KR102409077B1 - 프로그램 가능한 항암 바이러스 백신 시스템 및 이의 적용 - Google Patents
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Abstract
세포-특이적 프로모터를 가지는 제1 핵산 분자; 전사 활성화제를 암호화하는 제2 핵산 분자; 전사 활성화제의 제1 인식 서열을 가지는 제3 핵산 분자; 제1 프로모터 및 제1 조절 요소를 가지는 제4 핵산 분자; 제1 조절 단백질을 암호화하는 제5 핵산 분자; 전사 활성화제의 제2 인식 서열을 가지는 제6 핵산 분자; 제2 프로모터 및 제2 조절 요소를 가지는 제7 핵산 분자; 제2 조절 단백질을 암호화하는 제8 핵산 분자; 뿐만 아니라 제1 조절 단백질의 발현을 조건부로 억제하도록 구성된 제9 핵산 분자, 및 제2 조절 단백질의 발현을 조건부로 억제하도록 구성된 제10 핵산 분자를 포함하며, 여기서 제1 조절 요소는 제2 조절 단백질에 대한 결합에 의하여 제1 프로모터의 기능을 억제하도록 적응되고, 및 제2 조절 요소는 제1 조절 단백질에 대한 결합에 의하여 제2 프로모터의 기능을 억제하도록 적응된 것인 발현 시스템.
Description
선행기술 정보
본 출원은 2017년 3월 24일에 중화인민공화국(PRC)의 중국 국가 지식재산권국(National Intellectual Property Administration)에 출원된 특허 출원 일련 번호 제 201710184736.2호의 우선권 및 이익을 주장하며, 그 전문은 본원에 참조로 포함된다.
기술분야
본 개시는 생물의학 분야에 관한 것이다. 특히, 본 개시는 발현 시스템 및 이것의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 발현 시스템, 재조합 바이러스, 재조합 세포, 및 유전자 발현 시스템, 재조합 바이러스 및 재조합 세포의 의약 제조에서의 사용에 관한 것이다. 추가로, 본 개시는 또한 발현 시스템을 사용함으로써 관심 있는 단백질을 발현하는 방법에 관한 것이다.
항암 바이러스(oncolytic virus)는 종양 사멸을 이루기 위한 복제 및 포장 능력을 가지는 바이러스 유형을 나타낸다. 현재, 대부분의 연구는 조작 변형 후 자연스럽게 발생하는 일부 약독화된 바이러스가 종양 세포에서 특이적으로 발현되고 포장될 수 있으며, 그로써 항암 효과를 실현시킬 수 있는 것을 보여주었다. 항암 바이러스를 통해 종양 세포를 인식하는 것에는 두 가지 주요 원칙이 있다. 첫째, 항암 바이러스는 표적 세포에서 종양 억제자 유전자의 비활성화 또는 결함으로 인해 종양 세포를 선택적으로 감염시킨다. 둘째, 항암 바이러스가 종양 세포를 파괴하기 위하여 종양 세포에서 대량으로 복제되고 독성 단백질을 발현하며, 및/또는 자가면역 체계를 자극하기 위하여 동시에 사이토카인을 분비함으로써, 종양 세포를 공격하도록 종양-특이적 프로모터가 항암 바이러스의 핵심 유전자의 발현을 조절하기 위해 선택된다. 상응하는 항암 바이러스는 유기체의 정상 세포에서 복제할 수 없고, 그로써 사멸 능력을 갖지 않음으로써 항암 바이러스는 더 높은 항종양 효과 및 더 낮은 부작용을 가진다. 최근 수십년간, 항암 바이러스 치료는 광범위한 관심을 끌었고, 관련 연구들은 대단한 진전을 이루었다. 현재, 아데노바이러스, 단순 헤르페스 바이러스-1(HSV-1), 뉴캐슬병(Newcastle disease) 바이러스 등이 항암 바이러스에 대해 조작되었다. 2006년도에, 암용해성 아데노바이러스(oncolytic adenovirus) 제품(젠디신(Gendicine) 및 온코린(Oncorine))이 중국에서, 주로 두경부암, 부비동암 등의 치료를 위해, 임상 치료에 사용된 바 있다. 젠디신 및 온코린은 유사한 메커니즘을 가지는데, 즉, 인간 타입-5 아데노바이러스의 E1B-55kD 영역을 삭제하여서, 인간 타입-5 아데노바이러스가 p53 유전자-돌연변이된 암세포에서 재생하고 종양 세포를 사멸시킬 수 있음으로써, 치료적 항암 효과를 생성할 수 있다. 그러나, 임상 데이터는 단일 p53 유전자 돌연변이를 기반으로 한 이들 2개의 암용해성 아데노바이러스가 이상적인 것이 아님을 보여준다. 추가로, 미국의 바이오치료제 회사인 Jennerex의 JX-594는 조작된 백시니아 바이러스이다. 원발성 간암 환자는 2013년에 완료된 제2기 임상 실험에서 저용량 주입 후 6.7개월의 수명에 비교하여, 조작된 백시니아 바이러스의 고용량 주입 후 14.1개월에 달하는 연장된 중앙 수명을 가진 것으로 나타난다. 나아가, 생물공학 회사인 BioVex사에 의해 개발된, 2015년 10월에 FDA에 의해 승인된 미국 및 유럽에서 판매중인 첫 번째 항암 바이러스 제품인, 유전자 조작된 단순 헤르페스 바이러스 OncoVEX GM-CSF는 신체에서 전신성 면역 반응의 생성을 개시하기 위하여 GM-CSF를 발현하고 분비하는 한편 종양 세포를 선택적으로 사멸시킬 수 있음으로써, 잔류하는 종양 세포 및 그것들의 전이 부위를 사멸할 수 있다. 2009년도에 BioVex사에 의해 공개된 제2기 실험에서 전이성 흑색종의 임상 결과는 50명의 환자 중 26%가 치료 후 개선을 나타내고 8명의 환자가 완전히 회복된 것을 보여준다. 제3기 임상 실험의 연구를 촉진하기 위하여 2011년도에 10억 달러에 회사 BioVex를 인수한 Amgen은 2013년 3월에 OncoVEX의 효능 데이터를 발표하였는데, 그것은 약물 OncoVEX가 진행된 환자의 종양 크기를 성공적으로 감소시킬 수 있고, 400명 이상의 환자를 포함한 제3기 임상 실험에서 다른 유사한 약물보다 더 강력한 효능을 나타내는 것을 증명한다.
항암 바이러스는 실제로 상기 연구 결과를 기반으로 한 종양 치료에 대해 효능을 나타내지만, 일부 결함도 여전히 존재한다.
현재, Ad1 내지 Ad52로서 명명된 52개의 공지된 인간 아데노바이러스가 있으며, 여기서 Ad2가 가장 보편적이다. 아데노바이러스의 전사 패턴은 매우 뚜렷한 특징을 가지는데, 아데노바이러스 게놈은 세포 형질전환에 관여하고 아데노바이러스 게놈의 좌측에 위치하며 E1A 및 E1B로 세분화될 수 있는 E1 영역; DNA 결합 단백질을 암호화하며 바이러스 복제에 관여하는 E2 영역; 숙주 세포의 표면에 나타나는 당단백질을 암호화하는 E3 영역; Ad2 게놈의 우측 단부에 위치하고 E2 영역에 의해 암호화된 DNA 결합 단백질에 의해 조절되는 E4 영역; 및 바이러스 감염의 중기(metaphase)에 Ad2 단백질 IV를 합성하는 제5 전사 단위를 포함하는, 적어도 5개의 공지된 전사 단위를 가진다. 아데노바이러스 게놈이 세포 핵에 들어간 후에, 세포의 전사 인자는첫째로 E1A 영역의 상류에 있는 인핸서에 결합하여 E1A 단백질을 발현하고, 그것은 세포 대사를 조절하며 바이러스 DNA가 세포에서 쉽게 복제되는 것을 허용할뿐만 아니라, 다른 초기 유전자들(E1B, E2A, E2B, E3 및 E4)의 프로모터를 활성화하며, E2B는 바이러스 복제에 관여하는 초기 유전자의 3개의 추가적인 전사 단위(즉 전구체 말단 단백질(pTP), 단일 가닥 DNA 결합 단백질(ssDBP) 및 DNA 중합효소(DNA pol))의 발현을 구동하고, 이들 3개의 유전자 발현 생성물은 복합체에 단단하게 결합하여, 바이러스 게놈의 복제를 개시하기 위해 적어도 3개의 세포 단백질과 상호작용한다. 다음의 조작 전략이 아데노바이러스 게놈 및 전사 패턴의 분석에 따라 만들어질 수 있다: 표적 세포에서 아데노바이러스의 복제 및 포장을 조절하기 위해 E1A 발현을 조절하는 것; 바이러스의 포장 능력을 증가시키면서 비표적 세포에 미치는 바이러스의 독성을 감소시키기 위하여 바이러스 포장에 관련된 일부 비필수 유전자(예컨대, E3, E4 등)를 제거하는 것; 아데노바이러스의 코트 단백질을 대체함으로써 특이적 세포 및 조직에 대한 아데노바이러스의 표적화를 변화시키는 것.
그러나, 암용해성 아데노바이러스의 기존의 연구 결과는 아데노바이러스를 조작하기 위한 번거로운 방법뿐만 아니라 단조로움, 빈약한 특이성, 낮은 안전성 등과 같은 현재 조절 시스템의 결함의 존재를 나타낸다. 그러므로, 보다 엄격하고 안전한 조절 시스템을 설계하는 방법 및 빠르고 효과적인 방법으로 암용해성 아데노바이러스의 조립을 실현하는 방법이 암용해성 아데노바이러스의 설계 및 구성의 측면에서 시급하게 해결될 필요가 있다.
본 개시는 상기 언급된 여러 기술적인 문제들을 적어도 어느 정도 해결하는 것을 목적으로 한다.
발명자들의 실험실에서의 연구 성과를 토대로, 발명자들은 아데노바이러스 조절에 적합하고 상이한 미세환경에 반응성인 유전자 회로(gene circuit)를 설계하고 구성하였다. 이 유전자 회로에서, 발명자들은 다중 수준의 생체마커를 이용한다. 구체적으로, 첫째, 특이적 프로모터가 유전자 회로를 조절하기 위한 마스터 스위치로서 사용된다, 즉, 마스터 활성화제의 발현을 조절하기 위하여 특이적 프로모터를 사용함으로써, 추가로 아데노바이러스 E1A 유전자의 발현을 조절한다; 둘째, 마이크로RNA 표적 서열이 유전자 회로를 조절하기 위한 이차 스위치로서 작용하는 상이한 미세환경 하에서 마이크로RNA의 발현 특징에 반응하기 위하여 사용된다; 셋째, 폐루프(close-loop) 유전자 회로가 상호 억압 스위치를 구성하기 위해 사용된다, 이러한 상호 억압 폐루프 스위치가 누출을 효과적으로 피하면서 미세환경의 변화에 보다 효율적으로 억압 반응을 할 수 있다; 넷째, E1B 유전자가 제거됨으로써, 조작된 아데노바이러스가 E1B 유전자의 부재로 인해 정상 세포로부터 P53 결핍 종양 세포를 구별하는 개선된 능력을 가진다; 다섯째, E3 유전자가 제거됨으로써, 아데노바이러스 벡터의 포장 능력을 증가시키는 한편 정상 세포에 대한 암용해성 아데노바이러스의 독성을 감소시킨다.
일반적으로, 유형-2 및 유형-5 인간 아데노바이러스는 36 Kbp의 게놈 길이를 가짐으로써, 절단, 결찰 등과 같은 전통적인 플라스미드 구성 방법에 의해 아데노바이러스를 유전자적으로 변형시키는 것은 매우 어렵고 시간 소모적일 것이다. 이런 문제를 해결하기 위하여, 발명자들은 다음의 3 단계를 포함하는, 본 유전자 회로에 의해 구성된 아데노바이러스를 신속하게 구성하는 방법을 설계하였다. 첫 번째 단계로, 일차 요소 라이브러리가 구성되는데, 여기에서 필요한 구성요소들이 상응하는 플라스미드로 구성된다. 이러한 일차 요소 라이브러리는, 주로 유전자 회로의 한 쪽에서 억압 구성요소, 아데노바이러스의 E1A 유전자 및 아데노바이러스 E1A 유전자와 공동 발현된 이펙터 유전자(예컨대 면역 인자 유전자 또는 살해 유전자)를 발현하는 억압 요소 라이브러리 A; 유전자 회로의 효과적인 반전을 조절하기 위해 구성됨으로써, 스위치의 안전성을 증강시키는, 주로 유전자 회로의 다른 쪽에서 억압 유전자를 발현하는 억압 요소 라이브러리 B; 및 조직 또는 종양-특이적 프로모터를 통해 유전자 회로의 하류 유전자를 조절하는 마스터 스위치인, 특이적 프로모터 라이브러리를 포함한, 3개의 유전자 부분을 포함한다. 두 번째 단계로, 발현될 생체마커 및 이펙터의 결정 후에, 일차 요소 라이브러리로부터 선택된 상응하는 플라스미드가 골든 게이트 방법(Golden Gate method)을 통해 신속하게 유전자 회로로 조립된다. 세 번째 단계로, 유전자 회로가 조작된 아데노바이러스 벡터 안으로 로딩된다(아데노바이러스의 인공적인 조절을 용이하게 하기 위한 E1 유전자의 제거; 및 포장 능력을 확대시키기 위한 일부 E3 서열의 제거).
다중 유전자를 운반하고 동시에 발현하는 것은 암용해성 아데노바이러스의 또 다른 뚜렷한 특징이다. 본 개시에서, IL-2, GM-CSF, 항-PD-1 scFv, 항-PD-L1 scFv, 및 이들 유전자 사이의 융합 단백질 등과 같은 하나 이상의 세포 면역-관련 유전자는 발명자들에 의한 개시를 통해 암용해성 아데노바이러스에 의해 동시에 발현된다. 암용해성 아데노바이러스는 종양 세포를 공격할 때 전신성 면역 반응을 촉발할 것인 한편, 면역-관련 유전자의 존재로 인해 면역 과잉반응을 유발할 위험이 있다. 그러므로, 항암 바이러스의 치료 효과는 운반된 면역-관련 유전자, 상응하는 투여 용량 및 투여 경로에 의해 강력하게 영향을 받을 것이다. 본 개시에서, 발명자들은 생물정보학 방법에 의해 표적 세포에 대한 아데노바이러스의 감염 과정을 모델화하기 위해 시도하였고, 가능한 많이 암용해성 아데노바이러스의 효능을 개선하기 위하여, 종양 세포를 사멸할 때 암용해성 아데노바이러스의 특성을 연구하였다.
제1 측면으로, 본 개시는 구현예에서 발현 시스템을 제공한다. 본 개시의 구현예에 따르면, 발현 시스템은 다음을 포함한다: 세포 특이적 프로모터를 포함하는 제1 핵산 분자; 제1 핵산 분자에 작동 가능하게 연결되고 전사 활성화제를 암호화하는 제2 핵산 분자; 전사 활성화제의 제1 인식 서열을 포함하는 제3 핵산 분자; 제3 핵산 분자에 작동 가능하게 연결되고 제1 프로모터 및 제1 조절 요소를 포함하는 제4 핵산 분자; 제4 핵산 분자에 작동 가능하게 연결되고 제1 조절 단백질을 암호화하는 제5 핵산 분자; 전사 활성화제의 제2 인식 서열을 포함하는 제6 핵산 분자; 제6 핵산 분자에 작동 가능하게 연결되고 제2 프로모터 및 제2 조절 요소를 포함하는 제7 핵산 분자; 제7 핵산에 작동 가능하게 연결되고 제2 조절 단백질을 암호화하는 제8 핵산 분자; 및 제5 핵산 분자에 작동 가능하게 연결되고 제1 조절 단백질의 발현을 조건부로 억제하도록 구성된 제9 핵산 분자; 제8 핵산 분자에 작동 가능하게 연결되고 제2 조절 단백질의 발현을 조건부로 억제하도록 구성된 제10 핵산 분자로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나, 여기서 제1 조절 요소는 제2 조절 단백질에 대한 결합에 의해 제1 프로모터의 기능을 억제하도록 적응되고, 제2 조절 요소는 제1 조절 단백질에 대한 결합에 의해 제2 프로모터의 기능을 억제하도록 적응된다. 본 개시의 구현예에 따르는 발현 시스템으로, 관심 있는 유전자는 상호 억압 방식으로 조절되는 한편으로 강력한 제어, 고효율 및 특이성으로, 특이적 세포 환경 하에서 특이적으로 발현될 수 있다.
본 개시의 구현예에서, 발현 시스템은 추가로 다음과 같은 추가적인 기술적 특징들 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
본 개시의 구현예에서, 세포 특이적 프로모터는 종양 세포 특이적 프로모터이다. 종양 세포 특이적 프로모터는 알파-태아단백질-특이적 프로모터, 서바이빈 프로모터, 인간 텔로머라제 역전사효소 유전자 프로모터, 콜레시스토키닌(cholecystokinin) A 수용체 유전자 프로모터, 암종배아 항원 프로모터, 원-종양유전자 인간 표피 성장 인자 수용체 2 프로모터, 프로스타글란딘 엔도옥시게나제 환원효소 2 프로모터, 케모카인 수용체-4, E2F-1 유전자 프로모터, 뮤신 프로모터, 전립선 특이적 항원, 인간 티로시나제-관련 단백질 1, 및 티로시나제 프로모터로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나이다. 구현예의 발현 시스템은 상기에서와 같이 기술된 종양 세포-특이적 프로모터의 제어 하에 특이적 종양 세포의 미세환경에서 개시될 수 있음으로써, 추가로 유전자 발현 및 조절의 특이성을 증강시킬 수 있다.
본 개시의 구현예에서, 전사 활성화제는 Gal4VP16, Gal4VP64, Gal4esn, dCas9-VP16, dCas9-VP64, dCas9-VPR, dCas9-VTR 및 rtTA로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나이다.
본 개시의 구현예에서, 제1 인식 서열 및 제2 인식 서열은 각각 독립적으로 5 x UAS, 7 x tetO 및 dCas9의 표적 서열 중 적어도 하나로부터 선택된다.
본 개시의 구현예에서, 제1 프로모터 및 제2 프로모터는 각각 독립적으로 miniCMV 및 TATA 박스로부터 선택된다.
본 개시의 구현예에서, 제1 조절 단백질 및 제2 조절 단백질은 각각 독립적으로 LacI, tetR, 아연 핑거, KRAB, tetR-KRAB 및 dCas9-KRAB 중 적어도 하나로부터 선택된다.
본 개시의 구현예에서, 제1 조절 요소 및 제2 조절 요소는 각각 독립적으로 tetO, LacO, 아연 핑거 표적 부위 및 및 dCas9의 표적 서열 중 적어도 하나로부터 선택된다.
본 개시의 한 구현예에서, 제1 조절 단백질은 LacI이고, 제2 조절 요소는 다수의 반복된 LacO 서열을 포함하며, 여기서 다수의 반복된 LacO 서열 중 적어도 하나는 제2 프로모터의 하류에 놓인다. 발현된 후 LacI은 LacO 서열에 특이적으로 결합할 수 있음으로써, 제2 프로모터의 기능을 억제한다. 구현예에 따르는 LacI/LacO 억압 시스템은 실험에 의해 증명되는 바 제2 프로모터의 하류 유전자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있다.
본 개시의 한 구현예에서, 제2 조절 단백질은 tetR-KRAB이고, 제1 조절 요소는 다수의 반복된 tetO 서열을 포함하며, 여기서 다수의 반복된 tetO 서열 중 적어도 하나는 제1 프로모터의 하류에 놓인다. 구현예에 따르는 tetR-KRAB/tetO 억압 시스템은 제1 프로모터의 하류 유전자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있다.
본 개시의 한 구현예에서, 제5 핵산 분자 및 제9 핵산 분자 중 적어도 하나는 추가로 관심 있는 단백질을 암호화하는 서열을 포함한다. 본 개시의 구현예에 따르는 발현 시스템으로, 관심 있는 단백질은 특이적 세포 미세환경에서 특이적으로 발현될 수 있는 한편, 상호 억압 방식으로 조절된다. 본 개시의 특정 구현예에 따르면, 발현 시스템은 관심 있는 단백질의 발현에 대해 상당히 증가된 특이성 및 조절을 나타낸다.
본 개시의 한 구현예에서, 제5 핵산 분자는 관심 있는 단백질을 암호화하는 서열을 포함하고, 관심 있는 단백질은 바이러스 복제 및 포장 단백질 및 면역 이펙터로부터 선택된 적어도 하나를 포함한다. 선택적으로, 바이러스 복제 및 포장 단백질 및 면역 이펙터는 융합 단백질의 형태로 존재할 수 있다. 바이러스 복제 및 포장 단백질은 숙주에서 발현 시스템 벡터의 생존 및 복제를 효과적으로 보장할 수 있다. 면역 이펙터의 발현은 신체에서 면역 시스템을 효과적으로 활성화할 수 있음으로써, 종양 세포와 같은 특이적 세포에 대한 면역 사멸을 촉진한다.
본 개시의 한 구현예에서, 바이러스 복제 및 포장 단백질은 아데노바이러스 E1 유전자, 아데노바이러스 E1A 유전자, 아데노바이러스 E1B 유전자, 아데노바이러스 E2 유전자, 및 아데노바이러스 E4 유전자로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함한다.
본 개시의 한 구현예에서, 면역 이펙터는 PD-1 유전자를 길항하는 억제 서열, PD-L1 유전자를 길항하는 억제 서열, CTLA4 유전자를 길항하는 억제 서열, Tim-3 유전자, GM-CSF, IL-2, IL-12 및 IL-15를 길항하는 억제 서열로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 서열을 포함한다. 선택적으로, 상기 기술된 면역 이펙터는 융합 단백질의 형태로 존재할 수 있다.
본 개시의 한 구현예에서, 관심 있는 단백질 및 제1 조절 단백질은 융합 단백질의 형태로 발현되고, 관심 있는 단백질 및 제1 조절 단백질은 절단 가능한 링커 펩타이드에 의해 연결된다. 관심 있는 단백질 및 제1 조절 단백질은 동일한 프로모터에 의해 조절 및 발현되며, 발현된 후에 링커 펩타이드에서 절단됨으로써, 관심 있는 단백질 및 제1 조절 단백질은 분리되고, 서로 독립적으로 기능한다.
본 개시의 한 구현예에서, 제9 핵산 분자 및 제10 핵산 분자는 독립적으로 RNA 간섭을 통해 제1 조절 단백질 또는 제2 조절 단백질의 발현을 억제하고, 마이크로RNA는 상이한 세포 미세환경에서 발현된 특이적 마이크로RNA이며, 제9 또는 제10 핵산 분자는 마이크로RNA의 특이적 표적 서열이다. 특이적 미세환경에서 발현된 마이크로RNA는 RNA 간섭을 통해 표적 서열에 특이적으로 작용할 수 있고, 그로써 제1 조절 단백질 또는 제2 조절 단백질의 발현은 특이적으로 조절될 수 있다. 본 개시의 구현예에서, 제9 핵산 분자는 제1 마이크로RNA에 의해 특이적으로 인식된 핵산 서열을 포함하고, 제1 마이크로RNA는 정상 세포-특이적 마이크로RNA이며; 제10 핵산 분자는 제2 마이크로RNA에 의해 특이적으로 인식된 핵산 서열을 포함하고, 제2 마이크로RNA는 비정상 세포-특이적 마이크로RNA이다. 추가로, 제1 조절 단백질은 비정상 세포에서 발현되며 정상 세포에서는 발현되지 않거나 낮게 발현되는 한편, 제2 조절 단백질은 정상 세포에서 발현되며 비정상 세포에서는 발현되지 않거나 낮게 발현된다.
본 개시의 특정 구현예에서, 제1 마이크로RNA는 miR199a, miR95, miR125, miR25b, Let-7, miR143, miR145 및 miR200C로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함한다. 상기 기술된 마이크로RNA는 정상 간 세포에서 발현된다.
본 개시의 특정 구현예에서, 제2 마이크로RNA는 miR21, miR223, miR224, miR221, miR18, miR214, miR146a 및 miR1792로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함한다. 상기 기술된 제2 마이크로RNA는 간암종 세포(예컨대 HepG2, Huh7, 및 PLC)에서 특이적으로 발현된 마이크로RNA이다. 나아가, 제1 조절 단백질은 간암종 세포에서 발현되며 정상 세포에서는 발현되지 않거나 낮게 발현되는 한편, 제2 조절 단백질은 정상 세포에서 발현되며 간암종 세포에서는 발현되지 않거나 낮게 발현된다.
본 개시의 한 구현예에서, 제1 핵산 분자 및 제2 핵산 분자는 제1 발현 벡터에 로딩되며; 제3 핵산 분자, 제4 핵산 분자, 제5 핵산 분자 및 선택적으로 제9 핵산 분자는 제2 발현 벡터에 로딩되고; 제6 핵산 분자, 제7 핵산 분자, 제8 핵산 분자 및 선택적으로 제10 핵산 분자는 제3 발현 벡터에 로딩된다. 제1, 제2 및 제3 발현 벡터는 세포와 같은, 적합한 미세환경에서 관심 있는 유전자의 특이적 발현을 조절하기 위하여 발현 시스템에 대한 로딩 벡터로서 작용한다.
발현 벡터의 선택은 발현 시스템이 적합한 미세환경에서 그것의 기능을 나타낼 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 본 개시의 특정 구현예에 따르면, 제1 발현 벡터, 제2 발현 벡터 및 제3 발현 벡터는 각각 독립적으로 플라스미드, 바이러스, 안정적인 세포주, 및 나노물질, 리포좀, 분자적으로 결합된 벡터, 네이키드 DNA, 염색체 벡터 및 중합체와 같은 기타 운반체 중 적어도 하나로부터 선택된다.
본 개시의 한 구현예에서, 바이러스는 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 레트로바이러스로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함한다.
본 개시의 한 구현예에서, 제1 발현 벡터, 제2 발현 벡터 및 제3 발현 벡터는 하나의 동일한 벡터에 로딩된다. 제1 발현 벡터, 제2 발현 벡터 및 제3 발현 벡터의 연결 순서는 그것이 발현 시스템의 생물학적 기능의 현실화에 영향을 미치지 않는 한 특별히 제한되지 않는다는 것이 주지되어야 한다. 본 개시의 특정 구현예에 따르면, 다수의 큰 단편 벡터의 매우 낮은 공동 트랜스펙션 효율의 문제는 하나의 동일한 발현 벡터 상에의 로딩에 의해 효과적으로 해결될 수 있다.
본 개시의 한 구현예에서, 하나의 동일한 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 유전자 요법 벡터로서, 아데노바이러스는 광범위한 숙주, 인간에 대한 낮은 병원성, 증식 및 비증식 세포에서의 감염 및 유전자 발현, 고역가, 인간 유전자와의 상동성, 삽입 후 돌연변이유발성 없음, 뿐만 아니라 현탁 상태에서의 증폭 및 동시에 다중 유전자를 발현하는 장점들을 가진다.
본 개시의 특정 구현예에서, 제1 발현 벡터는 5' 단부로부터 3' 단부쪽으로: BsaI, AFP III, Gal4VP16 및 BsaI을 포함한다(BsaI-AFP III-Gal4VP16-BsaI).
본 개시의 한 구현예에서, 제1 발현 벡터는 SEQ ID NO: 1에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산을 운반한다.
GGTCTCTGCTCCAGATTGAATTATTTGCCTGTCATACAGCTAATAATTGACCATAAGACAATTAGATTTAAATTAGTTTTGAATCTTTCTAATACCAAAGTTCAGTTTACTGTTCCATGTTGCTTCTGAGTGGCTTCACAGACTTATGAAAAAGTAAACGGAATCAGAATTACATCAATGCAAAAGCATTGCTGTGAACTCTGTACTTAGGACTAAACTTTGAGCAATAACACATATAGATTGAGGATTGTTTGCTGTTAGTATACAAACTCTGGTTCAAAGCTCCTCTTTATTGCTTGTCTTGGAAAATTTGCTGTTCTTCATGGTTTCTCTTTTCACTGCTATCTATTTTTCTCAACCACTCACATGGCTACAAAAGCTTCCTGATTAATAATTACACTAAGTCAATAGGCATAGAGCCAGGACTGTTTGGGTAAACTGGTCACTTTATCTTAAACTAAATATATCCAAAACTGAACATGTACTTAGTTACTAAGTCTTTGACTTTATCTCATTCATACCACTCAGCTTTATCCAGGCCACTTATTTGACAGTATTATTGCGAAAACTTCCTATCTAGAAGTTTGAGGAGAATATTTGTTATATTTGCAAAATAAAATAAGTTTGCAAGTTTTTTTTTTCTGCCCCAAAGAGCTCTGTGTCCTTGAACATAAAATACAAATAACCGCTATGCTGTTAATTATTGACAAATGTCCCATTTTCAACCTAAGGAAATACCATAAAGTAACAGATATACCAACAAAAGGTTACTAGTTAACAGGCATTGCCTGAAAAGAGTATAAAAGAATTTCAGCATGATTTTCCATATTGTGCTTCCACCACTGCCAATAACAAAATAACTAGCAAGGATCCGGCCACCATGGCCCCCCCGACCGATGTCAGCCTGGGGGACGAGCTCCACTTAGACGGCGAGGACGTGGCGATGGCGCATGCCGACGCGCTAGACGATTTCGATCTGGACATGTTGGGGGACGGGGATTCCCCGGGTCCGGGATTTACCCCCCACGACTCCGCCCCCTACGGCGCTCTGGATATGGCCGACTTCGAGTTTGAGCAGATGTTTACCGATGCCCTTGGAATTGACGAGTACGGTGGGACGCGTATGAAGCTACTGTCTTCTATCGAACAAGCATGCGATATTTGCCGACTTAAAAAGCTCAAGTGCTCCAAAGAAAAACCGAAGTGCGCCAAGTGTCTGAAGAACAACTGGGAGTGTCGCTACTCTCCCAAAACCAAAAGGTCTCCGCTGACTAGGGCACATCTGACAGAAGTGGAATCAAGGCTAGAAAGACTGGAACAGCTATTTCTACTGATTTTTCCTCGAGAAGACCTTGACATGATTTTGAAAATGGATTCTTTACAGGATATAAAAGCATTGTTAACAGGATTATTTGTACAAGATAATGTGAATAAAGATGCCGTCACAGATAGATTGGCTTCAGTGGAGACTGATATGCCTCTAACATTGAGACAGCATAGAATAAGTGCGACATCATCATCGGAAGAGAGTAGTAACAAAGGTCAAAGACAGTTGACTGTATAATTCACTCCTCAGGTGCAGGCTGCCTATCAGAAGGTGGTGGCTGGTGTGGCCAATGCCCTGGCTCACAAATACCACTGAGATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCATTTAAAACATCAGAATGAGTATTTGGTTTAGAGTTTGGCAACATATGCCCATATGCTGGCTGCCATGAACAAAGGTTGGCTATAAAGAGGTCATCAGTATATGAAACAGCCCCCTGCTGTCCATTCCTTATTCCATAGAAAAGCCTTGACTTGAGGTTAGATTTTTTTTATATTTTGTTTTGTGTTATTTTTTTCTTTAACATCCCTAAAATTTTCCTTACATGTTTTACTAGCCAGATTTTTCCTCCTCTCCTGACTACTCCCAGTCATAGCTGTCCCTCTTCTCTTATGGAGATCGGAGAAAGAGGTAATTTAATTAAGTCGATGAGACC(SEQ ID NO:1).
본 개시의 특정 구현예에서, 제2 발현 벡터는 5' 단부로부터 3' 단부쪽으로: BsaI, 5 Х UAS, tetO, miniCMV, tetO, E1A, 2A, 면역 효과 인자(이펙터), LacI, 마이크로RNA199a 특이적 인식 서열(표적 부위) 및 BsaI을 포함한다(BsaI-5 Х UAS-tetO-miniCMV-tetO-E1A-2A-이펙터-LacI-miR199a 표적 부위-BsaI). 본 개시의 특정 구현예에서, 이펙터는 구체적으로 IL-2, hGM-CSF, mGM-CSF, 항-PD-1 scFv, 항-PD-L1 scFv, IL-2-항-PD-1 scfv 융합 단백질, hGM-CSF-항-PD-1scfv 융합 단백질, mGM-CSF-항-PD-1scfv 융합 단백질, IL-2-항-PD-L1scfv 융합 단백질, hGM-CSF-항-PD-L1scfv 융합 단백질, mGM-CSF-항-PD-L1scfv 융합 단백질을 포함한다.
본 개시의 한 구현예에서, 제2 발현 벡터는 SEQ ID NO: 2 내지 7로 구성되는 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산을 운반한다.
GGTCTCTCTATTTAATTAAGTAACTATAACGGTCGCTCCGAATTTCTCGAGTTAATTAAGATTACGCCAAGCTACGGGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTTCTGTCCTCCGAGCGGAGACTCTAGACTCCCTATCAGTGATAGAGATAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCTCCCTATCAGTGATAGAGAGAATTCGACCGCCACCATGTCGGAATTCATGAGACATATTATCTGCCACGGAGGTGTTATTACCGAAGAAATGGCCGCCAGTCTTTTGGACCAGCTGATCGAAGAGGTACTGGCTGATAATCTTCCACCTCCTAGCCATTTTGAACCACCTACCCTTCACGAACTGTATGATTTAGACGTGACGGCCCCCGAAGATCCCAACGAGGAGGCGGTTTCGCAGATTTTTCCCGACTCTGTAATGTTGGCGGTGCAGGAAGGGATTGACTTACTCACTTTTCCGCCGGCGCCCGGTTCTCCGGAGCCGCCTCACCTTTCCCGGCAGCCCGAGCAGCCGGAGCAGAGAGCCTTGGGTCCGGTTTCTATGCCAAACCTTGTACCGGAGGTGATCGATCTTACCTGCCACGAGGCTGGCTTTCCACCCAGTGACGACGAGGATGAAGAGGGTGAGGAGTTTGTGTTAGATTATGTGGAGCACCCCGGGCACGGTTGCAGGTCTTGTCATTATCACCGGAGGAATACGGGGGACCCAGATATTATGTGTTCGCTTTGCTATATGAGGACCTGTGGCATGTTTGTCTACAGTAAGTGAAAATTATGGGCAGTGGGTGATAGAGTGGTGGGTTTGGTGTGGTAATTTTTTTTTTAATTTTTACAGTTTTGTGGTTTAAAGAATTTTGTATTGTGATTTTTTTAAAAGGTCCTGTGTCTGAACCTGAGCCTGAGCCCGAGCCAGAACCGGAGCCTGCAAGACCTACCCGCCGTCCTAAAATGGCGCCTGCTATCCTGAGACGCCCGACATCACCTGTGTCTAGAGAATGCAATAGTAGTACGGATAGCTGTGACTCCGGTCCTTCTAACACACCTCCTGAGATACACCCGGTGGTCCCGCTGTGCCCCATTAAACCAGTTGCCGTGAGAGTTGGTGGGCGTCGCCAGGCTGTGGAATGTATCGAGGACTTGCTTAACGAGCCTGGGCAACCTTTGGACTTGAGCTGTAAACGCCCCAGGCCACTCGAGGGTACCGGGTCCGGAGCTACAAATTTTTCCCTCCTCAAACAGGCTGGAGATGTCGAAGAAAATCCTGGGCCTACCGGTCCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGAGGGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCAACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGAGCCACGGCGTGCAGTGCTTCGCCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCACCTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTAGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCGTCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTTCAACAGCCACAACATCTATATCATGGCCGTCAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACGTGGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAGCCACTACCTGAGCACCCAGTCCGTGCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCCGCACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGAGATCTGAGGGCCGCGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAAAACCCCGGCCCCGGATCCATGAAACCAGTAACGTTATACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGGAAAAAGTGGAAGCGGCGATGGCGGAGCTGAATTACATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCACCTCCAGTCTGGCCCTGCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATCAACTGGGTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAGCCTGTAAAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTGATCATTAACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCTGCACTAATGTTCCGGCGTTATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATGAAGACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCATCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGCGCTGTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATAAATATCTCACTCGCAATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGTGCCATGTCCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGTTCCCACTGCGATGCTGGTTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGATATCTCGGTAGTGGGATACGACGATACCGAAGACAGCTCATGTTATATCCCGCCGTTAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGAGCAGCCTGAGGCCTCCTAAGAAGAAGAGGAAGGTTGCGGCCGCTAACCAATGTGCAGACTACTGTTAACCAATGTGCAGACTACTGTGAATTCTAACCAATGTGCAGACTACTGTTAACCAATGTGCAGACTACTGTAAGCTTCGAATTGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGGTCGACAATACTAGTTAAGAAATGAGACC(SEQ ID NO:2).
