核苷酸为T21序列，第4592-5308位核苷酸为EYFP的编码基因，第5315-5368位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第5378-8821位核苷酸为TALER10蛋白的编码基因，第8900-8921位核苷酸为shRNA-FF4的靶序列Target^FF4，第8922-8943位核苷酸为shRNA-FF4的靶序列Target^FF4，第8944-8965位核苷酸为shRNA-FF4的靶序列Target^FF4，第8972-8993位核苷酸为shRNA-FF4的靶序列Target^FF4。
pT21+T21x3+72-EYFP-2A-TALER12-4xTarget^FF5质粒如序列118所示。序列118中，自5’末端第4275-4367位核苷酸为5×UAS序列，第4383-4401位核苷酸为T21序列(TALER21蛋白的靶点序列)，第4408-4467位核苷酸为CMVmini启动子，第4474-4492位核苷酸为T21序列，第4493-4511位核苷酸为T21序列，第4512-4530位核苷酸为T21序列，第4592-5308位核苷酸为EYFP的编码基因，第5315-5368位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第5378-8617位核苷酸为TALER12蛋白的编码基因，第8707-8728位核苷酸为shRNA-FF5的靶序列Target^FF5，第8729-8750位核苷酸为shRNA-FF5的靶序列Target^FF5，第8751-8772位核苷酸为shRNA-FF5的靶序列Target^FF5，第8773-8794位核苷酸为shRNA-FF5的靶序列Target^FF5。
pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒如序列119所示。序列119中，自5’末端第4275-4367位核苷酸为5×UAS序列，第4383-4399位核苷酸为T14序列(TALER14蛋白的靶点序列)，第4406-4465位核苷酸为CMVmini启动子，第4472-4488位核苷酸为T14序列，第4489-4505位核苷酸为T14序列，第4506-4522位核苷酸为T14序列，第4584-5300位核苷酸为EYFP的编码基因，第5307-5360位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第5370-8813位核苷酸为TALER10蛋白的编码基因，第8892-8913位核苷酸为shRNA-FF4的靶序列Target^FF4，第8914-8935位核苷酸为shRNA-FF4的靶序列Target^FF4，第8936-8957位核苷酸为shRNA-FF4的靶序列Target^FF4，第8964-8985位核苷酸为shRNA-FF4的靶序列Target^FF4。
pSIREN_U6-shRNA-FF3质粒如序列120所示。序列120中，自5’末端第229-477位核苷酸为U6启动子，第484-536位核苷酸为shRNA-FF3的编码基因，第741-1329位核苷酸为CMVIE启动子，第1361-2311位核苷酸为iRFP(近红外荧光素蛋白)的编码基因。
pSIREN_U6-shRNA-FF4质粒如序列121所示。序列121中，自5’末端第229-477位核苷酸为U6启动子，第484-536位核苷酸为shRNA-FF4的编码基因，第741-1329位核苷酸为CMVIE启动子，第1361-2311位核苷酸为iRFP(近红外荧光素蛋白)的编码基因。
pSIREN_U6-shRNA-FF5质粒如序列122所示。序列122中，自5’末端第229-477位核苷酸为U6启动子，第484-536位核苷酸为shRNA-FF5的编码基因，第741-1329位核苷酸为CMVIE启动子，第1361-2311位核苷酸为iRFP(近红外荧光素蛋白)的编码基因。
pSIREN_U6-shRNA-FF6质粒如序列123所示。序列123中，自5’末端第229-477位核苷酸为U6启动子，第484-536位核苷酸为shRNA-FF6的编码基因，第741-1329位核苷酸为CMVIE启动子，第1361-2311位核苷酸为iRFP(近红外荧光素蛋白)的编码基因。
shRNA-FF3、shRNA-FF4、shRNA-FF5、shRNA-FF6均为shRNA。
基因开关对于哺乳动物细胞的命运决定是必不可少的。合成基因开关是由两个相互转录抑制的元件组成，并且开关可以通过外部的信号分子抑制其中一个转录抑制元件实现状态的转换。有了高效转录抑制的TALER蛋白，发明人利用两个相互抑制的TALER蛋白作为模块来构建TALER开关，并且利用microRNA/shRNA作为信号来控制TALER开关的状态(图13A，波浪线代表shRNA，shRNA靶位点用小方块表示)。选择在以前的分析中具有强的抑制作用和强的正交性的TALER9蛋白、TALER10蛋白、TALER12蛋白、TALER14蛋白和TALER21蛋白作为构建TALER蛋白开关的模块。通过自断裂肽2A连接TALER蛋白和mKate2或EYFP荧光报告基因形成双基因表达载体。
一、实验一
通过绘制每个TALER蛋白对所有其它TALER蛋白的输出输入转移函数曲线进行零变位分析。
将pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、pT10+T10x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒和pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒共转染HEK293细胞(每孔转染100ng pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、100ng pT10+T10x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒和100ng pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒)，转染48小时后进行流式细胞术分析，检测mKate2的荧光强度、TagBFP的荧光强度和EYFP的荧光强度。质粒转染细胞的方式：取24孔板，每孔接种0.5mL HEK293细胞悬液(含6×104个HEK293细胞)，培养24小时后，更换新的DMEM培养基，然后进行质粒转染。
质粒转染细胞的方式：取24孔板，每孔接种0.5mL HEK293细胞悬液(含6×104个HEK293细胞)，培养24小时后，更换新的DMEM培养基，然后进行质粒转染。
用pT12+T12x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒代替pT10+T10x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒、且用pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER12-4xTarget^FF6质粒代替pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒，进行上述步骤。
用pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒代替pT10+T10x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒、且用pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF4质粒代替pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒，进行上述步骤。
用pT21+T21x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒代替pT10+T10x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒、且用pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER21-4xTarget^FF3质粒代替pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER10-4xF4质粒，进行上述步骤。
用pT12+T12x3+72-EYFP-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒代替pT10+T10x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒、且用pT10+T10x3+72-mKate2-2A-TALER12-4xTarget^FF6质粒代替pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER10-4xF4质粒，进行上述步骤。
用pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒代替pT10+T10x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒、且用pT10+T10x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF5质粒代替pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒，进行上述步骤。
用pT21+T21x3+72-EYFP-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒代替pT10+T10x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒、且用pT10+T10x3+72-mKate2-2A-TALER21-4xTarget^FF3质粒代替pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒，进行上述步骤。
用pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER12-4xTarget^FF5质粒代替pT10+T10x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒、且用pT12+T12x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF4质粒代替pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒，进行上述步骤。
用pT21+T21x3+72-EYFP-2A-TALER12-4xTarget^FF5质粒代替pT10+T10x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒、且用pT12+T12x3+72-mKate2-2A-TALER21-4xTarget^FF3质粒代替pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒，进行上述步骤。
用pT21+T21x3+72-EYFP-2A-TALER14-4xTarget^FF4质粒代替pT10+T10x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒、且用pT14+T14x3+72-mKate2-2A-TALER21-4xTarget^FF3质粒代替pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒，进行上述步骤。
结果见图13C。矩阵所示为有代表性的流式细胞散点图，其中每行标注为在转染实验中相同的与mKate2相连的TALER蛋白，而每列标注为在转染实验中相同的与EYFP相连的TALER蛋白。通过实验和由零变位分析预测的得到的EYFP和mKate2的比例有很好的相关性，拟合优度为0.85。这表明实验导出的零变位分析可以指导TALER开关的设计。
