CN104178506B - Taler蛋白通过空间位阻发挥转录抑制作用及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了TALER蛋白通过空间位阻发挥转录抑制作用及其应用。本发明保护TALER蛋白在使目的启动子失活中的应用；所述目的启动子的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白的靶点，或，所述目的启动子的上游不具有所述TALER蛋白的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白的靶点。本发明还保护TALER蛋白在使目的蛋白的编码基因失活中的应用；所述目的蛋白的编码基因由目的启动子启动表达；所述目的启动子的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白的靶点，或，所述目的启动子的上游不具有所述TALER蛋白的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白的靶点。本发明对于蛋白的调控表达方式和功能研究具有重大价值。
Description
技术领域
本发明涉及TALER蛋白通过空间位阻发挥转录抑制作用及其应用。
背景技术
合成的基因线路经过精心设计，依据功能将基因调控装置组装起来，感受、整合、处理细胞内的分子信息，行使一定的功能。各种合成基因线路已发展在细胞内实现可定制、可编程的功能，包括动态行为、开关和记忆、细胞间通讯、适应性、细胞极化、数字和模拟计算和复杂的生物合成途径。这些基因线路中大多数是通过使用有限的基因元件和昂贵、低效的“尝试-错误”的方法构建。因此，为了简化设计和优化对活体细胞进行复杂的操作，研发出一个大规模的、功能定义良好的合成基因元件库和相应的计算模型和模拟方法是很有必要的。
在针对哺乳动物的合成生物学研究领域，工程化的合成转录激活子和抑制子是支持可扩展的基因线路设计的一个重要的目标。目前，构建哺乳动物/真核生物转录抑制子常用的策略是融合一个转录抑制结构域和一个工程化的DNA结合蛋白结构域，比如锌指蛋白、转录激活子类似因子(TALE)蛋白和失活的Cas9(dCas9)核酸酶在RNA引导的CRISPR(簇状周期性间隔短回文重复序列)系统。然而，转录抑制结构域，如Krüppel相关盒(KRAB)转录抑制结构域和mSin相互作用结构域(SID4)通常会导致靶启动子附近的表观遗传学修饰，因而响应时间很慢。因此，这种转录抑制不适用于构建响应快速、可逆的基因线路。
另一种普遍存在于原核生物中的转录抑制模式是通过无功能结构域的空间位阻，而这在真核生物中并不常见，例如，Lac抑制子(LacI)和四环素抑制子(TetR)通过低聚化结合在启动子附近的特异DNA序列，使DNA形成一个环，从而阻止转录起始核心元件在启动子区域的结合)。已有研究表明，在哺乳动物基因调控的环境下，在合成基因线路中把LacI结合位点放置在巨细胞病毒启动子(CMV)或者CAG启动子下游，可以抑制基因表达，虽然抑制效率在哺乳动物表达系统中低于原核表达系统。类似的，在哺乳动物系统中dCas9蛋白不融合任何转录抑制结构域也表现出弱的转录抑制功能。
TALER蛋白由若干个特异性识别DNA的串联“蛋白模块”和两侧的N-末端及C-末端序列组成。每个“蛋白模块”包含33-35个氨基酸残基，第12、13位氨基酸残基是靶向识别的关键位点，被称作重复可变的双连氨基酸残基(RVDs)位点。TALER蛋白上的每个RVD仅能识别一个碱基。TALEN(Transcription Activator-Like Effector Nuclease)是一种人工改造的限制性内切酶，是将TALER蛋白(作为DNA结合域)与限制性内切酶FokⅠ(作为DNA切割域，又称抑制结构域)融合而得到的TALEN融合蛋白。TALEN在细胞中与基因组的靶位点结合，形成二聚体发挥内切酶活性，导致左右TALEN的spacer区域发生双链DNA断裂(DSB，Double-Strand Breaks)，从而诱发DNA损伤修复机制。细胞可以通过非同源性末端接合机制(NHEJ,Non-homologous End Joining)修复DNA。NHEJ修复机制并不精确，极易发生错误(缺失/插入)，从而造成移码突变，因此可以达到基因敲除的目的。
发明内容
本发明的目的是提供TALER蛋白通过空间位阻发挥转录抑制作用及其应用。
本发明保护TALER蛋白在使目的启动子失活中的应用；所述目的启动子的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白的靶点，或，所述目的启动子的上游不具有所述TALER蛋白的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白的靶点。
具体来说，所述目的启动子的上游具有1个所述TALER蛋白的靶点且其下游具有1-3个所述TALER蛋白的靶点。
更为具体来说，所述目的启动子上游的TALER蛋白的靶点与所述目的启动子下游最邻近的TALER蛋白的靶点之间的距离为72-100bp。
所述目的启动子具体可为CMVmini启动子。
本发明还保护TALER蛋白在使目的蛋白的编码基因失活中的应用；所述目的蛋白的编码基因由目的启动子启动表达；所述目的启动子的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白的靶点，或，所述目的启动子的上游不具有所述TALER蛋白的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白的靶点。
具体来说，所述目的启动子的上游具有1个所述TALER蛋白的靶点且其下游具有1-3个所述TALER蛋白的靶点。
更为具体来说，所述目的启动子上游的TALER蛋白的靶点与所述目的启动子下游最邻近的TALER蛋白的靶点之间的距离为72-100bp。
所述目的启动子具体可为CMVmini启动子。
本发明还保护TALER蛋白在使目的功能片段失活中的应用；所述目的功能片段为DNA片段；所述目的功能片段的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白的靶点，或，所述目的功能片段的上游不具有所述TALER蛋白的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白的靶点。
具体来说，所述目的功能片段的上游具有1个所述TALER蛋白的靶点且其下游具有1-3个所述TALER蛋白的靶点。
更为具体来说，所述目的功能片段上游的TALER蛋白的靶点与所述目的功能片段下游最邻近的TALER蛋白的靶点之间的距离为72-100bp。
本发明还保护一种DNA分子组合，包括DNA分子甲、DNA分子乙和DNA分子丙；所述DNA分子甲自上游至下游依次包括启动子和Gal4/vp16的编码基因；所述DNA分子乙自上游至下游依次包括如下元件：5×UAS序列、TALER蛋白的靶点、CMVmini启动子、1-3个所述TALER蛋白的靶点和目的蛋白的编码基因；所述DNA分子丙自上游至下游依次包括启动子和所述TALER蛋白的编码基因。
所述DNA分子甲中的启动子具体可为pEF1a启动子。所述DNA分子甲中还可具有荧光蛋白的编码基因(具体可为TagBFP的编码基因)，所述荧光蛋白的编码基因位于所述Gal4/vp16的编码基因的上游或下游，且两者通过2A连接肽的编码基因连接。
所述DNA分子乙中的目的蛋白具体可为荧光蛋白，如mKate2。
所述DNA分子丙中，所述启动子具体可为CMV启动子。所述DNA分子丙中还可具有荧光蛋白的编码基因(具体可为EYFP的编码基因)，所述荧光蛋白的编码基因位于所述TALER蛋白的编码基因的上游或下游，且两者通过2A连接肽的编码基因连接。
本发明还保护一种质粒组合，包括质粒甲、质粒乙和质粒丙；所述质粒甲具有以上任一所述的DNA分子甲；所述质粒乙具有以上任一所述的DNA分子乙；所述质粒丙具有以上任一所述的DNA分子丙。
本发明还保护一种调控目的蛋白表达的方法，包括如下步骤：通过将所述的DNA分子甲和所述的DNA分子乙转染宿主细胞，从而使得所述目的蛋白表达；通过在转染所述DNA分子甲和所述DNA分子乙的细胞中转染所述DNA分子丙，从而抑制所述目的蛋白表达。
本发明还保护一种调控目的蛋白表达的方法，包括如下步骤：通过将所述的质粒甲和所述的质粒乙转染宿主细胞，从而使得所述目的蛋白表达；通过在转染所述质粒甲和所述质粒乙的细胞中转染所述质粒丙，从而抑制所述目的蛋白表达。
所述CMV启动子可为实施例1-2中的任一所述质粒中的CMV启动子。
所述EYFP的编码基因可为实施例1-2中的任一所述质粒中的EYFP的编码基因。
所述2A连接肽的编码基因可为实施例1-2中的任一所述质粒中的2A连接肽的编码基因。
所述TALER蛋白的编码基因可为实施例1-2中的任一所述质粒中的TALER蛋白的编码基因(如TALER1的编码基因、TALER2的编码基因、TALER4的编码基因等等)。
所述5×UAS序列可为实施例1-2中的任一所述质粒中的5×UAS序列。
所述TALER蛋白的靶点可为实施例1-2中的任一所述质粒中的TALER蛋白的靶点序列(如T1序列、T2序列、T4序列等等)。
所述CMVmini启动子可为实施例1-2中的任一所述质粒中的CMVmini启动子。
所述mKate2的编码基因可为实施例1-2中的任一所述质粒中的mKate2的编码基因。
所述pEF1a启动子可为实施例1-2中的任一所述质粒中的pEF1a启动子。
所述TagBFP的编码基因可为实施例1-2中的任一所述质粒中的TagBFP的编码基因。
所述Gal4/vp16的编码基因可为实施例1-2中的任一所述质粒中的Gal4/vp16的编码基因。
所述质粒甲具体可为pEF1a-TagBFP-2A质粒。
所述质粒乙具体可为实施例中任一带有TALER蛋白的靶点的质粒(如pT1+T1+质粒、pT2+T2+质粒、pT4+T4+质粒等等)。所述质粒乙具体可为pCMV-TALER1质粒、pCMV-TALER9质粒、pCMV-TALER10质粒、pCMV-TALER12质粒、pCMV-TALER13质粒、pCMV-TALER14质粒、pCMV-TALER16质粒、pCMV-TALER21质粒、pCMV-TALER29质粒或pCMV-TALER35质粒。