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GGTCTCTCTATTTAATTAAGTAACTATAACGGTCGCTCCGAATTTCTCGAGTTAATTAAGATTACGCCAAGCTACGGGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTTCTGTCCTCCGAGCGGAGACTCTAGACTCCCTATCAGTGATAGAGATAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCTCCCTATCAGTGATAGAGAGAATTCGACCGCCACCATGTCGGAATTCATGAGACATATTATCTGCCACGGAGGTGTTATTACCGAAGAAATGGCCGCCAGTCTTTTGGACCAGCTGATCGAAGAGGTACTGGCTGATAATCTTCCACCTCCTAGCCATTTTGAACCACCTACCCTTCACGAACTGTATGATTTAGACGTGACGGCCCCCGAAGATCCCAACGAGGAGGCGGTTTCGCAGATTTTTCCCGACTCTGTAATGTTGGCGGTGCAGGAAGGGATTGACTTACTCACTTTTCCGCCGGCGCCCGGTTCTCCGGAGCCGCCTCACCTTTCCCGGCAGCCCGAGCAGCCGGAGCAGAGAGCCTTGGGTCCGGTTTCTATGCCAAACCTTGTACCGGAGGTGATCGATCTTACCTGCCACGAGGCTGGCTTTCCACCCAGTGACGACGAGGATGAAGAGGGTGAGGAGTTTGTGTTAGATTATGTGGAGCACCCCGGGCACGGTTGCAGGTCTTGTCATTATCACCGGAGGAATACGGGGGACCCAGATATTATGTGTTCGCTTTGCTATATGAGGACCTGTGGCATGTTTGTCTACAGTAAGTGAAAATTATGGGCAGTGGGTGATAGAGTGGTGGGTTTGGTGTGGTAATTTTTTTTTTAATTTTTACAGTTTTGTGGTTTAAAGAATTTTGTATTGTGATTTTTTTAAAAGGTCCTGTGTCTGAACCTGAGCCTGAGCCCGAGCCAGAACCGGAGCCTGCAAGACCTACCCGCCGTCCTAAAATGGCGCCTGCTATCCTGAGACGCCCGACATCACCTGTGTCTAGAGAATGCAATAGTAGTACGGATAGCTGTGACTCCGGTCCTTCTAACACACCTCCTGAGATACACCCGGTGGTCCCGCTGTGCCCCATTAAACCAGTTGCCGTGAGAGTTGGTGGGCGTCGCCAGGCTGTGGAATGTATCGAGGACTTGCTTAACGAGCCTGGGCAACCTTTGGACTTGAGCTGTAAACGCCCCAGGCCACTCGAGGGTACCGGGTCCGGAGCTACAAATTTTTCCCTCCTCAAACAGGCTGGAGATGTCGAAGAAAATCCTGGGCCTACCGGTCACCATGGATGTGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCTTGGGCACTGTGGCCTGCAGCATCTCTGCACCCGCCCGCTCGCCCAGCCCCAGCACGCAGCCCTGGGAGCATGTGAATGCCATCCAGGAGGCCCGGCGTCTCCTGAACCTGAGTAGAGACACTGCTGCTGAGATGAATGAAACAGTAGAAGTCATCTCAGAAATGTTTGACCTCCAGGAGCCGACCTGCCTACAGACCCGCCTGGAGCTGTACAAGCAGGGCCTGCGGGGCAGCCTCACCAAGCTCAAGGGCCCCTTGACCATGATGGCCAGCCACTACAAGCAGCACTGCCCTCCAACCCCGGAAACTTCCTGTGCAACCCAGATTATCACCTTTGAAAGTTTCAAAGAGAACCTGAAGGACTTTCTGCTTGTCATCCCCTTTGACTGCTGGGAGCCAGTCCAGGAGTGAAGATCTGAGGGCCGCGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAAAACCCCGGCCCCGGATCCATGAAACCAGTAACGTTATACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGGAAAAAGTGGAAGCGGCGATGGCGGAGCTGAATTACATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCACCTCCAGTCTGGCCCTGCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATCAACTGGGTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAGCCTGTAAAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTGATCATTAACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCTGCACTAATGTTCCGGCGTTATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATGAAGACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCATCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGCGCTGTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATAAATATCTCACTCGCAATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGTGCCATGTCCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGTTCCCACTGCGATGCTGGTTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGATATCTCGGTAGTGGGATACGACGATACCGAAGACAGCTCATGTTATATCCCGCCGTTAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGAGCAGCCTGAGGCCTCCTAAGAAGAAGAGGAAGGTTGCGGCCGCTAACCAATGTGCAGACTACTGTTAACCAATGTGCAGACTACTGTGAATTCTAACCAATGTGCAGACTACTGTTAACCAATGTGCAGACTACTGTAAGCTTCGAATTGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGGTCGACAATACTAGTTAAGAAATGAGACC(SEQ ID NO:4).
GGTCTCTCTATTTAATTAAGTAACTATAACGGTCGCTCCGAATTTCTCGAGTTAATTAAGATTACGCCAAGCTACGGGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTTCTGTCCTCCGAGCGGAGACTCTAGACTCCCTATCAGTGATAGAGATAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCTCCCTATCAGTGATAGAGAGAATTCGACCGCCACCATGTCGGAATTCATGAGACATATTATCTGCCACGGAGGTGTTATTACCGAAGAAATGGCCGCCAGTCTTTTGGACCAGCTGATCGAAGAGGTACTGGCTGATAATCTTCCACCTCCTAGCCATTTTGAACCACCTACCCTTCACGAACTGTATGATTTAGACGTGACGGCCCCCGAAGATCCCAACGAGGAGGCGGTTTCGCAGATTTTTCCCGACTCTGTAATGTTGGCGGTGCAGGAAGGGATTGACTTACTCACTTTTCCGCCGGCGCCCGGTTCTCCGGAGCCGCCTCACCTTTCCCGGCAGCCCGAGCAGCCGGAGCAGAGAGCCTTGGGTCCGGTTTCTATGCCAAACCTTGTACCGGAGGTGATCGATCTTACCTGCCACGAGGCTGGCTTTCCACCCAGTGACGACGAGGATGAAGAGGGTGAGGAGTTTGTGTTAGATTATGTGGAGCACCCCGGGCACGGTTGCAGGTCTTGTCATTATCACCGGAGGAATACGGGGGACCCAGATATTATGTGTTCGCTTTGCTATATGAGGACCTGTGGCATGTTTGTCTACAGTAAGTGAAAATTATGGGCAGTGGGTGATAGAGTGGTGGGTTTGGTGTGGTAATTTTTTTTTTAATTTTTACAGTTTTGTGGTTTAAAGAATTTTGTATTGTGATTTTTTTAAAAGGTCCTGTGTCTGAACCTGAGCCTGAGCCCGAGCCAGAACCGGAGCCTGCAAGACCTACCCGCCGTCCTAAAATGGCGCCTGCTATCCTGAGACGCCCGACATCACCTGTGTCTAGAGAATGCAATAGTAGTACGGATAGCTGTGACTCCGGTCCTTCTAACACACCTCCTGAGATACACCCGGTGGTCCCGCTGTGCCCCATTAAACCAGTTGCCGTGAGAGTTGGTGGGCGTCGCCAGGCTGTGGAATGTATCGAGGACTTGCTTAACGAGCCTGGGCAACCTTTGGACTTGAGCTGTAAACGCCCCAGGCCACTCGAGGGTACCGGGTCCGGAGCTACAAATTTTTCCCTCCTCAAACAGGCTGGAGATGTCGAAGAAAATCCTGGGCCTACCGGTCACCATGGATGTGGCTGCAGAATTTACTTTTCCTGGGCATTGTGGTCTACAGCCTCTCAGCACCCACCCGCTCACCCATCACTGTCACCCGGCCTTGGAAGCATGTAGAGGCCATCAAAGAAGCCCTGAACCTCCTGGATGACATGCCTGTCACGTTGAATGAAGAGGTAGAAGTCGTCTCTAACGAGTTCTCCTTCAAGAAGCTAACATGTGTGCAGACCCGCCTGAAGATATTCGAGCAGGGTCTACGGGGCAATTTCACCAAACTCAAGGGCGCCTTGAACATGACAGCCAGCTACTACCAGACATACTGCCCCCCAACTCCGGAAACGGACTGTGAAACACAAGTTACCACCTATGCGGATTTCATAGACAGCCTTAAAACCTTTCTGACTGATATCCCCTTTGAATGCAAAAAACCAGGCCAAAAATGAAGATCTGAGGGCCGCGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAAAACCCCGGCCCCGGATCCATGAAACCAGTAACGTTATACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGGAAAAAGTGGAAGCGGCGATGGCGGAGCTGAATTACATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCACCTCCAGTCTGGCCCTGCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATCAACTGGGTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAGCCTGTAAAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTGATCATTAACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCTGCACTAATGTTCCGGCGTTATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATGAAGACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCATCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGCGCTGTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATAAATATCTCACTCGCAATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGTGCCATGTCCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGTTCCCACTGCGATGCTGGTTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGATATCTCGGTAGTGGGATACGACGATACCGAAGACAGCTCATGTTATATCCCGCCGTTAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGAGCAGCCTGAGGCCTCCTAAGAAGAAGAGGAAGGTTGCGGCCGCTAACCAATGTGCAGACTACTGTTAACCAATGTGCAGACTACTGTGAATTCTAACCAATGTGCAGACTACTGTTAACCAATGTGCAGACTACTGTAAGCTTCGAATTGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGGTCGACAATACTAGTTAAGAAATGAGACC(SEQ ID NO:5).
GGTCTCTCTATTTAATTAAGTAACTATAACGGTCGCTCCGAATTTCTCGAGTTAATTAAGATTACGCCAAGCTACGGGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTTCTGTCCTCCGAGCGGAGACTCTAGACTCCCTATCAGTGATAGAGATAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCTCCCTATCAGTGATAGAGAGAATTCGACCGCCACCATGTCGGAATTCATGAGACATATTATCTGCCACGGAGGTGTTATTACCGAAGAAATGGCCGCCAGTCTTTTGGACCAGCTGATCGAAGAGGTACTGGCTGATAATCTTCCACCTCCTAGCCATTTTGAACCACCTACCCTTCACGAACTGTATGATTTAGACGTGACGGCCCCCGAAGATCCCAACGAGGAGGCGGTTTCGCAGATTTTTCCCGACTCTGTAATGTTGGCGGTGCAGGAAGGGATTGACTTACTCACTTTTCCGCCGGCGCCCGGTTCTCCGGAGCCGCCTCACCTTTCCCGGCAGCCCGAGCAGCCGGAGCAGAGAGCCTTGGGTCCGGTTTCTATGCCAAACCTTGTACCGGAGGTGATCGATCTTACCTGCCACGAGGCTGGCTTTCCACCCAGTGACGACGAGGATGAAGAGGGTGAGGAGTTTGTGTTAGATTATGTGGAGCACCCCGGGCACGGTTGCAGGTCTTGTCATTATCACCGGAGGAATACGGGGGACCCAGATATTATGTGTTCGCTTTGCTATATGAGGACCTGTGGCATGTTTGTCTACAGTAAGTGAAAATTATGGGCAGTGGGTGATAGAGTGGTGGGTTTGGTGTGGTAATTTTTTTTTTAATTTTTACAGTTTTGTGGTTTAAAGAATTTTGTATTGTGATTTTTTTAAAAGGTCCTGTGTCTGAACCTGAGCCTGAGCCCGAGCCAGAACCGGAGCCTGCAAGACCTACCCGCCGTCCTAAAATGGCGCCTGCTATCCTGAGACGCCCGACATCACCTGTGTCTAGAGAATGCAATAGTAGTACGGATAGCTGTGACTCCGGTCCTTCTAACACACCTCCTGAGATACACCCGGTGGTCCCGCTGTGCCCCATTAAACCAGTTGCCGTGAGAGTTGGTGGGCGTCGCCAGGCTGTGGAATGTATCGAGGACTTGCTTAACGAGCCTGGGCAACCTTTGGACTTGAGCTGTAAACGCCCCAGGCCACTCGAGGGTACCGGGTCCGGAGCTACAAATTTTTCCCTCCTCAAACAGGCTGGAGATGTCGAAGAAAATCCTGGGCCTACCGGTCCCATGAGTGTGCCCACTCAGGTCCTGGGGTTGCTGCTGCTGTGGCTTACAGACGCTCGCTGCCAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCCGGCAGGAGCCTGAGGCTGGACTGCAAGGCCAGCGGCATCACCTTCAGCAACAGCGGCATGCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCGTGATCTGGTACGACGGCAGCAAGAGGTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCAGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTTCCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCACCAACGACGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGCCACCCTGAGCCTGAGCCCCGGCGAGAGGGCCACCCTGAGCTGCAGGGCCAGCCAGAGCGTGAGCAGCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCAGGCTGCTGATCTACGACGCCAGCAACAGGGCCACCGGCATCCCCGCCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGGAGCCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGAGCAGCAACTGGCCCAGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGAGATCTGAGGGCCGCGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAAAACCCCGGCCCCGGATCCATGAAACCAGTAACGTTATACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGGAAAAAGTGGAAGCGGCGATGGCGGAGCTGAATTACATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCACCTCCAGTCTGGCCCTGCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATCAACTGGGTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAGCCTGTAAAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTGATCATTAACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCTGCACTAATGTTCCGGCGTTATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATGAAGACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCATCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGCGCTGTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATAAATATCTCACTCGCAATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGTGCCATGTCCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGTTCCCACTGCGATGCTGGTTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGATATCTCGGTAGTGGGATACGACGATACCGAAGACAGCTCATGTTATATCCCGCCGTTAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGAGCAGCCTGAGGCCTCCTAAGAAGAAGAGGAAGGTTGCGGCCGCTAACCAATGTGCAGACTACTGTTAACCAATGTGCAGACTACTGTGAATTCTAACCAATGTGCAGACTACTGTTAACCAATGTGCAGACTACTGTAAGCTTCGAATTGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGGTCGACAATACTAGTTAAGAAATGAGACC(SEQ ID NO:6).
GGTCTCTCTATTTAATTAAGTAACTATAACGGTCGCTCCGAATTTCTCGAGTTAATTAAGATTACGCCAAGCTACGGGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTTCTGTCCTCCGAGCGGAGACTCTAGACTCCCTATCAGTGATAGAGATAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCTCCCTATCAGTGATAGAGAGAATTCGACCGCCACCATGTCGGAATTCATGAGACATATTATCTGCCACGGAGGTGTTATTACCGAAGAAATGGCCGCCAGTCTTTTGGACCAGCTGATCGAAGAGGTACTGGCTGATAATCTTCCACCTCCTAGCCATTTTGAACCACCTACCCTTCACGAACTGTATGATTTAGACGTGACGGCCCCCGAAGATCCCAACGAGGAGGCGGTTTCGCAGATTTTTCCCGACTCTGTAATGTTGGCGGTGCAGGAAGGGATTGACTTACTCACTTTTCCGCCGGCGCCCGGTTCTCCGGAGCCGCCTCACCTTTCCCGGCAGCCCGAGCAGCCGGAGCAGAGAGCCTTGGGTCCGGTTTCTATGCCAAACCTTGTACCGGAGGTGATCGATCTTACCTGCCACGAGGCTGGCTTTCCACCCAGTGACGACGAGGATGAAGAGGGTGAGGAGTTTGTGTTAGATTATGTGGAGCACCCCGGGCACGGTTGCAGGTCTTGTCATTATCACCGGAGGAATACGGGGGACCCAGATATTATGTGTTCGCTTTGCTATATGAGGACCTGTGGCATGTTTGTCTACAGTAAGTGAAAATTATGGGCAGTGGGTGATAGAGTGGTGGGTTTGGTGTGGTAATTTTTTTTTTAATTTTTACAGTTTTGTGGTTTAAAGAATTTTGTATTGTGATTTTTTTAAAAGGTCCTGTGTCTGAACCTGAGCCTGAGCCCGAGCCAGAACCGGAGCCTGCAAGACCTACCCGCCGTCCTAAAATGGCGCCTGCTATCCTGAGACGCCCGACATCACCTGTGTCTAGAGAATGCAATAGTAGTACGGATAGCTGTGACTCCGGTCCTTCTAACACACCTCCTGAGATACACCCGGTGGTCCCGCTGTGCCCCATTAAACCAGTTGCCGTGAGAGTTGGTGGGCGTCGCCAGGCTGTGGAATGTATCGAGGACTTGCTTAACGAGCCTGGGCAACCTTTGGACTTGAGCTGTAAACGCCCCAGGCCACTCGAGGGTACCGGGTCCGGAGCTACAAATTTTTCCCTCCTCAAACAGGCTGGAGATGTCGAAGAAAATCCTGGGCCTACCGGTCCCATGAGTGTGCCCACTCAGGTCCTGGGGTTGCTGCTGCTGTGGCTTACAGACGCTCGCTGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCGACAGCTGGATCCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCTGGATCAGCCCCTACGGCGGCAGCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCGCCGACACCAGCAAGAACACCGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGGCACTGGCCCGGCGGCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAGGGCCAGCCAGGACGTGAGCACCGCCGTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACAGCGCCAGCTTCCTGTACAGCGGCGTGCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTACCTGTACCACCCCGCCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGAGATCTGAGGGCCGCGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAAAACCCCGGCCCCGGATCCATGAAACCAGTAACGTTATACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGGAAAAAGTGGAAGCGGCGATGGCGGAGCTGAATTACATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCACCTCCAGTCTGGCCCTGCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATCAACTGGGTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAGCCTGTAAAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTGATCATTAACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCTGCACTAATGTTCCGGCGTTATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATGAAGACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCATCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGCGCTGTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATAAATATCTCACTCGCAATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGTGCCATGTCCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGTTCCCACTGCGATGCTGGTTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGATATCTCGGTAGTGGGATACGACGATACCGAAGACAGCTCATGTTATATCCCGCCGTTAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGAGCAGCCTGAGGCCTCCTAAGAAGAAGAGGAAGGTTGCGGCCGCTAACCAATGTGCAGACTACTGTTAACCAATGTGCAGACTACTGTGAATTCTAACCAATGTGCAGACTACTGTTAACCAATGTGCAGACTACTGTAAGCTTCGAATTGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGGTCGACAATACTAGTTAAGAAATGAGACC(SEQ ID NO:7).
상기에서 SEQ ID NO: 2는 BsaI-5 Х UAS-tetO-miniCMV-tetO-E1A-2A-EBFP-2A-LacI-miR199a 표적 부위-BsaI의 서열이고;
SEQ ID NO: 3은 BsaI-5 Х UAS-tetO-miniCMV-tetO-E1A-2A-hIL-2-2A-LacI-miR199a 표적 부위-BsaI의 서열이며;
SEQ ID NO: 4는 BsaI-5 Х UAS-tetO-miniCMV-tetO-E1A-2A-hGM-CSF-2A-LacI-miR199a 표적 부위-BsaI의 서열이고;
SEQ ID NO: 5는 BsaI-5 Х UAS-tetO-miniCMV-tetO-E1A-2A-mGM-CSF-2A-LacI-miR199a 표적 부위-BsaI의 서열이며;
SEQ ID NO: 6은 BsaI-5 Х UAS-tetO-miniCMV-tetO-E1A-2A-항-PD-1scFv-2A-LacI-miR199a 표적 부위-BsaI의 서열이고; 및
SEQ ID NO: 7은 BsaI-5 Х UAS-tetO-miniCMV-tetO-E1A-2A-항-PD-L1scFv-2A-LacI-miR199a 표적 부위-BsaI의 서열이다.
본 개시의 특정 구현예에서, 제3 발현 벡터는 5' 단부로부터 3' 단부쪽으로: BsaI, 5 Х UAS, LacO, miniCMV, LacO, tetR-KRAB, 마이크로RNA21 특이적 인식 서열(표적 부위) 및 BsaI을 포함한다(BsaI-5 Х UAS-LacO-miniCMV-LacO-tetR-KRAB-마이크로RNA21 표적 부위-BsaI).
본 개시의 한 구현예에서, 제3 발현 벡터는 SEQ ID NO: 8에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산을 운반한다.
GGTCTCCGAAATCGCCAAGCTACGGGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGACTCTAGAAATTGTGAGCGGATAACAATTTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCAGCTGACAAAATTGTGAGCGCTCACAATTACTAGAAGATCTTGAATTCGCCACCATGGCTAGATTAGATAAAAGTAAAGTGATTAACAGCGCATTAGAGCTGCTTAATGAGGTCGGAATCGAAGGTTTAACAACCCGTAAACTCGCCCAGAAGCTAGGTGTAGAGCAGCCTACATTGTATTGGCATGTAAAAAATAAGCGGGCTTTGCTCGACGCCTTAGCCATTGAGATGTTAGATAGGCACCATACTCACTTTTGCCCTTTAGAAGGGGAAAGCTGGCAAGATTTTTTACGTAATAACGCTAAAAGTTTTAGATGTGCTTTACTAAGTCATCGCGATGGAGCAAAAGTACATTTAGGTACACGGCCTACAGAAAAACAGTATGAAACTCTCGAAAATCAATTAGCCTTTTTATGCCAACAAGGTTTTTCACTAGAGAATGCATTATATGCACTCAGCGCTGTGGGGCATTTTACTTTAGGTTGCGTATTGGAAGATCAAGAGCATCAAGTCGCTAAAGAAGAAAGGGAAACACCTACTACTGATAGTATGCCGCCATTATTACGACAAGCTATCGAATTATTTGATCACCAAGGTGCAGAGCCAGCCTTCTTATTCGGCCTTGAATTGATCATATGCGGATTAGAAAAACAACTTAAATGTGAAAGTGGGTCGCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTCGACGGCGGTGGTGCTTTGTCTCCTCAGCACTCTGCTGTCACTCAAGGAAGTATCATCAAGAACAAGGAGGGCATGGATGCTAAGTCACTAACTGCCTGGTCCCGGACACTGGTGACCTTCAAGGATGTATTTGTGGACTTCACCAGGGAGGAGTGGAAGCTGCTGGACACTGCTCAGCAGATCGTGTACAGAAATGTGATGCTGGAGAACTATAAGAACCTGGTTTCCTTGGGTTATCAGCTTACTAAGCCAGATGTGATCCTCCGGTTGGAGAAGGGAGAAGAGCCCTGGCTGGTGGAGAGAGAAATTCACCAAGAGACCCATCCTGATTCAGAGACTGCATTTGAAATCAAATCATCAGTTTAATACAAGGCGGCCGCAAATCAACATCAGTCTGATAAGCTATCAACATCAGTCTGATAAGCTATCAACATCAGTCTGATAAGCTATCAACATCAGTCTGATAAGCTAAAGCTTCGAATTCTGATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCAGCTCTGAGACC(SEQ ID NO:8).
본 개시의 특정 구현예에서, 아데노바이러스는 5' 단부로부터 3' 단부쪽으로: 제1 반전 말단 반복 서열(ITR), 포장 신호, AFPIII, Gal4VP16, 5 x UAS, tetO, miniCMV, tetO, E1A, 2A, 이펙터, 2A, LacI, miR 199a 표적 부위, 5 x UAS, LacO, miniCMV, LacO, tetR-KRAB, miR21 표적 부위, 아데노바이러스 E2 유전자 영역, 아데노바이러스 E3 유전자 영역(영역 28922-30801의 제거), 아데노바이러스 E4 유전자 영역, 및 제2 반전 말단 반복 서열(ITR)을 포함한다. 상기 아데노바이러스는 발명자들에 의해 종양 마우스 모델에 주입될 때 마우스에서 종양의 성장을 유의하게 억제할 수 있다. 상기 아데노바이러스는 안전하고 효과적인 방식으로 관련 종양을 특이적으로 사멸하기 위한 안전하고 효과적인 항암 바이러스 백신으로서 사용될 수 있다.
본 개시의 한 구현예에서, 아데노바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 9 내지 14로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산을 운반한다.
GTAACTATAACGGTCGCTCCGAATTTCTCGAGTTAATTAAGATTACGCCAAGCTACGGGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTTCTGTCCTCCGAGCGGAGACTCTAGACTCCCTATCAGTGATAGAGATAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCTCCCTATCAGTGATAGAGAGAATTCGACCGCCACCATGTCGGAATTCATGAGACATATTATCTGCCACGGAGGTGTTATTACCGAAGAAATGGCCGCCAGTCTTTTGGACCAGCTGATCGAAGAGGTACTGGCTGATAATCTTCCACCTCCTAGCCATTTTGAACCACCTACCCTTCACGAACTGTATGATTTAGACGTGACGGCCCCCGAAGATCCCAACGAGGAGGCGGTTTCGCAGATTTTTCCCGACTCTGTAATGTTGGCGGTGCAGGAAGGGATTGACTTACTCACTTTTCCGCCGGCGCCCGGTTCTCCGGAGCCGCCTCACCTTTCCCGGCAGCCCGAGCAGCCGGAGCAGAGAGCCTTGGGTCCGGTTTCTATGCCAAACCTTGTACCGGAGGTGATCGATCTTACCTGCCACGAGGCTGGCTTTCCACCCAGTGACGACGAGGATGAAGAGGGTGAGGAGTTTGTGTTAGATTATGTGGAGCACCCCGGGCACGGTTGCAGGTCTTGTCATTATCACCGGAGGAATACGGGGGACCCAGATATTATGTGTTCGCTTTGCTATATGAGGACCTGTGGCATGTTTGTCTACAGTAAGTGAAAATTATGGGCAGTGGGTGATAGAGTGGTGGGTTTGGTGTGGTAATTTTTTTTTTAATTTTTACAGTTTTGTGGTTTAAAGAATTTTGTATTGTGATTTTTTTAAAAGGTCCTGTGTCTGAACCTGAGCCTGAGCCCGAGCCAGAACCGGAGCCTGCAAGACCTACCCGCCGTCCTAAAATGGCGCCTGCTATCCTGAGACGCCCGACATCACCTGTGTCTAGAGAATGCAATAGTAGTACGGATAGCTGTGACTCCGGTCCTTCTAACACACCTCCTGAGATACACCCGGTGGTCCCGCTGTGCCCCATTAAACCAGTTGCCGTGAGAGTTGGTGGGCGTCGCCAGGCTGTGGAATGTATCGAGGACTTGCTTAACGAGCCTGGGCAACCTTTGGACTTGAGCTGTAAACGCCCCAGGCCACTCGAGGGTACCGGGTCCGGAGCTACAAATTTTTCCCTCCTCAAACAGGCTGGAGATGTCGAAGAAAATCCTGGGCCTACCGGTCCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGAGGGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCAACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGAGCCACGGCGTGCAGTGCTTCGCCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCACCTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTAGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCGTCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTTCAACAGCCACAACATCTATATCATGGCCGTCAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACGTGGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAGCCACTACCTGAGCACCCAGTCCGTGCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCCGCACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGAGATCTGAGGGCCGCGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAAAACCCCGGCCCCGGATCCATGAAACCAGTAACGTTATACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGGAAAAAGTGGAAGCGGCGATGGCGGAGCTGAATTACATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCACCTCCAGTCTGGCCCTGCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATCAACTGGGTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAGCCTGTAAAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTGATCATTAACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCTGCACTAATGTTCCGGCGTTATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATGAAGACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCATCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGCGCTGTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATAAATATCTCACTCGCAATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGTGCCATGTCCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGTTCCCACTGCGATGCTGGTTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGATATCTCGGTAGTGGGATACGACGATACCGAAGACAGCTCATGTTATATCCCGCCGTTAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGAGCAGCCTGAGGCCTCCTAAGAAGAAGAGGAAGGTTGCGGCCGCTAACCAATGTGCAGACTACTGTTAACCAATGTGCAGACTACTGTGAATTCTAACCAATGTGCAGACTACTGTTAACCAATGTGCAGACTACTGTAAGCTTCGAATTGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGGTCGACAATACTAGTTAAGAAATCGCCAAGCTACGGGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGACTCTAGAAATTGTGAGCGGATAACAATTTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCAGCTGACAAAATTGTGAGCGCTCACAATTACTAGAAGATCTTGAATTCGCCACCATGGCTAGATTAGATAAAAGTAAAGTGATTAACAGCGCATTAGAGCTGCTTAATGAGGTCGGAATCGAAGGTTTAACAACCCGTAAACTCGCCCAGAAGCTAGGTGTAGAGCAGCCTACATTGTATTGGCATGTAAAAAATAAGCGGGCTTTGCTCGACGCCTTAGCCATTGAGATGTTAGATAGGCACCATACTCACTTTTGCCCTTTAGAAGGGGAAAGCTGGCAAGATTTTTTACGTAATAACGCTAAAAGTTTTAGATGTGCTTTACTAAGTCATCGCGATGGAGCAAAAGTACATTTAGGTACACGGCCTACAGAAAAACAGTATGAAACTCTCGAAAATCAATTAGCCTTTTTATGCCAACAAGGTTTTTCACTAGAGAATGCATTATATGCACTCAGCGCTGTGGGGCATTTTACTTTAGGTTGCGTATTGGAAGATCAAGAGCATCAAGTCGCTAAAGAAGAAAGGGAAACACCTACTACTGATAGTATGCCGCCATTATTACGACAAGCTATCGAATTATTTGATCACCAAGGTGCAGAGCCAGCCTTCTTATTCGGCCTTGAATTGATCATATGCGGATTAGAAAAACAACTTAAATGTGAAAGTGGGTCGCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTCGACGGCGGTGGTGCTTTGTCTCCTCAGCACTCTGCTGTCACTCAAGGAAGTATCATCAAGAACAAGGAGGGCATGGATGCTAAGTCACTAACTGCCTGGTCCCGGACACTGGTGACCTTCAAGGATGTATTTGTGGACTTCACCAGGGAGGAGTGGAAGCTGCTGGACACTGCTCAGCAGATCGTGTACAGAAATGTGATGCTGGAGAACTATAAGAACCTGGTTTCCTTGGGTTATCAGCTTACTAAGCCAGATGTGATCCTCCGGTTGGAGAAGGGAGAAGAGCCCTGGCTGGTGGAGAGAGAAATTCACCAAGAGACCCATCCTGATTCAGAGACTGCATTTGAAATCAAATCATCAGTTTAATACAAGGCGGCCGCAAATCAACATCAGTCTGATAAGCTATCAACATCAGTCTGATAAGCTATCAACATCAGTCTGATAAGCTATCAACATCAGTCTGATAAGCTAAAGCTTCGAATTCTGATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCAGCTCCAGATTGAATTATTTGCCTGTCATACAGCTAATAATTGACCATAAGACAATTAGATTTAAATTAGTTTTGAATCTTTCTAATACCAAAGTTCAGTTTACTGTTCCATGTTGCTTCTGAGTGGCTTCACAGACTTATGAAAAAGTAAACGGAATCAGAATTACATCAATGCAAAAGCATTGCTGTGAACTCTGTACTTAGGACTAAACTTTGAGCAATAACACATATAGATTGAGGATTGTTTGCTGTTAGTATACAAACTCTGGTTCAAAGCTCCTCTTTATTGCTTGTCTTGGAAAATTTGCTGTTCTTCATGGTTTCTCTTTTCACTGCTATCTATTTTTCTCAACCACTCACATGGCTACAAAAGCTTCCTGATTAATAATTACACTAAGTCAATAGGCATAGAGCCAGGACTGTTTGGGTAAACTGGTCACTTTATCTTAAACTAAATATATCCAAAACTGAACATGTACTTAGTTACTAAGTCTTTGACTTTATCTCATTCATACCACTCAGCTTTATCCAGGCCACTTATTTGACAGTATTATTGCGAAAACTTCCTATCTAGAAGTTTGAGGAGAATATTTGTTATATTTGCAAAATAAAATAAGTTTGCAAGTTTTTTTTTTCTGCCCCAAAGAGCTCTGTGTCCTTGAACATAAAATACAAATAACCGCTATGCTGTTAATTATTGACAAATGTCCCATTTTCAACCTAAGGAAATACCATAAAGTAACAGATATACCAACAAAAGGTTACTAGTTAACAGGCATTGCCTGAAAAGAGTATAAAAGAATTTCAGCATGATTTTCCATATTGTGCTTCCACCACTGCCAATAACAAAATAACTAGCAAGGATCCGGCCACCATGGCCCCCCCGACCGATGTCAGCCTGGGGGACGAGCTCCACTTAGACGGCGAGGACGTGGCGATGGCGCATGCCGACGCGCTAGACGATTTCGATCTGGACATGTTGGGGGACGGGGATTCCCCGGGTCCGGGATTTACCCCCCACGACTCCGCCCCCTACGGCGCTCTGGATATGGCCGACTTCGAGTTTGAGCAGATGTTTACCGATGCCCTTGGAATTGACGAGTACGGTGGGACGCGTATGAAGCTACTGTCTTCTATCGAACAAGCATGCGATATTTGCCGACTTAAAAAGCTCAAGTGCTCCAAAGAAAAACCGAAGTGCGCCAAGTGTCTGAAGAACAACTGGGAGTGTCGCTACTCTCCCAAAACCAAAAGGTCTCCGCTGACTAGGGCACATCTGACAGAAGTGGAATCAAGGCTAGAAAGACTGGAACAGCTATTTCTACTGATTTTTCCTCGAGAAGACCTTGACATGATTTTGAAAATGGATTCTTTACAGGATATAAAAGCATTGTTAACAGGATTATTTGTACAAGATAATGTGAATAAAGATGCCGTCACAGATAGATTGGCTTCAGTGGAGACTGATATGCCTCTAACATTGAGACAGCATAGAATAAGTGCGACATCATCATCGGAAGAGAGTAGTAACAAAGGTCAAAGACAGTTGACTGTATAATTCACTCCTCAGGTGCAGGCTGCCTATCAGAAGGTGGTGGCTGGTGTGGCCAATGCCCTGGCTCACAAATACCACTGAGATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCATTTAAAACATCAGAATGAGTATTTGGTTTAGAGTTTGGCAACATATGCCCATATGCTGGCTGCCATGAACAAAGGTTGGCTATAAAGAGGTCATCAGTATATGAAACAGCCCCCTGCTGTCCATTCCTTATTCCATAGAAAAGCCTTGACTTGAGGTTAGATTTTTTTTATATTTTGTTTTGTGTTATTTTTTTCTTTAACATCCCTAAAATTTTCCTTACATGTTTTACTAGCCAGATTTTTCCTCCTCTCCTGACTACTCCCAGTCATAGCTGTCCCTCTTCTCTTATGGAGATCGGAGAAAGAGGTAAT(SEQ ID NO:9).