基于希尔方程拟合的转移方程曲线对TALER开关进行零变位分析如图13B所示(实线与虚线均代表TALER转移方程曲线，其中虚线的横轴对应输出而纵轴对应输入，粗线区域代表实验观测的输入范围，细线区域代表拟合的希尔方程推测的转移方程曲线，交点表示的TALER开关的平衡状态)。被测试的TALER开关通常有两种结果。第一种，和预期一样，两个TALER不平衡，则该TALER开关容易产生强的TALER模块的输出，而较弱模块的输出被抑制；第二种，当两个TALER是平衡的，则倾向于两个输出都被抑制。
二、试验二
质粒转染细胞的方式：取24孔板，每孔接种0.5mL HEK293细胞悬液(含6×104个HEK293细胞)，培养24小时后，更换新的DMEM培养基，然后进行质粒转染。
mKate2的荧光强度/TagBFP的荧光强度＝校正后的mKate2的荧光强度。EYFP的荧光强度/TagBFP的荧光强度＝校正后的EYFP的荧光强度。图14和图15中均采用校正后的mKate2的荧光强度和校正后的EYFP的荧光强度。
1、第一组：将pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒和pT10+T10x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒共转染HEK293细胞(每孔转染100ng pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、100ng pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒和100ng pT10+T10x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒)；第二组：将pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒、pT10+T10x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒和pSIREN_U6-shRNA-FF5质粒共转染HEK293细胞(每孔转染100ng pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、100ng pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒、100ng pT10+T10x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒和100ng pSIREN_U6-shRNA-FF5质粒)；第三组，用等质量pSIREN_U6-shRNA-FF4质粒代替pSIREN_U6-shRNA-FF5质粒，其它同第二组；转染48小时后进行流式细胞术分析，检测mKate2的荧光强度、TagBFP的荧光强度和EYFP的荧光强度。结果见图14A。
2、第一组：将pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER12-4xTarget^FF6质粒和pT12+T12x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒共转染HEK293细胞(每孔转染100ng pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、100ng pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER12-4xTarget^FF6质粒和100ng pT12+T12x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒)；第二组：将pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER12-4xTarget^FF6质粒、pT12+T12x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒和pSIREN_U6-shRNA-FF5质粒共转染HEK293细胞(每孔转染100ng pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、100ng pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER12-4xTarget^FF6质粒、100ng pT12+T12x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒和100ng pSIREN_U6-shRNA-FF5质粒)；第三组，用等质量pSIREN_U6-shRNA-FF6质粒代替pSIREN_U6-shRNA-FF5质粒，其它同第二组；转染48小时后进行流式细胞术分析，检测mKate2的荧光强度、TagBFP的荧光强度和EYFP的荧光强度。结果见图14B。
3、第一组：将pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF4质粒和pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒共转染HEK293细胞(每孔转染100ng pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、100ng pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF4质粒和100ng pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒)；第二组：将pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF4质粒、pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒和pSIREN_U6-shRNA-FF5质粒共转染HEK293细胞(每孔转染100ng pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、100ng pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF4质粒、100ng pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒和100ng pSIREN_U6-shRNA-FF5质粒)；第三组，用等质量pSIREN_U6-shRNA-FF4质粒代替pSIREN_U6-shRNA-FF5质粒，其它同第二组；转染48小时后进行流式细胞术分析，检测mKate2的荧光强度、TagBFP的荧光强度和EYFP的荧光强度。结果见图14C。
4、第一组：将pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER21-4xTarget^FF3质粒和pT21+T21x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒共转染HEK293细胞(每孔转染100ng pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、100ng pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER21-4xTarget^FF3质粒和100ng pT21+T21x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒)；第二组：将pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER21-4xTarget^FF3质粒、pT21+T21x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒和pSIREN_U6-shRNA-FF5质粒共转染HEK293细胞(每孔转染100ng pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、100ng pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER21-4xTarget^FF3质粒、100ng pT21+T21x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒和100ng pSIREN_U6-shRNA-FF5质粒)；第三组，用等质量pSIREN_U6-shRNA-FF3质粒代替pSIREN_U6-shRNA-FF5质粒，其它同第二组；转染48小时后进行流式细胞术分析，检测mKate2的荧光强度、TagBFP的荧光强度和EYFP的荧光强度。结果见图14D。
5、第一组：将pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、pT10+T10x3+72-mKate2-2A-TALER12-4xTarget^FF6质粒和pT12+T12x3+72-EYFP-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒共转染HEK293细胞(每孔转染100ng pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、100ng pT10+T10x3+72-mKate2-2A-TALER12-4xTarget^FF6质粒和100ng pT12+T12x3+72-EYFP-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒)；第二组：将pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、pT10+T10x3+72-mKate2-2A-TALER12-4xTarget^FF6质粒、pT12+T12x3+72-EYFP-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒和pSIREN_U6-shRNA-FF4质粒共转染HEK293细胞(每孔转染100ng pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、100ng pT10+T10x3+72-mKate2-2A-TALER12-4xTarget^FF6质粒、100ng pT12+T12x3+72-EYFP-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒和100ng pSIREN_U6-shRNA-FF4质粒)；第三组，用等质量pSIREN_U6-shRNA-FF6质粒代替pSIREN_U6-shRNA-FF4质粒，其它同第二组；转染48小时后进行流式细胞术分析，检测mKate2的荧光强度、TagBFP的荧光强度和EYFP的荧光强度。结果见图15C。
