KR101153844B1

KR101153844B1 - ＫｒａｓＧ１２ＶＲＮＡ를 특이적으로 인지할 수 있는 트랜스-스플라이싱 그룹 Ｉ 리보자임

Info

Publication number: KR101153844B1
Application number: KR1020120039745A
Authority: KR
Inventors: 이성욱; 김성진; 김주현; 정진숙
Original assignee: 단국대학교 산학협력단
Priority date: 2012-04-17
Filing date: 2012-04-17
Publication date: 2012-06-20
Also published as: KR20120064656A

Abstract

본 발명은 단 염기 변이 전사체를 특이적으로 인지할 수 있는 트랜스-스플라이싱 그룹 I 리보자임에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 Kras 유전자의 12번째 코돈의 단 염기 변이 Ras RNA를 특이적으로 인식하여 치환할 수 있는 트랜스-스플라이싱 그룹 I 리보자임에 관한 것이다.
본 발명의 리보자임은 단 염기 변이된 유전자 전사체를 정상 유전자 전사체와 구별하여 특이적으로 인식하므로, 이러한 리보자임을 이용하여 돌연변이 전사체를 발현하는 암세포를 특이적으로 치료 및 진단이 가능하다.

Description

ＫｒａｓＧ１２ＶＲＮＡ를 특이적으로 인지할 수 있는 트랜스-스플라이싱 그룹 Ｉ 리보자임{trans―splicing group I ribozyme specific for Kras G12V RNA}

본 발명은 Kras 단 염기 변이 전사체를 특이적으로 인지할 수 있는 트랜스-스플라이싱 그룹 Ｉ 리보자임에 관한 것이다.

현재 항암치료로 주로 이용되고 있는 방사선 치료법과 항암화학요법 등은 이런 방법에 저항성을 보이는 환자에게는 비효과적이며 정상세포에도 부작용을 유발할 수 있는 한계점을 가지고 있었다. 따라서, 보다 특이적인 암 치료를 위해 암세포에서만 특이적인 세포사를 유도하는 방법이 필요하다.

라스 단백질(Ras protein)은 세포 성장, 증식과 분화를 조절하는 소 지티파제 단백질(small GTPase protein)으로 진화적으로 매우 보존되어 있고 각 조직마다 서로 다른 양을 발현한다.

이러한 라스의 아이소폼인 H-ras, N-ras, K-ras들은 서로 다른 위치에 의해 같은 활성자(activator)와 작동자(effector)를 가지고도 다른 기능을 한다(John F. Hancock. RAS proteins: different signals from diffrent locations. Nature Molecular Cell Biology 4; 373-384(2003)). RAS 아이소폼은 약 85%의 유사성을 가지고 있으며, H-ras와 N-ras의 하나 혹은 동시의 녹아웃 실험을 통해 정상 발달(normal development)에 필수적이지 않음이 알려졌다.

그러나, K-ras의 경우에는 배아 치사(embryonic lethal)가 되는 필수적인 단백질임이 보고되었다(Johnson, L. et al., K-ras is an essential gene in the mouse with partial functional overlap with N-ras. Genes Dev. 11; 2468-2481(1997)).

정상 세포에서의 RAS 단백질의 활성은 GTP와 GDP의 결합 비율에 의해 조절되어진다(Campbell, S. L. et al., Increasing complexity of Ras signaling. Oncogene 17;1395-1413(1998)). RAS 단백질의 활성 상태는 GTP나 GDP의 결합 여부에 의해 결정이 되는데, RAS-GTP는 활성 상태이고 RAS-GDP는 불활성 상태로 RAF, PI3K, RALGDS, PLCε등의 하위 단계 단백질들의 연속적인 인산화를 유도하여 외부로부터 신호전달을 하는 "분자 스위치(molecular switch)" 역할을 한다(Fabbro, D. et al., Protein tyrosine kinase inhibitors: new treatment modalities Curr . Opin. Pharmacol. 2; 374-381 (2002)).

비활성 상태의 RAS는 GEFs(guanine nucleotide exchange factors)에 의해 GDP를 방출하고 GTP 바인딩을 허용함으로써 활성화될 수 있다. Ras 신호화의 종결은 GAPs(GTPase activating proteins)에 의해 RAS의 내재성의 GTPase를 활성화시켜 GTP를 GDP로 전환함으로써 불활성화된다(John F. Hancock. RAS proteins: different signals from diffrent locations. Nature Molecular Cell Biology 4; 373-384(2003)).

RAS의 발현은 조직 특이적으로 발현되는데 각 조직의 암에서 RAS 돌연변이가 많이 발견되었다. Kras의 경우 대장, 흉선 그리고 폐에서 많이 발현이 되며 결장암, 췌장암, 폐암에서 Kras의 G12V 단 염기 돌연변이는 RAS 단백질의 구조적인 변화에 의해 GAP의 친화도와 활성도가 감소하게 된다. 따라서, RAS의 GTPase 활성이 감소되어 RAS는 계속적으로 단백질의 활성을 유지시킨다(Fabbro, D. et al., P A. Protein tyrosine kinase inhibitors: new treatment modalities, Curr . Opin . Pharmacol. 2; 374-381 (2002); Fahd Al-Mulla et al., Structural differences between valine-12 and aspartate-12 ras protein may modify carcinoma aggression. J. Pathol 18; 433-438(1999)).

Kras 유전자와 인간 암의 관계를 살펴보면 NSCLC(Non small cell carcinoma)의 33%, 결장암의 44% 그리고 췌장암의 90%에서 K-ras 유전자의 돌연변이가 발견된다. 다른 ras 종류의 경우 N-ras는 흑색종(13%), 간암(30%), 그리고 형질구성 백혈병(30%)에서 그 변이가 발견되며, H-ras는 방광(10%)그리고 신장암(10%)에서 발견된다(Mu D.Q. et al., Xualues of mutations of K-ras oncogene at codon 12 in detection of pancreatic cancer. World J Gastroenterol. 10(4); 471-5. (2004)).

이 중 특히 폐암의 경우 통증이 없어 발병의 진단이 늦고 또한 현재 폐암의 85% 이상이 사망하는 것으로 알려져 있다. 실제 대장암, 유방암 그리고 전립선암보다 더 많은 사람이 폐암으로 사망한다.

폐암은 암세포의 현미경적 형태에 따라 크게 비소세포성폐암(Non Small Cell Lung Cancer;NSCLC)와 소세포성폐암(Small Cell Lung Cancer;SCLC)으로 나뉘는데, 비소세포성폐암은 폐암의 65~75%, 소세포성폐암은 15~30%, 기타 폐암이 10%를 차지한다.

상기 비소세포성폐암은 편평상피암(squamous cell carcinoma)과 선암(adenocarcinoma) 그리고 대세포암종(large cell carcinoma)으로 분류한다(Minamoto T., Mai M. and Ronai Z. K-ras mutation: early detection in molecular diagnosis and risk assessment of colorectal, pancreas, and lung cancers a review. Cancer Detect Prev, 24(1); 1-12. (2004)).

상기 편평상피암은 폐암 중 가장 흔한 형태로 폐 중심부에 잘 생기며, 남자 폐암에 가장 맣은 형태로 흡연과 가장 관련이 많은 것으로 알려져 있다. 또한, 선암은 폐의 주변에서 주로 발견되며 간, 뇌, 뼈 등으로 전이가 잘 일어난다. 마지막으로 대세포암종은 전체 폐암의 4~10%를 차지하며, 폐 주변에 주로 발생하며, 암세포가 빠르게 증식하여 전이되는 속도가 빠른 경향이 있다.

상기 소세포성폐암은 주로 기도에서 처음 발생한다. 대개 기관의 표면이나 선을 따라서 생성되며 대부분은(80%) 폐 중앙부에 생기고 나머지(20%)는 주변부에서 발생한다. 전반적으로 악성도가 강해서 림프계통이나 혈액순환을 통해서 조기에 멀리 전이되는 경향이 있다. 소세포성폐암 암세포는 대개는 작고 동그란 형태로 자라는데, 그 모양을 본 따서 연맥세포암(oat cell)이라고도 한다.

나머지 기타 암으로, 세기관지폐포암(bronchioloalveoiar carcinoma)은 천천히 자라는 암세포이며, 나이가 많은 사람에게서 종종 발견되며 진행정도도 다양하다. 또한, 전체 폐암의 1% 미만으로 발생하는 거대세포암(giant cell carcinoma)은 주로 주변부에서 크게 나타나며, 악성도가 심해서 빨리 진행된다.

이 중 편평상피암의 46%와 선암의 44%가 K-ras의 돌연변이로 인해 발병되는데, 그 중 40%가 K-ras의 단 염기 변이로 알려져 있다(Minamoto T., Mai M., and Ronai Z. K-ras mutation: early detection in molecular diagnosis and risk assessment of colorectal, pancreas, and lung cancers. Cancer Detect Prev. 24(1); 1-12. (2000)).

Kras는 세포 내에서 세포의 성장, 분열, 분화의 신호전달에 관여하는 상위단계의 단백질로, Kras의 돌연변이 중 12번, 13번, 61번 코돈이 핫 스팟(hot spot)으로 알려져 있다. 특히 Kras의 12, 13, 61번째 코돈의 돌연변이는 GTP의 가수분해에 관여하는 도메인을 암호화하는 부위에서 구조적 변화를 일으켜 세포의 계속적인 성장을 유도하여 암세포로 발전시키게 된다.

한편, Tetrahmena thermophila로부터의 그룹 I 인트론 리보자임이 실험관 내에서 자기 자신의 3'끝에 부착되어 있는 엑손 RNA를 트랜스하게 존재하는 5'엑손을 표적으로 한 후 부착시킴으로써 별도로 존재하는 전사체를 서로 연결시킬 수 있는 트랜스-스플라이싱 반응을 일으킬 수 있음이 보고되었다(Been, M. and Cech, T. One binding site determines sequence specificity of Tetrahymena pre-rRNA self-splicing, trans-splicing, and RNA enzyme activity. Cell 47; 207-216. (1986)). 이러한 리보자임은 포유류 세포 내에서도 일어날 수 있음이 밝혀졌다(Jones, J.T., Lee, S.W., and Sullenger, B.A Tagging ribozyme reaction sites to follow trans-splicing in mammalian cells. Nat . Med. 2; 643-648. (1996); Lee, S.W. Effects of substrate RNA structure on the trans-splicing reaction by group I intron of Tetrahymena thermophila. Korean Journal of Microbiology 35; 211-217. (1999)).

이는 곧 그룹 I 리보자임의 트랜스-스플라이싱 반응을 통하여 여러 유전질환과 관련있는 유전자의 전사체도 보정될 수 있음을 시사하며 실제로 최근에 겸상적혈구(sickle cell) 질병을 갖은 환자의 적혈구 전구(erythrocyte precursor) 세포에서 β-글로빈 유전자 전사체가 트랜스-스플라이싱 리보자임에 의해 항-겸상적혈구화(anti-sickling), γ-글로빈 유전자 전사체로 전환될 수 있음이 밝혀졌다(Lan, N., Howrey, R.P., Lee, S.W., Howrey, R.P., Lee, S.W., Howrey, R.P., Smith, C.A., and Sullenger, B.A. Ribozyme-Mediated Repair of Sickle β-Globin mRNAs in Erythrocyte Precursors. Science 280; 1593-1596. (1998); Lan, N., Rooney, B.L., Lee, S.W., Howrey, R.P., Smith, C.A., and Sullenger, B.A. Enhancing RNA repair efficiency by combining trans-splicing ribozymes that recognize different accessible sites on a target RNA. Mol . Ther . 2; 245-255. (2000)).

또한, 여러 다른 부위를 인지하는 리보자임들을 함께 반응시켰을 경우 트랜스-스플라이싱 반응이 더욱 증가한다(Lan, N., Rooney, B.L., Lee, S.W., Howrey, R.P., Smith, C.A., and Sullenger, B.A. Enhancing RNA repair efficiency by combining trans-splicing ribozymes that recognize different accessible sites on a target RNA. Mol . Ther . 2; 245-255. (2000)).