GTAACTATAACGGTCGCTCCGAATTTCTCGAGTTAATTAAGATTACGCCAAGCTACGGGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTTCTGTCCTCCGAGCGGAGACTCTAGACTCCCTATCAGTGATAGAGATAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCTCCCTATCAGTGATAGAGAGAATTCGACCGCCACCATGTCGGAATTCATGAGACATATTATCTGCCACGGAGGTGTTATTACCGAAGAAATGGCCGCCAGTCTTTTGGACCAGCTGATCGAAGAGGTACTGGCTGATAATCTTCCACCTCCTAGCCATTTTGAACCACCTACCCTTCACGAACTGTATGATTTAGACGTGACGGCCCCCGAAGATCCCAACGAGGAGGCGGTTTCGCAGATTTTTCCCGACTCTGTAATGTTGGCGGTGCAGGAAGGGATTGACTTACTCACTTTTCCGCCGGCGCCCGGTTCTCCGGAGCCGCCTCACCTTTCCCGGCAGCCCGAGCAGCCGGAGCAGAGAGCCTTGGGTCCGGTTTCTATGCCAAACCTTGTACCGGAGGTGATCGATCTTACCTGCCACGAGGCTGGCTTTCCACCCAGTGACGACGAGGATGAAGAGGGTGAGGAGTTTGTGTTAGATTATGTGGAGCACCCCGGGCACGGTTGCAGGTCTTGTCATTATCACCGGAGGAATACGGGGGACCCAGATATTATGTGTTCGCTTTGCTATATGAGGACCTGTGGCATGTTTGTCTACAGTAAGTGAAAATTATGGGCAGTGGGTGATAGAGTGGTGGGTTTGGTGTGGTAATTTTTTTTTTAATTTTTACAGTTTTGTGGTTTAAAGAATTTTGTATTGTGATTTTTTTAAAAGGTCCTGTGTCTGAACCTGAGCCTGAGCCCGAGCCAGAACCGGAGCCTGCAAGACCTACCCGCCGTCCTAAAATGGCGCCTGCTATCCTGAGACGCCCGACATCACCTGTGTCTAGAGAATGCAATAGTAGTACGGATAGCTGTGACTCCGGTCCTTCTAACACACCTCCTGAGATACACCCGGTGGTCCCGCTGTGCCCCATTAAACCAGTTGCCGTGAGAGTTGGTGGGCGTCGCCAGGCTGTGGAATGTATCGAGGACTTGCTTAACGAGCCTGGGCAACCTTTGGACTTGAGCTGTAAACGCCCCAGGCCACTCGAGGGTACCGGGTCCGGAGCTACAAATTTTTCCCTCCTCAAACAGGCTGGAGATGTCGAAGAAAATCCTGGGCCTACCGGTCCCATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACAAACAGTGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTGAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCCAAACTCACCGCGATGCTCACAGCTAAGTTTGCCATGCCCAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAAGAAGCACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAGCAAAAACTTTCACTTAAGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACGTAATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGAAACAACATTCATGTGTGAATATGCTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACAGATGGATTACCTTTTGTCAAAGCATCATCTCAACACTGACTTGAAGATCTGAGGGCCGCGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAAAACCCCGGCCCCGGATCCATGAAACCAGTAACGTTATACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGGAAAAAGTGGAAGCGGCGATGGCGGAGCTGAATTACATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCACCTCCAGTCTGGCCCTGCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATCAACTGGGTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAGCCTGTAAAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTGATCATTAACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCTGCACTAATGTTCCGGCGTTATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATGAAGACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCATCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGCGCTGTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATAAATATCTCACTCGCAATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGTGCCATGTCCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGTTCCCACTGCGATGCTGGTTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGATATCTCGGTAGTGGGATACGACGATACCGAAGACAGCTCATGTTATATCCCGCCGTTAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGAGCAGCCTGAGGCCTCCTAAGAAGAAGAGGAAGGTTGCGGCCGCTAACCAATGTGCAGACTACTGTTAACCAATGTGCAGACTACTGTGAATTCTAACCAATGTGCAGACTACTGTTAACCAATGTGCAGACTACTGTAAGCTTCGAATTGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGGTCGACAATACTAGTTAAGAAATCGCCAAGCTACGGGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGACTCTAGAAATTGTGAGCGGATAACAATTTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCAGCTGACAAAATTGTGAGCGCTCACAATTACTAGAAGATCTTGAATTCGCCACCATGGCTAGATTAGATAAAAGTAAAGTGATTAACAGCGCATTAGAGCTGCTTAATGAGGTCGGAATCGAAGGTTTAACAACCCGTAAACTCGCCCAGAAGCTAGGTGTAGAGCAGCCTACATTGTATTGGCATGTAAAAAATAAGCGGGCTTTGCTCGACGCCTTAGCCATTGAGATGTTAGATAGGCACCATACTCACTTTTGCCCTTTAGAAGGGGAAAGCTGGCAAGATTTTTTACGTAATAACGCTAAAAGTTTTAGATGTGCTTTACTAAGTCATCGCGATGGAGCAAAAGTACATTTAGGTACACGGCCTACAGAAAAACAGTATGAAACTCTCGAAAATCAATTAGCCTTTTTATGCCAACAAGGTTTTTCACTAGAGAATGCATTATATGCACTCAGCGCTGTGGGGCATTTTACTTTAGGTTGCGTATTGGAAGATCAAGAGCATCAAGTCGCTAAAGAAGAAAGGGAAACACCTACTACTGATAGTATGCCGCCATTATTACGACAAGCTATCGAATTATTTGATCACCAAGGTGCAGAGCCAGCCTTCTTATTCGGCCTTGAATTGATCATATGCGGATTAGAAAAACAACTTAAATGTGAAAGTGGGTCGCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTCGACGGCGGTGGTGCTTTGTCTCCTCAGCACTCTGCTGTCACTCAAGGAAGTATCATCAAGAACAAGGAGGGCATGGATGCTAAGTCACTAACTGCCTGGTCCCGGACACTGGTGACCTTCAAGGATGTATTTGTGGACTTCACCAGGGAGGAGTGGAAGCTGCTGGACACTGCTCAGCAGATCGTGTACAGAAATGTGATGCTGGAGAACTATAAGAACCTGGTTTCCTTGGGTTATCAGCTTACTAAGCCAGATGTGATCCTCCGGTTGGAGAAGGGAGAAGAGCCCTGGCTGGTGGAGAGAGAAATTCACCAAGAGACCCATCCTGATTCAGAGACTGCATTTGAAATCAAATCATCAGTTTAATACAAGGCGGCCGCAAATCAACATCAGTCTGATAAGCTATCAACATCAGTCTGATAAGCTATCAACATCAGTCTGATAAGCTATCAACATCAGTCTGATAAGCTAAAGCTTCGAATTCTGATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCAGCTCCAGATTGAATTATTTGCCTGTCATACAGCTAATAATTGACCATAAGACAATTAGATTTAAATTAGTTTTGAATCTTTCTAATACCAAAGTTCAGTTTACTGTTCCATGTTGCTTCTGAGTGGCTTCACAGACTTATGAAAAAGTAAACGGAATCAGAATTACATCAATGCAAAAGCATTGCTGTGAACTCTGTAC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ID NO:10).
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ID NO:12).
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ID NO:13).
GTAACTATAACGGTCGCTCCGAATTTCTCGAGTTAATTAAGATTACGCCAAGCTACGGGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTTCTGTCCTCCGAGCGGAGACTCTAGACTCCCTATCAGTGATAGAGATAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCTCCCTATCAGTGATAGAGAGAATTCGACCGCCACCATGTCGGAATTCATGAGACATATTATCTGCCACGGAGGTGTTATTACCGAAGAAATGGCCGCCAGTCTTTTGGACCAGCTGATCGAAGAGGTACTGGCTGATAATCTTCCACCTCCTAGCCATTTTGAACCACCTACCCTTCACGAACTGTATGATTTAGACGTGACGGCCCCCGAAGATCCCAACGAGGAGGCGGTTTCGCAGATTTTTCCCGACTCTGTAATGTTGGCGGTGCAGGAAGGGATTGACTTACTCACTTTTCCGCCGGCGCCCGGTTCTCCGGAGCCGCCTCACCTTTCCCGGCAGCCCGAGCAGCCGGAGCAGAGAGCCTTGGGTCCGGTTTCTATGCCAAACCTTGTACCGGAGGTGATCGATCTTACCTGCCACGAGGCTGGCTTTCCACCCAGTGACGACGAGGATGAAGAGGGTGAGGAGTTTGTGTTAGATTATGTGGAGCACCCCGGGCACGGTTGCAGGTCTTGTCATTATCACCGGAGGAATACGGGGGACCCAGATATTATGTGTTCGCTTTGCTATATGAGGACCTGTGGCATGTTTGTCTACAGTAAGTGAAAATTATGGGCAGTGGGTGATAGAGTGGTGGGTTTGGTGTGGTAATTTTTTTTTTAATTTTTACAGTTTTGTGGTTTAAAGAATTTTGTATTGTGATTTTTTTAAAAGGTCCTGTGTCTGAACCTGAGCCTGAGCCCGAGCCAGAACCGGAGCCTGCAAGACCTACCCGCCGTCCTAAAATGGCGCCTGCTATCCTGAGACGCCCGACATCACCTGTGTCTAGAGAATGCAATAGTAGTACGGATAGCTGTGACTCCGGTCCTTCTAACACACCTCCTGAGATACACCCGGTGGTCCCGCTGTGCCCCATTAAACCAGTTGCCGTGAGAGTTGGTGGGCGTCGCCAGGCTGTGGAATGTATCGAGGACTTGCTTAACGAGCCTGGGCAACCTTTGGACTTGAGCTGTAAACGCCCCAGGCCACTCGAGGGTACCGGGTCCGGAGCTACAAATTTTTCCCTCCTCAAACAGGCTGGAGATGTCGAAGAAAATCCTGGGCCTACCGGTCCCATGAGTGTGCCCACTCAGGTCCTGGGGTTGCTGCTGCTGTGGCTTACAGACGCTCGCTGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCGACAGCTGGATCCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCTGGATCAGCCCCTACGGCGGCAGCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCAGCGCCGACACCAGCAAGAACACCGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGGCACTGGCCCGGCGGCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAGGGCCAGCCAGGACGTGAGCACCGCCGTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACAGCGCCAGCTTCCTGTACAGCGGCGTGCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTACCTGTACCACCCCGCCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGAGATCTGAGGGCCGCGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAAAACCCCGGCCCCGGATCCATGAAACCAGTAACGTTATACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGGAAAAAGTGGAAGCGGCGATGGCGGAGCTGAATTACATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCACCTCCAGTCTGGCCCTGCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATCAACTGGGTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAGCCTGTAAAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTGATCATTAACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCTGCACTAATGTTCCGGCGTTATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATGAAGACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCATCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGCGCTGTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATAAATATCTCACTCGCAATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGTGCCATGTCCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGTTCCCACTGCGATGCTGGTTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGATATCTCGGTAGTGGGATACGACGATACCGAAGACAGCTCATGTTATATCCCGCCGTTAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGAGCAGCCTGAGGCCTCCTAAGAAGAAGAGGAAGGTTGCGGCCGCTAACCAATGTGCAGACTACTGTTAACCAATGTGCAGACTACTGTGAATTCTAACCAATGTGCAGACTACTGTTAACCAATGTGCAGACTACTGTAAGCTTCGAATTGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGAGTAGTGCTTTCTACTTTATGGTCGACAATACTAGTTAAGAAATCGCCAAGCTACGGGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGACTCTAGAAATTGTGAGCGGATAACAATTTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCAGCTGACAAAATTGTGAGCGCTCACAATTACTAGAAGATCTTGAATTCGCCACCATGGCTAGATTAGATAAAAGTAAAGTGATTAACAGCGCATTAGAGCTGCTTAATGAGGTCGGAATCGAAGGTTTAACAACCCGTAAACTCGCCCAGAAGCTAGGTGTAGAGCAGCCTACATTGTATTGGCATGTAAAAAATAAGCGGGCTTTGCTCGACGCCTTAGCCATTGAGATGTTAGATAGGCACCATACTCACTTTTGCCCTTTAGAAGGGGAAAGCTGGCAAGATTTTTTACGTAATAACGCTAAAAGTTTTAGATGTGCTTTACTAAGTCATCGCGATGGAGCAAAAGTACATTTAGGTACACGGCCTACAGAAAAACAGTATGAAACTCTCGAAAATCAATTAGCCTTTTTATGCCAACAAGGTTTTTCACTAGAGAATGCATTATATGCACTCAGCGCTGTGGGGCATTTTACTTTAGGTTGCGTATTGGAAGATCAAGAGCATCAAGTCGCTAAAGAAGAAAGGGAAACACCTACTACTGATAGTATGCCGCCATTATTACGACAAGCTATCGAATTATTTGATCACCAAGGTGCAGAGCCAGCCTTCTTATTCGGCCTTGAATTGATCATATGCGGATTAGAAAAACAACTTAAATGTGAAAGTGGGTCGCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTCGACGGCGGTGGTGCTTTGTCTCCTCAGCACTCTGCTGTCACTCAAGGAAGTATCATCAAGAACAAGGAGGGCATGGATGCTAAGTCACTAACTGCCTGGTCCCGGACACTGGTGACCTTCAAGGATGTATTTGTGGACTTCACCAGGGAGGAGTGGAAGCTGCTGGACACTGCTCAGCAGATCGTGTACAGAAATGTGATGCTGGAGAACTATAAGAACCTGGTTTCCTTGGGTTATCAGCTTACTAAGCCAGATGTGATCCTCCGGTTGGAGAAGGGAGAAGAGCCCTGGCTGGTGGAGAGAGAAATTCACCAAGAGACCCATCCTGATTCAGAGACTGCATTTGAAATCAAATCATCAGTTTAATACAAGGCGGCCGCAAATCAACATCAGTCTGATAAGCTATCAACATCAGTCTGATAAGCTATCAACATCAGTCTGATAAGCTATCAACATCAGTCTGATAAGCTAAAGCTTCGAATTCTGATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTG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ID NO:14).
상기에서 SEQ ID NO: 9는 아데노바이러스 벡터에 의해 운반된 EBFP-포함 핵산의 서열이고;
SEQ ID NO: 10은 아데노바이러스 벡터에 의해 운반된 hIL-포함 핵산의 서열이며;
SEQ ID NO: 11은 아데노바이러스 벡터에 의해 운반된 hGMCSF-포함 핵산의 서열이고;
SEQ ID NO: 12는 아데노바이러스 벡터에 의해 운반된 mGMCSF-포함 핵산의 서열이며;
SEQ ID NO: 13은 아데노바이러스 벡터에 의해 운반된 항-PD-1 scFv-포함 핵산의 서열이고; 및
SEQ ID NO: 14는 아데노바이러스 벡터에 의해 운반된 항-PD-L1 scFv-포함 핵산의 서열이다.
본 개시의 한 구현예에서, 아데노바이러스는 다음 단계들에 의해 얻어진다: 아데노바이러스 벡터로부터 아데노바이러스 복제 및 포장과 관련된 아데노바이러스 E1 유전자 및 아데노바이러스 E3 유전자의 일부를 제거하는 단계; 아데노바이러스 E1A 유전자를 단계식 골든 게이트 방법에 의해 유전자 회로에 삽입하는 단계; 및 유전자 회로를 게이트웨이(Gateway) 또는 깁슨(Gibson) 방법에 의해 아데노바이러스 벡터에 통합시키는 단계. 상기 기술된 것과 같은 아데노바이러스를 얻는 방법은 복잡하고 큰 단편인 암용해성 아데노바이러스 벡터의 신속한 조작을 가능하게 한다.
제2 측면으로, 본 개시는 구현예에서 재조합 바이러스를 제공한다. 본 개시의 한 구현예에서, 재조합 바이러스는 다음을 포함한다: 종양 세포-특이적 프로모터를 포함하는 제1 핵산 분자, 여기서 종양 세포-특이적 프로모터는 알파-태아단백질-특이적 프로모터이며; 제1 핵산 분자에 작동 가능하게 연결되고 전사 활성화제를 암호화하는 제2 핵산 분자, 여기서 전사 활성화제는 Gal4VP16이고; 전사 활성화제의 제1 인식 서열을 포함하는 제3 핵산 분자, 여기서 제1 인식 서열은 5 x UAS이며; 제3 핵산 분자에 작동 가능하게 연결되고 제1 프로모터 및 제1 조절 요소를 포함하는 제4 핵산 분자, 여기서 제1 프로모터는 miniCMV이며, 제1 조절 요소는 다수의 반복된 tetO 서열을 포함하고, 다수의 반복된 tetO 서열 중 적어도 하나는 제1 프로모터의 하류에 놓이며; 제4 핵산 분자에 작동 가능하게 연결되고 제1 조절 단백질을 암호화하는 제5 핵산 분자, 여기서 제1 조절 단백질은 LacI이며, 제5 핵산 분자는 추가로 관심 있는 단백질을 암호화하는 서열을 포함하고, 관심 있는 단백질은 바이러스 복제 단백질 및 면역 이펙터를 포함하며, 여기서 면역 이펙터는 개별적인 단백질 또는 융합 단백질의 형태로 발현되고, 바이러스 복제 단백질 및 면역 이펙터는 절단 가능한 링커 펩타이드에 의해 연결되며, 관심 있는 단백질 및 제1 조절 단백질은 융합 단백질의 형태로 발현되고, 관심 있는 단백질 및 제1 조절 단백질은 절단 가능한 링커 펩타이드에 의해 연결되며; 전사 활성화제의 제2 인식 서열을 포함하는 제6 핵산 분자, 여기서 제2 인식 서열은 5 x UAS이고; 제6 핵산 분자에 작동 가능하게 연결되며 제2 프로모터 및 제2 조절 요소를 포함하는 제7 핵산 분자, 여기서 제2 프로모터는 miniCMV이고, 제2 조절 요소는 다수의 반복된 LacO 서열을 포함하며, 다수의 반복된 LacO 서열 중 적어도 하나는 제2 프로모터의 하류에 삽입되고; 제7 핵산 분자에 작동 가능하게 연결되며 제2 조절 단백질을 암호화하는 제8 핵산 분자, 여기서 제2 조절 단백질은 tetR-KRAB이고; 제5 핵산 분자에 작동 가능하게 연결되며 제1 조절 단백질의 발현을 조건부로 억제하기 위해 구성된 제9 핵산 분자, 여기서 제9 핵산 분자는 제1 마이크로RNA에 의해 특이적으로 인식된 핵산 서열을 포함하고, 제1 마이크로RNA는 정상 세포-특이적 마이크로RNA이며; 및 제8 핵산 분자에 작동 가능하게 연결되고 제2 조절 단백질의 발현을 조건부로 억제하기 위해 구성된 제10 핵산 분자, 여기서 제10 핵산 분자는 제2 마이크로RNA에 의해 특이적으로 인식된 핵산 서열을 포함하며, 제2 마이크로RNA는 종양 세포-특이적 마이크로RNA이고, 여기서 제1 조절 요소는 제2 조절 단백질에 대한 결합에 의해 제1 프로모터의 기능을 억제하기 위해 적응되고, 제2 조절 요소는 제1 조절 단백질에 대한 결합에 의해 제2 프로모터의 기능을 억제하기 위해 적응된다. 본 개시의 구현예에 따르는 재조합 바이러스로, 제1 조절 단백질 LacI 및 관심 있는 단백질은 종양 세포에서 특이적으로 발현되고 제2 조절 단백질 tetR-KRAB는 알파-태아단백질-특이적 프로모터, 제9 핵산 분자 및 제10 핵산 분자의 동시조절 하에 종양 세포에서는 발현되지 않거나 특이적으로 낮게 발현됨으로써, 제1 프로모터 miniCMV에 대한 tetR-KRAB-매개 억제 메커니즘이 방출되고, 따라서 제1 조절 단백질 LacI 및 관심 있는 단백질이 제1 프로모터 miniCMV의 제어 하에 효과적으로 발현되며, 제2 프로모터 miniCMV의 기능이 LacI-매개 억제 메커니즘을 통해 효과적으로 억제되고, tetR-KRAB의 발현이 추가로 억제된다. 나아가, 고효율 및 고특이성으로, 표적 단백질 LacI과 같은 단백질은 종양 세포에서 특이적으로 발현되고 tetR-KRAB과 같은 단백질은 본 개시의 구현예에 따르는 재조합 바이러스를 사용함으로써 종양 세포에서 특이적으로 발현되지 않는다.
본 개시의 구현예에서, 재조합 바이러스는 다음과 같은 추가적인 기술적 특징 중 적어도 하나를 더 포함할 수 있다.
본 개시의 한 구현예에서, 재조합 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스 및 백시니아 바이러스로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함한다.
본 개시의 한 구현예에서, 재조합 바이러스는 아데노바이러스이다. 상기에서 언급된 것과 같이, 유전자 요법 벡터로서의 아데노바이러스는 광범위한 숙주, 인간에 대한 낮은 병원성, 증식 및 비증식 세포에서의 감염 및 유전자 발현, 고역가, 인간 유전자에 대한 상동성, 및 삽입 후 돌연변이유발성 없음, 뿐만 아니라 현탁 상태에서의 증폭 및 동시에 다중 유전자를 발현하는 장점들을 가진다.
본 개시의 한 구현예에서, 면역 이펙터는 PD-1 유전자를 길항하는 억제 서열, PD-L1 유전자를 길항하는 억제 서열, CTLA4 유전자를 길항하는 억제 서열, Tim-3 유전자, IL-2, IL-12, IL-15 및 GM-CSF를 길항하는 억제 서열로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 서열을 포함한다. 선택적으로, 면역 이펙터는 융합 단백질의 형태로 존재할 수 있다.
제3 측면으로, 본 개시는 구현예에서 재조합 세포를 제공한다. 본 개시의 한 구현예에서, 재조합 세포는 상기 기술된 것과 같은 발현 시스템을 포함한다. 본 개시의 구현예에 따르는 재조합 세포는, 고안전성 및 특이성으로, 인체에서 전신성 면역 반응을 효과적으로 활성화할 수 있고, 종양 세포와 같은 이종발생성 세포를 공격할 수 있다.
본 개시의 구현예에서, 재조합 세포는 다음과 같은 추가적인 기술적 특징 중 적어도 하나를 더 포함할 수 있다.
본 개시의 한 구현예에서, 발현 시스템의 적어도 일부가 재조합 세포의 게놈에 통합된다. 발현 시스템은 재조합 세포 게놈이 복제함에 따라 복제하고, 거기서 발현 시스템은 관심 있는 단백질의 발현을 여전히 효과적으로 조절할 수 있다.
제4 측면으로, 본 개시는 구현예에서 상기 언급된 발현 시스템, 상기 언급된 재조합 바이러스, 및 상기 언급된 재조합 세포의 암치료를 위한 의약의 제조에서의 사용을 제공한다. 본 개시에서 기술된 발현 시스템은 관심 있는 단백질이 종양 세포에서 특이적으로 발현되는 것을 허용하고, 구현예의 의약은 더 강력한 효능, 특이성 및 안전성을 암치료시에 나타낸다.
본 개시의 구현예에서, 상기에서 기술된 용도는 다음과 같은 추가적인 기술적 특징 중 적어도 하나를 더 포함할 수 있다.
본 개시의 한 구현예에서, 암은 간암, 폐암, 대장암, 흑색종, 유방암 또는 전립선암을 포함한다. 발명자들은 구현예의 의약이 간암, 폐암, 대장암, 흑색종, 유방암 및 전립선암의 치료에 더 유의한 효능을 나타내는 것을 발견하였다.
제5 측면으로, 본 개시는 구현예에서 발현 시스템을 사용함으로써 관심 있는 단백질을 발현하는 방법을 제공하며, 여기서 발현 시스템은 상기에서 기술된 것과 같은 발현 시스템이다. 본 개시의 한 구현예에서, 방법은 (1) 관심 있는 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제5 핵산 분자를 제공하는 단계; 및 (2) 관심 있는 단백질을 발현하기 위하여 제10 핵산 분자에 의해 제2 조절 단백질의 발현을 억제하는 단계를 포함한다. 구현예에서 상기 기술된 관심 있는 단백질을 발현하는 방법으로, 제1 프로모터에 대한 제2 조절 단백질-매개된 억제 메커니즘이 방출되고, 그로써 관심 있는 단백질은 세포-특이적 프로모터 및 제2 프로모터의 공동 작용 하에 특이적 세포에서 효과적으로 발현된다.
본 개시의 구현예에서, 상기 방법은 다음과 같은 추가적인 기술적 특징 중 적어도 하나를 더 포함할 수 있다.
본 개시의 한 구현예에서, 발현은 세포에서 수행된다. 세포는 관심 있는 단백질의 발현에 대해 미세환경을 제공할 수 있고, 세포에서의 관심 있는 단백질의 발현이 보다 효율적이다.
본 개시의 한 구현예에서, 제10 핵산 분자는 제2 마이크로RNA에 의해 특이적으로 인식된 핵산 서열을 포함하며, 단계 (2)는 제2 마이크로RNA를 제10 핵산 분자와 접촉시키는 단계를 더 포함한다.
제6 측면으로, 본 개시는 구현예에서 발현 시스템을 사용함으로써 관심 있는 단백질을 발현하는 방법을 제공하며, 여기서 발현 시스템은 상기 기술된 것과 같은 발현 시스템이다. 본 개시의 한 구현예에서, 방법은 (1) 관심 있는 제1 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제8 핵산 분자를 제공하고, 관심 있는 제2 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제5 핵산 분자를 제공하는 단계; 및 (2) 관심 있는 제1 단백질을 발현시키기 위하여 제9 핵산 분자에 의해 제1 조절 단백질의 발현을 억제하거나; 또는 관심 있는 제2 단백질을 발현시키기 위하여 제10 핵산 분자에 의해 제2 조절 단백질의 발현을 억제함으로써 관심 있는 제1 단백질 또는 관심 있는 제2 단백질을 발현시키는 단계를 포함한다. 구현예에서, 상기 기술된 관심 있는 단백질을 발현하는 방법으로, 제1 프로모터에 대한 제2 조절 단백질-매개된 억제 메커니즘이 방출되고, 그로써 관심 있는 제2 단백질은 세포-특이적 프로모터 및 제1 프로모터의 공동 작용 하에 특이적 세포에서 효과적으로 발현되거나; 또는 제2 프로모터에 대한 제1 조절 단백질-매개된 억제 메커니즘이 방출되고, 그로써 관심 있는 제1 단백질은 세포-특이적 프로모터 및 제2 프로모터의 공동 작용 하에 특이적 세포에서 효과적으로 발현된다.
본원에 기술된 융합 단백질은 단백질 간에 연결되지 않은 융합 단백질, 또는 다른 링커 펩타이드(예컨대 GGGS 또는 2A 서열)에 의해 연결된 융합 단백질을 포함하는, 동일한 프로모터의 제어 하에 동시 전사되는 단백질을 나타내는 것임이 주지되어야 한다.
도 1은 게이트웨이 시스템에 의해 조작된 아데노바이러스의 초기 구조를 보여주는 개략도이다.
도 2는 골든 게이트 시스템에 의해 조작된 아데노바이러스의 초기 구조를 보여주는 개략도이다.
도 3은 본 개시의 한 구현예에 따르는 상호 억압 스위치를 보여주는 개략도이다.
도 4는 본 개시의 한 구현예에 따라 형광 정량 PCR 방법에 의해 세포주 Chang, HepG2, Huh7, Hep3B, PLC 및 Hepa1-6에서의 알파-태아단백질-특이적 프로모터(hAFP)의 발현 수준을 보여주는 그래프도이다.
도 5는 본 개시의 한 구현예에 따르는 인간 AFP 프로모터의 변형을 보여주는 개략도이다.
도 6은 본 개시의 한 구현예에 따라 변형된 AFP 프로모터의 전송 시스템의 Chang 및 HepG2로의 일시적인 트랜스펙션의 결과를 보여주는 그래프도이다.
도 7은 본 개시의 한 구현예에 따르는 마이크로RNA 검출 시스템을 보여주는 개략도이다.
도 8은 본 개시의 한 구현예에 따라 상이한 세포주에서 마이크로RNA 마커의 유의하게 상이한 발현을 보여주는 그래프도이다.
도 9는 본 개시의 한 구현예에 따르는 LacI 및 tetR-KRAB 유전자를 기반으로 한 상호 억압 스위치의 개략도이다.
도 10은 본 개시의 한 구현예에 따르는 인공적으로 합성된 shRNA 신호에 대한 반응으로 상호 억압 스위치의 효과적인 반전을 보여주는 그래프도이다.
도 11은 본 개시의 일부 구현예에 따르는 상이한 활성화제에 대한 반응으로 상호 억압 스위치를 보여주는 개략도이다.
도 12는 본 개시의 한 구현예에 따르는 CGGA(캐스케이드 골든-게이트 및 게이트웨이/깁슨 어셈블 방법)의 제1 단계를 보여주는 개략도이다.
도 13은 본 개시의 한 구현예에 따르는 CGGA(캐스케이드 골든-게이트 및 게이트웨이/깁슨 어셈블 방법)의 제2 단계를 보여주는 개략도이다.
도 14는 본 개시의 한 구현예에 따르는 CGGA(캐스케이드 골든-게이트 및 게이트웨이/깁슨 어셈블 방법)의 제3 단계를 보여주는 개략도이다.
도 15는 본 개시의 일부 구현예에 따르는 세포 수준에서의 아데노바이러스의 검출을 보여주는 그래프도이다.
도 16은 본 개시의 일부 구현예에 따르는 시험관내에서 검출된 사이토카인(플라스미드 벡터에 의해 발현됨)의 활성을 보여주는 그래프도이다.
도 17은 본 개시의 일부 구현예에 따르는 시험관내에서 검출된 사이토카인(바이러스 벡터에 의해 발현됨)의 활성을 보여주는 그래프도이다.
도 18은 본 개시의 일부 구현예에 따라 암용해성 아데노바이러스를 사용함으로써 각각 HepG2, Huh7 및 Hepa1-6을 포함하는 누드 마우스 모델의 치료를 보여주는 개략도이다.
도 19는 본 개시의 한 구현예에 따라 암용해성 아데노바이러스를 사용함으로써 Hepa1-6을 포함하는 C57 마우스 모델의 치료를 보여주는 개략도이다.
도 20은 본 개시의 한 구현예에 따라 암용해성 아데노바이러스로의 치료 후 종양 침윤 T 세포 중에서 IFN-γ 및 Ki67 마커의 개선된 발현을 보여주는 그래프도이다.
도 21은 본 개시의 한 구현예에 따르는 치료 후 마우스에서 마우스 간암종 Hepal-6 세포의 재도전을 보여주는 그래프도이다.
도 22는 본 개시의 한 구현예에 따르는 종양-바이러스-이펙터 시스템의 모델을 도시한다.
도 23은 본 개시의 한 구현예에 따르는 종양-바이러스-이펙터 시스템의 시뮬레이션 중에 상이한 초기 종양 크기, 바이러스 역가 및 바이러스 복제 속도 하에서 시간 경과에 따른 초기 상태로부터 최종 상태까지의 최소 종양 크기를 보여주는 그래프도이다.
도 24는 본 개시의 한 구현예에 따르는 종양-바이러스-이펙터 시스템에 의해 시뮬레이션될 때 종양 및 바이러스에 미치는 면역 세포의 상이한 억제 효과 하에서 최종 상태의 종양 크기를 보여주는 그래프도이다.
도 2는 골든 게이트 시스템에 의해 조작된 아데노바이러스의 초기 구조를 보여주는 개략도이다.
도 3은 본 개시의 한 구현예에 따르는 상호 억압 스위치를 보여주는 개략도이다.
도 4는 본 개시의 한 구현예에 따라 형광 정량 PCR 방법에 의해 세포주 Chang, HepG2, Huh7, Hep3B, PLC 및 Hepa1-6에서의 알파-태아단백질-특이적 프로모터(hAFP)의 발현 수준을 보여주는 그래프도이다.
도 5는 본 개시의 한 구현예에 따르는 인간 AFP 프로모터의 변형을 보여주는 개략도이다.
도 6은 본 개시의 한 구현예에 따라 변형된 AFP 프로모터의 전송 시스템의 Chang 및 HepG2로의 일시적인 트랜스펙션의 결과를 보여주는 그래프도이다.
도 7은 본 개시의 한 구현예에 따르는 마이크로RNA 검출 시스템을 보여주는 개략도이다.
도 8은 본 개시의 한 구현예에 따라 상이한 세포주에서 마이크로RNA 마커의 유의하게 상이한 발현을 보여주는 그래프도이다.
도 9는 본 개시의 한 구현예에 따르는 LacI 및 tetR-KRAB 유전자를 기반으로 한 상호 억압 스위치의 개략도이다.
도 10은 본 개시의 한 구현예에 따르는 인공적으로 합성된 shRNA 신호에 대한 반응으로 상호 억압 스위치의 효과적인 반전을 보여주는 그래프도이다.
도 11은 본 개시의 일부 구현예에 따르는 상이한 활성화제에 대한 반응으로 상호 억압 스위치를 보여주는 개략도이다.
도 12는 본 개시의 한 구현예에 따르는 CGGA(캐스케이드 골든-게이트 및 게이트웨이/깁슨 어셈블 방법)의 제1 단계를 보여주는 개략도이다.
도 13은 본 개시의 한 구현예에 따르는 CGGA(캐스케이드 골든-게이트 및 게이트웨이/깁슨 어셈블 방법)의 제2 단계를 보여주는 개략도이다.
도 14는 본 개시의 한 구현예에 따르는 CGGA(캐스케이드 골든-게이트 및 게이트웨이/깁슨 어셈블 방법)의 제3 단계를 보여주는 개략도이다.
도 15는 본 개시의 일부 구현예에 따르는 세포 수준에서의 아데노바이러스의 검출을 보여주는 그래프도이다.
도 16은 본 개시의 일부 구현예에 따르는 시험관내에서 검출된 사이토카인(플라스미드 벡터에 의해 발현됨)의 활성을 보여주는 그래프도이다.
도 17은 본 개시의 일부 구현예에 따르는 시험관내에서 검출된 사이토카인(바이러스 벡터에 의해 발현됨)의 활성을 보여주는 그래프도이다.
도 18은 본 개시의 일부 구현예에 따라 암용해성 아데노바이러스를 사용함으로써 각각 HepG2, Huh7 및 Hepa1-6을 포함하는 누드 마우스 모델의 치료를 보여주는 개략도이다.
도 19는 본 개시의 한 구현예에 따라 암용해성 아데노바이러스를 사용함으로써 Hepa1-6을 포함하는 C57 마우스 모델의 치료를 보여주는 개략도이다.
도 20은 본 개시의 한 구현예에 따라 암용해성 아데노바이러스로의 치료 후 종양 침윤 T 세포 중에서 IFN-γ 및 Ki67 마커의 개선된 발현을 보여주는 그래프도이다.
도 21은 본 개시의 한 구현예에 따르는 치료 후 마우스에서 마우스 간암종 Hepal-6 세포의 재도전을 보여주는 그래프도이다.
도 22는 본 개시의 한 구현예에 따르는 종양-바이러스-이펙터 시스템의 모델을 도시한다.
도 23은 본 개시의 한 구현예에 따르는 종양-바이러스-이펙터 시스템의 시뮬레이션 중에 상이한 초기 종양 크기, 바이러스 역가 및 바이러스 복제 속도 하에서 시간 경과에 따른 초기 상태로부터 최종 상태까지의 최소 종양 크기를 보여주는 그래프도이다.
도 24는 본 개시의 한 구현예에 따르는 종양-바이러스-이펙터 시스템에 의해 시뮬레이션될 때 종양 및 바이러스에 미치는 면역 세포의 상이한 억제 효과 하에서 최종 상태의 종양 크기를 보여주는 그래프도이다.
본 개시의 구현예들은 하기에서 상세하게 기술된다. 하기에 기술된 구현예들은 단시 예시적인 것이고 본 개시를 제한하는 것으로서 해석되지 않아야 한다.