6、第一组：将pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、pT10+T10x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF5质粒和pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒共转染HEK293细胞(每孔转染100ng pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、100ng pT10+T10x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF5质粒和100ng pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒)；第二组：将pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、pT10+T10x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF5质粒、pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒和pSIREN_U6-shRNA-FF4质粒共转染HEK293细胞(每孔转染100ng pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、100ng pT10+T10x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF5质粒、100ng pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒和100ng pSIREN_U6-shRNA-FF4质粒)；第三组，用等质量pSIREN_U6-shRNA-FF5质粒代替pSIREN_U6-shRNA-FF4质粒，其它同第二组；转染48小时后进行流式细胞术分析，检测mKate2的荧光强度、TagBFP的荧光强度和EYFP的荧光强度。结果见图15D。
7、第一组：将pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、pT10+T10x3+72-mKate2-2A-TALER21-4xTarget^FF3质粒和pT21+T21x3+72-EYFP-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒共转染HEK293细胞(每孔转染100ng pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、100ng pT10+T10x3+72-mKate2-2A-TALER21-4xTarget^FF3质粒和100ng pT21+T21x3+72-EYFP-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒)；第二组：将pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、pT10+T10x3+72-mKate2-2A-TALER21-4xTarget^FF3质粒、pT21+T21x3+72-EYFP-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒和pSIREN_U6-shRNA-FF4质粒共转染HEK293细胞(每孔转染100ng pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、100ng pT10+T10x3+72-mKate2-2A-TALER21-4xTarget^FF3质粒、100ng pT21+T21x3+72-EYFP-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒和100ng pSIREN_U6-shRNA-FF4质粒)；第三组，用等质量pSIREN_U6-shRNA-FF3质粒代替pSIREN_U6-shRNA-FF4质粒，其它同第二组；转染48小时后进行流式细胞术分析，检测mKate2的荧光强度、TagBFP的荧光强度和EYFP 的荧光强度。结果见图15E。
8、第一组：将pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、pT12+T12x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF4质粒和pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER12-4xTarget^FF5质粒共转染HEK293细胞(每孔转染100ng pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、100ng pT12+T12x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF4质粒和100ng pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER12-4xTarget^FF5质粒)；第二组：将pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、pT12+T12x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF4质粒、pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER12-4xTarget^FF5质粒和pSIREN_U6-shRNA-FF5质粒共转染HEK293细胞(每孔转染100ng pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、100ng pT12+T12x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF4质粒、100ng pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER12-4xTarget^FF5质粒和100ng pSIREN_U6-shRNA-FF5质粒)；第三组，用等质量pSIREN_U6-shRNA-FF4质粒代替pSIREN_U6-shRNA-FF5质粒，其它同第二组；转染48小时后进行流式细胞术分析，检测mKate2的荧光强度、TagBFP的荧光强度和EYFP的荧光强度。结果见图15A。
9、第一组：将pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、pT12+T12x3+72-mKate2-2A-TALER21-4xTarget^FF3质粒和pT21+T21x3+72-EYFP-2A-TALER12-4xTarget^FF5质粒共转染HEK293细胞(每孔转染100ng pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、100ng pT12+T12x3+72-mKate2-2A-TALER21-4xTarget^FF3质粒和100ng pT21+T21x3+72-EYFP-2A-TALER12-4xTarget^FF5质粒)；第二组：将pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、pT12+T12x3+72-mKate2-2A-TALER21-4xTarget^FF3质粒、pT21+T21x3+72-EYFP-2A-TALER12-4xTarget^FF5质粒和pSIREN_U6-shRNA-FF5质粒共转染HEK293细胞(每孔转染100ng pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、100ng pT12+T12x3+72-mKate2-2A-TALER21-4xTarget^FF3质粒、100ng pT21+T21x3+72-EYFP-2A-TALER12-4xTarget^FF5质粒和100ng pSIREN_U6-shRNA-FF5质粒)；第三组，用等质量pSIREN_U6-shRNA-FF3质粒代替pSIREN_U6-shRNA-FF5质粒，其它同第二组；转染48小时后进行流式细胞术分析，检测mKate2的荧光强度、TagBFP的荧光强度和EYFP的荧光强度。结果见图15B。
10、第一组：将pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、pT14+T14x3+72-mKate2-2A-TALER21-4xTarget^FF3质粒和pT21+T21x3+72-EYFP-2A-TALER14-4xTarget^FF4质粒共转染HEK293细胞(每孔转染100ng pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、100ng pT14+T14x3+72-mKate2-2A-TALER21-4xTarget^FF3质粒和100ng pT21+T21x3+72-EYFP-2A-TALER14-4xTarget^FF4质粒)；第二组：将pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、pT14+T14x3+72-mKate2-2A-TALER21-4xTarget^FF3质粒、pT21+T21x3+72-EYFP-2A-TALER14-4xTarget^FF4质粒和pSIREN_U6-shRNA-FF4质粒共转染HEK293细胞(每孔转染100ng pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、100ng pT14+T14x3+72-mKate2-2A-TALER21-4xTarget^FF3质粒、100ng pT21+T21x3+72-EYFP-2A-TALER14-4xTarget^FF4质粒和100ng pSIREN_U6-shRNA-FF4质粒)；第三组，用等质量pSIREN_U6-shRNA-FF3质粒代替pSIREN_U6-shRNA-FF4质粒，其它同第二组；转染48小时后进行流式细胞术分析，检测mKate2的荧光强度、TagBFP的荧光强度和EYFP的荧光强度。结果见图14E。
图14和图15中，柱状图表示EYFP或mKate2荧光值均值±标准差，柱状图下的图为转染后48小时检测所得有代表性的流式细胞散点图。
结果表明，利用shRNA作为输入，足以将平衡和不平衡的TALER开关切换到任意的状态。
实施例6、内源性microRNA控制TALER开关提升细胞类型分类特性
pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒即为实施例4中的pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒。
pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒即为实施例5中的pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒。
pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF4质粒即为实施例5中的pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF4质粒。
pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒即为实施例5中的pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒。
pSIREN_U6-shRNA-FF5质粒即为实施例5中的pSIREN_U6-shRNA-FF5质粒。
pT21+T21x3+72-EYFP-2A-TALER12-4xTarget^FF5质粒即为实施例5中的pT21+T21x3+72-EYFP-2A-TALER12-4xTarget^FF5质粒。
pDT7004质粒(无特别元件，仅供转染时配平用)质粒如序列124所示。
pCH150质粒如序列125所示。序列125中，自5’末端第4781-4861位核苷酸为pEF1a(启动子)，第6750-7439位核苷酸为TagBFP的编码基因。TagBFP为组成型表达。
pCH169质粒如序列126所示。序列126中，自5’末端第4608-4703位核苷酸为H1/TOpromoter，第4709-4760位核苷酸为shRNA-FF4的编码基因，第4817-5989位核苷酸为pEF1a(启动子)，第6062-6706位核苷酸为Tet R的编码基因，第6785-7732位核苷酸为iRFP的编码基因。在存在DOX时,shRNA-FF4表达。