그리고, 트랜스-스플라이싱 리보자임이 포유류 세포 내에 있는 근긴장성이양증 단백질 키나아제(myotonic dystrophy protein kinase) 유전자 전사체도 변형할 수 있다고 보고되었다(Phylactou, L.A., Darrah, C. and Wood, M.A.J.. Ribozyme-mediated trans-splicing of a trinucleotide repeat. Nat . Genet. 18; 378-381. (1998)). 선천성근긴장증(Myotonic congenita)을 유발하는 돌연변이 골격근 클로라이드 채널(mutant skeletal muscle chloride channel) RNA를 기능 면에서도 보정할 수 있었(Rogers, C.S., Vanoye, C.G., Sullenger, B.A., and George, Jr., A.L. Functional repair of a mutant chloride channel using a trans-splicing ribozyme. J. Clin . Invest. 110; 1783-1798. (2002)).

리보자임의 특이도 및 활성도를 증가하기 위해 표적 RNA 인지부위인 내부 가이드 염기서열(internal guide sequence;IGS)를 변형한 IGS를 갖는 리보자임을 식물 병원체인 오이 모자이크 바이러스 RNA를 표적으로 하여 사이토톡신을 트랜스-스플라이싱할 수 있도록 고안하였을 때, 효모 내에서 바이러스 RNA만 발현하는 세포만 특이적으로 그 성장을 방해할 수 있음이 발표되었다(Ayre, B.G., Kohler, U., Goodman, H.M., and Haseloff, J. Design of highly specific cytotoxins by using trans-splicing ribozymes. Proc . Natl . Acad . Sci. 96; 3507-3512. (1999)).

다른 예로 위와 같이 내부 가이드 염기서열이 변형되어 있고 돌연변이 p53 RNA를 표적으로 하여 트랜스-스플라이싱할 수 있는 리보자임을 인체의 결핍성 p53이 관련된 암세포에서 발현시킬 경우 돌연변이 p53 전사체를 효과적으로 보정함으로써 정상적인 p53의 활성을 유도하였다(Watanabe, T., and Sullenger, B.A. Induction of wild-type p53 activity in human cancer cells by ribozymes that repair mutant p53 transcripts. Proc . Natl . Acad . Sci. 97; 8490-8494. (2000)). 이러한 연구는 트랜스-스플라이싱 리보자임이 돌연변이 유전자 RNA를 정상 RNA로 보정 가능함을 시사하고 있다.

또한, 최근에 C형 간염바이러스의 IRES RNA를 특이적으로 인지하는 리보자임을 개발하였으며 이러한 리보자임에 의해 HCV IRES RNA를 세포사 유발 RNA로 치환함으로써 표적 RNA를 발현하는 세포만 선택적으로 세포사가 유도할 수 있었다(Ryu, K.J., Kim, J.H., and Lee, S.W. Ribozyme-mediated selective induction of new gene activity in hepatitis C virus internal ribosome entry site-expressing cells by targeted trans-splicing. Mol . Ther. 7; 386-395. (2003)).

따라서, 이와 같은 결과는 트랜스-스플라이싱 리보자임에 의해 암 특이 유전자 전사체가 표적이 된 후 그 RNA가 다른 유전자 전사체로 치환되도록 재 프로그램될 수 있음을 시사한다.

지금까지 암 치료법에서 ras를 타겟으로 많은 연구들이 진행되어져 왔는데, RAS 단백질의 발현을 막고자 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 등의 시도나 억제제를 이용하여 RAS의 멤브레인 로컬라이제이션(membrane localization)을 블록하려는 시도들이 보고되었으며, 또한 ras의 기능을 막기 위해 하위단계의 상호작용을 하는 단백질들의 억제제들을 이용한 시도 또한 연구되어왔다.

그러나, 이러한 시도들은 특정 RAS를 표적하거나 변이된 RAS를 특이적으로 제거 또는 억제하지 못하여 정상세포에까지 영향을 미치는 문제점들이 있었으며, 또한 발현되는 RAS의 일부분을 제거 억제하는 것만으로는 암이 치료되지는 않는다는 문제점이 있다. 그리고, 최근 많은 연구가 진행 중인 siRNA를 이용한 Kras G12V의 RNA 간섭은 돌연변이 Kras에 대해 특이적이지만 오프-타겟 효과와 변역반응을 건드리는 점에서 적당하지 않다.

이에, 본 발명자들은 상기와 같은 점을 감안하여 Tetrahymena thermophila의 그룹 I 인트론 리보자임을 이용한 유전자 치료 방법에 대해 예의 연구 노력한 결과, Kras의 12번째 코돈의 단 염기 변이를 선택적으로 인지하는 트랜스-스플라이싱 리보자임을 개발하고, 이러한 리보자임이 in vitro와 in vivo에서 돌연변이 Kras 전사체를 인지, 절단하고 타겟 부위의 하류(down-steam) 부위에 리보자임의 3' 엑손을 연결할 수 있으며, 이때 리보자임의 엑손을 치료 유전자 또는 리포터 유전자로 치환함으로써 암세포를 선택적으로 치료하거나 진단할 수 있음을 확인하고, 이를 토대로 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 단 염기 변이 Ras RNA를 특이적으로 인식하여 치환할 수 있는 트랜스-스플라이싱 그룹 I 리보자임 및 이의 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

단 염기 변이 Ras RNA를 특이적으로 인식하여 치환할 수 있는 트랜스-스플라이싱 그룹 I 리보자임 및 이의 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 상술한 리보자임을 발현하는 벡터 및 이의 용도를 제공한다.

이때, 상기 리보자임은 Kras G12V RNA를 특이적으로 표적하며, 3' 엑손에는 치료 유전자 또는 리포터 유전자를 함유할 수 있다.

본 발명의 리보자임은 단 염기 변이된 유전자 전사체를 정상 유전자 전사체와 구별하여 특이적으로 인식하므로, 이러한 리보자임을 이용하여 돌연변이 전사체를 발현하는 암세포를 특이적으로 치료 및 진단이 가능하다.

도 1은 트랜스-스플라이싱 리보자임 매개 RNA 리프로그램을 나타낸 모식도이다.
도 2는 Kras RNA의 이차 구조를 나타낸 것이다[화살표: Kras의 12번째 코돈].
도 3은 Kras RNA의 모식도와 특이성 트랜스-스플라이싱 리보자임을 나타낸 것이다.
도 4는 in vitro 돌연변이 형성을 통해 Kras 야생형으로부터 제작된 Kras 12V의 구조를 나타낸 것이다.
도 5는 in vitro에서 KRib1, KRib2의 Kras G12V 트랜스-스플라이싱 산물의 분석을 나타낸 것이다[A: RT-PCR 분석, B-C: 서열분석(B: KRib1, C: KRib2)].
도 6은 P1/P10 헬릭스와 안티센스 부위를 변형함으로써 특이성과 효율성이 증대된 트랜스-스플라이싱 리보자임을 나타낸 것이다[A. 변형된 리보자임의 모식도, 화살표: trans-splicing junction; B. 변형된 KRib1 , KRib2의 구조체].
도 7은 in vitro에서 변형된 리보자임의 트랜스-스플라이싱 효율성 및 특이성 분석 결과를 나타낸 것이다[A-B: 트랜스-접합 산물의 RT-PCR 분석, C-D: 트랜스-접합 RT-PCR 산물의 서열분석(C: AS300KRib1, D: AS100KRib2)].
도 8은 트랜스-스플라이싱 리보자임에 의한 트랜스진의 선별적 유도를 확인하기 위한 리포터 에세이 결과를 나타낸 것이다[A: 293 세포에서 리포터 분석을 위한 구조체, B: Kras (야생형 또는 12V) RNA 및 레닐라 루시퍼라제가 함유된 리보자임(KRib1 세트 / KRib2 세트)의 트랜스펙션].
도 9는 트랜스-스플라이싱 리보자임에 의한 트랜스진의 선별적 발현을 확인하기 위한 RT-PCR 분석 결과를 것이다[A: 293 세포에서 리포터 분석을 위한 구조체, B: Kras (wild or 12V) RNA가 함유된 리보자임(KRib1 세트 / KRib2 세트)의 RT-PCR; W: 야생형 Kras, 12V: Kras G12V, IGS: 내부 가이드 염기서열, D)KRib: 불활성 리보자임].
도 10은 Kras G12V를 내생적으로 발현하는 세포주 SW480에서 TK 유전자 유도에 의한 세포 퇴행을 나타낸 것이다[A: SW480 세포에서 TK 분석을 위한 구조체, B: GFP 유전자 함유 AS100KRib2-TK의 트랜스펙션]
도 11은 박테리아에서 상동 재조합에 의한 재조합 아데노바이러스의 세대를 나타낸 것이다[A: 재조합 아데노바이러스 전달 시스템의 모식도, B: 아데노바이러스 리보자임 재조합의 구조체].
도 12는 재조합 Ad-AS300KRib1-TK의 분석을 나타낸 것이다[A. 바이러스 정제 전 PCR에 의한 바이러스 게놈 확인, B: Kras G12V 변이된 SW480에서 바이러스 정제 전 RT-PCR에 의한 Ad-AS300KRib1-TK 발현 확인; TK : Thymidine Kinase, LITR : Left Inverted Terminal Repeat].
도 13은 재조합 Ad-AS100KRib2-TK의 분석을 나타낸 것이다[A. 바이러스 정제 전 PCR에 의한 바이러스 게놈 확인, B: Kras G12V 변이된 SW480에서 바이러스 정제 전 RT-PCR에 의한 Ad-AS100KRib2-TK 발현 확인; TK : Thymidine Kinase, LITR : Left Inverted Terminal Repeat].
도 14는 재조합 Ad-AS100KRib2-LacZ의 분석을 나타낸 것이다[A. 바이러스 정제 전 PCR에 의한 바이러스 게놈 확인, B: Kras G12V 변이된 SW480에서 바이러스 정제 전 RT-PCR에 의한 Ad-AS100KRib2-LacZ 발현 확인; LITR : Left Inverted Terminal Repeat].
도 15는 Kras G12V 변이된 암 세포 SW480에서 아데노바이러스 전달 시스템을 이용한 트랜스-접합 RNA 산물의 분석을 나타낸 것이다.
도 16은 종양세포주에서 아데노바이러스 전달 시스템에 의한 특이적 트랜스-스플라이싱 리보자임의 세포 생존율을 분석한 것이다[A: SW480(KrasG12V)에서 세포 생존율 MTS 분석([left panel: M.O.I dependent / 100uM GCV , right panel GCV dose dependent / virus 150M.O.I), B: CAPAN-1(KrasG12V)에서 세포 생존율 MTS 분석(M.O.I dependent / 100uM GCV), C: HT-29(wild Kras)에서 세포 생존율 MTS 분석(left panel: M.O.I dependent / 100uM GCV , right panel GCV dose dependent / virus 150M.O.I)].
도 17은 이종이식 마우스 모델에서 아데노바이러스 인코딩 Kras G12V-특이적 리보자임의 분석을 나타낸 것이다[A: 복강 내 CAPAN-1(Kras G12V) 종양 모델(n=6 또는 7)에서 Ad-리보자임에 의한 효율적이고 특이적인 종양 퇴행 보임, B: 피하 내 HT-29(wild type Kras) 종양 모델(n=7)에서 Ad-리보자임에 의한 종양 퇴행 없음].

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 리보자임은 암 진행 여부를 진단할 수 있는 라스(Ras) 유전자의 단 염기 변이, 특히 Kras 유전자의 12번째 코돈의 단 염기 변이 Ras RNA를 특이적으로 인식하여 치환할 수 있는 트랜스-스플라이싱 그룹 I 리보자임이다.

도 1은 트랜스-스플라이싱 리보자임 매개 RNA 리프로그램을 나타낸 모식도이다.

