KR101497035B1 - 종양 특이적 프로모터 및 이를 포함하는 종양살상 바이러스 벡터 - Google Patents

Abstract

종양 특이적 프로모터, 종양살상 바이러스 벡터 및 상기 바이러스 벡터를 포함하는 약학적 조성물에 제공된다. 상기 신규 종양 특이적 프로모터를 포함하는 바이러스 벡터는 종양 세포에 대해 뛰어난 종양살상 효과를 나타내므로, 암을 치료하는데 유용하다.

Description

종양 특이적 프로모터 및 이를 포함하는 종양살상 바이러스 벡터 {TUMOR-SPECIFIC PROMOTER AND ONCOLYTIC VIRUS VECTOR COMPRISING THE SAME}

본 발명은 종양 특이적 프로모터 및 이를 포함하는 종양살상 바이러스 벡터에 관한 것이다.

종양살상 바이러스(oncolytic virus)는 종양 세포에서 선택적으로 증식하여 그 종양 세포를 죽이는 제한 증식형 바이러스(conditionally replication-competent virus)의 일종이다. 1950년대부터 1970년대까지의 기간 동안, 바이러스의 종양살상 효과가 아데노바이러스(adenovirus) 또는 이하선염바이러스(mumps virus)를 이용한 연구를 통해 확인된 바 있으나, 결국 일시적인 효능과 독성 부작용으로 인해 수십년간 주목을 받지 못하였다. 그러나 1990년대에, 단순포진바이러스-1(Herpes simplex virus-1; HSV-1)의 티미딘 키나아제(thymidine kinase; TK) 결손형 변이체 및 p53 결손형 종양 세포에서 선택적으로 증식하는 아데노바이러스 돌연변이인 dl1520(ONYX-015)과 같이 이전의 바이러스보다 안전성이 개선된 일부 바이러스가 개발된 이후, 급속도로 종양살상 바이러스에 대한 연구가 진행되었다(Jagus R, et al., Int. J. Biochem. Cell Biol., (1999) 31:123-138; Bischoff JR, et al., Science, (1996) 274(5286):373-376). 현재까지, 약 80종 이상의 종양살상 바이러스가 개발되었으며, 이들은 항암치료를 위한 유망한 도구가 될 것으로 기대되고 있다.

바이러스를 종양 세포에서 보다 선택적으로 증식시키고 이들의 종양살상 효과를 극대화하기 위해 다음과 같은 방법들이 시도되고 있다.

첫째는, 뉴캐슬병바이러스(NDV), 레오바이러스(reovirus) 등과 같이 자연적으로 종양 세포에서 그대로 증식할 수 있는 야생형 바이러스를 이용하는 것이다. 이러한 바이러스는 RNA-활성화 단백질 키나아제 R(PKR)/인터페론이 결손된 종양 세포에서 선택적으로 증식하기 때문에, 통상적으로 RNA 바이러스로 불린다.

둘째는, 형질도입에 의해 바이러스와 종양 세포 간의 친화성을 높이는 것이다. 최근 단백질공학 및 유전공학적 수법을 이용하여 친화성이 높은 리간드, 수용체 또는 항체를 바이러스 또는 종양세포에 형질도입하거나, 섬유소(fiber)와 같은 바이러스 피단백질(capsid protein)에 종양 세포 친화성 리간드를 부가함으로써 종양 세포에 대한 높은 지향성(tropism)을 부여한다.

셋째는, 바이러스의 유전자에 변이 또는 결손을 도입하여 정상 세포에서의 바이러스의 증식과 독성을 억제하는 것이다. 일반적으로 아데노바이러스는 피감염세포의 레티노블라스토마 단백질(pRb)에 결합능을 가진 E1A 일차단백질을 발현한다. 이 E1A 유전자에 pRb와 결합하지 못하도록 유전적 변이를 도입한 아데노바이러스는, 정상세포에 감염되면 E1A로부터 유리된 pRb가 E2F-1에 우선적으로 결합하여 결과적으로 감염된 바이러스의 증식에 필요한 E2F-1의 전사 활성이 억제된다. 반면, 종양세포는 보통 pRb의 변이를 가지고 있는데, E1A 유전자 변이 아데노바이러스가 종양 세포에 감염되면, 변이형 pRb는 E1A와의 결합여부와 관계없이 E2F-1과 결합하지 않기 때문에, E2F-1에 의한 감염된 바이러스 증식 및 세포용해가 활성화된다. 또 다른 돌연변이 아데노바이러스, E1B55K 유전자-결핍 아데노바이러스도 종양 억제물질로서 p53의 기능을 억제하는 E1B55K 유전자를 갖지 않기 때문에 정상 세포에서 복제와 독성이 감소되는 것으로 알려져 있다.

넷째는, 외부 유전자를 도입하거나 바이러스 유전자를 결손시켜 종양살상 효과를 향상시키는 방법이다. 아데노바이러스의 유전자 E1B19K는 세포 사멸을 저해하는 Bcl-2와 상동성을 갖는 것으로 알려져 있으며, E1B19K를 결손시키면 감염세포의 사멸이 촉진되고 항종양효과가 증가한다고 보고된 바 있다. 또한 G-CSF나 IL-12와 같은 세포용해 인자 또는 항 혈관신생인자를 아데노바이러스 벡터에 도입함으로써 항종양효과를 극대화하려는 시도도 있어 왔다.

마지막으로, 다섯째는, E1A와 같은 바이러스의 복제에 필수적인 유전자가 종양 세포에서만 발현되도록 하는 종양 특이적 프로모터를 이용하는 것이다. 현재까지 종양성태아항원(CEA), α-페토프로테인, 전립선특이항원(PSA) 및 텔로메라아제(TERT)와 같은 종양 특이적 발현 유전자로부터 유래된 몇 가지 종양 특이적 프로모터가 개발되었다.

그러나 최근의 연구에 의하면, 종양의 발병 및 전이 메커니즘은 매우 다양하고 또한 일부 종양 세포들은 이러한 메커니즘을 빈번하게 일탈하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 전술한 한 가지 방법에 의해 종양살상 바이러스를 종양 세포에 제한시키는 것과 종양살상 효과를 증가시키는 것이 어렵다는 사실에 비추어, 전술한 방법 중 적어도 하나 이상을 조합함으로써 치료 효과를 극대화할 필요가 있다.

대표적인 종양인자 중의 하나인 Wnt는 초파리의 분절 극성 유전자(segment polarity gene)인 wingless의 척추동물 상동체로서, MMTV(mouse mammary tumor virus)에 의해 유도된 마우스 유암에서 Wnt1(wingless/int-1)이 처음으로 동정되었다. 이와 유사하게, 전립선암, 대장암 및 유암에서 Wnt2 및 Wnt5의 발현 증가가 보고되었고, 특히, Wnt 발현 조절 이상과 대장암의 발암기작의 관련성이 잘 연구되어 있다. 약 90%를 넘는 대장암 환자에서 Wnt의 항시적 활성화가 발견되었으며, 이는 핵내 β-카테닌(β-catenin)의 축적을 야기하고, 핵의 β-카테닌은 전사인자 TCF와 결합하여 Wnt 표적유전자의 전사를 활성화시킨다. Wnt 표적유전자의 예는 세포증식에 관련된 C-myc 및 사이클린(Cyclin) D1, 세포사멸억제 인자 COX-2 및 PPARδ, 종양 세포의 침윤과 관련된 MMP, 성장인자 c-met, VEGF 및 BMP-4를 포함한다. 대장암에서 Wnt 신호전달 경로의 항시적 활성화는 β-카테닌의 인산화, 또는 APC, Axin 또는 GSK3β의 돌연변이에 의해 주로 유도되는데, 이들 각각은 β-카테닌의 유비퀴틴 관련 분해에서 중요한 부분을 담당한다. 또한 최근의 증거들은 β-카테닌이 전구체 mRNA에 직접 결합하여 mRNA의 스플라이싱과 안정화에 관여한다는 것을 제시한다.