pCAG-Gal4/vp16质粒如序列127所示。序列127中，自5’末端第4253-5962位核苷酸为CAG启动子，第6019-6702位核苷酸为Gal4/vp16的编码基因。
pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^miR21质粒如序列128所示。序列128中，自5’末端第4275-4367位核苷酸为5×UAS序列，第4383-4399位核苷酸为T14序列(TALER14蛋白的靶点序列)，第4406-4465位核苷酸为CMVmini启动子，第4472-4486位核苷酸为T14序列，第4487-4503位核苷酸为T14序列，第4504-4522位核苷酸为T14序列，第4584-5300位核苷酸为EYFP的编码基因，第5307-5360位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第5370-8915位核苷酸为TALER9蛋白的编码基因，第8997-9018位核苷酸为miR21的靶序列Target^miR21，第9021-9042位核苷酸为miR21的靶序列Target^miR21，第9056-9077位核苷酸为miR21的靶序列Target^miR21，第9080-9101位核苷酸为miR21的靶序列Target^miR21。
pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF5质粒如序列129所示。序列129中，自5’末端第4275-4367位核苷酸为5×UAS序列，第4383-4403位核苷酸为T9序列(TALER9蛋白的靶点序列)，第4410-4469位核苷酸为CMVmini启动子，第4476-4496位核苷酸为T9序列，第4497-4517位核苷酸为T9序列，第4518-4538位核苷酸为T9序列，第4603-5295 位核苷酸为mKate2的编码基因，第5302-5355位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第5365-8502位核苷酸为TALER14蛋白的编码基因，第8593-8614位核苷酸为shRNA-FF5的靶序列Target^FF5，第8615-8636位核苷酸为shRNA-FF5的靶序列Target^FF5，第8637-8658位核苷酸为shRNA-FF5的靶序列Target^FF5，第8659-8680位核苷酸为shRNA-FF5的靶序列Target^FF5。
pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^miR18a质粒如序列130所示。序列130中，自5’末端第4275-4367位核苷酸为5×UAS序列，第4383-4403位核苷酸为T9序列(TALER9蛋白的靶点序列)，第4410-4469位核苷酸为CMVmini启动子，第4476-4496位核苷酸为T9序列，第4497-4517位核苷酸为T9序列，第4518-4538位核苷酸为T9序列，第4603-5295位核苷酸为mKate2的编码基因，第5302-5355位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第5365-8502位核苷酸为TALER14蛋白的编码基因，第8575-8597位核苷酸为miR18a的靶序列Target^miR18a，第8598-8620位核苷酸为miR18a的靶序列Target^miR18a，第8621-8643位核苷酸为miR18a的靶序列Target^miR18a，第8644-8666位核苷酸为miR18a的靶序列Target^miR18a。
pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^miR19ab质粒如序列131所示。序列130中，自5’末端第4275-4367位核苷酸为5×UAS序列，第4383-4403位核苷酸为T9序列(TALER9蛋白的靶点序列)，第4410-4469位核苷酸为CMVmini启动子，第4476-4496位核苷酸为T9序列，第4497-4517位核苷酸为T9序列，第4518-4538位核苷酸为T9序列，第4603-5295位核苷酸为mKate2的编码基因，第5302-5355位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第5365-8502位核苷酸为TALER14蛋白的编码基因，第8575-8597位核苷酸为miR19ab的靶序列Target^miR19ab，第8598-8620位核苷酸为miR19ab的靶序列Target^miR19ab，第8621-8643位核苷酸为miR19ab的靶序列Target^miR19ab，第8644-8666位核苷酸为miR19ab的靶序列Target^miR19ab。
pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^miR191质粒如序列132所示。序列132中，自5’末端第4275-4367位核苷酸为5×UAS序列，第4383-4403位核苷酸为T9序列(TALER9蛋白的靶点序列)，第4410-4469位核苷酸为CMVmini启动子，第4476-4496位核苷酸为T9序列，第4497-4517位核苷酸为T9序列，第4518-4538位核苷酸为T9序列，第4603-5295位核苷酸为mKate2的编码基因，第5302-5355位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第5365-8502位核苷酸为TALER14蛋白的编码基因，第8575-8597位核苷酸为miR191的靶序列Target^miR191，第8598-8620位核苷酸为miR191的靶序列Target^miR191，第8621-8643位核苷酸为miR191的靶序列Target^miR191，第8644-8666位核苷酸为miR191的靶序列Target^miR191。
一、实验一
之前，发明人已经证明利用合成的多输入逻辑基因线路可以通过检测HeLa特异的microRNA表达谱进行逻辑运算可以明确的识别HeLa细胞，这种细胞分类器需要广泛的优化以减少错误的输出，因为最初的HeLa细胞高表达的microRNA检测器的信噪比低于预期。在相关的研究中，已经发现相互抑制的结构在细胞极化的功能上可以作为一个强大的开关。发明人推测，不平衡的TALER开关将可以改善microRNA检测器，使其具有更高的开/关比。本实施例中发明人选择了一对不平衡的TALER蛋白(TALER9蛋白和TALER14蛋白)，并构建了受合成shRNA-FF5调控的相互抑制的闭环结构开关(图16A)，和一个由TALER9蛋白抑制的TALER10蛋白的启动子、而TALER10蛋白不抑制TALER9蛋白的启动子的开环的开关(图16B)。
质粒转染细胞的方式：取24孔板，每孔接种0.5mL HEK293细胞悬液(含6×104个HEK293细胞)，培养24小时后，更换新的DMEM培养基，然后进行质粒转染。
1(开环结构1:1)、将pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒、pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5、pSIREN_U6-shRNA-FF5质粒和pDT7004质粒共转染HEK293细胞(每孔转染100ng pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、100ng pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒、100ng pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒、z ng pSIREN_U6-shRNA-FF5质粒和100-z ng pDT7004质粒)，z＝0、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50或100；转染48小时后进行流式细胞术分析，检测mKate2的荧光强度、TagBFP的荧光强度和EYFP的荧光强度。
2(开环结构2:1)、将pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒、pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5、pSIREN_U6-shRNA-FF5质粒和pDT7004质粒共转染HEK293细胞(每孔转染100ng pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、100ng pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒、200ng pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒、z ng pSIREN_U6-shRNA-FF5质粒和100-z ng pDT7004质粒)，z＝0、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50或100；转染48小时后进行流式细胞术分析，检测mKate2的荧光强度、TagBFP的荧光强度和EYFP的荧光强度。
3(闭环结构1:1)、将pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF4质粒、pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5、pSIREN_U6-shRNA-FF5质粒和pDT7004质粒共转染HEK293细胞(每孔转染100ng pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、100ng pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF4质粒、100ng pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒、z ng pSIREN_U6-shRNA-FF5质粒和100-z ng pDT7004质粒)，z＝0、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50或100；转染48小时后进行流式细胞术分析，检测mKate2的荧光强度、TagBFP的荧光强度和EYFP的荧光强度。
4(闭环结构2:1)、将pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF4质粒、pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5、pSIREN_U6-shRNA-FF5质粒和pDT7004质粒共转染HEK293细胞(每孔转染100ng pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒、100ng pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF4质粒、200ng pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒、z ng pSIREN_U6-shRNA-FF5质粒和100-z ng pDT7004质粒)，z＝0、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50或100；转染48小时后进行流式细胞术分析，检测mKate2的荧光强度、TagBFP的荧光强度和EYFP的荧光强度。
mKate2的荧光强度/TagBFP的荧光强度＝校正后的mKate2的荧光强度。EYFP的荧光强度/TagBFP的荧光强度＝校正后的EYFP的荧光强度。图16中均采用校正后的mKate2的荧光强度和校正后的EYFP的荧光强度。