所述质粒丙具体可为实施例中任一带有TALER蛋白的编码基因的质粒(如pCMV-TALER1质粒、pCMV-TALER2质粒、pCMV-TALER4质粒等等)。所述质粒丙具体可为pT1+T1+质粒、pT9+T9+质粒、pT10+T10+质粒、pT12+T12+质粒、pT13+T13+质粒、pT14+T14+质粒、pT16+T16+质粒、pT21+T21+质粒、pT29+T29+质粒或pT35+T35+质粒。
本发明发现，TALER蛋白(即没有抑制结构域的TALEN融合蛋白)可以利用空间位阻抑制转录起始元件和TALER蛋白靶点附近的启动子的结合，从而抑制转录，抑制效率受到TALER蛋白靶点的个数以及TALER蛋白靶点与CMVmini启动子的距离的影响。本发明对于蛋白的调控表达方式和功能研究具有重大价值。
附图说明
图1为TALER蛋白的作用机理示意图。
图2为pCMV-TALERx质粒、pTx+Tx+质粒和pEF1a-TagBFP-2A质粒的作用机理示意图。
图3为实施例1的步骤一的结果。
图4为实施例2的步骤二的结果。
图5为实施例2的步骤一的结果。
图6为实施例2的步骤二的结果。
图7为实施例2的步骤三的结果。
图8为实施例2的步骤四的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的定量试验，均设置三次重复，结果取平均值。HEK293细胞：Invitrogen公司。TALER蛋白的作用机理示意图见图1。
实施例中用质粒转染细胞的方式：取24孔板，每孔接种0.5mL HEK293细胞悬液(含6×104个HEK293细胞)，培养24小时后，更换新的DMEM培养基，然后进行质粒转染。
实施例1、TALER蛋白的功能验证和特异性分析
pCMV-TALERx质粒、pTx+Tx+质粒和pEF1a-TagBFP-2A质粒的作用机理示意图见图2。在pEF1a启动子的作用下，TagBFP和Gal4/vp16被表达(TagBFP和Gal4/vp16之间的2A连接肽为自剪接肽，所以TagBFP可以代表Gal4/vp16的表达量)。Gal4/vp16激活5×UAS序列，从而激活CMVmini启动子的转录起始，mKate2被表达。在CMV启动子的作用下，EYFP和TALER1蛋白被表达(EYFP和TALER1蛋白之间的2A连接肽为自剪接肽，所以EYFP可以代表TALER1蛋白的表达量)。TALER1蛋白结合T1序列，通过空间位阻发挥转录抑制作用，两个T1序列之间的CMVmini启动子失活，从而mKate2被抑制表达。
pCMV-TALER1质粒如序列1所示。序列1中，自5’末端第1-589位核苷酸为CMV启动子，第603-1319位核苷酸为EYFP(增强型黄色荧光蛋白)的编码基因，第1326-1379位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第1389-4220位核苷酸为TALER1蛋白的编码基因，第4227-4259位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pT1+T1+质粒如序列27所示。序列27中，自5’末端第4275-4367位核苷酸为5×UAS序列，第4383-4396位核苷酸为T1序列(TALER1蛋白的靶点序列)，第4403-4462位核苷酸为CMVmini启动子，第4469-4482位核苷酸为T1序列，第4532-5237位核苷酸为mKate2(远红荧光蛋白)的编码基因。
pEF1a-TagBFP-2A质粒如序列53所示。序列53中，自5’末端第4250-5423位核苷酸为pEF1a(启动子)，第5488-6177位核苷酸为TagBFP(蓝色荧光蛋白)的编码基因，第6178-6243位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第6250-6933位核苷酸为Gal4/vp16(融合转录因子)的编码基因。
pCMV-TALER2质粒如序列2所示。序列2中，第1-589位核苷酸为CMV启动子，第603-1319位核苷酸为EYFP的编码基因，第1326-1379位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第1389-4220位核苷酸为TALER2蛋白的编码基因，第4227-4259位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER4质粒如序列3所示。序列3中，第1713-2301位核苷酸为CMV启动子，第2315-3031位核苷酸为EYFP的编码基因，第3038-3091位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第3101-5932位核苷酸为TALER4蛋白的编码基因，第5939-5971位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER5质粒如序列4所示。序列4中，第5842-6430位核苷酸为CMV启动子，第6444-7160位核苷酸为EYFP的编码基因，第7167-7220位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第7230-2387位核苷酸为TALER5蛋白的编码基因，第2394-2426位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER9质粒如序列5所示。序列5中，第6148-6736位核苷酸为CMV启动子，第6750-7466位核苷酸为EYFP的编码基因，第7473-7526位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第7536-2693位核苷酸为TALER9蛋白的编码基因，第2700-2732位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER10质粒如序列6所示。序列6中，第1792-2380位核苷酸为CMV启动子，第2394-3110位核苷酸为EYFP的编码基因，第3117-3170位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第3180-6623位核苷酸为TALER10蛋白的编码基因，第6630-6662位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER11质粒如序列7所示。序列7中，第1766-2354位核苷酸为CMV启动子，第2368-3084位核苷酸为EYFP的编码基因，第3091-3144位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第3154-6597位核苷酸为TALER11蛋白的编码基因，第6604-6636位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER12质粒如序列8所示。序列8中，第1705-2293位核苷酸为CMV启动子，第2307-3023位核苷酸为EYFP的编码基因，第3030-3083位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第3093-6332位核苷酸为TALER12蛋白的编码基因，第6339-6371位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER13质粒如序列9所示。序列9中，第1687-2275位核苷酸为CMV启动子，第2289-3005位核苷酸为EYFP的编码基因，第3012-3065位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第3075-6212位核苷酸为TALER13蛋白的编码基因，第6219-6251位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER14质粒如序列10所示。序列10中，第1764-2352位核苷酸为CMV启动子，第2366-3082位核苷酸为EYFP的编码基因，第3089-3142位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第3152-6289位核苷酸为TALER14蛋白的编码基因，第6296-6328位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER15质粒如序列11所示。序列11中，第1-589位核苷酸为CMV启动子，第603-1319位核苷酸为EYFP的编码基因，第1326-1379位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第1394-4597位核苷酸为TALER15蛋白的编码基因，第4605-4637位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER16质粒如序列12所示。序列12中，第1-589位核苷酸为CMV启动子，第603-1319位核苷酸为EYFP的编码基因，第1326-1379位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第1394-4597位核苷酸为TALER16蛋白的编码基因，第4605-4637位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER17质粒如序列13所示。