전사인자 E2F 패밀리에서는 아데노바이러스 E2A 프로모터에 결합하여 E1A의 전사활성을 증가시키는 E2F-1이 처음으로 동정되었다. E2F의 표적유전자는 그 프로모터 영역에 TTT(C/G)CGCG의 E2F 결합 모티프를 함유하며 세포증식과 세포사멸이라는 두 가지 모순된 현상을 동시에 조절할 수 있다. 현재까지 알려진 E2F 표적유전자 중, 사이클린 E, 사이클린 A, 사이클린 D, cdc2 및 cdc25A와 같은 세포주기 조절인자를 코딩하는 유전자 및 DHFR(dihydrofolate reductase), DNA 폴리머라제 α 및 티미딘 키나아제(TK)와 같은 DNA 합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 세포증식과 관련이 있는 반면, Apaf1(apoptosis protease-activating factor 1), p73 및 ARF와 같은 유전자들은 세포사멸과 관련이 있다고 알려져 있다. E2F 패밀리는 포켓 단백질이라고도 불리는 pRb, 또는 pRb 관련 단백질인 p107 및 p130에 결합한다. 현재 알려진 E2F 패밀리 중 6종의 멤버 중에서, G1/S기에 특이적으로 발현하는 E2F-1, E2F-2, E2F-3은 pRb와 결합하여 전사 촉진인자로서 기능한다. 반면 E2F-4 및 E2F-5는 p107 및 p130과 결합하여 E2F 표적유전자의 전사활성을 억제한다. 마지막으로, 다른 E2F와는 달리 전사활성부위와 포켓 단백질 결합부위가 없는 E2F-6은 E2F 표적유전자의 전사활성을 억제하는 것으로 알려져 있다. E2F-1은 보통 다음과 같은 경우에 pRb와의 결합으로부터 유리되어 표적유전자의 전사를 위해 활성화된다: 1) G1/S기에 활성화된 사이클린 D4/Cdk4에 의해 pRb가 인산화되는 경우, 2) 아데노바이러스로 감염된 세포에서 발현된 E1A가 pRb에 결합하는 경우; 및 3) 종양 세포 등에서 pRb의 E2F 결합부위가 변이되는 경우. 활성화된 E2F-1은 G1/S 전이기를 촉진함으로써 세포증식을 촉진하거나, 반대로 ARF를 전사활성시켜 p53 억제물질인 MDM2를 억제시킴으로써 세포사멸을 유도할 수 있다.

전술한 바와 같이, 종양 세포에서 WNT/β-카테닌의 유전자 변이 또는 E2F/pRb 신호전달 인자의 기능부전이 높은 빈도로 발견되며, 이는 β-카테닌-TCF 복합체 또는 E2F의 핵내 축적을 야기한다. 또한, Axin2, Siah1 등을 통한 WNT/β-카테닌과 E2F/pRb 신호 경로 간의 상호작용이 보고되고 있어, WNT/β-카테닌 또는 E2F 신호전달 인자가 우수한 종양지표 인자로 간주될 수 있다.

본 발명에서는 종양세포에서 특이적으로 활성화되는 프로모터를 얻기 위하여 일부 종양세포에서 그 발현이 증가되는 유전자의 전사조절부위, 약 2kb를 조사하여 E2F 와 TCF 결합부위의 유무를 조사하였다. 그 결과 COX-2(cyclooxygenase-2), MMP-7(matrix metalloproteinase-7), DNMT-1(DNA methyl-transferase-1), Cylin D1, Wnt-2 등의 프로모터를 후보물질로 선정하고 각 프로모터의 동정에 착수하였다.

DNMT-1(DNA-메틸트랜스퍼라제 1)은 DNA에 메틸기를 부가하는 효소로서, HDAC(histone deacetylase) 등과 함께 전사조절 부위의 CpG 영역의 메틸화에 관여한다. 과메틸화(hypermethylation)된 유전자는 히스톤 단백질과 결합하여 DNA와 단백질의 견고한 복합체(헤테로크로마틴(heterochromatin))를 형성하여, DNA 전사를 억제한다. 종양 조직에서 유전자의 과메틸화는 빈번히 발견되는 현상으로 E-cadherin, GSTP1, MLH1, p16^INK4, p14^ARF, BRCA1 등의 종양억제인자의 과메틸화가 보고되어 있으며(Baylin SB, Herman JG. DNA hypermethylation in tumorigenesis: epigenetics joins genetics. Trends Genet. 2000;16:168), 또한 방광암, 신장암, 대장암 등에서도 DNMT-1의 발현증가가 인정된다(Robertson KD et al . The human DNA methyltransferases (DNMTs) 1, 3a and 3b: coordinate mRNA expression in normal tissues and overexpression in tumors. Nucleic Acids Res 1999;27:2291). 특히 pRb 결손형 전립선암에서 DNMT-1이 특이적으로 과발현되어 있고 이는 E2F-1 의존적인 것이 보고되었다(McCabe MT et al . Regulation of DNA methyltransferase 1 by the pRb/E2F1 pathway. Cancer Res 2005;65:3624).

본 발명자들은 DNMT-1의 상류 영역에서 E2F 결합 모티프를 가진 신규의 종양 특이적 프로모터를 동정하고 상기 프로모터를 포함하는 종양 선택적 살상 아데노바이러스 벡터를 제작하였다. 그 결과 상기 벡터로부터 생성된 아데노바이러스가 높은 종양살상 효과를 갖는다는 것을 발견하였다.

그러므로, 본 발명의 목적은 신규 종양 특이적 프로모터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프로모터를 포함하는 바이러스 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 바이러스 벡터를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 하나의 양태에 따라, 서열번호 8 또는 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 종양 특이적 프로모터가 제공된다.

본 발명의 다른 양태에 따라, 상기 종양 특이적 프로모터에 의해 바이러스 게놈 유전자를 조절하는 것을 특징으로 하는 바이러스 발현 벡터가 제공된다.

본 발명의 또 다른 양태에 따라, 상기 바이러스 발현 벡터 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 암 치료용 약학적 조성물이 제공된다.

