JP6961788B2 - プログラム可能な腫瘍溶解性ウイルスワクチン系及びその適用 - Google Patents

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Description

優先権情報
本出願は、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる、２０１７年３月２４日に中国国家知的財産局に提出された特許出願第２０１７１０１８４７３６．２号の優先権及び利益を主張するものである。
本開示は、生物医学の分野に関する。特に、本開示は、発現系及びその使用に関し、より詳細には、発現系、組換えウイルス、組換え細胞、及び医薬の調製における前記遺伝子発現系、前記組換えウイルス、及び前記組換え細胞の使用に関する。更に、本開示は、前記発現系を使用することにより目的のタンパク質を発現させる方法にも関する。
腫瘍溶解性ウイルスとは、腫瘍の死滅を達成するために複製及びパッケージングの能力を有するウイルスの一種を指す。現在、殆どの研究は、工学的改変後の幾つかの自然に発生する弱毒化ウイルスが、腫瘍細胞内で特異的に発現及びパッケージされ、それによって腫瘍溶解性効果を実現できることを示してきた。腫瘍溶解性ウイルスを介して、腫瘍細胞を認識するには、２つの主要な原則がある。第一に、腫瘍溶解性ウイルスは、標的細胞の腫瘍抑制遺伝子の不活性化又は欠陥により、腫瘍細胞に選択的に感染する。第二に、腫瘍特異的プロモーターが選択され、腫瘍溶解性ウイルスの鍵遺伝子の発現を調節し、それによって、腫瘍溶解性ウイルスが大量に複製し、腫瘍細胞中で毒性タンパク質を発現して、腫瘍細胞を破壊する、及び／又は同時にサイトカインを分泌して自己免疫系を刺激し、腫瘍細胞を攻撃する。対応する腫瘍溶解性ウイルスは、生体の正常な細胞では複製できないため、殺傷能力を持たず、それによって腫瘍溶解性ウイルスは高い抗腫瘍効果と低い副作用を有する。ここ数十年で、腫瘍溶解性ウイルス処置は、広範な注目を集めており、関連する研究は大きな進歩を遂げている。現在、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス−１型（ＨＳＶ−１）、ニューカッスル病ウイルスなどは、腫瘍溶解性ウイルスに設計されている。２００６年、腫瘍溶解性アデノウイルス製品（Ｇｅｎｄｉｃｉｎｅ及びＯｎｃｏｒｉｎｅ）は、主に頭頸部癌、副鼻腔癌などの治療のために、中国の臨床治療で使用されてきた。Ｇｅｎｄｉｃｉｎｅ及びＯｎｃｏｒｉｎｅには同様のメカニズムを有する。即ち、ヒトタイプ−５アデノウイルスのＥ１Ｂ−５５ｋＤ領域を削除し、ヒトタイプ−５アデノウイルスがｐ５３遺伝子変異癌細胞で増殖し、腫瘍細胞を殺し、それによって治療上の腫瘍溶解性効果を生成することができる。しかしながら、臨床データは、単一のｐ５３遺伝子変異に基づくこれら２つの腫瘍溶解性アデノウイルスの治療上の効果は理想的ではないことを示す。更に、米国のバイオ治療会社ＪｅｎｎｅｒｅｘのＪＸ−５９４は、遺伝子組み換えワクシニアウイルスである。原発性肝癌患者は、２０１３年に完了した第ＩＩ相臨床試験における低用量注射後の寿命の６．７か月と比較すると、遺伝子組み換えワクシニアウイルスの高用量注射後において１４．１か月に達する延長された寿命の中央値を有することが示されている。更に、バイオテクノロジー企業ＢｉｏＶｅｘによって開発された遺伝子組み換え単純ヘルペスウイルスＯｎｃｏＶＥＸ ＧＭ−ＣＳＦは、２０１５年１０月にＦＤＡによって承認された米国及びヨーロッパで最初の腫瘍溶解性ウイルス製品であり、ＧＭ−ＣＳＦを発現及び分泌して、体内で体系的な免疫応答の生成を開始し、残留腫瘍細胞とその転移部位を殺しながら、腫瘍細胞を選択的に殺すことができる。２００９年にＢｉｏＶｅｘによって発表された第ＩＩ相試験での転移性メラノーマの臨床結果は、５０人の患者の２６％が処置後に改善を示し、８人の患者が完全に回復したことを示す。第ＩＩＩ相臨床試験の研究を促進するために、２０１１年にＢｉｏＶｅｘ社を１０億ドルで買収したＡｍｇｅｎは、２０１３年３月にＯｎｃｏＶＥＸの有効性データを発表し、薬剤ＯｎｃｏＶＥＸが進行患者の腫瘍サイズを首尾よく減少させることができ、４００人超の患者が関わった第ＩＩＩ相臨床試験において、他の類似の薬剤よりも強力な効果を示すことを実証した。
腫瘍溶解性ウイルスは、実際、上記の研究結果に基づいて腫瘍の治療に有効性を示すが、まだ幾つかの欠陥が存在する。
現在、Ａｄｌ〜Ａｄ５２と名付けられた５２個の公知のヒトアデノウイルスがあり、Ａｄ２が最も一般的である。アデノウイルスの転写パターンには非常に明確な特徴があり、アデノウイルスゲノムには少なくとも５つの公知の転写ユニットがあり、それらは、細胞形質転換に関与し、アデノウイルスゲノムの左側に位置され、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂに細分化されることができるＥ１領域と、ＤＮＡ結合タンパク質をコードし、ウイルス複製に関与するＥ２領域と、宿主細胞の表面に現れる糖タンパク質をコードするＥ３領域と、Ａｄ２ゲノムの右端に位置され、Ｅ２領域によってコードされるＤＮＡ結合タンパク質によって調節されるＥ４領域と、ウイルス感染の中期でＡｄ２タンパク質ＩＶを合成する５番目の転写ユニットと、を含む。アデノウイルスゲノムが細胞核に入ると、細胞転写因子は、最初にＥ１Ａ領域のエンハンサー上流に結合し、Ｅ１Ａタンパク質を発現し、細胞代謝を調節し、ウイルスＤＮＡが細胞内で容易に複製されることを可能にし、他の初期遺伝子（Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、及びＥ４）のプロモーターを活性化し、Ｅ２Ｂはウイルス複製に関与する初期遺伝子の３つの追加の転写ユニット（即ち、前駆体末端タンパク質（ｐＴＰ）、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ｓｓＤＢＰ）、及びＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡ ｐｏｌ））の発現を駆動させ、これらの３つの遺伝子発現産物は、複合体にしっかりと結合し、少なくとも３つの細胞タンパク質と相互作用してウイルスゲノムの複製を開始する。アデノウイルスのゲノム及び転写パターンの分析に従って、以下の工学的戦略：標的細胞におけるアデノウイルスの複製とパッケージングを調節するためのＥ１Ａ発現を調節することと；ウイルスのパッケージングに関連する幾つかの非必須遺伝子を除去して、非標的細胞に対するウイルスの毒性を低減しながら、ウイルスのパッケージング容量を増加させることと（Ｅ３、Ｅ４など）；アデノウイルスのコートタンパク質を置換し、それによって特定の細胞及び組織へのアデノウイルスのターゲティングを変更することと、を立てることができる。
しかしながら、腫瘍溶解性アデノウイルスの既存の研究結果は、単調性、特異性の低さ、安全性の低さなどの現在の調節系の欠陥、並びにアデノウイルスを操作する方法の扱いにくさがあることを示す。したがって、腫瘍溶解性アデノウイルスの設計と構築の側面で早急に解決するには、より厳密で安全な調節系を設計する方法と、腫瘍溶解性アデノウイルスのアセンブリを迅速且つ効果的な方法で実現する方法が必要とされる。
本開示は、前述の技術的問題の幾つかを少なくともある程度解決することを目的とする。
発明者の研究室での研究成果に基づいて、本発明者らは、アデノウイルス調節に適し、異なる微小環境に反応する遺伝子回路を設計及び構築した。この遺伝子回路において、本発明者らは、複数レベルのバイオマーカーを使用する。具体的には、第１に、特異的プロモーターを、遺伝子回路を調節するためのマスタースイッチとして使用する。即ち、特異的プロモーターを使用してマスターアクチベーターの発現を調節し、アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子の発現を更に調節する。第２に、ｍｉｃｒｏＲＮＡ標的配列は、異なる微小環境下でのｍｉｃｒｏＲＮＡの発現特性に応答するために使用され、遺伝子回路を調節するための第２のスイッチとして機能する。第３に、閉ループ遺伝子回路を使用して相互抑制スイッチを構築し、そのような相互抑制閉ループスイッチは、リーク（ｌｅａｋａｇｅ）を効果的に回避しながら、微小環境の変化に対してより効果的に抑制応答することができる。第４に、Ｅ１Ｂ遺伝子が除去されるので、それによって操作されたアデノウイルスは、Ｅ１Ｂ遺伝子が存在しないため、正常細胞からＰ５３欠損腫瘍細胞を区別する改善された能力を有する。第５に、Ｅ３遺伝子が除去されるため、正常細胞における腫瘍溶解性アデノウイルスの毒性が減少し、一方でアデノウイルスベクターのパッケージング容量が増加する。
一般に、タイプ２及びタイプ５のヒトアデノウイルスのゲノム長は３６Ｋｂｐであるため、切断、ライゲーションなどの従来のプラスミド構築方法を用いてアデノウイルスを遺伝的に改変することは非常に難しく、時間がかかる。この問題を解決するために、本発明者らは、本遺伝子回路により構築されるアデノウイルスを迅速に構築する方法を設計し、前記方法は、以下の３つの工程を含む。第一の工程では、一次エレメントライブラリーが構築され、必要なコンポーネントが対応するプラスミドに構築される。そのような一次エレメントライブラリーは、３つの遺伝子部分を含み、前記３つの遺伝子部分は、遺伝子回路の一方の側における抑制コンポーネント、アデノウイルスのＥ１Ａ遺伝子、及びアデノウイルスＥ１Ａ遺伝子と同時発現されるとエフェクター遺伝子（免疫性因子遺伝子又はキラー遺伝子など）を主に発現する抑制エレメントライブラリーＡと；遺伝子回路の他方の側で抑制遺伝子を主に発現し、遺伝子回路の効果的な反転を調節し、スイッチの安全性を高めるように構成された抑制エレメントライブラリーＢと；組織又は腫瘍特異的プロモーターを介して遺伝子回路の下流遺伝子を調節するマスタースイッチである特異的プロモーターライブラリーと、を含む。第２の工程では、発現されるエフェクターとバイオマーカーを決定した後、一次エレメントライブラリーから選択された対応するプラスミドは、ゴールデンゲート（Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ）法により遺伝子回路に迅速にアセンブルされる。第３の工程では、操作されたアデノウイルスベクターに遺伝子回路をローディングする（アデノウイルスの人為的調節を容易にするためのＥ１遺伝子の除去、及びパッケージング容量を拡大するためのＥ３配列の除去）。
複数の遺伝子を有すると同時に発現させることは、腫瘍溶解性アデノウイルスの他の注目すべき特徴である。本開示では、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、抗−ＰＤ−１ ｓｃＦｖ、抗−ＰＤ−Ｌ１ ｓｃＦｖ、及びこれらの遺伝子間の融合タンパク質などの１つ以上の細胞性免疫関連遺伝子が、本発明者らの開示による溶解性アデノウイルスによって同時に発現される。腫瘍溶解性アデノウイルスは、腫瘍細胞を攻撃すると体系的な免疫反応を引き起こすが、免疫関連遺伝子の存在により免疫過剰反応を引き起こすリスクを有する。したがって、腫瘍溶解性ウイルスの治療効果は、運ばれる免疫関連遺伝子、対応する投与用量、及び投与経路に強く影響される。本開示において、本発明者らは、バイオインフォマティクス法により標的細胞に対するアデノウイルスの感染プロセスをモデル化することを試み、腫瘍溶解性アデノウイルスの有効性を改善するために、腫瘍細胞を殺す際の腫瘍溶解性アデノウイルスの特性を可能な限り研究した。
第１の態様においては、実施形態における本開示は発現系を提供する。本開示の実施形態によれば、前記発現系は、細胞特異的プロモーターを組み込む第１の核酸分子と；前記第１の核酸分子に機能可能に結合され、転写アクチベーターをコードする第２の核酸分子と；前記転写アクチベーターの第１の認識配列を組み込む第３の核酸分子と；前記第３の核酸分子に機能可能に結合され、第１のプロモーター及び第１の調節エレメントを組み込む第４の核酸分子と；前記第４の核酸分子に機能可能に結合され、第１の調節タンパク質をコードする第５の核酸分子と；前記転写アクチベーターの第２の認識配列を組み込む第６の核酸分子と；前記第６の核酸分子に機能可能に結合され、第２のプロモーター及び第２の調節エレメントを組み込む第７の核酸分子と；前記第７の核酸分子に機能可能に結合され、第２の調節タンパク質をコードする第８の核酸分子と；前記第５の核酸分子に機能可能に結合され、前記第１の調節タンパク質の発現を条件付きで阻害するように構成される第９の核酸分子、及び前記第８の核酸分子に機能可能に結合され、前記第２の調節タンパク質の発現を条件付きで阻害するように構成される第１０の核酸分子からなる群から選択される少なくとも１つと、を含み、前記第１の調節エレメントは、前記第２の調節タンパク質に結合することによって前記第１のプロモーターの機能を阻害するようにされ、前記第２の調節エレメントは、前記第１の調節タンパク質に結合することによって前記第２のプロモーターの機能を阻害するようにされる。強力な制御、高い効率、及び特異性を有する本開示の実施形態に係る前記発現系を用いて、特定の細胞環境下で目的の遺伝子を特異的に発現させながら、相互抑制方式によって調節されることができる。
本開示の実施形態においては、前記発現系は、下記に記載される追加の技術的特徴の少なくとも1つを更に含むことができる。
本開示の実施形態においては、前記細胞特異的プロモーターは、腫瘍細胞特異的プロモーターである。前記腫瘍細胞特異的プロモーターは、αフェトプロテイン特異的プロモーター、サバイビンプロモーター、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素遺伝子プロモーター、コレシストキニンＡ受容体遺伝子プロモーター、癌胎児抗原プロモーター、癌原遺伝子ヒト上皮成長因子受容体２プロモーター、プロスタグランジンエンドキシゲナーゼ（ｅｎｄｏｘｙｇｅｎａｓｅ）還元酵素２プロモーター、ケモカイン受容体−４、Ｅ２Ｆ−１遺伝子プロモーター、ムチンプロモーター、前立腺特異抗原、ヒトチロシナーゼ関連タンパク質１、及びチロシナーゼプロモーターからなる群から選択される少なくとも１つである。実施形態における前記発現系は、上記に記載される腫瘍細胞特異的プロモーターの制御下で特定の腫瘍細胞の微小環境で開始され、それによって調節及び遺伝子発現の特異性を更に高めることができる。
本開示の実施形態においては、前記転写アクチベーターは、Ｇａｌ４ＶＰ１６、Ｇａｌ４ＶＰ６４、Ｇａｌ４ｅｓｎ、ｄＣａｓ９−ＶＰ１６、ｄＣａｓ９−ＶＰ６４、ｄＣａｓ９−ＶＰＲ、ｄＣａｓ９−ＶＴＲ、及びｒｔＴＡからなる群から選択される少なくとも１つである。
本開示の実施形態においては、前記第１の認識配列及び前記第２の認識配列は、それぞれ独立して、５×ＵＡＳ、７×ｔｅｔＯ、及びｄＣａｓ９の標的配列の少なくとも１つから選択される。
本開示の実施形態においては、前記第１のプロモーター及び前記第２のプロモーターは、それぞれ独立して、ｍｉｎｉＣＭＶ及びＴＡＴＡ ｂｏｘから選択される。
本開示の実施形態においては、前記第１の調節タンパク質及び前記第２の調節タンパク質は、それぞれ独立して、ＬａｃＩ、ｔｅｔＲ、ジンクフィンガー、ＫＲＡＢ、ｔｅｔＲ−ＫＲＡＢ、及びｄＣａｓ９−ＫＲＡＢの少なくとも１つから選択される。
本開示の実施形態においては、前記第１の調節エレメント及び前記第２の調節エレメントは、それぞれ独立して、ｔｅｔＯ、ＬａｃＯ、ジンクフィンガー標的部位、及びｄＣａｓ９の標的配列の少なくとも１つから選択される。
本開示の実施形態においては、前記第１の調節タンパク質は、ＬａｃＩであり、前記第２の調節エレメントは、複数の繰り返されたＬａｃＯ配列を含み、前記複数の繰り返されたＬａｃＯ配列の少なくとも１つは、前記第２のプロモーターの下流に設定される。発現後の前記ＬａｃＩは、前記ＬａｃＯ配列に特異的に結合し、それによって前記第２のプロモーターの機能を抑制することができる。実施形態に係るＬａｃＩ／ＬａｃＯ抑制系は、実験により実証されるように、前記第２のプロモーターの下流遺伝子の発現を効果的に阻害することができる。
本開示の実施形態においては、前記第２の調節タンパク質は、ｔｅｔＲ−ＫＲＡＢであり、前記第１の調節エレメントは、複数の繰り返されたｔｅｔＯ配列を含み、前記複数の繰り返されたｔｅｔＯ配列の少なくとも１つは、前記第１のプロモーターの下流に設定される。実施形態に係るｔｅｔＲ−ＫＲＡＢ／ｔｅｔＯ抑制系は、前記第１のプロモーターの下流遺伝子の発現を効果的に阻害することができる。
本開示の実施形態においては、前記第５の核酸分子及び前記第９の核酸分子の少なくとも１つは、目的のタンパク質をコードする配列を更に含む。本開示の実施形態に係る発現系を用いると、特定の細胞微小環境で前記目的のタンパク質を特異的に発現させながら、相互抑制方式で調節されることができる。本開示の具体的な実施形態によれば、前記発現系は、前記目的のタンパク質の発現における顕著に増加した特異性及び調節を示す。
本開示の実施形態においては、前記第５の核酸分子は、前記目的のタンパク質をコードする配列を含み、前記目的のタンパク質は、ウイルス性複製及びパッケージングタンパク質、及び免疫エフェクターから選択される少なくとも１つを含む。任意に、前記ウイルス性複製及びパッケージングタンパク質、及び前記免疫エフェクターは、融合タンパク質の形態で存在することができる。前記ウイルス性複製及びパッケージングタンパク質は、宿主における発現系ベクターの生存及び複製を効果的に保証することができる。前記免疫エフェクターの発現は、体内の免疫系を効果的に活性化し、それによって腫瘍細胞などの特定の細胞に対する免疫殺傷を促進することができる。
本開示の実施形態においては、前記ウイルス性複製及びパッケージングタンパク質は、アデノウイルスＥ１遺伝子、アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子、アデノウイルスＥ１Ｂ遺伝子、アデノウイルスＥ２遺伝子、及びアデノウイルスＥ４遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つを含む。
本開示の実施形態においては、前記免疫エフェクターが、ＰＤ−１遺伝子をアンタゴナイズする阻害配列、ＰＤ−Ｌ１遺伝子をアンタゴナイズする阻害配列、ＣＴＬＡ４遺伝子をアンタゴナイズする阻害配列、Ｔｉｍ−３遺伝子アンタゴナイズする阻害配列、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、及びＩＬ−１５からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含む。任意に、上記に記載される免疫エフェクターは、融合タンパク質の形態で存在することができる。
本開示の実施形態においては、前記目的のタンパク質及び前記第１の調節タンパク質は、融合タンパク質の形態で発現され、前記目的のタンパク質及び前記第１の調節タンパク質は、切断可能なリンカーペプチドによって結合される。前記目的のタンパク質及び前記第１の調節タンパク質は、同じプロモーターによって調節及び発現され、発現後前記リンカーペプチドで切断され、それによって前記目的のタンパク質及び前記第１の調節タンパク質は分離され、互いに独立して機能する。
本開示の実施形態においては、前記第９の核酸分子及び前記第１０の核酸分子は、独立して、ＲＮＡ干渉を介して前記第１の調節タンパク質又は前記第２の調節タンパク質の発現を阻害し、ｍｉｃｒｏＲＮＡは、異なる細胞微小環境で発現される特異的なｍｉｃｒｏＲＮＡであり、前記第９の核酸分子又は前記第１０の核酸分子は、前記ｍｉｃｒｏＲＮＡの特異的標的配列である。特異的微小環境で発現される前記ｍｉｃｒｏＲＮＡは、ＲＮＡ干渉を介して前記標的配列に特異的に作用することができるので、それによって前記第１の調節タンパク質又は前記第２の調節タンパク質の発現は、特異的に調節されることができる。本開示の実施形態においては、前記第９の核酸分子は、第１のｍｉｃｒｏＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列を含み、前記第１のｍｉｃｒｏＲＮＡは、正常細胞特異的ｍｉｃｒｏＲＮＡであり；前記第１０の核酸分子は、第２のｍｉｃｒｏＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列を含み、前記第２のｍｉｃｒｏＲＮＡは、異常細胞特異的ｍｉｃｒｏＲＮＡである。更に、前記第１の調節タンパク質は、異常細胞で発現され、正常細胞では発現されない又は低い発現であり、一方前記第２の調節タンパク質は、正常細胞で発現され、異常細胞では発現されない又は低い発現である。
本開示の具体的な実施形態においては、前記第１のｍｉｃｒｏＲＮＡは、ｍｉＲ１９９ａ、ｍｉＲ９５、ｍｉＲ１２５、ｍｉＲ２５ｂ、Ｌｅｔ−７、ｍｉＲ１４３、ｍｉＲ１４５、及びｍｉＲ２００Ｃからなる群から選択される少なくとも１つを含む。上記に記載されるｍｉｃｒｏＲＮＡは、正常な肝細胞で発現される。
本開示の具体的な実施形態においては、前記第２のｍｉｃｒｏＲＮＡは、ｍｉＲ２１、ｍｉＲ２２３、ｍｉＲ２２４、ｍｉＲ２２１、ｍｉＲ１８、ｍｉＲ２１４、ｍｉＲ１４６ａ、及びｍｉＲ１７９２からなる群から選択される少なくとも１つを含む。上記に記載される第２のｍｉｃｒｏＲＮＡは、肝細胞癌細胞（ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、及びＰＬＣなど）で特異的に発現されるｍｉｃｒｏＲＮＡである。更に、前記第１の調節タンパク質は、肝細胞癌細胞で発現され、正常細胞では発現されない又は低い発現であり、一方前記第２の調節タンパク質は、正常細胞で発現され、肝細胞癌では発現されない又は低い発現である。
本開示の実施形態においては、前記第１の核酸分子及び前記第２の核酸分子は、第１の発現ベクターにローディングされ；前記第３の核酸分子、前記第４の核酸分子、前記第５の核酸分子、及び任意に前記第９の核酸分子は、第２の発現ベクターにローディングされ；前記第６の核酸分子、前記第７の核酸分子、前記第８の核酸分子、及び任意に前記第１０の核酸分子は、第３の発現ベクターにローディングされる。前記第１の発現ベクター、前記第２の発現ベクター、及び前記第３の発現ベクターは、前記発現系のためのローディングベクターとして機能し、それによって細胞などの好適な微小環境において目的の遺伝子の特異性発現を調節する。
前記発現ベクターの選択は、前記発現系が好適な微小環境でその機能を示すことができる限り、特に限定されない。本開示の具体的な実施形態によれば、前記第１の発現ベクター、前記第２の発現ベクター、及び前記第３の発現ベクターは、それぞれ独立して、プラスミド、ウイルス、安定発現株、及びナノ物質、リポソーム、分子結合ベクター、ネイキッドＤＮＡ、染色体ベクター、及びポリマーなど他のキャリアの少なくとも１つから選択される。