序列13中，第1-589位核苷酸为CMV启动子，第603-1319位核苷酸为EYFP的编码基因，第1326-1379位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第1394-4597位核苷酸为TALER17蛋白的编码基因，第4605-4637位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER18质粒如序列14所示。序列14中，第1-589位核苷酸为CMV启动子，第603-1319位核苷酸为EYFP的编码基因，第1326-1379位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第1394-4597位核苷酸为TALER18蛋白的编码基因，第4605-4637位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER19质粒如序列15所示。序列15中，第1711-2299位核苷酸为CMV启动子，第2313-3029位核苷酸为EYFP的编码基因，第3036-3089位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第3099-6440位核苷酸为TALER19蛋白的编码基因，第6447-6479位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER20质粒如序列16所示。序列16中，第1-589位核苷酸为CMV启动子，第603-1319位核苷酸为EYFP的编码基因，第1326-1379位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第1394-4597位核苷酸为TALER20蛋白的编码基因，第4605-4637位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER21质粒如序列17所示。序列17中，第1616-2204位核苷酸为CMV启动子，第2218-2934位核苷酸为EYFP的编码基因，第2941-2994位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第3004-6345位核苷酸为TALER21蛋白的编码基因，第6352-6384位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER22质粒如序列18所示。序列18中，第1-589位核苷酸为CMV启动子，第603-1319位核苷酸为EYFP的编码基因，第1326-1379位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第1394-3985位核苷酸为TALER22蛋白的编码基因，第3993-4025位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER23质粒如序列19所示。序列19中，第1-589位核苷酸为CMV启动子，第603-1319位核苷酸为EYFP的编码基因，第1326-1379位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第1394-3985位核苷酸为TALER23蛋白的编码基因，第3993-4025位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER24质粒如序列20所示。序列20中，第1-589位核苷酸为CMV启动子，第603-1319位核苷酸为EYFP的编码基因，第1326-1379位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第1394-3985位核苷酸为TALER24蛋白的编码基因，第3993-4025位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER26质粒如序列21所示。序列21中，第1679-2267位核苷酸为CMV启动子，第2281-2997位核苷酸为EYFP的编码基因，第3004-3057位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第3064-6009位核苷酸为TALER26蛋白的编码基因，第6024-6045位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER29质粒如序列22所示。序列22中，第1638-2226位核苷酸为CMV启动子，第2240-2956位核苷酸为EYFP的编码基因，第2963-3016位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第3023-5560位核苷酸为TALER29蛋白的编码基因，第5575-5596位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER30质粒如序列23所示。序列23中，第1838-2426位核苷酸为CMV启动子，第2440-3156位核苷酸为EYFP的编码基因，第3163-3216位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第3223-5760位核苷酸为TALER30蛋白的编码基因，第5775-5796位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER31质粒如序列24所示。序列24中，第3403-3991位核苷酸为CMV启动子，第4005-4721位核苷酸为EYFP的编码基因，第4728-4781位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第4788-7325位核苷酸为TALER31蛋白的编码基因，第7340-7361位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER32质粒如序列25所示。序列25中，第1691-2279位核苷酸为CMV启动子，第2293-3009位核苷酸为EYFP的编码基因，第3016-3069位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第3076-5613位核苷酸为TALER32蛋白的编码基因，第5628-5649位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pCMV-TALER35如序列26所示。序列26中，第1607-2195位核苷酸为CMV启动子，第2209-2925位核苷酸为EYFP的编码基因，第2932-2985位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第2992-5529位核苷酸为TALER35蛋白的编码基因，第5544-5565位核苷酸为核定位信号SV40NLS的编码基因。
pT2+T2+质粒如序列28所示。序列28中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-190位核苷酸为T2序列(TALER2蛋白的靶点序列)，第197-256位核苷酸为CMVmini启动子，第263-276位核苷酸为T2序列，第355-1073位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT4+T4+质粒如序列29所示。序列29中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-190位核苷酸为T4序列(TALER4蛋白的靶点序列)，第197-256位核苷酸为CMVmini启动子，第263-276位核苷酸为T4序列，第355-1073位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT5+T5+质粒如序列30所示。序列30中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-194位核苷酸为T5序列(TALER5蛋白的靶点序列)，第201-260位核苷酸为CMVmini启动子，第267-284位核苷酸为T5序列，第363-1081位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT9+T9+质粒如序列31所示。序列31中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-197位核苷酸为T9序列(TALER9蛋白的靶点序列)，第204-263位核苷酸为CMVmini启动子，第270-290位核苷酸为T9序列，第369-1087位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT10+T10+质粒如序列32所示。序列32中，自5’末端第7069-7161位核苷酸为5×UAS序列，第7177-7196位核苷酸为T10序列(TALER10蛋白的靶点序列)，第7203-7262位核苷酸为CMVmini启动子，第7269-7288位核苷酸为T10序列，第78-796位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT11+T11+质粒如序列33所示。序列33中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-196位核苷酸为T11序列(TALER11蛋白的靶点序列)，第203-262位核苷酸为CMVmini启动子，第269-288位核苷酸为T11序列，第367-1085位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT12+T12+质粒如序列34所示。序列34中，自5’末端第7069-7161位核苷酸为5×UAS序列，第7177-7194位核苷酸为T12序列(TALER12蛋白的靶点序列)，第7201-7260位核苷酸为CMVmini启动子，第7267-7284位核苷酸为T12序列，第78-796位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT13+T13+质粒如序列35所示。