발현 시스템
본 개시의 제1 측면으로, 구현예에서 발현 시스템이 제공된다. 본 개시의 구현예에 따르면, 발현 시스템은 다음을 포함한다: 세포 특이적 프로모터를 포함하는 제1 핵산 분자; 제1 핵산 분자에 작동 가능하게 연결되고 전사 활성화제를 암호화하는 제2 핵산 분자; 전사 활성화제의 제1 인식 서열을 포함하는 제3 핵산 분자; 제3 핵산 분자에 작동 가능하게 연결되고 제1 프로모터 및 제1 조절 요소를 포함하는 제4 핵산 분자; 제4 핵산 분자에 작동 가능하게 연결되고 제1 조절 단백질을 암호화하는 제5 핵산 분자; 전사 활성화제의 제2 인식 서열을 포함하는 제6 핵산 분자; 제6 핵산 분자에 작동 가능하게 연결되고 제2 프로모터 및 제2 조절 요소를 포함하는 제7 핵산 분자; 제7 핵산에 작동 가능하게 연결되고 제2 조절 단백질을 암호화하는 제8 핵산 분자; 및 제5 핵산 분자에 작동 가능하게 연결되고 제1 조절 단백질의 발현을 조건부로 억제하도록 구성된 제9 핵산 분자; 제8 핵산 분자에 작동 가능하게 연결되고 제2 조절 단백질의 발현을 조건부로 억제하도록 구성된 제10 핵산 분자로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나, 여기서 제1 조절 요소는 제2 조절 단백질에 대한 결합에 의해 제1 프로모터의 기능을 억제하도록 적응되고, 제2 조절 요소는 제1 조절 단백질에 대한 결합에 의해 제2 프로모터의 기능을 억제하도록 적응된다. 본 개시의 구현예에 따르는 발현 시스템으로, 관심 있는 유전자는 상호 억압 방식으로 조절되는 한편으로 강력한 제어, 고효율 및 특이성으로, 특이적 세포 환경 하에서 특이적으로 발현될 수 있다.
본 개시의 한 구현예에 따르면, 세포-특이적 프로모터는 종양 세포-특이적 프로모터이다. 종양 세포-특이적 프로모터는 알파-태아단백질-특이적 프로모터(AFP), 서바이빈 유전자 프로모터(SUR), 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT) 유전자 프로모터, 콜레시스토키닌 A 수용체 유전자 프로모터(CCKAR 프로모터), 암종배아 항원 프로모터(CEA 프로모터), 원-종양유전자 인간 표피 성장 인자 수용체 2 프로모터(인간 표피 성장 인자 수용체-2, HER2), 프로스타글란딘 산화효소 환원효소 2 프로모터(사이클로옥시게나제 2, COX2), 케모카인 수용체-4(CXCR4), E2F-1 유전자 프로모터(E2F-1프로모터), 뮤신 프로모터(뮤신1MUC1), 전립선 특이적 항원(PSA), 인간 티로신 관련 단백질 1(TRP1) 및 티로시나제(Tyr) 프로모터로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나이다. 구현예에서 발현 시스템은 상기와 같이 기술된 종양 세포-특이적 프로모터의 제어 하에 특이적 종양 세포의 미세환경에서 개시될 수 있고, 그로써 유전자 발현 및 조절의 특이성이 추가로 증강된다.
본 개시의 한 구현예에 따르면, 전사 활성화제는 Gal4VP16, Gal4esn, Gal4VP64, dCas9-VP16, dCas9-VP64, dCas9-VPR, dCas9-VTR 및 rtTA로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나이다. 효모 Gal4-UAS 유전자 발현 시스템은 진핵 세포의 가장 잘 알려져 있는 전사 조절 시스템 중 하나이고, Gal4 유전자는 효모(Saccharomyces cerevisiae)에서 전사 활성화제 단백질을 암호화한다. Gal4는 유전자 프로모터의 상류 활성화 서열(UAS)의 17 bp 서열, 즉, 5'-CGGRNNRCYNYNYNCNCCG-3'(R은 퓨린을 나타내고, Y는 피리미딘을 나타내며, N은 임의의 데옥시뉴클레오타이드를 나타냄)를 인식할 수 있다. Gal4는 갈락토오스 대사산물에 결합하는 GaL80과 상호작용한다. Gal4는 2개의 도메인(DNA 결합 도메인(N-말단 도메인) 및 활성화 도메인(C-말단 도메인))을 포함하며 추가로, 통상적으로 동종다이머의 형태로 기능하는 아연 클러스터 도메인(구체적으로 Zn(2)-Cys(6) 이중 코어 클러스터 도메인)을 포함한다. UAS 서열에서 GAL4 단백질에 결합하는 코어 서열은 4개 복사물 탠덤 반복부로, 각각의 복사물은 17개의 염기쌍(즉 서열 5'-CGGAGTACTGTCGTGGG-3')을 함유한다. 포유류 세포에 존재하는 Gal4는 UAS가 인식될 때에만 표적 유전자를 활성화함으로써, 하류 유전자의 전사를 양호한 특이성 및 유도성으로 개시한다. Gal4 단백질의 활성화 도메인은 단순 헤르페스 바이러스 VP16 단백질 또는 VP16의 4개의 복사물(VP64)의 활성화 도메인으로 대체될 수 있다. 형성된 융합 전사 인자는 Gal4 단백질의 결합 특이성을 유지시키는 한편으로 Gal4 단백질의 전사 활성화 활성을 증가시킨다. 테트라사이클린-유도 시스템은, 테트라사이클린 반응 요소 및 테트라사이클린-유도 단백질을 포함하는, 진핵 세포를 위한 박테리아-유래 전사 활성화 시스템이다. Tet 반응 요소(TRE)는 테트라사이클린-유도 단백질에 의해 인식될 수 있는, 19-뉴클레오타이드 테트라사이클린 오페론 서열(즉 5'-TCCCTATCAGTGATAGAGA-3')의 7개 반복부를 함유한다. 테트라사이클린-유도 시스템은 테트라사이클린-유도 억압 시스템 및 테트라사이클린-유도 활성화 시스템을 포함한다. 테트라사이클린-유도 억압 시스템은 테트라사이클린 반응 요소 및 테트라사이클린 리프레서 tetR을 포함한다. 테트라사이클린이 없을 때, 하류 유전자의 발현은 반응 요소에 대한 리프레서의 결합에 의해 활성화되고; 테트라사이클린이 존재할 때, 리프레서는 테트라사이클린에 결합함으로써, 하류 유전자의 발현을 억제한다. 테트라사이클린-유도 활성화 시스템은 테트라사이클린 반응 요소 및 역 테트라사이클린-제어된 교차활성화제 rtTA를 포함한다. 테트라사이클린이 없을 때, rtTA는 TRE 요소에 결합할 수 없고, 그로써 하류 유전자의 발현을 활성화할 수 없다; 한편 테트라사이클린이 존재할 때, rtTA는 테트라사이클린의 작용 하에 TRE에 결합함으로써, 하류 유전자의 발현을 활성화한다.
뉴클레아제 탈활성화된 Cas9(dCas9)는 Cas9의 돌연변이 형태로, DNA 서열에 대한 특이적 인식 및 결합으로만, 그리고 표적 서열에 대한 절단 활성 없이 gRNA 매개화를 통해 표적 서열을 인식할 수 있다. dCas9가 활성화 요소와 함께 융합-발현될 때, 표적 유전자의 발현은 효과적으로 활성화될 수 있다.
본 개시의 한 구현예에 따르면, 제1 인식 서열 및 제2 인식 서열은 각각 독립적으로 5 x UAS, 7 x tetO 및 dCas9의 표적 서열 중 적어도 하나로부터 선택된다. 5 x UAS는 Gal4VP16 조절 시스템의 반응 요소의 5개의 복사물이다. UAS 서열에서 Gal4 단백질에 결합하는 코어 서열은 4개 복사물 탠덤 반복부이고, 각각의 복사물은 17개의 염기쌍(서열 5'-CGGAGTACTGTCGTGGG-3')을 함유한다. 7 x tetO는 테트라사이클린 조절 시스템의 반응 요소인 TRE의 7개의 복사물이다. Tet 반응 요소 (TRE)는 테트라사이클린-유도 단백질에 의해 인식될 수 있는, 19-뉴클레오타이드 테트라사이클린 오페론 서열(5'-TCCCTATCAGTGATAGAGA-3')의 7개의 반복부를 함유한다.
본 개시의 한 구현예에 따르면, 제1 프로모터 및 제2 프로모터는 miniCMV이다. 5 x UAS-miniCMV는 합성 유도성 프로모터이다. 5 x UAS는 Gal4 단백질의 인식 서열이고, miniCMV는 사이토메갈로바이러스의 프로모터 서열의 일부이다. TRE는 또한 유도성 프로모터이다. 7 x tetO-miniCMV의 경우, tetO는 테트라사이클린 시스템의 반응 요소의 인식 서열이다.
본 개시의 한 구현예에 따르면, 제1 조절 단백질 및 제2 조절 단백질은 각각 독립적으로 LacI, tetR, 아연 핑거, KRAB 및 dCas9-KRAB 중 적어도 하나로부터 선택된다. 락토오스 리프레서(LacI)는 그것의 자체 DNA-결합 도메인의 나선-대-나선(helix-turn-helix) 요소를 통한 특이적 서열의 인식을 통해 락토오스 오페론(LacO)의 주요 홈(groove)에 결합할 뿐만 아니라, 대칭-관련 α-나선 잔기를 통해 LacO의 소수 홈 상의 염기 서열에 단단하게 결합한다. 이러한 단단한 결합은 RNA 중합효소의 프로모터 영역에의 고친화도 결합을 유발하고 DNA 연장을 방지함으로써, mRNA 전사 및 하류 유전자의 발현을 억제한다. 테트라사이클린 리프레서(TetR)는 테트라사이클린 오페론(tetO)에 결합하는 보존된 나선-대-나선 DNA 결합 영역(동종다이머를 형성함)을 함유함으로써, 하류 유전자의 전사 발현이 억제된다. 아연 핑거 단백질은 약 30개의 아미노산을 함유한 고리 및 고리 상의 4개의 Cys 단백질(또는 2개의 Cys) 및 2개의 His 단백질에 배위결합된 Zn2+로 구성되어 손가락 형상의 구조를 형성한다. 아연 핑거 단백질은 유전자 조절에서 중요한 역할을 하는 단백질 부류이다. 아연 핑거 단백질은 그것들의 보존된 도메인에 따라 주로 C2H2 유형, C4 유형 및 C6 유형으로 분류될 수 있다. 아연 핑거는 DNA, RNA, DNA-RNA 분자의 표적 서열에, 또는 그 자체의 또는 다른 아연 핑거 단백질에 특이적으로 결합함으로써 전사 및 번역 수준에서 유전자 발현, 세포 분화 및 배아 발달을 조절할 수 있다. 크루펠 연합 박스(Kruppel associated box, KRAB) 도메인은 인간의 거의 400개의 아연 핑거 단백질에 존재하는 전사 억압 영역의 부류이다. KRAB은 일반적으로 75개의 아미노산 잔기로 구성되며 그것의 가장 작은 효과적인 억제 영역은 45개의 아미노산으로 구성되고, 단백질 간의 양친매성 나선 연결을 통해 그것의 역할을 수행한다. KRAB은 상이한 엑손에 의해 암호화된 2개의 영역(A 박스 및 B 박스)으로 나누어질 수 있고, A 박스는 전사 억압에서 중심 역할을 하며, B 박스는 A 박스의 전사 억압을 증강시킨다.
뉴클레아제 탈활성화된 Cas9(dCas9)는 Cas9의 돌연변이 형태로, DNA 서열에 대한 특이적 인식 및 결합 활성으로만, 그리고 표적 서열에 대한 절단 활성 없이, gRNA 매개화를 통해 표적 서열을 인식할 수 있다. dCas9가 억압 영역과 함께 융합-발현될 때, 표적 유전자의 발현은 효과적으로 억제될 수 있다.
본 개시의 한 구현예에 따르면, 제1 조절 요소 및 제2 조절 요소는 각각 독립적으로 tetO, LacO, 아연 핑거 표적 부위, 및 dCas9의 표적 서열 중 적어도 하나로부터 선택된다. 테트라사이클린 오페론(tetO)은 하류 유전자의 발현을 억제하기 위해 테트라사이클린 리프레서에 의해 인식될 수 있다. 락토오스 오페론(LacO)은 하류 유전자의 발현을 억제하기 위하여 락토오스 리프레서(LacI)에 의해 인식될 수 있다. 아연 핑거 표적 부위는 하류 유전자의 발현을 조절하기 위해 아연 핑거 단백질에 의해 인식될 수 있다. dCas9 표적 서열은 하류 유전자의 발현을 억제하기 위해 상보하는 gRNA의 도움으로 dCas9-KRAB에 의해 인식될 수 있다.
본 개시의 한 구현예에 따르면, 제1 조절 단백질은 LacI이고, 제2 조절 요소는 다수의 반복된 LacO 서열을 포함하며, 다수의 반복된 LacO 서열 중 적어도 하나는 제2 프로모터의 하류에 놓인다. 발현된 LacI는 LacO 서열에 특이적으로 결합할 수 있음으로써, 제2 프로모터의 기능을 억제할 수 있다. 본 개시의 구현예의 LacI/LacO 억압 시스템에 따르면, 락토오스 리프레서(LacI)는 그 자체의 DNA-결합 도메인의 나선-대-나선 요소를 통한 특이적 서열의 인식을 통해 락토오스 오페론(LacO)의 주요 홈에 결합할뿐만 아니라, 대칭-관련 α-나선 잔기를 통해 LacO의 소수 홈 상의 염기 서열에 단단하게 결합한다. 이러한 단단한 결합은 RNA 중합효소의 프로모터 영역에 대한 고친화도 결합을 유발하고 DNA 연장을 방지함으로써, mRNA 전사 및 하류 유전자의 발현을 억제한다. 본 개시의 한 구현예에 따르면, 5 x UAS-miniCMV 프로모터의 miniCMV 서열의 두 쪽에는 각각 발명자들에 의해 LacO가 삽입되고, 이것은 실험에 의해 보여지는 것과 같이 프로모터의 하류 유전자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있다. 그러나, 발명자들은 그런 위치에서 사용될 수 있는 다른 억압 시스템을 배제하지 않는다.
본 개시의 한 구현예에 따르면, 제2 조절 단백질은 tetR-KRAB이고, 제1 조절 요소는 다수의 반복된 tetO 서열을 포함하며, 다수의 반복된 tetO 서열 중 적어도 하나는 제1 프로모터의 하류에 놓인다. 본 개시의 구현예에서 tetR-KRAB/tetO 억압 시스템에 따르면, 테트라사이클린 리프레서(TetR)는 보존된 나선-대-나선 DNA 결합 영역(동종다이머를 형성함)을 함유하며, 이것은 하류 유전자의 전사 발현을 억제하기 위하여 테트라사이클린 오페론(tetO)에 결합한다. 이 구현예에서, 5 x UAS-miniCMV 프로모터의 miniCMV 서열의 두 쪽에는 각각 발명자들에 의해 tetO가 삽입되고, 이것은 실험에 의해 보여지는 것과 같이 프로모터의 하류 유전자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있다. 제1 조절 단백질 및 제2 조절 단백질을 포함하는 스위치 시스템은 상응하는 입력 신호에 효과적으로 반응할 수 있음으로써, 상이한 세포주를 효과적으로 구별할 수 있다. 그러나, 발명자들은 그런 위치에서 사용될 수 있는 다른 억압 시스템을 배제하지 않는다.
본 개시의 한 구현예에 따르면, 제5 핵산 분자 및 제9 핵산 분자 중 적어도 하나는 관심 있는 단백질을 암호화하는 서열을 추가로 포함한다. 본 개시의 구현예에 따르는 발현 시스템으로, 관심 있는 단백질은 특이적 세포 미세환경에서 특이적으로 발현될 수 있는 한편, 상호 억압 방식으로 조절된다. 본 개시의 특정 구현예에 따르면, 발현 시스템은 관심 있는 단백질의 발현에 대해 유의한 증가된 특이성 및 조절을 나타낸다.
본 개시의 한 구현예에 따르면, 제5 핵산 분자는 관심 있는 단백질을 암호화하는 서열을 포함하고, 관심 있는 단백질은 바이러스 복제 및 포장 단백질, 및 면역 이펙터로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함한다. 바이러스 복제 및 포장 단백질은 숙주에서 발현 시스템의 생존 및 복제를 효과적으로 보장할 수 있다. 면역 이펙터의 발현은 신체의 면역 체계를 효과적으로 활성화할 수 있음으로써, 특이적 세포, 예컨대 종양 세포에 대한 면역 사멸을 촉진한다.
본 개시의 한 구현예에 따르면, 바이러스 복제 및 포장 단백질은 아데노바이러스 E1 유전자, 아데노바이러스 E1A 유전자, 아데노바이러스 E1B 유전자, 아데노바이러스 E2 유전자 및 아데노바이러스 E4 유전자로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함한다. 전사 타이밍에 따르면, 아데노바이러스 유전자는 주로 초기 발현 유전자(E1 ~ 4) 및 후기 발현 유전자(L1 ~ 5)로 나누어진다. 아데노바이러스 게놈이 핵에 들어간 후에, 세포 전사 인자는 먼저 E1A 영역의 상류에 위치한 인핸서에 결합하여 세포 대사를 조절하고 세포에서 바이러스 DNA가 보다 쉽게 복제되도록 만드는 E1A 단백질을 발현한다. E1A 단백질은 또한 다른 초기 유전자(E1B, E2A, E2B, E3 및 E4)의 프로모터를 활성화할 수 있고, 여기서 E2B는 바이러스 복제에 관여하는 초기 유전자의 3개의 추가적인 전사 단위(즉 전구체 말단 단백질(pTP), 단일 가닥 DNA 결합 단백질(ssDBP) 및 DNA 중합효소(DNA pol))의 발현을 구동한다. 이들 3개 유전자의 발현 생성물은 단단하게 결합되어 복합체를 이루고, 그것은 바이러스 게놈 복제를 개시하기 위하여 적어도 3개의 세포 단백질과 상호작용한다. E1 영역 유전자의 발현 생성물은 E1A 및 E1B로 나누어진다. E1A는 주로 2개 구성요소, 즉 289R(또는 13S) 및 243R(또는 12S)로 구성된다. E1A 단백질의 주요 기능은 세포 대사를 조절하는 데 있고, 그로써 세포를 바이러스 복제에 보다 민감하게 만드는 데 있다. E1B19K는 Bcl-2 유전자의 발현 생성물에 대해 상동성이고, Bax 패밀리 구성원을 비활성화하고 제거함으로써 세포가 세포자멸사하거나 괴사하는 것을 방지할 수 있다. E1B55K 유전자 생성물은 포함된 다른 아데노바이러스 유전자(예컨대 E4 또는 f6)와 함께, p53 유전자의 전사 수준을 하향 조절할 수 있다. E1B55K 유전자 생성물은 또한 바이러스 복제, 바이러스 후기 mRNA의 전사, 및 바이러스 RNA의 수송에 관여된다. E2 영역 유전자의 발현 생성물은 E2A 및 E2B로 나누어지며, 여기서 E2A는 DNA 결합 단백질(DBP)이고, E2B는 주로 2개의 생성물(즉 각각 전구체 말단 단백질(pTP) 및 바이러스 DNA 중합효소(pol))을 가진다. 이러한 3개의 단백질은 바이러스 후기 유전자의 전사 및 번역뿐만 아니라 아데노바이러스 DNA 복제를 개시하기 위하여 3개의 세포내 인자와 적어도 상호작용한다. E4 영역 유전자의 유전자 생성물은 보통 orf 1 내지 6/7로서 언급되며, 주로 바이러스 메신저 RNA의 대사에 관여할 뿐만 아니라, 바이러스 DNA 복제를 촉진하고 숙주에서 단백질 합성을 중지한다. 연구 결과 일부 E4 생성물이 바이러스 DNA가 연속되는 것을 방지하기 위하여 DNA-활성화된 단백질 키나아제에 결합할 수 있는 것으로 나타났다. 이런 키나아제가 p53 유전자를 활성화할 수 있기 때문에, E4 영역 유전자의 일부 생성물은 세포자멸사를 억제할 수 있는 것으로 여겨진다. E1B 및 E4 유전자의 많은 생성물이 E1A 단백질을 길항하는 데 관여한다. 예를 들어, E4는 E1A를 통해 E2F 프로모터의 활성화를 억제한다.
본 개시의 한 구현예에 따르면, 면역 이펙터는 PD-1 유전자를 길항하는 억제 서열, PD-L1 유전자를 길항하는 억제 서열, CTLA4 유전자를 길항하는 억제 서열, Tim-3 유전자, GM-CSF, IL-2, IL-12, IL-15 또는 이들 인자의 융합 발현 형태를 길항하는 억제 서열로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 서열을 포함한다. 예정된 사멸 1(예정된 사멸 수용체 1, PD-1)은 CD28 수퍼패밀리의 구성원에 속하는 중요한 면역억제 분자로, 원래 세포자멸성 마우스 T 세포 하이브리도마 2B4.11로부터 클론된다. PD-1은 T 세포 표면 상의 중요한 억제 분자이며, 그것의 세포내 도메인은 면역수용체 티로신 억제 모티프(ITIM) 및 면역수용체 티로신 전달 모티프(ITSM)를 포함한다. ITSM은 단백질 티로신 포스파타제 패밀리 포스파타제의 보충 및 T 세포 활성화 신호의 억제를 매개한다. ITSM의 리간드는 PD-L1 및 PD-L2로, 이것들은 주로 면역 체계의 면역 반응 중에 종양 미세환경에서 T 세포의 활성화를 억제하는 데 주요 역할을 한다. 분화 274의 클러스터(CD274) 또는 B7 호모로그(B7 호모로그 1, B7-H1)로도 알려져 있는, 예정된 세포 사멸 1 리간드(PD-L1)는 CD274 유전자에 의해 암호화된 신체의 인간 단백질이다. PD-L1은 다양한 종양 세포 및 종양 세포 미세환경의 조혈 세포에서 유도적으로 발현되며, 이것의 발현 수준은 종양의 악성과 양성적으로 상관이 있다. PD-1 항체 및 PD-L1 항체는 PD-1의 PD-L1에 대한 결합을 차단할 수 있다. 그러나, 조직의 종양 세포는 PD-1/PD-L1 경로를 통해 면역 체계로부터 벗어날 수 있다. 세포독성 T 림프구 회합 단백질-4, 짧게 말해 CTLA-4는 T 세포 표면에서 발현된 동시자극 분자 유형이다. CTLA-4는 CD28의 기능과 유사하게, T 세포의 활성화 중에 하류 신호를 활성화하기 위하여 APC의 표면에서 CD80/CD86에 특이적으로 결합할 수 있다. 연구 결과 T 세포 중에서 CTLA-4를 우세하게 발현하는 세포는 조절 T 세포(Treg)이며, 세포 면역력을 음성적으로 조절하는 T 세포의 부류인 것으로 나타났다. CTLA-4 수용체가 없을 때, 마우스는 T 세포 과다발현을 나타내고, 그로써 중증의 자가면역 질환이 수반된다. 상기 결과는 Treg가 그것의 기능을 실현하기 위하여 CTLA-4를 필요로 하는 것을 보여준다. 더불어, CTLA-4는 또한, T 세포 활성화의 신호전달을 억제하는 데 역할을 하는 conT 세포에서 발현된다. T 세포 면역글로불린 및 뮤신-도메인 함유 분자(TIM) 유전자 패밀리는 2001년도에 Mclntire에 의해 마우스 천식 민감성 유전자를 연구하는 중에 발견된 신규한 유전자 패밀리이고, 나중에 게놈 분석 및 위치 클로닝에 의해 확인되었다. TIM 패밀리 유전자는 면역글로불린 V 영역 및 뮤신 영역을 함유한다. Tim-3은 TIM 패밀리의 중요한 구성원이고 활성화된 Th1 세포의 표면에서 음성 조절 분자를 발현한다. 현재, TIM3은 CD8+ T 세포, Th17 세포, Treg, NK 세포 및 기타 림프구 하위세트에서 발현되는 것으로 나타난다. 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)는 대식세포, T 세포, NK 세포 등에 의해 분비된 모노머 당단백질 사이토카인으로, 줄기 세포를 자극하여 과립 세포(호중구, 호산성 세포, 호염기성 세포 및 단핵세포)를 생성하게 한다. GM-CSF는 또한 면역 체계의 성숙 세포에 영향을 미치는데, 예컨대 호중구의 전달을 억제하고 세포 표면에서 수용체의 발현을 변경시킨다. 이 인자는 또한 대식세포를 활성화함으로써 진균 감염을 억제할 수 있다. 인터류킨 2(IL-2)는 백혈구와 다른 세포 사이 뿐만 아니라 백혈구와 백혈구 사이에서 사이토카인을 매개할 수 있다. IL-2는 주로 활성화된 T 세포에 의해 생성되며, 면역 반응에 관여하는 주요 사이토카인으로, 자가분비 및 측분비(paracrine)의 방식으로 국지성 표적 세포에 작용함으로써, 유의한 면역 효과를 나타낸다. IL-2는 또한 T 세포 증식을 촉진하고 사이토카인을 생성하며, B 세포 증식을 촉진하고 Ig를 분비하며, 대식세포를 활성화하고 NK 세포의 활성화 및 증식을 증강시킬 수 있다. 또한, IL-2는 또한 음성 조절 효과를 가지며, Ag를 활성화하고, 면역 반응의 세기를 제한하며, 명백한 면역 손상을 피하는 T 세포의 세포자멸사를 유도할 수 있다. 인터류킨-12(IL-12)는 항원 자극에 대한 반응으로 수지상 세포, 대식세포, 호중구 및 인간 B 림프모세포(nc-37)에 의해 생성된 인터류킨 종류이다. T 세포 자극 인자로 불리는 IL-12는 나이브 세포의 Th1 세포로의 분화에 참여하고, 인터페론 감마(IFN-γ) 및 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)의 생성을 자극한다. IL-12는 천연 살해 세포 및 T 림프구의 활성을 조절하는 데 중요한 역할을 한다. IL-12는 NK 세포 및 CD8+ 세포독성 T 림프구의 증강된 세포독성 활성을 매개한다. IL-12는 항-혈관형성 활성을 가지는데, 이것은 IL-12가 새로운 혈관의 형성을 차단할 수있음을 나타낸다. IL-12는 감마-인터페론(INF-γ)의 생성을 증가시킴으로써 단백질 10(IP-10 또는 CXCL10)의 유도를 증가시키고, 이때 IL-10은 항-혈관신생을 매개한다. IL-12는 면역 반응 및 항-혈관신생을 유도하는 능력 때문에 잠재적인 항암 약물로서 테스트되었다. IL-15는 다양한 세포, 예컨대 활성화된 단핵세포-대식세포, 상피 세포, 섬유모세포 등에 의해 생성될 수 있는, 최근에 발견된 인자이다. IL-15의 분자 구조는 IL-2의 그것과 훨씬 더 유사하며, 그로써 IL-15는 표적 세포에 대한 IL-2 수용체의 β-사슬 및 γ-사슬의 결합을 기반으로 하여 IL-2와 유사한 생물학적 활성을 발휘할 수 있다. IL-15는 B 세포의 증식 및 분화를 유도할 수 있고, 초기 항체 생성을 유도하기 위해 IL-2를 부분적으로 치환할 수 있는 유일한 사이토카인이다. IL-15는 T 세포 및 NK 세포의 증식을 자극할 수 있고, LAK 세포 활성을 유도할 수 있으며, 또한 IFN-γ를 생성하기 위하여 NK 세포를 상조적으로 자극하기 위해 IL-12와 상호작용할 수 있다.
본 개시의 한 구현예에 따르면, 관심 있는 단백질 및 제1 조절 단백질은 하나의 동일한 프로모터의 제어 하에 동시 발현되며, 관심 있는 단백질 및 제1 조절 단백질은 절단 가능한 링커 펩타이드에 의해 연결된다. 관심 있는 단백질 및 제1 조절 단백질은 하나의 동일한 프로모터 하에서 조절 및 발현되며, 추가로 발현 후에 링커 펩타이드에서 절단된다. 관심 있는 단백질은 제1 조절 단백질로부터 분리되고, 관심 있는 단백질 및 제1 조절 단백질은 서로 독립적으로 기능한다.
본 개시의 한 구현예에 따르면, 제9 핵산 분자 및 제10 핵산 분자는 독립적으로, 각각, RNA 간섭을 통해 제1 조절 단백질 또는 제2 조절 단백질의 발현을 억제한다. 마이크로RNA는 상이한 세포 미세환경에서 발현된 특이적 마이크로RNA이며, 제9 또는 제10 핵산 분자는 마이크로RNA의 특이적 표적 서열이다. 특이적 미세환경에서 발현된 마이크로RNA와 그것의 표적 서열 사이의 특이적 효과는 RNA 간섭을 통해 현실화될 수 있음으로써, 제1 조절 단백질 또는 제2 조절 단백질의 발현을 특이적으로 조절한다. 마이크로RNA(miRNA)는 약 20 내지 24개의 뉴클레오타이드를 가진 내인성 작은 RNA의 부류이고, 여러 miRNA가 하나의 동일한 유전자를 조절할 수 있다. 유전자의 발현은 여러 miRNA의 조합에 의해 미세하게 조절될 수 있다. 마이크로RNA는 약 300 내지 1000개 염기의 길이의 것인, 원래 형태의 pri-miRNA; pri-miRNA의 프로세싱에 의해 형성되고 약 70 내지 90개 염기의 길이의 것인, 마이크로RNA 전구체 형태의 pre-miRNA; 및 pre-miRNA의 Dicer로의 소화에 의해 생성된, 약 20 내지 24 nt의 성숙한 miRNA를 포함하는, 여러 형태를 가진다. RNA-유도된 침묵 복합체(RISC)는 표적 유전자의 발현을 억제한다. 표적 유전자의 mRNA에 미치는 마이크로RNA-RISC의 영향은 언제나, 3가지 방법으로 수행된, 마이크로RNA-RISC와 표적 유전자 전사물 서열 사이의 상보성 정도에 크게 좌우되었다. 첫 번째 방법으로, 표적 유전자의 mRNA 분자는 절단된다, 즉 표적 유전자에 완전히 상보하는(siRNA의 메커니즘 및 기능에 매우 유사한 메커니즘 및 기능을 가지는) miRNA가 절단된다. 식물에서, 표적 유전자의 miRNA의 대부분이 상기 기술된 방법에 의해 절단되고, 폴리(A)가 없는 분자는 3' 단부에서 우라실(U)이 첨가되며 신속하게 분해되는 한편 폴리(A)가 있는 분자는 일정 시간 동안 안정적으로 존재할 수 있다(예컨대 아라비돕시스 miR-171). 현재, 하나의 miRNA가 식물에서 3개의 잠재적인 표적 유전자에 완전히 상보하는 것으로 발견되지만, 이들 유전자가 miRNA의 표적인지의 여부는 불명확하다. 그러나, miRNA가 이것의 잠재적 표적에 완전히 상보할 수 있음이 최초로 드러나고, 이것은 miRNA가 siRNA와 유사한 메커니즘을 가질 수 있음을 시사한다. 두 번째 방법으로, 표적 유전자의 번역이 억제된다. miRNA는 표적 유전자에 완전히 상보하지 않음으로써, mRNA의 안정성에 영향을 주지 않으면서 표적 유전자의 번역을 억제한다. 이러한 miRNA는 네마토드 lin-4와 같이 가장 광범위하게 발견된 miRNA이지만, 식물에서 소수의 miRNA가 이 방법으로 표적 유전자를 억제한다. 세 번째 방법은 결합 억제, 즉 상기 두 방법에서 두 메커니즘을 통합시키는 것을 나타낸다. miRNA가 표적 유전자에 완전히 상보할 때, 그것들은 직접 절단된다. miRNA가 표적 유전자에 완전히 상보하지 않을 때, 그것들은 유전자 발현의 조절에 참여한다.
본 개시의 한 구현예에 따르면, 제9 핵산 분자는 제1 마이크로RNA에 의해 특이적으로 인식된 핵산 서열을 포함하고, 제10 핵산 분자는 제2 마이크로RNA에 의해 특이적으로 인식된 핵산 서열을 포함하며, 여기서 제1 마이크로RNA는 정상 세포-특이적 마이크로RNA이고, 제2 마이크로RNA는 비정상 세포-특이적 마이크로RNA이다. 추가로, 제1 조절 단백질은 비정상 세포에서 발현되며 정상 세포에서 발현되지 않거나 낮게 발현되는 한편, 제2 조절 단백질은 정상 세포에서 발현되며 비정상 세포에서 발현되지 않거나 낮게 발현된다.
본 개시의 또 다른 특정 구현예에 따르면, 제1 마이크로RNA는 miR199a, miR95, miR125, miR125b, Let-7, miR143, miR145 및 miR200C로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함한다. 상기 기술된 마이크로RNA는 정상 간 세포에서 발현된다.
본 개시의 또 다른 특정 구현예에 따르면, 제2 마이크로RNA는 간암종 세포(HepG2, Huh7 및 PLC)에서 발현된 miR21, miR223, miR224, miR221, miR18, miR214, miR146a 및 miR1792로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함한다. 상기 기술된 제2 마이크로RNA는 간암종 세포에서 특이적으로 발현된 마이크로RNA이다. 추가로, 제1 조절 단백질은 간암 세포에서 발현되며 정상 세포에서 발현되지 않거나 낮게 발현되는 한편, 제2 조절 단백질은 정상 세포에서 발현되며 간암 세포에서 발현되지 않거나 낮게 발현된다.
본 개시의 한 구현예에 따르면, 제1 핵산 분자 및 제2 핵산 분자는 제1 발현 벡터에 로딩되며; 제3 핵산 분자, 제4 핵산 분자, 제5 핵산 분자, 및 선택적으로 제9 핵산 분자는 제2 발현 벡터에 로딩되고; 및 제6 핵산 분자, 제7 핵산 분자, 제8 핵산 분자, 및 선택적으로 제10 핵산 분자는 제3 발현 벡터에 로딩된다. 제1, 제2 및 제3 발현 벡터는 적합한 미세환경, 예컨대 세포에서 관심 있는 유전자의 특이적 발현을 조절하기 위한 발현 시스템을 위한 로딩 벡터로서 작용한다.
발현 벡터의 선택은 적합한 미세환경에서 발현 시스템의 기능이 이루어질 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 본 개시의 특별한 구현예에 따르면, 제1 발현 벡터, 제2 발현 벡터 및 제3 발현 벡터는 각각 독립적으로 다음 중 적어도 하나로부터 선택된다:
플라스미드, 바이러스, 안정적인 세포주, 및 다른 물질 담체, 예컨대 나노 물질, 리포좀, 분자-콘쥬게이트된 벡터, 네이키드 DNA, 염색체 벡터 및 중합체. 리포좀 담체는 인공 이중층 인지질로 DNA를 포장함으로써 형성된 리포좀-DNA 복합체이다. 리포좀 담체는 무독성이며 비항원성이고, 큰 용량을 가지며, 표적 유전자가 리포좀 담체의 캡슐화로 인한 뉴클레아제 분해되는 것을 방지할 수 있다. 이러한 리포좀 담체는 단독으로 또는 다른 담체와 함께 사용될 수 있고, 표적 유전자는 표적 유전자를 캡슐화하는 리포좀 담체를 정맥내 주입함으로써 특정 부위로 도입될 수 있으며, 이때 단점은 짧은 발현 기간이고, 세포막 장벽을 통해 통과할 수 없다. 분자-콘쥬게이트된 벡터는 3 부분: DNA, DNA 결합 인자 및 리간드로 구성된다.
본 개시의 한 구현예에 따르면, 바이러스는 아데노바이러스, 백시니아 바이러스 및 레트로바이러스로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함한다.
본 개시의 한 구현예에 따르면, 제1 발현 벡터, 제2 발현 벡터 및 제3 발현 벡터는 하나의 동일한 벡터이다. 본 개시의 특정 구현예에 따르면, 본 개시의 발현 시스템의 구성요소는 본 발명자들에 의해 캐스케이드 골든-게이트 깁슨/게이트웨이 어셈블 방법을 통해 하나의 동일한 발현 벡터로 로딩됨으로써, 다수의 큰 단편이 트랜스펙션될 때 매우 낮은 트랜스펙션 효율의 문제점을 효과적으로 해결한다.
본 개시의 한 구현예에 따르면, 하나의 동일한 벡터는 아데노바이러스이다. 유전자 요법 벡터로서의 아데노바이러스는 다음의 장점을 가진다.