本開示の実施形態においては、前記ウイルスは、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、及びレトロウイルスからなる群から選択される少なくとも１つを含む。
本開示の実施形態においては、前記第１の発現ベクター、前記第２の発現ベクター、及び前記第３の発現ベクターは、１つの同じベクターにローディングされる。前記第１の発現ベクター、前記第２の発現ベクター、及び前記第３の発現ベクターの接続順序は、前記発現系の生物学的機能の実現に影響を与えない限り、特に限定されないことに留意されるべきである。本開示の具体的な実施形態によれば、複数の大きな断片ベクターの同時トランスフェクション効率が非常に低いという問題は、１つの同じ発現ベクターにローディングすることによって、効果的に解決されることができる。
本開示の実施形態においては、前記１つの同じベクターは、アデノウイルスベクターである。遺伝子治療ベクターとして、アデノウイルスは、広範な宿主、ヒトへの低い病原性、増殖及び非増殖細胞での感染及び遺伝子発現、高力価、ヒト遺伝子との相同性、挿入後の変異原性がないこと、及び懸濁液中で増幅し、同時に複数の遺伝子の発現をすることといった利点を有する。
本開示の具体的な実施形態においては、前記第１の発現ベクターは、５’末端から３’末端に、ＢｓａＩ、ＡＦＰＩＩＩ、Ｇａｌ４ＶＰ１６、及びＢｓａＩを含む（ＢｓａＩ−ＡＦＰＩＩＩ−Ｇａｌ４ＶＰ１６−ＢｓａＩ）。
本開示の実施形態においては、前記第１の発現ベクターは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する核酸を有する。
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本開示の具体的な実施形態においては、前記第２の発現ベクターは、５’末端から３’末端に、ＢｓａＩ、５×ＵＡＳ、ｔｅｔＯ、ｍｉｎｉＣＭＶ、ｔｅｔＯ、Ｅ１Ａ、２Ａ、免疫効果因子（エフェクター）、ＬａｃＩ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ１９９ａ特異的認識配列（標的部位）、及びＢｓａＩを含む（ＢｓａＩ−５×ＵＡＳ−ｔｅｔＯ−ｍｉｎｉＣＭＶ−ｔｅｔＯ−Ｅ１Ａ−２Ａ−エフェクター−ＬａｃＩ−ｍｉＲ１９９ａ標的部位−ＢｓａＩ）。本開示の具体的な実施形態においては、前記エフェクターは、ＩＬ−２、ｈＧＭ−ＣＳＦ、ｍＧＭ−ＣＳＦ、抗−ＰＤ−１ｓｃＦｖ、抗−ＰＤ−Ｌ１ｓｃＦｖ、ＩＬ−２−抗−ＰＤ−１ｓｃＦｖ融合タンパク質、ｈＧＭ−ＣＳＦ−抗−ＰＤ−１ｓｃＦｖ融合タンパク質、ｍＧＭ−ＣＳＦ−抗−ＰＤ−１ｓｃＦｖ融合タンパク質、ＩＬ−２−抗−ＰＤ−Ｌ１ｓｃｆｖ融合タンパク質、ｈＧＭ−ＣＳＦ−抗−ＰＤ−Ｌ１ｓｃｆｖ融合タンパク質、ｍＧＭ−ＣＳＦ−抗−ＰＤ−Ｌ１ｓｃｆｖ融合タンパク質を具体的に含む。
本開示の実施形態においては、前記第２の発現ベクターは、配列番号２〜７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する核酸を有する。
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 配列番号２は、ＢｓａＩ−５×ＵＡＳ−ｔｅｔＯ−ｍｉｎｉＣＭＶ−ｔｅｔＯ−Ｅ１Ａ−２Ａ−ＥＢＦＰ−２Ａ−ＬａｃＩ−ｍｉＲ１９９ａ標的部位−ＢｓａＩの配列である。
配列番号３は、ＢｓａＩ−５×ＵＡＳ−ｔｅｔＯ−ｍｉｎｉＣＭＶ−ｔｅｔＯ−Ｅ１Ａ−２Ａ−ｈＩＬ−２−２Ａ−ＬａｃＩ−ｍｉＲ１９９ａ標的部位−ＢｓａＩの配列である。
配列番号４は、ＢｓａＩ−５×ＵＡＳ−ｔｅｔＯ−ｍｉｎｉＣＭＶ−ｔｅｔＯ−Ｅ１Ａ−２Ａ−ｈＧＭ−ＣＳＦ−２Ａ−ＬａｃＩ−ｍｉＲ１９９ａ標的部位−ＢｓａＩの配列である。
配列番号５は、ＢｓａＩ−５×ＵＡＳ−ｔｅｔＯ−ｍｉｎｉＣＭＶ−ｔｅｔＯ−Ｅ１Ａ−２Ａ−ｍＧＭ−ＣＳＦ−２Ａ−ＬａｃＩ−ｍｉＲ１９９ａ標的部位−ＢｓａＩの配列である。
配列番号６は、ＢｓａＩ−５×ＵＡＳ−ｔｅｔＯ−ｍｉｎｉＣＭＶ−ｔｅｔＯ−Ｅ１Ａ−２Ａ−抗−ＰＤ−１ｓｃＦｖ−２Ａ−ＬａｃＩ−ｍｉＲ１９９ａ標的部位−ＢｓａＩの配列である。
配列番号７は、ＢｓａＩ−５×ＵＡＳ−ｔｅｔＯ−ｍｉｎｉＣＭＶ−ｔｅｔＯ−Ｅ１Ａ−２Ａ−抗−ＰＤ−Ｌ１ｓｃＦｖ−２Ａ−ＬａｃＩ−ｍｉＲ１９９ａ標的部位−ＢｓａＩの配列である。
本開示の具体的な実施形態においては、前記第３の発現ベクターは、５’末端から３’末端に、ＢｓａＩ、５×ＵＡＳ、ＬａｃＯ、ｍｉｎｉＣＭＶ、ＬａｃＯ、ｔｅｔＲ−ＫＲＡＢ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ２１特異的認識配列（標的部位）、及びＢｓａＩを含む（ＢｓａＩ−５×ＵＡＳ−ＬａｃＯ−ｍｉｎｉＣＭＶ−ＬａｃＯ−ｔｅｔＲ−ＫＲＡＢ−ｍｉｃｒｏＲＮＡ２１標的部位−ＢｓａＩ）。
本開示の実施形態においては、前記第３の発現ベクターは、配列番号８に示されるヌクレオチド配列を有する核酸を有する。
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本開示の具体的な実施形態においては、前記アデノウイルスは、５’末端から３’末端に、第１の末端逆位配列（ＩＴＲ）、パッケージングシグナル、ＡＦＰＩＩＩ、Ｇａｌ４ＶＰ１６、５×ＵＡＳ、ｔｅｔＯ、ｍｉｎｉＣＭＶ、ｔｅｔＯ、Ｅ１Ａ、２Ａ、エフェクター、２Ａ、ＬａｃＩ、ｍｉＲ１９９ａ標的部位、５×ＵＡＳ、ＬａｃＯ、ｍｉｎｉＣＭＶ、ＬａｃＯ、ｔｅｔＲ−ＫＲＡＢ、ｍｉＲ２１標的部位、アデノウイルスＥ２遺伝子領域、アデノウイルスＥ３遺伝子領域（領域２８９２２−３０８０１の除去）、アデノウイルスＥ４遺伝子領域、及び第２の末端逆位配列（ＩＴＲ）を含む。本発明者らが腫瘍マウスモデルに注射すると、上記アデノウイルスは、マウスにおける腫瘍の成長を有意に阻害することができる。上記アデノウイルスは、安全で効果的な腫瘍溶解性ウイルスワクチンとして使用され、関連する腫瘍を安全且つ効果的な方法で特異的に死滅させることができる。
本開示の実施形態においては、前記アデノウイルスベクターは、配列番号９〜１４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する核酸を有する。
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 配列番号９は、アデノウイルスベクターが有するＥＢＦＰを担持する核酸の配列である。
配列番号１０は、アデノウイルスベクターが有するｈＩＬ−２を担持する核酸の配列である。
配列番号１１は、アデノウイルスベクターが有するｈＧＭＣＳＦを担持する核酸の配列である。
配列番号１２は、アデノウイルスベクターが有するｍＧＭＣＳＦを担持する核酸の配列である。
配列番号１３は、アデノウイルスベクターが有する抗−ＰＤ−１ｓｃＦｖを担持する核酸の配列である。
配列番号１４は、アデノウイルスベクターが有する抗−ＰＤ−Ｌ１ ｓｃＦｖを担持する核酸の配列である。
本開示の実施形態においては、前記アデノウイルスは、アデノウイルスベクターから、アデノウイルス複製及びパッケージングに関連する前記アデノウイルスＥ１遺伝子及び前記アデノウイルスＥ３遺伝子の一部を除去する工程と；段階的ゴールデンゲート法によって、遺伝子回路に前記アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子を挿入する工程と；ゲートウェイ（Ｇａｔｅｗａｙ）法又はギブソン（Ｇｉｂｓｏｎ）法によって、前記アデノウイルスベクターに前記遺伝子回路を組み込む工程と、によって得られる。上記に記載されるアデノウイルスを得る方法は、複雑で大きな断片の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターの迅速なエンジニアリングが可能になる。
第２の態様においては、実施形態における本開示は、組換えウイルスを提供する。本開示の実施形態においては、前記組換えウイルスは、αフェトプロテイン特異的プロモーターである腫瘍細胞特異的プロモーターを含む第１の核酸分子と；前記第１の核酸分子に機能可能に結合され、Ｇａｌ４ＶＰ１６である転写アクチベーターをコードする第２の核酸分子と；前記転写アクチベーターの５×ＵＡＳである第１の認識配列を含む第３の核酸分子と；前記第３の核酸分子に機能可能に結合され、第１のプロモーター及び第１の調節エレメントを含む第４の核酸分子であって、前記第１のプロモーターは、ｍｉｎｉＣＭＶであり、前記第１の調節エレメントは、複数の繰り返されたｔｅｔＯ配列を含み、前記複数の繰り返されたｔｅｔＯ配列の少なくとも１つは、前記第１のプロモーターの下流に設定される第４の核酸分子と；前記第４の核酸分子に機能可能に結合され、ＬａｃＩである第１の調節タンパク質をコードする第５の核酸分子であって、前記第５の核酸分子は、目的のタンパク質をコードする配列を更に含み、前記目的のタンパク質は、ウイルス性複製タンパク質及び免疫エフェクターを含み、前記免疫エフェクターは、個々のタンパク質又は融合タンパク質の形態で発現され、前記ウイルス性複製タンパク質及び前記免疫エフェクターは、切断可能なリンカーペプチドによって結合され、前記目的のタンパク質及び前記第１の調節タンパク質は、融合タンパク質の形態で発現され、前記目的のタンパク質及び前記第１の調節タンパク質は、切断可能なリンカーペプチドによって結合される第５の核酸分子と；前記転写アクチベーターの５×ＵＡＳである第２の認識配列を含む第６の核酸分子と；前記第６の核酸分子に機能可能に結合され、第２のプロモーター及び第２の調節エレメントを含む第７の核酸分子であって、前記第２のプロモーターは、ｍｉｎｉＣＭＶであり、前記第２の調節エレメントは、複数の繰り返されたＬａｃＯ配列を含み、前記複数の繰り返されたＬａｃＯ配列の少なくとも１つは、前記第２のプロモーターの下流に挿入される第７の核酸分子と；前記第７の核酸分子に機能可能に結合され、ｔｅｔＲ−ＫＲＡＢである第２の調節タンパク質をコードする第８の核酸分子と；前記第５の核酸分子に機能可能に結合され、前記第１の調節タンパク質の発現を条件付きで阻害するように構成される第９の核酸分子であって、前記第９の核酸分子は、正常細胞特異的ｍｉｃｒｏＲＮＡである第１のｍｉｃｒｏＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列を含む第９の核酸分子と；前記第８の核酸分子に機能可能に結合され、前記第２の調節タンパク質の発現を条件付きで阻害するように構成される第１０の核酸分子であって、前記第１０の核酸分子は、腫瘍細胞特異的ｍｉｃｒｏＲＮＡである第２のｍｉｃｒｏＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列を含む第１０の核酸分子と、を含み、前記第１の調節エレメントは、前記第２の調節タンパク質に結合することによって前記第１のプロモーターの機能を阻害するようにされ、前記第２の調節エレメントは、前記第１の調節タンパク質に結合することによって前記第２のプロモーターの機能を阻害するようにされる。本開示の実施形態に係る組換えウイルスを用いて、前記αフェトプロテイン特異的プロモーター、前記第９の核酸分子、及び前記第１０の核酸分子の同時調節下で、前記第１の調節タンパク質ＬａｃＩ及び前記目的のタンパク質は、腫瘍細胞で特異的に発現され、特異的に腫瘍細胞において、前記第２の調節タンパク質ｔｅｔＲ−ＫＲＡＢは、発現されない又は低い発現であり、それによって、第１のプロモーターｍｉｎｉＣＭＶにおけるｔｅｔＲ−ＫＲＡＢ媒介抑制メカニズムが解放されるので、前記第１の調節タンパク質ＬａｃＩ及び前記目的のタンパク質は、前記第１のプロモーターｍｉｎｉＣＭＶの制御下で効果的に発現され、前記第２のプロモーターｍｉｎｉＣＭＶの機能は、ＬａｃＩ媒介阻害メカニズムを介して効果的に阻害され、ｔｅｔＲ−ＫＲＡＢの発現は更に抑制される。更に、高い効率及び特異性を有する本開示の実施形態に係る組換えウイルスを用いることにより、標的タンパク質ＬａｃＩのようなタンパク質は、腫瘍細胞で特異的に発現され、ｔｅｔＲ−ＫＲＡＢのようなタンパク質は、腫瘍細胞で特異的に発現されない。
本開示の実施形態においては、前記組換えウイルスは、下記の追加の技術的特徴の少なくとも１つを更に含むことができる。
本開示の実施形態においては、前記組換えウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、及びワクシニアウイルスからなる群から選択される少なくとも１つを含む。
本開示の実施形態においては、前記組換えウイルスは、アデノウイルスである。上記に記載されるように、遺伝子治療ベクターとして、アデノウイルスは、広範な宿主、ヒトへの低い病原性、増殖及び非増殖細胞での感染及び遺伝子発現、高力価、ヒト遺伝子との相同性、挿入後の変異原性がないこと、及び懸濁液中で増幅し、同時に複数の遺伝子の発現をすることといった利点を有する。
本開示の実施形態においては、前記免疫エフェクターは、ＰＤ−１遺伝子をアンタゴナイズする阻害配列、ＰＤ−Ｌ１遺伝子をアンタゴナイズする阻害配列、ＣＴＬＡ４遺伝子をアンタゴナイズする阻害配列、Ｔｉｍ−３遺伝子をアンタゴナイズする阻害配列、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、及びＧＭ−ＣＳＦからなる群から選択される少なくとも１つの配列を含む。任意に、前記免疫エフェクターは、融合タンパク質の形態で存在することができる。
第３の態様においては、実施形態に係る本開示は、組換え細胞を提供する。本開示の実施形態においては、前記組換え細胞は、上記に記載される発現系を含む。本開示の実施形態に係る組換え細胞は、人体の全身性免疫応答を効果的に活性化し、腫瘍細胞などの異種細胞を高い安全性及び特異性で攻撃することができる。
本開示の実施形態においては、前記組換え細胞は、下記の追加の技術的特徴の少なくとも１つを更に含むことができる。
本開示の実施形態においては、前記発現系の少なくとも一部は、前記組換え細胞のゲノムに組み込まれる。前記組換え細胞のゲノムが複製すると、前記発現系は、複製し、前記発現系は、前記目的のタンパク質の発現を更に効果的に調節することができる。
第４の態様においては、実施形態における本開示は、癌の治療のための医薬の調製における、上記の発現系、上記の組換えウイルス、及び上記の組換え細胞の使用を提供する。本開示に記載される発現系は、前記目的のタンパク質を腫瘍細胞で特異的に発現させることを可能にし、実施形態における前記医薬は、癌の治療においてより強い有効性、特異性、及び安全性を示す。
本開示の実施形態においては、上記に記載される使用は、下記の追加の技術的特徴の少なくとも１つを更に含むことができる。
本開示の実施形態においては、前記癌は、肝癌、肺癌、結腸直腸癌、メラノーマ、乳癌、又は前立腺癌を含む。発明者らは、実施形態における前記医薬が、肝癌、肺癌、結腸直腸癌、メラノーマ、乳癌、及び前立腺癌の治療において、より有意な有効性を有することを見出した。
第５の態様においては、実施形態における本開示は、上記に記載される発現系である発現系の使用によって、目的のタンパク質を発現させる方法を提供する。本開示の実施形態においては、前記方法は、（１）前記目的のタンパク質をコードする核酸配列を含む第５の核酸分子を提供することと；（２）第１０の核酸分子によって、第２の調節タンパク質の発現を阻害し、前記目的のタンパク質を発現させることと、を含む。実施形態において上記に記載される目的のタンパク質を発現させる方法を用いて、前記第１のプロモーターにおける前記第２の調節タンパク質媒介抑制メカニズムが解放され、それによって前記目的のタンパク質は、前記細胞特異的プロモーター及び前記第２のプロモーターの相互作用下で特定の細胞で効果的に発現される。
本開示の実施形態においては、上記の方法は、下記の追加の技術的特徴の少なくとも１つを更に含むことができる。
本開示の実施形態においては、前記発現は、細胞内で行われる。前記細胞は、前記目的のタンパク質の発現のための微小環境を提供することができ、前記細胞内の前記目的のタンパク質の発現は、より効率的である。
本開示の実施形態においては、前記第１０の核酸分子は、第２のｍｉｃｒｏＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列を含み、前記工程（２）は、前記第２のｍｉｃｒｏＲＮＡを前記第１０の核酸分子に接触させることを更に含む。
第６の態様においては、実施形態における本開示は、上記に記載される発現系である発現系の使用によって、目的のタンパク質を発現させる方法を提供する。本開示の実施形態においては、前記方法は、（１）第１の目的のタンパク質をコードする核酸配列を含む第８の核酸分子を提供し、第２の目的のタンパク質をコードする核酸配列を含む第５の核酸分子を提供することと；（２）前記第９の核酸分子によって、前記第１の調節タンパク質の発現を阻害することによって、前記第１の目的のタンパク質を発現させ、前記第1の目的タンパク質を発現させること、又は前記第１０の核酸分子によって、前記第２の調節タンパク質の発現を阻害することによって、前記第２の目的のタンパク質を発現させ、前記第２の目的のタンパク質を発現させることと、を含む。実施形態において上記に記載される目的のタンパク質を発現させる方法を用いて、前記第１のプロモーターにおける前記第２の調節タンパク質媒介抑制メカニズムが解放され、それによって前記第２の目的のタンパク質は、前記細胞特異的プロモーター及び前記第１のプロモーターの相互作用下で特定の細胞で効果的に発現される、又は前記第２のプロモーターにおける前記第１の調節タンパク質媒介抑制メカニズムが解放され、それによって前記第１の目的のタンパク質は、前記細胞特異的プロモーター及び前記第２のプロモーターの相互作用下で特定の細胞で効果的に発現される。
本明細書に記載される融合タンパク質は、同じプロモーターの制御下で共転写されるタンパク質を指し、タンパク質間で結合されていない融合タンパク質、又は他のリンカーペプチドによって結合された融合タンパク質（ＧＧＧＳ又は２Ａ配列）を含むことに留意されるべきである。
図１は、ゲートウェイ系によって操作されたアデノウイルスの初期構造を示す概略図である。 図２は、ゴールデンゲートウェイ系によって操作されたアデノウイルスの初期構造を示す概略図である。 図３は、本開示の実施形態に係る相互抑制スイッチを示す概略図である。 図４は、本開示の実施形態に係る蛍光定量的ＰＣＲ法によって、細胞株Ｃｈａｎｇ、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、Ｈｅｐ３Ｂ、ＰＬＣ、及びＨｅｐａ１−６におけるαフェトプロテイン特異的プロモーター（ｈＡＦＰ）の発現レベルを示すグラフである。 図５は、本開示の実施形態に係るヒトＡＦＰプロモーターの改変を示す概略図である。 図６は、本開示の実施形態に係るＣｈａｎｇ及びＨｅｐＧ２への改変されたＡＦＰプロモーターの伝達系の一過性導入の結果を示すグラフである。 図７は、本開示の実施形態に係るｍｉｃｒｏＲＮＡ検出系を示す概略図である。 図８は、本開示の実施形態に係る異なる細胞株におけるｍｉｃｒｏＲＮＡマーカーの有意に異なる発現を示すグラフである。 図９は、本開示の実施形態に係るＬａｃＩ及びｔｅｔＲ−ＫＲＡＢ遺伝子に基づく相互抑制スイッチの概略図である。 図１０は、本開示の実施形態に係る人工的に合成されたｓｈＲＮＡシグナルに応答した相互抑制スイッチの効果的な反転を示すグラフである。 図１１Ａは、本開示の幾つかの実施形態に係る異なるアクチベーターに応答する相互抑制スイッチを示す概略図である。 図１１Ｂは、本開示の幾つかの実施形態に係る異なるアクチベーターに応答する相互抑制スイッチを示す概略図である。 図１１Ｃは、本開示の幾つかの実施形態に係る異なるアクチベーターに応答する相互抑制スイッチを示す概略図である。 図１１Ｄは、本開示の幾つかの実施形態に係る異なるアクチベーターに応答する相互抑制スイッチを示す概略図である。 図１２は、本開示の実施形態に係るＣＧＧＡ（Ｃａｓｃａｄｅ Ｇｏｌｄｅｎ−Ｇａｔｅ ａｎｄ Ｇａｔｅｗａｙ／Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｅ法）の第１の工程を示す概略図である。 図１３は、本開示の実施形態に係るＣＧＧＡ（Ｃａｓｃａｄｅ Ｇｏｌｄｅｎ−Ｇａｔｅ ａｎｄ Ｇａｔｅｗａｙ／Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｅ法）の第２の工程を示す概略図である。 図１４は、本開示の実施形態に係るＣＧＧＡ（Ｃａｓｃａｄｅ Ｇｏｌｄｅｎ−Ｇａｔｅ ａｎｄ Ｇａｔｅｗａｙ／Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｅ法）の第３の工程を示す概略図である。 図１５Ａは、本開示の幾つかの実施形態に係る細胞レベルにおけるアデノウイルスの検出を示すグラフである。 図１５Ｂは、本開示の幾つかの実施形態に係る細胞レベルにおけるアデノウイルスの検出を示すグラフである。 図１５Ｃは、本開示の幾つかの実施形態に係る細胞レベルにおけるアデノウイルスの検出を示すグラフである。 図１６は、本開示の幾つかの実施形態に係るｉｎ ｖｉｔｒｏで検出されたサイトカイン（プラスミドベクターによって発現された）の活性を示すグラフである。 図１７ａは、本開示の幾つかの実施形態に係るｉｎ ｖｉｔｒｏで検出されたサイトカイン（ウイルスベクターによって発現された）の活性を示すグラフである。 図１７ｂは、本開示の幾つかの実施形態に係るｉｎ ｖｉｔｒｏで検出されたサイトカイン（ウイルスベクターによって発現された）の活性を示すグラフである。 図１７ｃは、本開示の幾つかの実施形態に係るｉｎ ｖｉｔｒｏで検出されたサイトカイン（ウイルスベクターによって発現された）の活性を示すグラフである。 図１８Ａは、本開示の幾つかの実施形態に係る腫瘍溶解性アデノウイルスを用いて、それぞれＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、及びＨｅｐａ１−６を担持するヌードマウスモデルの処置を示す概略図である。 図１８Ｂは、本開示の幾つかの実施形態に係る腫瘍溶解性アデノウイルスを用いて、それぞれＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、及びＨｅｐａ１−６を担持するヌードマウスモデルの処置を示す概略図である。 図１８Ｃは、本開示の幾つかの実施形態に係る腫瘍溶解性アデノウイルスを用いて、それぞれＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、及びＨｅｐａ１−６を担持するヌードマウスモデルの処置を示す概略図である。 図１８Ｄは、本開示の幾つかの実施形態に係る腫瘍溶解性アデノウイルスを用いて、それぞれＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、及びＨｅｐａ１−６を担持するヌードマウスモデルの処置を示す概略図である。 図１９Ａは、本開示の幾つかの実施形態に係る腫瘍溶解性アデノウイルスを用いて、Ｈｅｐａ１−６を担持するＣ５７マウスモデルの処置を示す概略図である。 図１９Ｂは、本開示の幾つかの実施形態に係る腫瘍溶解性アデノウイルスを用いて、Ｈｅｐａ１−６を担持するＣ５７マウスモデルの処置を示す概略図である。 図１９Ｃは、本開示の幾つかの実施形態に係る腫瘍溶解性アデノウイルスを用いて、Ｈｅｐａ１−６を担持するＣ５７マウスモデルの処置を示す概略図である。 図１９Ｄは、本開示の幾つかの実施形態に係る腫瘍溶解性アデノウイルスを用いて、Ｈｅｐａ１−６を担持するＣ５７マウスモデルの処置を示す概略図である。 図１９Ｅは、本開示の幾つかの実施形態に係る腫瘍溶解性アデノウイルスを用いて、Ｈｅｐａ１−６を担持するＣ５７マウスモデルの処置を示す概略図である。 図１９Ｆは、本開示の幾つかの実施形態に係る腫瘍溶解性アデノウイルスを用いて、Ｈｅｐａ１−６を担持するＣ５７マウスモデルの処置を示す概略図である。 図１９Ｇは、本開示の幾つかの実施形態に係る腫瘍溶解性アデノウイルスを用いて、Ｈｅｐａ１−６を担持するＣ５７マウスモデルの処置を示す概略図である。 図１９Ｈは、本開示の幾つかの実施形態に係る腫瘍溶解性アデノウイルスを用いて、Ｈｅｐａ１−６を担持するＣ５７マウスモデルの処置を示す概略図である。 図１９Ｉは、本開示の幾つかの実施形態に係る腫瘍溶解性アデノウイルスを用いて、Ｈｅｐａ１−６を担持するＣ５７マウスモデルの処置を示す概略図である。 図２０ａは、本開示の実施形態に係る腫瘍溶解性アデノウイルスで処置した後の腫瘍侵潤（ｔｕｍｏｒ ｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ）Ｔ細胞の中でＩＦＮ−γ及びＫｉ６７マーカーの改善された発現を示すグラフである。 図２０ｂは、本開示の実施形態に係る腫瘍溶解性アデノウイルスで処置した後の腫瘍侵潤Ｔ細胞の中でＩＦＮ−γ及びＫｉ６７マーカーの改善された発現を示すグラフである。 図２１は、本開示の実施形態に係る処置後のマウスにおけるマウス肝癌Ｈｅｐａ１−６細胞の再誘発を示すグラフである。 図２２は、本開示の実施形態に係る腫瘍−ウイルス−エフェクター系のモデルを示す。 図２３は、本開示の実施形態に係る腫瘍−ウイルス系のシミュレーション中の異なる初期腫瘍サイズ、ウイルス力価、及びウイルス複製率の下で、初期状態から最終状態までの最小腫瘍サイズを経時的に示すグラフである。 図２４は、本開示の実施形態に係る腫瘍−ウイルス−エフェクター系によってシミュレートされた場合の腫瘍及びウイルスにおける免疫細胞の異なる阻害効果下の最終状態の腫瘍サイズを示すグラフである。