序列35中，自5’末端第7069-7161位核苷酸为5×UAS序列，第7177-7193位核苷酸为T13序列(TALER13蛋白的靶点序列)，第7200-7259位核苷酸为CMVmini启动子，第7266-7282位核苷酸为T13序列，第78-796位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT14+T14+质粒如序列36所示。序列36中，自5’末端第7069-7161位核苷酸为5×UAS序列，第7177-7193位核苷酸为T14序列(TALER14蛋白的靶点序列)，第7200-7259位核苷酸为CMVmini启动子，第7266-7282位核苷酸为T14序列，第78-796位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT15+T15+质粒如序列37所示。序列37中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-201位核苷酸为T15序列(TALER15蛋白的靶点序列)，第208-267位核苷酸为CMVmini启动子，第274-298位核苷酸为T15序列，第377-1095位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT16+T16+质粒如序列38所示。序列38中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-201位核苷酸为T16序列(TALER16蛋白的靶点序列)，第208-267位核苷酸为CMVmini启动子，第274-298位核苷酸为T16序列，第377-1095位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT17+T17+质粒如序列39所示。序列39中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-201位核苷酸为T17序列(TALER17蛋白的靶点序列)，第208-267位核苷酸为CMVmini启动子，第274-298位核苷酸为T17序列，第377-1095位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT18+T18+质粒如序列40所示。序列40中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-201位核苷酸为T18序列(TALER18蛋白的靶点序列)，第208-267位核苷酸为CMVmini启动子，第274-298位核苷酸为T18序列，第377-1095位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT19+T19+质粒如序列41所示。序列41中，自5’末端第7069-7161位核苷酸为5×UAS序列，第7177-7195位核苷酸为T19序列(TALER19蛋白的靶点序列)，第7202-7261位核苷酸为CMVmini启动子，第7268-7286位核苷酸为T19序列，第78-796位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT20+T20+质粒如序列42所示。序列42中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-201位核苷酸为T20序列(TALER20蛋白的靶点序列)，第208-267位核苷酸为CMVmini启动子，第274-298位核苷酸为T20序列，第377-1095位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT21+T21+质粒如序列43所示。序列43中，自5’末端第7069-7161位核苷酸为5×UAS序列，第7177-7195位核苷酸为T21序列(TALER21蛋白的靶点序列)，第7202-7261位核苷酸为CMVmini启动子，第7268-7286位核苷酸为T21序列，第78-796位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT22+T22+质粒如序列44所示。序列44中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-195位核苷酸为T22序列(TALER22蛋白的靶点序列)，第202-261位核苷酸为CMVmini启动子，第268-286位核苷酸为T22序列，第365-1083位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT23+T23+质粒如序列45所示。序列45中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-195位核苷酸为T23序列(TALER23蛋白的靶点序列)，第202-261位核苷酸为CMVmini启动子，第268-286位核苷酸为T23序列，第365-1083位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT24+T24+质粒如序列46所示。序列46中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-195位核苷酸为T24序列(TALER24蛋白的靶点序列)，第202-261位核苷酸为CMVmini启动子，第268-286位核苷酸为T24序列，第365-1083位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT26+T26+质粒如序列47所示。序列47中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-194位核苷酸为T26序列(TALER26蛋白的靶点序列)，第201-260位核苷酸为CMVmini启动子，第267-284位核苷酸为T26序列，第363-1081位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT29+T29+质粒如序列48所示。序列48中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-190位核苷酸为T29序列(TALER29蛋白的靶点序列)，第197-256位核苷酸为CMVmini启动子，第263-276位核苷酸为T29序列，第355-1073位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT30+T30+质粒如序列49所示。序列49中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-190位核苷酸为T30序列(TALER30蛋白的靶点序列)，第197-256位核苷酸为CMVmini启动子，第263-276位核苷酸为T30序列，第355-1073位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT31+T31+质粒如序列50所示。序列50中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-189位核苷酸为T31序列(TALER31蛋白的靶点序列)，第196-255位核苷酸为CMVmini启动子，第262-274位核苷酸为T31序列，第353-1071位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT32+T32+质粒如序列51所示。序列51中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-190位核苷酸为T32序列(TALER32蛋白的靶点序列)，第197-256位核苷酸为CMVmini启动子，第263-276位核苷酸为T32序列，第355-1073位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT35+T35+质粒如序列52所示。序列52中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-190位核苷酸为T35序列(TALER35蛋白的靶点序列)，第197-256位核苷酸为CMVmini启动子，第263-276位核苷酸为T35序列，第355-1073位核苷酸为mKate2的编码基因。
一、实验一
将pCMV-TALER1质粒、pT1+T1+质粒和pEF1a-TagBFP-2A质粒共转染HEK293细胞(每孔转染200ng pCMV-TALER1质粒、50ng pT1+T1+质粒和30ng pEF1a-TagBFP-2A质粒)，转染48小时后进行流式细胞术分析，检测EYFP的荧光强度、mKate2的荧光强度和TagBFP的荧光强度。设置不加入pCMV-TALER1质粒的对照处理。抑制倍数＝对照组mKate2荧光强度校正值÷实验组mKate2荧光强度校正值。抑制百分比＝(对照组mKate2荧光强度校正值-实验组mKate2荧光强度校正值)÷对照组mKate2荧光强度校正值。mKate2荧光强度校正值＝mKate2的荧光强度/TagBFP的荧光强度。