EYFP或mKate2荧光值见图16B(从左向右的点代表pSIREN_U6-shRNA-FF5质粒的加入量依次增加)，转染后48小时检测所得有代表性的流式细胞散点图见图16C。在转染实验中所使用的两种TALER质粒质量相等时，在加入100ng shRNA-FF5时，在闭环结构开关中观察到了～26倍的mKate2诱导表达，而在开环结构开关中则只有～4倍的mKate2诱导表达。当使用2:1的比例TALER9质粒和TALER14质粒时，相比与等量的TALER9质粒和TALER14质粒，需要大约8倍以上的shRNA才可以使得mKate2的诱导表达达到同一水平。结果表明，闭环的TALER开关显著的提高了microRNA信号检测的灵敏度和准确度，而通过改变两个TALER的比例可以调节对microRNA输入的灵敏度。
二、实验二
接着，发明人试图用内源性的microRNA来控制TALER开关。microRNA表达数据库表明miR18a、miR191和miR19ab的(miR19a加miR19b)是在HEK293细胞中的高表达，而在HeLa细胞中低表达的。HeLa细胞特异性的microRNA为miR21。见图17B。
1、制备重组细胞系
将pCH150质粒导入HeLa细胞，得到表达蓝色荧光蛋白TagBFP的HeLa细胞系(HeLa：TagBFP)。将pCH169质粒导入HEK293细胞，得到表达近红外荧光蛋白iRFP和shRNA-FF4的HEK293细胞系(HEK293：iRFP_shRNA-FF4)。具体方法如下：
在12孔板中，每孔加入含约2×105个HEK293-FT细胞(293FT Cell Line，InvitrogenTM，货号R700-07)的DMEM完全培养基1mL，培养24小时，然后用LipofectamineLTX配合Plus试剂将pCH150质粒，包装载体pCMV-dR8.2(Addgene公司)与pCMV-VSV-G(Addgene公司)共转染，转染24小时后，收集培养上清，即为含有表达TagBFP的慢病毒的病毒液，简称原代病毒液。取每孔含有约2×105个HeLa细胞的24孔板，每孔加入1mL原代病毒液、1ml培养基和10μg/mL的聚凝胺(Millipore公司)，培养72小时后；然后，加入终浓度为5μg/mL的杀稻瘟菌素(InvivoGen公司)，培养6天；然后，将杀稻瘟菌素浓度提高至10μg/mL，培养2天，经流式细胞仪确认，约95％的HeLa:TagBFP细胞为TagBFP阳性。
在12孔板中，每孔加入含约2×105个HEK293-FT细胞的DMEM完全培养基1mL，培养24小时，然后用Lipofectamine LTX配合Plus试剂将pCH169质粒，包装载体pCMV-dR8.2(Addgene公司)与pCMV-VSV-G(Addgene公司)共转染，转染24小时后，收集培养上清，即为含有表达iRFP_shRNA-FF4的慢病毒的病毒液，简称原代病毒液。取每孔含有约2×105个HEK293细胞的24孔板，每孔加入1mL原代病毒液，1ml培养基和10μg/mL的聚凝胺(Millipore公司)，培养72小时后；然后，加入终浓度为5μg/mL的杀稻瘟菌素(InvivoGen公司)，培养6天；然后，将杀稻瘟菌素浓度提高至10μg/mL，培养2天，经流式细胞仪确认，约40％的HEK293:iRFP_shRNA-FF4细胞为iRFP阳性；经过胰酶消化，300g离心5分钟，富集iRFP阳性HEK293:iRFP_shRNA-FF4细胞，用含10％FBS(Invitrogen)和1％sodium pyruvate(Invitrogen)的1xPBS重悬；利用BD AriaII进行细胞分选。选择波长640nm红色激光，780/60滤光片的ACP-Cy7通道分选HEK293:iRFP_shRNA-FF4细胞，用DMEM完全培养基收集前约10％的iRFP阳性HEK293:iRFP_shRNA-FF4细胞置于6孔板内，在湿度100％，二氧化碳浓度5％的37℃培养箱内培养。培养后，经流式细胞仪检测98％的HEK293:iRFP_shRNA-FF4细胞为iRFP阳性。
HeLa细胞(又称野生型细胞)、HeLa：TagBFP(又称改造型细胞)的流式细胞散点图如图17A所示，椭圆表示HEK293:iRFP_shRNA-FF4与HeLa:TagBFP区域。HEK293细胞(又称野生型细胞)、HEK293：iRFP_shRNA-FF4(又称改造型细胞)的流式细胞散点图如图17A所示，椭圆表示HEK293:iRFP_shRNA-FF4与HeLa:TagBFP区域。在iRFP/TagBFP散点图中，HEK293:iRFP_shRNA-FF4细胞和HeLa:TagBFP细胞有显著区别。
2、将HeLa：TagBFP细胞和HEK293:iRFP_shRNA-FF4细胞混合，得到混合细胞群。将pCAG-Gal4/vp16质粒、pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^miR-21质粒和pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF4质粒共转染混合细胞群(每孔转染100ng pCAG-Gal4/vp16质粒、x ng pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^miR-21质粒和y ng pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF4质粒)，转染同时在细胞培养体系中加入DOX使DOX浓度为1000ng/mL；转染48小时后进行流式细胞术分析，检测mKate2的荧光强度、TagBFP的荧光强度、iRFP的荧光强度和EYFP的荧光强度。(x:y)＝(100:200)、(100:150)、(100:100)、(150,100)或(200,100)。质粒转染细胞的方式：取24孔板，每孔接种0.5mL混合细胞悬液(含6×104个混合细胞)，培养24小时后，更换新的DMEM培养基，然后进行质粒转染。
流式细胞术分析图表明，进行分析时HeLa：TagBFP细胞和HEK293:iRFP_shRNA-FF4细胞数量基本一致。
原理示意图见图18A。结果见图18B：柱状图所示为HeLa：TagBFP细胞和HEK293:iRFP_shRNA-FF4细胞在EYFP+或mKate2+细胞群体中所占比例，所有数据条均表示三次独立重复实验结果均值±标准差；iRFP-TagBFP流式细胞散点图上排所示为EYFP+细胞群体分布，下排所示为mKate2+细胞群体分布，椭圆表示改造后HEK293或HeLa细胞群体。图18C所示为有代表性的EYFP-mKate2流式细胞散点图。
在所有被测的比例中，TALER开关在HEK293：iRFP_shRNA-FF4细胞中产生高EYFP表达，而基本没有mKate2表达。在所有被测的比例中，在HeLa：TagBFP细胞中产生高mKate2表达，而几乎没有EYFP表达。当以1:1的比例将开关转染入混合细胞群，～9％的HeLa：TagBFP细胞是EYFP假阳性的，～7％的HEK293：iRFP_shRNA-FF4细胞是mKate2假阳性的，这是在所有测试的比例中最准确。
3、TALER开关的可以通过内源的microRNA来控制
将HeLa：TagBFP细胞和HEK293:iRFP_shRNA-FF4细胞混合，得到混合细胞群。将pCAG-Gal4/vp16质粒、pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^miR-21质粒和pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^miR18a质粒共转染混合细胞群(每孔转染100ng pCAG-Gal4/vp16质粒、100ng pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^miR-21质粒和100ngpT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^miR18a质粒)，转染同时在细胞培养体系中加入DOX使DOX浓度为1000ng/mL；转染48小时后进行流式细胞术分析，检测mKate2的荧光强度、TagBFP的荧光强度、iRFP的荧光强度和EYFP的荧光强度。质粒转染细胞的方式：取24孔板，每孔接种0.5mL混合细胞悬液(含6×104个混合细胞)，培养24小时后，更换新的DMEM培养基，然后进行质粒转染。
pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^miR19ab质粒代替pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^miR18a质粒进行上述步骤。
pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^miR191质粒代替pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^miR18a质粒进行上述步骤。
流式细胞术分析图表明，进行分析时HeLa：TagBFP细胞和HEK293:iRFP_shRNA-FF4细胞数量基本一致。
结果见图19A：柱状图所示为HeLa：TagBFP细胞和HEK293:iRFP_shRNA-FF4细胞在EYFP+或mKate2+细胞群体中所占比例，所有数据条均表示三次独立重复实验结果均值±标准差；iRFP-TagBFP流式细胞散点图上排所示为EYFP+细胞群体分布，下排所示为mKate2+细胞群体分布，椭圆表示改造后HEK293或HeLa细胞群体。图19B所示为有代表性的EYFP-mKate2流式细胞散点图。
结果表明，HEK293特异的miR18a和HeLa特异的miR21是作为内源microRNA分类器信号最好的输入。这也表明TALER开关的可以通过内源的microRNA来控制。
4、混合细胞群中HEK293特异性microRNA的选择作用
基因线路如图20A所示，miRx表示miR18a、miR191或miR19ab，Tx表示miR18a、miR191、miR19ab的完全互补靶位点的四联重复序列，FF5表示shRNA-FF5的完全互补靶位点的四联重复序列。
将HeLa：TagBFP细胞和HEK293:iRFP_shRNA-FF4细胞混合，得到混合细胞群。将pCAG-Gal4/vp16质粒、pT21+T21x3+72-EYFP-2A-TALER12-4xTarget^FF5质粒和pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF5质粒共转染混合细胞群(每孔转染100ng pCAG-Gal4/vp16质粒、100ng pT21+T21x3+72-EYFP-2A-TALER12-4xTarget^FF5质粒和100ng pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF5质粒)，转染同时在细胞培养体系中加入DOX使DOX浓度为1000ng/mL；转染48小时后进行流式细胞术分析，检测mKate2的荧光强度、TagBFP的荧光强度、iRFP的荧光强度和EYFP的荧光强度。质粒转染细胞的方式：取24孔板，每孔接种0.5mL混合细胞悬液(含6×104个混合细胞)，培养24小时后，更换新的DMEM培养基，然后进行质粒转染。
用pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^miR18a质粒代替pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF5质粒进行上述步骤。
pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^miR19ab质粒代替pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF5质粒进行上述步骤。
pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^miR191质粒代替pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF5质粒进行上述步骤。