도 1을 참조하면, 본 발명의 리보자임은 발암의 원인이 되는 온코진(oncogene)인 Kras의 돌연변이 중 12번째 코돈이 GGT에서 GTT로 변이된 KRas 전사체를 인지, 절단하고 타겟 부위의 하류(down-steam) 부위에 리보자임의 3'엑손을 연결한다. 이때 리보자임의 3' 엑손은 치료 유전자 또는 리포터 유전자를 함유함으로써 돌연변이 KRas 전사체를 보정하여 암세포만을 선택적으로 세포사를 유발하거나 진단하여, 치료 또는 진단할 수 있다.

그룹 I 인트론은 6개의 내부 가이드 염기서열(internal guide sequence; IGS)로 타겟을 인지하게 되는데, 이때 5' 끝의 G·U 와블 염기쌍(wobble base pair)은 필수이다. 따라서, 본 발명의 리보자임은 12번째 코돈이 GTT로 변이된 K-ras 12V를 타겟팅하는데 있어서 35번째 nt인 T와 G·U 와블 염기쌍을 이루도록 내부 가이드 염기서열로 'GCAGCU'을 갖거나, 36번째 nt인 T와 G·U 와블 염기쌍을 이루도록 내부 가이드 염기서열로 'GACAGC'를 갖게 하였다.

여기서, 치료 유전자(therapeutic gene)는 암 세포 내에서 발현되어 치료학적 효과를 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 말한다. 예를 들면, 약제감수성 유전자, 세포사멸 유전자, 세포증식 억제 유전자, 세포독성 유전자, 종양 억제인자 유전자, 항원성 유전자, 항신생 혈관 생성 유전자, 사이토카인 유전자 등이 포함되며, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 약제감수성 유전자(drug-sensitizing gene)는 독성이 없는 전구체(prodrug)를 독성물질로 전환시키는 효소에 대한 유전자로 유전자가 이입된 세포가 사멸하게 되므로 자살 유전자(suicide gene)로도 불린다. 즉, 정상세포에는 독성이 없는 전구체를 전신적으로 투여했을 때 암세포에만 전구체가 독성 대사체(toxic metabolite)로 전환되어 약제에 대한 감수성을 변화시킴으로써 암세포를 파괴시키는 방법이다. 대표적으로 HSV-tk(Herpes simplex virus-thymidine kinase) 유전자와 갠시클로비르(ganciclovir), 대장균의 사이토신 탈아미노효소 (cytosine deaminase, CD) 유전자와 5-플루오로시토신(5-fluorocytosine, 5-FC)가 가능하다.

상기 세포사멸 유전자(proapoptotic gene)는 발현되어 프로그램된 세포 소멸을 유도하는 뉴클레오타이드 서열을 말한다. 당업자에게 공지된 세포사멸 유전자로, p53, 아데노바이러스 E3-11.6K (Ad2 및 Ad5에서 유래) 또는 아데노바이러스 E3-10.5K (Ad에서 유래), 아데노바이러스 E4 유전자, p53 경로 유전자 및 카스파제를 코딩하는 유전자가 포함된다.

상기 세포증식 억제 유전자(cytostatic gene)는 세포 내에서 발현되어 세포 주기 도중에 세포 주기를 정지시키는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 대표적으로 p21, 망막아세포종 유전자, E2F-Rb 융합 단백질 유전자, 사이클린-종속성 카이네이즈 억제인자를 코딩하는 유전자(예를 들면, p16, p15, p18 및 p19), 성장 중지 특이성 호메오박스(growth arrest specific homeobox, GAX) 유전자 (국제특허출원공개 WO 97/16459호 및 WO 96/30385호) 등이 있다.

상기 세포독성 유전자(cytotoxic gene)는 세포 내에서 발현되어 독성 효과를 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 말한다. 일예로, 슈도모나스 외독소(exotoxin), 리신 독소, 디프테리아 독소 등을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 등이 있다.

상기 종양 억제인자 유전자(tumor suppressor gene)는 표적 세포 내에서 발현되어 종양 표현형을 억제할 수 있거나 세포사멸을 유도할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 대표적으로 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor-a, TNF-a), p53 유전자, APC 유전자, DPC-4/Smad4 유전자, BRCA-1 유전자, BRCA-2 유전자, WT-1 유전자, 망막아세포종 유전자(Lee et al., Nature, 329,642, 1987), MMAC-1 유전자, 선종양 폴립증 코일 단백질(adenomatous polyposis coil protein)(Albertsen et al. 미국특허공보 US 5,783,666호), 결손된 결장 종양 (DCC) 유전자, MMSC-2 유전자, NF-1 유전자, 염색체 3p21.3에 위치한 비인후 종양 억제인자 유전자(Cheng et al. Proc.Nat.Acad . Sci., 95,3042-3047, 1998), MTS1 유전자, CDK4 유전자, NF-1 유전자, NF-2 유전자 및 VHL 유전자가 포함된다.

상기 항원성 유전자(antigenic gene)는 표적 세포 내에서 발현되어 면역 시스템에서 인식할 수 있는 세포 표면 항원성 단백질을 생산하는 뉴클레오타이드 서열을 말한다. 당업자에게 공지된 항원성 유전자의 예에는 암태아성 항원 (carcinoembryonic antigen, CEA) 및 p53(Levine, A., 국제특허출원공개 WO 94/02167호)이 포함된다.

상기 사이토카인 유전자(cytokine gene)는 세포 내에서 발현되어 사이토카인을 생성하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 대표적으로 GM-CSF, 인터류킨(IL-1, IL-2, IL-4, IL-12, IL-10, IL-19,IL-20), 인터페론 α, β, γ(인터페론 α-2β) 및 인터페론 α-2α-1과 같은 융합체 등이 포함된다.

상기 항신생혈관 생성 유전자(anti-angiogenic gene)는 발현되어 항-신생혈관 생성 인자를 세포밖으로 방출하는 뉴클레오타이드 서열을 말한다. 그 예로 안지오스타틴, 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 억제 인자, 엔도스타틴 등이 포함된다.

또한, 본 발명에서는 상술한 리보자임 활성을 통해 타겟 부위의 하류(down-steam) 부위에 리포터 유전자를 접합할 수 있다. 이렇게 접합된 리포터 유전자는 리포터 단백질로 발현되므로, 발현된 리포터 단백질의 활성 또는 양을 측정함으로써 암 세포를 진단할 수 있다.

이때 리포터 유전자는 본 발명이 속하는 분야에서 공지된 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 LacZ, 클로람페니콜 아세틸 전이효소(CAT: chloramphenicol acetyl transferase), 레닐라 루시퍼라제(Renila luciferase), 반딧불이(firefly) 루시퍼라아제, 적색형광단백질(RFP), 녹색형광단백질(GFP), 분비성 태반 알칼라인 포스파타아제(secreted placental alkaline phosphatase, SEAP) 또는 HSV-tk(Herpes simplex virus-thymidine kinase)를 암호화하는 유전자를 사용한다. 이 중 활성 분석의 편이성 및 민감도 면에서 LacZ를 사용하는 것이 바람직하다.

이러한 리포터 단백질들의 활성은 하기와 같이 당업자에게 공지되어 있는 방법을 사용하여 측정할 수 있다:

반딧불이 루시퍼라아제(de Wet J. et al., Mol. Cell Biol., 7, 725-737, 1987 참조), 레닐라 루시퍼라아제([Lorenz W.W. et al., PNAS 88, 4438-42, 1991) 참조), 클로람페니콜 아세틸 전이효소(Gorman C. et al.,Mol. Cell Biol., 2, 1044-1051, 1982 참조), LacZ(Hall C.V. et al., J. Mol. Appl . Genet ., 2,101-109, 1983 참조), 인간 성장 호르몬(Selden R. et al.., Mol. Cell Biol., 6, 3173-3179, 1986 참조), 녹색 형광 단백질(Chalfie M. et al., Science, 263, 802-805, 1994 참조) 및 분비성 태반 알칼린 포스파타아제(Berger, J. et al., Gene, 66, 1-10, 1988 참조). 또한, 티미딘 키나제(thymidine kinase)를 리포터 단백질로 한 경우 PET(positron emission tomography) 이미징 법을 이용할 수 있다.

본 발명의 실시예 1에 따르면, 발암의 원인이 되는 온코진(oncogene)인 Kras의 돌연변이 중 12번째 코돈이 GGT에서 GTT로 변이된 Kras를 타겟으로 하여 KRib1, KRib2 트랜스-스플라이싱 리보자임을 제작하였다.

이때 12번째 코돈이 GTT로 변이된 K-ras 12V를 타겟팅하는데 있어서 35번째 nt인 T와 G·U 와블 염기쌍을 이루도록 디자인한 KRib1, 36번째 nt인 T와 G·U 와블 염기쌍을 이루도록 디자인한 KRib2를 제작하였다.

본 발명의 실시예 2에 따르면, 제작된 리보자임을 in vitro에서 트랜스-스플라이싱 반응 실험을 수행하였고, Kras G12V를 타겟팅하는 리보자임 KRib1, KRib2이 특이적으로 Kras G12V를 인지하여 절단하고 리보자임의 3' 엑손을 정확한 타겟 부위에 연결한다는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명의 실시예 3에 따르면, IGS만 갖는 리보자임과 효율성을 높이기 위한 P1, P10, AS(안티센스) 구조를 추가한 변형(modification) 리보자임을 제작하고, 이들을 가지고 in vitro 트랜스-스플라이싱 반응을 수행하였다. 그 결과, P1, P10, AS가 있는 리보자임이 특이성과 효율성 면에서 우수하다는 것을 확인하였다.

본 발명의 실시예 4에 따르면, 세포 내에서도 트랜스-접합 산물 즉, 트랜스진의 발현이 유도되는지를 리포터 유전자를 사용하여 리포터 분석을 수행하였고, 그 결과 세포주에서 루시퍼라제의 발현을 확인하여, 세포 내에서도 본 발명의 리보자임이 특이적으로 트랜스-스플라이싱을 일으키며, 트랜스진의 발현이 유도된다는 것을 알 수 있었다.

또한, 트랜스-스플라이싱을 RNA 레벨에서 보기 위해 293 세포에 리보자임들과 Kras(G12V, 야생형) RNA를 코-트랜스펙션시킨 후 RT-PCR을 했다. 그 결과 1 세트에서 AS300KRib1-F.luc과 2 세트에서 AS100KRib2-F.luc이 in vitro 트랜스-스플라이싱 분석을 수행했던 것과 일치하는 결과인 트랜스-스플라이싱 밴드라고 예상 되어지는 크기의 밴드가 나왔다. 이 밴드가 비특이성 밴드가 아닌 트랜스-스플라이싱 산물임을 확인하기 위해 시퀀싱을 하여 Kras G12V의 타겟 부위에서 정확하게 트랜스-스플라이싱이 일어남을 확인하였다.

본 발명의 실시예 5에 따르면, 리보자임의 3'엑손에 TK 유전자(HSV-TK(herpes simplex virus thymidine kinase))를 도입하는 클로닝된 pAVQ CMV AS300KRib1-TK와 pAVQ CMV AS100KRib2-TK들 중 AS100KRib2-TK를 가지고 TK 분석을 통해 세포 생존력을 관찰하였다. TK 분석 결과, HT-29 세포에서는 GCV를 처리하거나 미처리 시에 GFP의 발광에는 어떠한 변화도 없는 것으로 보아 세포의 생존력에 영향을 끼치지 않음을 볼 수가 있었다.

그러나, SW480 세포에서는 AS100KRib2-TK를 트랜스펙션한 세포에서 GCV를 처리하였을 때 GCV를 처리하지 않은 세포에 비해 GFP의 발광 수가 감소한 것을 볼 수가 있었다.

한편, 유전자 치료에서 중요시 되어야 할 점은 재조합 유전자를 세포에 전달시키는 방법이다.

일반적인 방법으로 크게 물리화학적인 방법으로 재조합 DNA를 직접 투여하는 방법과 생물학적인 방법으로 재조합 바이러스 벡터를 들 수가 있다. DNA를 직접 투여하는 방법은 간단하기 때문에 위험성이 낮고 경제적이라는 장점을 가지고 있지만, 재조합 DNA의 전달률이 낮은 단점을 가지고 있다.

이에 본 발명은 상기 리보자임의 세포 전달 방법으로서 위험성도 적고 DNA 전달율도 우수한 아데노 바이러스 전달 시스템을 포함한다.