用pCMV-TALER2质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT2+T2+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER4质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT4+T4+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER5质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT5+T5+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER9质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT9+T9+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER10质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT10+T10+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER11质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT11+T11+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER12质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT12+T12+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER13质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT13+T13+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER14质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT14+T14+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER15质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT15+T15+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER16质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT16+T16+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER17质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT17+T17+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER18质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT18+T18+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER19质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT19+T19+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER20质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT20+T20+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER21质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT21+T21+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER22质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT22+T22+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER23质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT23+T23+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER24质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT24+T24+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER26质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT26+T26+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER29质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT29+T29+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER30质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT30+T30+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER31质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT31+T31+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER32质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT32+T32+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。用pCMV-TALER35质粒代替pCMV-TALER1质粒，用pT35+T35+质粒代替pT1+T1+质粒进行上述步骤。
抑制倍数结果和抑制百分比结果见图3(柱形图代表抑制倍数，点状图代表抑制百分比)和表1。26个TALER蛋白中的23个都表现出大于90％的转录抑制效果，其中16个TALER蛋白具有大于100倍的转录抑制效果。结果表明：在哺乳动物细胞中，TALER蛋白(即没有抑制结构域的TALEN融合蛋白)也可以通过空间位阻发挥高效的转录抑制作用。
表1 抑制倍数结果和抑制百分比结果
二、实验二
在实验一的基础上，通过测定前十个最强抑制效果的TALER蛋白对验证模块(Tx-CMVmini启动子-Tx-mKate2基因)的转录抑制作用来检测正交性。
举例如下：将pCMV-TALER1质粒、pT35+T35+质粒和pEF1a-TagBFP-2A质粒共转染HEK293细胞(每孔转染200ng pCMV-TALER1质粒、50ng pT1+T1+质粒和30ng pEF1a-TagBFP-2A质粒)，转染48小时后进行流式细胞术分析，检测EYFP的荧光强度、mKate2的荧光强度和TagBFP的荧光强度。设置不加入pCMV-TALER1质粒的对照处理。
结果见图4(图4中的101直至10-2.5代表mKate2的荧光强度/TagBFP的荧光强度)和表2。被测试的所有TALER蛋白对其相应的靶点之间的启动子都表现出较强的抑制作用而对其他靶点之间的启动子的影响不大。比如，TALER1蛋白、TALER9蛋白、TALER10蛋白、TALER12蛋白、TALER14蛋白和TALER21蛋白，对它们相应靶点之间的启动子和其他靶点之间启动子相比，抑制倍数强100倍以上。
表2 图4的结果(mKate2的荧光强度/TagBFP的荧光强度)
实施例2、进一步延展性研究
pEF1a-TagBFP-2A质粒即实施例1中的pEF1a-TagBFP-2A质粒。
pCMV-TALER1质粒即实施例1中的pCMV-TALER1质粒。
pCMV-TALER2质粒即实施例1中的pCMV-TALER2质粒。
pCMV-TALER4质粒即实施例1中的pCMV-TALER4质粒。
pCMV-TALER5质粒即实施例1中的pCMV-TALER5质粒。
pCMV-TALER32质粒即实施例1中的pCMV-TALER32质粒。
pT1+T1+72-DsRed质粒如序列54所示。序列54中，自5’末端第2441-2533位核苷酸为5×UAS序列，第2549-2562位核苷酸为T1序列(TALER1蛋白的靶点序列)，第2569-2628位核苷酸为CMVmini启动子，第2635-2648位核苷酸为T1序列，第2668-3345位核苷酸为DsRed(红色荧光蛋白)的编码基因。
pT1+T2+72-DsRed质粒如序列55所示。序列55中，自5’末端第2441-2533位核苷酸为5×UAS序列，第2549-2562位核苷酸为T1序列，第2569-2628位核苷酸为CMVmini启动子，第2635-2648位核苷酸为T2序列(TALER2蛋白的靶点序列)，第2668-3345位核苷酸为DsRed的编码基因。
pT2+T1+72-DsRed质粒如序列56所示。序列56中，自5’末端第2441-2533位核苷酸为5×UAS序列，第2549-2562位核苷酸为T2序列，第2569-2628位核苷酸为CMVmini启动子，第2635-2648位核苷酸为T1序列，第2668-3345位核苷酸为DsRed的编码基因。
pT2+T2+72-DsRed质粒如序列57所示。序列57中，自5’末端第2441-2533位核苷酸为5×UAS序列，第2549-2562位核苷酸为T2序列，第2569-2628位核苷酸为CMVmini启动子，第2635-2648位核苷酸为T2序列，第2668-3345位核苷酸为DsRed的编码基因。