本開示の実施形態を以下に詳細に説明する。以下に記載される実施形態は、例示にすぎず、本開示を限定するものとして解釈されるべきではない。
発現系
本開示の第１の態様においては、発現系が実施形態において提供される。本開示の実施形態によれば、前記発現系は、細胞特異的プロモーターを組み込む第１の核酸分子と；前記第１の核酸分子に機能可能に結合され、転写アクチベーターをコードする第２の核酸分子と；前記転写アクチベーターの第１の認識配列を組み込む第３の核酸分子と；前記第３の核酸分子に機能可能に結合され、第１のプロモーター及び第１の調節エレメントを組み込む第４の核酸分子と；前記第４の核酸分子に機能可能に結合され、第１の調節タンパク質をコードする第５の核酸分子と；前記転写アクチベーターの第２の認識配列を組み込む第６の核酸分子と；前記第６の核酸分子に機能可能に結合され、第２のプロモーター及び第２の調節エレメントを組み込む第７の核酸分子と；前記第７の核酸分子に機能可能に結合され、第２の調節タンパク質をコードする第８の核酸分子と；前記第５の核酸分子に機能可能に結合され、前記第１の調節タンパク質の発現を条件付きで阻害するように構成される第９の核酸分子、及び前記第８の核酸分子に機能可能に結合され、前記第２の調節タンパク質の発現を条件付きで阻害するように構成される第１０の核酸分子からなる群から選択される少なくとも１つと、を含み、前記第１の調節エレメントが、前記第２の調節タンパク質に結合することによって前記第１のプロモーターの機能を阻害するようにされ、前記第２の調節エレメントが、前記第１の調節タンパク質に結合することによって前記第２のプロモーターの機能を阻害するようにされる。強力な制御、高い効率、及び特異性を有する本開示の実施形態に係る前記発現系を用いて、特定の細胞環境下で目的の遺伝子を特異的に発現させながら、相互抑制方式によって調節されることができる。
本開示の実施形態によれば、前記細胞特異的プロモーターは、腫瘍細胞特異的プロモーターである。前記腫瘍細胞特異的プロモーターは、αフェトプロテイン特異的プロモーター（ＡＦＰ）、サバイビン遺伝子プロモーター（ＳＵＲ）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）遺伝子プロモーター、コレシストキニンＡ受容体遺伝子プロモーター（ＣＣＫＡＲプロモーター）、癌胎児抗原プロモーター（ＣＥＡプロモーター）、癌原遺伝子ヒト上皮成長因子受容体２プロモーター（ヒト上皮成長因子受容体−２、ＨＥＲ２）、プロスタグランジンオキシダーゼ還元酵素２プロモーター（シクロオキシゲナーゼ２、ＣＯＸ２）、ケモカイン受容体−４（ＣＸＣＲ４）、Ｅ２Ｆ−１遺伝子プロモーター（Ｅ２Ｆ−１プロモーター）、ムチンプロモーター（ムチン１ＭＵＣ１）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ヒトチロシン関連タンパク質１（ＴＲＰ１）、及びチロシナーゼ（Ｔｙｒ）プロモーターからなる群から選択される少なくとも１つである。実施形態における前記発現系は、上記に記載される腫瘍細胞特異的プロモーターの制御下で特定の腫瘍細胞の微小環境で開始され、それによって調節及び遺伝子発現の特異性を更に高めることができる。
本開示の実施形態によれば、前記転写アクチベーターは、Ｇａｌ４ＶＰ１６、Ｇａｌ４ｅｓｎ、Ｇａｌ４ＶＰ６４、ｄＣａｓ９−ＶＰ１６、ｄＣａｓ９−ＶＰ６４、ｄＣａｓ９−ＶＰＲ、ｄＣａｓ９−ＶＴＲ、及びｒｔＴＡからなる群から選択される少なくとも1つである。酵母Ｇａｌ４−ＵＡＳ遺伝子発現系は、真核細胞の最もよく理解されている転写調節系の１つであり、Ｇａｌ４遺伝子は、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中の転写アクチベータータンパク質をコードする。Ｇａｌ４は、５’−ＣＧＧＲＮＮＲＣＹＮＹＮＹＮＣＮＣＣＧ−３’（Ｒはプリンを表し、Ｙはピリミジンを表し、Ｎは、任意のデオキシヌクレオチドを表す）である遺伝子プロモーターの上流活性化領域（ＵＡＳ）における１７ｂｐの配列を認識することができる。Ｇａｌ４は、ガラクトース代謝物に結合するＧａｌ８０と相互作用する。Ｇａｌ４は、２つのドメイン（ＤＮＡ結合ドメイン（Ｎ末端ドメイン）及び活性化ドメイン（Ｃ末端ドメイン））を含み、更に通常はホモダイマーの形態で機能するジンククラスタードメイン（特にＺｎ（２）−Ｃｙｓ（６）デュアルコアクラスタードメイン）を含む。ＧＡＬ４タンパク質に結合するＵＡＳ配列内のコア配列は、４つのコピーのタンデムリピートであり、各コピーは、１７塩基対（即ち、配列５’−ＣＧＧＡＧＴＡＣＴＧＴＣＧＴＧＧＧ−３’）を含む。哺乳類細胞に存在するＧａｌ４は、ＵＡＳが認識された場合にのみ標的遺伝子を活性化し、良好な特異性と誘導性で下流遺伝子の転写を開始する。Ｇａｌ４タンパク質の活性化ドメインは、単純ヘルペスウイルスＶＰ１６タンパク質又はＶＰ１６の４つのコピー（ＶＰ６４）の活性化ドメインで置き換えられることができる。形成された融合転写因子は、Ｇａｌ４タンパク質の結合特異性を維持しながら、Ｇａｌ４タンパク質の転写活性化活性を増加させる。テトラサイクリン誘導系は、テトラサイクリン応答エレメント及びテトラサイクリン誘導タンパク質を含む、真核細胞のための細菌由来の転写活性化系である。Ｔｅｔ応答エレメント（ＴＲＥ）は、テトラサイクリン誘導タンパク質によって認識されることができる、７つのリピートの１９ヌクレオチドのテトラサイクリンオペロン配列（即ち、５’−ＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡ−３’）を含む。テトラサイクリン誘導系は、テトラサイクリン誘導抑制系及びテトラサイクリン誘導活性化系を含む。前記テトラサイクリン誘導抑制系は、テトラサイクリン応答エレメント及びテトラサイクリンリプレッサーｔｅｔＲを含む。テトラサイクリンが存在しない場合、リプレッサーが応答エレメントに結合することにより、下流遺伝子の発現が活性化される；テトラサイクリンが存在する場合、リプレッサーはテトラサイクリンに結合し、それによって下流遺伝子の発現を阻害する。テトラサイクリン誘導活性化系は、テトラサイクリン応答エレメント及びリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子ｒｔＴＡを含む。テトラサイクリンが存在しない場合、ｒｔＴＡはＴＲＥエレメントに結合できないので、下流遺伝子の発現を活性化できず、一方、テトラサイクリンが存在する場合、ｒｔＴＡはテトラサイクリンの作用下でＴＲＥに結合し、それによって下流遺伝子の発現を活性化させる。
ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）は、Ｃａｓ９の変異体型であり、ｇＲＮＡ媒介を介して標的配列を認識することができ、ＤＮＡに特異的な認識及び結合があり、標的配列の切断活性はない。ｄＣａｓ９が活性化エレメントと共に融合発現されると、標的遺伝子の発現が効果的に活性化されることができる。
本開示の実施形態によれば、前記第１の認識配列及び前記第２の認識配列は、それぞれ独立して、５×ＵＡＳ、７×ｔｅｔＯ、及びｄＣａｓ９の標的配列の少なくとも１つから選択される。５×ＵＡＳは、５つのコピーのＧａｌ４ＶＰ１６調節系の応答エレメントである。Ｇａｌ４タンパク質に結合するＵＡＳ配列におけるコア配列は、４つのコピーのタンデムリピートで、各コピーは、１７塩基対（配列５’−ＣＧＧＡＧＴＡＣＴＧＴＣＧＴＧＧＧ−３’）を含む。７×ｔｅｔＯは、テトラサイクリン調節系の応答エレメントである７つのコピーのＴＲＥである。Ｔｅｔ応答エレメント（ＴＲＥ）は、テトラサイクリン誘導タンパク質によって認識されることができる、７つのリピートの１９ヌクレオチドのテトラサイクリンオペロン配列（５’−ＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡ−３’）を含む。
本開示の実施形態によれば、前記第１のプロモーター及び前記第２のプロモーターは、ｍｉｎｉＣＭＶである。５×ＵＡＳ−ｍｉｎｉＣＭＶは、合成誘導性プロモーターである。５×ＵＡＳは、Ｇａｌ４タンパク質の認識配列であり、ｍｉｎｉＣＭＶは、サイトメガロウイルスのプロモーター配列の一部である。ＴＲＥは、誘導性プロモーターでもある。７×ｔｅｔＯ−ｍｉｎｉＣＭＶにおいては、ｔｅｔＯは、テトラサイクリン系の応答エレメントの認識配列である。
本開示の実施形態においては、前記第１の調節タンパク質及び前記第２の調節タンパク質は、それぞれ独立して、ＬａｃＩ、ｔｅｔＲ、ジンクフィンガー、ＫＲＡＢ、及びｄＣａｓ９−ＫＲＡＢの少なくとも１つから選択される。ラクトースリプレッサー（ＬａｃＩ）は、自身のＤＮＡ結合ドメインのヘリックス−ターン−ヘリックスエレメントを介して、特定の配列を認識することにより、ラクトースオペロン（ＬａｃＯ）の主要なくぼみに結合し、また対称性に関連するαヘリックス残基を介して、ＬａｃＯの小さいくぼみにおける塩基配列にしっかりと結合する。このようなしっかりとした結合は、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター領域への高親和性結合を引き起こし、ＤＮＡの伸長を防ぎ、それによってｍＲＮＡの転写及び下流遺伝子の発現を阻害する。テトラサイクリンリプレッサー（ＴｅｔＲ）は、テトラサイクリンオペロン（ｔｅｔＯ）に結合する、保存されたヘリックス−ターン−ヘリックスＤＮＡ結合領域（ホモダイマーを形成）を含むので、下流遺伝子の転写発現が阻害される。ジンクフィンガータンパク質は、約３０個のアミノ酸を含む環と、前記環上の４個のＣｙｓタンパク質（又は２個のＣｙｓ）及び２個のＨｉｓタンパク質に配位したＺｎ２＋からなり、指の形態の構造を形成する。ジンクフィンガータンパク質は、遺伝子調節において重要な役割を果たすタンパク質のクラスである。ジンクフィンガータンパク質は、保存されているドメインに応じて、主にＣ２Ｈ２タイプ、Ｃ４タイプ、Ｃ６タイプに分類されることができる。ジンクフィンガーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ分子の標的配列、又はそれ自身若しくは他のジンクフィンガータンパク質に特異的に結合することにより、転写及び翻訳レベルで遺伝子発現、細胞分化、及び胚発生を調節することができる。Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメインは、ヒトにおいて約４００個のジンクフィンガータンパク質に存在する転写抑制領域のクラスである。ＫＲＡＢは、一般に７５個のアミノ酸残基からなり、その最小有効阻害領域は４５個のアミノ酸からなり、タンパク質間の両親媒性らせん状接続を通じて役割を果たす。ＫＲＡＢは、異なるエクソンによってコードされる２つの領域（Ａボックス及びＢボックス）に分割されることができ、Ａボックスは転写抑制において中心的な役割を果たし、ＢボックスはＡボックスの転写抑制を高める。
ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）は、Ｃａｓ９の変異体型であり、ｇＲＮＡ媒介を介して標的配列を認識することができ、ＤＮＡ配列におけるに特異的な認識及び結合活性があり、標的配列の切断活性はない。ｄＣａｓ９が抑制領域と共に融合発現されると、標的遺伝子の発現を効果的に阻害されることができる。
本開示の実施形態によれば、前記第１の調節エレメント及び前記第２の調節エレメントは、それぞれ独立して、ｔｅｔＯ、ＬａｃＯ、ジンクフィンガー標的部位、及びｄＣａｓ９の標的配列の少なくとも１つから選択される。テトラサイクリンオペロン（ｔｅｔＯ）は、テトラサイクリンリプレッサーによって認識され、それによって下流遺伝子の発現を阻害することができる。ラクトースオペロン（ＬａｃＯ）は、ラクトースリプレッサー（ＬａｃＩ）によって認識され、下流遺伝子の発現を阻害することができる。ジンクフィンガー標的部位は、ジンクフィンガータンパク質によって認識され、下流遺伝子の発現を調節することができる。ｄＣａｓ９標的配列は、相補ｇＲＮＡの助けを借りて、ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢによって認識され、下流遺伝子の発現を阻害することができる。
本開示の実施形態によれば、前記第１の調節タンパク質は、ＬａｃＩであり、前記第２の調節エレメントは、複数の繰り返されたＬａｃＯ配列を含み、前記複数の繰り返されたＬａｃＯ配列の少なくとも１つは、前記第２のプロモーターの下流に設定される。発現したＬａｃＩは、ＬａｃＯ配列に特異的に結合し、それによって前記第２のプロモーターの機能を阻害することができる。本開示の実施形態のＬａｃＩ／ＬａｃＯ抑制系によれば、ラクトースリプレッサー（ＬａｃＩ）は、自身のＤＮＡ結合ドメインのヘリックス−ターン−ヘリックスエレメントを介して、特定の配列を認識することにより、ラクトースオペロン（ＬａｃＯ）の主要なくぼみに結合し、また対称性に関連するαヘリックス残基を介して、ＬａｃＯの小さいくぼみにおける塩基配列にしっかりと結合する。このようなしっかりとした結合は、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター領域への高親和性結合を引き起こし、ＤＮＡの伸長を防ぎ、それによってｍＲＮＡの転写及び下流遺伝子の発現を阻害する。本開示の実施形態によれば、実験に示されるように、５×ＵＡＳ−ｍｉｎｉＣＭＶプロモーターにおけるｍｉｎｉＣＭＶ配列の２つの側に、発明者らによってＬａｃＯがそれぞれ挿入され、プロモーターの下流遺伝子の発現を効果的に阻害することができる。しかしながら、本発明者らは、それらの位置で使用されることができる他の抑制系を除外していない。
本開示の実施形態によれば、前記第２の調節タンパク質はｔｅｔＲ−ＫＲＡＢであり、前記第１の調節エレメントは、複数の繰り返されたｔｅｔＯ配列を含み、前記複数の繰り返されたｔｅｔＯ配列の少なくとも１つは、前記第１のプロモーターの下流に設定される。本開示の実施形態に係るｔｅｔＲ−ＫＲＡＢ／ｔｅｔＯ抑制系によれば、テトラサイクリンリプレッサー（ＴｅｔＲ）は、保存されたヘリックス−ターン−ヘリックスＤＮＡ結合領域（ホモダイマーを形成）を含み、テトラサイクリンオペロン（ｔｅｔＯ）に結合し、下流遺伝子の転写発現を阻害する。この実施形態においては、実験に示されるように、５×ＵＡＳ−ｍｉｎｉＣＭＶプロモーターにおけるｍｉｎｉＣＭＶ配列の２つの側に、発明者らによってｔｅｔＯがそれぞれ挿入され、プロモーターの下流遺伝子の発現を効果的に阻害することができる。前記第１の調節タンパク質及び前記第２の調節タンパク質を含むスイッチ系は、対応する入力シグナルに効果的に応答することができ、それによって異なる細胞株を効果的に区別することができる。しかしながら、本発明者らは、それらの位置で使用されることができる他の抑制系を除外していない。
本開示の実施形態によれば、前記第５の核酸分子及び前記第９の核酸分子の少なくとも１つは、目的のタンパク質をコードする配列を更に含む。本開示の実施形態に係る発現系を用いると、特定の細胞微小環境で前記目的のタンパク質を特異的に発現させながら、相互抑制方式で調節されることができる。本開示の具体的な実施形態によれば、前記発現系は、前記目的のタンパク質の発現における顕著に増加した特異性及び調節を示す。
本開示の実施形態においては、前記第５の核酸分子は、前記目的のタンパク質をコードする配列を含み、前記目的のタンパク質は、ウイルス性複製及びパッケージングタンパク質、及び免疫エフェクターからなる群から選択される少なくとも１つを含む。前記ウイルス性複製及びパッケージングタンパク質は、宿主における発現系ベクターの生存及び複製を効果的に保証する。前記免疫エフェクターの発現は、体内の免疫系を効果的に活性化し、それによって腫瘍細胞などの特定の細胞に対する免疫殺傷を促進することができる。
本開示の実施形態によれば、前記ウイルス性複製及びパッケージングタンパク質は、アデノウイルスＥ１遺伝子、アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子、アデノウイルスＥ１Ｂ遺伝子、アデノウイルスＥ２遺伝子、及びアデノウイルスＥ４遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つを含む。転写のタイミングに従って、アデノウイルス遺伝子は、主に初期発現遺伝子（Ｅ１〜４）と後期発現遺伝子（Ｌ１〜５）に分けられる。アデノウイルスのゲノムが核に入ると、細胞性転写因子は、最初にＥ１Ａ領域の上流に位置されるエンハンサーに結合し、細胞の代謝を調節し、ウイルスＤＮＡを細胞内で複製しやすくするＥ１Ａタンパク質を発現する。前記Ｅ１Ａタンパク質は、他の初期遺伝子（Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、及びＥ４）のプロモーターを活性化することもでき、Ｅ２Ｂは、ウイルス複製に関与する初期遺伝子の３つの追加転写ユニット（即ち、前駆体末端タンパク質（ｐＴＰ）、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ｓｓＤＢＰ）、及びＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡｐｏｌ））の発現を駆動する。これらの３つの遺伝子の発現産物は、複合体にしっかりと結合され、少なくとも３つの細胞タンパク質と相互作用して、ウイルスゲノムの複製を開始する。Ｅ１領域遺伝子の発現産物は、Ｅ１ＡとＥ１Ｂに分けられる。Ｅ１Ａは、主に２８９Ｒ（又は１３Ｓ）と２４３Ｒ（又は１２Ｓ）の２つのコンポーネントからなる。Ｅ１Ａタンパク質の主な機能は、細胞の代謝を調節することであり、それによって細胞中でのウイルス複製がより行われやすくなる。Ｅ１Ｂ１９Ｋは、Ｂｃｌ−２遺伝子の発現産物と相同であり、Ｂａｘファミリーのメンバーを不活性化及び除去することにより、細胞のアポトーシス又はネクローシスを防ぐことができる。Ｅ１Ｂ５５Ｋ遺伝子産物は、関与する他のアデノウイルス遺伝子（Ｅ４又はｆ６など）と共に、ｐ５３遺伝子の転写レベルをダウンレギュレートすることができる。Ｅ１Ｂ５５Ｋ遺伝子産物は、ウイルス複製、ウイルス後期ｍＲＮＡの転写、及びウイルスＲＮＡの輸送にも関与する。Ｅ２領域遺伝子の発現産物は、Ｅ２ＡとＥ２Ｂに分けられ、Ｅ２Ａは、ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）であり、Ｅ２Ｂは、主に２つの産物（即ち、それぞれ、前駆体末端タンパク質（ｐＴＰ）及びウイルス性ＤＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌ））を有する。このような３つのタンパク質は、少なくとも３つの細胞内因子と相互作用して、アデノウイルスＤＮＡ複製、並びにウイルス後期遺伝子の転写及び翻訳を開始する。Ｅ４領域遺伝子の遺伝子産物は通常ｏｒｆ１から６／７と呼ばれ、主に、宿主におけるウイルスメッセンジャーＲＮＡの代謝、並びにウイルスＤＮＡの複製の促進、及びタンパク質合成の停止に関与する。幾つかのＥ４産物がＤＮＡ活性化タンパク質キナーゼに結合して、ウイルスＤＮＡを鎖状に繋ぐことから防ぐことができることが研究で見出されている。このキナーゼは、ｐ５３遺伝子を活性化することができるので、Ｅ４領域遺伝子の幾つかの産物が細胞のアポトーシスを阻害することができると考えられている。Ｅ１Ｂ及びＥ４遺伝子の多くの産物が、Ｅ１Ａタンパク質をアンタゴナイズすることに関与している。例えば、Ｅ４は、Ｅ１Ａを介したＥ２Ｆプロモーターの活性化を阻害する。