본 발명의 상기 및 기타 목적과 특징은 각각 하기를 나타내는 첨부된 도면을 함께 고려하여, 본 발명의 하기 설명으로부터 명확해질 것이다:
도 1a 및 1b: 각각 종양 특이적 프로모터 DS 및 E2F를 포함하는 루시퍼라아제 발현벡터의 개열지도;
도 2a: 정상 세포주(WI38, MRC-5 및 SAEC) 및 종양 세포주(A549, H358, H460, H596, H2009, H2172, Hep3B, Huh-7, HT29 및 Hela)에서 종양 특이적 프로모터에 의해 유도된 루시퍼라아제의 상대적 활성;
도 2b 내지 2d: 정상 세포주(WI38, MRC-5 및 SAEC)에서의 루시퍼라아제 활성 대비 종양 세포주에서의 루시퍼라아제의 상대적 활성으로 표시된, 종양 특이적 프로모터의 종양 선택성;
도 3a 내지 3c: 각각 변형형 DS 프로모터로서 DL 프로모터, 단축형 5'E2F 프로모터, 및 5'ED 프로모터를 포함하는 루시퍼라아제 발현벡터의 개열지도;
도 4a: 각각의 프로모터 CMV, E2F, DS, DL, 및 5'ED에 의해 유도된 루시퍼라아제의 상대적 활성;
도 4b 및 4c: MRC-5 및 WI38에서의 루시퍼라아제 활성 대비 다양한 정상 세포주에서의 루시퍼라아제의 상대적 활성으로 표시된, 각각의 프로모터 CMV, E2F, DS, DL, 및 5'ED의 종양선택성;
도 5a: 공(mock), 대조군 siRNA, β-카테닌 siRNA 및 E2F-1 siRNA의 처리 후, DS 및 SV40 프로모터에 의해 유도된 루시퍼라아제의 상대적 활성;
도 5b: 대조군 siRNA로 처리하여 얻은 값을 100으로 가정한 것을 기초로 하여 도 5a의 상대적 값을 환산한 루시퍼라아제의 상대적 활성;
도 6a 및 6b: E2F 결합 모티프-결손형 프로모터 dDS 및 dDL을 각각 포함하는 루시퍼라아제 발현벡터의 개열지도;
도 7: DS 프로모터, DL 프로모터, 및 E2F 결합 모티프-결손형 프로모터 dDS 및 dDL에 의해 유도된 루시퍼라아제의 상대적 활성;
도 8a 내지 8d: 종양 특이적 프로모터 또는 LK8 유전자를 포함하는 셔틀벡터의 개열지도;
도 9a 내지 9d: 종양 특이적 프로모터 또는 LK8 유전자를 포함하는 아데노바이러스 벡터의 개열지도;
도 10: 정상 세포주(MRC-5)와 종양 세포주(A549)를 각각 500 및 20 m.o.i(multiplicity of infection)의 rAd-8DS_A(0)으로 감염시킨 후 웨스턴 블롯법을 이용하여 종양특이적 프로모터에 의해 유도된 E1A 발현을 검출한 것;
도 11: 순차희석된 rAd-LacZ 대조군, rAd-Rb7Δ19 및 rAd-8DS로 감염된 정상 세포주(HMEC, SAEC, MRC-5 및 WI38) 및 종양 세포주(A549, H2172, C33A, MDA-MB231, U87MG 및 RPMI2650)에서의 rAd-8DS의 종양 특이적 종양살상 효과를 보여주는 CPE(Cytopathic effect, 세포변성효과) 분석 결과;
도 12: 종양살상 아데노바이러스(rAd-8E2F, rAd-8DS 및 rAd-8ED)의 살상능을 보여주는 CPE 분석 결과;
도 13a 및 13b: 폐암(H2172) 이소성 이식모델에서의 종양살상 아데노바이러스(rAd-8E2F, rAd-8ED, rAd-8DS 및 rAd-LacZ)의 항종양 활성을 나타낸 것으로서, (A) 및 (B)는 각각 종양 크기 및 마우스 생존율을 나타냄;
도 14: 종양살상 아데노바이러스로 감염된 마우스 모델의 세포질과 핵(H & E), 사멸세포(TUNNEL), 혈관 관련 조직(CD34), 및 증식세포(PCNA)의 면역조직화학 결과;
도 15a 및 15b: 폐암(H2172) 이소성 이식모델에서의 rAd-8DS 및 rAd-DS의 항종양 활성을 나타낸 것으로서, (A) 및 (B)는 각각 종양 크기 및 마우스 생존율을 나타냄;
도 16a: 마우스 모델에 rAd-8DS 및 rAd-DS를 투여한 경우의 면역조직화학 결과를 나타낸 것이고,
도 16b: 마우스 모델에 rAd-8DS 및 rAd-DS를 투여한 경우의 사멸세포 수, 혈관세포 수, 증식세포 수;
도 17a 및 17b: 동소성 이식모델에 rAd-8DS 및 rAd-DS를 투여한 경우에 얻은 종양 결절(nodule) 수(17A) 및 면역조직화학 결과(17B);
도 18a 내지 18b: 흑색종(A373SM) 동소성 이식모델에서의 rAd-8DS와 rAd-DS의 항종양 효과를 종양 크기(18A) 및 마우스 생존율(B)의 측면에서 나타낸 것;
도 18c: 흑색종(A373SM) 동소성 이식모델에서 rAd-8DS와 rAd-DS를 투여한 경우 얻은 면역조직화학 결과;
도 19: 대조군 아데노바이러스(Ad-ΔE1/LacZ) 및 혈청형 35의 파이버로 대체된 아데노바이러스(Ad-ΔE1/LacZ/35K)로 A549, HepI 및 U343 세포주를 감염시킨 후, LacZ 발현에 따른 유전자 전달 효율을 나타낸 것;
도 20: 대조군 아데노바이러스(Ad-ΔE1/LacZ) 및 혈청형 35의 파이버로 대체된 아데노바이러스(Ad-ΔE1/LacZ/35K)로 FaDu, MCF-7 및 CBHEL 세포주를 감염시킨 후, LacZ 발현에 따른 유전자 전달 효율을 나타낸 것; 및
도 21: 대조군 아데노바이러스(Ad-ΔE1/LacZ) 및 혈청형 35의 파이버로 대체된 아데노바이러스((Ad-ΔE1/LacZ/35K)로 Pro5, Lec2, 및 CHO-K1 세포주를 감염시킨 후, LacZ 발현에 따른 유전자 전달 효율을 나타낸 것.

달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야의 숙련자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 또한, 본원에 언급된 모든 문헌들은 전체가 참고로써 통합되어 있다.

본원에 사용된 용어 "아데노바이러스"는 약 36 kb의 선형 게놈을 갖는 외피가 없는(non-enveloped) 정20면체의 이중가닥 DNA 바이러스를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "종양 특이적 프로모터"는 정상 세포와 비교하여 종양 세포에서 특이적으로 활성화되어 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 촉진시키는 프로모터를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "핵산 컨스트럭트" 또는 "핵산 카세트"는 발현 벡터에 삽입하기 위해 구축한 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "벡터"는 유전자 전달을 위한 비히클(vehicle)을 지칭하고, 상기 용어는 본 기술분야의 숙련자에 의해 이해되며, 바이러스, 플라스미드 등을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "작동가능하게 연결된"은 다양한 핵산 분자 요소들이 기능적으로 연결되고 서로 상호작용할 수 있도록 서로에 대해 배열된 것을 지칭한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 8 또는 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 종양 특이적 프로모터를 제공한다.