아데노바이러스는 지름이 약 70~80 nm로 크며 내부는 20~26×10⁶ 달톤의 dsDNA를 가진 DNA 바이러스이다. 게놈의 양끝에는 ITR(inverted terminal repeat)이 있고, 이곳에서 바이러스 복제가 시작된다. 아데노바이러스의 게놈은 E1-E4의 초기부위, L1-L5의 후기부위로 구분된다.

아데노바이러스 벡터의 장점은 첫째, 인체 내 종양 발생에 무관한 바이러스로 알려져 있고, 오랜 바이러스 백신의 개발로 위험성이 낮은 바이러스이다. 둘째, 높은 역가의 바이러스를 제조할 수 있다. 셋째, 감수분열이 끝난 세포와 거의 모든 인체의 세포에 감염시킬 수 있다. 넷째, 아데노바이러스 벡터에 10kb에 가까운 DNA를 삽입할 수 있다.

단점은 첫째, 아데노바이러스가 숙주의 게놈에 통합하지 못함으로 영구적인 효과를 보지 못한다. 둘째, 바이러스에 대한 항원·항체반응으로 치료효과가 짧다. 셋째, 많은 적가 투여 시 부작용을 고려하지 않을 수 없다.

본 발명의 실시예 6에 따르면, BJ5183이라는 박테리아에서 리보자임 트랜스퍼 벡터와 pAdenovactor ΔE1/E3 백본 벡터의 코-트랜스포메이션을 하여 상동성 재조합을 시켜 재조합 리보자임을 만들었고, 이를 293 세포에 트랜스펙션함으로써 재조합 리보자임 바이러스를 얻게 되었다.

이렇게 얻은 재조합 리보자임 바이러스는 293 세포에 감염하여 증폭하는데 증폭하는 과정에서 재조합 리보자임 바이러스가 제대로 만들어지고 있는지 확인하기 위해서 바이러스 게놈 DNA를 추출하여 리보자임의 TK 유전자와 바이러스의 LITR을 PCR을 통해 확인하였다.

또한, SW480 세포에 감염하여 RNA 레벨에서도 TK 유전자를 RT-PCR을 통해 확인하였다. 이렇게 확인된 재조합 리보자임 바이러스들은 Vivapure^® AdenoPACK^TM 100 RT를 사용하여 정제하였다.

이렇게 정제된 Ad-AS300KRib1-TK와 Ad-AS100KRib2-TK 바이러스들은 종양 세포에 감염하여 종양 세포에서 Ad-리보자임의 특이성과 효울성을 보았다. SW480 세포에 감염한 결과 Ad-AS300KRib1-TK와 Ad-AS100KRib2-TK에서 트랜스-스플라이싱 밴드를 보았고, 이것을 시퀀싱을 통해 타겟 부위에서 일어났는지를 확인하였다.

본 발명의 실시예 7에 따르면, Ad-리보자임들이 특이적으로 트랜스-스플라이싱을 일으켜 트랜스진을 유도함을 보기 위해서 MTS 분석을 진행하였다. 그 결과, Kras G12V 변이된 세포주인 SW480 세포와 CAPAN-1 세포에서는 대조군과 비교하였을 때 Ad-리보자임들만이 세포사가 유도됨을 볼 수 있었고, Kras 야생형인 HT-29 세포에서는 대조군과 비교하여 세포사가 일어나지 않음을 관찰하였다. 이는 Ad-리보자임이 Kras G12V를 특이적으로 인지하여 트랜스-스플라이싱하고 트랜스진을 유도하여 특이적으로 세포사를 일으킬 수 있음을 나타낸다.

본 발명의 실시예 8에 따르면, Ad-리보자임의 in vivo에서 특이성과 효율성을 알아보기 위해 이종이식 마우스 모델(xenograft mice model) 실험을 수행하였다.

그 결과, Kras 변이된 종양에서는 대조군과 비교하여 Ad-AS100KRib2-TK의 종양 무게가 감소하였다. 그러나, Kras 야생형 종양의 경우에는 음성 대조군인 Ad-CMV-LacZ와 양성 대조군인 Ad-CMV-TK와 비교했을 때, Ad-리보자임들이 Kras 야생형 종양에서는 작용을 하지 않는 것을 확인할 수 있었다.

이러한 결과는 본 발명에 따른 Ad-리보자임이 Kras G12V만을 발현하는 종양을 특이적으로 퇴행(regression)시킬 수 있다는 것을 보여준다.

이와 같이 본 발명의 리보자임은 암 특이적 유전자를 치료 유전자로 보정하여 유전자 발현을 유도한다. 그 결과 암 세포만을 선택적으로 세포사를 유발할 수 있다.

따라서, 본 발명에서는 상기 리보자임을 유효성분으로 포함하는 항암용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 항암용 약학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여가 바람직하고, 예컨대 정맥내 투여, 복강내 투여, 종양내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명 항암용 약학적 조성물의 투여량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 단독으로, 또는 외과적 수술요법 등의 보조 치료 방법들과 병행하여 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 화학 요법제(chemotherapeutic agent)는 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴 carboplatin), 프로카르바진(procarbazine), 메클로레타민(mechlorethamine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드 (ifosfamide), 멜팔란(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 비술판(bisulfan), 니트로소우레아 (nitrosourea), 디악티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 블레오마이신(bleomycin), 플리코마이신(plicomycin), 마이토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 탁목시펜(tamoxifen), 택솔 (taxol), 트랜스플라티눔(transplatinum), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 빈크리스틴(vincristin), 빈블라스틴(vinblastin) 및 메토트렉세이트(methotrexate) 등을 포함한다. 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 방사 요법은 X-선 조사 및 -선 조사 등이다.

아울러, 본 발명의 리보자임은 암 특이적 유전자에 리포터 유전자를 접합하여 암세포만을 선택적으로 진단할 수 있다.

따라서, 본 발명에서는 상기 리보자임을 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.

[실시예]

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나. 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: Kras G12V RNA 를 특이적으로 인지할 수 있는 트랜스- 스플라이싱 그룹 Ｉ 리보자임 제작

1. K- ras 타겟팅 리보자임의 디자인

리보자임의 내부 가이드 염기서열(Internal guide sequence; IGS)이 타겟 주형 RNA를 인식하여 트랜스-스플라이싱 기작을 일으키는데 있어서 타겟 RNA의 2차 구조가 영향을 미치게 되므로 mfold program(RNA 2차 structure form program)을 이용하여 2차 구조를 예측하였으며, 타겟하려고 하는 12번 코돈 부위가 리보자임이 트랜스-스플라이싱을 일으키는데 용이한 구조인지를 확인하였다.

기존 맵핑 방법을 통하여 리보자임이 타겟팅 하기에 적합한 부분을 찾아 분석한 결과와 비교하여 볼 때 Kras의 12번째 코돈이 Gly에서 Val으로 단 염기 변이가 일어난 경우의 이차구조가 타겟팅 가능한 구조라는 것을 확인하고 특이 리보자임을 제작하기로 결정하였다.

Kras의 12번째 코돈이 GGT에서 GTT로 치환된 변이를 타겟팅하는 리보자임의 내부 가이드 염기서열(internal guide sequence; IGS)을 디자인하였다. 이때, IGS가 변이된 단 염기와 G·U 염기쌍을 이루게 한 KRib1(GCAGCT)과 변이된 다음의 염기와 G·U 염기쌍을 이루게 한 KRib2(GACAGC) 두 가지의 리보자임을 디자인하였다(도 3 참조).

2. K- ras 12V(기질) 구조체 제작

2-1. In vitro 돌연변이 형성 및 클로닝

도 4는 in vitro 돌연변이 형성을 통해 Kras 야생형으로부터 제작된 Kras 12V의 구조를 나타낸 것이다.

타겟 구조체를 만들기 위하여 GeneEditor in vitro 부위 유도 돌연변이 형성 시스템(site-Directed mutagenesis System, Promega)를 사용하여 Kras 야생형으로부터 12번째 코돈이 발린으로 치환된 Kras 12V를 제작하였다.

서열번호 1의 프라이머(표 1 참조)를 사용하였으며, 이를 pUC19에 5' BamHI, 3' HindIII로 클로닝하였다.

서열번호	프라이머 서열
1	5'-GTTGGAGCTGGTGGCGTAGGC-3	Kras wild
2	5'-TAATACGACTCACTA-3'	Kras 5' BamHI
3	5'-GGGTAATACGACTCACTATAGGAGGTAAAAGTTATCAGGCATGC-3'	kras rib T7-5'
4	5'-GGGTAATACGACTCACTATAGACAGCAAAAGTTATCAGGCATGC-3'	RY-PCR
5	5'-TGTAAAACGACGGCCAGTG-3	RY-RT
6	5'-CGATGATCACGAAGACGCCAAAAACATA-3'	kras p1p10-rib1-5
7	5'-CGACATGATCACGAAGACGCCAAAAACATA-3'	kras p1p10-rib2-5
8	5'-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTATTACAATTTGGACTTT-3'	krib 3'
9	5'-GGGAAGCTTGCAAGAGTGCCTTGACGA-3	kras as 5'
10	5'-GGGAAGGCTTCCATCAATTACTACTTGC-3	kras as 3'
11	5'-GGGTAATACGACTCACTATAGGGCTACTAGGACCATAGGTA-3'	kras as300 5'
12	5'-CGCGGATCCACTGAATATAAACTTGTGGTA-3'	kras t/s BamHI5'
13	5'-CCCAAGCTTGCCCAACACCGGCATAAAG-3	cell t/s luci 3' nest
14	5'-GTGATCATCGCGATGATCACGCTTCGTACCCCTGCCAT-3'	TK 5' NruI 1set
15	5'-GTGATCATCGCGACATGATCACGCTTCGTACCCCTGCCAT-3'	TK 5' NruI 2setI
16	5'-AAGGAAAAAATTCGAATTAGCCTCCCCCAT-3'	3' TK BstBI
17	5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'	T7-R-Primer
18	5'-CCTTTCCCGCAATTTGACGGTCTT-3'	IGS rev seq
19	5'-CGGGAATTCGTGGTAATGACAAGC-3'	5' TK stable
20	5'-CGGGGATCCATCCAGGATAAAGACGTGCATGGG-3'	3' TK stable
21	5'-GGAATTCTGGAGTTTGTGACGTGGCG-3'	5' LITR EcoRI
22	5'-GCTCTAGATGGCCAAATCTTACTCGGTTACGC-3'	3' LITR XbaI
23	5'-GGAATTCATGGTCGTTTTACAACGTCGTG-3'	5' viral LacZ
24	5'-GGGAAGCTTCGGATTGACCGTAATGGGA-3'	cancer.lacZ-3

2-1-1. 벡터와 삽입물의 제조

Kras PCR 산물 DNA 1μg을 BamHI(0.3u)/ HindⅢ(0.3u)와 10X B 버퍼 (Roche)와 20 ㎕까지의 dH₂O 37 ℃에서 3시간 동안 반응시켜 2.5% TBE 겔에 전기영동을 하여 크기를 확인하였다. 그 다음 3μg의 pUC19 벡터도 동일하게 BamHI(0.3u)/ HindⅢ(0.3u) 처리하여 잘린 것을 확인한 후 페놀 & EtOH 침전 반응을 시킨 후 정량을 하였다.

2-1-2. DNA 용출( insert )

겔 추출(DNA)(Omega bio tec. E.Z.N.A Kit)를 이용하여 DNA 크기에 맞는 농도로 0.5 X TAE 아가로스 겔을 만들어 DNA를 로딩한 다음 롱 웨이브 UV로 밴드를 확인한 후 원하는 밴드 부분만을 정확히 잘라냈다.

각각의 겔 조각을 1.5㎕ 튜브에 50 ~ 300 ㎎이 되도록 넣고 용출 버퍼 0.5 ㎕씩을 넣고 60 ℃에서 10분간 완전히 녹이는데, 200㎎ 이상일 경우 10분 이상 녹였다. 겔을 완전히 녹인 후 검체 튜브에 겔 추출 컬럼을 끼운 후 녹은 용액을 컬럼에 옮겨 13000 rpm으로 60초간 돌린 후 가라앉은 용액을 버리고 워쉬Ⅰ버퍼 0.5 ㎕ 을 각기 컬럼에 넣고 60초간 돌린 후 다시 걸러진 버퍼를 버렸다.