pT1+T1+72-mKate2质粒如序列58所示。序列58中，自5’末端第4275-4367位核苷酸为5×UAS序列，第4383-4396位核苷酸为T1序列，第4403-4462位核苷酸为CMVmini启动子，第4469-4482位核苷酸为T1序列，第4532-5237位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT1+T1+78-mKate2质粒如序列59所示。序列59中，自5’末端第7161-7253位核苷酸为5×UAS序列，第7269-7282位核苷酸为T1序列，第6-65位核苷酸为CMVmini启动子，第78-91位核苷酸为T1序列，第170-888位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT1+T1+83-mKate2质粒如序列60所示。序列60中，自5’末端第7166-7258位核苷酸为5×UAS序列，第7274-7287位核苷酸为T1序列，第6-65位核苷酸为CMVmini启动子，第83-96位核苷酸为T1序列，第175-893位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT1+T1+89-mKate2质粒如序列61所示。序列61中，自5’末端第7172-7264位核苷酸为5×UAS序列，第7280-7293位核苷酸为T1序列，第6-65位核苷酸为CMVmini启动子，第89-102位核苷酸为T1序列，第181-899位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT1+T1+94-mKate2质粒如序列62所示。序列62中，自5’末端第7177-7269位核苷酸为5×UAS序列，第7285-7298位核苷酸为T1序列，第6-65位核苷酸为CMVmini启动子，第94-107位核苷酸为T1序列，第186-904位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT1+T1+100-mKate2质粒如序列63所示。序列63中，自5’末端第7203-7295位核苷酸为5×UAS序列，第6-19位核苷酸为T1序列，第26-85位核苷酸为CMVmini启动子，第120-133位核苷酸为T1序列，第212-930位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT2+T2+72-mKate2质粒如序列64所示。序列64中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-190位核苷酸为T2序列，第197-256位核苷酸为CMVmini启动子，第263-276位核苷酸为T2序列，第355-1073位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT2+T2x3+72-mKate2质粒如序列65所示。序列65中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-190位核苷酸为T2序列，第197-256位核苷酸为CMVmini启动子，第263-276位核苷酸为T2序列，第279-292位核苷酸为T2序列，第295-308位核苷酸为T2序列，第388-1106位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT4+T4+72-mKate2质粒如序列66所示。序列66中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-190位核苷酸为T4序列(TALER4蛋白的靶点序列)，第197-256位核苷酸为CMVmini启动子，第263-276位核苷酸为T4序列，第355-1073位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT4+T4x3+72-mKate2质粒如序列67所示。序列67中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-190位核苷酸为T4序列，第197-256位核苷酸为CMVmini启动子，第263-276位核苷酸为T4序列，第277-290位核苷酸为T4序列，第291-304位核苷酸为T4序列，第383-1101位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT5+T5+72-mKate2质粒如序列68所示。序列68中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-194位核苷酸为T5序列(TALER5蛋白的靶点序列)，第201-260位核苷酸为CMVmini启动子，第267-284位核苷酸为T5序列，第363-1081位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT5+T5x3+72-mKate2质粒如序列69所示。序列69中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-194位核苷酸为T5序列，第201-260位核苷酸为CMVmini启动子，第267-284位核苷酸为T5序列，第285-302位核苷酸为T5序列，第303-320位核苷酸为T5序列，第399-1117位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT32+T32+72-mKate2质粒如序列70所示。序列70中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-190位核苷酸为T32序列(TALER32蛋白的靶点序列)，第197-256位核苷酸为CMVmini启动子，第263-276位核苷酸为T32序列，第355-1073位核苷酸为mKate2的编码基因。
pT32+T32x3+72-mKate2如序列71所示。序列71中，自5’末端第69-161位核苷酸为5×UAS序列，第177-190位核苷酸为T32序列，第197-256位核苷酸为CMVmini启动子，第263-276位核苷酸为T32序列，第277-290位核苷酸为T32序列，第291-304位核苷酸为T32序列，第383-1101位核苷酸为mKate2的编码基因。
一、实验一
将pCMV-TALER1质粒、pT1+T1+72-DsRed质粒和pEF1a-TagBFP-2A质粒共转染HEK293细胞(每孔转染200ng pCMV-TALER1质粒、50ng pT1+T1+72-DsRed质粒和30ngpEF1a-TagBFP-2A质粒)，转染48小时后进行流式细胞术分析，检测EYFP的荧光强度、DsRed的荧光强度和TagBFP的荧光强度。设置不加入pCMV-TALER1质粒的对照处理。
分别用pT1+T2+72-DsRed质粒、pT2+T1+72-DsRed质粒或pT2+T2+72-DsRed质粒代替pT1+T1+72-DsRed质粒进行上述步骤。
抑制倍数结果和抑制百分比结果见图5和表3。结果表明，TALER蛋白的3’结合位点对于强的抑制能力所必需的，而5'结合位点的抑制效果要弱得多，当两个结合位点都存在时有更强的抑制效果。
表3 抑制倍数结果和抑制百分比结果
二、实验二
将pCMV-TALER1质粒、pT1+T1+72-mKate2质粒和pEF1a-TagBFP-2A质粒共转染HEK293细胞(每孔转染200ng pCMV-TALER1质粒、50ng pT1+T1+72-mKate2质粒和30ngpEF1a-TagBFP-2A质粒)，转染48小时后进行流式细胞术分析，检测EYFP的荧光强度、mKate2的荧光强度和TagBFP的荧光强度。设置不加入pCMV-TALER1质粒的对照处理。
分别用pT1+T1+78-mKate2质粒、pT1+T1+83-mKate2质粒、pT1+T1+89-mKate2质粒、pT1+T1+94-mKate2质粒或pT1+T1+100-mKate2质粒代替pT1+T1+72-mKate2质粒进行上述步骤。
抑制倍数结果和抑制百分比结果见图6和表4。TALER蛋白没有周期性的抑制行为，当TALER结合位点越接近miniCMV启动子时有越强的抑制效果。
表4 抑制倍数结果和抑制百分比结果
三、实验三
将pCMV-TALER2质粒、pT2+T2+72-mKate2质粒(或T2+T2x3+72-mKate2质粒)和pEF1a-TagBFP-2A质粒共转染HEK293细胞(每孔转染200ng pCMV-TALER2质粒、50ngpT2+T2+72-mKate2质粒或T2+T2x3+72-mKate2质粒、30ng pEF1a-TagBFP-2A质粒)，转染48小时后进行流式细胞术分析，检测EYFP的荧光强度、mKate2的荧光强度和TagBFP的荧光强度。设置不加入pCMV-TALER2质粒的对照处理。
分别用pCMV-TALER4质粒代替pCMV-TALER2质粒、用pT4+T4+72-mKate2质粒代替pT2+T2+72-mKate2质粒(或用pT4+T4x3+72-mKate2质粒代替T2+T2x3+72-mKate2质粒)进行上述步骤。
分别用pCMV-TALER5质粒代替pCMV-TALER2质粒、用pT5+T5+72-mKate2质粒代替pT2+T2+72-mKate2质粒(或用pT5+T5x3+72-mKate2质粒代替T2+T2x3+72-mKate2质粒)进行上述步骤。
分别用pCMV-TALER32质粒代替pCMV-TALER2质粒、用pT32+T32+72-mKate2质粒代替pT2+T2+72-mKate2质粒(或用pT32+T32x3+72-mKate2质粒代替T2+T2x3+72-mKate2质粒)进行上述步骤。