本開示の実施形態によれば、前記免疫エフェクターは、ＰＤ−１遺伝子をアンタゴナイズする阻害配列、ＰＤ−Ｌ１遺伝子をアンタゴナイズする阻害配列、ＣＴＬＡ４遺伝子をアンタゴナイズする阻害配列、Ｔｉｍ−３遺伝子をアンタゴナイズする阻害配列、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、又はこれらの因子の融合発現形態からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含む。プログラム死（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ）１（プログラム死受容体１、ＰＤ−１）は、ＣＤ２８スーパーファミリーのメンバーに属する重要な免疫抑制分子であり、本来、アポトーシスマウスＴ細胞ハイブリドーマ２Ｂ４．１１からクローン化される。ＰＤ−１は、Ｔ細胞表面の重要な阻害分子であり、その細胞内ドメインは、免疫受容体チロシン阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）及び免疫受容体チロシン導入モチーフ（ＩＴＳＭ）を含む。ＩＴＳＭは、タンパク質チロシンホスファターゼファミリーホスファターゼの会合及びＴ細胞活性化シグナルの阻害を媒介する。ＩＴＳＭのリガンドは、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２であり、主に、免疫系の免疫応答時の腫瘍微小環境におけるＴ細胞の活性化を阻害することにおいて主要な役割を果たす。プログラム細胞死（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ）１リガンド（ＰＤ−Ｌ１）は、分化のクラスター２７４（ＣＤ２７４）又はＢ７ホモログ（Ｂ７ホモログ１、Ｂ７−Ｈ１）としても知られ、ＣＤ２７４遺伝子でコードされる体内のヒトタンパク質である。ＰＤ−Ｌ１は、腫瘍細胞微小環境における様々な腫瘍細胞及び造血細胞で誘導的に発現され、その発現レベルは、腫瘍の悪性度と正の相関がある。ＰＤ−１抗体及びＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１への結合を遮断することができる。しかしながら、組織内の腫瘍細胞は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路によって免疫系から逃れることができる。ＣＴＬＡ−４の略である細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質−４は、Ｔ細胞の表面に発現される副刺激分子の一種である。ＣＴＬＡ−４は、ＡＰＣの表面におけるＣＤ８０／ＣＤ８６に特異的に結合し、ＣＤ２８の機能と同様に、Ｔ細胞の活性化中に下流シグナルを活性化することができる。研究によって、Ｔ細胞の中でＣＴＬＡ−４を主に発現する細胞は、細胞性免疫を負に調節するＴ細胞のクラスである調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）であることが見出された。ＣＴＬＡ−４受容体の非存在下では、マウスは、Ｔ細胞の過剰発現を示し、それによって重度の自己免疫疾患を伴う。上記の結果は、Ｔｒｅｇがその機能を発揮するにはＣＴＬＡ−４が必要であることを示す。更に、ＣＴＬＡ−４は、ｃｏｎＴ細胞においても発現され、Ｔ細胞活性化のシグナル伝達を阻害する役割を果たす。Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有分子（ＴＩＭ）遺伝子ファミリーは、２００１年にＭｃｌｎｔｉｒｅがマウス喘息感受性遺伝子を求めて発見された新規遺伝子ファミリーであり、ゲノム解析及びポジショナルクローニングにより更に特定される。ＴＩＭファミリー遺伝子は、免疫グロブリンＶ領域及びムチン領域を含む。Ｔｉｍ−３は、ＴＩＭファミリーの重要なメンバーであり、活性化Ｔｈ１細胞の表面に負の調節分子を発現する。現在、ＴＩＭ３はＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｒｅｇ、ＮＫ細胞、及び他のリンパ球サブセットで発現されていることが分かっている。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、マクロファージ、Ｔ細胞、ＮＫ細胞などによって分泌される単量体糖タンパク質サイトカインであり、幹細胞を刺激して、顆粒細胞（好中球、好酸球、好塩基球、及び単球）を生成する。ＧＭ−ＣＳＦは、好中球の移動の阻害や細胞表面上の受容体の発現の変化など、免疫系の成熟細胞においても影響を及ぼす。この因子は、マクロファージを活性化することにより真菌感染を阻害することもできる。インターロイキン２（ＩＬ−２）は、白血球と白血球との間、及び白血球と他の細胞との間のサイトカインを媒介することができる。ＩＬ−２は、主に活性化Ｔ細胞によって産生され、オートクリン及びパラクリン的に局所的な標的細胞に作用し、免疫応答に関与する主要なサイトカインであり、それによって顕著な免疫効果を示す。ＩＬ−２はまた、Ｔ細胞の増殖を促進し、サイトカインを産生し、Ｂ細胞の増殖を促進し、Ｉｇを分泌し、マクロファージを活性化し、ＮＫ細胞の活性化及び増殖を促進する。更に、ＩＬ−２には、負の調節効果も有し、Ａｇを活性化し、免疫応答の強度を制限し、明らかな免疫損傷を回避するＴ細胞のアポトーシスを誘導することができる。インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）は、抗原刺激に応答して樹状細胞、マクロファージ、好中球、及びヒトＢリンパ芽球（ｎｃ−３７）によって産生されるインターロイキンの一種である。Ｔ細胞刺激因子と呼ばれるＩＬ−１２は、未感作細胞のＴｈ１細胞への分化に関与し、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）及び腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）の産生を刺激する。ＩＬ−１２は、ナチュラルキラー細胞及びＴリンパ球の活性を調節する上で重要な役割を果たす。ＩＬ−１２は、ＮＫ細胞及びＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球の増加した細胞傷害活性を媒介する。ＩＬ−１２は、抗−血管新生活性も有し、新しい血管の形成を遮断することができることを示す。ＩＬ−１２は、ガンマインターフェロン（ＩＮＦ−γ）の産生を増加させるので、タンパク質１０（ＩＰ−１０又はＣＸＣＬ１０）の誘導を増加させ、ＩＰ−１０は抗−血管新生を媒介する。ＩＬ−１２は、免疫応答と抗−血管新生を誘導する能力があるので、潜在的な抗癌薬剤として試験されている。ＩＬ−１５は、活性化された単球−マクロファージ、表皮細胞、線維芽細胞などの様々な細胞によって産生され得る最近発見された因子である。ＩＬ−１５の分子構造は、ＩＬ−２のものと非常に似ているため、標的細胞へのＩＬ−２受容体のβ鎖とγ鎖の結合に基づいて、ＩＬ−１５は、ＩＬ−２と同様の生物学的活性を発揮することができる。ＩＬ−１５は、Ｂ細胞の増殖と分化を誘導でき、ＩＬ−２を部分的に置換して初期抗体産生を誘導することができる唯一のサイトカインである。ＩＬ−１５は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の増殖を刺激し、ＬＡＫ細胞活性を誘導することができ、ＩＬ−１２と相互作用し、ＮＫ細胞を相乗的に刺激し、それによってＩＦＮ−γを産生することもできる。
本開示の実施形態によれば、前記目的のタンパク質及び前記第１の調節タンパク質は、１つの同じプロモーターの制御下で同時発現し、前記目的のタンパク質及び前記第１の調節タンパク質は、切断可能なリンカーペプチドによって結合される。前記目的のタンパク質及び前記第１の調節タンパク質は、前記１つの同じプロモーター下で調節及び発現され、発現後リンカーペプチドによって更に切断される。前記目的のタンパク質は、前記第１の調節タンパク質から分離され、前記目的のタンパク質及び前記第１の調節タンパク質は、互いに独立して機能する。
本開示の実施形態によれば、前記第９の核酸分子及び前記第１０の核酸分子は、それぞれ独立して、ＲＮＡ干渉を介して前記第１の調節タンパク質又は前記第２の調節タンパク質の発現を阻害する。ｍｉｃｒｏＲＮＡは、異なる細胞微小環境で発現される特異的なｍｉｃｒｏＲＮＡであり、前記第９の核酸分子又は前記第１０の核酸分子は、ｍｉｃｒｏＲＮＡの特異的標的配列である。特異的微小環境内で発現されるｍｉｃｒｏＲＮＡとその標的配列との特異的効果は、ＲＮＡ干渉を介して実現されることができ、それによって前記第１の調節タンパク質又は前記第２の調節タンパク質の発現を特異的に調節する。ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、約２０〜２４個のヌクレオチドを有する内在性小型ＲＮＡのクラスであり、幾つかのｍｉＲＮＡは１つの同じ遺伝子を調節することができる。遺伝子の発現は、幾つかのｍｉＲＮＡの組合せによって細かく調節されることができる。ｍｉｃｒｏＲＮＡは、約３００〜１０００塩基の長さのものである、原形におけるｐｒｉ−ｍｉＲＮＡと；前記ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡのプロセシングにより形成され、約７０〜９０塩基の長さのものである、ｍｉｃｒｏＲＮＡ前駆体の形態であるｐｒｅ−ｍｉＲＮＡと；Ｄｉｃｅｒを用いて前記ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの切断（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）によって生成される約２０〜２４ｎｔの成熟ｍｉＲＮＡと、を含む多くの形態を有する。ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）は、標的遺伝子の発現を阻害する。標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるｍｉｃｒｏＲＮＡ−ＲＩＳＣの効果は、３つの方法で行われるｍｉｃｒｏＲＮＡ−ＲＩＳＣと標的遺伝子転写配列との間の相補度に常に大きく依存してきた。第１の方法では、標的遺伝子のｍＲＮＡ分子が切断され、即ち標的遺伝子に対して完全に相補的なｍｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡのものと密接に類似したメカニズムと機能を有する）が切断される。植物においては、標的遺伝子のｍｉＲＮＡの多くが上記の方法で切断され、ｐｏｌｙ（Ａ）を有さない分子は、３’末端にウラシル（Ｕｓ）が追加され、急速に分解されるが、ｐｏｌｙ（Ａ）を有する分子は、一定期間安定して存在できる（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｍｉＲ−１７１など）。現在、これらの遺伝子がｍｉＲＮＡのターゲットであるかどうかは不明であるが、１つのｍｉＲＮＡが、植物における３つの潜在的な標的遺伝子に対して完全に相補的であることが分かっている。しかしながら、ｍｉＲＮＡが潜在的な標的に対して完全に相補的であり得ることが初めて見出され、ｍｉＲＮＡがｓｉＲＮＡと同様のメカニズムを有することできることが示唆されている。第２の方法では、標的遺伝子の翻訳が阻害される。ｍｉＲＮＡは、標的遺伝子に完全に相補的ではないので、ｍＲＮＡの安定性に影響を与えることなく、標的遺伝子の翻訳を阻害する。このようなｍｉＲＮＡは、線虫ｌｉｎ−４のように最も広く発見されているｍｉＲＮＡであるが、植物におけるｍｉＲＮＡの殆どは、このようにして標的遺伝子を阻害しない。第３の方法は、結合阻害を指し、即ち上記の２つの方法で２つのメカニズムを組み込む。ｍｉＲＮＡが標的遺伝子に完全に相補的である場合、直接切断される。ｍｉＲＮＡが標的遺伝子に完全に相補的でない場合、遺伝子発現の調節に関与する。
本開示の実施形態によれば、前記第９の核酸分子は、第１のｍｉｃｒｏＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列を含み、前記第１０の核酸分子は、第２のｍｉｃｒｏＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列を含み、前記第１のｍｉｃｒｏＲＮＡが、正常細胞特異的ｍｉｃｒｏＲＮＡであり、前記第２のｍｉｃｒｏＲＮＡは、異常細胞特異的ｍｉｃｒｏＲＮＡである。更に、前記第１の調節タンパク質は、異常細胞で発現され、正常細胞では発現されない又は低い発現であり、一方前記第２の調節タンパク質は、正常細胞で発現され、異常細胞では発現されない又は低い発現である。
本開示の更に他の具体的な実施形態によれば、前記第１のｍｉｃｒｏＲＮＡは、ｍｉＲ１９９ａ、ｍｉＲ９５、ｍｉＲ１２５、ｍｉＲ１２５ｂ、Ｌｅｔ−７、ｍｉＲ１４３、ｍｉＲ１４５、及びｍｉＲ２００Ｃからなる群から選択される少なくとも１つを含む。上記に記載されるｍｉｃｒｏＲＮＡは、正常な肝細胞で発現される。
本開示の更に他の具体的な実施形態によれば、前記第２のｍｉｃｒｏＲＮＡは、肝細胞癌細胞（ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、及びＰＬＣ）で発現されるｍｉＲ２１、ｍｉＲ２２３、ｍｉＲ２２４、ｍｉＲ２２１、ｍｉＲ１８、ｍｉＲ２１４、ｍｉＲ１４６ａ、及びｍｉＲ１７９２からなる群から選択される少なくとも１つを含む。上記に記載される第２のｍｉｃｒｏＲＮＡは、肝細胞癌細胞で特異的に発現されるｍｉｃｒｏＲＮＡである。更に、前記第１の調節タンパク質は、肝癌細胞で発現され、正常細胞では発現されない又は低い発現であり、一方前記第２の調節タンパク質は、正常細胞で発現され、肝癌細胞では発現されない又は低い発現である。
本開示の実施形態によれば、前記第１の核酸分子及び前記第２の核酸分子は、第１の発現ベクターにローディングされ；前記第３の核酸分子、前記第４の核酸分子、前記第５の核酸分子、及び任意に前記第９の核酸分子は、第２の発現ベクターにローディングされ；前記第６の核酸分子、前記第７の核酸分子、前記第８の核酸分子、及び任意に前記第１０の核酸分子は、第３の発現ベクターにローディングされる。前記第１の発現ベクター、前記第２の発現ベクター、及び前記第３の発現ベクターは、前記発現系のためのローディングベクターとして機能し、細胞などの好適な微小環境において目的の遺伝子の特異性発現を調節する。
前記発現ベクターの選択は、好適な微小環境において前記発現系の機能が達成されることができる限り、特に限定されない。本開示の具体的な実施形態によれば、前記第１の発現ベクター、前記第２の発現ベクター、及び前記第３の発現ベクターは、それぞれ独立して、プラスミド、ウイルス、安定発現株、並びにナノ物質、リポソーム、分子複合型ベクター（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｖｅｃｔｏｒ）、ネイキッドＤＮＡ、染色体ベクター、及びポリマーなど他の物質キャリアの少なくとも１つから選択される。リポソームキャリアは、ＤＮＡを人工の二重層リン脂質でパッケージ化することによって形成されたリポソーム−ＤＮＡ複合体である。リポソームキャリアは、非毒性且つ非抗原性であり、大きな容量を有し、リポソームキャリアの被包によって、標的遺伝子をヌクレアーゼ分解から防止することができる。このようなリポソームキャリアは、単独で、又は他のキャリアと組み合わせて用いられることができ、標的遺伝子をカプセル化したリポソームキャリアを静脈内注射することで特定の部位に標的遺伝子を導入することができるが、発現時間が短く、細胞膜バリアを通過できないという欠点を有する。分子複合型ベクターは、ＤＮＡ、ＤＮＡ結合因子、及びリガンドの３つの部分からなる。
本開示の実施形態によれば、前記ウイルスは、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、及びレトロウイルスからなる群から選択される少なくとも１つを含む。
本開示の実施形態によれば、前記第１の発現ベクター、前記第２の発現ベクター、及び前記第３の発現ベクターは、１つの同じベクターである。本開示の具体的な実施形態によれば、本開示における発現系のコンポーネントは、本発明者らによって、Ｃａｓｃａｄｅ Ｇｏｌｄｅｎ−Ｇａｔｅ Ｇｉｂｓｏｎ／Ｇａｔｅｗａｙ Ａｓｓｅｍｂｌｅ法により１つの同じ発現ベクターにローディングされ、それによって複数の大きなフラグメントがトランスフェクトされる場合の非常に低いトランスフェクション効率の問題を効果的に解決する。
本開示の実施形態によれば、前記１つの同じベクターは、アデノウイルスである。遺伝子治療ベクターとしてのアデノウイルスは、下記の利点を有する。
１）アデノウイルスは、広範囲の宿主に有用であり、ヒトに対する病原性が低く、それによってアデノウイルスベクター系は、ヒト及び非ヒトタンパク質の発現に広く用いられる。更に、アデノウイルスは、様々な哺乳類細胞に感染することができるため、殆どの哺乳類細胞及び組織における組換えタンパク質の発現に有用であることができる。アデノウイルスは、上皮細胞性（ｅｐｉｔｈｅｌｉｏｐｈｉｌｉｃ）であり、ヒト腫瘍の殆どは上皮細胞から由来されることに特に留意される。更に、アデノウイルスの複製遺伝子及び病原性遺伝子は、十分に明確であり、アデノウイルスに対する抗体は、ヒト集団において存在する（７０〜８０％の大人は、アデノウイルスに対する中和抗体を有する）。ヒトは、野生型アデノウイルスに感染した後にのみ僅かな自己制限症状を引き起こし、リバビリンによる処置が有効である。
２）アデノウイルスは、増殖細胞及び非増殖細胞において感染し、遺伝子発現することができる。レトロウイルスは、増殖細胞のみ感染することができ、ＤＮＡトランスフェクションは、非増殖細胞で行われることができず、それによって細胞は、インキュベーション中に保持される必要がある。アデノウイルスは、アデノウイルスに対する幾つかのリンパ腫細胞を除き、ほぼ全ての細胞型に感染することができる。アデノウイルスは、非増殖性の初代細胞での遺伝子発現を研究するのに最も良好な系であり、形質転換細胞及び初代細胞から得られた結果間の直接比較を可能にする。
３）アデノウイルスは、効果的に増殖でき、高い力価を有する。アデノウイルス系は、１０１０〜１０１１ＶＰ／ｍｌＬの力価を生じさせることができ、濃縮後に最大１０１３ＶＰ／ｍＬになることができる。したがって、この機能は、遺伝子治療を非常に好適にする。
４）アデノウイルスは、ヒトの遺伝子と相同である。ヒトウイルスは、一般にベクターとして用いられ、ヒト細胞は、アデノウイルスベクター系の宿主として用いられ、これは正確な翻訳後プロセッシング及びヒトタンパク質の適切なフォールディングのための理想的な環境を提供する。殆どのヒトタンパク質は、高い発現レベルを達成でき、完全に機能する。
５）アデノウイルスは、染色体に組み込まれず、挿入後に変異原性を引き起さない。レトロウイルスは、宿主の染色体にランダムに組み込まれ、遺伝子の不活性化又は癌遺伝子の活性化を引き起こす。しかしながら、アデノウイルスは、卵細胞を除く殆ど全ての公知の細胞の染色体に組み込まれないため、宿主における他の遺伝子を妨害しない。アデノウイルスの単一コピーで組み込まれた卵細胞は、特定の特性を有するトランスジェニック動物を作製するための優れた系である。
６）アデノウイルスは、懸濁培養培地で増幅されることができる。２９３細胞は、懸濁培養によって調整されることができるため、アデノウイルスの大幅の増幅を可能にする。２９３細胞の懸濁液が、１〜２０Ｌのバイオリアクターにおいて組換えタンパク質を発現することができることが多数の事実によって示されている。
７）アデノウイルスは、複数の遺伝子を同時に発現させる能力を有する。これは、同じ細胞株又は組織において複数の遺伝子を発現するように設計された最初の発現系である。発現系の構築のための最も簡単な方法は、２つの遺伝子を含む二重発現カセットをアデノウイルス導入ベクターに挿入する、又は目的の細胞株を異なる組換えウイルスでそれぞれコトランスフェクトし、タンパク質を発現させることを含む。個々の組換えタンパク質の相対的な同時発現は、異なる組換えウイルスのＭＯＩ比を決定することにより正確に推定されることができる。
本開示の具体的な実施形態によれば、上記アデノウイルスは、本発明者らによって腫瘍マウスモデルに注入され、マウス腫瘍の成長を有意に阻害する。上記アデノウイルスは、安全で効果的な方法で、関連する腫瘍を特異的に死滅させるために、安全で効果的な腫瘍溶解性ウイルスワクチンとして用いられることができる。
本開示の実施形態によれば、前記アデノウイルスは、アデノウイルスベクターから、アデノウイルス複製及びパッケージングに関連する前記アデノウイルスＥ１遺伝子及び前記アデノウイルスＥ３遺伝子の一部を除去する工程と；段階的ゴールデンゲート法によって、遺伝子回路に前記アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子を挿入する工程と；ゲートウェイ法又はギブソン法によって、前記アデノウイルスベクターに前記遺伝子回路を組み込む工程と、によって得られる。具体的には、本発明者らは、３つの工程によって、癌細胞を認識する遺伝子回路をアデノウイルスベクターに挿入する。第１に、正常細胞から癌細胞を区別することに関連するマーカー要素（腫瘍−特異的プロモーター、遺伝子回路関連抑制エレメント、及び癌細胞を区別するｍｉＲＮＡ認識配列など）が一次ベクタープラスミドに構築され、一次エレメントライブラリーを形成し、一次エレメントの２つの端部は、それぞれ、Ｅｓｐ３Ｉの認識部位に挿入され、それによって、ゴールデンゲート法によって１つの第２の発現系に構築された複数の一次エレメントを生成する。第２に、発現系ライブラリーが構築され、一次エレメントライブラリーから選択された複数の一次エレメントは、ゴールデンゲート法によって３つの発現系にアセンブルされ、このような３つの発現系は、腫瘍−特異的プロモーター系、第１の調節エレメント媒介抑制系、及び第２の調節エレメント媒介抑制系を含み、各発現系の２つの端部は、ＢｓａＩエンドヌクレアーゼの認識部位で挿入されている。第三に、ゴールデンゲート法により３つの発現系をランダムにアセンブルすることにより、完全な遺伝子回路が形成される。更なる実験のため、遺伝子回路の２つの端部には、ギブソン相同配列又はゲートウェイ認識部位がそれぞれ挿入される。最後に、遺伝子回路は、ギブソン法又はゲートウェイ法により、アデノウイルスベクター（Ｅ１遺伝子及びＥ３遺伝子の一部は除去される）に構築される。上記アデノウイルスを得る方法は、大きな断片を含む複雑な腫瘍溶解性アデノウイルスベクターの迅速な改変を保証する。
組換えウイルス