컬럼을 새로운 1.5㎕ 튜브에 옮겨 끼운 후 dH₂O 30㎕를 넣고 1분간 보관 후 2분 정도 원심분리를 돌려 DNA를 얻어낸 후 정량 하여 -20 ℃에 보관하였다.

2-1-3. 연결

효소 처리된 pUC19과 삽입물(trans-splicing product)을 각각 벡터 : 삽입물(1:3) 비율로 T₄리가아제(Roche)로 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다.

2-1-4. 형질전환

연결 산물을 대장균(JM109)에 형질전환하기 위해 수용성 세포(competent cell)로 제작된 JM109에 연결 산물 1㎕를 넣고 전기형질전환장치(electrophorator)를 25μF, 1.8Kv, 펄스 조절기(pulse controller) 400Ω으로 셋팅하여 형질전환한 후 1ml 후레쉬 배지에 넣어 잘 섞은 후 1시간 동안 배양하였다.

X-gal, IPTG를 넣어 만든 아가 플레이트에 골고루 깐 다음 37℃ 배양기에 16시간 동안 배양시킨 후 컬러 스크리닝을 통하여 백색 콜로니를 선택적으로 5ml 암피실린이 포함된 LB 배지에 접종하여 16시간 동안 37℃ 흔들면서 배양하였다.

2-2. 염기서열 확인

In vitro 돌연변이 형성을 통하여 제작된 Kras 12V의 염기서열을 확인하였다. 종결자 준비 반응 혼합물(terminator ready reaction mixture, PE applied Biosystems) 3㎕, 정량된 DNA 100ng, 서열번호 2의 프라이머(표 1 참조) 3.2pmol을 총 10㎕ 반응으로 (96℃-10', 50℃-5', 60℃-4')× 25 사이클 반응하였다.

이후 정제를 위하여 dH₂O 40㎕ 첨가한 다음 3M NaoAC(1/10 volume), 100% EtOH(2 volume)를 넣고 보르텍스 후 13000 rpm, 4℃에서 30분간 원심분리하고 70% EtOH(400㎕)로 세척한 다음 EtOH를 제거하고 speed-vacuum으로 말린 후 주형 억제 시약(template suppression reagent) 15㎕에 녹였다. 이어서 보르텍스 & 스핀 다운 후 시퀀싱 튜브에 옮겨 자동 시퀀서(ABI 310 Genetic Analyzer)로 시퀀싱을 시행하였다.

3. 기질 RNA (K- ras )의 제조

3-1. K- ras 기질 제조

기질로 이용될 Kras 12V와 대조군으로 사용될 Kras 야생형의 DNA를 Hind III로 잘라서 페놀 추출, EtoH 침전하여 준비하였다.

3-2. 기질 전사

상기 2-1과 같은 방법으로 제조된 DNA를 전사를 통하여 RNA를 만들게 되는데 DNA 주형(1㎍), 1x 전사 버퍼, 10mM DTT (Sigma), 0.5mM ATP, GTP, CTP, UTP (Roche), 80U RNase 억제제(Kosco), T7 RNA 중합효소(Takara), DEPC-H₂O를 100㎕까지 넣어서 섞은 후 37℃에서 3시간동안 반응시켰다.

이를 위해 5'프라이머 제작 시에 T7 프로모터 부분을 붙이게 되며, 이후 남아있는 DNA를 제거하기 위해 5U DNase I(promega)를 37℃에서 30분간 처리하여 DNA 주형을 완전히 제거한 후 페놀 추출(PH7.0), 에탄올 침전을 통하여 RNA만을 순수 분리 정제한 후 TE 버퍼(10mM Tris-Hcl PH7.5, 1mM EDTA)에 농축시켜 놓았다.

4. KRib1 , KRib2 ( Kras targeting ribozyme ) 제조

4-1. 리보자임 기질 제조

Kras의 12번 코돈을 인지하여 트랜스-스플라이싱할 수 있는 내부 가이드 염기서열(Internal guide sequence;IGS)를 가진 리보자임을 제작하기 위해 서열번호 3, 4의 프라이머(표 1 참조)를 사용하여 pt7L21로부터 PCR하여 KRib1, KRib2를 제작하였다. 또한, d)pt7L21로부터 PCR을 통하여 촉매의 코어(catalytic core)가 제거된 d)KRib1, d)KRib2를 제작하여 대조군으로 사용하였다.

4-2. 리보자임 전사

기질과 같은 방법으로 전사를 하는데, 이때 dNTP 양을 1.5mM로 늘려서 자가-스플라이싱을 최대한 방지하며,1x 스플라이싱 버퍼(40Mm Tris (ph7.5), 5mM MgCl₂, 10mM DTT, 4mM spermidin)를 사용하였다.

5. RNA 용출

원하는 RNA만을 얻기 위해, RNA 용액의 1/2 볼륨의 변성 RNA 로딩 염료(10㎕ Formamide, 10mM EDTA, 0.01% Bromophenol blue, 0.01% Xylenecyanol)를 섞은 후 95℃에서 5분간 처리하여 변성시켰다.

변성된 RNA를 우레아가 들어있는 6% 폴리아크릴아마이드 겔에 로딩하여 0.5x TBE 버퍼에서 40분간 230V로 전기영동한 후 원하는 크기의 RNA 밴드 부분의 겔을 잘라서 용출 버퍼(0.6M Ammonium acetate, 1mM EDTA, 0.2% SDS) 400㎕에 넣어서 37 ℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 그 다음 젤은 스핀 다운으로 가라앉은 후 그 상층액을 따서 페놀 추출과 EtOH 침전을 통하여 정제하고 TE 버퍼에 최종적으로 농축한 후 UV-분광광도계를 이용하여 RNA를 정량하였다. 이때 리보자임은 비-자가-스플라이싱 산물만을 용출하여 UV-분광광도계를 용출하여 정량하였다.

6. 페놀 추출 및 에탄올 침전

용액과 동량의 페놀 : 클로로포름 : 이소아밀알콜 (25:24:1)을 넣고 보르텍스를 이용하여 완전히 섞어준 뒤 4℃ 10000ⅹg에서 10분간 원심분리하였다. 상층 액만을 조심스럽게 1.5ml 튜브에 옮긴 후 2배 부피의 100% EtOH(-70℃)과 1/10 볼륨의 3M 소듐 아세테이트를 넣어 잘 섞어준 뒤 -70℃에서 40분간 넣어주었다.

4℃에서 30분간 원심분리 후 상층액을 조심스럽게 제거하고 70% EtOH (-70℃) 400㎕를 넣어 골고루 벽면을 씻은 다음 10분간 원심분리를 한 후 EtOH을 모두 제거한 후 10초 정도 말리고 TE 버퍼에 녹였다.

실시예 2: In vitro 에서 트랜스- 스플라이싱 리보자임 KRib1 , KRib2 의 특이성 확인

1. 트랜스- 스플라이싱 반응

상기 실시예 1에서 디자인한 리보자임 KRib1, KRib2의 특이성을 확인하기 위하여, 먼저 시험관 상에서 트랜스-스플라이싱 반응을 하였다. In vitro 돌연변이 형성을 통하여 제작된 Kras G12V RNA(10nM)와 KRib1과 KRib2 리보자임(50nM)의 RNA를 시험관 내에서 트랜스-스플라이싱 반응을 하였다.

특이 IGS를 갖는 리보자임(KRib1, KRib2)과 Kras의 트랜스-스플라이싱 반응을 위하여 기질 RNA와 리보자임의 절대량을 10nΜ : 50nΜ로 정하였으며 기질 RNA(2x reaction buffer, substrate RNA, 0.2mM dGTP, DEPC-H₂O)는 37℃에서 미리 5분간 예열시켰다. 리보자임 RNA(2x reaction buffer, Ribozyme RNA, DEPC-H₂O)는 50℃에서 5분간 반응시킨 후 37℃에서 2분간 반응시킴으로써 올바른 3차 구조 형성을 유도한 후 두 반응물을 잘 섞어준 다음 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다.

2. 역전사

트랜스-스플라이싱된 RNA 전사체의 3' 엑손(Ribozyme) 부분에 결합하는 서열번호 5의 3'프라이머(표 1 참조)와 5x RT 버퍼, 트랜스-스플라이싱 산물(10㎕)를 잘 섞은 다음 65℃에서 5분간 반응시킨 다음 상온에서 10분간 보관하였다.

상온 보관 후 0.5mM dNTP(BMS)와 MMLV 역전사효소 1U(Promega)와 DEPC dH₂0로 총 50㎕를 만들어 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 95℃에서 5분간 반응시켜 MMLV-RT의 활성을 완전히 제거 후 4℃에서 보관하였다.

3. PCR

RT 반응을 마친 반응물(20㎕)을 서열번호 2와 5의 프라이머(표 1 참조)를 사용하여 MgCl₂ 50mM, 5% DMSO를 넣고(63℃ 20 sec annealing/ 25 cycle) PCR을 수행하였다.

4. 클로닝 ( RT - PCR 산물) 및 염기서열 분석

pUC19에 RT-PCR 산물 클로닝(상기 실시예 1의 2-1과 동일)을 하였으며, 서열번호 2의 프라이머(표 1 참조)(3.2 pmol)를 사용하여 시퀀싱(상기 실시예 2의 2-2와 동일)을 수행하였다.

도 5는 in vitro에서 KRib1, KRib2의 Kras G12V 트랜스-스플라이싱 산물의 분석을 나타낸 것이다[A: RT-PCR 분석, B-C: 서열분석(B: KRib1, C: KRib2)].

도 5A를 참조하면, Kras에 결합하는 5' 프라이머와 리보자임 3' 엑손에 결합하는 3' 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행한 결과, KRib1과 KRib2와 Kras G12V RNA를 반응시킨 샘플에서만 트랜스-스플라이싱이 일어났을 때 나올 수 있는 산물 크기의 밴드를 얻었다.

반면, 촉매성 코어(catalytic core) 부위를 제거한 불활성 리보자임인 (d)KRib1, d)KRib2)과 Kras G12V RNA를 반응시켰을 때 혹은 KRib1과 KRib2와 야생형 Kras RNA만을 각각 반응시켰을 때는 어떠한 산물도 볼 수 없었다.

또한, 도 5B 및 5C를 참조하면, PCR 산물을 클로닝 후 시퀀싱한 결과, 정확하게 타겟 부위에서 트랜스-스플라이싱이 일어나 5' 에는 Kras의 염기서열이 존재하고 3' 쪽으로는 리보자임의 3' 엑손 염기서열이 존재하는 것을 확인할 수 있었다.

이러한 결과를 통해 Kras G12V를 타겟팅하는 리보자임인 KRib1과 KRib2가 in vitro에서 특이적으로 Kras G12V를 인지하여 절단하고 리보자임의 3' 엑손을 정확한 타겟 부위에 연결한다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 변형 정도에 따른 트랜스- 스플라이싱 리보자임의 in vitro 에서 효율성 및 특이성 확인

타겟에 대한 특이적인 6개의 염기서열인 IGS 외에 P1/ P10 헬릭스와 안티센스 부위를 변형(modify)함으로써 트랜스-스플라이싱 리보자임의 특이성과 효율성을 높일 수 있는데, 이러한 강화된 리보자임을 디자인함에 있어서 각 부위를 점차 변형 정도에 따른 특이성과 효율성을 확인하고자 하였다.

도 6은 P1/P10 헬릭스와 안티센스 부위를 변형함으로써 특이성과 효율성이 증대된 트랜스-스플라이싱 리보자임을 나타낸 것이다.

도 6을 참조하면, IGS만을 가진 리보자임, P1/ P10 구조를 더해준 리보자임, 안티센스 100개 또는 300개를 가진 리보자임 이렇게 각 부위를 점차 더해준 변형된 리보자임 RNA 시리즈를 KRib1과 KRib2 두 종류의 리보자임에 대하여 각각 제조하였다.