抑制倍数结果和抑制百分比结果见图7和表5。与在miniCMV启动子下游具有1个靶点相比，在miniCMV启动子下游具有3个靶点时，TALER蛋白表现出更强的抑制效果。在一些高效的TALER中，额外的结合位点出乎意料的导致了抑制效果的轻微减弱。发明人注意到，抑制能力强的TALER蛋白被额外的结合位点所带来的额外的抑制能力显著的低，但启动子的本底表达也会因miniCMV启动子和报告基因之间的插入序列而降低。这些结果表明，可通过平衡启动子的本底表达水平和TALER对miniCMV启动子的抑制能力来优化转录抑制能力。
表5 抑制倍数结果和抑制百分比结果
四、实验四
合成序列表的序列72所示的质粒。序列72中，自5’末端第4766-5033位核苷酸为强力霉素反应元件TRE(其中第4766-4961位核苷酸为tetO，第4976-5033位核苷酸为CMVmini启动子)，第5113-8250位核苷酸为TALER14蛋白的编码基因，第9306-9549位核苷酸为cHS4core，第9625-9868位核苷酸为cHS4core，第9987-10079位核苷酸为5×UAS序列，第10095-10111位核苷酸为T14序列(TALER14蛋白的靶点序列)，第10118-10177位核苷酸为CMVmini启动子，第10184-10200位核苷酸为T14序列，第10201-10217位核苷酸为T14序列，第10218-10234位核苷酸为T14序列，第10313-11031位核苷酸为mKate2的编码基因，第11979-12222位核苷酸为cHS4core，第12298-12541位核苷酸为cHS4core，第12658-12925位核苷酸为强力霉素反应元件TRE(其中第112658-12853位核苷酸为tetO，第12868-12925位核苷酸为CMVmini启动子)，第12982-13701位核苷酸为EYFP的编码基因，第14612-14855位核苷酸为cHS4core，第14931-15174位核苷酸为cHS4core，第15292-16465位核苷酸为pEF1a(启动子)，第16539-17219位核苷酸为Gal4/vp16的编码基因，第17220-17285位核苷酸为2A连接肽的编码基因，第17292-17996位核苷酸为rtTA的编码基因。序列72所示的质粒的元件示意图见图8A。
将序列72所示的质粒导入HEK293细胞，得到重组细胞。在没有强力霉素(DOX)存在时，在pEF1a作用下Gal4/vp16和rtTA被表达，Gal4/vp16结合到5×UAS序列上，从而激活CMVmini启动子的转录起始，mKate2被表达。加入强力霉素后，强力霉素与和rtTA结合，激活强力霉素反应元件TRE，TALER14蛋白和EYFP被表达，TALER14蛋白结合T14序列，通过空间位阻发挥转录抑制作用，T14序列之间的CMVmini启动子失活，从而mKate2被抑制表达。用EYFP的表达水平来估计TALER14蛋白在Dox诱导下的表达，而mKate2的表达水平水平变化反映了TALER14对两个T14序列之间的CMVmini启动子的抑制作用。
先在有Dox的环境中培养重组细胞，直至mKate2表达被最大限度抑制，然后换成不含Dox的培养基。在去除Dox3天后，EYFP表达水平下降到最大值的16％，而mKate2表达水平几乎恢复到无Dox诱导的对照组的水平。接着在第8天加入Dox诱导，使得mKate2表达水平再次被抑制，第16天再次换成不含Dox的培养基，仍然可以恢复mKate2表达水平。具体结果见图8B和图8C。以上结果表明，TALER蛋白可以实现快速、可逆的转录抑制功能。
序列1、pCMV-TALER1质粒，7657bp，DNA5'→3'
序列2、pCMV-TALER2质粒，7657bp，DNA5'→3'
序列3、pCMV-TALER4质粒，7674bp，DNA5'→3'
序列4、pCMV-TALER5质粒，8082bp，DNA5'→3'
序列5、pCMV-TALER9质粒，8388bp，DNA5'→3'
序列6、pCMV-TALER10质粒，8286bp，DNA5'→3'
序列7、pCMV-TALER11质粒，8286bp，DNA5'→3'
序列8、pCMV-TALER12质粒，8082bp，DNA5'→3'
序列9、pCMV-TALER13质粒，7980bp，DNA5'→3'
序列10、pCMV-TALER14质粒，7980bp，DNA5'→3'
序列11、pCMV-TALER15质粒，8035bp，DNA5'→3'
序列12、pCMV-TALER16质粒，8035bp，DNA5'→3'
序列13、pCMV-TALER17质粒，8035bp，DNA5'→3'
序列14、pCMV-TALER18质粒，8035bp，DNA5'→3'
序列15、pCMV-TALER19质粒，8184bp，DNA5'→3'
序列16、pCMV-TALER20质粒，8035bp，DNA5'→3'
序列17、pCMV-TALER21质粒，8184bp，DNA5'→3'
序列18、pCMV-TALER22质粒，7423bp，DNA5'→3'
序列19、pCMV-TALER23质粒，7423bp，DNA5'→3'
序列20、pCMV-TALER24质粒，7423bp，DNA5'→3'
序列21、pCMV-TALER26质粒，7788bp，DNA5'→3'
序列22、pCMV-TALER29质粒，7380bp，DNA5'→3'
序列23、pCMV-TALER30质粒，7380bp，DNA5'→3'
序列24、pCMV-TALER31质粒，7380bp，DNA5'→3'
序列25、pCMV-TALER32质粒，7380bp，DNA5'→3'
序列26、pCMV-TALER35质粒，7380bp，DNA5'→3'
序列27、pT1+T1+质粒，7370bp，DNA5'→3'
序列28、pT2+T2+质粒，7277bp，DNA5'→3'
序列29、pT4+T4+质粒，7277bp，DNA5'→3'
序列30、pT5+T5+质粒，7285bp，DNA5'→3'
序列31、pT9+T9+质粒，7291bp，DNA5'→3'
序列32、pT10+T10+质粒，7289bp，DNA5'→3'
序列33、pT11+T11+质粒，7289bp，DNA5'→3'
序列34、pT12+T12+质粒，7285bp，DNA5'→3'
序列35、pT13+T13+质粒，7283bp，DNA5'→3'
序列36、pT14+T14+质粒，7283bp，DNA5'→3'
序列37、pT15+T15+质粒，7299bp，DNA5'→3'
序列38、pT16+T16+质粒，7299bp，DNA5'→3'
序列39、pT17+T17+质粒，7299bp，DNA5'→3'
序列40、pT18+T18+质粒，7299bp，DNA5'→3'
序列41、pT19+T19+质粒，7287bp，DNA5'→3'
序列42、pT20+T20+质粒，7299bp，DNA5'→3'
序列43、pT21+T21+质粒，7287bp，DNA5'→3'
序列44、pT22+T22+质粒，7287bp，DNA5'→3'
序列45、pT23+T23+质粒，7287bp，DNA5'→3'
序列46、pT24+T24+质粒，7287bp，DNA5'→3'
序列47、pT26+T26+质粒，7285bp，DNA5'→3'
序列48、pT29+T29+质粒，7277bp，DNA5'→3'
序列49、pT30+T30+质粒，7277bp，DNA5'→3'
序列50、pT31+T31+质粒，7275bp，DNA5'→3'
序列51、pT32+T32+质粒，7277bp，DNA5'→3'
序列52、pT35+T35+质粒，7277bp，DNA5'→3'
序列53、pEF1a-TagBFP-2A质粒，9066bp，DNA5'→3'
序列54、pT1+T1+72-DsRed质粒，3727bp，DNA5'→3'
序列55、pT1+T2+72-DsRed质粒，3727bp，DNA5'→3'
序列56、pT2+T1+72-DsRed质粒，3727bp，DNA5'→3'
序列57、pT2+T2+72-DsRed质粒，3727bp，DNA5'→3'
序列58、pT1+T1+72-mKate2质粒，7370bp，DNA5'→3'
序列59、pT1+T1+78-mKate2质粒，7283bp，DNA5'→3'
序列60、pT1+T1+83-mKate2质粒，7288bp，DNA5'→3'
序列61、pT1+T1+89-mKate2质粒，7294bp，DNA5'→3'
序列62、pT1+T1+94-mKate2质粒，7299bp，DNA5'→3'
序列63、pT1+T1+100-mKate2质粒，7305bp，DNA5'→3'
序列64、pT2+T2+72-mKate2质粒，7277bp，DNA5'→3'
序列65、pT2+T2x3+72-mKate2质粒，7310bp，DNA5'→3'
序列66、pT4+T4+72-mKate2质粒，7277bp，DNA5'→3'
序列67、pT4+T4x3+72-mKate2质粒，7305bp，DNA5'→3'
序列68、pT5+T5+72-mKate2质粒，7285bp，DNA5'→3'
序列69、pT5+T5x3+72-mKate2质粒，7321bp，DNA5'→3'
序列70、pT32+T32+72-mKate2质粒，7277bp，DNA5'→3'
序列71、pT32+T32x3+72-mKate2质粒，7305bp，DNA5'→3'
序列72、
Claims (13)
1.TALER蛋白在使目的启动子失活中的应用；所述目的启动子的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白的靶点，或，所述目的启动子的上游不具有所述TALER蛋白的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白的靶点。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述目的启动子的上游具有1个所述TALER蛋白的靶点且其下游具有1-3个所述TALER蛋白的靶点。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述目的启动子上游的TALER蛋白的靶点与所述目的启动子下游最邻近的TALER蛋白的靶点之间的距离为72-100bp。