본 발명자들은 DNMT-1(DNA 메틸트랜스퍼라제-1) 유전자의 상류 영역으로부터 종양 특이적 프로모터를 조사하고자 노력하였다. 그 결과, 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 갖는 343 bp 크기의 프로모터를 선발하고, 이를 "DS 프로모터"로 명명하였고, DS 프로모터를 함유하는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 1108 bp 크기의 프로모터를 추가로 선발하고 "DL 프로모터"로 명명하였다. 또한, E2F 프로모터의 5' 영역이 결손된 5'E2F 단편과 DS 프로모터를 융합시켜, 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열을 갖는 692 bp 크기의 프로모터를 제작하고, 상기 프로모터를 "5'ED 프로모터"로 명명하였다. 본 발명의 프로모터들은 기존에 확립된 종양 특이적 프로모터 E2F와 비교하여 현저한 종양 선택성을 나타낸다(도 2 및 4 참조).

서열번호 8 또는 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 종양 특이적 프로모터는, 얻어진 프로모터가 종양 특이적 프로모터 활성을 나타내는 한, 서열번호 8 또는 10의 뉴클레오티드 서열 내에 삽입되거나 이에 연결된 부가적인 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 부가적인 뉴클레오티드는 본 기술분야의 숙련자에게 알려진 임의의 뉴클레오티드 서열이며, 외래(exogenous) 프로모터가 바람직하다. 상기 외래 프로모터의 예는 유비쿼터스(ubiquitous) 프로모터(CMV, SV40, TK, β-액틴, elF4A1, GAPDH, EF1, hsp70 및 유비퀴틴 B), 조직 특이적 프로모터(알부민, α1-안트트립신 프로테아제, FVII, B29, CD14, CD43, CD45, CD68, 엘라스타제-1, 엔도글린, 피브로넥틴, flt-1, GFAP 및 ICAM-2) 및 종양 특이적 프로모터(E2F1, TERT, PSA, AFP, CEA, 수르비빈(survivin), COX-2, CXCR4 및 MUC1)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명은 서열번호 8 또는 10의 뉴클레오티드 서열의 단편을 포함하며, 상기 단편이 종양 특이적 프로모터 활성을 나타내는, 종양 특이적 프로모터를 제공한다. 바람직한 단편은 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하나 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 초과하지 않는 단편일 수 있다.

서열번호 8 또는 10의 뉴클레오티드 서열의 단편을 포함하는 종양 특이적 프로모터는, 얻어진 프로모터가 종양 특이적 프로모터 활성을 나타내는 한, 서열번호 8 또는 10의 뉴클레오티드 서열의 단편 내에 삽입되거나 이에 연결된 부가적인 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 부가적인 뉴클레오티드는 본 기술분야의 숙련자에게 알려진 임의의 뉴클레오티드 서열이며, 외래 프로모터가 바람직하다. 상기 외래 프로모터의 예는 유비쿼터스(ubiquitous) 프로모터(CMV, SV40, TK, β-액틴, elF4A1, GAPDH, EF1, hsp70 및 유비퀴틴 B), 조직 특이적 프로모터(알부민, α1-안트트립신 프로테아제, FVII, B29, CD14, CD43, CD45, CD68, 엘라스타제-1, 엔도글린, 피브로넥틴, flt-1, GFAP 및 ICAM-2) 및 종양 특이적 프로모터(E2F1, TERT, PSA, AFP, CEA, 수르비빈(survivin), COX-2, CXCR4 및 MUC1)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

또한, 본 발명은 상기 종양 특이적 프로모터를 포함하는 핵산 컨스트럭트 또는 핵산 카세트를 제공한다. 본 발명의 핵산 컨스트럭트는 상기 종양 특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 외래 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 상기 외래 유전자는 바람직하게는 본 기술분야의 숙련자에게 알려진 바이러스의 복제에 필수적인 유전자일 수 있으며, 보다 바람직하게는 E1A, E1B, E2A, E2B, E3, E4, L1, L2, L3, L4 및 L5로 이루어진 군으로부터 선택되는 아데노바이러스 유전자일 수 있다. 나아가, 본 발명은 상기 핵산 컨스트럭트를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

더욱이, 본 발명은 본 발명에 따른 종양 특이적 프로모터의 조절 하에 바이러스의 게놈 유전자를 발현하는 발현 벡터를 제공한다. 상기 바이러스는 바람직하게는 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 레트로바이러스(retrovirus), 렌티바이러스(lentivirus), 단순포진 바이러스(herpes simplex virus), 레오바이러스(reovirus) 등, 보다 바람직하게는 아데노바이러스, 가장 바람직하게는 영장류로부터 유래한 아데노바이러스일 수 있다. 아데노바이러스는 레트로바이러스와는 달리 분열세포와 비분열세포 모두를 감염시키며, 숙주세포의 게놈 내로 삽입되지 않고 핵내에서 에피솜 요소(episomal element)를 이용하여 복제함으로써 숙주의 게놈을 손상시키지 않는다. 또한 아데노바이러스는 높은 수율, 길고 안전한 보관, 및 외래 유전자를 삽입하는데 있어서 낮은 제한으로 인해 유전자 치료에 유용하다.

한편, 상기 바이러스 게놈의 유전자는 바람직하게는 바이러스의 복제에 필수적인 유전자, 보다 바람직하게는 아데노바이러스의 복제 및 합성에 필수적인 유전자일 수 있다. 아데노바이러스가 숙주세포를 감염시키면, 복제에 필수적인 E1A 유전자를 비롯한 초기 유전자(예컨대, E1B, E2A, E2B, E3 및 E4)가 전사되며, 감염 5 내지 7시간 후에는 후기 유전자(예컨대, L1, L2, L3, L4 및 L5)가 전사되어 숙주 세포에서의 DNA 합성의 억제와 더불어 피단백질의 합성을 유도한다. 따라서, 아데노바이러스의 게놈 유전자는 바람직하게는 E1A, E1B, E2A, E2B, E3, E4, L1, L2, L3, L4 및 L5로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 바이러스 발현 벡터는 바이러스 게놈을 포함하는 발현 벡터로서, 바이러스의 게놈 유전자를 종양 특이적 프로모터로 조절하는 것을 특징으로 한다. 즉, 상기 발현 벡터에서, 바이러스의 게놈 유전자가 종양 특이적 프로모터에 작동가능하게 연결되거나, 바이러스 게놈의 내생적(endogenous) 프로모터가 본 발명의 종양 특이적 프로모터로 대체될 수 있다.

본 발명의 바이러스 발현 벡터는 외래 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 상기 외래 뉴클레오티드 서열은 종양 억제 유전자, 세포독성 유전자, 세포증식 억제 유전자(cytostatic gene), 사이토카인, 자살 유전자(suicide gene) 및 항원-코딩 유전자로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 종양 억제 유전자의 예는 WT1, p53, p16, Rb, BRCA1 및 LK8을 포함한다.