1. 특이성 증가시킨 특이성 리보자임 제작

리보자임의 IGS에서 3' 엑손 부위를 서열번호 6의 프라이머와 서열번호 8의 프라이머/서열번호 7의 프라이머와 서열번호 8의 프라이머(표 1 참조)를 이용하여 PCR 한 후 Hind III와 Nru I으로 SEAP 프로모터 벡터에 클로닝하였다.

상기 벡터에 클로닝된 리보자임 뒤에 Nru I과 Xba I으로 루시퍼라제를 클로닝하였는데, 이때 3' 엑손인 루시퍼라제가 Kras에 연결되어 트랜스진의 단백질이 올바르게 발현되도록 루시퍼라제 유전자 앞에 여분의 뉴클레오타이드를 더하여 프레임을 맞춰 주었다.

그 후 Kras 서열상에서 IGS에 의해 인지되는 곳으로부터 3' 말단 쪽으로 상보적인 100nt, 300nt의 안티센스 스트랜드를 서열번호 9의 프라이머와 서열번호 10의 프라이머/ 서열번호 9의 프라이머와 서열번호 11의 프라이머(표 1 참조)를 이용하여 PCR을 수행하였으며, 이를 SEAP KRib 1, SEAP KRib 2 구조체의 IGS 앞에 Hind III 효소 부위로 클로닝하였다.

이렇게 완성된 SEAP-KRib 1, SEAP KRib 2, SEAP AS100 KRib1, SEAP AS100 KRib2, SEAP AS300 KRib1, SEAP AS300 KRib2를 pAV 3.0 벡터로 BamH I과 Not I 부위를 이용하여 각각 클로닝하는 작업을 통하여 CMV 프로모터를 가진 리보자임 구조체 셋트를 제작하였다.

2. 트랜스- 스플라이싱 리보자임의 in vitro 에서 효율성 및 특이성 확인

상기에서 제작된 각각의 리보자임들(50nM)을 in vitro 상에서 Kras 야생형 RNA 또는 Kras G12V RNA(10nM)와 트랜스-스플라이싱 반응하였으며 Kras에 결합하는 5' 프라이머와 리보자임 3' 엑손에 결합하는 3' 프라이머를 이용하여 상기 실시예 2와 같이 RT-PCR을 수행하였다.

도 7은 in vitro에서 변형된 리보자임의 트랜스-스플라이싱 효율성 및 특이성 분석 결과를 나타낸 것이다.

도 7A 및 7B를 참조하면, KRib1 또는 KRib2와 Kras G12V RNA를 반응시킨 샘플에서 트랜스-스플라이싱이 일어났을 때 나올 수 있는 산물 크기의 밴드를 얻었다.

in vitro 상에서의 변형 정도에 따른 KRib1의 2 셋트의 트랜스-스플라이싱 반응 실험의 결과 KRib1 셋트의 경우 안티센스 100개를 갖는 리보자임 보다 300개를 갖는 리보자임의 트랜스-접합(t/s) 산물 양이 많음을 PCR로 확인할 수 있었으며, KRib2의 경우 안티센스 100개를 갖는 리보자임과 300개를 갖는 리보자임의 트랜스-접합 산물 양이 같음을 PCR로 확인할 수 있었다.

또한, 변형된 정도에 따라 Kras 야생형 RNA와 트랜스-스플라이싱한 샘플에서도 트랜스-스플라이싱 산물과 같은 크기의 PCR 밴드가 흐리게 나왔으나, 이를 클로닝 후 시퀀싱한 결과 트랜스-스플라이싱되지 않은 리보자임이 PCR되었거나 기질이 PCR된 비특이적 PCR 산물임을 확인할 수 있었다.

그리고, 촉매성 코어 부위를 제거한 불활성 리보자임인 (d)KRib1, d)KRib2)과 Kras RNA를 반응시켰을 때 혹은 리보자임과 야행형 Kras RNA만을 각각 반응시켰을 때는 어떠한 산물도 볼 수 없었다.

도 7C 및 도 7D를 참조하면, PCR 산물을 클로닝 후 시퀀싱한 결과, 정확하게 타겟 부위에서 트랜스-스플라이싱이 일어나 5' 에는 Kras의 염기서열이 존재하고 3' 쪽으로는 리보자임의 3' 엑손에 루시퍼라제(Luciferase) 염기서열이 존재하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 세포주에서의 트랜스- 스플라이싱 특이성, 효율성 확인

특이성 리보자임이 세포내에서 단 염기 변이된 Kras G12V RNA를 표적으로 리보자임에 부착된 특정유전자를 트랜스-스플라이싱하는지 알아보기 위해서, Kras 야생형을 발현하는 293 세포에서 3' 엑손에 반딧불의 루시퍼라제를 태깅한 리보자임을 디자인하고 리포터 에세이를 수행하였다.

루시퍼라제를 태깅한 리보자임은 12번째 코돈이 Gly(ggt)에서 Val(gtt)로 단 염기 변이된 Kras G12V RNA를 타겟팅하는데, 이때 IGS를 변이된 단 염기와 G·U 염기쌍을 이루게 한 KRib1(GCAGCT) 1 셋트와 변이된 다음의 염기와 G·U 염기쌍을 이루게 한 KRib2(GACAGC) 2 셋트 두 가지의 리보자임을 디자인하였다.

이렇게 디자인된 1 셋트와 2 셋트 리보자임들은 pAV3.0 벡터에 AS100KRib/ AS300KRib의 1 셋트, 2 셋트의 구조체, pAV AS100 KRib1, pAV as300 KRib1의 구조체를 제작하였다. 클로닝된 리보자임들을 이용하여 Kras 야생형을 발현하는 293 세포에서 트랜스-접합 산물 분석을 수행하였다. 기질인 Kras G12V는 RNA 상태로, 리보자임은 DNA 플라스미드 상태로 코-트랜스펙션시켰다.

1. 세포 배양

293 세포는 10% FBS(fetal bovine serum), DMEM(Dulbecco's modified eagle medium; HyClone), 0.5% antibiotic/antimycotic solution이 첨가된 배지로 37℃, 5% CO₂배양기에서 배양하였으며, 3~4일마다 계대배양하였다.

이때, 1X PBS(8g NaCl, 0.2g KCl, 1.14g Na₂HPO₄, 0.2g KH₄PO₄/L)로 세포를 씻어준 후, 1x 트립신/EDTA(8.2g NaCl, 0.2g KCl, 1.14g Na₂HPO₄, 0.2g KH₂PO₄, 0.029g Na₂EDTA·dH₂0, 1g trypsin, pH 7.35/L) 1㎖를 처리하여 CO₂ 배양기에 1~3분간 두었다. 배지 9ml로 트립신을 불활성화시킨 뒤 1500×g로 2분 30초간 원심분리하여 상청액을 제거하고 배지로 재현탁하였다. 새 100mm 디쉬에 이중 1/3을 씨딩하여 배양하였다.

2. DMRIE -C에 의한 DNA , RNA 코트랜스펙션

클로닝으로 얻은 도 8A 및 도 9A 구조체들의 DNA와 Kras RNA를(상기 실시예 1의 3-2와 동일한 방법으로 제조) 293 세포에 코트랜스펙션시켰다. 환원된 혈청 배지(Reduced serum media) Opti-MEMⅠ 300㎕에 구조체 DNA 1㎍을 넣고 Opti-MEMⅠ300㎕에 DMRIE-C (Invitrogen) 3㎕를 넣은 튜브와 섞어 30분간 상온에서 반응시켰다.

Opti-MEMⅠ 600㎕와 DMRIE-C 3㎕에 Kras 야생형, Kras 12V RNA 4㎍을 넣고 섞어준 뒤 세척한 세포에 오버레이하였다. 4시간 동안 5% CO₂ 배양기에서 배양한 후 콤플리트 성장 배지(complete growth media)를 교체해 주었다.

3. 듀얼 루시퍼라제 분석

35mm 디쉬에 트랜스펙션한 각각 세포의 배지를 제거하고 1x PBS로 잘 닦아준다. 여기서 1x 수동 용해 버퍼(passive lysis buffer)를 200㎕ 넣고 상온에서 15분간 용해시킨 후 세포를 수확한 뒤 13000rpm으로 30초간 원심분리하여 상층액 만을 새 튜브에 옮겼다.

루미노미터 튜브에 LARII(Luciferase assay reagent II)을 100 ㎕를 넣고 여기에 세포 용해물 20㎕를 넣어 섞은 후 루미노미터로 읽었다. 다시 여기에 Stop & Glo reagent mix(Stop & Glo 20㎕ + Stop & Glo buffer 1㎖)를 100㎕넣고 섞은 후 루미노미터(TD+20/20)로 읽었다. 지연 시간은 3초, 통합 시간(integrate time)은 12초로 하고 감도 단계(sensitivity level)는 각각의 세포에 알맞게 60%로 설정하였다.

4. RT - PCR 을 통한 세포내에서의 트랜스- 스플라이싱 산물의 발현 확인

4-1. RNA 분리

세포에서 총 RNA를 분리하기 위해, 20mM EDTA가 첨가된 Trizol(Invitrogen)을 사용하였다. 매뉴얼을 기본으로 Trizol 1㎖을 처리한 후 5분간 배양하고 세포를 떼어낸 후 클로로포름을 200㎕ 첨가한 후 보르텍스를 하여 4℃ 원심분리기에서 10분간 원심분리하였다. 상층액을 새로운 튜브에 옮긴 후 EtOH 침전하였다. 그 후 DNase(Promega)를 처리하였다.

4-2. 역전사

상기 2에서 분리한 총 RNA 중 5㎕를 L-아르기닌아마이드가 첨가된 OligodT(Invitrigen)를 사용하여 총 RNA를 잘 섞은 다음 65℃에서 5분간 배양시킨 다음 4℃에서 5분간 보관하였다. 그 후 5x RT buffer, 0.5mM dNTP(BMS)와 MMLV 역전사효소 1U (Promega)와 DEPC dH₂0로 총 25㎕를 만들어 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, 95℃에서 5분간 반응 시켜 MMLV-RT의 활성을 완전히 제거 후 4℃에서 보관했다.

4-3. PCR

RT 반응을 마친 cDNA는 서열번호 12,13의 프라이머(표 1 참조)를 사용하여 PCR 버퍼, dNTP, PCR 태그 중합효소, 5% DMSO를 넣고 (58℃ 30sec annealing/ 30 cycle) PCR하였다. 로딩 대조군으로 사용된 GAPDH는 프라이머를 사용하여 PCR 버퍼, dNTP, PCR 태그 중합효소를 넣고 PCR하였다.

4-4. 클로닝 ( RT - PCR 산물) 및 염기서열 분석

pGEM-T 이지 벡터 시스템(Promega)을 이용하여 TA-벡터에 RT-PCR 산물 클로닝을 하였으며, 서열번호 17의 프라이머(표 1 참조) 3.2 pmol을 사용하여 시퀀싱을 수행하였다.

4-4-1. RT - PCR 산물 용출

DNA 겔 추출(Bio basic inc.)을 이용하여 상기 실시예 1의 2-1-2와 같은 방법으로 DNA를 용출을 했다.

4-4-2. 연결

TA-벡터와 RT-PCR 산물 용출한 DNA(trans-splicing product)를 상기 실시예 1의 2-1-3과 같은 방법으로 연결했다.

4-4-3. 형질전환

연결 산물을 대장균(JM109)에 상기 실시예 1의 2-1-4와 같은 방법으로 형질전환했다.

4-4-4. 시퀀싱을 통한 염기 서열 분석

콜로니를 접종하여 미니-준비로 얻어진 DNA를 EcoRI으로 잘라서 삽입물이 들어간 클론을 얻었다. 상기 실시예 1의 2-2와 같은 방법으로 시퀀싱을 통해 서열을 확인하였다.

5. 트랜스- 스플라이싱 특이성, 효율성 확인

도 8B는 트랜스-스플라이싱 리보자임에 의한 트랜스진의 리포터 에세이 결과를 나타낸 것이다.