4.TALER蛋白在使目的蛋白的编码基因失活中的应用；所述目的蛋白的编码基因由目的启动子启动表达；所述目的启动子的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白的靶点，或，所述目的启动子的上游不具有所述TALER蛋白的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白的靶点。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述目的启动子的上游具有1个所述TALER蛋白的靶点且其下游具有1-3个所述TALER蛋白的靶点。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述目的启动子上游的TALER蛋白的靶点与所述目的启动子下游最邻近的TALER蛋白的靶点之间的距离为72-100bp。
7.TALER蛋白在使目的功能片段失活中的应用；所述目的功能片段为DNA片段；所述目的功能片段的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白的靶点，或，所述目的功能片段的上游不具有所述TALER蛋白的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白的靶点。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述目的功能片段的上游具有1个所述TALER蛋白的靶点且其下游具有1-3个所述TALER蛋白的靶点。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述目的功能片段上游的TALER蛋白的靶点与所述目的功能片段下游最邻近的TALER蛋白的靶点之间的距离为72-100bp。
10.一种DNA分子组合，包括DNA分子甲、DNA分子乙和DNA分子丙；所述DNA分子甲自上游至下游依次包括启动子和Gal4/vp16的编码基因；所述DNA分子乙自上游至下游依次包括如下元件：5×UAS序列、TALER蛋白的靶点、CMVmini启动子、1-3个所述TALER蛋白的靶点和目的蛋白的编码基因；所述DNA分子丙自上游至下游依次包括启动子和所述TALER蛋白的编码基因。
11.一种质粒组合，包括质粒甲、质粒乙和质粒丙；所述质粒甲具有权利要求10所述的DNA分子甲；所述质粒乙具有权利要求10所述的DNA分子乙；所述质粒丙具有权利要求10所述的DNA分子丙。
12.一种调控目的蛋白表达的方法，包括如下步骤：通过将权利要求10中所述DNA分子甲和权利要求10中所述DNA分子乙转染宿主细胞，从而使得所述目的蛋白表达；通过在转染权利要求10中所述DNA分子甲和权利要求10中所述DNA分子乙的细胞中转染权利要求10中所述DNA分子丙，从而抑制所述目的蛋白表达。
13.一种调控目的蛋白表达的方法，包括如下步骤：通过将权利要求11中所述质粒甲和权利要求11中所述质粒乙转染宿主细胞，从而使得所述目的蛋白表达；通过在转染权利要求11中所述的质粒甲和权利要求11中所述的质粒乙的细胞中转染权利要求11中所述的质粒丙，从而抑制所述目的蛋白表达。
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| WO2018165504A1 (en) | 2017-03-09 | 2018-09-13 | President And Fellows Of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
| US11542496B2 (en) | 2017-03-10 | 2023-01-03 | President And Fellows Of Harvard College | Cytosine to guanine base editor |
| GB2575930A (en) | 2017-03-23 | 2020-01-29 | Harvard College | Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable DNA binding proteins |
| JP6961788B2 (ja) * | 2017-03-24 | 2021-11-05 | ツィンファ ユニバーシティ | プログラム可能な腫瘍溶解性ウイルスワクチン系及びその適用 |
| US11560566B2 (en) | 2017-05-12 | 2023-01-24 | President And Fellows Of Harvard College | Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation |
| JP2020534795A (ja) | 2017-07-28 | 2020-12-03 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | ファージによって支援される連続的進化（ｐａｃｅ）を用いて塩基編集因子を進化させるための方法および組成物 |
| EP3676376A2 (en) | 2017-08-30 | 2020-07-08 | President and Fellows of Harvard College | High efficiency base editors comprising gam |
| WO2019079347A1 (en) | 2017-10-16 | 2019-04-25 | The Broad Institute, Inc. | USES OF BASIC EDITORS ADENOSINE |
| CN108424934A (zh) * | 2018-04-16 | 2018-08-21 | 和元生物技术（上海）股份有限公司 | 一种慢病毒cag-cmv双启动子改造载体构建及应用 |
| WO2020191249A1 (en) | 2019-03-19 | 2020-09-24 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for editing nucleotide sequences |
| MX2022014008A (es) | 2020-05-08 | 2023-02-09 | Broad Inst Inc | Métodos y composiciones para la edición simultánea de ambas cadenas de una secuencia de nucleótidos de doble cadena objetivo. |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102558309A (zh) * | 2012-02-10 | 2012-07-11 | 浙江大学 | 一对转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因与应用 |
| CN103184202A (zh) * | 2011-12-28 | 2013-07-03 | 浙江大学 | 一对短肽、蛋白质和多核苷酸、其宿主细胞及其应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2206723A1 (en) * | 2009-01-12 | 2010-07-14 | Bonas, Ulla | Modular DNA-binding domains |
| CN104178506B (zh) * | 2014-04-30 | 2017-03-01 | 清华大学 | Taler蛋白通过空间位阻发挥转录抑制作用及其应用 |
-
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- 2015-03-06 WO PCT/CN2015/000138 patent/WO2015165274A1/zh active Application Filing
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2016
- 2016-05-09 TW TW105114331A patent/TW201723168A/zh unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103184202A (zh) * | 2011-12-28 | 2013-07-03 | 浙江大学 | 一对短肽、蛋白质和多核苷酸、其宿主细胞及其应用 |
| CN102558309A (zh) * | 2012-02-10 | 2012-07-11 | 浙江大学 | 一对转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因与应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 类转录激活因子效应物核酸酶（TALENs）的构建及其在基因组定点修饰中的应用;周金伟等;《中国细胞生物学学报》;20131231;第35卷(第11期);1672-1680 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2015165274A1 (zh) | 2015-11-05 |
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| TW201723168A (zh) | 2017-07-01 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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