1) 아데노바이러스는 광범위한 숙주에 대해 유용하고 인간에 대한 낮은 병원성을 가짐으로써, 아데노바이러스 벡터 시스템은 인간 및 비인간 단백질의 발현에 대해 광범위하게 사용된다. 추가로, 아데노바이러스는 다양한 포유류 세포를 감염시킬 수 있고, 그러므로 대부분의 포유류 세포 및 조직에서 재조합 단백질의 발현에 유용할 수 있다. 아데노바이러스는 상피세포 친화적(epitheliophilic)이라는 것이 특히 주지되고, 대부분의 인간 종양은 상피 세포로부터 유래된다. 또한, 아데노바이러스의 복제 유전자 및 병원성 유전자는 충분히 분명하고 아데노바이러스에 대한 항체는 인간 집단에서 널리 퍼져 있다(성인의 70 내지 80%가 아데노바이러스에 대한 중화 항체를 가짐). 인간은 야생형 아데노바이러스로 감염된 후에만 약간의 자체-제한 증상을 유발하며, 리바비린으로의 치료가 효과적이다.
2) 아데노바이러스는 증식 및 비증식 세포에서 유전자를 감염시키고 발현할 수 있다. 레트로바이러스는 증식 세포만을 감염시킬 수 있고, DNA 트랜스펙션은 비증식 세포에서 수행될 수 없음으로써, 세포는 인큐베이션으로 유지될 필요가 있다. 아데노바이러스는 아데노바이러스에 대한 일부 림프종 세포를 제외한, 거의 모든 세포 유형을 감염시킬 수 있다. 아데노바이러스는 비증식 일차 세포에서 유전자 발현을 연구하기 위한 최상의 시스템으로, 형질전환된 세포 및 일차 세포로부터 얻어진 결과 사이의 직접 비교를 가능하게 한다.
3) 아데노바이러스는 효과적으로 증식할 수 있고 고역가를 가진다. 아데노바이러스 시스템은 1010 내지 1011 VP/mlL의 역가를 생성할 수 있고 농축 후 1013 VP/mL까지일 수 있음으로써, 이 특징은 아데노바이러스를 유전자 요법에 매우 적합하게 만든다.
4) 아데노바이러스는 인간 유전자에 상동한다. 인간 바이러스는 일반적으로 벡터로서 사용되며 인간 세포는 아데노바이러스 벡터 시스템에 대한 숙주로서 사용되어, 인간 단백질의 정확한 번역 후 프로세싱 및 적절한 접힘에 대한 이상적인 환경을 제공한다. 대부분의 인간 단백질은 고발현 수준을 이룰 수 있고 전체적으로 기능한다.
5) 아데노바이러스는 염색체 안으로 통합되지 않으며 삽입 후 돌연변이원성을 유발하지 않는다. 레트로바이러스는 숙주의 염색체(들) 안으로 무작위로 통합되어, 유전자 비활성화 또는 종양유전자 활성화를 유발할 것이다. 그러나, 아데노바이러스는 난 세포를 제외한 거의 모든 알려진 세포에서 염색체 안으로 통합되지 않음으로써, 숙주에서 다른 유전자를 간섭하지 않는다. 단일 복사물의 아데노바이러스로 통합된 난 세포는 특이적 특성을 가진 형질도입 동물을 생성하기 위한 양호한 시스템이다.
6) 아데노바이러스는 현탁 배양 배지에서 증폭될 수 있다. 293 세포는 현탁 배양에 대해 조정될 수 있고, 그로써 아데노바이러스의 대량 증폭을 가능하게 한다. 대다수의 사실이 293 세포의 현탁액이 1 내지 20 L 생체반응기에서 재조합 단백질을 발현할 수 있음을 보여주었다.
7) 아데노바이러스는 다수의 유전자를 동시에 발현하는 능력을 가진다. 이것은 동일한 세포주 또는 조직에서 다수의 유전자를 발현하도록 설계된 최초의 발현 시스템이다. 발현 시스템을 구성하기 위한 가장 간단한 방법은 두 유전자를 함유하는 이중 발현 카세트를 아데노바이러스 전달 벡터 안에 삽입하거나, 또는 단백질을 각각 발현하기 위하여 상이한 재조합 바이러스로 관심 있는 세포 스트레인을 동시 트랜스펙션하는 단계를 포함한다. 개별적인 재조합 단백질의 상대적인 동시 발현은 상이한 재조합 바이러스의 MOI 비율을 측정함으로써 정확하게 산정될 수 있다.
본 개시의 특정 구현예에 따르면, 상기 기술된 아데노바이러스는 발명자들에 의해 종양 마우스 모델에 주입되었고, 마우스 종양의 성장은 유의하게 억제되었다. 상기 기술된 아데노바이러스는 안전하고 효과적인 방식으로 관련 종양을 특이적으로 사멸하기 위하여 안전하고 효과적인 항암 바이러스 백신으로서 사용될 수 있다.
본 개시의 한 구현예에 따르면, 아데노바이러스는 다음의 단계들에 의해 얻어진다: 아데노바이러스 복제 및 포장과 관련된 아데노바이러스 E1 유전자 및 아데노바이러스 E3 유전자의 일부를 아데노바이러스 벡터로부터 제거하는 단계; 아데노바이러스 E1A 유전자를 단계식 골든 게이트 방법에 의해 유전자 회로에 삽입하는 단계; 및 유전자 회로를 게이트웨이 또는 깁슨 방법에 의해 아데노바이러스 벡터에 통합시키는 단계. 구체적으로, 암세포를 인식하는 유전자 회로가 발명자들에 의해 3 단계를 통해 아데노바이러스 벡터로 삽입된다. 먼저, 정상 세포로부터 암세포를 구별하는 것과 관련된 마커 요소(예컨대 종양-특이적 프로모터, 유전자 회로-관련 억압 요소, 및 암세포-구별 miRNA 인식 서열)가 일차 벡터 플라스미드 안으로 구성됨으로써, 일차 요소 라이브러리가 형성되는데, 여기서 일차 요소의 양 단부에, 각각 골든 게이트 방법에 의해 하나의 이차 발현 시스템으로 구성된 다중 일차 요소를 만들기 위하여 Esp3I의 인식 부위가 삽입된다. 두 번째로, 발현 시스템 라이브러리가 구성되는데, 여기서 일차 요소 라이브러리로부터 선택된 다중 일차 요소가 골든 게이트 방법에 의해 3개의 발현 시스템으로 조립되며, 이러한 3개의 발현 시스템은 종양-특이적 프로모터 시스템, 제1 조절 요소-매개된 억압 시스템 및 제2 조절 요소-매개된 억압 시스템을 포함하며, 이때 각 발현 시스템의 양 단부에 BsaI 엔도뉴클레아제의 인식 부위가 삽입된다. 세 번째로, 완전한 유전자 회로는 골든 게이트 방법을 통해 3개의 발현 시스템을 무작위로 조립함으로써 형성된다. 유전자 회로의 양 단부에는 추가의 실험을 위해 각각 깁슨 상동성 서열 또는 게이트웨이 인식 부위가 삽입된다. 마지막으로, 유전자 회로는 깁슨 또는 게이트웨이 방법에 의해 (E1 유전자 및 E3 유전자의 일부가 제거된) 아데노바이러스 벡터로 구성된다. 상기 기술된 아데노바이러스를 얻는 방법은 큰 단편으로의, 암용해성 아데노바이러스 벡터의 복합체의 신속한 변형을 보장해준다.
재조합 바이러스
본 개시의 제2 측면으로, 구현예에서 재조합 바이러스가 제공된다. 본 개시의 구현예에 따르면, 재조합 바이러스는 다음을 포함한다: 종양 세포-특이적 프로모터를 포함하는 제1 핵산 분자, 여기서 종양 세포-특이적 프로모터는 알파-태아단백질-특이적 프로모터이며; 제1 핵산 분자에 작동 가능하게 연결되고 전사 활성화제를 암호화하는 제2 핵산 분자, 여기서 전사 활성화제는 Gal4VP16이고; 전사 활성화제의 제1 인식 서열을 포함하는 제3 핵산 분자, 여기서 제1 인식 서열은 5 x UAS이며; 제3 핵산 분자에 작동 가능하게 연결되고 제1 프로모터 및 제1 조절 요소를 포함하는 제4 핵산 분자, 여기서 제1 프로모터는 miniCMV이며, 제1 조절 요소는 다수의 반복된 tetO 서열을 포함하고, 다수의 반복된 tetO 서열 중 적어도 하나는 제1 프로모터의 하류에 놓이며; 제4 핵산 분자에 작동 가능하게 연결되고 제1 조절 단백질을 암호화하는 제5 핵산 분자, 여기서 제1 조절 단백질은 LacI이며, 제5 핵산 분자는 추가로 관심 있는 단백질을 암호화하는 서열을 포함하고, 관심 있는 단백질은 바이러스 복제 단백질 및 면역 이펙터를 포함하고, 여기서 면역 이펙터 및 바이러스 복제 단백질은 동시 발현되며, 면역 이펙터는 절단 가능한 링커 펩타이드에 의해 연결되고, 관심 있는 단백질 및 제1 조절 단백질은 하나의 동일한 프로모터에 의해 조절 및 동시 발현되며, 관심 있는 단백질 및 제1 조절 단백질은 절단 가능한 링커 펩타이드에 의해 연결되고; 전사 활성화제의 제2 인식 서열을 포함하는 제6 핵산 분자, 여기서 제2 인식 서열은 5 x UAS이며; 제6 핵산 분자에 작동 가능하게 연결되고 제2 프로모터 및 제2 조절 요소를 포함하는 제7 핵산 분자, 여기서 제2 프로모터는 miniCMV이며, 제2 조절 요소는 다수의 반복된 LacO 서열을 포함하고, 다수의 반복된 LacO 서열 중 적어도 하나는 제2 프로모터의 하류에 삽입되며; 제7 핵산 분자에 작동 가능하게 연결되고 제2 조절 단백질을 암호화하는 제8 핵산 분자, 여기서 제2 조절 단백질은 tetR-KRAB이며; 제5 핵산 분자에 작동 가능하게 연결되고 제1 조절 단백질의 발현을 조건부로 억제하기 위해 구성된 제9 핵산 분자, 여기서 제9 핵산 분자는 제1 마이크로RNA에 의해 특이적으로 인식된 핵산 서열을 포함하며, 제1 마이크로RNA는 정상 세포-특이적 마이크로RNA이고; 및 제8 핵산 분자에 작동 가능하게 연결되고 제2 조절 단백질의 발현을 조건부로 억제하기 위해 구성된 제10 핵산 분자, 여기서 제10 핵산 분자는 제2 마이크로RNA에 의해 특이적으로 인식된 핵산 서열을 포함하며, 제2 마이크로RNA는 종양 세포-특이적 마이크로RNA이고, 여기서 제1 조절 요소는 제2 조절 단백질에 대한 결합에 의해 제1 프로모터의 기능을 억제하기 위해 적응되며, 제2 조절 요소는 제1 조절 단백질에 대한 결합에 의해 제2 프로모터의 기능을 억제하기 위해 적응된다. 본 개시의 구현예에 따르는 재조합 바이러스로, 제1 조절 단백질 LacI 및 관심 있는 단백질은 종양 세포에서 특이적으로 발현되고 제2 조절 단백질 tetR-KRAB는 알파-태아단백질-특이적 프로모터, 제9 핵산 분자 및 제10 핵산 분자의 동시조절 하에 종양 세포에서는 발현되지 않거나 특이적으로 낮게 발현됨으로써, 제1 프로모터 miniCMV에 대한 tetR-KRAB-매개 억제 메커니즘이 방출되고, 따라서 제1 조절 단백질 LacI 및 관심 있는 단백질이 제1 프로모터 miniCMV의 제어 하에 효과적으로 발현되며, 제2 프로모터 miniCMV의 기능이 LacI-매개 억제 메커니즘을 통해 효과적으로 억제되고, tetR-KRAB의 발현이 추가로 억제된다. 추가로, 고효율 및 고특이성으로, 단백질(관심 있는 단백질 E1A 및 제1 조절 단백질 LacI와 같은)은 종양 세포에서 보다 특이적으로 발현되고 제2 조절 단백질 tetR-KRAB과 같은 단백질은 본 개시의 구현예에 따르는 재조합 바이러스를 사용함으로써 종양 세포에서 특이적으로 발현되지 않는다.
본 개시의 한 구현예에 따르면, 재조합 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스 및 백시니아 바이러스로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나이다. (1) 레트로바이러스 벡터는 보편적인 레트로바이러스의 구조 및 감염 과정과 유사한 구조 및 감염 과정, 관심 있는 유전자의 형질전환된 표적 세포에서의 안정적인 발현, 표적 세포의 감염 후 확산 없음, 표적 세포를 감염시키는 데 있어 위바이러스의 고효율, 및 비증식 세포에 대한 감염 없음과 같은 특징을 가진다. (2) 아데노바이러스 벡터는 광범위한 숙주, 아데노바이러스 단백질의 발현에서 숙주 증식에 대한 의존성 없음, 고바이러스 역가, 안정적인 재조합, 종양에 대한 유도 없음, 높은 안전성, 엔벨로프 단백질 없음, 보체 의해 쉽게 비활성화되지 않음, 신체에서의 직접 적용 및 염색체로의 통합 없음의 특징을 가진다. (3) 단순 헤르페스 바이러스 벡터는 고역가, 큰 용량, 증식 및 비증식 세포 둘 다로의 감염, 통합 없음, 및 장기간 존재 및 안정적인 발현의 특징을 가진다.
본 개시의 한 구현예에 따르면, 재조합 바이러스는 아데노바이러스이다. 상기 언급된 것과 같이, 유전자 요법 벡터로서의 아데노바이러스는 많은 장점을 가진다.
1. 아데노바이러스는 광범위한 숙주에 대해 유용하고 인간에 대한 낮은 병원성을 가짐으로써, 아데노바이러스 벡터 시스템은 인간 및 비인간 단백질의 발현에 대해 광범위하게 사용된다. 추가로, 아데노바이러스는 다양한 포유류 세포를 감염시킬 수 있고, 그러므로 대부분의 포유류 세포 및 조직에서 재조합 단백질의 발현에 유용할 수 있다. 아데노바이러스는 상피세포 친화적인 것이 특히 주지되고, 대부분의 인간 종양은 상피 세포로부터 유래된다. 또한, 아데노바이러스의 복제 유전자 및 병원성 유전자는 충분히 분명하고 아데노바이러스에 대한 항체는 인간 집단에서 널리 퍼져 있다(성인의 70 내지 80%가 아데노바이러스에 대한 중화 항체를 가짐). 인간은 야생형 아데노바이러스로 감염된 후에만 약간의 자체-제한 증상을 유발하며, 리바비린으로의 치료가 효과적이다.
2. 아데노바이러스는 증식 및 비증식 세포에서 유전자를 감염시키고 발현할 수 있다. 레트로바이러스는 증식 세포만을 감염시킬 수 있고, DNA 트랜스펙션은 비증식 세포에서 수행될 수 없음으로써, 세포는 인큐베이션으로 유지될 필요가 있다. 아데노바이러스는 아데노바이러스에 대한 일부 림프종 세포를 제외한, 거의 모든 세포 유형을 감염시킬 수 있다. 아데노바이러스는 비증식 일차 세포에서 유전자 발현을 연구하기 위한 최상의 시스템으로, 형질전환된 세포 및 일차 세포로부터 얻어진 결과 사이의 직접 비교를 가능하게 한다.
3. 아데노바이러스는 효과적으로 증식할 수 있고 고역가를 가진다. 아데노바이러스 시스템은 1010 내지 1011 VP/mlL의 역가를 생성할 수 있고 농축 후 1013 VP/mL까지일 수 있음으로써, 이 특징은 아데노바이러스를 유전자 요법에 매우 적합하게 만든다.
4. 아데노바이러스는 인간 유전자에 상동한다. 인간 바이러스는 일반적으로 벡터로서 사용되며 인간 세포는 아데노바이러스 벡터 시스템에 대한 숙주로서 사용되어, 인간 단백질의 정확한 번역 후 프로세싱 및 적절한 접힘에 대한 이상적인 환경을 제공한다. 대부분의 인간 단백질은 고발현 수준을 이룰 수 있고 전체적으로 기능화된다.
5. 아데노바이러스는 염색체 안으로 통합되지 않으며 삽입 후 돌연변이원성을 유발하지 않는다. 레트로바이러스는 숙주의 염색체(들) 안으로 무작위로 통합되어, 유전자 비활성화 또는 종양유전자 활성화를 유발할 것이다. 그러나, 아데노바이러스는 난 세포를 제외한 거의 모든 알려진 세포에서 염색체 안으로 통합되지 않음으로써, 숙주에서 다른 유전자를 간섭하지 않는다. 단일 복사물의 아데노바이러스로 통합된 난 세포는 특이적 특성을 가진 형질도입 동물을 생성하기 위한 양호한 시스템이다.
6. 아데노바이러스는 현탁 배양 배지에서 증폭될 수 있다. 293 세포는 현탁 배양에 대해 조정될 수 있고, 그로써 아데노바이러스의 대량 증폭을 가능하게 한다. 대다수의 사실이 293 세포의 현탁액이 1 내지 20 L 생체반응기에서 재조합 단백질을 발현할 수 있음을 보여주었다.
7. 아데노바이러스는 다수의 유전자를 동시에 발현하는 능력을 가진다. 이것은 동일한 세포주 또는 조직에서 다수의 유전자를 발현하도록 설계된 최초의 발현 시스템이다. 발현 시스템을 구성하기 위한 가장 간단한 방법은 두 유전자를 함유하는 이중 발현 카세트를 아데노바이러스 전달 벡터 안에 삽입하거나, 또는 단백질을 각각 발현하기 위하여 상이한 재조합 바이러스로 관심 있는 세포 스트레인을 동시 트랜스펙션하는 단계를 포함한다. 개별적인 재조합 단백질의 상대적인 동시 발현은 상이한 재조합 바이러스의 MOI 비율을 측정함으로써 정확하게 산정될 수 있다.
본 개시의 한 구현예에 따르면, 면역 이펙터는 PD-1 유전자를 길항하는 억제 서열, PD-L1 유전자를 길항하는 억제 서열, CTLA4 유전자를 길항하는 억제 서열, Tim-3 유전자, IL-2, IL-12, IL-15 및 GM-CSF 또는 이들 인자의 융합 발현 형태를 길항하는 억제 서열로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 서열을 포함한다. 예정된 사멸 1(예정된 사멸 수용체 1, PD-1)은 CD28 수퍼패밀리의 구성원에 속하는 중요한 면역억제 분자로, 원래 세포자멸성 마우스 T 세포 하이브리도마 2B4.11로부터 클론된다. PD-1은 T 세포 표면 상의 중요한 억제 분자이며, 그것의 세포내 도메인은 면역수용체 티로신 억제 모티프(ITIM) 및 면역수용체 티로신 전달 모티프(ITSM)를 포함한다. ITSM은 단백질 티로신 포스파타제 패밀리 포스파타제의 보충 및 T 세포 활성화 신호의 억제를 매개한다. ITSM의 리간드는 PD-L1 및 PD-L2로, 이것들은 주로 면역 체계의 면역 반응 중에 종양 미세환경에서 T 세포의 활성화를 억제하는 데 주요 역할을 한다. 분화 274의 클러스터(CD274) 또는 B7 호모로그(B7 호모로그 1, B7-H1)로도 알려져 있는, 예정된 세포 사멸 1 리간드(PD-L1)는 CD274 유전자에 의해 암호화된 신체의 인간 단백질이다. PD-L1은 다양한 종양 세포 및 종양 세포 미세환경의 조혈 세포에서 유도적으로 발현되며, 이것의 발현 수준은 일부 종양의 악성과 양성적으로 상관이 있다. PD-1 항체 및 PD-L1 항체는 PD-1의 PD-L1에 대한 결합을 차단할 수 있다. 그러나, 조직의 종양 세포는 PD-1/PD-L1 경로를 통해 면역 체계로부터 벗어날 수 있다. 세포독성 T 림프구 회합 단백질-4, 짧게 말해 CTLA-4는 T 세포 표면에서 발현된 동시자극 분자 유형이다. CTLA-4는 CD28의 기능과 유사하게, T 세포의 활성화 중에 하류 신호를 활성화하기 위하여 APC의 표면에서 CD80/CD86에 특이적으로 결합할 수 있다. 연구 결과 T 세포 중에서 CTLA-4를 우세하게 발현하는 세포는 조절 T 세포(Treg)이며, 세포 면역력을 음성적으로 조절하는 T 세포의 부류인 것으로 나타났다. CTLA-4 수용체가 없을 때, 마우스는 T 세포 과다발현을 나타내고, 그로써 중증의 자가면역 질환이 수반된다. 상기 결과는 Treg가 그것의 기능을 실현하기 위하여 CTLA-4를 필요로 하는 것을 보여준다. 더불어, CTLA-4는 또한, T 세포 활성화의 신호전달을 억제하는 데 역할을 하는 conT 세포에서 발현된다. T 세포 면역글로불린 및 뮤신-도메인 함유 분자(TIM) 유전자 패밀리는 2001년도에 Mclntire에 의해 마우스 천식 민감성 유전자를 연구하는 중에 발견된 신규한 유전자 패밀리이고, 나중에 게놈 분석 및 위치 클로닝에 의해 확인되었다. TIM 패밀리 유전자는 면역글로불린 V 영역 및 뮤신 영역을 함유한다. Tim-3은 TIM 패밀리의 중요한 구성원이고 활성화된 Th1 세포의 표면에서 음성 조절 분자를 발현한다. 현재, TIM3은 CD8+ T 세포, Th17 세포, Treg, NK 세포 및 기타 림프구 하위세트에서 발현되는 것으로 나타난다. 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)는 대식세포, T 세포, NK 세포 등에 의해 분비된 모노머 당단백질 사이토카인으로, 줄기 세포를 자극하여 과립 세포(호중구, 호산성 세포, 호염기성 세포 및 단핵세포)를 생성하게 한다. GM-CSF는 또한 면역 체계의 성숙 세포에 영향을 미치는데, 예컨대 호중구의 전달을 억제하고 세포 표면에서 수용체의 발현을 변경시킨다. 이 인자는 또한 대식세포를 활성화함으로써 진균 감염을 억제할 수 있다. 인터류킨 2(IL-2)는 백혈구와 다른 세포 사이 뿐만 아니라 백혈구와 백혈구 사이에서 사이토카인을 매개할 수 있다. IL-2는 주로 활성화된 T 세포에 의해 생성되며, 면역 반응에 관여하는 주요 사이토카인으로, 자가분비 및 측분비(paracrine)의 방식으로 국지성 표적 세포에 작용함으로써, 유의한 면역 효과를 나타낸다. IL-2는 또한 T 세포 증식을 촉진하고 사이토카인을 생성하며, B 세포 증식을 촉진하고 Ig를 분비하며, 대식세포를 활성화하고 NK 세포의 활성화 및 증식을 증강시킬 수 있다. 또한, IL-2는 또한 음성 조절 효과를 가지며, Ag를 활성화하고, 면역 반응의 세기를 제한하며, 명백한 면역 손상을 피하는 T 세포의 세포자멸사를 유도할 수 있다. 인터류킨-12(IL-12)는 항원 자극에 대한 반응으로 수지상 세포, 대식세포, 호중구 및 인간 B 림프모세포(nc-37)에 의해 생성된 인터류킨 종류이다. T 세포 자극 인자로 불리는 IL-12는 나이브 세포의 Th1 세포로의 분화에 참여하고, 인터페론 감마(IFN-γ) 및 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)의 생성을 자극한다. IL-12는 천연 살해 세포 및 T 림프구의 활성을 조절하는 데 중요한 역할을 한다. IL-12는 NK 세포 및 CD8+ 세포독성 T 림프구의 증강된 세포독성 활성을 매개한다. IL-12는 항-혈관형성 활성을 가지는데, 이것은 IL-12가 새로운 혈관의 형성을 차단할 수있음을 나타낸다. IL-12는 감마-인터페론(INF-γ)의 생성을 증가시킴으로써 단백질 10(IP-10 또는 CXCL10)의 유도를 증가시키고, 이때 IL-10은 항-혈관신생을 매개한다. IL-12는 면역 반응 및 항-혈관신생을 유도하는 능력 때문에 잠재적인 항암 약물로서 테스트되었다. IL-15는 다양한 세포, 예컨대 활성화된 단핵세포-대식세포, 상피 세포, 섬유모세포 등에 의해 생성될 수 있는, 최근에 발견된 인자이다. IL-15의 분자 구조는 IL-2의 그것과 훨씬 더 유사하며, 그로써 IL-15는 표적 세포에 대한 IL-2 수용체의 β-사슬 및 γ-사슬의 결합을 기반으로 하여 IL-2와 유사한 생물학적 활성을 발휘할 수 있다. IL-15는 B 세포의 증식 및 분화를 유도할 수 있고, 초기 항체 생성을 유도하기 위해 IL-2를 부분적으로 대체할 수 있는 유일한 사이토카인이다. IL-15는 T 세포 및 NK 세포의 증식을 자극할 수 있고, LAK 세포 활성을 유도할 수 있으며, 또한 IFN-γ를 생성하기 위하여 NK 세포를 상조적으로 자극하기 위해 IL-12와 상호작용할 수 있다.
재조합 세포
본 개시의 제3 측면으로, 구현예에서 재조합 세포가 제공된다. 본 개시의 구현예에 따르면, 재조합 세포는 상기 기술된 것과 같은 발현 시스템을 포함한다. 본 개시의 구현예에 따르는 재조합 세포는, 고안전성 및 특이성으로, 인체에서 전신성 면역 반응을 효과적으로 활성화할 수 있고, 종양 세포와 같은 이종발생성 세포를 공격할 수 있다.
본 개시의 한 구현예에 따르면, 발현 시스템의 적어도 일부는 재조합 세포의 게놈으로 통합된다. 발현 시스템은 재조합 세포 게놈이 복제함에 따라 복제하고, 발현 시스템은 관심 있는 단백질의 발현을 일정하게 및 효과적으로 조절할 수 있다.
의약의 제조에서의 용도
본 개시의 제4 측면으로, 구현예에서 상기 언급된 발현 시스템, 상기 언급된 재조합 바이러스, 및 상기 언급된 재조합 세포의 암치료를 위한 의약의 제조에서의 용도가 제공된다. 본 개시에서 기술된 발현 시스템은 관심 있는 단백질을 종양 세포에서 특이적으로 발현할 수 있다. 본 개시의 구현예에 따르는 약물은 보다 효과적이고, 특이적이며 안전한 방식으로 암을 치료할 수 있다. 본 구현예에서, 본 발명자들은 합성 생물학의 개념에 따라 아데노바이러스 전사와 관련된 핵심 유전자 E1A의 발현을 조절하기 위하여 다중 표적에 대한 반응으로 유전자 회로를 설계하였다. 동시에, 이러한 동시 발현은 전신성 면역 반응에 관련되는 사이토카인 또는 항체 유전자를 활성화할 수 있다. 먼저, 본 발명자들에 의해 설계된 유전자 회로는, 전통적인 암용해성 아데노바이러스와 달리, 다중 수준으로 아데노바이러스의 포장을 조절할 수 있다. 제1 단계에서, 종양-특이적 프로모터는 발명자들에 의해 유전자 회로의 마스터 스위치 Gal4VP16의 발현을 조절하기 위해 사용된다. 제2 단계에서, 유전자 회로의 마이크로RNA의 표적 서열은 상이한 세포주에서 마이크로RNA 발현에 대한 반응으로 비종양 세포로부터 종양 세포를 구별할 수 있다. 제3 단계에서, 안정적인 상호 억압 스위치는 발명자들에 의해 설계된 유전자 회로에서 사용되며, 세포-특이적 프로모터 및 마이크로RNA 신호와 같은 외부 입력 신호에 대해 효율적으로 반응할 수 있고, 유전자 회로는 추가로 입력 신호의 차이를 확대시킬 수 있고 비종양 세포로부터 종양 세포를 구별하는 데 보다 효과적일 수 있다. 제4 단계에서, 발명자들에 의해 설계된 아데노바이러스 벡터의 발현 시스템은 아데노바이러스 E1B 유전자를 포함하지 않으며, 여기서 E1B 유전자는 정상 세포에서 성공적인 아데노바이러스 증식을 보장하기 위해 정상 세포에서 P53 유전자와 상호작용할 수 있다. E1B 유전자가 없는 아데노바이러스는 P53을 발현하는 정상 세포에서 증식할 수 없었던 한편, P53 유전자가 없는 종양 세포에서는 여전히 효과적으로 증식할 수 있다. 그러므로, 구현예에서 아데노바이러스 벡터는 다중 수준 조절을 통해 전통적인 암용해성 아데노바이러스보다 더 특이적이고 더 안전하다. 또한, 이런 조작된 아데노바이러스는 구현예에서 다양한 사이토카인 및 항체를 발현하는 유전자를 운반하기 위한 벡터로서 사용된다. 그러므로, 아데노바이러스는 암용해 효과를 나타낼뿐만 아니라, 암용해성 아데노바이러스의 개선된 효능으로, 동시 발현된 인자를 사용함으로써 전신성 면역 반응을 활성화할 수 있다.
구체적으로, 본 출원은 합성 생물학 수단에 의해 간세포 암종 세포에서 암용해성 아데노바이러스의 특이적 발현 및 포장을 조절하기 위해 유전자 회로를 구성한다. 암용해성 효능을 가지는 것을 제외하고, 본 발명자들에 의해 구성된 아데노바이러스는 또한 신체에서 면역 반응을 활성화할 수 있는 사이토카인을 발현하는 유전자로 로딩된다. 이러한 사이토카인은 일단 발현되면 종양을 치료하기 위하여 종양 성장을 억제하는 면역 반응을 자극할 수 있다. 본 출원에서 설계된 발현 시스템은 다음과 같은 대단히 혁신적이고 기술적인 장점을 가진다.
효율적이고 안전하다: 본 출원에서 설계된 유전자 회로는 다중 수준에서 암세포로부터 정상 세포를 구별하는 생체마커에 대해 반응할 수 있고 상이한 세포에서 아데노바이러스의 복제를 조절하기 위하여 상호 억압성 폐루프 유전자 회로를 포함하므로, 유전자 발현 노이즈의 효과를 감소시키는 한편으로 상이한 세포주에서 미세환경에 대해 더 민감하게 반응할 수 있다.
효율적이다: 본 출원의 유전자 회로는 다양한 사이토카인 및/또는 항체를 발현하는 유전자로 로딩되므로, 효과적인 면역 반응이 관심 있는 세포에서 유도될 수 있다.
유전자 회로의 모듈화: 유전자 회로에 관여된 생체마커는 각각 상이한 질환에 대한 생체마커를 함유하는 상이한 모듈 라이브러리로 모델화되는, 모듈로 모듈화됨으로써, 질환-특이적 유전자 회로는 상대적인 모듈을 신속하게 조립함으로써 구성될 수 있다.
정확성: 발명자들의 경우 신속한 조립 기술을 기반으로 상이한 종양 마커를 대체하는 것이 가능함으로써, 상이한 환자를 지정하는 유전자 회로가 정확한 치료를 위해 설계될 수 있다.
본 개시의 한 구현예에 따르면, 암은 간암, 폐암, 대장암, 흑색종, 유방암 또는 전립선암을 포함한다. 발명자들은 본 개시의 구현예의 약물이 간암, 폐암, 대장암, 흑색종, 유방암 및 전립선암에 대해 더 뚜렷한 치료 효과를 가지는 것을 발견하였다.
본 개시의 특정 구현예에 따르면, 발명자들은 상이한 종양 세포주에서 마이크로RNA의 발현이 표 1과 같이 나타나는 것을 발견하였다. 상향 화살표는 정상 세포에 비교하여 암세포에서 고도로 발현되는 마이크로RNA를 나타내는 한편, 하향 화살표는 정상 세포에 비교하여 암세포에서 저발현되는 마이크로RNA를 나타낸다.
| 간세포 암종 | miR-21↑,18↑,224↑,199↓,195↓,200↓,125↓ |
| 폐암 | Let-7↓, miR-17-92↑ |
| 유방암 | miR125b↓, 145↓, 21↓, 155↓ |
| 뇌암 | miR-21↑, 221↑,181↓, |
| 대장암 | miR143↓, 145↓ |
| 림프종 | miR155↑, miR-17-92↑ |
| 흑색종 | miR21↑,221↑,214↑146a↑137↓200c↓let-7↓ |
발현 시스템을 사용함으로써 관심 있는 단백질을 발현하는 방법
본 개시의 제5 측면으로, 구현예에서 발현 시스템을 사용함으로써 관심 있는 단백질을 발현하는 방법이 제공된다. 발현 시스템은 상기에서 기술된 발현 시스템이다. 본 개시의 구현예에 따르면, 방법은 (1) 관심 있는 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제5 핵산 분자를 제공하는 단계; 및 (2) 관심 있는 단백질을 발현시키기 위하여 제10 핵산 분자에 의해 제2 조절 단백질의 발현을 억제하는 단계를 포함한다. 구현예의 발현 시스템을 사용함으로써 관심 있는 단백질을 발현하는 방법으로, 제1 프로모터에 대한 제2 조절 단백질-매개된 억제 메커니즘이 방출됨으로써, 관심 있는 단백질은 세포-특이적 프로모터 및 제1 프로모터의 공동 작용 하에 특이적 세포에서 효과적으로 발현된다.
본 개시의 한 구현예에 따르면, 발현은 세포에서 수행된다. 세포는 관심 있는 단백질의 발현을 위한 미세환경을 제공할 수 있음으로써, 관심 있는 단백질은 세포에서 보다 효율적으로 발현될 수 있다.
본 개시의 한 구현예에 따르면, 제10 핵산 분자는 제2 마이크로RNA에 의해 특이적으로 인식된 핵산 서열을 포함하고, 방법은 추가로 단계 (2)에서 제2 마이크로RNA를 제10 핵산 분자와 접촉시키는 단계를 포함한다. 마이크로RNA(miRNA)는 약 20 내지 24개 뉴클레오타이드를 가지는 내인성 작은 RNA의 부류이고, 여러 miRNA가 하나의 동일한 유전자를 조절할 수 있다. 유전자의 발현은 여러 miRNA의 조합에 의해 미세하게 조절될 수 있다. 마이크로RNA는 약 300 내지 1000개 염기의 길이의 것인, 원래 형태의 pri-miRNA; pri-miRNA의 프로세싱에 의해 형성되고 약 70 내지 90개 염기의 길이의 것인, 마이크로RNA 전구체 형태의 pre-miRNA; 및 pre-miRNA의 Dicer로의 소화에 의해 생성된, 약 20 내지 24 nt의 성숙한 miRNA를 포함하는, 여러 형태를 가진다. RNA-유도된 침묵 복합체(RISC)는 표적 유전자의 발현을 억제한다. 표적 유전자 mRNA에 미치는 마이크로RNA-RISC의 영향은 언제나, 3가지 방법으로 수행된, 마이크로RNA-RISC와 표적 유전자 전사물 서열 사이의 상보성 정도에 크게 좌우되었다. 첫 번째 방법으로, 표적 유전자의 mRNA 분자는 절단된다, 즉 표적 유전자에 완전히 상보하는(siRNA의 메커니즘 및 기능에 매우 유사한 메커니즘 및 기능을 가지는) miRNA가 절단된다. 식물에서, 표적 유전자의 miRNA의 대부분이 상기 기술된 방법에 의해 절단되고, 폴리(A)가 없는 분자는 3' 단부에서 우라실(U)이 첨가되며 신속하게 분해되는 한편 폴리(A)가 있는 분자는 일정 시간 동안 안정적으로 존재할 수 있다(예컨대 아라비돕시스 miR-171). 현재, 하나의 miRNA가 식물에서 3개의 잠재적인 표적 유전자에 완전히 상보하는 것으로 발견되지만, 이들 유전자가 miRNA의 표적인지의 여부는 불명확하다. 그러나, miRNA가 이것의 잠재적 표적에 완전히 상보할 수 있음이 최초로 드러나고, 이것은 miRNA가 siRNA와 유사한 메커니즘을 가질 수 있음을 시사한다. 두 번째 방법으로, 표적 유전자의 번역이 억제된다. miRNA는 표적 유전자에 완전히 상보하지 않음으로써, mRNA의 안정성에 영향을 주지 않으면서 표적 유전자의 번역을 억제한다. 이러한 miRNA는 네마토드 lin-4와 같이 가장 광범위하게 발견된 miRNA이지만, 식물에서 소수의 miRNA가 이 방법으로 표적 유전자를 억제한다. 세 번째 방법은 결합 억제, 즉 상기 두 방법에서 두 메커니즘을 통합시키는 것을 나타낸다. miRNA가 표적 유전자에 완전히 상보할 때, 그것들은 직접 절단된다. miRNA가 표적 유전자에 완전히 상보하지 않을 때, 그것들은 유전자 발현의 조절에 참여한다.