도 8B를 참조하면, pAV AS100 KRib1을 Kras 야생형 또는 Kras G12V와 코-트랜스펙션한 경우 Kras 야생형을 넣어준 샘플에서는 루시퍼라제의 발현이 없었고 Kras G12V를 넣어준 샘플에서는 루시퍼라제가 적은 양이지만 발현된다는 것을 확인할 수 있었다.

그런데, pAV AS300 KRib1은 Kras 야생형을 넣어준 샘플 보다 Kras G12V를 넣어준 샘플에서 더 높은 루시퍼라제 값을 관찰할 수 있었으나, Kras G12V에 특이적으로 트랜스진이 발현되지 않음을 관찰하였다. 대조군으로 사용한 Mock이나 기질(Kras G12V)만 넣어준 샘플, 벡터 대조군의 샘플에서는 루시퍼라제가 발현되지 않았다.

이러한 결과로부터, AS100KRib1이 실험관 내에서 확인된 결과와 동일하게 세포에서도 Kras G12V에 특이적으로 트랜스진을 발현하는 것을 관찰할 수 있었다.

도 9B는 트랜스-스플라이싱 리보자임에 의한 트랜스진의 선별적 발현을 확인하기 위한 RT-PCR 분석 결과를 것이다

도 9B를 참조하면, Krib 1 셋트에서는 KRAS G12V RNA와 AS300KRib1-F,luc(레인 8)에서만 특이적으로 T/S 산물의 밴드를 볼 수가 있었다. 또한, 2 셋트에서는 KRAS G12V RNA와 AS100KRib2-F.luc(레인 6)에서만 T/S 산물 밴드를 특이적으로 볼 수 있었다.

이러한 특이적인 밴드가 트랜스-접합 산물인지 그리고 정확한 부위에서 스플라이싱이 일어났는지 알아보기 위해 트랜스-스플라이싱 밴드를 시퀀싱하여 확인하였다. 그 결과, 정확한 부위에서 트랜스-스플라이싱이 일어났음을 알 수 있었다. 이로부터 본 발명의 리보자임은 특이적으로 Kras 야생형과 Kras G12V인 단 염기 변이를 구별하여 트랜스-스플라이싱을 일으킨다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 5: In vivo 에서 트랜스- 스플라이싱 트랜스진 발현을 통한 세포 사멸 유도 확인

그룹 I 리보자임은 특이적인 부위를 인지하여 절단하는 것 이외에도 자신의 3' 엑손을 타겟 부위의 5' 엑손에 연결하는 역할을 함으로써 새로운 트래스진의 발현을 유도할 수가 있다. 따라서, Kras 리보자임의 3'엑손에 HSV-TK(thymidine kinase) 유전자를 삽입함으로써 전구 약물인 GCV을 처리하면 특이적으로 트랜스-스플라이싱이 된 새로운 트랜스진을 발현하는 세포에서 세포사를 유도하게 된다.

도 10A는 SW480 세포에서 TK 분석을 위한 구조체를 나타낸 것이다.

도 10A를 참조하면, TK 유전자를 도입한 리보자임이 세포사를 유도할 수 있는지 알아보기 위해 먼저 pAVQ 트랜스퍼 벡터에 TK 유전자가 삽입된 구조체를 제작하였다.

1. Kras - 리보자임 - TK 구조체 클로닝

1-1. 벡터와 삽입물 준비

AS300KRib1-F.luc와 AS100KRib2-F.luc를 가지고 3' 엑손에 F.루시퍼라제 대신 HSV-TK의 TK 유전자를 삽입하기 위해 클로닝을 하였다.

pAVQ 벡터였던 리보자임 구조체들 3μg을 BglII(3U, Rocho)와 BstBI(3U, NEB) 제한효소를 이용하여 37℃ 3시간 자른 후 1% TAE 겔에 걸어 잘린 것을 확인 한 후, 플라스미드를 용출하였다.

TK 유전자를 얻기 위해 pCDNA3.1(+) CMV-TK의 구조체를 이용하여 TK 유전자를 서열번호 14, 15의 프라이머와 서열번호 16의 프라이머(표 1 참조)를 가지고 PCR[96℃-5'→(96℃-30", 58℃-1'30", 72℃-1'30") × 30 cycles → 72℃-7']로 증폭하였다.

이렇게 만들어진 TK DNA를 페놀 추출 및 에탄올 침전 후 3μg에 NruI(3U;Rocho)과 BstBI(3U;NEB) 제한효소를 이용하여 dH₂O를 최종 50㎕까지 넣고 섞어 37℃에 3시간 동안 반응시킨 후 페놀 추출 및 에탄올 침전을 통하여 DNA를 정제하고 dH₂O에 녹였다.

1-2. 연결

효소 처리된 pAVQ KRib1/KRib2 벡터와 삽입물(TK gene)을 각각 벡터:삽입물(1:3) 비율로 T₄리가아제(Roche)로 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다.

1-3. 형질전환

연결한 벡터와 삽입물을 DH5α 수용성 세포에 42℃에서 1분 30초간 열 쇼크를 주어 형질전환을 한 후 5분간 얼음에 보관하고 1㎖의 새로운 LB를 첨가하여 37℃에서 30분간 배양시켰다. 그 후 카나마이신 아가 플레이트에 골고루 깐 다음 37℃ 배양기에 16시간 동안 배양시킨 후 콜로니를 암피실린이 포함된 5㎖ LB 배지에 접종하여 16시간 동안 37℃에서 흔들면서 배양하였다.

1-4. 시퀀싱을 통한 클로닝 확인

콜로니를 접종하여 미니-준비로 얻어진 DNA를 상기 실시예 1의 2-2와 같은 방법으로 서열번호 18의 프라이머(표 1 참조) 시퀀싱을 하여 확인하였다.

2. 자살유전자 활성 분석

실험을 하기 하루 전에 SW480(Kras G12V) 세포과 HT-29(wild type Kras) 세포를 35mm 디쉬에 2×10⁵ 세포를 배양하였다. 클로닝된 도 10A의 구조체와 함께 pEGFP-NI(250ng)을 코-트랜스펙션하였다.

2-1. DNA 트랜스펙션

구조체와 함께 pEGFP-NI(250ng)을 welfec M Gold 트랜스펙션 시약(Welgen)을 사용하여 코-트랜스펙션하였다. PBS로 세포를 세척한 후 환원된 혈청 배지 OPTI-MEM 2㎖을 첨가하여 37℃ 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 환원된 혈청 배지 OPTI-MEM 100㎕에 GFP 250ng와 리보자임 1μg을 섞은 후 골드 인핸서 4㎕를 OPTI-MEM 100ul에 희석시킨 후 DNA 혼합물에 섞어 15분간 배양했다.

이 DNA 혼합물과 OPTI-MEM 100㎕에 희석시킨 M gold 6㎕를 반응시킨 후 15분 배양했다. 배양 후 세포 위에 골고루 첨가해주었다. 그 후 37℃ 5% CO₂ 배양기에서 5시간 배양 후 콤플리트 메디아로 교체해 주었다.

2-2. 세포 생존율 관찰

24시간 후 200 μM GCV(Cymevene^®, Roche)을 각 디쉬에 첨가해 주고 3일 동안 배양했다. AxioCam HR4 version 5.05.10. Zeiss 현미경을 이용하여 현광파장을 9 필터(488~509nm)로 하여 트랜스펙션된 세포에서 GFP의 발광 수를 측정하였다. 세포의 생존율(%)은 아래와 같은 공식을 이용하였다.

[수학식 1]

3. 세포 사멸 유도 확인

Kras 야생형을 내생적으로 발현하는 세포주 HT-29와 Kras G12V를 내생적으로 발현하는 세포주 SW480에 AS100KRib2-TK를 GFP 유전자와 함께 플라스미드 상태로 트랜스펙션하였다.

도 10B를 참조하면, HT-29 세포에서는 GCV를 처리하거나 미처리 시에 GFP의 발광에는 어떠한 변화도 않은 것으로 보아 세포의 생존력에 영향을 끼치지 않음을 볼 수가 있었다.

그러나, SW480 세포에서는 AS100KRib2-TK를 트랜스펙션한 세포에서 GCV를 처리하였을 때 GCV를 처리하지 않은 세포에 비해 GFP의 발광 수가 감소한 것을 볼 수가 있었다. 이는 AS100KRib2-TK가 특이적인 트랜스-스플라이싱에 의한 TK 유전자의 발현으로 전구약물인 GCV를 톡신으로 바꾸어 세포 생존율을 감소시켰음을 알 수가 있다.

이러한 결과로 부터, 본 발명의 리보자임은 야생형 Kras와 변이된 Kras를 특이적으로 구별하여 트랜스-스플라이싱하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 6: 아데노바이러스 전달 시스템을 위한 바이러스 구조체 제작

pAVQ 트랜스퍼 벡터에 TK 유전자가 삽입된 구조체인 pAVQ 트랜스퍼 벡터 리보자임을 pAdenovactor ΔE1/E3 백본 벡터와 함께 BJ5183 균주의 박테리아에 코-트랜스펙션시켜 트랜스퍼 벡터 리보자임과 pAdenovactor ΔE1/E3 백본 벡터를 상동 재조합시켰다. 이러한 방법으로 도 11B의 아데노바이러스 재조합 트랜스-스플라이싱 리보자임을 제작하였다.

1. 전달 시스템의 개발을 위한 재조합 아데노바이러스 벡터

클로닝된 도 10A의 pAdenovactor-CMV5-IRES-GFP 트랜스퍼 벡터(Qbiogene)들을 박테리아(BJ5183)에서 pAdenovactor ΔE1/E3 백본 벡터(Qbiogene)와 함께 코-트랜스포메이션시켜서 상동 재조합시켰다(도 11A 참조).

먼저, 트랜스퍼 벡터를 제한효소 PmeI으로 선형화시킨 후 페놀 추출 및 에탄올 침전을 통해 정제한 후 정량하여 1μg과 100ng의 pAdenovactor ΔE1/E3 백본 벡터를 BJ5183에 코-트랜스포메이션했다.

이렇게 얻은 도 11B의 BJ5183에서 상동 재조합된 재조합 벡터들은 PacI으로 선형화하여 페놀 추출 및 에탄올 침전을 통해 정제한 후 정량하여 293 세포에 트랜스펙션하였다. 293 세포에 트랜스펙션된 선형화된 재조합 벡터들은 3번의 플라크 정제를 통해 재조합 아데노바이러스를 만들었다.

293 세포를 이용하여 증폭시킨 재조합 바이러스들은 Vivapure^® AdenoPACK^TM 100 RT(Sartorius AG.)를 사용하여 정제하고 농축시켰다. 재조합 아데노바이러스들의 적가를 결정하기 위해 TCID50(tissue culture infectious dose for 50% of the cells) 방법을 이용하였다. 바이랄 스톡(Viral stock)들은 10%의 수크로스와 함께 -80℃에 보관하였다.

1-1. 정제 전에 Ad - AS300KRib1 - TK 의 분석

상동 재조합시킨 바이러스 재조합 리보자임들은 293 세포에 트랜스펙션함으로써 감염 능력을 가진 Ad-리보자임-TK 바이러스를 얻게 되었다. 이러한 바이러스들은 적가가 낮기 때문에 293 세포에 여러 번의 감염을 통해 고 적가를 얻어야한다. 고 적가의 바이러스를 얻게 되면 정제 과정을 통해 순수한 바이러스들을 정제하게 된다.

따라서, 바이러스들을 정제하기 전에 바이러스가 잘 생성되고 있는지, 올바른 Ad-리보자임들이 만들어지고 있는지 확인을 해야 한다. 또한, 여러 클론들 중 효율이 좋은 클론을 선별해야 한다. 이러한 확인을 위해 여러 번의 감염 중 저 적가에서 바이러스의 게놈을 얻어 PCR을 통해 리보자임의 3'엑손의 TK(thymidine kinase) 유전자와 pAdenovactor ΔE1/E3 백본 벡터의 LITR(left inverted terminal repeat)을 PCR을 통해 확인하였다(도 12A).