상기 종양 억제 유전자 LK8은 혈관 내피세포를 직접 표적으로 하여 세포사멸을 유도하고 내피 세포의 이동을 억제하는 것으로 알려져 있다(Kim JS et al., J. Biol. Chem., (2003) 278:29000). 특히, 마우스에서 간세포암의 성장이 LK8 유전자를 함유하는 아데노바이러스 벡터를 투여함으로써 억제된다고 보고되었고(Lee K et al., Hepatology, (2006) 43:1063), 따라서 LK8의 도입에 의해 아데노바이러스의 종양살상 효과가 증가할 것으로 예상된다. LK8 유전자는 본 기술분야에 알려진 임의의 방법에 의해 얻을 수 있으며, 예를 들어 제WO2009/102085호에 개시된 플라스미드인 pAAV-CMV_LK8_UN으로부터 얻을 수 있다.

예정세포사멸(programmed cell death) 또는 아폽토시스(apoptosis)의 과정에 관여하는 자살 유전자는 단순포진바이러스(herpes simplex virus) 티미딘 키나아제, 사이토신 디아미나제(cytosine deaminase), 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제(purine nucleoside phosphorylase), 베타-락타마제(β-lactamase), 카복시펩티다제 G2(carboxypeptidase G2), 사이토크롬(cytochrome) P450-2B1, 니트로리덕타제(nitroreductase), 및 베타-글루쿠로니다제(β-glucuronidase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 하나일 수 있다.

또한, 본 발명의 바이러스 발현 벡터에서, 상기 벡터에 포함되는 바이러스의 게놈 유전자의 일부가 다른 유전자로 대체될 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스 게놈의 E1A 유전자가 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열을 갖는 변이형 E1A 유전자로 대체되거나, 아데노바이러스 게놈의 E1B 유전자가 E1B의 19 kDa 영역이 결실된 E1B55K로 대체될 수 있다. 상기 변이형 E1A 유전자는, Kim 등(Kim JS et al ., Human Gene Ther ., (2007) 18:773)에 의해 제안된 벡터(Ad-E1mt7-ΔE1B19)에 사용된 바와 같이, pRb 결합 부위로 알려진 CR1 부위의 Glu가 Gly로 대체되고, CR2 코딩 부위에 존재하는 7개 아미노산(DLTCHEA)이 7개의 Gly으로 대체된 유전자이다. 또한, 상기 E1B-결손형 유전자는 E1B의 19 kDa 영역이 결실된 E1B55K 유전자일 수 있다. 본 발명의 대안적인 구현예에서, 피단백질 또는 파이버 단백질을 코딩하는 유전자가 타혈청형의 피단백질 또는 파이버 단백질을 코딩하는 유전자, 바람직하게는 아데노바이러스 혈청형 35의 파이버 단백질을 코딩하는 유전자로 대체될 수 있다(도 19 내지 21 참조).

본 발명의 종양 특이적 프로모터를 포함하는 예시적인 바이러스 벡터는, 도 9a에 표시된 pAd/PL-8DS 벡터, 도 9b에 표시된 pAd/PL-8ED 벡터, 및 도 9D에 표시된 pAd/PL-DS 벡터를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자라면 종래 알려진 다양한 백본(backbone) 플라스미드를 이용하여 다양한 바이러스 벡터를 구축할 수 있음을 인식할 것이다.

본 발명에서, 상기 종양살상 아데노바이러스 벡터 및 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 약학적 조성물이 또한 제공된다. 상기 본 발명의 조성물은 유전자 치료요법, 바람직하게는 암 치료에 유용하다.

본 발명의 조성물 내에 함유되는 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체는 식염수 용액, 적절한 완충제, 보존제 및 안정제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 적합한 부형제 또는 담체의 예는 물, 염수, 알코올, 지질, 왁스, 완충액, 고체 담체, 예컨대 만니톨, 락토스, 전분, 스테아린산 마그네슘, 사카린 나트륨, 탈크, 셀룰로오스, 글루코스, 수크로스 및 탄산 마그네슘, 또는 생분해성 미세구형(예컨대, 폴리락테이트, 폴리글리콜레이트)이다.

본 발명의 조성물은 밀봉된 앰플 또는 바이알과 같은 단일 용량 또는 다중 용량 용기의 형태로 제공될 수 있다. 바람직하게는, 상기 용기는 사용 전에 약학적 제형의 무균 상태를 유지하기 위해 밀봉될 수 있다. 일반적으로, 상기 제형은 현탁액, 유체, 및 유상 또는 수상 비히클 내의 유화액으로 보존될 수 있다. 또한 상기 약학적 제형은 동결 건조 조건 하에 보존될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 부위-특이적 주사 또는 정맥내 주사로 투여될 수 있다. 부위-특이적 주사는, 예를 들면 복강내 주사, 흉막강내 주사, 수강내 주사, 동맥내 주사, 종양내 주사 또는 국소 적용을 포함할 수 있다. 바람직한 방법은 정맥내 주사이다.

실제 투여되는 활성 성분의 적합한 양은 치료될 질환, 개별 환자의 연령 및 체중, 음식, 투여 시간, 배설 속도, 환자의 증상의 중증도 및 반응 민감도를 비롯한 다양한 관련 인자들에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 용량은 어떤 식으로든 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것이 아니다. 일반적으로, 약학 조성물 내에 함유된 아데노바이러스 벡터는 적절한 생리적으로 허용가능한 담체 내에 약 10⁴ 내지 10¹⁴ vp/mL의 용량으로 투여될 수 있다. 감염 다중도(MOI, multiplicity of infection)는 일반적으로 0.001 내지 100의 범위일 수 있다. 만약 폴리뉴클레오티드 컨스트럭트로서 투여되는 경우, 약 0.01 μg 내지 1000 μg/kg의 아데노바이러스 벡터가 투여될 수 있다. 상기 아데노바이러스 벡터는 의도된 용도 및 숙주의 면역 반응 가능성에 따라 1회 이상 투여될 수 있으며, 다중의 동시 주사로서 투여될 수도 있다. 만약 면역 반응을 원하지 않는 경우, 다양한 면역억제제를 사용하거나, 강한 면역 반응 없이 반복적인 투여를 가능하게 하기 위해, 혈액으로부터 아데노바이러스 항체를 제거하는 면역흡착 과정(예를 들어, 면역성분채집(immunoapheresis))과 같은 기술을 사용하여 면역 반응을 줄일 수 있다.

본 발명의 조성물은 단일 치료요법으로서 사용될 수 있다. 하지만, 이는 암을 치료하기 위한 통상적인 화학치료요법이나 방사선 치료요법과 같은 다른 항종양 프로토콜과 조합될 수 있다. 본 발명의 조성물과 함께 사용될 수 있는 화학치료요법 약물은 파클리탁셀, 시스플라틴, 카보플라틴, 프로카바진, 메클로레타민, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 멜팔란, 클로람부실, 비설판, 니트로소우레아, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루시빈, 블레오마이신, 플리코마이신, 미토마이신, 에토폽시드, 타목시펜, 탁솔, 트랜스백금(transplatinum), 5-플루오로우라실, 빈크리스틴, 빈블라스틴 및 메토트렉세이트를 포함한다. 본 발명의 조성물과 함께 사용될 수 있는 방사선 치료요법은 X-선 방사선 및 γ-선 방사선 등일 수 있다.