본 개시의 제6 측면으로, 구현예에서 발현 시스템을 사용함으로써 관심 있는 단백질을 발현하는 방법이 제공된다. 발현 시스템은 상기 기술된 것과 같은 발현 시스템이다. 본 개시의 한 구현예를 따르면, 방법은 다음을 포함한다: (1) 관심 있는 제1 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제8 핵산 분자를 제공하고, 관심 있는 제2 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제5 핵산 분자를 제공하는 단계; 및 (2) 관심 있는 제1 단백질을 발현시키기 위하여 제9 핵산 분자에 의해 제1 조절 단백질의 발현을 억제하거나; 또는 관심 있는 제2 단백질을 발현시키기 위하여 제10 핵산 분자에 의해 제2 조절 단백질의 발현을 억제하는 단계를 포함한다. 구현예의 발현 시스템을 사용함으로써 관심 있는 단백질을 발현하는 방법으로, 제1 프로모터에 대한 제2 조절 단백질-매개된 억제 메커니즘이 방출되고, 그로써 관심 있는 제2 단백질은 세포-특이적 프로모터 및 제1 프로모터의 공동 작용 하에 특이적 세포에서 효과적으로 발현되거나, 또는 제2 프로모터에 대한 제1 조절 단백질-매개된 억제 메커니즘이 방출되고, 그로써 관심 있는 제1 단백질은 세포-특이적 프로모터 및 제2 프로모터의 공동 작용 하에 특이적 세포에서 효과적으로 발현된다.
본 개시의 실험 구현예가 하기에 상세하게 기술된다. 하기 기술된 구현예는 단지 예시적인 것이고 본 개시를 제한하는 것으로서 해석되지 않는다. 특정 기법 또는 조건이 실시예에서 표시되지 않는 경우, 실시예는 당업계의 문헌에 기술된 기법 또는 조건에 따라 또는 생성물 명세에 따라 수행된다. 제조사에 의해 표시되지 않은 사용된 시약 또는 기기는 모두 상업적으로 얻어질 수 있는 종래 제품이다.
실험 물질 및 방법
1. 세포 배양 및 트랜스펙션
HEK293(293-H) 세포주를 Invitrogen Co., Ltd.로부터 구입하였다. 인간 간암종 세포주 HepG2, 정상 간 세포 Chang 및 Hepa1-6을 ATCC로부터 구입하였다. 인간 간암종 세포주 Huh7을 BeNa Co., Ltd.로부터 구입하였다. 세포를 4.5 g/L 글루코오스, 0.045 단위/mL 페니실린, 0.045 g/mL 스트렙토마이신 및 10% FBS(Invitrogen Co., Ltd.로부터 구입함)를 함유한 고글루코오스 둘베코 변형 이글스 배지(즉 DMEM 완전 배지)에서 37℃, 100% 습도 및 5% CO2 농도에서 배양하였다.
세포 트랜스펙션을 다음과 같이 수행하였다. 0.5 mL의 고-글루코오스 DMEM 완전 배지 중의 약 7.5 x 104 HEK293 세포를 24-웰 플레이트(Falcon)의 각각의 웰에 시딩하고 24시간 동안 인큐베이션한 후, 배지를 신선한 DMEM 완전 배지로 교체하고 트랜스렉션을 위해 아트락텐(Attractene) 트랜스펙션 시약(Qiagen) 또는 리포펙타민 LTX(Life Technologies)를 첨가하였다. 구체적으로, 1.5 μL의 아트락텐을 소정량의 혼합 DNA 플라스미드에 첨가하고, 실온에서 15분 동안 놓아둔 후, 만약 아트락텐이 사용되었다면 해당 웰에 첨가하였다. 그러나, 만약 리포펙타민 LTX가 사용되었다면, 적절한 양의 Plus 시약을 먼저 혼합 DNA 플라스미드에 첨가하고 실온에서 5분 동안 놓아둔 후, 1.25 μL의 리포펙타민 LTX를 첨가하고 실온에서 다시 25분 동안 놓아둔 후 24-웰 플레이트에 전달하였다. 옥수수 유비퀴틴 프로모터(UBI)를 함유하고 이어서 UBI와 NOS 사이의 단백질-코딩 서열이 없이 NOS 터미네이터를 함유한 pDT7004(pUBI-링커-NOS)를 사용하여, 상이한 실험 군의 플라스미드 DNA의 양이 동일한 것을 확실하게 하였다. 트랜스펙션 후의 세포를 48시간 동안 배양한 후 유동 세포분석법 분석을 하거나 사이토카인 검출에 관련된 일부 실험에 적용하였다.
2. 아데노바이러스 벡터
2개의 초기 아데노바이러스 벡터 서열, 즉 ViraPowerTM 아데노바이러스 GatewayTM 발현 키트(K49300 Invitrogen) 및 아데노-X-아데노바이러스 시스템 3(632266 Clontech)을 이 실시예에서 사용한다. 2개의 아데노바이러스 벡터의 구조를 각각 도 1 및 도 2에 나타낸다.
3. 플라스미드 구성
절단된 AFP 프로모터 유도체에 관련된 플라스미드를 구성하였다. AFP 인핸서 및 AFP 프로모터 서열을 특수하게 설계된 PCR 프라이머 하에 PCR 증폭을 통해 간암종 세포주의 게놈으로부터 직접 얻었다. AFP 프로모터 서열의 점 돌연변이를 중첩 연장 PCR 방법을 사용함으로써 얻었다. AFP 인핸서 및 AFP 프로모터 서열을 진입 클론 안으로, 진입 클론의 양 단부에서 LR 클로나제의 특수하게 설계한 인식 서열을 사용하여 구성하였다. 특이적 프로모터 및 활성화제 유전자 Gal4VP16을 하나의 동일한 벡터로 LR 반응에 의해 구성하였다. 마이크로RNA의 표적 서열을 프라이머 어닐링, 효소 소화 및 결찰을 통해 CMV-EYFP 벡터(XbaI/SalI) 안으로 삽입하였다. 발현 시스템의 일차 요소 라이브러리를 골든 게이트 방법을 통해 구성하였다. 타입 II 제한 효소(예컨대 BsaI, BbsI, BsmBI, SapI 등)는 인식 부위가 비-회문성이고 대칭적인 서열이며 그것의 절단 부위가 인식 부위 외부에 위치한 제한 효소의 특수한 부류로서, 인식 부위가 회문성이고 대칭적인 서열이며 절단 부위가 인식 서열과 중첩하는 분자 생물학에서 가장 통상적으로 사용된 타입 II 제한 효소와 상이하다. 그러므로, 타입 II 제한 효소에 의해 소화된 두 단편이 후속 소화 및 결찰 반응에서 결찰될 때, 그것들은 이전의 인식 부위의 부재로 인해 다시 절단되지 않을 것이며, 그로써 용접의 효과를 이룰 것이다. 골든 게이트 클로닝 방법의 경우, 타입 II 제한 효소의 이러한 특징 때문에 상이한 절단 부위 서열이 인식 서열의 외부에서 인공적으로 설계되고, 이것에 의해 하나의 동일한 타입 II 제한 효소가 상이한 점착(sticky) 단부를 생성할 수 있음으로써, 한 번에 다수의 단편을 조립하는 것을 q보장할 수 있고, 그로써 다수의 상이한 제한 효소의 사용과 같은 전통적인 다중-단편 조립의 결핍을 극복할 수 있다. 이런 골든 게이트 클로닝 방법의 가장 큰 특징은 추가적인 "상처(scar)"가 도입되지 않고 그로써 전통적인 소화-결찰 방법과 비교하여 심리스(semless) 결찰을 이룬다는 점에 있다. 이 실시예에서 일차 요소 라이브러리에 사용된 타입 II 제한 효소는 Esp3I이다. 발현 시스템의 제2 로직(logic) 회로 라이브러리를 또한 골든 게이트 방법에 의해 구성하였는데, 타입 II 제한 효소 BsaI을 사용하였다. 그런 후 제2 로직 회로를 ViraPowerTM 아데노바이러스 GatewayTM 발현 키트의 아데노바이러스 벡터 서열에 골든 게이트 방법에 의해 삽입하거나, 또는 아데노-X 아데노바이러스 시스템 3의 아데노바이러스 벡터 서열에 깁슨 클로닝에 의해 삽입하였다. 게이트웨이 기법은 BP 및 LR 반응으로 구성된, 잘 연구되어 있는 파지 λ 부위-특이적 재조합 시스템(attB X attP → attL X attR)을 기반으로 한다. BP 반응은 attB DNA 단편 또는 발현 클론과 attP 도너 벡터 사이의 재조합 반응으로, 진입 클론이 생성된다. LR 반응은 attL 진입 클론과 attR 목표 벡터(destination vector) 사이의 재조합 반응으로, 병렬 반응으로 하나 이상의 목표 벡터로 관심 있는 서열을 삽입하기 위해 사용된다. 본 발명자들은 이 실시예에서 LR 반응을 사용하였다. "깁슨 자동온도조절식 일단계 조립 방법"으로도 알려져 있는 깁슨 조립 기법은 미국 J. CraigVenter 연구소에서 깁슨 등에 의해 생성된 DNA 조립 방법으로, 중복하는 단부 서열을 가진 다수의 DNA 단편을 T5 엑소뉴클레아제, DNA 중합효소 및 리가아제의 상조 효과 하에 시험관내에서 조립한다. 이것들 중에서, T5 엑소뉴클레아제는 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 가지며, 중복하는 단부 서열을 가진 DNA 단편을 DNA 단편의 한 가닥의 5' 단부로부터 절단할 수 있고, 그로써 50℃에서 특수하게 어닐링되는(T5 엑소뉴클레아제는 이 온도에서 점차로 비활성화됨) 상보하는 가닥의 3' 단부에서 중복하는 서열을 가지는 돌출 단부를 생성하고, 마지막으로 DNA 중합효소 및 Taq 리가아제의 존재 하에 완전한 DNA 분자가 형성되어 심리스 조립이 달성된다.
4. 세포 RNA 추출, 역전사 및 정량적 PCR 반응
세포 RNA를 Triol 방법에 의해 추출하였다. 1 mL의 Trizol을 원심분리에 의해 펠릿화된 5 x 106 세포에 첨가한 후, 피펫으로 반복적으로 피펫팅하거나 격렬하게 흔들어줌으로써 세포를 용해하였다. 15 내지 30℃의 실온에서 5분 동안 놓아둔 후, 0.2 mL의 클로로포름을 첨가하고, 혼합물을 격렬하게 15초 동안 흔들어준 후, 실온에서 다시 2 내지 3분 동안 놓아둔 후, 12,000 x g에서 4℃에서 15분 동안 원심분리하였다. 0.5 mL의 아이소프로판올을 분리된 상부 수성 층에 첨가하고, 실온에서 10분 동안 놓아둔 후, 12,000 x g에서 4℃에서 10분 동안 원심분리한 후, 1 mL의 75% 에탄올을 첨가하고, 와동시킨 후 7500 x g에서 4℃에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 버리고, 침전된 RNA를 실온에서 자연 건조시켰다. 건조된 RNA를 RNase가 없는 물에 용해시켰다. 역전사 실험을 QuantiTect 역전사 키트(Cat No./ID: 205310 QIAGEN)를 사용함으로써 수행하였다. 정량적 PCR 프라이머는 qAFP 전방향: CAAAGCTGAAAATGCAGTTGAATG(SEQ ID NO: 15), qAFP 역방향: TTCCCCATCCTGCAGACAATCC(SEQ ID NO: 16), GAPDH 전방향: AGAAGGCTGGGGCTCATTTG(SEQ ID NO: 17), 및 GAPDH 역방향: AGGGGCCATCCACAGTCTTC(SEQ ID NO: 18)이다. 형광 염료는 PowerUpTM SYBR®그린 마스터 믹스(A25741Thermo Fisher)이다.
5. 아데노바이러스의 포장, 정제 및 적정
고순도의 내독소-유리 재조합 아데노바이러스 플라스미드를 추출하였다. HEK293 세포를 PacI에 의해 밤새 소화됨으로써 선형화된 아데노바이러스 DNA로 트랜스펙션한 후, 완전 배지로 배양 배지를 교체하였다. 세포를 1 mL의 배양 배지와 함께 1주일의 배양 후에(배양 중에 세포 성장 상태에 따라 신선한 배지를 첨가함) 15 mL 원심분리 튜브에 수집한 후, 액체 질소를 통해 37℃에서 3회의 연속적인 냉동-해동 사이클로 용해시킨 후, 2000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 일차 바이러스 용액으로서 얻었다. 3회의 연속적인 트랜스펙션 세대 후에, 얻어진 아데노바이러스를 증폭을 위해 15 cm 플레이트 중 10개에 시딩하였고, 추가로 CsCl 밀도 구배 원심분리 및 투석의 조합에 의해 정제하였다. CsCl 밀도 구배를 2 mL의 CsCl 용액을 1.4 g/mL의 밀도로 첨가하고, 추가로 3 mL의 CsCl 용액을 1.3 g/mL의 밀도로 서서히 첨가한 후, 5 mL의 바이러스 현탁액을 첨가함으로써 제조하였다. 20000 rpm 및 4℃에서 10시간 동안 원심분리한 후, 1.3 g/mL과 1.4 g/mL 사이의 밀도로 CsCl 용액에 농축한 아데노바이러스를, 사용 전에 10분 동안 10 mM EDTA-Na2로 끓여놓은 투석 주머니에 수집하였다. 투석 완충액은 50 g의 수크로오스, 10 mL의 1 M Tris-HCl 및 2 mL의 1 M MgCl2를 사용하고, 물을 사용하여 1 L로 만들고 pH를 8.0으로 조정함으로써 제조한다. 4℃에서 밤새 교반하고 투석 완충액을 2회 교환한 후, 아데노바이러스를 바이러스 역가의 측정을 위해 수집하였다. 바이러스 역가를 감염된 세포로부터 추출한 바이러스 DNA를 정량화함으로써 측정하였다. 구체적으로, 약 2 x 106 HeLa 세포/웰을 6-웰 조직 배양 플레이트에 시딩하고(세포 커버리지 속도는 인큐베이션 하루 후에 90 내지 100%에 도달함) 500 μL의 혈청-유리 배지로 희석한 5 μL의 바이러스 스톡으로 2회 감염시킨 후, 37℃에서 3 내지 6시간 동안 인큐베이션하고, 배양 배지를 제거하고, 1 mL의 PBS로 2회 세척하였다. 세포를 500 μL의 신선한 NP-40 용해 완충액(0.65% NP-40(Calbiochem, Billerica, MA, USA), 150 mM NaCl, 10 mM Tris를 포함함, pH 8.0)을 첨가함으로써 용해시키고, 실온에서 5 내지 10분 동안, 완전한 용해를 위해 위 아래로 10 내지 15회 피펫팅하면서 인큐베이션한 후, 바이러스 침전을 위해 2000 x g에서 3분 동안 원심분리하였다. 상층액을 버린 후, 1 mL의 NP-40 용해 완충액을 첨가하고 이어서 짧게 와동시킨 후 2000 x g에서 3분 동안 원심분리하였다. 상층액을 다시 버리고 침전물을 200 μL의 PBS에 현탁시켰다. DNA 분리 및 정제 중에, DNA를 DNeasy 혈액 & 조직 키트(QIAgen, Valencia, CA, USA)를 사용함으로써 후속 정량 반응을 위해 추출하였다. 정량적 프라이머는 L2 전방향 프라이머: TTGTGGTTCTTGCAGATATGGC(SEQ ID NO: 19), 및 L2 역방향 프라이머: TCGGAATCCCGGCACC(SEQ ID NO: 20)이다.
표준 곡선을 제조하였다. PCR L2 표적 서열을 T 벡터로 구성하고, 이것을 표준 서열로서 1 x 109 내지 1 x 102 복사물/μL로 희석하였다. 희석 공식은 다음과 같다: [플라스미드 농도(μg/μL) x 아보가드로 수 x 106] / [뉴클레오타이드의 수 x 1 bp 분자량] = 입자 복사물/μL.
6. 세포 실험
아데노바이러스를 상이한 세포에 대한 그것의 인식 및 사멸 능력에 대해 검출하였다. Chang 세포(1 x 104 세포/웰), 및 HepG2 및 Huh7 세포(각각 5 x 10 4 세포/웰)를 96-웰 플레이트에 시딩하고 아데노바이러스 벡터로 7 감염 다중도(MOI) 구배로 102부터 10-4까지의 10배 희석으로 감염시키고, 관찰 6일 후 MTS 방법에 의해 세포 생존성을 측정하였다.
7. MTS 검출
세포의 수를 MTS 방법에 의해 측정하였다. 20 μL의 MTS/PMS 혼합물(Promega)을 테스트하고자 하는 세포를 함유한 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가한 후, 혼합하고, 37℃에서 1 내지 4시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 발색 후 10초 동안 흔들어서 균일한 색이 되도록 하였다. 490 nm의 파장에서의 흡광도(OD 값)를 마이크로플레이트 판독기를 사용함으로써 측정하였다. 표준 곡선을 확립하였다. 관심 있는 세포의 수를 표준 곡선을 참조하여 검출하였다.
8. 사이토카인 검출
사이토카인의 생물학적 활성을 사이토카인-의존성 세포주의 증식을 통해 검출할 수 있다. IL-2, mGM-CSF 및 hGM-CSF의 생물학적 활성을 각각 CTLL-2, FDC-P1 및 TF-1 세포주를 사용함으로써 검출하였다. 수집 후, 테스트하고자 하는 1 x 104 사이토카인-의존성 세포를 96-웰 플레이트에 시딩하고, 테스트하고자 하는 사이토카인을 함유한 샘플로 감염시키고, 온도조절방식으로 37℃에서 24시간 동안 또는 48시간 동안 배양하였다. 증폭된 세포를 MTS 방법에 의해 측정하였다. 용량-증식 표준 곡선을 확립하였다. 측정된 샘플에서 사이토카인의 생물활성을 표준 곡선을 사용함으로써 산정하였다.
9. 동시 면역침전 검정
동시 면역침전법을 다음과 같이 수행하였다. 적절한 양의 단백질 용해 완충액(Biyuntian Co., Ltd.)을 테스트하고자 하는 수집한 세포에 첨가하였고, 원심분리하여 세포 파편을 제거하였다. 소량의 단백질 용해 완충액을 후속 웨스턴 블롯 분석을 위해 남겨두었다. 나머지 단백질 용해 완충액 플러스 상응하는 태그 항체(Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.)로 콘쥬게이트된 10 내지 30 μL의 단백질 A/G-아가로오스 비드를 얻어진 세포 용해물에 첨가하고, 4℃에서 밤새 약간 흔들어주면서 인큐베이션한 후, 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 침전된 비드를 3회 세척한 후, 항체 및 포획된 단백질을 아가로오스 비드로부터 용출액을 사용함으로써 용출한 후, SDS-PAGE 로딩 완충액(Shanghai Shenggong Co., Ltd.)을 첨가하고 끓였다. 관련 단백질의 풍부화를 웨스턴 블롯 방법에 의해 검출하였다.
10. 동물 연구
실험 동물을 HuafuKang Co., Ltd.로부터 또는 Weitonglihua Co., Ltd.로부터 구입하였다. 종양 모델을 SPF 환경에서 유지한 생후 6주령의 수컷 또는 암컷 마우스를 사용함으로써 구성하였다. 인간 종양 모델의 경우, 생후 6주령의 누드 마우스에 마트리겔(BD Co., Ltd.) 중의 1 x 107 인간 간암종 세포 HepG2를 우측 옆구리에 피하 주사하였다. 마우스 종양 모델의 경우, 1 x 106 마우스 간암종 세포 Hepa1-6을 생후 6주령의 야생형 C57BL/6J 마우스의 우측 옆구리에 피하 주사하였다. 피하 종양 크기를 버니어 캘리퍼스에 의해 3일마다 측정하였고, 다음 식을 사용하여 계산하였다: 부피 = 0.5 x 길이 x 폭2. 종양 부피가 100 mm3를 초과한 후, 암용해성 아데노바이러스 또는 대조군 치료를 투여하였다. 종양-포함 마우스를 종양 크기가 직경이 15 mm에 도달한 후에, 동물 실험 윤리 요건에 따라, 안락사시켰다.
실험 결과
1. 합성 생물학의 사용에 의한 비암세포로부터 암세포를 구별하기 위한 다양한 생체마커에 대한 반응으로 상호 억압 스위치의 구성
최근 수년의 관련 연구는 항암 바이러스가 암 치료에 매우 효과적인 것을 보여주었고, 그로써 암용해성 아데노바이러스에 대한 많은 임상 연구가 개발되었다. 기존의 임상 연구 결과에 따르면, 암용해성 아데노바이러스에 대한 상대적으로 고비율의 누출이 있고, 따라서 임상 단계에서 암용해성 아데노바이러스의 안전성을 개선하는 방법이 중요한 쟁점이다. 기존의 암용해성 아데노바이러스의 분석을 기반으로, 대부분의 암용해성 아데노바이러스는 단일 생체마커, 예컨대 아데노바이러스 복제에 핵심적인 유전자 E1의 발현을 조절하는 종양-특이적 프로모터에 따라 조절된다. 그러나, 하나의 생체마커만이 상대적으로 높은 누출 가능성을 유발할 수 있다. 그러므로, 발명자들은 이 실시예에서 다양한 생체마커에 대한 반응으로 및 다양한 수준에서 아데노바이러스 E1A 유전자의 발현을 조절하고, 그로써 암용해성 아데노바이러스의 인식 특이성을 개선하고 안전성을 증강시키기 위하여 상호 억압 스위치를 설계하였다.
도 3에 도시된 것과 같이, 상호 억압 스위치는 다음의 특징을 가진다. 종양 특이적 프로모터(pC)는 상호 억압 스위치의 마스터 활성화제를 조절한다. 마스터 활성화제는 하류 유전자의 발현을 조절하기 위하여 활성화제 반응 프로모터(pAct)에 대해 작용한다. 상호 억압 스위치의 첫 번째 쪽은 아데노바이러스 포장-관련 E1A 유전자, 이펙터 및 리프레서 a(Rep-a), 뿐만 아니라 두 번째 쪽에서 발현된 리프레서 b의 인식 서열을 추가로 포함하는, 비종양 세포에서 고도로 발현된 마이크로RNA a(miRNA a)의 표적 서열을 발현하고, 리프레서 b의 인식 서열은 각각 첫 번째 쪽의 제1 프로모터의 두 쪽에 위치한다. 상호 억압 스위치의 두 번째 쪽은 리프레서 b(Rep-b) 뿐만 아니라 종양 세포에서 고도로 발현된 마이크로RNA b(miRNA b)의 표적 서열을 발현하고, 이는 첫 번째 쪽에서 발현된 리프레서 a의 인식 서열을 추가로 포함하며, 리프레서 a의 인식 서열은 각각 두 번째 쪽의 제2 프로모터의 두 쪽에 위치한다. 종양 세포에서, 종양 특이적 프로모터(pC)는 전체 시스템의 발현을 개시한다. 리프레서 b는 종양 세포에서 miRNA b의 고발현 및 miRNA a의 저발현으로 인해 RNA 간섭을 통해 분해되고, 그로써 첫 번째 쪽에서 유전자 발현에 대한 리프레서 b의 억제가 제거된다. 그 외에, 리프레서 a의 고발현은 추가로 리프레서 b의 발현을 억제할 수 있고, 그로써 상호 억압 스위치가 E1A 발현 상태로 빠르게 및 효율적으로 스위칭되는 것을 허용함으로써, 아데노바이러스의 포장 및 이펙터의 발현이 개시된다. 역으로, 상호 억압 스위치가 비종양 세포로 들어갈 때, E1A 및 이펙터는 종양-특이적 프로모터, miRNA 마커 및 로직 회로의 조합으로 인해 발현될 수 없고, 그로써, 아데노바이러스의 포장 과정이 효과적으로 닫혀지며, 이 로직 회로의 특이성 및 안전성이 보장된다. 그러므로, 이러한 상호 억압 스위치는 다양한 유입 신호에 반응할 수 있고 전사 및 전사후 수준에서 비표적 세포로부터 표적 세포를 구별할 수 있다. 또한, 발명자들에 의해 제안된 본 발현 시스템은 E1A 유전자만을 발현할 수 있고, E1B 유전자가 제거됨으로써, 기능성 결함의 보완의 관점으로부터 표적 세포에 대한 항암 바이러스의 인식 능력이 개선된다. 그러므로, 발명자들에 의해 설계된 발현 시스템은 다중 수준에서 표적 세포를 구별할 수 있고, 아데노바이러스 안전성은 효과적으로 개선된다.
2. 정상 세포로부터 간암종 세포를 구별하는 생체마커의 확인 및 분석
2.1 간암종-특이적 알파-태아단백질(AFP) 프로모터의 구성
알파-태아단백질(αFP 또는 AFP)은 주로 태아의 간에서 합성되며, 정상 성인에서는 발현되지 않지만, 간 세포가 암성이 될 때 다시 발현될 것이고, 혈청 중의 AFP의 양은 간암이 진행됨에 따라 극적으로 증가할 것이다. 현재, 알파-태아단백질은 원발성 간암의 진단을 위한 특이적 임상 지표이고, 그로써 발명자들은 실시예에서 비-간암종 세포로부터 간암종 세포를 구별하기 위한 프로모터 마커로서 알파-태아단백질 프로모터를 선택하였다.
발명자들은 추가로 실험에 의해 AFP의 특이적 발현을 검출하였다. 먼저, 일련의 비-간암종 세포 및 간암종 세포에서 인간 AFP 유전자의 발현을 qPCR 방법에 의해 검출하였다. 도 4에 나타낸 것과 같이, Chang, HepG2, Huh7, PLC, Hep3B 및 Hepa1-6 세포주의 RNA를 각각 추출하였고, 이들 세포에서 AFP 유전자의 발현 수준을 정량적 PCR 방법에 의해 검출하였는데, Chang 세포는 정상 인간의 간 세포이고, HepG2, Huh7, PLC 및 Hep3B 세포는 인간 간암종 세포이며, Hepa1-6 세포는 마우스 간암종 세포이다. 결과는 인간 AFP 유전자가 HepG2 및 Huh7 세포주에서 고도로 발현되며, PLC 및 Hep3B 세포주에서 저발현될뿐만 아니라, 마우스 Hepa1-6 간암종 세포에서 약간 발현된 것을 나타내며, 이것은 AFP 프로모터가 발명자들에 의해 그것의 특이적 발현으로 인해 간암종 세포에서 프로모터 마커로서 사용될 수 있음을 시사한다.
현재 광범위하게 사용된 AFP 프로모터는 인핸서 및 프로모터로 구성된다. 인핸서는 프로모터를 활성화할 수 있는 2개의 서열, 즉 도메인 A(DA) 및 도메인 B(DB)를 함유한다. 프로모터의 효율을 증가시키기 위하여, 발명자들은 프로모터의 위치 -119 에서 구아닌(G)을 아데닌(A)으로 돌연변이시켰다. 또한, 인핸서 영역을 발명자들에 의해 상이한 정도로 절단하였다. 도 5에 나타낸 것과 같이, AFP I은 1.8 Kbp의 길이의 AFP의 인핸서 서열을 포함하고(SEQ ID NO:21로 나타냄); AFP II는 활성화 영역 A(DA), 활성화 영역 B(DB) 및 2개의 활성화 영역 사이의 서열을 포함하며(SEQ ID NO:22로 나타냄); AFP III은 활성화 영역 A(DA) 및 활성화 영역 B(DB)만을 포함하고(SEQ ID NO:23으로 나타냄); AFP IV는 활성화 영역 A(DA)만을 포함하며(SEQ ID NO:24로 나타냄); AFP V는 활성화 영역 B(DB)만을 포함한다(SEQ ID NO:25로 나타냄). AFP 프로모터의 발현 효율 및 특이성을 검출하기 위하여, 이들 5개의 AFP 프로모터 리포터 시스템 플라스미드를 각각 정상 간세포 Chang 및 간암종 세포 HepG2에 일시적으로 트랜스펙션하였다. 도 6의 결과는 5개의 AFP 프로모터가 모두 간암종 세포주에서 고도로 발현되며, 심지어 통상적으로 발현된 CMV 프로모터의 발현 수준을 초과하는 것을 보여준다. 특이성의 분석을 기반으로, AFP II 프로모터를 제외한 다른 4개의 프로모터는 Chang 세포에서 분명하게 누출되지 않으며, AFP II 리포터 유전자는 Chang 세포에서 약간 발현된다. 삽입될 서열의 길이, 및 프로모터의 효율 및 특이성을 고려하여, 발명자들은 후속 실험에서 본 상호 억압 스위치를 조절하기 위하여 AFP III 프로모터를 선택하였다.
TTTAGAAATATGGGGGTAGGGGTGGTGGTGGGGCCTGGATAAAGCTGAGTGGTATGAATGAGTTAGAAATATGGGGGTAGGGGTGGTGGTGGTAATTCTGTTTTCTCCCCATAGGTGAGATAAGCATTGGGTTAAATGTGCTTTCTCTCTCTCCCTCTCCTTTCTTAAGAATTAAGGGACAGACTATGGGCTGGAGGACTTTGAGGATGTCTGTCTCATAACACTTGGGTTGTATCTGTTCTATGGGGCTTGTTTTAAGCTTGGCAACTTGCAACAGGGTTCACTGACTTTCTCCCCAGGCCCAAGGTACTGTCCTCTTTTCATATCTGTTTTGGGGCCTCTGGGGCTTGAATATCTGAGAAAATATAAACATTTCAATAATGTTCTGTGGTGAGATGAGTATGAGAGATGTGTCATTCATTTGTATCAATGAATGAATGAGGACAATTAGTGTATAAATCCTTAGTACAACAATCTGAGGGTAGGGGTGGTACTATTCAATTTCTATTTATAAAGATACTTATTTCTATTTATTTATGCTTGTGACAAATGTTTTGTTCGGGACCACAGGAATCACAAAGATGAGTCTTTGAATTTAAGAAGTTAATGGTCCAGGAATAATTACATAGCTTACAAATGACTATGATATACCATCAAACAAGAGGTTCCATGAGAAAATAATCTGAAAGGTTTAATAAGTTGTCAAAGGTGAGAGGGCTCTTCTCTAGCTAGAGACTAATCAGAAATACATTCAGGGATAATTATTTGAATAGACCTTAAGGGTTGGGTACATTTTGTTCAAGCATTGATGGAGAAGGAGAGTGAATATTTGAAAACATTTCAACTAACCAACCACCCAATCCAACAAACAAAAAATGAAAAGAATCTCAGAAACAGTGAGATAAGAGAAGGAATTTTCTCACAACCCACACGTATAGCTCAACTGCTCTGAAGAAGTATATATCTAATATTTAACACTAACATCATGCTAATAATGATAATAATTACTGTCATTTTTTAATGTCTATAAGTACCAGGCATTTAGAAGATATTATTCCATTTATATATCAAAATAAACTTGAGGGGATAGATCATTTTCATGATATATGAGAAAAATTAAAAATCAGATTGAATTATTTGCCTGTCATACAGCTAATAATTGACCATAAGACAATTAGATTTAAATTAGTTTTGAATCTTTCTAATACCAAAGTTCAGTTTACTGTTCCATGTTGCTTCTGAGTGGCTTCACAGACTTATGAAAAAGTAAACGGAATCAGAATTACATCAATGCAAAAGCATTGCTGTGAACTCTGTACTTAGGACTAAACTTTGAGCAATAACACATATAGATTGAGGATTGTTTGCTGTTAGTATACAAACTCTGGTTCAAAGCTCCTCTTTATTGCTTGTCTTGGAAAATTTGCTGTTCTTCATGGTTTCTCTTTTCACTGCTATCTATTTTTCTCAACCACTCACATGGCTACAATAACTGTCTGCAAGCTTATGATTCCCAAATATCTATCTCTAGCCTCAATCTTGTTCCAGAAGATAAAAAGTAGTATTCAAATGCACATCAACGTCTCCACTTGGAGGGCTTAAAGACGTTTCAACATACAAACCGGGGAGTTTTGCCTGGAATGTTTCCTAAAATGTGTCCTGTAGCACATAGGGTCCTCTTGTTCCTTAAAATCTAATTACTTTTAGCCCAGTGCTCATCCCACCTATGGGGAGATGAGAGTGAAAAGGGAGCCTGATTAATAATTACACTAAGTCAATAGGCATAGAGCCAGGACTGTTTGGGTAAACTGGTCACTTTATCTTAAACTAAATATATCCAAAACTGAACATGTACTTAGTTACTAAGTCTTTGACTTTATCTCATTCATACCACTCAGCTTTATCCAGGCCTCTAGAAGTTTGAGGAGAATATTTGTTATATTTGCAAAATAAAATAAGTTTGCAAGTTTTTTTTTTCTGCCCCAAAGAGCTCTGTGTCCTTGAACATAAAATACAAATAACCGCTATGCTGTTAATTATTGACAAATGTCCCATTTTCAACCTAAGGAAATACCATAAAGTAACAGATATACCAACAAAAGGTTACTAGTTAACAGGCATTGCCTGAAAAGAGTATAAAAGAATTTCAGCATGATTTTCCATATTGTGCTTCCACCACTGCCAATAACAAAATAACTAGCAA(SEQ ID NO:21).
CAGATTGAATTATTTGCCTGTCATACAGCTAATAATTGACCATAAGACAATTAGATTTAAATTAGTTTTGAATCTTTCTAATACCAAAGTTCAGTTTACTGTTCCATGTTGCTTCTGAGTGGCTTCACAGACTTATGAAAAAGTAAACGGAATCAGAATTACATCAATGCAAAAGCATTGCTGTGAACTCTGTACTTAGGACTAAACTTTGAGCAATAACACATATAGATTGAGGATTGTTTGCTGTTAGTATACAAACTCTGGTTCAAAGCTCCTCTTTATTGCTTGTCTTGGAAAATTTGCTGTTCTTCATGGTTTCTCTTTTCACTGCTATCTATTTTTCTCAACCACTCACATGGCTACAATAACTGTCTGCAAGCTTATGATTCCCAAATATCTATCTCTAGCCTCAATCTTGTTCCAGAAGATAAAAAGTAGTATTCAAATGCACATCAACGTCTCCACTTGGAGGGCTTAAAGACGTTTCAACATACAAACCGGGGAGTTTTGCCTGGAATGTTTCCTAAAATGTGTCCTGTAGCACATAGGGTCCTCTTGTTCCTTAAAATCTAATTACTTTTAGCCCAGTGCTCATCCCACCTATGGGGAGATGAGAGTGAAAAGGGAGCCTGATTAATAATTACACTAAGTCAATAGGCATAGAGCCAGGACTGTTTGGGTAAACTGGTCACTTTATCTTAAACTAAATATATCCAAAACTGAACATGTACTTAGTTACTAAGTCTTTGACTTTATCTCATTCATACCACTCAGCTTTATCCAGGCCACTTATTTGACAGTATTATTGCGAAAACTTCCTATCTAGAAGTTTGAGGAGAATATTTGTTATATTTGCAAAATAAAATAAGTTTGCAAGTTTTTTTTTTCTGCCCCAAAGAGCTCTGTGTCCTTGAACATAAAATACAAATAACCGCTATGCTGTTAATTATTGACAAATGTCCCATTTTCAACCTAAGGAAATACCATAAAGTAACAGATATACCAACAAAAGGTTACTAGTTAACAGGCATTGCCTGAAAAGAGTATAAAAGAATTTCAGCATGATTTTCCATATTGTGCTTCCACCACTGCCAATAACAAAATAACTAGCAA(SEQ ID NO:22).