流式细胞术分析图表明，进行分析时HeLa：TagBFP细胞和HEK293:iRFP_shRNA-FF4细胞数量基本一致。
图20B：左图所示为有代表性的HEK293:iRFP_shRNA-FF4细胞与HeLa：TagBFP细胞的EYFP-mKate2流式细胞散点图；右图所示为相应细胞中microRNA敲除效率，柱状图均表示三次独立重复实验所得mKate2荧光值均值与EYFP荧光值均值之比。图20C：柱状图所示为EYFP+或mKate2+细胞群体中改造后HEK293与HeLa细胞所占比例，均表示三次独立重复实验所得均值±标准差；iRFP-TagBFP流式细胞散点图上排所示为EYFP+细胞分布，下排所示为mKate2+细胞分布，椭圆表示改造后HEK293或HeLa区域。
在混合细胞群中的荧光报告基因检测表明，miR18a具有显著的RNAi敲除效果，而miR191和miR19ab没有，没有相互抑制的开环结构TALER开关也不能有效的进行细胞分类。
进一步扩展的基因线路见图21(TALER开关的组合逻辑扩展示意图)。TALER a、b表示TALER基因；2A表示自剪切氨基酸序列；Ta和Tb表示TALERa和TALERb的结合位点；Activator表示转录激活子；5×ARS表示转录激活响应位点；miniCMV表示最小CMV启动子；pCAG表示组成型启动子；OUTa与OUTb表示两种不同输出。(A)TALER开关的基本设计。shRNA或者microRNA a、b作为输入。下方所示为相应逻辑表达式。(B)通过增加shRNA或者microRNA靶位点进行多shRNA或者microRNA的输入扩展的TALER开关。shRNA或者microRNAa1、a2和b1、b2等作为输入。下方所示为相应逻辑表达式。(C)通过增加平行的输出线路进行多shRNA或者microRNA输入扩展的TALER开关。
序列1、pCMV-TALER1质粒，7657bp，DNA5'→3'
序列2、pCMV-TALER2质粒，7657bp，DNA5'→3'
序列3、pCMV-TALER4质粒，7674bp，DNA5'→3'
序列4、pCMV-TALER5质粒，8082bp，DNA5'→3'
序列5、pCMV-TALER9质粒，8388bp，DNA5'→3'
序列6、pCMV-TALER10质粒，8286bp，DNA5'→3'
序列7、pCMV-TALER11质粒，8286bp，DNA5'→3'
序列8、pCMV-TALER12质粒，8082bp，DNA5'→3'
序列9、pCMV-TALER13质粒，7980bp，DNA5'→3'
序列10、pCMV-TALER14质粒，7980bp，DNA5'→3'
序列11、pCMV-TALER15质粒，8035bp，DNA5'→3'
序列12、pCMV-TALER16质粒，8035bp，DNA5'→3'
序列13、pCMV-TALER17质粒，8035bp，DNA5'→3'
序列14、pCMV-TALER18质粒，8035bp，DNA5'→3'
序列15、pCMV-TALER19质粒，8184bp，DNA5'→3'
序列16、pCMV-TALER20质粒，8035bp，DNA5'→3'
序列17、pCMV-TALER21质粒，8184bp，DNA5'→3'
序列18、pCMV-TALER22质粒，7423bp，DNA5'→3'
序列19、pCMV-TALER23质粒，7423bp，DNA5'→3'
序列20、pCMV-TALER24质粒，7423bp，DNA5'→3'
序列21、pCMV-TALER26质粒，7788bp，DNA5'→3'
序列22、pCMV-TALER29质粒，7380bp，DNA5'→3'
序列23、pCMV-TALER30质粒，7380bp，DNA5'→3'
序列24、pCMV-TALER31质粒，7380bp，DNA5'→3'
序列25、pCMV-TALER32质粒，7380bp，DNA5'→3'
序列26、pCMV-TALER35质粒，7380bp，DNA5'→3'
序列27、pT1+T1+质粒，7370bp，DNA5'→3'
序列28、pT2+T2+质粒，7277bp，DNA5'→3'
序列29、pT4+T4+质粒，7277bp，DNA5'→3'
序列30、pT5+T5+质粒，7285bp，DNA5'→3'
序列31、pT9+T9+质粒，7291bp，DNA5'→3'
序列32、pT10+T10+质粒，7289bp，DNA5'→3'
序列33、pT11+T11+质粒，7289bp，DNA5'→3'
序列34、pT12+T12+质粒，7285bp，DNA5'→3'
序列35、pT13+T13+质粒，7283bp，DNA5'→3'
序列36、pT14+T14+质粒，7283bp，DNA5'→3'
序列37、pT15+T15+质粒，7299bp，DNA5'→3'
序列38、pT16+T16+质粒，7299bp，DNA5'→3'
序列39、pT17+T17+质粒，7299bp，DNA5'→3'
序列40、pT18+T18+质粒，7299bp，DNA5'→3'
序列41、pT19+T19+质粒，7287bp，DNA5'→3'
序列42、pT20+T20+质粒，7299bp，DNA5'→3'
序列43、pT21+T21+质粒，7287bp，DNA5'→3'
序列44、pT22+T22+质粒，7287bp，DNA5'→3'
序列45、pT23+T23+质粒，7287bp，DNA5'→3'
序列46、pT24+T24+质粒，7287bp，DNA5'→3'
序列47、pT26+T26+质粒，7285bp，DNA5'→3'
序列48、pT29+T29+质粒，7277bp，DNA5'→3'
序列49、pT30+T30+质粒，7277bp，DNA5'→3'
序列50、pT31+T31+质粒，7275bp，DNA5'→3'
序列51、pT32+T32+质粒，7277bp，DNA5'→3'
序列52、pT35+T35+质粒，7277bp，DNA5'→3'
序列53、pEF1a-TagBFP-2A质粒，9066bp，DNA5'→3'
序列54、pT1+T1+72-DsRed质粒，3727bp，DNA5'→3'
序列55、pT1+T2+72-DsRed质粒，3727bp，DNA5'→3'
序列56、pT2+T1+72-DsRed质粒，3727bp，DNA5'→3'
序列57、pT2+T2+72-DsRed质粒，3727bp，DNA5'→3'
序列58、pT1+T1+72-mKate2质粒，7370bp，DNA5'→3'
序列59、pT1+T1+78-mKate2质粒，7283bp，DNA5'→3'
序列60、pT1+T1+83-mKate2质粒，7288bp，DNA5'→3'
序列61、pT1+T1+89-mKate2质粒，7294bp，DNA5'→3'
序列62、pT1+T1+94-mKate2质粒，7299bp，DNA5'→3'
序列63、pT1+T1+100-mKate2质粒，7305bp，DNA5'→3'
序列64、pT2+T2+72-mKate2质粒，7277bp，DNA5'→3'
序列65、pT2+T2x3+72-mKate2质粒，7310bp，DNA5'→3'
序列66、pT4+T4+72-mKate2质粒，7277bp，DNA5'→3'
序列67、pT4+T4x3+72-mKate2质粒，7305bp，DNA5'→3'
序列68、pT5+T5+72-mKate2质粒，7285bp，DNA5'→3'
序列69、pT5+T5x3+72-mKate2质粒，7321bp，DNA5'→3'
序列70、pT32+T32+72-mKate2质粒，7277bp，DNA5'→3'
序列71、pT32+T32x3+72-mKate2质粒，7305bp，DNA5'→3'
序列72、
序列73、pCAG-rtTA-2A-Gal4/vp16质粒，9636bp，DNA5'→3'
序列74、pT14+T14+72-mKate2质粒，7301bp，DNA5'→3'
序列75、pT14+T14x3+72-mKate2质粒，7317bp，DNA5'→3'
序列76、pT21+T21+72-mKate2质粒，7305bp，DNA5'→3'
序列77、pT21+T21x3+72-mKate2,7325bp，DNA5'→3'
序列78、pTRE-EBFP2质粒，7352bp，DNA5'→3'
序列79、pTRE-TALER14-4xT质粒，9919bp，DNA5'→3'
序列80、pTRE-TALER21-4xT质粒，10140bp，DNA5'→3'
序列81、pT14+T14+72_TALER21质粒，10089bp，DNA5'→3'
序列82、pT14+T14x3+72_TALER21质粒，10123bp，DNA5'→3'
序列83、pT21+T21+72_TALER14质粒，9872bp，DNA5'→3'
序列84、pT21+T21x3+72_TALER14质粒，9910bp，DNA5'→3'
序列85、pCAG-EYFP质粒，6371bp，DNA5'→3'
序列86、pCAG-TagBFP质粒，8833bp，DNA5'→3'
序列87、pTRE-mKate2质粒，7502bp，DNA5'→3'
序列88、pEF1a-rtTA-2A-Hyg质粒，9464bp，DNA5'→3'
序列89、pTRE-EYFP-2A-TALER14质粒，10768bp，DNA5'→3'
序列90、pTRE-mKate2-2A-TALER14质粒，10747bp，DNA5'→3'
序列91、pCAG-Gal4/vp16-2A-TagBFP-2A-Bla质粒，9890bp，DNA5'→3'
序列92、pT9+T9x3+72-mKate2质粒，7333bp，DNA5'→3'
序列93、pT10+T10x3+72-mKate2质粒，7329bp，DNA5'→3'
序列94、pT12+T12x3+72-mKate2质粒，7339bp，DNA5'→3'
序列95、pTRE-EYFP-2A-TALER9质粒，11185bp，DNA5'→3'
序列96、pTRE-EYFP-2A-TALER10质粒，11062bp，DNA5'→3'
序列97、pTRE-EYFP-2A-TALER12，10879bp，DNA5'→3'
序列98、pTRE-EYFP-2A-TALER21质粒，10981bp，DNA5'→3'
序列99、pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒，10965bp，DNA5'→3'
序列100、pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER12-4xTarget^FF6质粒，10772bp，DNA5'→3'
序列101、pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF4质粒，10671bp，DNA5'→3'
序列102、pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER21-4xTarget^FF3质粒，10892bp，DNA5'→3'
序列103、pT10+T10x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒，11105bp，DNA5'→3'
序列104、pT10+T10x3+72-mKate2-2A-TALER12-4xTarget^FF6质粒，10768bp，DNA5'→3'
序列105、pT10+T10x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF4质粒，10667bp，DNA5'→3'
序列106、pT10+T10x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF5质粒，10661bp，DNA5'→3'
序列107、pT10+T10x3+72-mKate2-2A-TALER21-4xTarget^FF3质粒，10888bp，DNA5'→3'
序列108、pT12+T12x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒，11097bp，DNA5'→3'