본 발명의 아데노바이러스 벡터로부터 생성된 아데노바이러스는 시험관내 및 생체내 실험으로부터 정상 세포에 낮은 효과를 나타내는 한편, 종양 세포에서는 높은 종양살상 효과를 나타낸다. 따라서, 본 발명의 종양 특이적 프로모터를 포함하는 바이러스 벡터는 암을 치료하는데 사용될 수 있다.

하기 실시예는 단지 예시를 위해 제공되는 것일 뿐 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것이 아니다.

실시예 1: 전사인자 E2F -1 또는 TCF -1의 결합부위를 포함하는 종양 특이적 프로모터의 동정 및 이들의 활성 분석

<1-1> 종양 특이적 프로모터의 동정

종양 특이적 프로모터를 선정하기 위하여, hDNMT-1(Genbank Accession No. NC_000019)의 개시 코돈으로부터 약 2000 b.p 범위의 상류 영역을 분석하였다. 구체적으로, 전사인자 E2F-1의 결합 모티프로 알려진 TTT(C/G)GCGC 서열 및 WNT 신호전달 경로에 관여하는 전사인자 TCF-1의 결합 모티프로 알려진 (A/T)(A/T)CAAAG 서열을 함유하는 전사 조절 요소를 탐색하고, 전사 결합 부위 예상 프로그램 TRANSFAC(Heinemeyer T et al . Nucleic Acids Res. 1998;26;364)와 TFSEARCH(http://mbs.cbrc.jp)를 이용하여 전사 결합 예상 지도를 작성하였다. 상기 지도를 기초로, 주형으로서 인간 게놈 DNA(Clontech, CA), 각각 서열번호 1 및 2의 센스 및 안티센스 프라이머 및 Ex-Taq 폴리머라제(Takara, Japan)를 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. 상기 반응은 하기 조건 하에서 수행하였다: 94℃에서 5분간 초기 변성(denaturation) 후 94℃에서 30초간 변성, 56℃에서 30초간 어닐링(annealing) 및 72℃에서 1분간 연장(extension)을 30회 수행한 후, 72℃에서 1분간 최종 연장. PCR에 의해 증폭된 DNA 단편(DS 프로모터)을 겔 추출에 의해 정제한 다음, pCR2.1-TOPO 플라스미드 벡터(Invitrogen, CA)에 삽입하여 pCR-DS를 제작하였다. 제한효소를 이용한 개열지도와 뉴클레오티드 서열 분석에 의해, 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 갖는 "DS 프로모터"의 삽입을 확인하였다. 상기 플라스미드를 EcoRI으로 절단하고, 상기 절단된 단편을 루시퍼라아제 리포터 벡터인 phRL-null 벡터(Promega, WI)에 삽입하여 phRL-DS를 제작하였다(도 1a).

또한, 각각 서열번호 3 및 4의 센스 및 안티센스 프라이머를 사용하는 것을 제외하고, 상기 PCR 반응을 반복함으로써, 대조군으로서 기존에 확립된 E2F 프로모터를 합성하였다. PCR에 의해 증폭된 단편을 pCR2.1-TOPO 플라스미드 벡터에 삽입하고, 상기 프로모터를 함유하는 단편을 전술한 방법에 따라 phRL-null 벡터에 삽입하여 서열번호 9의 hE2F-1 프로모터를 함유하는 phRL-E2F를 제작하였다(도 1b).

한편, 종래 프로모터 CMV 또는 SV40을 각각 함유하는 루시퍼라아제 벡터 phRL-CMV 및 phRL-SV40(Promega, WI)을 대조군으로 사용하였다.

상기 획득한 프로모터와 그 뉴클레오티드 서열 및 PCR에 사용한 프라이머를 표 1에 나타내었다.

프로모터 종류와 염기서열 및 PCR에 사용한 프라이머

프로모터	뉴클레오티드 서열	PCR 프라이머
DS 프로모터	서열번호 8	센스 프라이머 (서열번호 1); 안티센스 프라이머 (서열번호 2)
E2F 프로모터	서열번호 9	센스 프라이머 (서열번호 3); 안티센스 프라이머 (서열번호 4)

<1-2> 종양 특이적 프로모터에 의한 루시퍼라아제 활성의 측정

실시예 1에서 얻은 DS 프로모터의 종양 세포 특이성을 측정하기 위하여, 정상 세포와 종양 세포 및 루시퍼라아제 리포터 벡터를 이용하여 루시퍼라아제 활성을 측정하였다.

정상 세포주로서, MRC-5(폐 섬유아세포, ATCC CCL-171), WI38(폐 섬유아세포, ATCC CCL-75), SAEC(소호흡기 상피세포, CAMBREX, U.S.), HMEC(유선 상피세포, CAMBREX, U.S.), PrEC(전립선 상피세포, CAMBREX, U.S.), HRE(인간 신장 상피세포, CAMBREX, U.S.) 및 bMVEC-B(뇌 미세혈관 내피세포, CAMBREX, U.S.)를 사용하였다. 종양 세포주로서, A549(비소세포폐암, ATCC CCL-185), H358(비소세포폐암, ATCC CRL-5807), H460(비소세포폐암, ATCC HTB-177), H596(비소세포폐암, ATCC HTB-178), H2009(비소세포폐암, ATCC CRL-5911), H2172(비소세포폐암, ATCC CRL-5930), Hep3B(간세포암, ATCC HB-8064), Huh-7(간세포암, KCLB 60104), HeLa(자궁암, ATCC CCL-2), DU145(전립선암, ATCC HTB-81), C33A(자궁암, ATCC HTB-31), Miapaca-2(췌장암, ATCC CRL-1420), MDA-MB-231(유방암, ATCC HTB-26), HT29(대장암, ATCC HTB-38) 및 U2OS(골암, ATCC HTB-96)을 사용하였다. 각 세포를 제조사의 배양 방법에 따라 배양하였다.

구체적으로, 정상 세포 및 종양 세포를 6-웰 플레이트(TPP, Swizerland)의 각 웰에 4×10⁵ 세포/웰의 수로 배양하였다. 상기 배양된 세포를 폴리에틸렌이민 형질주입 시약(Jet-PEI, Polyplus, France)을 이용하여 실시예 <1-1>에서 제작된 각각의 루시퍼라아제 벡터 2 μg 및 pcDNA-lacZ 1 μg으로 동시에 형질주입시켰다. 상기 형질주입된 세포를 37℃에서 48시간 동안 배양한 후, 트립신-EDTA를 가하여 수거하고, 3,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 세포와 배지를 분리하였다. 상기 분리된 세포를 200 μL의 용해 완충액(25 mM 트리스-포스페이트, pH 7.8, 2 mM DTT(Dithiothreitol), 2 mM 1,2-디아미노사이클로헥산 N,N,N,N'-테트라아세트산, 10% 글리세롤, 1%의 트리톤 X-100)에 재현탁시킨 다음, 냉동과 해동을 2회 반복하여 세포를 용해시켰다. 상기 세포 용해물을 10,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 얻어진 상층액 80 μL를 루시퍼라아제 분석 키트(Renilla Luciferase Assay System, Promega, WI)를 이용하여 효소-기질 반응을 수행한 후, 형광 마이크로플레이트 리더(Microlumat Plus, EG&G BERTHOLD, Germany)를 이용하여 루시퍼라아제 활성을 분석하였다. 또한, 형질주입 효율을 보정하기 위해, 상기 상층액 25 μL를 β-갈락토시다제 분석 키트(β-Galactosidase Enzyme Assay System, Promega, WI)를 이용하여 효소-기질 반응을 수행한 다음, 흡광기(Spectra Shell Microplate Reader, STL Spectra, Italy)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한, 세포 내 단백질 농도를 보정하기 위하여, 상기 상층액 10 μL를 취하여 브래드포드 염색액(BIO-RAD Protein dye, Bio-Rad, CA)을 이용하여 단백질 염색을 수행한 후, 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 프로모터에 의해 유도된 루시퍼라아제 활성을 갈락토시다제 활성값과 단백질 농도를 기준으로 한 상대적 값으로 도 2a에 나타내었다.