本開示の第２の態様においては、実施形態において、組換えウイルスが提供される。本開示の実施形態においては、前記組換えウイルスは、αフェトプロテイン特異的プロモーターである腫瘍細胞特異的プロモーターを含む第１の核酸分子と；前記第１の核酸分子に機能可能に結合され、Ｇａｌ４ＶＰ１６である転写アクチベーターをコードする第２の核酸分子と；前記転写アクチベーターの５×ＵＡＳである第１の認識配列を含む第３の核酸分子と；前記第３の核酸分子に機能可能に結合され、第１のプロモーター及び第１の調節エレメントを含む第４の核酸分子であって、前記第１のプロモーターは、ｍｉｎｉＣＭＶであり、前記第１の調節エレメントは、複数の繰り返されたｔｅｔＯ配列を含み、前記複数の繰り返されたｔｅｔＯ配列の少なくとも１つは、前記第１のプロモーターの下流に設定される第４の核酸分子と；前記第４の核酸分子に機能可能に結合され、ＬａｃＩである第１の調節タンパク質をコードする第５の核酸分子であって、前記第５の核酸分子は、目的のタンパク質をコードする配列を更に含み、前記目的のタンパク質は、ウイルス性複製タンパク質及び免疫エフェクターを含み、前記免疫エフェクター及び前記ウイルス性複製タンパク質は、同時発現され、前記免疫エフェクターは、切断可能なリンカーペプチドによって結合され、前記目的のタンパク質及び前記第１の調節タンパク質は、１つの同じプロモーターによって調節及び同時発現され、前記目的のタンパク質及び前記第１の調節タンパク質は、切断可能なリンカーペプチドによって結合される第５の核酸分子と；前記転写アクチベーターの５×ＵＡＳである第２の認識配列を含む第６の核酸分子と；前記第６の核酸分子に機能可能に結合され、第２のプロモーター及び第２の調節エレメントを含む第７の核酸分子であって、前記第２のプロモーターは、ｍｉｎｉＣＭＶであり、前記第２の調節エレメントは、複数の繰り返されたＬａｃＯ配列を含み、前記複数の繰り返されたＬａｃＯ配列の少なくとも１つは、前記第２のプロモーターの下流に挿入される第７の核酸分子と；前記第７の核酸分子に機能可能に結合され、ｔｅｔＲ−ＫＲＡＢである第２の調節タンパク質をコードする第８の核酸分子と；前記第５の核酸分子に機能可能に結合され、前記第１の調節タンパク質の発現を条件付きで阻害するように構成される第９の核酸分子であって、前記第９の核酸分子は、正常細胞特異的ｍｉｃｒｏＲＮＡである第１のｍｉｃｒｏＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列を含む第９の核酸分子と；前記第８の核酸分子に機能可能に結合され、前記第２の調節タンパク質の発現を条件付きで阻害するように構成される第１０の核酸分子であって、前記第１０の核酸分子は、腫瘍細胞特異的ｍｉｃｒｏＲＮＡである第２のｍｉｃｒｏＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列を含む第１０の核酸分子と、を含み、前記第１の調節エレメントは、前記第２の調節タンパク質に結合することによって前記第１のプロモーターの機能を阻害するようにされ、前記第２の調節エレメントは、前記第１の調節タンパク質に結合することによって前記第２のプロモーターの機能を阻害するようにされる。本開示の実施形態に係る組換えウイルスを用いて、前記αフェトプロテイン特異的プロモーター、前記第９の核酸分子、及び前記第１０の核酸分子の同時調節下で、前記第１の調節タンパク質ＬａｃＩ及び前記目的のタンパク質は、腫瘍細胞で特異的に発現され、特異的に腫瘍細胞において、前記第２の調節タンパク質ｔｅｔＲ−ＫＲＡＢは、発現されない又は低い発現であり、それによって、前記第１のプロモーターｍｉｎｉＣＭＶにおけるｔｅｔＲ−ＫＲＡＢ−媒介抑制メカニズムが解放されるので、前記第１の調節タンパク質ＬａｃＩ及び前記目的のタンパク質は、前記第１のプロモーターｍｉｎｉＣＭＶの制御下で効果的に発現され、前記第２のプロモーターｍｉｎｉＣＭＶの機能は、ＬａｃＩ媒介阻害メカニズムを介して効果的に阻害され、ｔｅｔＲ−ＫＲＡＢの発現は更に阻害される。更に、高い効率及び特異性を有する本開示の実施形態に係る組換えウイルスを用いることによって、タンパク質（前記目的のタンパク質Ｅ１Ａ及び前記第１の調節タンパク質ＬａｃＩなど）は、腫瘍細胞でより特異的に発現され、前記第２の調節タンパク質ｔｅｔＲ−ＫＲＡＢなどのタンパク質は、腫瘍細胞では特異的に発現されない。
本開示の実施形態によれば、前記組換えウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、及びワクシニアウイルスからなる群から選択される少なくとも１つである。（１）レトロウイルスベクターは、一般的なレトロウイルスのものと類似の構造及び感染プロセス、形質転換された標的細胞における目的遺伝子の安定した発現、標的細胞の感染後の拡散がないこと、感染している標的細胞における偽ウイルスの高い効率、並びに非増殖細胞への感染がないこと、という特徴を有する。（２）アデノウイルスベクターは、広範囲の宿主であること、アデノウイルスタンパク質の発現時に宿主増殖に依存しないこと、高いウイルス力価であること、安定的な組換えであること、腫瘍への誘導がないこと、高い安全性を有すること、エンベロープタンパク質がないこと、補体により容易に不活性化されないこと、体内において直接適用できること、並びに染色体への組み込みがないことという特徴を有する。（３）単純ヘルペスウイルスベクターは、高力価、大容量、増殖細胞と非増殖細胞の両方への感染、組込みがないこと、並びに長期的な存在及び安定した発現という特徴を有する。
本開示の実施形態によれば、前記組換えウイルスは、アデノウイルスである。上記に記載されるように、遺伝子治療ベクターとしてのアデノウイルスは、多くの利点を有する。
１．アデノウイルスは、広範囲の宿主に有用であり、ヒトに対する病原性が低く、それによってアデノウイルスベクター系は、ヒト及び非ヒトタンパク質の発現に広く用いられる。更に、アデノウイルスは、様々な哺乳類細胞に感染することができるため、殆どの哺乳類細胞及び組織における組換えタンパク質の発現に有用であることができる。アデノウイルスは、上皮細胞性であり、ヒト腫瘍の殆どは上皮細胞から由来されることに特に留意される。更に、アデノウイルスの複製遺伝子及び病原性遺伝子は、十分に明確であり、アデノウイルスに対する抗体は、ヒト集団において存在する（７０〜８０％の大人は、アデノウイルスに対する中和抗体を有する）。ヒトは、野生型アデノウイルスに感染した後にのみ僅かな自己制限症状を引き起こし、リバビリンによる処置が有効である。
２．アデノウイルスは、増殖細胞及び非増殖細胞において感染し、遺伝子発現することができる。レトロウイルスは、増殖細胞のみ感染することができ、ＤＮＡトランスフェクションは、非増殖細胞で行われることができず、それによって細胞は、インキュベーション中に保持される必要がある。アデノウイルスは、アデノウイルスに対する幾つかのリンパ腫細胞を除き、ほぼ全ての細胞型に感染することができる。アデノウイルスは、非増殖性の初代細胞での遺伝子発現を研究するのに最も良好な系であり、形質転換細胞及び初代細胞から得られた結果間の直接比較を可能にする。
３．アデノウイルスは、効果的に増殖でき、高い力価を有する。アデノウイルス系は、１０１０〜１０１１ＶＰ／ｍｌＬの力価を生じさせることができ、濃縮後に最大１０１３ＶＰ／ｍＬになることができる。したがって、この機能は、遺伝子治療を非常に好適にする。
４．アデノウイルスは、ヒトの遺伝子と相同である。ヒトウイルスは、一般にベクターとして用いられ、ヒト細胞は、アデノウイルスベクター系の宿主として用いられ、これは正確な翻訳後プロセッシング及びヒトタンパク質の適切なフォールディングのための理想的な環境を提供する。殆どのヒトタンパク質は、高い発現レベルを達成でき、完全に機能される。
５．アデノウイルスは、染色体に組み込まれず、挿入後に変異原性を引き起さない。レトロウイルスは、宿主の染色体にランダムに組み込まれ、遺伝子の不活性化又は癌遺伝子の活性化を引き起こす。しかしながら、アデノウイルスは、卵細胞を除く殆ど全ての公知の細胞の染色体に組み込まれないため、宿主における他の遺伝子を妨害しない。アデノウイルスの単一コピーで組み込まれた卵細胞は、特定の特性を有するトランスジェニック動物を作製するための優れた系である。
６．アデノウイルスは、懸濁培養培地で増幅されることができる。２９３細胞は、懸濁培養によって調整されることができるため、アデノウイルスの大幅の増幅を可能にする。２９３細胞の懸濁液が、１〜２０Ｌのバイオリアクターにおいて組換えタンパク質を発現することができることが多数の事実によって示されている。
７．アデノウイルスは、複数の遺伝子を同時に発現させる能力を有する。これは、同じ細胞株又は組織において複数の遺伝子を発現するように設計された最初の発現系である。発現系の構築のための最も簡単な方法は、２つの遺伝子を含む二重発現カセットをアデノウイルス導入ベクターに挿入する、又は目的の細胞株を異なる組換えウイルスでそれぞれコトランスフェクトし、タンパク質を発現させることを含む。個々の組換えタンパク質の相対的な同時発現は、異なる組換えウイルスのＭＯＩ比を決定することにより正確に推定されることができる。
本開示の実施形態によれば、前記免疫エフェクターは、ＰＤ−１遺伝子をアンタゴナイズする阻害配列、ＰＤ−Ｌ１遺伝子をアンタゴナイズする阻害配列、ＣＴＬＡ４遺伝子をアンタゴナイズする阻害配列、Ｔｉｍ−３遺伝子をアンタゴナイズする阻害配列、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、及びＧＭ−ＣＳＦ、又はこれらの因子の融合発現形態からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含む。プログラム死１（プログラム死受容体１、ＰＤ−１）は、ＣＤ２８スーパーファミリーのメンバーに属する重要な免疫抑制分子であり、本来、アポトーシスのマウスＴ細胞ハイブリドーマ２Ｂ４．１１からクローン化される。ＰＤ−１は、Ｔ細胞表面の重要な阻害分子であり、その細胞内ドメインは、免疫受容体チロシン阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）及び免疫受容体チロシン導入モチーフ（ＩＴＳＭ）を含む。ＩＴＳＭは、タンパク質チロシンホスファターゼファミリーホスファターゼの会合及びＴ細胞活性化シグナルの阻害を媒介する。ＩＴＳＭのリガンドは、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２であり、主に、免疫系の免疫応答時の腫瘍微小環境におけるＴ細胞の活性化を阻害することにおいて大きな役割を果たす。プログラム細胞死１リガンド（ＰＤ−Ｌ１）は、分化のクラスター２７４（ＣＤ２７４）又はＢ７ホモログ（Ｂ７ホモログ１、Ｂ７−Ｈ１）としても知られ、ＣＤ２７４遺伝子でコードされる体内のヒトタンパク質である。ＰＤ−Ｌ１は、腫瘍細胞微小環境における様々な腫瘍細胞及び造血細胞で誘導的に発現され、その発現レベルは、幾つかの腫瘍の悪性度と正の相関がある。ＰＤ−１抗体及びＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１への結合を遮断することができる。しかしながら、組織内の腫瘍細胞は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路によって免疫系から逃れることができる。ＣＴＬＡ−４の略である細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質−４は、Ｔ細胞の表面に発現される副刺激分子の一種である。ＣＴＬＡ−４は、ＡＰＣの表面におけるＣＤ８０／ＣＤ８６に特異的に結合することができ、ＣＤ２８の機能と同様に、Ｔ細胞の活性化中に下流シグナルを活性化する。研究によって、Ｔ細胞の中でＣＴＬＡ−４を主に発現する細胞は、細胞性免疫を負に調節するＴ細胞のクラスである調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）であることが見出された。ＣＴＬＡ−４受容体の非存在下では、マウスはＴ細胞の過剰発現を示し、それによって重度の自己免疫疾患を伴う。上記の結果は、Ｔｒｅｇがその機能を発揮するにはＣＴＬＡ−４が必要であることを示す。更に、ＣＴＬＡ−４は、ｃｏｎＴ細胞においても発現され、Ｔ細胞活性化のシグナル伝達を阻害する役割を果たす。Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有分子（ＴＩＭ）遺伝子ファミリーは、２００１年にＭｃｌｎｔｉｒｅがマウス喘息感受性遺伝子を求めて発見された新規遺伝子ファミリーであり、ゲノム解析及びポジショナルクローニングにより更に特定される。ＴＩＭファミリー遺伝子は、免疫グロブリンＶ領域及びムチン領域を含む。Ｔｉｍ−３はＴＩＭファミリーの重要なメンバーであり、活性化Ｔｈ１細胞の表面に負の調節分子を発現する。現在、ＴＩＭ３はＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｒｅｇ、ＮＫ細胞、及び他のリンパ球サブセットで発現されていることが分かっている。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、マクロファージ、Ｔ細胞、ＮＫ細胞などによって分泌される単量体糖タンパク質サイトカインであり、幹細胞を刺激して、顆粒細胞（好中球、好酸球、好塩基球、単球）を生成する。ＧＭ−ＣＳＦは、好中球の移動の阻害や細胞表面上の受容体の発現の変化など、免疫系の成熟細胞においても影響を及ぼす。この因子は、マクロファージを活性化することにより真菌感染を阻害することもできる。インターロイキン２（ＩＬ−２）は、白血球と白血球との間、及び白血球と他の細胞との間のサイトカインを媒介することができる。ＩＬ−２は、主に活性化Ｔ細胞によって産生され、オートクリン及びパラクリン的に局所的な標的細胞に作用し、免疫応答に関与する主要なサイトカインであり、それによって顕著な免疫効果を示す。ＩＬ−２はまた、Ｔ細胞の増殖を促進し、サイトカインを産生し、Ｂ細胞の増殖を促進し、Ｉｇを分泌し、マクロファージを活性化し、ＮＫ細胞の活性化及び増殖を促進する。更に、ＩＬ−２には負の調節効果も有し、Ａｇを活性化し、免疫応答の強度を制限し、明らかな免疫損傷を回避するＴ細胞のアポトーシスを誘導することができる。インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）は、抗原刺激に応答して樹状細胞、マクロファージ、好中球、及びヒトＢリンパ芽球（ｎｃ−３７）によって産生されるインターロイキンの一種である。Ｔ細胞刺激因子と呼ばれるＩＬ−１２は、未感作細胞のＴｈ１細胞への分化に関与し、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）及び腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）の産生を刺激する。ＩＬ−１２は、ナチュラルキラー細胞及びＴリンパ球の活性を調節する上で重要な役割を果たす。ＩＬ−１２は、ＮＫ細胞及びＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球の増加した細胞傷害活性を媒介する。ＩＬ−１２は、抗−血管新生活性も有し、新しい血管の形成を遮断することができることを示す。ＩＬ−１２は、ガンマインターフェロン（ＩＮＦ−γ）の産生を増加させるので、タンパク質１０（ＩＰ−１０又はＣＸＣＬ１０）の誘導を増加させ、ＩＰ−１０は抗−血管新生を媒介する。ＩＬ−１２は、免疫応答と抗−血管新生を誘導する能力があるので、潜在的な抗癌薬剤として試験されている。ＩＬ−１５は、活性化された単球−マクロファージ、表皮細胞、線維芽細胞などの様々な細胞によって産生され得る最近発見された因子である。ＩＬ−１５の分子構造はＩＬ−２のものと非常に似ているため、標的細胞へのＩＬ−２受容体のβ鎖とγ鎖の結合に基づいて、ＩＬ−１５は、ＩＬ−２と同様の生物学的活性を発揮することができる。ＩＬ−１５は、Ｂ細胞の増殖と分化を誘導でき、ＩＬ−２を部分的に置換して初期抗体産生を誘導することができる唯一のサイトカインである。ＩＬ−１５は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の増殖を刺激し、ＬＡＫ細胞活性を誘導することができ、ＩＬ−１２と相互作用し、ＮＫ細胞を相乗的に刺激し、それによってＩＦＮ−γを産生することもできる。
組換え細胞
本開示の第３の態様においては、実施形態において、組換え細胞が提供される。本開示の実施形態によれば、前記組換え細胞は、上記に記載される発現系を含む。本開示の実施形態に係る組換え細胞は、人体の全身性免疫応答を効果的に活性化し、腫瘍細胞などの異種細胞を高い安全性及び特異性で攻撃することができる。
本開示の実施形態によれば、前記発現系の少なくとも一部は、前記組換え細胞のゲノムに組み込まれる。前記組換え細胞のゲノムが複製すると、前記発現系は、複製し、前記発現系は、前記目的のタンパク質の発現を一定且つ効果的に調節することができる。
医薬の調製における使用
本開示の第４の態様においては、実施形態においては、癌の治療のための医薬の調製における、上記発現系、上記組換えウイルス、及び上記組換え細胞の使用が提供される。本開示に記載される発現系は、目的のタンパク質を腫瘍細胞で特異的に発現させることができる。本開示の実施形態に係る薬剤は、より効果的、特異的、及び安全な方法で、癌を治療することができる。この実施形態においては、本発明者らは、合成生物学の概念に従って、アデノウイルス転写に関連する重要な遺伝子Ｅ１Ａの発現を調節するために、複数の標的に応答した遺伝子回路を設計した。同時に、そのような同時発現は、全身性免疫応答に関連するサイトカイン又は抗体遺伝子を活性化することができる。第一に、本発明者らによって設計された遺伝子回路は、従来の腫瘍溶解性アデノウイルスとは異なり、アデノウイルスのパッケージングを複数のレベルで調節できる。第１の工程においては、本発明者らによって、腫瘍−特異的プロモーターが用いられ、遺伝子回路においてマスタースイッチＧａｌ４ＶＰ１６の発現を調節する。第２の工程においては、遺伝子回路におけるｍｉｃｒｏＲＮＡの標的配列は、異なる細胞株におけるｍｉｃｒｏＲＮＡの発現に応じて、非腫瘍細胞から腫瘍細胞を区別することができる。第３の工程においては、安定した相互抑制スイッチが、細胞特異的プロモーター及びｍｉｃｒｏＲＮＡシグナルなどの外部入力シグナルに効率的に応答することができる本発明者らによって設計された遺伝子回路で用いられ、前記遺伝子回路は、入力シグナルの差を更に拡大することができ、非腫瘍細胞から腫瘍細胞を区別することにおいてより効率的であることができる。第４の工程においては、本発明者らによって設計されたアデノウイルスベクターにおける発現系は、アデノウイルスＥ１Ｂ遺伝子を含まず、Ｅ１Ｂ遺伝子は、正常細胞内のＰ５３遺伝子と相互作用し、正常細胞における成功した（ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ）アデノウイルスの増殖を保証することができる。Ｅ１Ｂ遺伝子を有さないアデノウイルスは、Ｐ５３を発現する正常細胞では増殖できないが、一方Ｐ５３遺伝子を欠く腫瘍細胞では更に効率的に増殖することができる。したがって、実施形態におけるアデノウイルスベクターは、マルチレベル調節により、従来の腫瘍溶解性アデノウイルスよりも、より特異的で安全である。更に、この操作されたアデノウイルスは、実施形態において様々なサイトカイン及び抗体を発現する遺伝子を有するためのベクターとして用いられる。したがって、アデノウイルスは、腫瘍溶解性効果を示すだけでなく、同時発現因子を使用することにより、全身性免疫応答を活性化することもでき、腫瘍溶解性アデノウイルスの有効性を改善する。
具体的には、本出願は、遺伝子回路を構築して、合成生物学的手段により肝細胞癌細胞における腫瘍溶解性アデノウイルスの特異的発現及びパッケージングを調節する。腫瘍溶解性の有効性を有することを除いて、本発明者らによって構築されたアデノウイルスは、体内で免疫応答を活性化できるサイトカインを発現する遺伝子もローディングされている。一度発現したそのようなサイトカインは、腫瘍の成長を阻害する免疫応答を刺激して腫瘍を治療することができる。本出願で設計された発現系は、以下のように大きな革新と技術的利点を有する。
効率的で安全：本出願で設計された遺伝子回路は、複数のレベルで癌細胞から正常細胞を区別するバイオマーカーに応答することができ、異なる細胞でアデノウイルスの複製を調節する相互抑制的閉ループ遺伝子回路を含み、それによって遺伝子発現ノイズの効果を低減しながら、異なる細胞株における微小環境により高感度に反応することができる。
効率的：本出願における遺伝子回路には、種々のサイトカイン及び／又は抗体を発現する遺伝子がローディングされているため、目的の細胞で効果的な免疫応答を誘導することができる。
遺伝子回路のモジュール化：遺伝子回路に関与するバイオマーカーは、モジュールにモジュール化され、それぞれ、異なる疾患に対するバイオマーカーを含む異なるモジュールライブラリーにモジュール化され、それによって、関連モジュールを迅速にアセンブルすることにより、疾患固有の遺伝子回路を構築することができる。
正確さ：発明者らは、迅速なアセンブリ技術に基づいて様々な腫瘍マーカーを置き換えることができるため、正確な処置のために、異なる患者に向けた遺伝子回路を設計することができる。
本開示の実施形態によれば、前記癌は、肝癌、肺癌、結腸直腸癌、メラノーマ、乳癌、又は前立腺癌を含む。本発明者らは、本開示の実施形態における薬剤は、肝癌、肺癌、結腸直腸癌、メラノーマ、乳癌、及び前立腺癌におけるより顕著な治療効果を有することを見出した。
本開示の具体的な実施形態によれば、本発明者らは、異なる腫瘍細胞株におけるｍｉｃｒｏＲＮＡの発現が表１に示されることを見出した。上向きの矢印は、正常細胞と比較して癌細胞で高く発現されるｍｉｃｒｏＲＮＡを示す、下向きの矢印は、正常細胞と比較して癌細胞で低く発現されるｍｉｃｒｏＲＮＡを示す。
Figure 0006961788
発現系を用いて目的のタンパク質を発現させる方法
本開示の第５の態様においては、実施形態において、発現系を用いることによって目的のタンパク質を発現させる方法が、提供される。前記発現系は、上記に記載される発現系である。本開示の実施形態によれば、前記方法は、（１）前記目的のタンパク質をコードする核酸配列を含む第５の核酸分子を提供することと；（２）第１０の核酸分子によって、第２の調節タンパク質の発現を阻害し、前記目的のタンパク質を発現させることと、を含む。実施形態において発現系を用いて目的のタンパク質を発現させる方法を用いて、前記第１のプロモーターにおける前記第２の調節タンパク質媒介抑制メカニズムが解放され、それによって前記目的のタンパク質は、前記細胞特異的プロモーター及び前記第１のプロモーターの相互作用下で特定の細胞で効果的に発現される。
本開示の実施形態によれば、発現は、細胞内で行われる。前記細胞は、目的のタンパク質の発現のための微小環境を提供できるため、前記目的のタンパク質をより効率的に細胞内で発現させることができる。