序列109、pT12+T12x3+72-EYFP-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒，10974bp，DNA5'→3'
序列110、pT12+T12x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF4质粒，10659bp，DNA5'→3'
序列111、pT12+T12x3+72-mKate2-2A-TALER21-4xTarget^FF3质粒，10880bp，DNA5'→3'
序列112、pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒，11093bp，DNA5'→3'
序列113、pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER12-4xTarget^FF5质粒，10787bp，DNA5'→3'
序列114、pT14+T14x3+72-mKate2-2A-TALER21-4xTarget^FF3质粒，10876bp，DNA5'→3'
序列115、pT21+T21x3+72-EYFP-2A-TALER14-4xTarget^FF4质粒，10684bp，DNA5'→3'
序列116、pT21+T21x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^FF5质粒，11101bp，DNA5'→3'
序列117、pT21+T21x3+72-EYFP-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒，10978bp，DNA5'→3'
序列118、pT21+T21x3+72-EYFP-2A-TALER12-4xTarget^FF5质粒，10795bp，DNA5'→3'
序列119、pT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER10-4xTarget^FF4质粒，10970bp，DNA5'→3'
序列120、pSIREN_U6-shRNA-FF3质粒，6896bp，DNA5'→3'
序列121、pSIREN_U6-shRNA-FF4质粒，6896bp，DNA5'→3'
序列122、pSIREN_U6-shRNA-FF5质粒，6896bp，DNA5'→3'
序列123、pSIREN_U6-shRNA-FF6质粒，6896bp，DNA5'→3'
序列124、pDT7004质粒，5426bp，DNA5'→3'
序列125、pCH150质粒，11296bp，DNA5'→3'
序列126、pCH169，11589bp，DNA5'→3'
序列127、pCAG-Gal4/vp16质粒，8761bp，DNA5'→3'
序列128、ppT14+T14x3+72-EYFP-2A-TALER9-4xTarget^miR21质粒，11086bp，DNA5'→3'
序列129、pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^FF5质粒，10665bp，DNA5'→3'
序列130、pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^miR18a质粒，10650bp，DNA5'→3'
序列131、pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^miR19ab质粒，10644bp，DNA5'→3'
序列132、pT9+T9x3+72-mKate2-2A-TALER14-4xTarget^miR191质粒，10650bp，DNA5'→3'
Claims (18)
1.一种实现两种蛋白可调控式表达的试剂盒，为如下(a)或(b)：
(a)包括表达盒甲-Ⅰ、表达盒乙-Ⅰ和表达盒丙的试剂盒；
(b)包括具有所述表达盒甲-Ⅰ的重组载体甲-Ⅰ、具有所述表达盒乙-Ⅰ的重组载体乙-Ⅰ和具有所述表达盒丙的重组载体丙的试剂盒；
所述表达盒甲-Ⅰ自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动子甲、通过自剪切多肽的编码基因连接的蛋白甲的编码基因和TALER蛋白甲的编码基因、靶序列甲-Ⅰ；所述靶序列甲-Ⅰ包括1个以上shRNA1的靶序列；
所述表达盒乙-Ⅰ自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动子乙、通过自剪切多肽的编码基因连接的蛋白乙的编码基因和TALER蛋白乙的编码基因、靶序列乙-Ⅰ；所述靶序列乙-Ⅰ包括1个以上shRNA2的靶序列；
所述表达盒甲-Ⅰ中，所述启动子甲的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白乙的靶点，或，所述启动子甲的上游不具有所述TALER蛋白乙的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白乙的靶点；
所述表达盒乙-Ⅰ中，所述启动子乙的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白甲的靶点，或，所述启动子乙的上游不具有所述TALER蛋白甲的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白甲的靶点；
所述表达盒丙自上游至下游依次包括组成型启动子和激活元件的编码序列；在所述激活元件的刺激下，位于所述反馈元件的编码序列的下游的DNA表达；
将具有所述表达盒甲-Ⅰ的重组载体甲-Ⅰ、具有所述表达盒乙-Ⅰ的重组载体乙-Ⅰ和具有所述表达盒丙的重组载体丙导入宿主细胞，通过加入shRNA1或shRNA2调控所述蛋白甲的表达和所述蛋白乙的表达。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：
所述表达盒甲-Ⅰ中，所述启动子甲的上游具有1个所述TALER蛋白乙的靶点且其下游具有1-3个所述TALER蛋白乙的靶点；
所述表达盒乙-Ⅰ中，所述启动子乙的上游具有1个所述TALER蛋白甲的靶点且其下游具有1-3个所述TALER蛋白甲的靶点。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：
所述表达盒甲-Ⅰ中，所述启动子甲上游的TALER蛋白乙的靶点与所述启动子甲下游最邻近的TALER蛋白乙的靶点之间的距离为72-100bp；
所述表达盒乙-Ⅰ中，所述启动子乙上游的TALER蛋白甲的靶点与所述启动子乙下游最邻近的TALER蛋白甲的靶点之间的距离为72-100bp。
4.一种实现两种蛋白可调控式表达的试剂盒，为如下(a)或(b)：
(a)包括表达盒甲-Ⅰ、表达盒乙-Ⅰ和表达盒丙的试剂盒；
(b)包括具有所述表达盒甲-Ⅰ的重组载体甲-Ⅰ、具有所述表达盒乙-Ⅰ的重组载体乙-Ⅰ和具有所述表达盒丙的重组载体丙的试剂盒；
所述表达盒甲-Ⅰ自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动子甲、通过自剪切多肽的编码基因连接的蛋白甲的编码基因和TALER蛋白甲的编码基因、靶序列甲-Ⅰ；所述靶序列甲-Ⅰ包括shRNA1-1的靶序列、……、shRNA1-n的靶序列，n为2以上的自然数；
所述表达盒乙-Ⅰ自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动子乙、通过自剪切多肽的编码基因连接的蛋白乙的编码基因和TALER蛋白乙的编码基因、靶序列乙-Ⅰ；所述靶序列乙-Ⅰ包括shRNA2-1的靶序列、……、shRNA2-n的靶序列，n为2以上的自然数；
所述表达盒甲-Ⅰ中，所述启动子甲的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白乙的靶点，或，所述启动子甲的上游不具有所述TALER蛋白乙的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白乙的靶点；
所述表达盒乙-Ⅰ中，所述启动子乙的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白甲的靶点，或，所述启动子乙的上游不具有所述TALER蛋白甲的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白甲的靶点；
所述表达盒丙自上游至下游依次包括组成型启动子和激活元件的编码序列；在所述激活元件的刺激下，位于所述反馈元件的编码序列的下游的DNA表达；
将具有所述表达盒甲-Ⅰ的重组载体甲-Ⅰ、具有所述表达盒乙-Ⅰ的重组载体乙-Ⅰ和具有所述表达盒丙的重组载体丙导入宿主细胞，通过加入shRNA1-1、……、shRNA1-n、shRNA2-1、……或shRNA2-n调控所述蛋白甲的表达和所述蛋白乙的表达。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：
所述表达盒甲-Ⅰ中，所述启动子甲的上游具有1个所述TALER蛋白乙的靶点且其下游具有1-3个所述TALER蛋白乙的靶点；
所述表达盒乙-Ⅰ中，所述启动子乙的上游具有1个所述TALER蛋白甲的靶点且其下游具有1-3个所述TALER蛋白甲的靶点。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：
所述表达盒甲-Ⅰ中，所述启动子甲上游的TALER蛋白乙的靶点与所述启动子甲下游最邻近的TALER蛋白乙的靶点之间的距离为72-100bp；
所述表达盒乙-Ⅰ中，所述启动子乙上游的TALER蛋白甲的靶点与所述启动子乙下游最邻近的TALER蛋白甲的靶点之间的距离为72-100bp。
7.一种实现两种蛋白可调控式表达的试剂盒，为如下(a)或(b)：
(a)包括表达盒甲-Ⅰ、表达盒乙-Ⅰ、表达盒丙和表达盒丁-Ⅰ的试剂盒；
(b)包括具有所述表达盒甲-Ⅰ的重组载体甲-Ⅰ、具有所述表达盒乙-Ⅰ的重组载体乙-Ⅰ、具有所述表达盒丙的重组载体丙和具有所述表达盒丁-Ⅰ的重组载体丁-Ⅰ的试剂盒；
所述表达盒甲-Ⅰ自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动子甲、通过自剪切多肽的编码基因连接的蛋白甲的编码基因和TALER蛋白甲的编码基因、靶序列甲-Ⅰ；所述靶序列甲-Ⅰ包括shRNA1-1的靶序列、……、shRNA1-n的靶序列，n为2以上的自然数；
所述表达盒乙-Ⅰ自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动子乙、通过自剪切多肽的编码基因连接的蛋白乙的编码基因和TALER蛋白乙的编码基因、靶序列乙-Ⅰ；所述靶序列乙-Ⅰ包括shRNA2-1的靶序列、……、shRNA2-n的靶序列，n为2以上的自然数；
所述表达盒丁-Ⅰ自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动子丁、通过自剪切多肽的编码基因连接的蛋白乙的编码基因和TALER蛋白乙的编码基因、靶序列丁；所述靶序列丁-Ⅰ包括shRNA3-1的靶序列、……、shRNA3-n的靶序列，n为2以上的自然数；
所述表达盒甲-Ⅰ中，所述启动子甲的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白乙的靶点，或，所述启动子甲的上游不具有所述TALER蛋白乙的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白乙的靶点；
所述表达盒乙-Ⅰ中，所述启动子乙的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白甲的靶点，或，所述启动子乙的上游不具有所述TALER蛋白甲的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白甲的靶点；
所述表达盒丁-Ⅰ中，所述启动子丁的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白甲的靶点，或，所述启动子丁的上游不具有所述TALER蛋白甲的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白甲的靶点；