도 2a에 나타난 바와 같이, DS 프로모터는 정상 세포보다 종양 세포에서 높은 루시퍼라아제 활성을 유도하였고, DS 프로모터에 의해 유도된 루시퍼라아제 활성은 종양 특이적 프로모터 E2F에 의해 유도된 것보다 동등하거나 10배 높았다. 특히, 정상 세포(WI38, MRC-5 및 SAEC)의 활성값을 종양 세포의 활성값으로 나누어 계산된 프로모터의 종양 특이성에 있어서, DS 프로모터가 E2F 프로모터에 비해 2.5배 내지 100배 우수하였다(도 2b 내지 2D).

<1-3> 변형형 DS 프로모터의 제작

실시예 <1-1>에서 획득한 DS 프로모터의 변형에 따른 종양 특이적 활성의 변화를 살펴보기 위하여, 3종의 변형형 프로모터를 제작하였다: a) DS 프로모터를 포함하는, 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DL 프로모터; b) E2F 프로모터의 5' 영역이 결실된, 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열을 갖는 5'E2F 프로모터; 및 c) 5'E2F 프로모터가 DS 프로모터와 융합된, 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열을 갖는 5'ED 프로모터.

구체적으로, 각각 서열번호 5 및 2의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하는 것을 제외하고 실시예 <1-1>에 기재된 PCR 반응을 반복함으로써, 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DL 프로모터를 얻고, 이를 pCR2.1-TOPO 플라스미드 벡터에 삽입하여 pCR-DL을 제작하였다. 상기 플라스미드 pCR-DL을 EcoRI으로 절단하고, 상기 절단된 단편을 EcoRI으로 절단된 phRL-null 벡터에 삽입하여, 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DL 프로모터를 함유하는 루시퍼라아제 벡터 phRL-DL을 제작하였다(도 3a).

또한, 각각 서열번호 6 및 4의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하는 것을 제외하고 실시예 <1-1>에 기재된 PCR 반응을 반복함으로써, 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열을 갖는 5'E2F 프로모터를 얻고, 이를 pCR2.1-TOPO 플라스미드 벡터에 삽입하여 pCR-5'E2F를 제작하였다. 상기 플라스미드 pCR-5'E2F를 EcoRI으로 절단하고, 상기 절단된 단편을 EcoRI으로 절단된 phRL-null 벡터에 삽입하여, 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열을 갖는 5'E2F 프로모터를 함유하는 루시퍼라아제 벡터 phRL-5'E2F를 제작하였다(도 3b).

나아가, 상기 pCR-5'E2F 플라스미드를 SacI 및 XhoI으로 절단하고, 상기 절단된 단편을 실시예 <1-1>에 기술된 phRL-DS의 SacI/SalI 영역에 삽입하여 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열을 갖는 5'ED 프로모터를 함유하는 phRL-5'ED 플라스미드를 제작하였다.

<1-4> 변형형 DS 프로모터의 루시퍼라아제 활성 측정

플라스미드 phRL-DS, phRL-DL, phRL-5'ED, phRL-E2F 및 phRL-5'E2F 및 phRL-CMV를 실시예 <1-2>에 기재된 바와 같이 각 세포주에 각각 형질주입시켰다. 프로모터에 의해 유도된 루시퍼라아제 활성이 도 4a에 나타나 있다.

그 결과, 종양 특이적 프로모터에 대한 음성 대조군으로 사용된 CMV 프로모터는 정상 세포와 종양 세포에서 루시퍼라아제 활성차를 관찰할 수 없었고, 따라서 종양 특이적 유도 활성을 지니지 않는 것을 확인하였다. 한편, DS 프로모터를 포함한 종양 특이적 프로모터들은 정상 세포 대비 종양 세포에서 높은 루시퍼라아제 활성을 나타내었다. DL 및 5'ED 프로모터와 같은 변형형 DS 프로모터는 DS 프로모터에 비해 종양 세포에서 증가된 활성을 보이지 않았으나, MRC-5 및 WI-38과 같은 정상 세포 대비 종양 특이성은 DS 프로모터에 비해 50-100% 개선되었으며, 특히 WI-38 대비 종양 특이성의 경우 E2F 프로모터에 대해 20배 이상 우수한 것으로 관찰되었다(도 4b 및 4C).

<1-5> 종양 특이적 프로모터 활성의 기작 검증

DS 프로모터 활성과 유전적 환경 사이의 관련성을 조사하기 위해, siRNA를 이용하였다. A549 세포를 60% 세포 밀도에 도달할 때까지 6-웰 플레이트에서 배양하고 배지를 opti-MEM 배지로 치환하였다. 그리고, 세포를 리포펙타민 2000(Invitrogen, CA)을 이용하여 250 pmol의 E2F-1 siRNA(서열번호 15) 및 β-카테닌 siRNA(서열번호 16)으로 각각 형질주입시켰다. 37℃, 5% CO₂에서 6시간 동안 배양한 후, 배지를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지로 치환한 다음, 세포를 실시예 <1-2>에 기재된 방법에 따라 phRL-DS 벡터로 형질주입시켰다. 48시간 배양 후, DS 프로모터에 의해 유도된 루시퍼라아제 활성을 측정하였고, 이는 도 5a 및 5B에 나타나 있다. 도 5a는 β-카테닌 또는 E2F-1에 대한 siRNA의 처리 후, DS 프로모터와 SV40 프로모터에 의해 유도된 루시퍼라아제의 상대적 활성을 나타낸 것이고, 도 6b는 대조군 siRNA로 처리시 얻어진 값을 100으로 가정한 것에 기초한 도 5a의 값의 변환값을 나타낸다.

그 결과, A549 세포주에서 E2F-1 및 β-카테닌에 대한 siRNA의 처리에 의해 DS 프로모터 유도된 루시퍼라아제 활성이 비특이적 siRNA 처리와 비교하여 약 40% 감소하였다(도 5b). 그러나, E2F-1과 β-카테닌의 억제에 의한 프로모터 활성 감소는 음성 대조군인 SV40 프로모터의 경우에는 관찰되지 않았으며, 이는 DS 프로모터의 활성이 E2F-1 및 β-카테닌에 의존적임을 보여준다.