또한, 저 적가의 Ad-AS300KRib1-TK를 Kras G12V 변이된 세포주인 SW480 세포에 감염하여 Ad-AS300KRib1-TK의 발현을 확인하였다(도 12B). 바이러스는 클론들의 밴드를 비교하여 클론 18번을 가지고 바이러스 정제를 진행하였다.

1-2. 정제 전에 Ad - AS100KRib2 - TK 의 분석

상기 1-1과 같은 방식으로 Ad-AS100KRib2-TK을 분석하였다(도 13). 바이러스의 게놈을 뽑아 PCR을 해본 결과 리보자임의 3'엑손의 TK(thymidine kinase) 유전자와 pAdenovactor ΔE1/E3 백본 벡터의 LITR(left inverted terminal repeat)을 확인하였다(도 13A). 그리고 SW480 세포에 감염하여 Ad-AS100KRib2-TK의 발현을 확인하였다(도 13B). 바이러스는 클론들의 밴드를 비교한 결과 클론 1번을 가지고 바이러스 정제를 진행하였다.

1-3. 정제 전에 Ad - AS100KRib2 - LacZ 의 분석

상기 1-1과 같은 방식으로 Ad-AS100KRib2-LacZ를 분석하였다(도 14). 바이러스의 게놈을 뽑아 PCR을 해본 결과 리보자임의 3'엑손의 LacZ 유전자와 pAdenovactor ΔE1/E3 백본 벡터의 LITR(left inverted terminal repeat)을 확인하였다(도 14A). 그리고 SW480 세포에 감염하여 Ad-AS100KRib2-LacZ의 발현을 확인하였다(도 14B). 바이러스는 클론들의 밴드를 비교한 결과 클론 30번을 가지고 바이러스 정제를 진행하였다.

2. 재조합 바이러스의 확인

3번의 플라크 정제를 통해 재조합 아데노바이러스를 만드는 중간에 바이러스를 감염한 293 세포에서 바이러스가 제대로 만들어지고 있는지 확인하기 위해 바이러스 게놈 DNA를 추출하여 서열번호 19 내지 24의 프라이머(표 1 참조)를 가지고 PCR[96℃-5'→(96℃-30", 58℃-1'30", 72℃-1') × 30 cycles → 72℃-7']을 통해 증폭하였고, 2% TBE 아가로스 겔에 로딩하여 크기를 확인하였다. 또한, SW480 세포에 주입하여 상기 실시예 4의 5, 6과 같은 방법으로 RT-PCR을 통해 재조합 바이러스들을 확인하였다.

3. 바이러스 재조합들의 트랜스- 스플라이싱 확인

상기 1에서 정제된 Ad-리보자임들을 Kras G12V 변이된 세포주인 SW480에 50 M.O.I의 바이러스를 감염한 후, 48시간 후에 11-3,4와 같은 방법으로 서열번호 1과 14의 프라이머(표 1 참조)를 가지고 RT-PCR과 서열번호 17의 프라이머(표 1 참조)를 가지고 시퀀싱을 통해 트랜스-스플라이싱을 확인하였다.

4. 종양 세포에서 Ad - 리보자임을 이용한 T/S 산물 확인

이렇게 제작된 Ad-리보자임은 종양세포에서 특이적으로 트랜스-스플라이싱 일어나 T/S 산물을 생성하는지 확인하기 위해 Kras G12V 변이된 세포주인 SW480 세포에 Ad-리보자임을 감염하였다. 대조군으로 Ad-CMV-TK와 혼합하여 사용하였다. Ad-CMV-TK는 리보자임의 3'엑손의 TK 유전자와 같은 유전자로 리보자임이 없는 구조체이다. 혼합(Mix)은 RNA 추출 시 in vitro 상에서 트랜스-스플라이싱이 일어나지 않는다는 것을 보여주는 것으로 SW480 세포의 내생적인 돌연변이 Kras와 내생적인 Kras 야생형인 HT-29 세포에 Ad-AS100KRib2-TK를 감염한 것을 튜브 상에서 반응시킨 것이다.

도 15는 Kras G12V 변이된 SW480 세포에서 아데노바이러스 전달 시스템을 이용한 트랜스-접합 RNA 산물의 분석 결과를 나타낸 것이다.

도 15를 참조하면, 대조군들은 밴드가 없는 반면에 Ad-AS300KRib1-TK와 Ad0AS100KRib2-TK를 감염한 레인에서만 특이적으로 밴드가 보이는 것을 알 수가 있다.

이러한 특이적 밴드가 리보자임에 의한 특이적인 T/S 산물인지를 확인하기 위해서 시퀀싱을 통해 확인하였다. 그 결과, Ad-리보자임들이 특이적이고 올바르게 작용을 하고 있음을 알 수 있었다.

실시예 7: 아데노바이러스 Kras G12V -특이성 리보자임에 의한 Kras G12V 돌열변이된 암 세포에서 특이적인 세포 사멸

Kras G12V 변이된 암 세포에서 Kras G12V를 타겟팅하는 특이성 리보자임이 세포사를 유도하는지를 실험하기 위해 MTS 분석을 진행하였다. Kras G12V 변이된 세포주인 SW480 세포, CAPAN-1 세포와 Kras 야생형인 HT-29 세포에 Ad-리보자임들을 감염시키고 다음날 GCV를 처리함으로써 암 세포의 세포사를 관찰하였다.

1. 세포 배양

HT-29(colorectal adenocarcinoma)는 10% FBS(fetal bovine serum), DMEM(Dulbecco's modified eagle medium; HyClone), 0.5% antibiotic/antimycotic solution이 첨가된 배지로 SW480(colorectal adenocarcinoma)는 10% FBS(fetal bovine serum), RPMI 1640(Roswell Park Memorial Institute 1640; HyClone), 0.5% 항생/항진균 용액이 첨가된 배지로 CAPAN-1(pancreatic adenocarcinoma)은 10% FBS(fetal bovine serum), RPMI 1640(Roswell Park Memorial Institute 1640; HyClone), 0.5% antibiotic/antimycotic solution이 첨가된 배지로 37℃, 5% CO₂배양기에서 배양하였으며, 3~4일마다 계대배양하였다.

2. 세포 증식 분석

세포 증식(MTS) 분석법은 CellTiter 96Aqueous one solution reagent(MTS, Promega)의 매뉴얼을 기초로 하여 수행하였다.

96-웰 플레이트에 세포를 3×10³ cells/well(0.1 ㎖)로 씨딩하였다. 37℃ 5% CO₂배양기에서 밤새도록 배양한 후, 각 웰에 다양한 M.O.I의 바이러스를 감염시켰다. 16시간 후에 각 플레이트 100 uM GCV(Cymevene^®, Roche)을 처리하여 5일 동안 배양시켰다. Opti-MEM 100ul에 CellTiter 96Aqueous one solution reagent(MTS, Promega)를 20% 추가하여 각 웰에 첨가한 후 1~4시간 동안 37℃ 5% CO₂ 배양기에서 배양한 후 세포 생존율을 490nm에서 흡수도를 측정하였다.

3. Kras G12V 돌열변이된 암 세포에서 특이적인 세포 사멸 확인

도 16A는 SW480 세포에서 MTS 분석 결과를 나타낸 것이다.

도 16A의 왼쪽 그래프를 참조하면, 동일하게 GCV를 100uM로 처리하였을 때 Ad-리보자임들은 M.O.I 의존적으로 감염하였다. 도 16A의 오른쪽 그래프를 참조하면, 동일하게 Ad-리보자임들을 150 M.O.I로 감염하고 GCV 복용별로 처리를 하였다.

Ad-CMV-TK과 이미 보고된 논문에서 특이성과 효율이 인정된 Ad-CMV-리보자임-TK가 양성 대조군으로 사용되었으며, Ad-CMV-LacZ는 음성 대조군으로 사용되었다.

그 결과, 양성 대조군과 음성 대조군과 비교하였을 때 Ad-리보자임들은 특이적인 트랜스-스플라이싱과 트랜스진이 유도되어 세포사가 일어남을 볼 수 있었다.

도 16B 및 16C는 각각 CAPAN-1 세포, HT-29 세포에서 MTS 분석 결과를 나타낸 것이다.

도 16B의 경우도 동일하게 GCV를 100uM로 처리하고, Ad-리보자임들은 M.O.I 의존적으로 감염한 결과, Ad-리보자임들에서 특이적인 세포사가 일어남을 볼 수 있었다. 그러나, 도 16C 야생형 Kras인 HT-29 세포에서는 양성 바이러스들을 제외하고는 세포사가 일어나지 않음을 볼 수 있었다.

이러한 결과로부터 Ad-리보자임들이 특이적으로 변이된 Kras G12V를 인지하여 트랜스-스플라이싱을 해서 트랜스진을 유도했음을 알 수가 있다.

실시예 8: Ad - 리보자임에 의한 이종이식 모델에서의 종양 퇴행 확인

1. 실험동물

특이적으로 병원체 부재 조건인 4주에서 5주의 수컷 BALB/cAnNCrI 누드 마우스(Orient Bio Inc.)를 실험을 위해 사용하였다. 이종이식 마우스 모델을 만들기 위해, 먼저 마우스 8마리에 CAPAN-1(1×10⁷cells)을 복강 내 주사한 후 3주 후에 종양 생성시킨 다음 아데노바이러스 리보자임들을 이틀 간격으로 3회(1×10⁹ PFU) 감염시켰다. GCV(50mg/kg)는 바이러스를 처음 감염시킨 날 다음날부터 하루에 2번씩 10일 동안 복강을 통해 처리하였다. 그리고 야생형의 Kras 피하 종양 모델을 만들기 위해서 HT-29을 이용해서 종양 모델을 제작하였다. 수컷 BALB/c 누드 마우스 7마리에 1×10⁷cells을 피하 주사하여 2주 후에 종양을 생성시켰다. Ad-리보자임은 정맥 내로 이틀 간격으로 3번, 1×10⁹cell을 처리하였다. GCV(50mg/kg)는 10일 동안 2번씩 복강으로 처리한 후 관찰하였다.

2. 이종이식 모델에서의 종양 퇴행 확인

In vivo에서 Ad-리보자임의 특이성과 효율성을 확인하기 위해서 MTS 분석을 통해 확인된 Ad-리보자임들을 인간 종양이 이식된 이종이식 마우스 모델에 감염했다.

Kras G12V 변이된 CAPAN-1을 i,p로 주사하여 종양을 생성하였고, Ad-리보자임을 처리했다(도 17A 참조). 그 후 GCV를 처리하여 Ad-리보자임에 의해 특이적으로 종양이 퇴행(regression)되는지를 확인했다. 음성 바이러스로는 Ad-CMV-LacZ를 감염했고 양성 바이러스로는 Ad-CMV-TK를 감염했다.

Ad-CMV-LacZ에 비해 Ad-CMV-TK와 Ad-AS100KRib2-TK는 유사하게 Kras G12V 변이된 종양에서 종양 퇴행이 일어남을 알 수가 있었다(P=0.467). 또한, 야생형 Kras를 발현하는 HT-29로 피하의 종양 마우스 모델을 만들었다.

도 17B는 H&E 염색하여 괴사를 제외한 종양을 관찰하여 종양의 중량을 그래프로 나타낸 것이다.

도 17B를 참조하면, 종양의 중량은 음성 대조군과 비슷하게 Ad-리보자임들도 감소하지 않은 것을 알 수 있다(P=0.5137). 그러나, 양성 바이러스인 Ad-CMV-TK인 경우에는 종양의 중량이 감소한 것을 볼 수 있었다. 또한, Kras G12V 변이된 종양과 야생형 Kras 종양의 결과를 비교해 보면 Ad-리보자임은 Kras G12V를 특이적으로 인지하여 작용한다는 것을 알 수가 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 27로 표시되는 AS100KRib2인 Kras G12V RNA를 표적으로 하여 특이적으로 인지할 수 있는 트랜스-스플라이싱 그룹 Ｉ 리보자임.
제1항에 따른 리보자임을 유효성분으로 포함하는 항암용 약학 조성물.