本開示の実施形態によれば、前記第１０の核酸分子は、前記第２のｍｉｃｒｏＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列を含み、前記方法は、工程（２）において、前記第２のｍｉｃｒｏＲＮＡを前記第１０の核酸分子に接触させることを更に含む。ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、約２０〜２４個のヌクレオチドを有する内在性小型ＲＮＡのクラスであり、幾つかのｍｉＲＮＡは１つの同じ遺伝子を調節することができる。遺伝子の発現は、幾つかのｍｉＲＮＡの組合せによって細かく調節されることができる。ｍｉｃｒｏＲＮＡは、約３００〜１０００塩基の長さのものである原形におけるｐｒｉ−ｍｉＲＮＡと；前記ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡのプロセシングにより形成され、約７０〜９０塩基の長さのものである、ｍｉｃｒｏＲＮＡ前駆体の形態であるｐｒｅ−ｍｉＲＮＡと；Ｄｉｃｅｒを用いて前記ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの切断（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）によって生成される約２０〜２４ｎｔの成熟ｍｉＲＮＡと、を含む多くの形態を有する。ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）は、標的遺伝子の発現を阻害する。標的遺伝子のｍＲＮＡにおけるｍｉｃｒｏＲＮＡ−ＲＩＳＣの効果は、３つの方法で行われるｍｉｃｒｏＲＮＡ−ＲＩＳＣと標的遺伝子転写配列との間の相補度に常に大きく依存してきた。第１の方法では、標的遺伝子のｍＲＮＡ分子が切断され、即ち標的遺伝子に対して完全に相補的なｍｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡのものと密接に類似したメカニズムと機能を有する）が切断される。植物においては、標的遺伝子のｍｉＲＮＡの多くが上記の方法で切断され、ｐｏｌｙ（Ａ）を有さない分子は３’末端にウラシル（Ｕｓ）が追加され、急速に分解されるが、ｐｏｌｙ（Ａ）を有する分子は一定期間安定して存在できる（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｍｉＲ−１７１など）。現在、これらの遺伝子がｍｉＲＮＡのターゲットであるかどうかは不明であるが、１つのｍｉＲＮＡが、植物における３つの潜在的な標的遺伝子に対して完全に相補的であることが分かっている。しかしながら、ｍｉＲＮＡが潜在的な標的に対して完全に相補的であり得ることが初めて見出され、ｍｉＲＮＡがｓｉＲＮＡと同様のメカニズムを有することできることが示唆されている。第２の方法では、標的遺伝子の翻訳が阻害される。ｍｉＲＮＡは、標的遺伝子に完全に相補的ではないので、ｍＲＮＡの安定性に影響を与えることなく、標的遺伝子の翻訳を阻害する。このようなｍｉＲＮＡは、線虫ｌｉｎ−４のように最も広く発見されているｍｉＲＮＡであるが、植物におけるｍｉＲＮＡの殆どは、このようにして標的遺伝子を阻害しない。第３の方法は、結合阻害を指し、即ち上記の２つの方法で２つのメカニズムを組み込む。ｍｉＲＮＡが標的遺伝子に完全に相補的である場合、直接切断される。ｍｉＲＮＡが標的遺伝子に完全に相補的でない場合、遺伝子発現の調節に関与する。
本開示の第６の態様においては、実施形態において、発現系を用いることによって目的のタンパク質を発現させる方法が、提供される。前記発現系は、上記に記載される発現系である。本開示の実施形態によれば、前記方法は、（１）第１の目的のタンパク質をコードする核酸配列を含む第８の核酸分子を提供し、第２の目的のタンパク質をコードする核酸配列を含む第５の核酸分子を提供することと；（２）前記第９の核酸分子によって、前記第１の調節タンパク質の発現を阻害し、前記第１の目的のタンパク質を発現させること、又は前記第１０の核酸分子によって、前記第２の調節タンパク質の発現を阻害し、前記第２の調節タンパク質を発現させること、とを含む。実施形態において発現系を用いることによって目的のタンパク質を発現させる方法を用いて、前記第１のプロモーターにおける前記第２の調節タンパク質媒介抑制メカニズムが解放され、それによって前記第２の目的のタンパク質は、前記細胞特異的プロモーター及び前記第１のプロモーターの相互作用下で特定の細胞で効果的に発現される、又は前記第２のプロモーターにおける前記第１の調節タンパク質媒介抑制メカニズムが解放され、それによって前記第１の目的のタンパク質は、前記細胞特異的プロモーター及び前記第２のプロモーターの相互作用下で特定の細胞で効果的に発現される。
本開示の実験的実施形態を以下に詳細に説明する。以下に記載される実施形態は、例示にすぎず、本開示を限定するものとして解釈されるべきではない。実施例において特定の技術又は条件が示されていない場合、それらは当該技術分野の文献に記載されている技術又は条件に従って、又は製品の仕様に従って実施される。製造元によって示されていない使用された試薬又は機器は、全て商業的に得られることができる従来の製品である。
実験材料及び方法
１．細胞培養及びトランスフェクション
ＨＥＫ２９３（２９３−Ｈ）細胞株は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏ．，Ｌｔｄから購入した。ヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２、正常肝細胞Ｃｈａｎｇ及びＨｅｐａ１−６は、ＡＴＣＣから購入した。ヒト肝癌細胞株Ｈｕｈ７は、ＢｅＮａ Ｃｏ．，Ｌｔｄから購入した。細胞を、４．５ｇ／Ｌのグルコース、０．０４５ユニット／ｍＬのペニシリン、０．０４５ｇ／ｍＬのストレプトマイシン、及び１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）を含む高グルコースダルベッコ変法イーグル培地（即ち、ＤＭＥＭ完全培地）で、３７℃、湿度１００％、５％ＣＯ２濃度にて培養した。
細胞トランスフェクションを以下のように行った。高グルコースＤＭＥＭ完全培地０．５ｍＬ中の約７．５×１０４個のＨＥＫ２９３細胞を、２４ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）の各ウェルに播種し、２４時間インキュベートした後、培地を新鮮なＤＭＥＭ完全培地と交換し、Ａｔｔｒａｃｔｅｎｅトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）又はリポフェクタミンＬＴＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をトランスフェクションのために添加した。具体的には、Ａｔｔｒａｃｔｅｎｅを使用したときは、１．５μＬのＡｔｔｒａｃｔｅｎｅを一定量の混合ＤＮＡプラスミドに添加し、室温で１５分間放置し、次いで、対応するウェルに添加した。ただし、リポフェクタミンＬＴＸを使用したときは、適切な量のＰｌｕｓ試薬を混合ＤＮＡプラスミドにまず添加し、室温で５分間放置し、次いで、１．２５μＬのリポフェクタミンＬＴＸを添加し、更に２５分間室温で放置してから、２４ウェルプレートに移した。トウモロコシユビキチンプロモーター（ＵＢＩ）と、ＵＢＩとＮＯＳとの間にタンパク質コード配列を有しないＮＯＳターミネーターとを含むｐＤＴ７００４（ｐＵＢＩ−リンカー−ＮＯＳ）を使用して、異なる実験群のプラスミドＤＮＡの量が等しくなるようにした。トランスフェクション後の細胞を４８時間培養した後、フローサイトメトリー分析又はサイトカイン検出に関連する幾つかの実験を行った。
２．アデノウイルスベクター
この実施例では、２つの初期アデノウイルスベクター配列を用いる。即ち、ＶｉｒａＰｏｗｅｒＴＭ Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ＧａｔｅｗａｙＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｋ４９３００ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＡｄｅｎｏ−Ｘ−Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ Ｓｙｓｔｅｍ ３（６３２２６６ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）である。これらの２つのアデノウイルスベクターの構造をそれぞれ図１と図２に示す。
３．プラスミド構築
トランケートされたＡＦＰプロモーター誘導体に関連するプラスミドを構築した。ＡＦＰエンハンサー及びＡＦＰプロモーター配列は、ＰＣＲ増幅を介して、特異的に設計されたＰＣＲプライマーの下で肝癌細胞株のゲノムから直接得た。ＡＦＰプロモーター配列の点突然変異は、オーバーラップエクステンションＰＣＲ法を使用して取得した。ＡＦＰエンハンサー及びＡＦＰプロモーター配列は、エントリークローン中に構築され、エントリークローンの両端に特異的に設計されたＬＲクロナーゼの認識配列が存在する。特異的プロモーターと活性化遺伝子Ｇａｌ４ＶＰ１６は、ＬＲ反応により１つの同一ベクター中に構築した。ｍｉｃｒｏＲＮＡの標的配列は、プライマーアニーリング、酵素消化、及びライゲーションによりＣＭＶ−ＥＹＦＰベクター（ＸｂａＩ／ＳａｌＩ）に挿入した。発現系の一次エレメントライブラリーは、ゴールデンゲート法によって構築した。タイプＩＩｓ制限酵素（例えば、ＢｓａＩ、ＢｂｓＩ、ＢｓｍＢＩ、ＳａｐＩなど）は、その認識部位が非パリンドロームであり且つ対称な配列であり、その切断部位が認識部位の外側に位置する特定のクラスの制限酵素である。これは、その認識部位がパリンドロームであり且つ対称な配列であり、その切断部位が認識配列と重複している分子生物学で最も一般的に使用されるタイプＩＩ制限酵素とは異なる。したがって、タイプＩＩｓ制限酵素によって消化された２つのフラグメントを後続の消化及びライゲーション反応でライゲーションすると、以前あった認識部位が存在しないため再度は切断されることがなく、接続（ｗｅｌｄｉｎｇ）の効果が得られる。ゴールデンゲートクローニング法では、タイプＩＩｓ制限酵素の特性により、異なる切断部位配列が認識配列の外側に人工的に設計される。これにより、１つの同一のタイプＩＩｓ制限酵素が異なる付着末端を生成することができるので、複数のフラグメントを一度に組み立てることを確実にし、複数の異なる制限酵素を使用するなどの、従来のマルチフラグメントアセンブリの欠点を克服する。このゴールデンゲートクローニング法の最大の特徴は、従来の消化連結法と比較して、更なる「傷跡（ｓｃａｒ）」が導入されず、ＤＮＡフラグメントのシームレスな連結が達成されることである。この実施例の一次エレメントライブラリーで使用されるタイプＩＩｓ制限酵素は、Ｅｓｐ３Ｉである。発現系の２番目の論理回路ライブラリーも、ＩＩｓ型制限酵素ＢｓａＩを使用して、ゴールデンゲート法によって構築した。次に、ゲートウェイ（Ｇａｔｅｗａｙ）法によりＶｉｒａＰｏｗｅｒＴＭ Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ＧａｔｅｗａｙＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔのアデノウイルスベクター配列に２番目の論理回路を挿入した、又はギブソン（Ｇｉｂｓｏｎ）クローニングによりＡｄｅｎｏ−Ｘ Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ Ｓｙｓｔｅｍ ３のアデノウイルスベクター配列に挿入した。ゲートウェイ技術は、ＢＰ及びＬＲ反応からなる、十分に研究されたファージλ部位特異的組換え系（ａｔｔＢ×ａｔｔＰ→ａｔｔＬ×ａｔｔＲ）に基づく。ＢＰ反応は、ａｔｔＢ ＤＮＡフラグメント又は発現クローンと、ａｔｔＰドナーベクターとの間の組換え反応であり、エントリークローンを作成する。ＬＲ反応は、ａｔｔＬエントリークローンとａｔｔＲ宛先ベクターとの間の組換え反応であり、並行反応における１以上の宛先ベクターに目的の配列を挿入するために使用される。本発明者らは、この実施例においてＬＲ反応を使用した。「ギブソンサーモスタットワンステップアセンブリ法」としても知られるギブソンアセンブリ技術は、米国のＪ．ＣｒａｉｇＶｅｎｔｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅでギブソンらによって作成されたＤＮＡアセンブリ法であり、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、及びリガーゼの相乗効果の下で、重複する末端配列を有する複数のＤＮＡフラグメントがｉｎ ｖｉｔｒｏで組み立てられる。中でも、Ｔ５エキソヌクレアーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有し、ＤＮＡフラグメントの一方の鎖の５’末端から重複末端配列を有するＤＮＡフラグメントを切断し、相補鎖の３’末端に重複配列を有するオーバーハング末端を生成する。この相補鎖は、５０℃で特異的にアニーリングされ（この温度で、Ｔ５エキソヌクレアーゼは徐々に不活性化される）、最後に、ＤＮＡポリメラーゼとＴａｑリガーゼの存在下で完全なＤＮＡ分子が形成され、シームレスなアセンブリが達成される。
４．細胞ＲＮＡ抽出、逆転写、及び定量的ＰＣＲ反応
細胞ＲＮＡはＴｒｉｚｏｌ法により抽出した。１ｍＬのＴｒｉｚｏｌを遠心分離によりペレット化した５×１０６個の細胞に添加した後、ピペットで繰り返しピペッティングする又は激しく振とうして細胞を溶解した。１５〜３０℃の室温で５分間放置した後、０．２ｍＬのクロロホルムを添加し、混合物を１５秒間激しく振とうし、室温で更に２〜３分間維持し、１２，０００×ｇで４℃にて１５分間、遠心分離した。０．５ｍＬのイソプロパノールを、分離した上部の水層に添加し、室温で１０分間放置し、１２，０００×ｇで４℃にて１０分間、遠心分離した後、１ｍＬの７５％エタノールを添加し、ボルテックスし、７５００×ｇで４℃にて５分間、遠心分離した。上清を廃棄し、沈殿したＲＮＡを室温で自然乾燥させた。乾燥したＲＮＡをＲＮａｓｅフリー水に溶解させた。ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｒｅｖ． Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ番号／ＩＤ：２０５３１０ ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、逆転写実験を行った。定量的ＰＣＲプライマーは、ｑＡＦＰ ｆｏｒ：ＣＡＡＡＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＣＡＧＴＴＧＡＡＴＧ（配列番号１５）、ｑＡＦＰ ｒｅｖ：ＴＴＣＣＣＣＡＴＣＣＴＧＣＡＧＡＣＡＡＴＣＣ（配列番号１６）、ＧＡＰＤＨ ｆｏｒ：ＡＧＡＡＧＧＣＴＧＧＧＧＣＴＣＡＴＴＴＧ（配列番号１７）、及びＧＡＰＤＨ ｒｅｖ：ＡＧＧＧＧＣＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＣＴＴＣ（配列番号１８）である。蛍光色素は、ＰｏｗｅｒＵｐＴＭ ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＭａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａ２５７４１ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）である。
５．アデノウイルスのパッケージング、精製、及び滴定
高純度のエンドトキシンフリー組換えアデノウイルスプラスミドを抽出した。ＨＥＫ２９３細胞に、線状化したアデノウイルスＤＮＡをトランスフェクトし、これを一晩ＰａｃＩで消化した後、培養培地を完全培地に交換した。培養１週間後に、細胞を培養培地１ｍＬと共に１５ｍＬ遠心管に回収した（培養中の細胞増殖状態に応じて新鮮な培地を添加）。次いで、これを液体窒素による３７℃での３回連続の凍結融解サイクルにより溶解させ、２０００ｒｐｍで５分間、遠心分離した。上清を一次ウイルス溶液として得た。連続する３世代のトランスフェクション後、得られたアデノウイルスを増幅のために１０枚の１５ｃｍプレートに播種し、ＣｓＣｌ密度勾配遠心分離と透析との組合せにより更に精製した。ＣｓＣｌ密度勾配は、１．４ｇ／ｍＬの密度のＣｓＣｌ溶液２ｍＬを添加し、更に１．３ｇ／ｍＬの密度のＣｓＣｌ溶液３ｍＬをゆっくりと添加した後、５ｍＬのウイルス懸濁液を添加することにより調製した。２００００ｒｐｍ、４℃にて１０時間の遠心分離後、１．３ｇ／ｍＬ〜１．４ｇ／ｍＬの密度のＣｓＣｌ溶液に濃縮されたアデノウイルスを透析バッグに回収し、使用前に１０分間、１０ｍＭ ＥＤＴＡ−Ｎａ２で煮沸した。透析バッファーは、５０ｇのスクロース、１０ｍＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、及び２ｍＬの１Ｍ ＭｇＣｌ２を使用して調製し、水で１Ｌにし、ｐＨ８．０に調整する。４℃で一晩攪拌し、透析バッファーを２回交換した後、ウイルス力価の測定のためにアデノウイルスを回収した。ウイルス力価は、感染細胞から抽出されたウイルスＤＮＡを定量することにより検出した。具体的には、約２×１０６のＨｅＬａ細胞／ウェルを６ウェル組織培養プレートに播種し（インキュベーション１日間後に細胞被覆率が９０〜１００％に達する）、無血清培地５００μＬで希釈したウイルスストックの５μＬにて２連で感染させた後、３７℃で３〜６時間インキュベートし、培養培地を除去し、１ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した。５００μＬの新鮮なＮＰ−４０溶解バッファー（０．６５％ＮＰ−４０（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０を含む）を添加し、室温で５〜１０分間インキュベートすることにより細胞を溶解した。ここで、完全に溶解するために１０〜１５回ピペッティングした後、ウイルス沈殿のために２０００×ｇで３分間、遠心した。上清を廃棄した後、１ｍＬのＮＰ−４０溶解バッファーを添加し、短時間ボルテックスして、２０００×ｇで３分間、遠心分離した。上清を再び廃棄し、沈殿物を２００μＬのＰＢＳに懸濁した。ＤＮＡの単離及び精製中に、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用してＤＮＡを抽出し、その後の定量反応に使用した。定量プライマーは、Ｌ２フォワードプライマー：ＴＴＧＴＧＧＴＴＣＴＴＧＣＡＧＡＴＡＴＧＧＣ（配列番号１９）、及びＬ２リバースプライマー：ＴＣＧＧＡＡＴＣＣＣＧＧＣＡＣＣ（配列番号２０）である。
標準曲線を作成した。ＰＣＲ Ｌ２標的配列をＴベクター中に構築し、これを、標準配列として１×１０９〜１×１０２コピー／μＬに希釈した。希釈式は次のように示される：［プラスミド濃度（μｇ／μＬ）×アボガドロ数×１０ ６ ］／［ヌクレオチド数×１ｂｐ分子量］＝粒子コピー／μＬ
６．細胞実験
アデノウイルスを、各種細胞に対する認識能力と殺滅能力について検出した。Ｃｈａｎｇ細胞（１×１０４細胞／ウェル）、ＨｅｐＧ２及びＨｕｈ７細胞（それぞれ５×１０４細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに播種し、１０２〜１０−４に１０倍希釈された７種の感染多重度（ＭＯＩ）勾配でアデノウイルスベクターに感染させた。ここで、６日間の観察後に、ＭＴＳ法にて細胞生存率を測定した。
７．ＭＴＳ検出
細胞数はＭＴＳ法で測定した。２０μＬのＭＴＳ／ＰＭＳ混合物（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、試験対象細胞を含む９６ウェルプレートの各ウェルに添加した後、混合し、３７℃で１〜４時間インキュベートした。発色後、プレートを１０秒間振とうして均一な色を得た。マイクロプレートリーダーを使用して、４９０ｎｍの波長での吸光度（ＯＤ値）を測定した。標準曲線を確立した。目的細胞の数は、標準曲線を参照して検出した。
８．サイトカイン検出
サイトカインの生物活性は、サイトカイン依存性細胞株の増殖を介して検出できる。ＩＬ−２、ｍＧＭ−ＣＳＦ、及びｈＧＭ−ＣＳＦの生物学的活性は、それぞれＣＴＬＬ−２、ＦＤＣ−Ｐ１、及びＴＦ−１細胞株を使用して検出した。回収後、１×１０４個の試験対象のサイトカイン依存性細胞を９６ウェルプレートに播種し、試験対象のサイトカインを含むサンプルを感染させ、３７℃で２４時間又は４８時間、恒温培養した。増幅した細胞をＭＴＳ法により測定した。用量増殖標準曲線を確立した。測定したサンプル中のサイトカインの生物活性は、標準曲線を使用して推定した。
９．共免疫沈降アッセイ
共免疫沈降は、以下のようにして行った。適切な量のタンパク質溶解バッファー（Ｂｉｙｕｎｔｉａｎ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を、試験対象の回収した細胞に添加し、遠心分離して細胞片を除去した。後続のウエスタンブロット分析のために、少量のタンパク質溶解バッファーを残した。残りのタンパク質溶解バッファーと、対応するタグ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．、Ｌｔｄ．）をコンジュゲートさせた１０〜３０μＬのプロテインＡ／Ｇ−アガロースビーズとを、得られた細胞溶解物に添加し、軽く振とうしながら４℃で一晩インキュベートした後、遠心分離して上清を除去した。沈殿したビーズを３回洗浄した後、溶離液を使用して抗体及び捕捉されたタンパク質をアガロースビーズから溶出し、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファー（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓｈｅｎｇｇｏｎｇ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を添加して煮沸した。関連タンパク質の濃縮は、ウエスタンブロット法によって検出した。
１０．動物試験
実験動物は、ＨｕａｆｕＫａｎｇ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．又はＷｅｉｔｏｎｇｌｉｈｕａ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入した。腫瘍モデルは、ＳＰＦ環境で飼育された６週齢の雄又は雌のマウスを使用して構築した。ヒト腫瘍モデルでは、６週齢のヌードマウスの右側腹部にマトリゲル（ＢＤ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）中の１×１０７個のヒト肝癌細胞ＨｅｐＧ２を皮下注射した。マウス腫瘍モデルでは、１×１０６個のマウス肝癌細胞Ｈｅｐａ１−６を、６週齢の野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの右側腹部に皮下注射した。皮下腫瘍サイズは、３日ごとにノギスで測定し、次の式を使用して計算した：体積＝０．５×長さ×幅２。腫瘍体積が１００ｍｍ３を超えた後、腫瘍溶解性アデノウイルス又は対照処置を行った。動物実験倫理の要求にしたがって、腫瘍サイズが直径１５ｍｍに到達後、担腫瘍マウスを安楽死させた。