所述表达盒丙自上游至下游依次包括组成型启动子和激活元件的编码序列；在所述激活元件的刺激下，位于所述反馈元件的编码序列的下游的DNA表达；
将具有所述表达盒甲-Ⅰ的重组载体甲-Ⅰ、具有所述表达盒乙-Ⅰ的重组载体乙-Ⅰ、具有所述表达盒丙的重组载体丙和具有所述表达盒丁-Ⅰ的重组载体丁-Ⅰ导入宿主细胞，通过加入shRNA1-1、……、shRNA1-n、shRNA2-1、……、shRNA2-n、shRNA3-1、……或shRNA3-n调控所述蛋白甲的表达和所述蛋白乙的表达。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：
所述表达盒甲-Ⅰ中，所述启动子甲的上游具有1个所述TALER蛋白乙的靶点且其下游具有1-3个所述TALER蛋白乙的靶点；
所述表达盒乙-Ⅰ中，所述启动子乙的上游具有1个所述TALER蛋白甲的靶点且其下游具有1-3个所述TALER蛋白甲的靶点；
所述表达盒丁-Ⅰ中，所述启动子丁的上游具有1个所述TALER蛋白甲的靶点且其下游具有1-3个所述TALER蛋白甲的靶点。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：
所述表达盒甲-Ⅰ中，所述启动子甲上游的TALER蛋白乙的靶点与所述启动子甲下游最邻近的TALER蛋白乙的靶点之间的距离为72-100bp；
所述表达盒乙-Ⅰ中，所述启动子乙上游的TALER蛋白甲的靶点与所述启动子乙下游最邻近的TALER蛋白甲的靶点之间的距离为72-100bp；
所述表达盒丁-Ⅰ中，所述启动子丁上游的TALER蛋白甲的靶点与所述启动子丁下游最邻近的TALER蛋白甲的靶点之间的距离为72-100bp。
10.一种从混合细胞中分选细胞甲和/或细胞乙的试剂盒，为如下(a)或(b)：
(a)包括表达盒甲-Ⅱ、表达盒乙-Ⅱ和表达盒丙的试剂盒；
(b)包括具有所述表达盒甲-Ⅱ的重组载体甲-Ⅱ、具有所述表达盒乙-Ⅱ的重组载体乙-Ⅱ和具有所述表达盒丙的重组载体丙的试剂盒；
所述表达盒甲-Ⅱ自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动子甲、通过自剪切多肽的编码基因连接的荧光蛋白甲的编码基因和TALER蛋白甲的编码基因、靶序列甲-Ⅱ；所述靶序列甲-Ⅱ包括1个以上miRNA1的靶序列；
所述表达盒乙-Ⅱ自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动子乙、通过自剪切多肽的编码基因连接的荧光蛋白乙的编码基因和TALER蛋白乙的编码基因、靶序列乙-Ⅱ；所述靶序列乙-Ⅱ包括1个以上miRNA2的靶序列；
所述表达盒甲-Ⅱ中，所述启动子甲的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白乙的靶点，或，所述启动子甲的上游不具有所述TALER蛋白乙的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白乙的靶点；
所述表达盒乙-Ⅱ中，所述启动子乙的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白甲的靶点，或，所述启动子乙的上游不具有所述TALER蛋白甲的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白甲的靶点；
所述表达盒丙自上游至下游依次包括组成型启动子和激活元件的编码序列；在所述激活元件的刺激下，位于所述反馈元件的编码序列的下游的DNA表达；
所述miRNA1为所述细胞甲具有的特定miRNA；所述miRNA2为所述细胞乙具有的特定miRNA；
所述荧光蛋白甲和所述荧光蛋白乙具有不同的荧光颜色；
将具有表达盒甲-Ⅱ的重组载体甲-Ⅱ、具有表达盒乙-Ⅱ的重组载体乙-Ⅱ和具有表达盒丙的重组载体丙导入所述混合细胞，通过检测荧光蛋白甲和/或荧光蛋白乙的强度分选所述细胞甲和/或所述细胞乙。
11.如权利要求10所述的试剂盒，其特征在于：
所述表达盒甲-Ⅱ中，所述启动子甲的上游具有1个所述TALER蛋白乙的靶点且其下游具有1-3个所述TALER蛋白乙的靶点；
所述表达盒乙-Ⅱ中，所述启动子乙的上游具有1个所述TALER蛋白甲的靶点且其下游具有1-3个所述TALER蛋白甲的靶点。
12.如权利要求11所述的试剂盒，其特征在于：
所述表达盒甲-Ⅱ中，所述启动子甲上游的TALER蛋白乙的靶点与所述启动子甲下游最邻近的TALER蛋白乙的靶点之间的距离为72-100bp；
所述表达盒乙-Ⅱ中，所述启动子乙上游的TALER蛋白甲的靶点与所述启动子乙下游最邻近的TALER蛋白甲的靶点之间的距离为72-100bp。
13.一种从混合细胞中分选细胞甲和/或细胞乙的试剂盒，为如下(a)或(b)：
(a)包括表达盒甲-Ⅱ、表达盒乙-Ⅱ和表达盒丙的试剂盒；
(b)包括具有所述表达盒甲-Ⅱ的重组载体甲-Ⅱ、具有所述表达盒乙-Ⅱ的重组载体乙-Ⅱ和具有所述表达盒丙的重组载体丙的试剂盒；
所述表达盒甲-Ⅱ自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动子甲、通过自剪切多肽的编码基因连接的荧光蛋白甲的编码基因和TALER蛋白甲的编码基因、靶序列甲-Ⅱ；所述靶序列甲-Ⅱ包括miRNA1-1的靶序列、……、miRNA1-n的靶序列，n为2以上的自然数；
所述表达盒乙-Ⅱ自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动子乙、通过自剪切多肽的编码基因连接的荧光蛋白乙的编码基因和TALER蛋白乙的编码基因、靶序列乙-Ⅱ；所述靶序列乙-Ⅱ包括miRNA2-1的靶序列、……、miRNA2-n的靶序列，n为2以上的自然数；
所述表达盒甲-Ⅱ中，所述启动子甲的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白乙的靶点，或，所述启动子甲的上游不具有所述TALER蛋白乙的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白乙的靶点；
所述表达盒乙-Ⅱ中，所述启动子乙的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白甲的靶点，或，所述启动子乙的上游不具有所述TALER蛋白甲的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白甲的靶点；
所述表达盒丙自上游至下游依次包括组成型启动子和激活元件的编码序列；在所述激活元件的刺激下，位于所述反馈元件的编码序列的下游的DNA表达；
所述miRNA1-1、……、miRNA1-n为细胞甲具有的特定miRNA；
所述miRNA2-1、……、miRNA2-n为细胞乙具有的特定miRNA；
所述荧光蛋白甲和所述荧光蛋白乙具有不同的荧光颜色；
将具有表达盒甲-Ⅱ的重组载体甲-Ⅱ、具有表达盒乙-Ⅱ的重组载体乙-Ⅱ和具有表达盒丙的重组载体丙导入所述混合细胞，通过检测荧光蛋白甲和/或荧光蛋白乙的强度分选所述细胞甲和/或所述细胞乙。
14.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于：
所述表达盒甲-Ⅱ中，所述启动子甲的上游具有1个所述TALER蛋白乙的靶点且其下游具有1-3个所述TALER蛋白乙的靶点；
所述表达盒乙-Ⅱ中，所述启动子乙的上游具有1个所述TALER蛋白甲的靶点且其下游具有1-3个所述TALER蛋白甲的靶点。
15.如权利要求14所述的试剂盒，其特征在于：
所述表达盒甲-Ⅱ中，所述启动子甲上游的TALER蛋白乙的靶点与所述启动子甲下游最邻近的TALER蛋白乙的靶点之间的距离为72-100bp；
所述表达盒乙-Ⅱ中，所述启动子乙上游的TALER蛋白甲的靶点与所述启动子乙下游最邻近的TALER蛋白甲的靶点之间的距离为72-100bp。
16.一种从混合细胞中分选细胞甲和/或细胞乙的试剂盒，为如下(a)或(b)：
(a)包括表达盒甲-Ⅱ、表达盒乙-Ⅱ、表达盒丙和表达盒丁-Ⅱ的试剂盒；
(b)包括具有所述表达盒甲-Ⅱ的重组载体甲-Ⅱ、具有所述表达盒乙-Ⅱ的重组载体乙-Ⅱ、具有所述表达盒丙的重组载体丙和具有所述表达盒丁-Ⅱ的重组载体丁-Ⅱ的试剂盒；
所述表达盒甲-Ⅱ自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动子甲、通过自剪切多肽的编码基因连接的所述荧光蛋白甲的编码基因和TALER蛋白甲的编码基因、靶序列甲-Ⅱ；所述靶序列甲-Ⅱ包括miRNA1-1的靶序列、……、miRNA1-n的靶序列，n为2以上的自然数；
所述表达盒乙-Ⅱ自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动子乙、通过自剪切多肽的编码基因连接的所述荧光蛋白乙的编码基因和TALER蛋白乙的编码基因、靶序列乙-Ⅱ；所述靶序列乙-Ⅱ包括miRNA2-1的靶序列、……、miRNA2-n的靶序列，n为2以上的自然数；
所述表达盒丁-Ⅱ自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动子乙、通过自剪切多肽的编码基因连接的所述荧光蛋白乙的编码基因和TALER蛋白乙的编码基因、靶序列丁-Ⅱ；所述靶序列丁-Ⅱ包括miRNA3-1的靶序列、……、miRNA3-n的靶序列，n为2以上的自然数；
所述表达盒甲-Ⅱ中，所述启动子甲的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白乙的靶点，或，所述启动子甲的上游不具有所述TALER蛋白乙的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白乙的靶点；
所述表达盒乙-Ⅱ中，所述启动子乙的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白甲的靶点，或，所述启动子乙的上游不具有所述TALER蛋白甲的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白甲的靶点；
所述表达盒丁-Ⅱ中，所述启动子乙的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白甲的靶点，或，所述启动子乙的上游不具有所述TALER蛋白甲的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白甲的靶点；
所述表达盒丙自上游至下游依次包括组成型启动子和激活元件的编码序列；在所述激活元件的刺激下，位于所述反馈元件的编码序列的下游的DNA表达；
所述miRNA1-1、……、miRNA1-n为细胞甲具有的特定miRNA；
所述miRNA2-1、……、miRNA2-n为细胞乙具有的特定miRNA；
所述miRNA3-1、……、miRNA3-n为细胞乙具有的特定miRNA；
所述荧光蛋白甲和所述荧光蛋白乙具有不同的荧光颜色；
将具有表达盒甲-Ⅱ的重组载体甲-Ⅱ、具有表达盒乙-Ⅱ的重组载体乙-Ⅱ、具有表达盒丙的重组载体丙和具有表达盒丁-Ⅱ的重组载体丁-Ⅱ导入所述混合细胞，通过检测荧光蛋白甲和/或荧光蛋白乙的强度分选所述细胞甲和/或所述细胞乙。
17.如权利要求16所述的试剂盒，其特征在于：
所述表达盒甲-Ⅱ中，所述启动子甲的上游具有1个所述TALER蛋白乙的靶点且其下游具有1-3个所述TALER蛋白乙的靶点；
所述表达盒乙-Ⅱ中，所述启动子乙的上游具有1个所述TALER蛋白甲的靶点且其下游具有1-3个所述TALER蛋白甲的靶点；
所述表达盒丁-Ⅱ中，所述启动子乙的上游具有1个所述TALER蛋白甲的靶点且其下游具有1-3个所述TALER蛋白甲的靶点。
18.如权利要求17所述的试剂盒，其特征在于：
所述表达盒甲-Ⅱ中，所述启动子甲上游的TALER蛋白乙的靶点与所述启动子甲下游最邻近的TALER蛋白乙的靶点之间的距离为72-100bp；
所述表达盒乙-Ⅱ中，所述启动子乙上游的TALER蛋白甲的靶点与所述启动子乙下游最邻近的TALER蛋白甲的靶点之间的距离为72-100bp；
所述表达盒丁-Ⅱ中，所述启动子乙上游的TALER蛋白甲的靶点与所述启动子乙下游最邻近的TALER蛋白甲的靶点之间的距离为72-100bp。
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