CAGATTGAATTATTTGCCTGTCATACAGCTAATAATTGACCATAAGACAATTAGATTTAAATTAGTTTTGAATCTTTCTAATACCAAAGTTCAGTTTACTGTTCCATGTTGCTTCTGAGTGGCTTCACAGACTTATGAAAAAGTAAACGGAATCAGAATTACATCAATGCAAAAGCATTGCTGTGAACTCTGTACTTAGGACTAAACTTTGAGCAATAACACATATAGATTGAGGATTGTTTGCTGTTAGTATACAAACTCTGGTTCAAAGCTCCTCTTTATTGCTTGTCTTGGAAAATTTGCTGTTCTTCATGGTTTCTCTTTTCACTGCTATCTATTTTTCTCAACCACTCACATGGCTACAAAAGCTTCCTGATTAATAATTACACTAAGTCAATAGGCATAGAGCCAGGACTGTTTGGGTAAACTGGTCACTTTATCTTAAACTAAATATATCCAAAACTGAACATGTACTTAGTTACTAAGTCTTTGACTTTATCTCATTCATACCACTCAGCTTTATCCAGGCCACTTATTTGACAGTATTATTGCGAAAACTTCCTATCTAGAAGTTTGAGGAGAATATTTGTTATATTTGCAAAATAAAATAAGTTTGCAAGTTTTTTTTTTCTGCCCCAAAGAGCTCTGTGTCCTTGAACATAAAATACAAATAACCGCTATGCTGTTAATTATTGACAAATGTCCCATTTTCAACCTAAGGAAATACCATAAAGTAACAGATATACCAACAAAAGGTTACTAGTTAACAGGCATTGCCTGAAAAGAGTATAAAAGAATTTCAGCATGATTTTCCATATTGTGCTTCCACCACTGCCAATAACAAAATAACTAGCAA(SEQ ID NO:23).
CAGATTGAATTATTTGCCTGTCATACAGCTAATAATTGACCATAAGACAATTAGATTTAAATTAGTTTTGAATCTTTCTAATACCAAAGTTCAGTTTACTGTTCCATGTTGCTTCTGAGTGGCTTCACAGACTTATGAAAAAGTAAACGGAATCAGAATTACATCAATGCAAAAGCATTGCTGTGAACTCTGTACTTAGGACTAAACTTTGAGCAATAACACATATAGATTGAGGATTGTTTGCTGTTAGTATACAAACTCTGGTTCAAAGCTCCTCTTTATTGCTTGTCTTGGAAAATTTGCTGTTCTTCATGGTTTCTCTTTTCACTGCTATCTATTTTTCTCAACCACTCACATGGCTACAAAAGCTTTCTAGAAGTTTGAGGAGAATATTTGTTATATTTGCAAAATAAAATAAGTTTGCAAGTTTTTTTTTTCTGCCCCAAAGAGCTCTGTGTCCTTGAACATAAAATACAAATAACCGCTATGCTGTTAATTATTGACAAATGTCCCATTTTCAACCTAAGGAAATACCATAAAGTAACAGATATACCAACAAAAGGTTACTAGTTAACAGGCATTGCCTGAAAAGAGTATAAAAGAATTTCAGCATGATTTTCCATATTGTGCTTCCACCACTGCCAATAACAAAATAACTAGCAA(SEQ ID NO:24).
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2.2 상이한 세포주의 발현 수준을 검출하기 위한 마이크로RNA(miRNA) 형광 플라스미드 리포터 시스템의 구성
최근의 연구는 종양의 형성 및 성장이 마이크로RNA(miRNA)의 발현 수준을 크게 변화시킬 것임을 보여준다. 표 1에 나타낸 것과 같이, 다양한 마이크로RNA는 상이한 암세포에서 고도로 발현한다. 발명자들은 정상 간세포의 고발현을 특성화하기 위하여 마이크로RNA 마커로서 miR199a를 선택하였고, 이에 상응하여 공지된 연구 결과의 분석을 기반으로 간암종 세포의 고발현을 특성화하기 위하여 마이크로RNA 마커로서 miR21 및 miR122를 선택하였다. 먼저, 발명자들은 마이크로RNA 형광 플라스미드 리포터 시스템을 설계 및 구성하였다. 도 7에 나타낸 것과 같이, 마이크로RNA의 표적 서열을 발명자들에 의해 통상적으로 발현된 EYFP의 3' 미번역 영역에 삽입하였고, 이때 다른 통상적으로 발현된 EBFP를 형광 대조군으로 하였다. 여러 상이한 세포주를 각각 EYFP 및 EBFP 형광 플라스미드로 트랜스펙션하여 마이크로RNA 표적 서열의 발현을 검출하였다. 실험 결과를 도 8에 도시하며, miR199a가 간암종 세포주에 비교하여 정상 간세포에서 고도로 발현된 한편, miR21이 간암종 세포주에서 유의하게 증가된 발현 수준을 나타냄으로써, miR199a 및 miR21이 정상 세포로부터 간암종 세포를 구별하기 위해 발명자들에 의해 설계된 상호 억압 스위치의 효과적인 마커로서 사용될 수 있음을 나타낸다.
2.3 상호 억압 스위치는 마이크로RNA 입력 신호에 효과적으로 반응할 수 있고 상이한 세포주에서 안정적으로 기능할 수 있다
암용해성 아데노바이러스의 제한된 포장 능력(8 Kbp 외래 유전자만이 최대한으로 포장될 수 있음)으로 인해, 발명자들은 이 실시예에서 가능한 많은 짧고 효과적인 억제 요소를 선택하였다. 발명자들은 이 실시예에서 LacI 및 tetR-KRAB를 선택하였다. 도 9에 나타낸 것과 같이, 발명자들은 EYFP 유전자가 tetR-KRAB 쪽에서 공동 발현되는지의 여부에 따라 2개의 로직 회로, 즉 EYFP를 발현하지 않는 스위치 I(SI), 및 EYFP를 발현하는 스위치 II(SII)를 구성하였다. 2개의 스위치를 HEK293 세포에 개별적으로 일시적으로 트랜스펙션하였고 각각을 shRNA-FF4 및 shRNA-FF5로 각각 동시트랜스펙션하였다. 도 10에 나타낸 것과 같이, 본 2개의 스위치는 둘 다 상이한 입력 신호 하에서 효율적으로 반전될 수 있다. SI은 LacI 쪽에서 보다 높은 수준으로 발현하지만, tetR-KRAB 쪽에서 SII보다 더 높은 누출 수준을 나타낸다. 발명자들은 포괄적인 고려 후에, SI 스위치 시스템이 상이한 입력 신호에 반응할 수 있고 관심 있는 세포에서 E1 유전자를 효율적으로 발현할 수 있기 때문에, SI 시스템을 후속 실험에서 상이한 이펙터를 운반하는 본 암용해성 아데노바이러스를 구성하기 위한 골격으로서 선택하였다. 실험실에서의 이전 결과를 기반으로, 발명자들은 상호 억압 스위치 SI에 미치는 상이한 활성화제의 조절 효과를 테스트하였다. 도 11에서 나타낸 것과 같이, 발명자들은 활성화제 Gal4VP16, Gal4esn, dCas9-VP64 및 rtTA의 조절 효율을 테스트하였다. 실험 결과는 유전자 회로가 그런 상이한 활성화제에 효과적으로 반응할 수 있어서, 이러한 유전자 회로의 안정성을 증명하는 것을 보여준다.
2.4 CGGA 방법을 사용함에 의한 암용해성 아데노바이러스의 구성
대량의 임상 정보는 종양 마커의 발현이 개체별로 크게 다른 것을 나타낸다. 그러므로, 상이한 마커를 상이한 개체에 대해 발명자들에 의해 선택할 수 있다. 개별 환자에 대한 정확한 치료를 달성하기 위하여, 발명자들은 상이한 생체마커를 운반하는 다양한 암용해성 아데노바이러스를 제조할 필요가 있다. 그러나, 이들 암용해성 아데노바이러스를 전통적인 효소 소화 및 결찰 방법을 통해 신속하게 구성하는 것은 매우 어렵다. 본 실시예에서, 발명자들은 3-단계 라이브러리를 설계 및 구성하였고, CGGA 방법(캐스케이드 골든-게이트 게이트웨이/깁슨 조립 방법)에 의해 암용해성 아데노바이러스를 신속하게 변형시켰다. 먼저, 정상 세포로부터 암세포의 구별과 관련된 마커 요소(예컨대 종양-특이적 프로모터, 로직 회로-관련 억압 요소, 및 암세포-구별 miRNA 인식 서열)를 일차 플라스미드 상에서 구성함으로써, 도 12에 나타낸 것과 같이, 일차 요소 라이브러리를 형성하였다. 골든 게이트 방법에 의하여 다중 일차 요소를 하나의 이차 발현 시스템으로 구성하기 위하여, 일차 요소의 두 단부에 각각 EI(인식 부위 및 절단 부위가 상이한 제한 효소, 예컨대 Esp3I 및 BsaI)의 인식 부위를 삽입하였다. 발현 시스템은 다음과 같이 구성한다. 구체적으로, 다중 일차 요소를 일차 요소 라이브러리로부터 선택하고 골든 게이트 방법에 의하여 3개의 발현 시스템으로 조립하는데, 여기서 3개의 발현 시스템은 종양-특이적 프로모터 시스템, 제1 조절 요소-매개된 억압 시스템 및 제2 조절 요소-매개된 억압 시스템을 포함한다. 그런 후, 완전한 로직 회로를, 도 13에 나타낸 것과 같이, 골든 게이트 방법에 의하여 3개의 발현 시스템을 무작위로 조립함으로써 형성한다. 로직 회로의 두 단부에 추가 실험을 위해 각각 깁슨 상동 서열 또는 게이트웨이 인식 부위(표적 서열)를 삽입한다. 마지막으로, 로직 회로를, 도 14에 나타낸 것과 같이, 깁슨 또는 게이트웨이 방법에 의해 (E1 및 E3의 일부가 제거된) 아데노바이러스 벡터로 구성한다. 조작된 아데노바이러스 벡터를 PacI 소화에 의해 선형화한 후, 아데노바이러스 입자를 포장하기 위하여 특이적 세포주로 트랜스펙션한다. 그러므로, 하나 이상의 종양 생체마커를 발명자들에 의해 교체할 수 있다.
2.5 세포 수준에서 간암종 세포의 효과적 사멸에 대한 암용해성 아데노바이러스의 검출
발명자들에 의해 구성한 암용해성 아데노바이러스의 상호 억압 스위치가 간암종 세포를 효과적으로 구별하고 사멸시킬 수 있는지의 여부를 검출하기 위하여, 발명자들은 암용해성 아데노바이러스에 대한 시험관내 세포 사멸 검정을 설계하였다. 상이한 세포주를 상이한 감염 다중도의 암용해성 아데노바이러스로 감염시켰고, 이때 Chang 세포는 정상 간 세포이며, Huh7 및 HepG2 세포는 인간 간암종 세포주이다. 세포의 생존성을 인큐베이션 6일 후에 MTS 방법에 의하여 측정하였다. 도 15에 나타낸 것과 같이, 간암종 세포는 감염 다중도가 각각 100, 10 및 1일 때, 및 간암종 세포가 0.1의 감염 다중도에서 약간의 세포 사멸을 나타낼 때 유의한 세포독성으로 인해 중증의 사멸을 보이는 것으로 나타난다. 상대적으로, Chang 세포는 감염 다중도가 10 이하일 때 세포 사멸 없이 정상 성장 상태에 있고; 한편 이것들은 100의 감염 다중도에서 약간의 세포독성 반응을 나타내며, 세포 부피가 확대되고 세포 성장이 둔화되었다. 이 데이터는 감염 다중도의 특정 범위 내에서 포장된 아데노바이러스가 정상 간세포의 성장 및 증식의 간섭 없이, 간암종 세포를 효과적으로 구별하고 사멸시킬 수 있음을 나타낸다.
2.6 암용해성 아데노바이러스에 의해 운반된 이펙터의 발현 수준의 시험관내 검출
현재 임상 실제에서 사용된 아데노바이러스 벡터는 자연계에 광범위하게 존재하는 인간 Ad2 또는 Ad5형 아데노바이러스이다. 추가로, 이들 아데노바이러스를 길항하는 중화 항체는 인체에 존재하는 것으로 알려져 있다. 그러므로, 임상 데이터는 아데노바이러스 단독의 항암 효과에 의존하는 종양 치료에 대해 빈약한 치료 효과를 나타냈다. 그러므로, 실시예에서 발명자들은 전신성 면역 반응을 유발하기 위하여 종양 부위로 이펙터 유전자를 운반하기 위한 전달 시스템으로서 암용해성 아데노바이러스를 사용하였다. 도 16에서 나타낸 것과 같이, 발명자들은 먼저, 이들 이펙터 유전자를 자주 발현된 플라스미드 벡터로 구성하였고, 일시적인 트랜스펙션에 의하여 이들 이펙터의 활성을 검출하였다. 결과는 발명자들에 의해 구성된 이펙터 유전자가 생물학적 기능을 가지는 면역 인자, 및 면역학적 체크포인트 유전자의 리프레서를 효율적으로 발현할 수 있음을 증명한다. 발명자들은 추가로 이들 이펙터 유전자를 암용해성 아데노바이러스 벡터 상에 구성함으로써, 포장 및 정제 후에 이들 이펙터를 발현할 수 있는 암용해성 아데노바이러스를 얻었다. 간암종 세포 HepG2의 감염 후, 발명자들은 상층액을 추출하여 상층액 중의 면역 인자의 활성을 검출하였다.
한편, 아데노바이러스 벡터에서 이펙터 유전자에 의해 발현된 이펙터의 활성을 또한 발명자들에 의해 검출하였다. 도 17에 나타낸 것과 같이, 아데노바이러스에 의해 발현된 이펙터는 시간이 지남에 따라 효과적으로 증강된다. 3개의 사이토카인을 다음과 같은 방법에 의해 검출한다. 도 17(a)에서, 3 x 106 HepG2 세포를 12-웰 플레이트에 시딩하고, 각각 10의 감염 다중도에서 synOV-EBFP 및 synOV-mGM-SCF로 감염시키고, 감염 후 1, 2, 3, 및 4일째에 상층액을 수집하였다. 상층액의 마우스 GM-CSF 함량을 ELISA 키트에 의해 검출하였다. 도 17(b)에서, 3 x 106 HepG2 세포를 12-웰 플레이트에 시딩하고, 각각 10의 감염 다중도에서 synOV-EBFP 및 synOV-hIL-2로 감염시키고, 감염 후 1, 2, 3, 및 4일째에 상층액을 수집하였다. 상층액을 IL-2 의존성 세포를 함유한 배지에 첨가하고, 상층액 중의 IL-2 함량을 MTS 방법에 의해 검출하였다. 도 17(c)에서, 3 x 106 HepG2 세포를 12-웰 플레이트에 시딩하고, 각각 10의 감염 다중도에서 synOV-EBFP, synOV-항-PD-1 scFv 및 synOV-항-PD-L1 scFv로 감염시키고, 감염 후 1, 2, 3, 및 4일째에 상층액을 수집하였다. 얻어진 상층액을비장 세포 시스템(T 세포 활성화를 위해 분리된 비장 세포에 2 μg/mL의 항-마우스 CD3-항체를 첨가함으로써 형성됨)에 1:10의 희석 비율에서 첨가하였고, 비장 세포 시스템에서 IFN-γ 생성을 인큐베이션 48시간 후에 ELISA 방법에 의해 검출하였다.
2.7 동물 연구에 의한 암용해성 아데노바이러스의 치료 효과의 검출
도 18에 나타낸 것과 같이, 1 x 107 HepG2, Huh7 및 Hepa1-6 간암종 세포를 누드 마우스의 우측 옆구리에 피하 이식하고, 피하 종양 부피를 3일마다 측정하였다. HepG2 및 Huh7 세포는 인간 간암종 세포이고, Hepa1-6 세포는 마우스 간암종 세포이다. 종양 부피가 100 mm3를 초과한 후에, 마우스를 무작위로 2그룹으로 나누었고, 치료 그룹에는 1 x 109 암용해성 아데노바이러스를 종양내로 주사하였으며 대조군 그룹은 PBS로 주사하였다. 치료 후 종양 부피의 변화를 계속해서 관찰하였다. PBS를 주사한 대조군 그룹에서 종양은 계속해서 성장하였고, 종양 부피가 점점 더 증가한 한편, 치료 그룹의 종양은 암용해성 아데노바이러스의 주사 후 유의하게 억제된 것을 알 수 있고, 이것은 암용해성 아데노바이러스가 종양 세포의 용해를 통해 생체내에서 종양 성장을 억제할 수 있고, 그로써 형성된 종양에 대해 유의한 치료 효과를 나타낸 것을 가리킨다. 마우스 간암의 치료에서, 발명자들은 또 다른 바이러스 대조군으로서 비-항암 바이러스(제2 세대 아데노바이러스 벡터, GFP 유전자-포함 바이러스, Ad-GFP)를 사용하였다. 실험 결과로부터 PBS 및 Ad-GFP 치료 그룹의 종양은 계속해서 성장하는 한편, 항암 바이러스 치료 그룹은 종양 HepG2 및 Huh7의 성장을 어느 정도 억제할 수 있으며 종양 Hepa1-6의 성장을 약간 억제한 것을 알 수 있다. 그것은 HepG2 및 Huh7 세포보다 Hepa1-6 세포의 빠른 성장 속도뿐만 아니라 Hepa1-6 세포에서 AFP의 상대적으로 낮은 발현 수준으로부터 초래되었을 가능성이 있다. 그러므로, 발명자들은 후속 실험에서 Hepa1-6 종양 모델을 치료하기 위하여 면역 이펙터-운반 암용해성 아데노바이러스를 사용하였고, 그것은 크게 효과적인 결과를 달성하였다.
종양-포함 마우스를 암용해성 아데노바이러스로 치료한 2주 또는 1개월 후에, 마우스의 다양한 기관의 조직 샘플을 취하였고, 바이러스 DNA를 균등화 후에 추출하였다. 바이러스 역가를 qPCR 방법에 의해 검출하였다. 바이러스는 바이러스 감염 후에 종양 세포에서만 복제하였고 다른 조직으로 확산되지 않은 것으로 나타난다. 결과는 암용해성 아데노바이러스가 생체내에서 강력한 특이성을 가지며 정상 조직 세포에 대해 안전한 것을 증명한다.
본 암용해성 아데노바이러스가 면역 체계를 가진 C57 마우스 모델에 미치는 치료 효과를 추가로 증명한다. 도 19에서 나타낸 것과 같이, 1 x 106 마우스 간암종 세포 Hepa1-6를 야생형 C57BL/6J 마우스의 우측 옆구리에 피하 주사하였다. 종양 부피가 100 mm3에 도달한 후에, 상이한 사이토카인을 발현하는 1 x 109 암용해성 아데노바이러스를 각 그룹에 종양내로 주사하였고, PBS 주사를 음성 대조군으로서 사용하였다. 치료 후 종양 부피를 관찰하였고, 종양-포함 마우스의 생존 시간을 카플란-마이어 방법에 의해 분석하였다. 실험 결과는 암용해성 아데노바이러스가 종양 성장을 억제할 수 있고 온전한 면역 체계를 가진 종양-포함 마우스의 생존 시간을 유의하게 연장시킬 수 있음을 증명한다. 일부 종양-포함 마우스는 치료 후에 치유되었는데, 종양이 완전히 소멸되었다. 암용해성 아데노바이러스로의 초기 치료 후 1개월 후, 생존한 마우스를 1 x 106 마우스 간암종 세포 Hepa1-6으로 재도전시켰다. 한마리의 동일한 마우스에 제1 이식 부위로부터 떨어진 부위에서 먼저 주사된 것과 동일한 종양 세포를 이식하였을 때 종양 덩어리는 형성되지 않은 것으로 나타난다. 이들 결과는 항암 바이러스로 치료된 마우스가 신체에서 종양 세포에 대한 특이적 면역력을 생성시켰고, 신체에서 동일한 종양 세포가 다시 성장하는 것에 저항할 수 있음을 증명한다.
종양-포함 마우스의 종양을 종양 조직에서 림프구 침윤의 검출을 위해 취하고, 고정시키고, 섹션화하고 HE 염색하였다. 암용해성 아데노바이러스로 치료된 마우스의 종양 조직에서 림프구 침윤은 PBS 대조군 그룹과 비교하여 유의하게 증가한 것을 알 수 있고, 이것은 암용해성 아데노바이러스의 치료가 종양 조직에서 더 많은 림프구를 보충할 수 있음을 증명한다. 이들 결과는 면역 자극제의 발현이 항암 바이러스 요법 중에 세포독성 T 세포 반응을 촉진할 수 있음을 나타냈다. 종양에서 침윤하는 림프구를 분리 및 정제하였고, 마우스 종양에서 침윤하는 T 세포의 표현형을 유동 세포분석에 의하여 검출하였다. 항암 바이러스로 치료된 마우스의 종양에서 침윤하는 T 세포 중에 Ki-67+ 세포의 더 큰 비율이 있는 것으로 나타나고, 그것은 암용해성 아데노바이러스로의 치료가 종양 내부에서 T 세포의 증식을 촉진하고 더 강력한 면역 반응을 촉발하는 것을 나타낸다. 종양-침윤 림프구를 PMA(20 ng/mL) 및 이오노마이신(1 μg/ml L)을 함유한 RPMI 1640 배지에 첨가하고, 37℃에서 4시간 동안 브레베들린 A(Brevedlin A)의 존재 하에 배양한 후, 고정하고 세포를 염색하고, 유동 세포분석에 의해 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 γ-인터페론의 발현을 검출하였다. 본 발명자들은 암용해성 아데노바이러스 치료 그룹의 종양에서 T 세포에서의 γ-인터페론의 더 높은 발현과, 그것이 도 20(a) 및 도 20(b)에서 나타낸 것과 같이, 종양의 면역 미세환경을 변화시켰고 종양 세포의 사멸을 촉진하였음을 발견하였다.
암용해성 아데노바이러스의 치료에 의한 전신성 항-종양 면역 반응
C57BL/6 마우스에 마우스 간암종 세포 Hepa1-6을 좌측 및 우측 옆구리에 모두 피하 주사하였다. 종양 덩어리가 형성된 후, 각각 사이토카인 hIL-2, mGM-CSF 및 항-PD-1 scFv를 발현하는 암용해성 아데노바이러스를 우측 옆구리 상의 종양에 주사하였고, PBS 및 AdGFP를 대조군으로서 주사하였다. 종양 성장을 계속해서 측정하였다. 치료 후 14일 후 종양-포함 마우스의 좌측 및 우측 옆구리에서 종양의 침윤하는 림프구를 분리 및 정제하였고, 종양의 침윤하는 T 세포의 표현형을 유동 세포분석법에 의해 검출하였다. 본 발명자들은 대조군 그룹과 비교하여, Ki-67+ T 세포 또는 인터페론-γ를 발현하는 고비율의 T 세포가 우측 옆구리에서 암용해성 아데노바이러스로 주사된 종양에서뿐만 아니라 암용해성 아데노바이러스가 주사되지 않은 좌측 옆구리에서의 종양에도 존재하는 것을 발견하였다. 암용해성 아데노바이러스의 치료에 의해 유발된 면역 반응은 주사 부위에서의 종양에 대해서뿐만 아니라 먼 쪽의 종양에 대해서도 기능할 수 있는 것이 증명된다. 이것은 암용해성 아데노바이러스가 주사 부위에서의 종양에 대해 치료 효과를 가질뿐만 아니라, 원위 전이의 종양에 대해서도 치료 효과를 나타내는 것을 시사한다.
동시에, 암용해성 아데노바이러스의 치료가 생존한 마우스에어 효과적인 전신성 면역 반응을 생성하였는지의 여부를 검출하기 위하여, Hepa1-6을 다시 발명자들에 의한 치료 후에 마우스에 피하 주사하였다. 도 21에 나타낸 것과 같이, 모든 마우스의 거부율은 100%인 것으로 나타난다.
2.8 암용해성 아데노바이러스의 치료 과정의 모델화
암용해성 아데노바이러스의 치료 과정을 미감염 종양 세포, 감염된 종양 세포, 유리 바이러스, 암용해성 아데노바이러스 항원 활성화된 면역 세포 및 종양 항원 활성화된 면역 세포를 포함하는, 종양-바이러스-면역 체계로 요약하며, 이러한 5개의 구성요소는 각각, 도 22에 나타낸 것과 같이, S, I, V, ZV 및 ZT로 표시한다. 모델은 미감염 종양 세포의 성장은 일반화된 논리적 성장 모델을 따르는 것으로 가정하며, 여기서 γ는 성장 속도를 나타내고, K는 운반 용량을 나타내며 ε은 비-선형성을 나타낸다. 미감염 종양 세포는 유리 바이러스로 감염되고 감염된 종양 세포로 κ의 속도로 형질전환될 수 있다. 감염된 종양 세포는 δ의 속도로 용해될 것이고, 대량의 유리 바이러스를 α의 속도로 방출할 것이다. 유리 바이러스는 자연적으로 ω의 속도로 환경에서 붕괴된다. ZV는 암용해성 아데노바이러스 또는 바이러스로 감염된 종양 세포의 표면 항원의 활성화에 의해 각각 cV1 및 cV2의 속도로 증가될 것인 한편, 감염된 종양 세포의 생성을 pV의 속도로 억제할 것이다. ZT는 용해된 종양 세포에 의해 방출된 항원의 활성화에 의해 cT의 속도로 증가될 것이고, 이것은 감염된 및 미감염 종양 세포의 생성을 pT의 속도로 억제할 것이다. ZV 및 ZT는 β의 속도로 환경에서 자연적으로 붕괴될 것이다.
면역 체계를 고려하지 않으면, 종양-바이러스 시스템의 최종 상태는 바이러스 복제 속도가 증가함에 따라 수렴 상태로부터 진동 상태로 전환될 것이다. 시뮬레이션은 종양-바이러스 시스템에서 최소 종양 부피가 상이한 초기 바이러스 역가, 초기 종양 크기 및 바이러스 복제 속도 하에서 시간의 경과에 따라 초기 상태로부터 최종 상태로 변화하는 것을 보여준다. 시뮬레이션 결과로부터 초기 바이러스 역가의 증가는 종양 크기의 제어에 기여하는 것을 알 수 있다. 실제 적용에서, 적절한 초기 투여 용량은, 도 23에 나타낸 것과 같이, 예측된 시점에서 종양을 제거하거나 다른 보조 요법을 제공하기 위하여 초기 종양 크기와 투여 용량 한계를 조합하여 선택될 수 있다.
종양 및 바이러스에 대한 면역 세포의 상이한 억제 효과 하에서 시뮬레이션 기간 중에 최종 상태에서 종양-바이러스-면역 체계에서의 종양 크기
시뮬레이션 결과로부터 시스템이 종양 제거를 완료하는 경향, 포화상태를 향한 종양 성장, 안정적인 종양 부피, 및 불안정한 종양 부피를 포함한 여러 동적인 거동을 나타내는 것을 알 수 있다. 일반적으로, 종양에 대한 면역 세포의 억제 효과가 더 강력할수록, 더 많은 종양이 시스템에 의해 제거되는 한편, 바이러스에 대한 면역 세포의 억제 효과가 더 강력할수록, 시스템의 더 많은 종양이 제어되지 않는다. 그러나, 시스템은 도 24에 나타낸ㄴ 것과 같이, 종양의 안정성 및 불안정성의 경향에 대해 단조롭지 않은 변화를 나타낸다.
본 개시의 명세서에서, 용어 "한 구현예", "일부 구현예", "특정 구현예", "실례", "특정 실례", "일부 실례" 등은 실례 또는 구현예에 의하여 기술된 특정 특징, 구조, 물질 또는 특성이 개시의 적어도 한 구현예 또는 실례에 함유되는 것을 나타내기 위해 의도된다. 본 명세서에서, 상기 용어의 개략적인 표현은 반드시 동일한 구현예 또는 실례를 언급하는 것은 아니다. 더욱이, 기술된 특정 특징, 구조, 물질 또는 특성은 하나 이상의 구현예 또는 실례에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다. 또한, 명세서에서 기술된 다양한 구현예 또는 실례 및 다양한 구현예 또는 실례의 특징은 모순 없이 당업자에 의해 조합될 수 있다.
비록 본 개시의 구현예들이 상세하게 기술되었지만, 구현예는 예시적이고 개시의 범주를 제한하는 것으로서 해석되지 않는 것이 인지될 것이다. 변화, 변형, 치환 및 변이는 이들 구현예에서 당업자들에 의해 본 개시의 범주 내에서 만들어질 수 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> Tsinghua University
Beijing Syngentech Co., LTD.