実験結果
１．合成生物学の使用によって癌細胞を非癌細胞から区別する各種バイオマーカーに対応する相互抑制スイッチの構築
近年、関連する研究により、腫瘍溶解性ウイルスが癌の治療に非常に有効であり、腫瘍溶解性アデノウイルスに関する多くの臨床研究が開発されていることが示されている。既存の臨床研究結果によると、腫瘍溶解性アデノウイルスのリークの割合が比較的高いので、臨床段階で腫瘍溶解性アデノウイルスの安全性をいかにして改善するかが重要な課題である。既存の腫瘍溶解性アデノウイルスの分析に基づくと、大部分の腫瘍溶解性アデノウイルスは、アデノウイルス複製の鍵となる遺伝子Ｅ１の発現を調節する腫瘍特異的プロモーターなど、単一のバイオマーカーに応じて調節される。しかし、１つのバイオマーカーだけが、比較的高いリーク確率を引き起こすことがある。したがって、本発明者らは、この実施例において、各種バイオマーカーに対応する相互抑制スイッチを設計し、様々なレベルでアデノウイルスＥ１Ａ遺伝子の発現を調節することにより、認識に対する腫瘍溶解性アデノウイルスの特異性を改善し、安全性を向上させた。
図３に示すように、相互抑制スイッチは、次の特徴を有する。腫瘍特異的プロモーター（ｐＣ）は、相互抑制スイッチのマスターアクチベーターを調節する。マスターアクチベーターは、アクチベーター応答プロモーター（ｐＡｃｔ）に作用して、下流遺伝子の発現を調節する。相互抑制スイッチの第１の側は、アデノウイルスパッケージング関連Ｅ１Ａ遺伝子、エフェクター、リプレッサーａ（Ｒｅｐ−ａ）、及び非腫瘍細胞で高度に発現したｍｉｃｒｏＲＮＡａ（ｍｉＲＮＡａ）の標的配列を発現する。これは更に、第２の側に発現するリプレッサーｂの認識配列を含み、リプレッサーｂの認識配列は、第１の側の第１のプロモーターの両側にそれぞれ位置する。相互抑制スイッチの第２の側は、リプレッサーｂ（Ｒｅｐ−ｂ）並びに腫瘍細胞で高度に発現するｍｉｃｒｏＲＮＡｂ（ｍｉＲＮＡｂ）の標的配列を発現し、これは更に、第１の側で発現するリプレッサーａの認識配列を含み、リプレッサーａの認識配列は、第２の側の第２のプロモーターの両側にそれぞれ位置する。腫瘍細胞では、腫瘍特異的プロモーター（ｐＣ）は、系全体の発現を開始する。リプレッサーｂは、腫瘍細胞でのｍｉＲＮＡｂの高発現とｍｉＲＮＡａの低発現によるＲＮＡ干渉を介して分解されるので、第１の側の遺伝子発現に対するリプレッサーｂの阻害は排除される。更に、リプレッサーａの高発現は、リプレッサーｂの発現を更に抑制でき、相互抑制スイッチが迅速且つ効率的にＥ１Ａ発現状態に切り替わることを可能にし、それによってアデノウイルスのパッケージングとエフェクターの発現を開始する。反対に、相互抑制スイッチが非腫瘍細胞に入ると、腫瘍特異的プロモーター、ｍｉＲＮＡマーカー、及び論理回路の組合せによりＥ１Ａ及びエフェクターが発現できなくなり、アデノウイルスのパッケージングプロセスが効果的に閉じられ、特異性と、この論理回路の安全性とが保証される。したがって、このような相互抑制スイッチは、様々な入力信号に応答でき、転写レベル及び転写後レベルで標的細胞を非標的細胞と区別することができる。また、本発明者らが提案する本発現系は、Ｅ１Ｂ遺伝子が除去されたＥ１Ａ遺伝子のみを発現できるので、機能欠損の補完の観点から、標的細胞に対する腫瘍溶解性ウイルスの認識能力を向上させる。したがって、本発明者らによって設計された発現系は、アデノウイルスの安全性を効果的に改善しながら、複数のレベルで標的細胞を区別することができる。
２．肝癌細胞と正常細胞を区別するバイオマーカーの検証と分析
２．１肝癌特異的アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーターの構築
アルファ−フェトプロテイン（αＦＰ又はＡＦＰ）は、主に胎児の肝臓で合成され、健常な成人では発現しないが、肝細胞が癌になると再び発現し、肝癌の進行に伴って血清中のＡＦＰ量は劇的に増加する。現在、アルファ−フェトプロテインは、原発性肝癌の診断のための特異的臨床指標であるので、本発明者らは、実施例において肝癌細胞を非肝癌細胞と区別するためのプロモーターマーカーとしてアルファ−フェトプロテインプロモーターを選択した。
本発明者らは、実験によりＡＦＰの特異的発現を更に検出した。まず、一連の非肝癌細胞及び肝癌細胞におけるヒトＡＦＰ遺伝子の発現を、ｑＰＣＲ法で検出した。図４に示すように、Ｃｈａｎｇ、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、ＰＬＣ、Ｈｅｐ３Ｂ、及びＨｅｐａ１−６細胞株のＲＮＡをそれぞれ抽出し、これらの細胞におけるＡＦＰ遺伝子の発現レベルを定量的ＰＣＲ法で検出した。ここで、Ｃｈａｎｇ細胞が健常なヒトの肝細胞であり、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、ＰＬＣ、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、及びＨｅｐａ１−６細胞が、マウス肝癌細胞である。結果から、ヒトＡＦＰ遺伝子がＨｅｐＧ２及びＨｕｈ７細胞株で高レベル発現し、ＰＬＣ及びＨｅｐ３Ｂ細胞株で低レベル発現し、マウスＨｅｐａ１−６肝癌細胞で僅かに発現することが示され、本発明者らが、ＡＦＰプロモーターを、その特異的発現により、肝癌細胞のプロモーターマーカーとして使用できることを示唆している。
現在広く使用されているＡＦＰプロモーターは、エンハンサーとプロモーターからなる。エンハンサーは、プロモーターを活性化できる２つの配列、即ち、ドメインＡ（ＤＡ）とドメインＢ（ＤＢ）を含む。プロモーターの効率を高めるために、本発明者らは、プロモーターの位置−１１９のグアニン（Ｇ）をアデニン（Ａ）に変異させた。加えて、本発明者らは、エンハンサー領域を異なる程度にトランケートした。図５に示されるように、ＡＦＰ Ｉは、１．８Ｋｂｐの長さのＡＦＰのエンハンサー配列を含む（配列番号２１に示す）；ＡＦＰ ＩＩは、活性化領域Ａ（ＤＡ）、活性化領域Ｂ（ＤＢ）、及び２つの活性化領域間の配列を含む（配列番号２２に示す）；ＡＦＰ ＩＩＩは、活性化領域Ａ（ＤＡ）及び活性化領域Ｂ（ＤＢ）のみを含む（配列番号２３に示す）；ＡＦＰ ＩＶは、活性化領域Ａ（ＤＡ）のみを含む（配列番号２４に示す）；ＡＦＰ Ｖは、活性化領域Ｂ（ＤＢ）のみを含む（配列番号２５に示す）。ＡＦＰプロモーターの発現効率と特異性を検出するために、これらの５種のＡＦＰプロモーターレポーター系プラスミドを、それぞれ正常な肝細胞Ｃｈａｎｇと肝癌細胞ＨｅｐＧ２に一過性トランスフェクトした。図６の結果から、５種のＡＦＰプロモーターがいずれも、肝癌細胞株で高レベルに発現され、通常発現されるＣＭＶプロモーターの発現レベルを超えることが示される。特異性の分析に基づき、ＡＦＰ ＩＩプロモーターを除く他の４種のプロモーターは、Ｃｈａｎｇ細胞で明らかにリークされて（ｌｅａｋｅｄ）おらず、Ｃｈａｎｇ細胞でのＡＦＰ ＩＩレポーター遺伝子の発現は僅かであった。挿入される配列の長さ、及びプロモーターの効率及び特異性を考慮し、本発明者らは、後続の実験で本相互抑制スイッチを調節するためにＡＦＰ ＩＩＩプロモーターを選択した。
Figure 0006961788
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２．２各種細胞株の発現レベルを検出するためのｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）蛍光プラスミドレポーター系の構築
最近の研究から、腫瘍の形成と成長が、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の発現レベルを大きく変えることが示されている。表１に示すように、各種癌細胞で様々なｍｉｃｒｏＲＮＡが高レベルに発現している。本発明者らは、正常な肝細胞の高発現を特徴付けるｍｉｃｒｏＲＮＡマーカーとしてｍｉＲ１９９ａを選択し、同様に、既知の研究結果の分析に基づき、肝癌細胞の高発現を特徴付けるｍｉｃｒｏＲＮＡマーカーとしてｍｉＲ２１及びｍｉＲ１２２を選択した。まず、本発明者らは、ｍｉｃｒｏＲＮＡ蛍光プラスミドレポーター系を設計、構築した。図７に示すように、本発明者らは、ｍｉｃｒｏＲＮＡの標的配列を、通常発現されるＥＹＦＰの３’非翻訳領域に挿入し、別の通常発現されるＥＢＦＰを蛍光対照として使用した。幾つかの異なる細胞株に、ＥＹＦＰ及びＥＢＦＰ蛍光プラスミドをそれぞれトランスフェクトして、ｍｉｃｒｏＲＮＡ標的配列の発現を検出した。実験結果を図８に示す。これは、ｍｉＲ１９９ａが肝癌細胞株と比較して正常肝細胞で高度に発現している一方で、ｍｉＲ２１は、肝癌細胞株で有意に高い発現レベルを示しているので、ｍｉＲ１９９ａとｍｉＲ２１を、肝癌細胞と正常細胞を区別するために本発明者らが設計した相互抑制スイッチの有効なマーカーとして使用できることを示している。
２．３相互抑制スイッチは、ｍｉｃｒｏＲＮＡ入力信号に効果的に応答し、各種細胞株で安定に機能することができる
腫瘍溶解性アデノウイルスの限られたパッケージング能力（最大８Ｋｂｐの外来遺伝子しかパッケージできない）のため、本発明者らは、この実施例ではできる限り短く有効な阻害エレメントを選択した。本発明者らは、この実施例でＬａｃＩ及びｔｅｔＲ−ＫＲＡＢを選択した。図９に示すように、本発明者らは、ＥＹＦＰ遺伝子がｔｅｔＲ−ＫＲＡＢ側で共発現されるかどうかに応じて２つの論理回路、即ち、ＥＹＦＰを発現しないＳｗｉｔｃｈ Ｉ（ＳＩ）と、ＥＹＦＰを発現するＳｗｉｔｃｈ ＩＩ（ＳＩＩ）を構築した。２つのスイッチを個別にＨＥＫ２９３細胞に一過性トランスフェクトし、それぞれを、ｓｈＲＮＡ−ＦＦ４及びｓｈＲＮＡ−ＦＦ５のそれぞれで共トランスフェクトした。図１０に示すように、これらの２つのスイッチはいずれも、各種入力信号下で効率的に反転できる。ＳＩは、ＬａｃＩ側でより高いレベルで発現するが、ｔｅｔＲ−ＫＲＡＢ側ではＳＩＩよりも高いリークレベルを示す。総合的に考慮した後、本発明者らは、後続の実験で異なるエフェクターを有する本腫瘍溶解性アデノウイルスを構築するためのバックボーンとしてＳＩ系を選択した。これは、ＳＩスイッチ系が、各種入力信号に応答し、目的の細胞中でＥ１遺伝子を効率的に発現することができるからである。実験室での過去の結果に基づいて、本発明者らは、相互抑制スイッチＳＩに対する各種アクチベーターの調節効果を試験した。図１１に示すように、本発明者らは、アクチベーターＧａｌ４ＶＰ１６、Ｇａｌ４ｅｓｎ、ｄＣａｓ９−ＶＰ６４、及びｒｔＴＡの調節効率を試験した。実験結果から、遺伝子回路がこれらの各種アクチベーターに効果的に応答することができ、そのような遺伝子回路の安定性を証明していることが示されている。
２．４ＣＧＧＡ法を用いた腫瘍溶解性アデノウイルスの構築
多くの臨床情報は、腫瘍マーカーの発現が個人によって大きく異なることを示す。したがって、本発明者らは、各個人に異なるマーカーを選択することができる。個々の患者の正確な治療を達成するために、本発明者らは、各種バイオマーカーを有する様々な腫瘍溶解性アデノウイルスを調製する必要がある。しかし、これらの腫瘍溶解性アデノウイルスを従来の酵素消化及びライゲーション法により迅速に構築することは非常に困難である。本実施例において、本発明者らは、３段階ライブラリーを設計、構築し、ＣＧＧＡ法（カスケードゴールデンゲートゲートウェイ／ギブソンアセンブル法）により腫瘍溶解性アデノウイルスを迅速に改変した。まず、癌細胞と正常細胞の区別に関連するマーカーエレメント（例えば、腫瘍特異的プロモーター、論理回路関連抑制エレメント、癌細胞を区別するｍｉＲＮＡ認識配列など）を一次プラスミド上に構築することにより、図１２に示す一次エレメントライブラリーを作製した。一次エレメントの２つの端部にはそれぞれ、ＥＩ（認識部位と切断部位が異なる制限酵素、例えば、Ｅｓｐ３ＩやＢｓａＩなど）の認識部位が挿入され、ゴールデンゲート法により複数の一次エレメントを１つの二次発現系に構築する。発現系は、以下のように構築される。具体的には、複数の一次エレメントが一次エレメントライブラリーから選択され、ゴールデンゲート法によって３つの発現系に組み立てられる。このような３つの発現系は、腫瘍特異的プロモーター系、第１の調節エレメント媒介抑制系、及び第２の調節エレメント媒介抑制系を含む。次いで、図１３に示すように、ゴールデンゲート法によって３つの発現系をランダムに組み立てることにより、完全な論理回路が形成される。更なる実験のために、論理回路の両端に、ギブソン相同配列又はゲートウェイ認識部位（標的配列）が挿入される。最後に、論理回路は、図１４に示すように、ギブソン法又はゲートウェイ法によってアデノウイルスベクター（Ｅ１及びＥ３の一部を除去）に構築される。操作されたアデノウイルスベクターは、ＰａｃＩ消化により線状化され、特定の細胞にトランスフェクトされ、アデノウイルス粒子をパッケージングする。したがって、１以上の腫瘍バイオマーカーを、本発明者らによって置き換えることができる。
２．５細胞レベルでの肝癌細胞の効果的な殺滅に対する腫瘍溶解性アデノウイルスの検出
本発明者らによって構築された腫瘍溶解性アデノウイルスにおける相互抑制スイッチが、肝癌細胞を効果的に区別し、殺滅できるかどうかを検出するために、本発明者らは、腫瘍溶解性アデノウイルスのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞殺滅アッセイを設計した。各種細胞株に、様々な感染多重度で腫瘍溶解性アデノウイルスを感染させた。ここで、Ｃｈａｎｇ細胞は正常な肝細胞であり、Ｈｕｈ７及びＨｅｐＧ２細胞はヒト肝癌細胞株である。細胞の生存率は、インキュベーションの６日後にＭＴＳ法で測定した。図１５に示すように、感染の多重度がそれぞれ１００、１０、１の場合、肝細胞腫細胞は重篤な細胞毒性により重度の死滅を示し、肝癌細胞は０．１の感染多重度において僅かな細胞死を示すことが分かった。同様に、感染多重度が１０以下の場合、Ｃｈａｎｇ細胞は、細胞死を示さずに正常な増殖状態である一方、感染多重度１００では僅かな細胞毒性応答を示し、細胞体積が大きくなり、細胞成長が遅くなった。このデータは、特定の感染多重度の範囲内でパッケージされたアデノウイルスが、正常な肝細胞の成長と増殖に干渉することなく、肝癌細胞を効果的に区別して殺滅できることを示している。
２．６腫瘍溶解性アデノウイルスが有するエフェクターの発現レベルのｉｎ ｖｉｔｒｏ検出
現在臨床診療で使用されているアデノウイルスベクターは、自然界に広く存在するヒトＡｄ２又はＡｄ５型アデノウイルスである。更に、これらのアデノウイルスに拮抗する中和抗体は、人体に存在することが知られている。したがって、臨床データは、アデノウイルス単独の腫瘍溶解効果に依存する腫瘍治療の治療効果が低いことを示した。そのため、本発明者らは、実施例において、腫瘍部位にエフェクター遺伝子を運ぶ送達系として腫瘍溶解性アデノウイルスを使用し、全身性免疫応答を引き起こすようにした。図１６に示すように、本発明者らは、まず、これらのエフェクター遺伝子を高頻度に発現するプラスミドベクターに構築し、一過性トランスフェクションによりこれらのエフェクターの活性を検出した。結果は、本発明者らによって構築されたエフェクター遺伝子が、生物学的機能を有する免疫因子、及び免疫学的チェックポイント遺伝子の抑制因子を効率的に発現できることを示している。本発明者らは、腫瘍溶解性アデノウイルスベクター上でこれらのエフェクター遺伝子を更に構築して、パッケージング及び精製後にこれらのエフェクターを発現できる腫瘍溶解性アデノウイルスを得た。本発明者らは、肝癌細胞ＨｅｐＧ２の感染後、上清を抽出して、上清中の免疫因子の活性を検出した。
一方、本発明者らは、アデノウイルスベクターのエフェクター遺伝子によって発現されるエフェクターの活性も検出した。図１７に示すように、アデノウイルスによって発現されるエフェクターは、経時で効果的に向上される。３種のサイトカインを以下の方法で検出する。図１７（ａ）では、３×１０６個のＨｅｐＧ２細胞を１２ウェルプレートに播種し、ｓｙｎＯＶ−ＥＢＦＰ及びｓｙｎＯＶ−ｍＧＭ−ＳＣＦをそれぞれ感染多重度１０で感染させ、感染後１、２、３、及び４日目に上清を回収した。上清中のマウスＧＭ−ＣＳＦ含有量は、ＥＬＩＳＡキットで検出した。図１７（ｂ）では、３×１０６個のＨｅｐＧ２細胞を１２ウェルプレートに播種し、ｓｙｎＯＶ−ＥＢＦＰ及びｓｙｎＯＶ−ｈＩＬ−２をそれぞれ感染多重度１０で感染させ、感染後１、２、３、及び４日目に上清を回収した。上清を、ＩＬ−２依存性細胞を含む培地に添加し、上清中のＩＬ−２含有量をＭＴＳ法により検出した。図１７（ｃ）では、３×１０６個のＨｅｐＧ２細胞を１２ウェルプレートに播種し、ｓｙｎＯＶ−ＥＢＦＰ、ｓｙｎＯＶ−抗−ＰＤ−１ ｓｃＦｖ、及びｓｙｎＯＶ−抗−ＰＤ−Ｌ１ ｓｃＦｖをそれぞれ感染多重度１０で感染させ、感染後１、２、３、及び４日目に上清を回収した。得られた上清を、１：１０の希釈比で脾臓細胞系（Ｔ細胞活性化のために単離された脾臓細胞に２μｇ／ｍＬの抗マウスＣＤ３抗体を添加することにより生成）に添加し、脾臓細胞系におけるＩＦＮ−γ産生を、４８時間のインキュベーション後にＥＬＩＳＡ法で検出した。
２．７動物実験による腫瘍溶解性アデノウイルスの治療効果の検出
図１８に示すように、１×１０７個のＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、及びＨｅｐａ１−６肝癌細胞をヌードマウスの右側腹部に皮下移植し、３日ごとに皮下腫瘍体積を測定した。ＨｅｐＧ２及びＨｕｈ７細胞はヒト肝癌細胞であり、Ｈｅｐａ１−６細胞はマウス肝癌細胞である。腫瘍体積が１００ｍｍ３を超えた後、マウスをランダムに２つの群に分け、処置群には、１×１０９個の腫瘍溶解性アデノウイルスを腫瘍内注射し、対照群には、ＰＢＳを注射した。処置後の腫瘍体積の変化を継続的に観察した。ＰＢＳを注射した対照群の腫瘍は成長を続け、腫瘍体積が増大していくのに対し、処置群の腫瘍は、腫瘍溶解性アデノウイルスの注射後に有意に抑制されており、腫瘍溶解性アデノウイルスが、腫瘍細胞の溶解によってｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍成長を抑制でき、形成された腫瘍に対する顕著な治療効果を発揮することを示す。マウス肝癌の処置において、本発明者らは、非腫瘍溶解性ウイルス（第二世代アデノウイルスベクター、ＧＦＰ遺伝子含有ウイルス、Ａｄ−ＧＦＰ）を別のウイルス対照として使用した。実験結果から、ＰＢＳ及びＡｄ−ＧＦＰ処置群の腫瘍は成長し続け、腫瘍溶解性ウイルス処置群は腫瘍ＨｅｐＧ２及びＨｕｈ７の成長がある程度抑制され、腫瘍Ｈｅｐａ１−６の成長を僅かに抑制することが分かる。これは恐らく、ＨｅｐＧ２及びＨｕｈ７細胞よりもＨｅｐａ１−６細胞の成長速度が速いことと、Ｈｅｐａ１−６細胞でのＡＦＰの発現レベルが比較的低いことに起因する。したがって、本発明者らは、後続の実験において、免疫エフェクター含有腫瘍溶解性アデノウイルスを使用してＨｅｐａ１−６腫瘍モデルを処置し、非常に効果的な結果を達成した。
担腫瘍マウスを腫瘍溶解性アデノウイルスで２週間又は１ヶ月間処置した後、マウスの様々な臓器の組織サンプルを採取し、ホモジナイズ後にウイルスＤＮＡを抽出した。ウイルス力価はｑＰＣＲ法で検出した。ウイルスは腫瘍細胞でのみ複製され、ウイルス感染後に他の組織に広がらないことが分かる。結果は、ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍溶解性アデノウイルスが高い特異性を有し、正常な組織細胞に対して安全であることを示す。
免疫系を有するＣ５７マウスモデルに対する本腫瘍溶解性アデノウイルスの治療効果を更に実証する。図１９に示すように、１×１０６個のマウス肝癌細胞Ｈｅｐａ１−６を野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの右側腹部に皮下注射した。腫瘍体積が１００ｍｍ３に達した後、各種サイトカインを発現する１×１０９個の腫瘍溶解性アデノウイルスを各群に腫瘍内注射し、ＰＢＳ注射を陰性対照として使用した。処置後の腫瘍体積を観察し、腫瘍を有するマウスの生存期間をカプラン・マイヤー法で分析した。実験結果は、腫瘍溶解性アデノウイルスが依然として腫瘍成長を阻害し、無傷の免疫系を有する担腫瘍マウスの生存期間を顕著に延長できることを示す。一部の担癌マウスは処置後に治癒し、腫瘍は完全に消失した。腫瘍溶解性アデノウイルスによる最初の治療の２ヶ月間後、生存マウスに、１×１０６個のマウス肝癌細胞Ｈｅｐａ１−６を再度接種した。同じマウスに、最初の移植部位から離れた部位に、最初に注射された腫瘍細胞と同じ腫瘍細胞を移植した場合、腫瘍塊を形成できないことが分かる。これらの結果は、腫瘍溶解性ウイルスで処置したマウスが体内の腫瘍細胞に対して特異的な免疫性を生成し、同じ腫瘍細胞が体内で再度成長するのを阻止できることを示す。
腫瘍組織におけるリンパ球浸潤の検出のために、担癌マウスの腫瘍を採取、固定、切片化し、ＨＥ染色した。腫瘍溶解性アデノウイルスで処置されたマウスの腫瘍組織におけるリンパ球浸潤は、ＰＢＳ対照群と比較して有意に増加することが分かり、腫瘍溶解性アデノウイルスの処置が腫瘍組織でより多くのリンパ球を動員できることを示す。これらの結果から、免疫刺激剤の発現が腫瘍溶解性ウイルス療法中の細胞傷害性Ｔ細胞応答を促進できることが示された。腫瘍内の浸潤リンパ球を単離精製し、マウス腫瘍内の浸潤Ｔ細胞の表現型をフローサイトメトリーで検出した。腫瘍溶解性ウイルスで処置したマウスの腫瘍の浸潤Ｔ細胞中でＫｉ−６７＋細胞の割合が高いことが分かり、これは、腫瘍溶解性アデノウイルスによる処置が腫瘍内のＴ細胞の増殖を促進し、より強い免疫応答を引き起こすことを示す。腫瘍浸潤リンパ球を、ＰＭＡ（２０ｎｇ／ｍＬ）及びイオノマイシン（１μｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ １６４０培地に添加し、ブレベドリンＡの存在下で３７℃にて４時間培養した後、細胞を固定及び染色し、フローサイトメトリーでＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞のγ−インターフェロンの発現を検出した。本発明者らは、腫瘍溶解性アデノウイルス処置群の腫瘍におけるＴ細胞でのγ−インターフェロンの発現がより高いことを見出し、これが、腫瘍の免疫微小環境を変化させ、腫瘍細胞の死滅を促進した（図２０（ａ）及び図２０（ｂ）に示す）。
腫瘍溶解性アデノウイルスの処置による全身性抗腫瘍免疫応答
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの左右側腹部に、マウス肝癌細胞Ｈｅｐａ１−６を皮下注射した。腫瘍塊の形成後、サイトカインｈＩＬ−２、ｍＧＭ−ＣＳＦ、及び抗ＰＤ−１ ｓｃＦｖをそれぞれ発現する腫瘍溶解性アデノウイルスを、右側腹部の腫瘍に注射した。対照としてＰＢＳ及びＡｄＧＦＰを注射した。腫瘍成長を継続的に測定した。処置の１４日間後の担癌マウスの左右側腹部の腫瘍における浸潤リンパ球を単離精製し、腫瘍内の浸潤Ｔ細胞の表現型をフローサイトメトリー法により検出した。本発明者らは、Ｋｉ−６７＋Ｔ細胞又はインターフェロン−γを発現しているＴ細胞の割合が、腫瘍溶解性アデノウイルスを右側腹部に注射した腫瘍だけではなく、腫瘍溶解性アデノウイルスを注射しなかった左側腹部の腫瘍においても、対照群に比べて高いことを見出した。腫瘍溶解性アデノウイルスの処置によって引き起こされる免疫応答は、注射部位の腫瘍だけでなく、遠位側の腫瘍でも機能できるが示される。これは、腫瘍溶解性アデノウイルスが注射部位の腫瘍に治療効果があるだけでなく、遠位転移の腫瘍にも治療効果を示すことを示唆する。
同時に、腫瘍溶解性アデノウイルスの処置が生存マウスで有効な全身性免疫応答を生成したかどうかを検出するために、本発明者らは、処置後のマウスに、Ｈｅｐａ１−６を再度、皮下注射した。図２１に示すように、全てのマウスの拒絶率が１００％であることが分かる。
２．８腫瘍溶解性アデノウイルスの処置プロセスのモデリング
図２２に示すように、腫瘍溶解性アデノウイルスの処置プロセスを、非感染腫瘍細胞、感染腫瘍細胞、遊離ウイルス、腫瘍溶解性アデノウイルス抗原活性化免疫細胞、及び腫瘍抗原活性化免疫細胞（これらの５種の成分をＳ、Ｉ、Ｖ、ＺＶ、及びＺＴでそれぞれ表す）を含む腫瘍ウイルス免疫系に抽象化する。モデルは、非感染腫瘍細胞の成長が一般化されたロジスティック成長モデルに適合することを想定しており、γは成長速度を示し、Ｋは収容力を示し、εは非線形性を示す。非感染腫瘍細胞に遊離ウイルスを感染させ、κの割合で感染腫瘍細胞に変換することができる。感染腫瘍細胞は速度δで溶解し、速度αで大量の遊離ウイルスを放出する。遊離ウイルスは、環境内で、速度ωで自然減衰する。ＺＶは、腫瘍溶解性アデノウイルス又はウイルス感染腫瘍細胞の表面抗原の活性化によってそれぞれｃＶ１及びｃＶ２の速度で増加する一方、速度ｐＶで感染腫瘍細胞の生成を阻害する。ＺＴは、溶解した腫瘍細胞から放出される抗原の活性化により速度ｃＴで増加し、速度ｐＴで感染及び非感染腫瘍細胞の生成を阻害する。ＺＶ及びＺＴは、環境内で、速度βで自然減衰する。
免疫系を考慮しなければ、腫瘍ウイルス系の最終状態は、ウイルス複製速度の上昇と共に収束（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｃｅ）から振動（ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ）の状態に変換される。シミュレーションは、異なる初期ウイルス力価、初期腫瘍サイズ、及びウイルス複製速度において、腫瘍ウイルス系の最小腫瘍体積の初期状態から最終状態への経時変化を示す。シミュレーション結果から、初期のウイルス力価の上昇が腫瘍サイズの制御に寄与することが分かる。実際の用途では、図２３に示すように、予測される時点で腫瘍を除去する又は他の補助療法を提供するために、初期腫瘍サイズと投与量制限の組合せにおいて適切な初期投与量を選択できる。
腫瘍及びウイルスに対する免疫細胞の阻害効果が異なる条件でのシミュレーション期間中の最終状態での腫瘍ウイルス免疫系の腫瘍サイズ
シミュレーション結果から、系は、完全な腫瘍の除去、飽和に向かう腫瘍成長、安定した腫瘍体積、及び不安定な腫瘍体積に対する傾向を含む幾つかの動的な挙動を示すことが分かる。一般に、腫瘍に対する免疫細胞の阻害効果が強いほど、系により多くの腫瘍が除去され、一方、ウイルスに対する免疫細胞の抑制効果が強いほど、系内のより多くの腫瘍が制御不能となる。しかし、図２４に示すように、系は、腫瘍の安定性と不安定性の傾向に非単調な変化を示す。
本開示の明細書において、「実施形態」、「幾つかの実施形態」、「特定の実施形態」、「例」、「特定の例」、「幾つかの例」などの用語は、実施例又は実施形態によって記載される特定の特徴、構造、材料、又は特性を指すことを意図し、本開示の少なくとも１つの実施形態又は実施例に含まれる。本明細書においては、上記の用語の概略図は、必ずしも同じ実施形態又は例を指すものではない。更に、記載された特定の特徴、構造、材料、又は特性は、１つ以上の実施形態又は実施例において任意の適切な方法で組み合わされることができる。更に、本明細書に記載した様々な実施形態又は実施例、及び様々な実施形態又は実施例の特徴は、矛盾することなく当業者によって組み合わされることができる。
本開示の実施形態を詳細に説明したが、実施形態は例示であり、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではないことが理解される。当業者は、本開示の範囲内で、これらの実施形態において変更、修正、置換、及び変形を行うことができる。

Claims (40)

  1. 腫瘍細胞特異的プロモーターを組み込む第１の核酸分子と；
    前記第１の核酸分子に機能可能に結合され、転写アクチベーターをコードする第２の核酸分子と；
    前記転写アクチベーターの第１の認識配列を組み込む第３の核酸分子と；
    前記第３の核酸分子に機能可能に結合され、第１のプロモーター及び第１の調節エレメントを組み込む第４の核酸分子と；
    前記第４の核酸分子に機能可能に結合され、第１の調節タンパク質及びウイルス性複製及びパッケージングタンパク質、好ましくはアデノウイルス性複製及びパッケージングタンパク質をコードする第５の核酸分子と；
    前記転写アクチベーターの第２の認識配列を組み込む第６の核酸分子と；
    前記第６の核酸分子に機能可能に結合され、第２のプロモーター及び第２の調節エレメントを組み込む第７の核酸分子と；
    前記第７の核酸分子に機能可能に結合され、第２の調節タンパク質をコードする第８の核酸分子と；
    前記第５の核酸分子に機能可能に結合され、前記第１の調節タンパク質の発現を条件付きで阻害する第９の核酸分子であって、前記第９の核酸分子が、第１のｍｉｃｒｏＲＮＡによって特異的に認識される標的部位を含み、前記第１のｍｉｃｒｏＲＮＡが、正常細胞特異的ｍｉｃｒｏＲＮＡである第９の核酸分子と；
    前記第８の核酸分子に機能可能に結合され、前記第２の調節タンパク質の発現を条件付きで阻害する第１０の核酸分子であって、前記第１０の核酸分子が、第２のｍｉｃｒｏＲＮＡによって特異的に認識される標的部位を含み、前記第２のｍｉｃｒｏＲＮＡが、腫瘍細胞特異的ｍｉｃｒｏＲＮＡである第１０の核酸分子と、
    を含み、
    前記第１の調節エレメントが、前記第２の調節タンパク質に結合することによって前記第１のプロモーターの機能を阻害し、
    前記第２の調節エレメントが、前記第１の調節タンパク質に結合することによって前記第２のプロモーターの機能を阻害することを特徴とする発現系。
  2. 前記腫瘍細胞特異的プロモーターが、αフェトプロテイン特異的プロモーター、サバイビンプロモーター、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素遺伝子プロモーター、コレシストキニンＡ受容体遺伝子プロモーター、癌胎児抗原プロモーター、癌原遺伝子ヒト上皮成長因子受容体２プロモーター、プロスタグランジンエンドキシゲナーゼ（ｅｎｄｏｘｙｇｅｎａｓｅ）還元酵素２プロモーター、ケモカイン受容体−４、Ｅ２Ｆ−１遺伝子プロモーター、ムチンプロモーター、前立腺特異抗原、ヒトチロシナーゼ関連タンパク質１、及びチロシナーゼプロモーターからなる群から選択される少なくとも１つである請求項１に記載の発現系。
  3. 前記転写アクチベーターが、Ｇａｌ４ＶＰ１６、Ｇａｌ４ｖｐ６４、ｄＣａｓ９−ＶＰＲ、ｄＣａｓ９−ＶＰ６４、ｄＣａｓ９−ＶＰ１６、ｄＣａｓ９−ＶＴＲ、及びｒｔＴＡからなる群から選択される少なくとも１つである請求項１に記載の発現系。
  4. 前記第１の認識配列及び前記第２の認識配列が、それぞれ独立して、５×ＵＡＳ、７×ｔｅｔＯ、及びｄＣａｓ９の標的配列の少なくとも１つから選択される請求項１に記載の発現系。
  5. 前記第１のプロモーター及び前記第２のプロモーターが、それぞれ独立して、ｍｉｎｉＣＭＶ及びＴＡＴＡ ｂｏｘから選択される請求項１に記載の発現系。
  6. 前記第１の調節タンパク質及び前記第２の調節タンパク質が、それぞれ独立して、ＬａｃＩ、ｔｅｔＲ、ジンクフィンガー、ＫＲＡＢ、ｔｅｔＲ−ＫＲＡＢ、及びｄＣａｓ９−ＫＲＡＢの少なくとも１つから選択される請求項１に記載の発現系。
  7. 前記第１の調節エレメント及び前記第２の調節エレメントが、それぞれ独立して、ｔｅｔＯ、ＬａｃＯ、ジンクフィンガー標的部位、及びｄＣａｓ９の標的配列の少なくとも１つから選択される請求項６に記載の発現系。
  8. 前記第１の調節タンパク質が、ＬａｃＩであり、前記第２の調節エレメントが、複数の繰り返されたＬａｃＯ配列を含み、前記複数の繰り返されたＬａｃＯ配列の少なくとも１つが、前記第２のプロモーターの下流に設定される請求項７に記載の発現系。
  9. 前記第２の調節タンパク質が、ｔｅｔＲ−ＫＲＡＢであり、前記第１の調節エレメントが、複数の繰り返されたｔｅｔＯ配列を含み、前記複数の繰り返されたｔｅｔＯ配列の少なくとも１つが、前記第１のプロモーターの下流に設定される請求項６に記載の発現系。
  10. 前記第５の核酸分子及び前記第８の核酸分子の少なくとも１つが、目的のタンパク質をコードする配列を更に含む請求項１に記載の発現系。
  11. 前記第５の核酸分子が、前記目的のタンパク質をコードする配列を含み、前記目的のタンパク質が、免疫エフェクターを含む請求項１０に記載の発現系。
  12. 前記アデノウイルス性複製及びパッケージングタンパク質が、アデノウイルスＥ１遺伝子、アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子、アデノウイルスＥ１Ｂ遺伝子、アデノウイルスＥ２遺伝子、及びアデノウイルスＥ４遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つを含む請求項１に記載の発現系。
  13. 前記アデノウイルス性複製及びパッケージングタンパク質が、アデノウイルスＥ１遺伝子を含む請求項１に記載の発現系。
  14. 前記免疫エフェクターが、ＰＤ−１遺伝子をアンタゴナイズする阻害配列、ＰＤ−Ｌ１遺伝子をアンタゴナイズする阻害配列、ＣＴＬＡ４遺伝子をアンタゴナイズする阻害配列、Ｔｉｍ−３遺伝子アンタゴナイズする阻害配列、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、又はＩＬ−１５からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含む請求項１１に記載の発現系。
  15. 前記目的のタンパク質及び前記第１の調節タンパク質が、融合タンパク質の形態で発現され、前記目的のタンパク質及び前記第１の調節タンパク質が、切断可能なリンカーペプチドによって結合される請求項１０に記載の発現系。
  16. 前記第９の核酸分子及び前記第１０の核酸分子が、それぞれ独立して、ＲＮＡ干渉によって、前記第１の調節タンパク質又は前記第２の調節タンパク質の発現を阻害する請求項１に記載の発現系。
  17. 前記第１のｍｉｃｒｏＲＮＡが、ｍｉＲ１９９ａ、ｍｉＲ９５、ｍｉＲ１２５、ｍｉＲ２５ｂ、Ｌｅｔ−７、ｍｉＲ１４３、ｍｉＲ１４５、及びｍｉＲ２００Ｃからなる群から選択される少なくとも１つを含む請求項１に記載の発現系。
  18. 前記第２のｍｉｃｒｏＲＮＡが、ｍｉＲ２１、ｍｉＲ２２３、ｍｉＲ２２４、ｍｉＲ２２１、ｍｉＲ１８、ｍｉＲ２１４、ｍｉＲ１４６ａ、及びｍｉＲ１７９２からなる群から選択される少なくとも１つを含む請求項１に記載の発現系。
  19. 前記第１の核酸分子及び前記第２の核酸分子が、第１の発現ベクターにローディングされ；前記第３の核酸分子、前記第４の核酸分子、前記第５の核酸分子、及び任意に前記第９の核酸分子が、第２の発現ベクターにローディングされ；前記第６の核酸分子、前記第７の核酸分子、前記第８の核酸分子、及び任意に前記第１０の核酸分子が、第３の発現ベクターにローディングされる請求項１に記載の発現系。
  20. 前記第１の発現ベクター、前記第２の発現ベクター、及び前記第３の発現ベクターが、それぞれ独立して、プラスミド、ウイルス、ナノ物質、リポソーム、分子結合ベクター、ネイキッドＤＮＡ、染色体ベクター、及びポリマーの少なくとも１つから選択される請求項１９に記載の発現系。
  21. 前記ウイルスが、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、及びレトロウイルスからなる群から選択される少なくとも１つを含む請求項２０に記載の発現系。
  22. 前記第１の発現ベクター、前記第２の発現ベクター、及び前記第３の発現ベクターが、１つの同じベクターにローディングされる請求項１９に記載の発現系。
  23. 前記１つの同じベクターが、アデノウイルスベクターである請求項２２に記載の発現系。
  24. 前記第１の発現ベクターが、５’末端から３’末端に、ＢｓａＩ、ＡＦＰＩＩＩ、Ｇａｌ４ＶＰ１６、及びＢｓａＩを含み、
    任意に、前記第１の発現ベクターが、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する核酸を有する請求項１９に記載の発現系。
  25. 前記第２の発現ベクターが、５’末端から３’末端に、ＢｓａＩ、５×ＵＡＳ、ｔｅｔＯ、ｍｉｎｉＣＭＶ、ｔｅｔＯ、Ｅ１Ａ、２Ａ、免疫効果因子、ＬａｃＩ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ１９９ａ特異的認識配列、及びＢｓａＩを含み、
    任意に、前記第２の発現ベクターが、配列番号２〜７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する核酸を有する請求項１９に記載の発現系。
  26. 前記第３の発現ベクターが、５’末端から３’末端に、ＢｓａＩ、５×ＵＡＳ、ＬａｃＯ、ｍｉｎｉＣＭＶ、ＬａｃＯ、ｔｅｔＲ−ＫＲＡＢ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ２１特異的認識配列、及びＢｓａＩを含み、
    任意に、前記第３の発現ベクターが、配列番号８に示されるヌクレオチド配列を有する核酸を有する請求項１９に記載の発現系。
  27. 前記アデノウイルスが、５’末端から３’末端に、第１の末端逆位配列、パッケージングシグナル、ＡＦＰＩＩＩ、Ｇａｌ４ＶＰ１６、５×ＵＡＳ、ｔｅｔＯ、ｍｉｎｉＣＭＶ、ｔｅｔＯ、Ｅ１Ａ、２Ａ、免疫エフェクター、２Ａ、ＬａｃＩ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ１９９ａ特異的認識配列、５×ＵＡＳ、ＬａｃＯ、ｍｉｎｉＣＭＶ、ＬａｃＯ、ｔｅｔＲ−ＫＲＡＢ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ２１特異的認識配列、アデノウイルスＥ２遺伝子領域、アデノウイルスＥ３遺伝子領域、アデノウイルスＥ４遺伝子領域、及び第２の末端逆位配列を含み、
    任意に、前記アデノウイルスベクターが、配列番号９〜１４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する核酸を有する請求項２３に記載の発現系。
  28. 前記アデノウイルスが、
    アデノウイルスベクターから、アデノウイルス複製及びパッケージングに関連する前記アデノウイルスＥ１遺伝子及び前記アデノウイルスＥ３遺伝子の一部を除去する工程と；
    段階的ゴールデンゲート（Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ）法によって、遺伝子回路に前記アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子を挿入する工程と；
    ゲートウェイ（Ｇａｔｅｗａｙ）法又はギブソン（Ｇｉｂｓｏｎ）法によって、前記アデノウイルスベクターに前記遺伝子回路を組み込む工程と、によって得られる請求項２７に記載の発現系。
  29. αフェトプロテイン特異的プロモーターである腫瘍細胞特異的プロモーターを組み込む第１の核酸分子と；
    前記第１の核酸分子に機能可能に結合され、Ｇａｌ４ＶＰ１６である転写アクチベーターをコードする第２の核酸分子と；
    前記転写アクチベーターの５×ＵＡＳである第１の認識配列を組み込む第３の核酸分子と；
    前記第３の核酸分子に機能可能に結合され、第１のプロモーター及び第１の調節エレメントを組み込む第４の核酸分子であって、前記第１のプロモーターが、ｍｉｎｉＣＭＶであり、前記第１の調節エレメントが、複数の繰り返されたｔｅｔＯ配列を含み、前記複数の繰り返されたｔｅｔＯ配列の少なくとも１つが、前記第１のプロモーターの下流に設定される第４の核酸分子と；
    前記第４の核酸分子に機能可能に結合され、ＬａｃＩである第１の調節タンパク質をコードする第５の核酸分子であって、
    前記第５の核酸分子が、目的のタンパク質をコードする配列を更に含み、前記目的のタンパク質が、ウイルス性複製タンパク質、好ましくはアデノウイルス複製タンパク質及びパッケージングタンパク質、並びに免疫エフェクターを含み、前記免疫エフェクターが、個々のタンパク質又は融合タンパク質の形態で発現され、前記ウイルス性複製タンパク質及び前記免疫エフェクターが、切断可能なリンカーペプチドによって結合され、
    前記目的のタンパク質及び前記第１の調節タンパク質が、融合タンパク質の形態で発現され、前記目的のタンパク質及び前記第１の調節タンパク質が、切断可能なリンカーペプチドによって結合され；
    前記転写アクチベーターの５×ＵＡＳである第２の認識配列を組み込む第６の核酸分子と；
    前記第６の核酸分子に機能可能に結合され、第２のプロモーター及び第２の調節エレメントを組み込む第７の核酸分子であって、前記第２のプロモーターが、ｍｉｎｉＣＭＶであり、前記第２の調節エレメントが、複数の繰り返されたＬａｃＯ配列を含み、前記複数の繰り返されたＬａｃＯ配列の少なくとも１つが、前記第２のプロモーターの下流に挿入される第７の核酸分子と；
    前記第７の核酸分子に機能可能に結合され、ｔｅｔＲ−ＫＲＡＢである第２の調節タンパク質をコードする第８の核酸分子と；
    前記第５の核酸分子に機能可能に結合され、前記第１の調節タンパク質の発現を条件付きで阻害する第９の核酸分子であって、前記第９の核酸分子が、正常細胞特異的ｍｉｃｒｏＲＮＡである第１のｍｉｃｒｏＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列を含む第９の核酸分子と；
    前記第８の核酸分子に機能可能に結合され、前記第２の調節タンパク質の発現を条件付きで阻害する第１０の核酸分子であって、前記第１０の核酸分子が、腫瘍細胞特異的ｍｉｃｒｏＲＮＡである第２のｍｉｃｒｏＲＮＡによって特異的に認識される核酸配列を含む第１０の核酸分子と、
    を含み、
    前記第１の調節エレメントが、前記第２の調節タンパク質に結合することによって前記第１のプロモーターの機能を阻害し、
    前記第２の調節エレメントが、前記第１の調節タンパク質に結合することによって前記第２のプロモーターの機能を阻害することを特徴とする組換えウイルス。
  30. 前記組換えウイルスが、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、及びヘルペスウイルスからなる群から選択される少なくとも１つを含む請求項２９に記載の組換えウイルス。
  31. 前記組換えウイルスが、アデノウイルスである請求項２９に記載の組換えウイルス。
  32. 前記免疫エフェクターが、ＰＤ−１遺伝子をアンタゴナイズする阻害配列、ＰＤ−Ｌ１遺伝子をアンタゴナイズする阻害配列、ＣＴＬＡ４遺伝子をアンタゴナイズする阻害配列、Ｔｉｍ−３遺伝子をアンタゴナイズする阻害配列、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、又はＧＭ−ＣＳＦからなる群から選択される少なくとも１つの配列を含む請求項２９に記載の組換えウイルス。
  33. 請求項１から２８のいずれかに記載の発現系を含むことを特徴とする組換え細胞。
  34. 前記発現系の少なくとも一部が、前記組換え細胞のゲノムに組み込まれる請求項３３に記載の組換え細胞。
  35. 癌の治療のための医薬の調製における、請求項１から２８のいずれかに記載の発現系、請求項２９から３２のいずれかに記載の組換えウイルス、及び請求項３３から３４のいずれかに記載の組換え細胞の使用。
  36. 前記癌が、肝癌、肺癌、結腸直腸癌、メラノーマ、乳癌、又は前立腺癌を含む請求項３５に記載の使用。
  37. 請求項１から２８のいずれかに記載の発現系を用いることによって、目的のタンパク質を発現させる方法であって、前記方法が、
    （１）前記第５の核酸分子が前記目的のタンパク質をコードする核酸配列を含むような請求項１０に記載の発現系を提供する工程と；
    （２）前記第１０の核酸分子によって、前記第２の調節タンパク質の発現を阻害し、前記目的のタンパク質を発現させる工程と、を含むことを特徴とする方法。
  38. 前記発現が、細胞内で行われる請求項３７に記載の方法。
  39. 前記方法が、工程（２）において、前記第２のｍｉｃｒｏＲＮＡを前記第１０の核酸分子に接触させることを更に含む請求項３７に記載の方法。
  40. 請求項１から２８のいずれかに記載の発現系を用いることによって、目的のタンパク質を発現させる方法であって、前記方法が、
    （１）前記第８の核酸分子が第１の目的のタンパク質をコードする核酸配列を含むような請求項１０に記載の発現系を提供し、前記第５の核酸分子が第２の目的のタンパク質をコードする核酸配列を含む工程と；
    （２）前記第９の核酸分子によって、前記第１の調節タンパク質の発現を阻害し、前記第１の目的のタンパク質を発現させる工程；又は前記第１０の核酸分子によって、前記第２の調節タンパク質の発現を阻害し前記第２の目的のタンパク質を発現させる工程と、
    を含むことを特徴とする方法。
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