<120> Programmable Oncolytic Virus Vaccine System and Application Thereof
<130> PIDC1168718P
<160> 25
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2126
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> A nucleotide sequence of a nucleic acid carried by the first expression vector
<400> 1
ggtctctgct ccagattgaa ttatttgcct gtcatacagc taataattga ccataagaca 60
attagattta aattagtttt gaatctttct aataccaaag ttcagtttac tgttccatgt 120
tgcttctgag tggcttcaca gacttatgaa aaagtaaacg gaatcagaat tacatcaatg 180
caaaagcatt gctgtgaact ctgtacttag gactaaactt tgagcaataa cacatataga 240
ttgaggattg tttgctgtta gtatacaaac tctggttcaa agctcctctt tattgcttgt 300
cttggaaaat ttgctgttct tcatggtttc tcttttcact gctatctatt tttctcaacc 360
actcacatgg ctacaaaagc ttcctgatta ataattacac taagtcaata ggcatagagc 420
caggactgtt tgggtaaact ggtcacttta tcttaaacta aatatatcca aaactgaaca 480
tgtacttagt tactaagtct ttgactttat ctcattcata ccactcagct ttatccaggc 540
cacttatttg acagtattat tgcgaaaact tcctatctag aagtttgagg agaatatttg 600
ttatatttgc aaaataaaat aagtttgcaa gttttttttt tctgccccaa agagctctgt 660
gtccttgaac ataaaataca aataaccgct atgctgttaa ttattgacaa atgtcccatt 720
ttcaacctaa ggaaatacca taaagtaaca gatataccaa caaaaggtta ctagttaaca 780
ggcattgcct gaaaagagta taaaagaatt tcagcatgat tttccatatt gtgcttccac 840
cactgccaat aacaaaataa ctagcaagga tccggccacc atggcccccc cgaccgatgt 900
cagcctgggg gacgagctcc acttagacgg cgaggacgtg gcgatggcgc atgccgacgc 960
gctagacgat ttcgatctgg acatgttggg ggacggggat tccccgggtc cgggatttac 1020
cccccacgac tccgccccct acggcgctct ggatatggcc gacttcgagt ttgagcagat 1080
gtttaccgat gcccttggaa ttgacgagta cggtgggacg cgtatgaagc tactgtcttc 1140
tatcgaacaa gcatgcgata tttgccgact taaaaagctc aagtgctcca aagaaaaacc 1200
gaagtgcgcc aagtgtctga agaacaactg ggagtgtcgc tactctccca aaaccaaaag 1260
gtctccgctg actagggcac atctgacaga agtggaatca aggctagaaa gactggaaca 1320
gctatttcta ctgatttttc ctcgagaaga ccttgacatg attttgaaaa tggattcttt 1380
acaggatata aaagcattgt taacaggatt atttgtacaa gataatgtga ataaagatgc 1440
cgtcacagat agattggctt cagtggagac tgatatgcct ctaacattga gacagcatag 1500
aataagtgcg acatcatcat cggaagagag tagtaacaaa ggtcaaagac agttgactgt 1560
ataattcact cctcaggtgc aggctgccta tcagaaggtg gtggctggtg tggccaatgc 1620
cctggctcac aaataccact gagatctttt tccctctgcc aaaaattatg gggacatcat 1680
gaagcccctt gagcatctga cttctggcta ataaaggaaa tttattttca ttgcaatagt 1740
gtgttggaat tttttgtgtc tctcactcgg aaggacatat gggagggcaa atcatttaaa 1800
acatcagaat gagtatttgg tttagagttt ggcaacatat gcccatatgc tggctgccat 1860
gaacaaaggt tggctataaa gaggtcatca gtatatgaaa cagccccctg ctgtccattc 1920
cttattccat agaaaagcct tgacttgagg ttagattttt tttatatttt gttttgtgtt 1980
atttttttct ttaacatccc taaaattttc cttacatgtt ttactagcca gatttttcct 2040
cctctcctga ctactcccag tcatagctgt ccctcttctc ttatggagat cggagaaaga 2100
ggtaatttaa ttaagtcgat gagacc 2126
<210> 2
<211> 3510
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> BsaI-5≠UAS-tetO-miniCMV-tetO-E1A-2A-EBFP-2A-LacI-miR199a target
site-BsaI sequence
<400> 2
ggtctctcta tttaattaag taactataac ggtcgctccg aatttctcga gttaattaag 60
attacgccaa gctacgggcg gagtactgtc ctccgagcgg agtactgtcc tccgagcgga 120
gtactgtcct ccgagcggag tactgtcctc cgagcggagt tctgtcctcc gagcggagac 180
tctagactcc ctatcagtga tagagatagg cgtgtacggt gggaggccta tataagcaga 240
gctcgtttag tgaaccgtca gatcgctccc tatcagtgat agagagaatt cgaccgccac 300
catgtcggaa ttcatgagac atattatctg ccacggaggt gttattaccg aagaaatggc 360
cgccagtctt ttggaccagc tgatcgaaga ggtactggct gataatcttc cacctcctag 420
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agatctgagg gccgcggcag cctgctgacc tgcggcgacg tggaggaaaa ccccggcccc 2160
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atgtccggtt ttcaacaaac catgcaaatg ctgaatgagg gcatcgttcc cactgcgatg 2940
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<213> Artificial
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<223> BsaI-5≠UAS-tetO-miniCMV-tetO-E1A-2A- anti-PD-L1scFv
-2A-LacI-miR199a target site-BsaI sequence
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<223> A nucleotide sequence of an anti-PD-1scFv-bearing nucleic acid carried by an adenoviral vector
<400> 13
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tttccgccgg cgcccggttc tccggagccg cctcaccttt cccggcagcc cgagcagccg 600
gagcagagag ccttgggtcc ggtttctatg ccaaaccttg taccggaggt gatcgatctt 660
acctgccacg aggctggctt tccacccagt gacgacgagg atgaagaggg tgaggagttt 720
gtgttagatt atgtggagca ccccgggcac ggttgcaggt cttgtcatta tcaccggagg 780
aatacggggg acccagatat tatgtgttcg ctttgctata tgaggacctg tggcatgttt 840
gtctacagta agtgaaaatt atgggcagtg ggtgatagag tggtgggttt ggtgtggtaa 900
tttttttttt aatttttaca gttttgtggt ttaaagaatt ttgtattgtg atttttttaa 960
aaggtcctgt gtctgaacct gagcctgagc ccgagccaga accggagcct gcaagaccta 1020
cccgccgtcc taaaatggcg cctgctatcc tgagacgccc gacatcacct gtgtctagag 1080
aatgcaatag tagtacggat agctgtgact ccggtccttc taacacacct cctgagatac 1140
acccggtggt cccgctgtgc cccattaaac cagttgccgt gagagttggt gggcgtcgcc 1200
aggctgtgga atgtatcgag gacttgctta acgagcctgg gcaacctttg gacttgagct 1260
gtaaacgccc caggccactc gagggtaccg ggtccggagc tacaaatttt tccctcctca 1320
aacaggctgg agatgtcgaa gaaaatcctg ggcctaccgg tcccatgagt gtgcccactc 1380
aggtcctggg gttgctgctg ctgtggctta cagacgctcg ctgcgaggtg cagctggtgg 1440
agagcggcgg cggcctggtg cagcccggcg gcagcctgag gctgagctgc gccgccagcg 1500
gcttcacctt cagcgacagc tggatccact gggtgaggca ggcccccggc aagggcctgg 1560
agtgggtggc ctggatcagc ccctacggcg gcagcaccta ctacgccgac agcgtgaagg 1620
gcaggttcac catcagcgcc gacaccagca agaacaccgc ctacctgcag atgaacagcc 1680
tgagggccga ggacaccgcc gtgtactact gcgccaggag gcactggccc ggcggcttcg 1740
actactgggg ccagggcacc ctggtgaccg tgagcagcgg tggaggcggt tcaggcggag 1800
gtggctctgg cggtggcgga tcggacatcc agatgaccca gagccccagc agcctgagcg 1860
ccagcgtggg cgacagggtg accatcacct gcagggccag ccaggacgtg agcaccgccg 1920
tggcctggta ccagcagaag cccggcaagg cccccaagct gctgatctac agcgccagct 1980
tcctgtacag cggcgtgccc agcaggttca gcggcagcgg cagcggcacc gacttcaccc 2040
tgaccatcag cagcctgcag cccgaggact tcgccaccta ctactgccag cagtacctgt 2100
accaccccgc caccttcggc cagggcacca aggtggagat caagagatct gagggccgcg 2160
gcagcctgct gacctgcggc gacgtggagg aaaaccccgg ccccggatcc atgaaaccag 2220
taacgttata cgatgtcgca gagtatgccg gtgtctctta tcagaccgtt tcccgcgtgg 2280
tgaaccaggc cagccacgtt tctgcgaaaa cgcgggaaaa agtggaagcg gcgatggcgg 2340
agctgaatta cattcccaac cgcgtggcac aacaactggc gggcaaacag tcgttgctga 2400
ttggcgttgc cacctccagt ctggccctgc acgcgccgtc gcaaattgtc gcggcgatta 2460
aatctcgcgc cgatcaactg ggtgccagcg tggtggtgtc gatggtagaa cgaagcggcg 2520
tcgaagcctg taaagcggcg gtgcacaatc ttctcgcgca acgcgtcagt gggctgatca 2580
ttaactatcc gctggatgac caggatgcca ttgctgtgga agctgcctgc actaatgttc 2640
cggcgttatt tcttgatgtc tctgaccaga cacccatcaa cagtattatt ttctcccatg 2700
aagacggtac gcgactgggc gtggagcatc tggtcgcatt gggtcaccag caaatcgcgc 2760
tgttagcggg cccattaagt tctgtctcgg cgcgtctgcg tctggctggc tggcataaat 2820
atctcactcg caatcaaatt cagccgatag cggaacggga aggcgactgg agtgccatgt 2880
ccggttttca acaaaccatg caaatgctga atgagggcat cgttcccact gcgatgctgg 2940
ttgccaacga tcagatggcg ctgggcgcaa tgcgcgccat taccgagtcc gggctgcgcg 3000
ttggtgcgga tatctcggta gtgggatacg acgataccga agacagctca tgttatatcc 3060
cgccgttaac caccatcaaa caggattttc gcctgctggg gcaaaccagc gtggaccgct 3120
tgctgcaact ctctcagggc caggcggtga agggcaatca gctgttgccc gtctcactgg 3180
tgaaaagaaa aaccaccctg gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg 3240
attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag agcagcctga 3300
ggcctcctaa gaagaagagg aaggttgcgg ccgctaacca atgtgcagac tactgttaac 3360
caatgtgcag actactgtga attctaacca atgtgcagac tactgttaac caatgtgcag 3420
actactgtaa gcttcgaatt gagtagtgct ttctacttta tgagtagtgc tttctacttt 3480
atgagtagtg ctttctactt tatgagtagt gctttctact ttatggtcga caatactagt 3540
taagaaatcg ccaagctacg ggcggagtac tgtcctccga gcggagtact gtcctccgag 3600
cggagtactg tcctccgagc ggagtactgt cctccgagcg gagtactgtc ctccgagcgg 3660
agactctaga aattgtgagc ggataacaat ttaggcgtgt acggtgggag gcctatataa 3720
gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatcg ccagctgaca aaattgtgag cgctcacaat 3780
tactagaaga tcttgaattc gccaccatgg ctagattaga taaaagtaaa gtgattaaca 3840
gcgcattaga gctgcttaat gaggtcggaa tcgaaggttt aacaacccgt aaactcgccc 3900
agaagctagg tgtagagcag cctacattgt attggcatgt aaaaaataag cgggctttgc 3960
tcgacgcctt agccattgag atgttagata ggcaccatac tcacttttgc cctttagaag 4020
gggaaagctg gcaagatttt ttacgtaata acgctaaaag ttttagatgt gctttactaa 4080
gtcatcgcga tggagcaaaa gtacatttag gtacacggcc tacagaaaaa cagtatgaaa 4140
ctctcgaaaa tcaattagcc tttttatgcc aacaaggttt ttcactagag aatgcattat 4200
atgcactcag cgctgtgggg cattttactt taggttgcgt attggaagat caagagcatc 4260
aagtcgctaa agaagaaagg gaaacaccta ctactgatag tatgccgcca ttattacgac 4320
aagctatcga attatttgat caccaaggtg cagagccagc cttcttattc ggccttgaat 4380
tgatcatatg cggattagaa aaacaactta aatgtgaaag tgggtcgcca aaaaagaaga 4440
gaaaggtcga cggcggtggt gctttgtctc ctcagcactc tgctgtcact caaggaagta 4500
tcatcaagaa caaggagggc atggatgcta agtcactaac tgcctggtcc cggacactgg 4560
tgaccttcaa ggatgtattt gtggacttca ccagggagga gtggaagctg ctggacactg 4620
ctcagcagat cgtgtacaga aatgtgatgc tggagaacta taagaacctg gtttccttgg 4680
gttatcagct tactaagcca gatgtgatcc tccggttgga gaagggagaa gagccctggc 4740
tggtggagag agaaattcac caagagaccc atcctgattc agagactgca tttgaaatca 4800
aatcatcagt ttaatacaag gcggccgcaa atcaacatca gtctgataag ctatcaacat 4860
cagtctgata agctatcaac atcagtctga taagctatca acatcagtct gataagctaa 4920
agcttcgaat tctgataatc agccatacca catttgtaga ggttttactt gctttaaaaa 4980
acctcccaca cctccccctg aacctgaaac ataaaatgaa tgcaattgtt gttgttaact 5040
tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata 5100
aagcattttt ttcactgcag ctccagattg aattatttgc ctgtcataca gctaataatt 5160
gaccataaga caattagatt taaattagtt ttgaatcttt ctaataccaa agttcagttt 5220
actgttccat gttgcttctg agtggcttca cagacttatg aaaaagtaaa cggaatcaga 5280
attacatcaa tgcaaaagca ttgctgtgaa ctctgtactt aggactaaac tttgagcaat 5340
aacacatata gattgaggat tgtttgctgt tagtatacaa actctggttc aaagctcctc 5400
tttattgctt gtcttggaaa atttgctgtt cttcatggtt tctcttttca ctgctatcta 5460
tttttctcaa ccactcacat ggctacaaaa gcttcctgat taataattac actaagtcaa 5520
taggcataga gccaggactg tttgggtaaa ctggtcactt tatcttaaac taaatatatc 5580
caaaactgaa catgtactta gttactaagt ctttgacttt atctcattca taccactcag 5640
ctttatccag gccacttatt tgacagtatt attgcgaaaa cttcctatct agaagtttga 5700
ggagaatatt tgttatattt gcaaaataaa ataagtttgc aagttttttt tttctgcccc 5760
aaagagctct gtgtccttga acataaaata caaataaccg ctatgctgtt aattattgac 5820
aaatgtccca ttttcaacct aaggaaatac cataaagtaa cagatatacc aacaaaaggt 5880
tactagttaa caggcattgc ctgaaaagag tataaaagaa tttcagcatg attttccata 5940
ttgtgcttcc accactgcca ataacaaaat aactagcaag gatccggcca ccatggcccc 6000
cccgaccgat gtcagcctgg gggacgagct ccacttagac ggcgaggacg tggcgatggc 6060
gcatgccgac gcgctagacg atttcgatct ggacatgttg ggggacgggg attccccggg 6120
tccgggattt accccccacg actccgcccc ctacggcgct ctggatatgg ccgacttcga 6180
gtttgagcag atgtttaccg atgcccttgg aattgacgag tacggtggga cgcgtatgaa 6240
gctactgtct tctatcgaac aagcatgcga tatttgccga cttaaaaagc tcaagtgctc 6300
caaagaaaaa ccgaagtgcg ccaagtgtct gaagaacaac tgggagtgtc gctactctcc 6360
caaaaccaaa aggtctccgc tgactagggc acatctgaca gaagtggaat caaggctaga 6420
aagactggaa cagctatttc tactgatttt tcctcgagaa gaccttgaca tgattttgaa 6480
aatggattct ttacaggata taaaagcatt gttaacagga ttatttgtac aagataatgt 6540
gaataaagat gccgtcacag atagattggc ttcagtggag actgatatgc ctctaacatt 6600
gagacagcat agaataagtg cgacatcatc atcggaagag agtagtaaca aaggtcaaag 6660
acagttgact gtataattca ctcctcaggt gcaggctgcc tatcagaagg tggtggctgg 6720
tgtggccaat gccctggctc acaaatacca ctgagatctt tttccctctg ccaaaaatta 6780
tggggacatc atgaagcccc ttgagcatct gacttctggc taataaagga aatttatttt 6840
cattgcaata gtgtgttgga attttttgtg tctctcactc ggaaggacat atgggagggc 6900
aaatcattta aaacatcaga atgagtattt ggtttagagt ttggcaacat atgcccatat 6960
gctggctgcc atgaacaaag gttggctata aagaggtcat cagtatatga aacagccccc 7020
tgctgtccat tccttattcc atagaaaagc cttgacttga ggttagattt tttttatatt 7080
ttgttttgtg ttattttttt ctttaacatc cctaaaattt tccttacatg ttttactagc 7140
cagatttttc ctcctctcct gactactccc agtcatagct gtccctcttc tcttatggag 7200
atcggagaaa gaggtaat 7218
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> qAFP forward primer
<400> 15
caaagctgaa aatgcagttg aatg 24
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> qAFP reverse primer
<400> 16
ttccccatcc tgcagacaat cc 22
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> GAPDH forward primer
<400> 17
agaaggctgg ggctcatttg 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> GAPDH reverse primer
<400> 18
aggggccatc cacagtcttc 20
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> L2 forward primer
<400> 19
ttgtggttct tgcagatatg gc 22
<210> 20
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> L2 reverse primer
<400> 20
tcggaatccc ggcacc 16
<210> 21
<211> 2203
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> AFPI sequence
<400> 21
tttagaaata tgggggtagg ggtggtggtg gggcctggat aaagctgagt ggtatgaatg 60
agttagaaat atgggggtag gggtggtggt ggtaattctg ttttctcccc ataggtgaga 120
taagcattgg gttaaatgtg ctttctctct ctccctctcc tttcttaaga attaagggac 180
agactatggg ctggaggact ttgaggatgt ctgtctcata acacttgggt tgtatctgtt 240
ctatggggct tgttttaagc ttggcaactt gcaacagggt tcactgactt tctccccagg 300
cccaaggtac tgtcctcttt tcatatctgt tttggggcct ctggggcttg aatatctgag 360
aaaatataaa catttcaata atgttctgtg gtgagatgag tatgagagat gtgtcattca 420
tttgtatcaa tgaatgaatg aggacaatta gtgtataaat ccttagtaca acaatctgag 480
ggtaggggtg gtactattca atttctattt ataaagatac ttatttctat ttatttatgc 540
ttgtgacaaa tgttttgttc gggaccacag gaatcacaaa gatgagtctt tgaatttaag 600
aagttaatgg tccaggaata attacatagc ttacaaatga ctatgatata ccatcaaaca 660
agaggttcca tgagaaaata atctgaaagg tttaataagt tgtcaaaggt gagagggctc 720
ttctctagct agagactaat cagaaataca ttcagggata attatttgaa tagaccttaa 780
gggttgggta cattttgttc aagcattgat ggagaaggag agtgaatatt tgaaaacatt 840
tcaactaacc aaccacccaa tccaacaaac aaaaaatgaa aagaatctca gaaacagtga 900
gataagagaa ggaattttct cacaacccac acgtatagct caactgctct gaagaagtat 960
atatctaata tttaacacta acatcatgct aataatgata ataattactg tcatttttta 1020
atgtctataa gtaccaggca tttagaagat attattccat ttatatatca aaataaactt 1080
gaggggatag atcattttca tgatatatga gaaaaattaa aaatcagatt gaattatttg 1140
cctgtcatac agctaataat tgaccataag acaattagat ttaaattagt tttgaatctt 1200
tctaatacca aagttcagtt tactgttcca tgttgcttct gagtggcttc acagacttat 1260
gaaaaagtaa acggaatcag aattacatca atgcaaaagc attgctgtga actctgtact 1320
taggactaaa ctttgagcaa taacacatat agattgagga ttgtttgctg ttagtataca 1380
aactctggtt caaagctcct ctttattgct tgtcttggaa aatttgctgt tcttcatggt 1440
ttctcttttc actgctatct atttttctca accactcaca tggctacaat aactgtctgc 1500
aagcttatga ttcccaaata tctatctcta gcctcaatct tgttccagaa gataaaaagt 1560
agtattcaaa tgcacatcaa cgtctccact tggagggctt aaagacgttt caacatacaa 1620
accggggagt tttgcctgga atgtttccta aaatgtgtcc tgtagcacat agggtcctct 1680
tgttccttaa aatctaatta cttttagccc agtgctcatc ccacctatgg ggagatgaga 1740
gtgaaaaggg agcctgatta ataattacac taagtcaata ggcatagagc caggactgtt 1800
tgggtaaact ggtcacttta tcttaaacta aatatatcca aaactgaaca tgtacttagt 1860
tactaagtct ttgactttat ctcattcata ccactcagct ttatccaggc ctctagaagt 1920
ttgaggagaa tatttgttat atttgcaaaa taaaataagt ttgcaagttt tttttttctg 1980
ccccaaagag ctctgtgtcc ttgaacataa aatacaaata accgctatgc tgttaattat 2040
tgacaaatgt cccattttca acctaaggaa ataccataaa gtaacagata taccaacaaa 2100
aggttactag ttaacaggca ttgcctgaaa agagtataaa agaatttcag catgattttc 2160
catattgtgc ttccaccact gccaataaca aaataactag caa 2203
<210> 22
<211> 1113
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> AFPII sequence
<400> 22
cagattgaat tatttgcctg tcatacagct aataattgac cataagacaa ttagatttaa 60
attagttttg aatctttcta ataccaaagt tcagtttact gttccatgtt gcttctgagt 120
ggcttcacag acttatgaaa aagtaaacgg aatcagaatt acatcaatgc aaaagcattg 180
ctgtgaactc tgtacttagg actaaacttt gagcaataac acatatagat tgaggattgt 240
ttgctgttag tatacaaact ctggttcaaa gctcctcttt attgcttgtc ttggaaaatt 300
tgctgttctt catggtttct cttttcactg ctatctattt ttctcaacca ctcacatggc 360
tacaataact gtctgcaagc ttatgattcc caaatatcta tctctagcct caatcttgtt 420
ccagaagata aaaagtagta ttcaaatgca catcaacgtc tccacttgga gggcttaaag 480
acgtttcaac atacaaaccg gggagttttg cctggaatgt ttcctaaaat gtgtcctgta 540
gcacataggg tcctcttgtt ccttaaaatc taattacttt tagcccagtg ctcatcccac 600
ctatggggag atgagagtga aaagggagcc tgattaataa ttacactaag tcaataggca 660
tagagccagg actgtttggg taaactggtc actttatctt aaactaaata tatccaaaac 720
tgaacatgta cttagttact aagtctttga ctttatctca ttcataccac tcagctttat 780
ccaggccact tatttgacag tattattgcg aaaacttcct atctagaagt ttgaggagaa 840
tatttgttat atttgcaaaa taaaataagt ttgcaagttt tttttttctg ccccaaagag 900
ctctgtgtcc ttgaacataa aatacaaata accgctatgc tgttaattat tgacaaatgt 960
cccattttca acctaaggaa ataccataaa gtaacagata taccaacaaa aggttactag 1020
ttaacaggca ttgcctgaaa agagtataaa agaatttcag catgattttc catattgtgc 1080
ttccaccact gccaataaca aaataactag caa 1113
<210> 23
<211> 856
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> AFPIII sequence
<400> 23
cagattgaat tatttgcctg tcatacagct aataattgac cataagacaa ttagatttaa 60
attagttttg aatctttcta ataccaaagt tcagtttact gttccatgtt gcttctgagt 120
ggcttcacag acttatgaaa aagtaaacgg aatcagaatt acatcaatgc aaaagcattg 180
ctgtgaactc tgtacttagg actaaacttt gagcaataac acatatagat tgaggattgt 240
ttgctgttag tatacaaact ctggttcaaa gctcctcttt attgcttgtc ttggaaaatt 300
tgctgttctt catggtttct cttttcactg ctatctattt ttctcaacca ctcacatggc 360
tacaaaagct tcctgattaa taattacact aagtcaatag gcatagagcc aggactgttt 420
gggtaaactg gtcactttat cttaaactaa atatatccaa aactgaacat gtacttagtt 480
actaagtctt tgactttatc tcattcatac cactcagctt tatccaggcc acttatttga 540
cagtattatt gcgaaaactt cctatctaga agtttgagga gaatatttgt tatatttgca 600
aaataaaata agtttgcaag tttttttttt ctgccccaaa gagctctgtg tccttgaaca 660
taaaatacaa ataaccgcta tgctgttaat tattgacaaa tgtcccattt tcaacctaag 720
gaaataccat aaagtaacag atataccaac aaaaggttac tagttaacag gcattgcctg 780
aaaagagtat aaaagaattt cagcatgatt ttccatattg tgcttccacc actgccaata 840
acaaaataac tagcaa 856
<210> 24
<211> 663
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> AFPIV sequence
<400> 24
cagattgaat tatttgcctg tcatacagct aataattgac cataagacaa ttagatttaa 60
attagttttg aatctttcta ataccaaagt tcagtttact gttccatgtt gcttctgagt 120
ggcttcacag acttatgaaa aagtaaacgg aatcagaatt acatcaatgc aaaagcattg 180
ctgtgaactc tgtacttagg actaaacttt gagcaataac acatatagat tgaggattgt 240
ttgctgttag tatacaaact ctggttcaaa gctcctcttt attgcttgtc ttggaaaatt 300
tgctgttctt catggtttct cttttcactg ctatctattt ttctcaacca ctcacatggc 360
tacaaaagct ttctagaagt ttgaggagaa tatttgttat atttgcaaaa taaaataagt 420
ttgcaagttt tttttttctg ccccaaagag ctctgtgtcc ttgaacataa aatacaaata 480
accgctatgc tgttaattat tgacaaatgt cccattttca acctaaggaa ataccataaa 540
gtaacagata taccaacaaa aggttactag ttaacaggca ttgcctgaaa agagtataaa 600
agaatttcag catgattttc catattgtgc ttccaccact gccaataaca aaataactag 660
caa 663
<210> 25
<211> 485
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> AFPV sequence
<400> 25
cctgattaat aattacacta agtcaatagg catagagcca ggactgtttg ggtaaactgg 60
tcactttatc ttaaactaaa tatatccaaa actgaacatg tacttagtta ctaagtcttt 120
gactttatct cattcatacc actcagcttt atccaggcca cttatttgac agtattattg 180
cgaaaacttc ctatctagaa gtttgaggag aatatttgtt atatttgcaa aataaaataa 240
gtttgcaagt tttttttttc tgccccaaag agctctgtgt ccttgaacat aaaatacaaa 300
taaccgctat gctgttaatt attgacaaat gtcccatttt caacctaagg aaataccata 360
aagtaacaga tataccaaca aaaggttact agttaacagg cattgcctga aaagagtata 420
aaagaatttc agcatgattt tccatattgt gcttccacca ctgccaataa caaaataact 480
agcaa 485
Claims (43)
- 발현 시스템으로서,
종양 세포-특이적 프로모터를 포함하는 제1 핵산 분자;
제1 핵산 분자에 작동 가능하게 연결되고 전사 활성화제를 암호화하는 제2 핵산 분자;
전사 활성화제의 제1 인식 서열을 포함하는 제3 핵산 분자;
제3 핵산 분자에 작동 가능하게 연결되고 제1 프로모터 및 제1 조절 요소를 포함하는 제4 핵산 분자;
제4 핵산 분자에 작동 가능하게 연결되고 제1 조절 단백질 및 아데노바이러스 복제 및 포장 단백질을 암호화하는 제5 핵산 분자;
전사 활성화제의 제2 인식 서열을 포함하는 제6 핵산 분자;
제6 핵산 분자에 작동 가능하게 연결되고 제2 프로모터 및 제2 조절 요소를 포함하는 제7 핵산 분자;
제7 핵산에 작동 가능하게 연결되고 제2 조절 단백질을 암호화하는 제8 핵산 분자;
제5 핵산 분자에 작동 가능하게 연결되고 제1 조절 단백질의 발현을 조건부로 억제하는 제9 핵산 분자로서, 제9 핵산 분자는 제1 마이크로RNA에 의해 특이적으로 인식된 표적 부위를 포함하고, 제1 마이크로RNA는 정상 세포-특이적 마이크로RNA인, 제9 핵산 분자; 및
제8 핵산 분자에 작동 가능하게 연결되고 제2 조절 단백질의 발현을 조건부로 억제하는 제10 핵산 분자로서, 제10 핵산 분자는 제2 마이크로RNA에 의해 특이적으로 인식된 표적 부위를 포함하고, 제2 마이크로RNA는 종양 세포-특이적 마이크로RNA인, 제10 핵산 분자;를 포함하며,
여기서
제1 조절 요소는 제2 조절 단백질에 대한 결합에 의해 제1 프로모터의 기능을 억제하고,
제2 조절 요소는 제1 조절 단백질에 대한 결합에 의해 제2 프로모터의 기능을 억제하는,
발현 시스템. - 제1항에 있어서, 종양 세포-특이적 프로모터는 알파-태아단백질-특이적 프로모터, 서바이빈 프로모터, 인간 텔로머라제 역전사효소 유전자 프로모터, 콜레시스토키닌 A 수용체 유전자 프로모터, 암종배아 항원 프로모터, 원-종양유전자 인간 표피 성장 인자 수용체 2 프로모터, 프로스타글란딘 엔도옥시게나제 환원효소 2 프로모터, 케모카인 수용체-4, E2F-1 유전자 프로모터, 뮤신 프로모터, 전립선 특이적 항원, 인간 티로시나제-관련 단백질 1, 및 티로시나제 프로모터로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나인 것인 발현 시스템.
- 제1항에 있어서, 전사 활성화제는 Gal4VP16, Gal4vp64, dCas9-VPR, dCas9-VP64, dCas9-VP16, dCas9-VTR, 및 rtTA로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나인 것인 발현 시스템.
- 제1항에 있어서, 제1 인식 서열 및 제2 인식 서열은 각각 독립적으로 5 x UAS, 7 x tetO 및 dCas9의 표적 서열 중 적어도 하나로부터 선택되는 것인 발현 시스템.
- 제1항에 있어서, 제1 프로모터 및 제2 프로모터는 각각 독립적으로 miniCMV 및 TATA 박스로부터 선택되는 것인 발현 시스템.
- 제1항에 있어서, 제1 조절 단백질 및 제2 조절 단백질은 각각 독립적으로 LacI, tetR, 아연 핑거, KRAB, tetR-KRAB 및 dCas9-KRAB 중 적어도 하나로부터 선택되는 것인 발현 시스템.
- 제6항에 있어서, 제1 조절 요소 및 제2 조절 요소는 각각 독립적으로 tetO, LacO, 아연 핑거 표적 부위, 및 dCas9의 표적 서열 중 적어도 하나로부터 선택되는 것인 발현 시스템.
- 제7항에 있어서, 제1 조절 단백질은 LacI이고, 제2 조절 요소는 다수의 반복된 LacO 서열을 포함하며, 다수의 반복된 LacO 서열 중 적어도 하나는 제2 프로모터의 하류에 놓이는 것인 발현 시스템.
- 제6항에 있어서, 제2 조절 단백질은 tetR-KRAB이고, 제1 조절 요소는 다수의 반복된 tetO 서열을 포함하며, 다수의 반복된 tetO 서열 중 적어도 하나는 제1 프로모터의 하류에 놓이는 것인 발현 시스템.
- 제1항에 있어서, 제5 핵산 분자 및 제8 핵산 분자 중 적어도 하나는 관심 있는 단백질을 암호화하는 서열을 더 포함하는 것인 발현 시스템.
- 제10항에 있어서, 제5 핵산 분자는 관심 있는 단백질을 암호화하는 서열을 포함하고, 관심 있는 단백질은 면역 이펙터를 포함하는 것인 발현 시스템.
- 제1항에 있어서, 아데노바이러스 복제 및 포장 단백질은 아데노바이러스 E1 유전자, 아데노바이러스 E1A 유전자, 아데노바이러스 E1B 유전자, 아데노바이러스 E2 유전자 및 아데노바이러스 E4 유전자로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는 것인 발현 시스템.
- 제1항에 있어서, 아데노바이러스 복제 및 포장 단백질은 아데노바이러스 E1A 유전자를 포함하는 것인 발현 시스템.
- 제11항에 있어서, 면역 이펙터는 PD-1 유전자를 길항하는 억제 서열, PD-L1 유전자를 길항하는 억제 서열, CTLA4 유전자를 길항하는 억제 서열, Tim-3 유전자, GM-CSF, IL-2, IL-12, 또는 IL-15를 길항하는 억제 서열로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 서열을 포함하는 것인 발현 시스템.
- 제10항에 있어서, 관심 있는 단백질 및 제1 조절 단백질은 융합 단백질의 형태로 발현되고, 관심 있는 단백질 및 제1 조절 단백질은 절단 가능한 링커 펩타이드에 의해 연결되는 것인 발현 시스템.
- 제1항에 있어서, 제9 핵산 분자 및 제10 핵산 분자는 독립적으로, 각각 제1 조절 단백질 또는 제2 조절 단백질의 발현을, RNA 간섭에 의해 억제하는 것인 발현 시스템.
- 제1항에 있어서, 제1 마이크로RNA는 miR199a, miR95, miR125, miR25b, Let-7, miR143, miR145, 및 miR200C로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는 것인 발현 시스템.
- 제1항에 있어서, 제2 마이크로RNA는 miR21, miR223, miR224, miR221, miR18, miR214, miR146a, 및 miR1792로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는 것인 발현 시스템.
- 제1항에 있어서, 제1 핵산 분자 및 제2 핵산 분자는 제1 발현 벡터에 로딩되고; 제3 핵산 분자, 제4 핵산 분자, 제5 핵산 분자 및 제9 핵산 분자는 제2 발현 벡터에 로딩되며; 제6 핵산 분자, 제7 핵산 분자, 제8 핵산 분자 및 제10 핵산 분자는 제3 발현 벡터에 로딩되는 것인 발현 시스템.
- 제19항에 있어서, 제1 발현 벡터, 제2 발현 벡터 및 제3 발현 벡터는 각각 독립적으로 플라스미드, 바이러스, 나노물질, 리포좀, 분자적으로 결합된 벡터, 네이키드 DNA, 염색체 벡터, 및 중합체 중 적어도 하나로부터 선택되는 것인 발현 시스템.
- 제20항에 있어서, 바이러스는 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 레트로바이러스로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는 것인 발현 시스템.
- 제19항에 있어서, 제1 발현 벡터, 제2 발현 벡터 및 제3 발현 벡터는 하나의 동일한 벡터에 로딩되는 것인 발현 시스템.
- 제22항에 있어서, 하나의 동일한 벡터는 아데노바이러스 벡터인 것인 발현 시스템.
- 제19항에 있어서, 제1 발현 벡터는 5' 단부로부터 3' 단부쪽으로: BsaI, AFP III, Gal4VP16 및 BsaI을 포함하고,
여기서, 제1 발현 벡터는 SEQ ID NO: 1에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산을 운반하는 것인 발현 시스템. - 제19항에 있어서, 제2 발현 벡터는 5' 단부로부터 3' 단부쪽으로: BsaI, 5 Х UAS, tetO, miniCMV, tetO, E1A, 2A, 면역 효과 인자, LacI, 마이크로RNA199a 특이적 인식 서열 및 BsaI을 포함하고,
여기서, 제2 발현 벡터는 SEQ ID NO: 2 내지 7로 구성되는 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산을 운반하는 것인 발현 시스템. - 제19항에 있어서, 제3 발현 벡터는 5' 단부로부터 3' 단부쪽으로: BsaI, 5 Х UAS, LacO, miniCMV, LacO, tetR-KRAB, 마이크로RNA21 특이적 인식 서열 및 BsaI을 포함하고,
여기서, 제3 발현 벡터는 SEQ ID NO: 8에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산을 운반하는 것인 발현 시스템. - 제23항에 있어서, 아데노바이러스는 5' 단부로부터 3' 단부쪽으로: 제1 반전 말단 반복 서열, 포장 신호, AFPIII, Gal4VP16, 5 x UAS, tetO, miniCMV, tetO, E1A, 2A, 면역 이펙터, 2A, LacI, 마이크로RNA 199a 특이적 인식 서열, 5 x UAS, LacO, miniCMV, LacO, tetR-KRAB, 마이크로RNA 21 특이적 인식 서열, 아데노바이러스 E2 유전자 영역, 아데노바이러스 E3 유전자 영역, 아데노바이러스 E4 유전자 영역, 및 제2 반전 말단 반복 서열을 포함하고,
여기서, 아데노바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 9 내지 14로 구성되는 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산을 운반하는 것인 발현 시스템. - 아데노바이러스를 얻기 위한 방법으로서:
아데노바이러스 벡터로부터 아데노바이러스 복제 및 포장과 관련된 아데노바이러스 E1 유전자 및 아데노바이러스 E3 유전자의 일부를 제거하는 단계;
아데노바이러스 E1A 유전자를 단계식 골든 게이트 방법에 의해 유전자 회로에 삽입하는 단계; 및
제27항에서 정의되는 아데노바이러스를 얻기 위하여, 유전자 회로를 게이트웨이 또는 깁슨 방법에 의해 아데노바이러스 벡터에 통합시키는 단계;를 포함하는, 방법. - 재조합 바이러스로서,
종양 세포-특이적 프로모터를 포함하고, 종양 세포-특이적 프로모터는 알파-태아단백질-특이적 프로모터인 제1 핵산 분자;
제1 핵산 분자에 작동 가능하게 연결되고 전사 활성화제를 암호화하며, 전사 활성화제는 Gal4VP16인 제2 핵산 분자;
전사 활성화제의 제1 인식 서열을 포함하고, 제1 인식 서열은 5 x UAS인 제3 핵산 분자;
제3 핵산 분자에 작동 가능하게 연결되고 제1 프로모터 및 제1 조절 요소를 포함하며, 제1 프로모터는 miniCMV이고, 제1 조절 요소는 다수의 반복된 tetO 서열을 포함하며, 다수의 반복된 tetO 서열 중 적어도 하나는 제1 프로모터의 하류에 놓이는 제4 핵산 분자;
제4 핵산 분자에 작동 가능하게 연결되고 제1 조절 단백질을 암호화하며, 제1 조절 단백질은 LacI인 제5 핵산 분자,
여기서
제5 핵산 분자는 추가로 관심 있는 단백질을 암호화하는 서열을 포함하며,
관심 있는 단백질은 아데노바이러스 복제 및 포장 단백질, 및 면역 이펙터를 포함하고,
면역 이펙터는 개별적인 단백질 또는 융합 단백질의 형태로 발현되며, 바이러스 복제 단백질 및 면역 이펙터는 절단 가능한 링커 펩타이드에 의해 연결되고,
관심 있는 단백질 및 제1 조절 단백질은 융합 단백질의 형태로 발현되며,
관심 있는 단백질 및 제1 조절 단백질은 절단 가능한 링커 펩타이드에 의해 연결되고;
전사 활성화제의 제2 인식 서열을 포함하며, 제2 인식 서열은 5 x UAS인 제6 핵산 분자;
제6 핵산 분자에 작동 가능하게 연결되고 제2 프로모터 및 제2 조절 요소를 포함하며, 여기서 제2 프로모터는 miniCMV이고, 제2 조절 요소는 다수의 반복된 LacO 서열을 포함하며, 다수의 반복된 LacO 서열 중 적어도 하나는 제2 프로모터의 하류에 삽입되는 제7 핵산 분자;
제7 핵산 분자에 작동 가능하게 연결되고 제2 조절 단백질을 암호화하며, 제2 조절 단백질은 tetR-KRAB인 제8 핵산 분자;
제5 핵산 분자에 작동 가능하게 연결되고 제1 조절 단백질의 발현을 조건부로 억제하며, 여기서 제9 핵산 분자는 제1 마이크로RNA에 의해 특이적으로 인식되는 핵산 서열을 포함하고, 제1 마이크로RNA는 정상 세포-특이적 마이크로RNA인 제9 핵산 분자; 및
제8 핵산 분자에 작동 가능하게 연결되고 제2 조절 단백질의 발현을 조건부로 억제하며, 여기서 제10 핵산 분자는 제2 마이크로RNA에 의해 특이적으로 인식되는 핵산 서열을 포함하고, 제2 마이크로RNA는 종양 세포-특이적 마이크로RNA인 제10 핵산 분자를 포함하며,
제1 조절 요소는 제2 조절 단백질에 대한 결합에 의해 제1 프로모터의 기능을 억제하며, 및
제2 조절 요소는 제1 조절 단백질에 대한 결합에 의해 제2 프로모터의 기능을 억제하는, 재조합 바이러스. - 제29항에 있어서, 재조합 바이러스는 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 레트로바이러스 및 헤르페스 바이러스로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는 것인 재조합 바이러스.
- 제29항에 있어서, 재조합 바이러스는 아데노바이러스인 것인 재조합 바이러스.
- 제29항에 있어서, 면역 이펙터는 PD-1 유전자를 길항하는 억제 서열, PD-L1 유전자를 길항하는 억제 서열, CTLA4 유전자를 길항하는 억제 서열, Tim-3 유전자, IL-2, IL-12, IL-15, 또는 GM-CSF를 길항하는 억제 서열로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 서열을 포함하는 것인 재조합 바이러스.
- 재조합 세포로서,
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따르는 발현 시스템을 포함하고, 재조합 세포는 분리된 세포인 것인 재조합 세포. - 제33항에 있어서, 발현 시스템의 적어도 일부는 재조합 세포의 게놈 안으로 통합되는 것인 재조합 세포.
- 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 암 치료를 위한 용도인 것인 발현 시스템.
- 제35항에 있어서, 상기 암은 간암, 폐암, 대장암, 흑색종, 유방암 또는 전립선암을 포함하는 것인 발현 시스템.
- 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 암 치료를 위한 용도인 것인 재조합 바이러스.
- 제33항에 있어서, 암 치료를 위한 용도인 것인 재조합 세포.
- 제34항에 있어서, 암 치료를 위한 용도인 것인 재조합 세포.
- 제1항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 따르는 발현 시스템을 사용함으로써 관심 있는 단백질을 발현시키는 방법으로서,
(1) 제5 핵산 분자가 관심 있는 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하도록 제10항의 발현 시스템을 제공하는 단계; 및
(2) 관심 있는 단백질을 발현시키기 위하여 제10 핵산 분자에 의해 제2 조절 단백질의 발현을 억제하는 단계;
를 포함하는 방법. - 제40항에 있어서, 발현은 분리된 세포에서 수행되는 것인 방법.
- 제40항에 있어서, 단계 (2)에서 제2 마이크로RNA를 제10 핵산 분자와 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 따르는 발현 시스템을 사용함으로써 관심 있는 단백질을 발현시키는 방법으로서,
(1) 제8 핵산 분자가 관심 있는 제1 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하고, 제5 핵산 분자가 관심 있는 제2 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하도록 제10항의 발현 시스템을 제공하는 단계; 및
(2) 관심 있는 제1 단백질을 발현시키기 위하여 제9 핵산 분자에 의해 제1 조절 단백질의 발현을 억제하는 단계; 또는
관심 있는 제2 단백질을 발현시키기 위하여 제10 핵산 분자에 의해 제2 조절 단백질의 발현을 억제하는 단계;
를 포함하는 방법.
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