DS 프로모터 내에 존재하는 E2F 전사인자 결합 모티프가 DS 또는 DL 프로모터에 어떠한 영향을 미치는지 조사하기 위해, E2F 결합 모티프가 결실된 dDS 및 dDL 프로모터를 제작하였다. 구체적으로, 서열번호 1 및 7의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 실시예 <1-1>에 기재된 방법에 의해 dDS 프로모터(서열번호 13)를 함유하는 루시퍼라아제 벡터 phRL-dDS를 제작하였다(도 6a). 동일한 방법에 의해, 서열번호 5 및 7의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 dDL 프로모터(서열번호 14)를 함유하는 루시퍼라아제 벡터 phRL-dDL을 제작하였다(도 6b). 상기 제작된 벡터 phRL-dDS, phRL-dDL 및 비교를 위한 phRL-DS 및 phRL-DL을 실시예 <1-2>에 기재된 방법대로 A549 세포에 형질주입하였다. 48시간 배양 후, 각 프로모터에 의해 유도된 루시퍼라아제 활성을 측정하였고, 그 결과가 도 7에 나타나있다. 도 7에서 보는 바와 같이, dDS 프로모터에 의해 유도된 루시퍼라아제 활성은 DS 프로모터 대비 약 80% 감소하였고, dDL 프로모터에 의해 유도된 활성은 DL 프로모터 대비 50% 감소하였다. 이 결과는 프로모터와 E2F 전사인자 간의 결합이 DS 또는 DL 프로모터 활성에 중요함을 시사한다.

실시예 2: 종양 특이적 프로모터를 함유하는 아데노바이러스 벡터 및 이를 이용한 아데노바이러스의 제조

<2-1> 아데노바이러스 벡터 제작

아데노바이러스 벡터 제작에 필요한 셔틀벡터를 다음과 같이 제작하였다. pENTR2B 벡터(Invitrogen, CA)를 EcoRI으로 절단하여 ccdB 부위를 제거하였다. 본 발명자들에 의해 제작된 pAAV-CMV_LK8_UN 플라스미드(국제출원공개 WO2009/102085 참조)를 KpnI/BglII(후에 평활화함)으로 절단하여 CMV_LK8 단편을 얻은 후, 상기 CMV_LK8 단편을 KpnI/XhoI(후에 평활화함)으로 절단된 pENTR2B 벡터 내로 삽입하여 pENTR-CMV_LK8을 제작하였다.

한편, 실시예 <1-1>에서 제작된 pCR-DS를 SacI과 XhoI으로 절단하고, 상기 얻어진 단편을 ClaI과 SalI으로 절단된 pSP72-E2F_mE1A_ΔE1B19K(mE1A: 대한민국 특허등록 제746122호 참조; ΔE1B19K: 대한민국 특허등록 제432953호 참조) 내로 삽입하여 pSP72-DS_mE1A_ΔE1B19K를 제작하였다.

또한, 실시예 <1-1>에 제작된 pCR-5'E2F를 BamHI(후에 평활화 함) 및 EcoRV로 절단하고, 상기 얻어진 단편을 Spe I(후에 평활화함)으로 절단된 pSP72-DS_mE1A_ΔE1B19K 플라스미드 내로 삽입하여 pSP72-5'ED_mE1A_ΔE1B19K를 제작하였다.

마지막으로, 상기 pSP72-DS_mE1A_ΔE1B19K, pSP72-5'ED_mE1A_ΔE1B19K 및 pSP72-E2F_mE1A_ΔE1B19K 플라스미드를 각각 BamHI으로 절단하고, 얻어진 각 단편을 BglII로 절단된 pENTR-CMV_LK8 내로 삽입하여, 각각 셔틀벡터 pENTR-CMV_LK8-DS_mE1A_ΔE1B19K(pENTR-LK8-DS_E1), pENTR-CMV_LK8-5'ED_mE1A_ΔE1B19K(pENTR-LK8-ED_E1), pENTR-CMV_LK8-E2F_mE1A_ΔE1B19K(pENTR-LK8-E2F_E1)를 제작하였다(도 8a 내지 8C).

또한, 상기 pENTR-LK8-DS_E1을 XmnI과 SpeI으로 절단하여 CMV_LK8을 제거하였다. 상기 절단된 벡터를 클레나우 효소(NEB, MA)를 이용하여 평활화하고 자가 접합시켜 pENTR-DS_mE1A_ΔE1B19K(pENTR-DS_E1)를 제작하였다(도 8d). 상기 제작된 4개의 셔틀벡터, pENTR-LK8-DS_E1, pENTR-LK8-ED_E1, pENTR-LK8-E2F_E1 및 pENTR-DS_E1을 LR 클로나제(Invitrogen, CA)를 이용하여 하기와 같이 아데노바이러스 벡터 pAd/PL-Dest(Invitrogen, CA) 내로 각각 삽입하였다. 구체적으로, 각각의 셔틀벡터 300 ng과 pAd/PL-Dest 벡터 100 ng을 혼합하고, 여기에 16 μL의 클로나제 I 반응 완충액(Invitrogen, CA) 및 2 μL의 클로나제 I을 연속 첨가하고, 25℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그리고 나서, 여기에 2 μL의 프로티나제 K(2 μg/μL)를 첨가하여 37℃에서 10분간 반응시켰다. DH5α과 같은 컴피턴트 세포를 상기 반응액 10 μL로 형질전환하여 암피실린 저항성 플레이트에 도말하였다. 단일 콜로니로부터 유래한 형질 전환체로부터 DNA를 정제한 후, 제한효소를 이용한 개열 지도와 염기서열 분석에 의해 표적 아데노바이러스 벡터의 존재를 확인하고 상기 아데노바이러스 벡터를 각각 "pAd/PL-8DS", "pAd/PL-8ED", "pAd/PL-8E2F" 및 "pAd/PL-DS"로 명명하였다(도 9a 내지 9D).

<2-2> 종양 특이적 재조합 아데노바이러스의 제조 및 정제

실시예 <2-1>에서 제작된 각각의 아데노바이러스 벡터 3 μg을 PacI으로 절단하고, 6-웰 플레이트에 2×10⁵ 세포/웰로 배양된 A549 세포에 Jet-PEI(Polyplus, France)를 이용하여 형질주입시켰다. 48시간 배양 후, 세포를 100 mm² 페트리디쉬에 계대배양하고 2일마다 10 mL의 DMEM/10% FBS를 교환하였다. 형질주입 약 10일 후 세포변성효과(cytopathic effect, CPE)가 나타나면, 세포와 배지를 회수한 다음 동결 및 해동을 2회 반복하여 세포를 용해시켰다. 세포 용해물을 3000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 얻어진 상층액을 10^-4부터 10^-9까지 순차 희석하고, 희석된 상층액 200 μL를 A549 세포가 2×10⁵ 세포/웰로 배양된 6-웰 플레이트에 감염시켰다. 1시간 동안 배양한 후, 배지를 제거하고, 3 mL의 1.5% 아가로스/DMEM/10% FBS를 세포 위에 중층시키고, 2일 내지 3일마다 1 mL의 1.5% 아가로스/DMEM/10% FBS를 첨가하였다. 10 내지 14일 후, 각각의 바이러스 당 10개의 플라크(rAd/PL-8DS-1~10, rAd/PL-8ED-1~10, rAd/PL-8E2F-1~10, rAd/PL-DS-1~10)를 회수하여 1 mL의 DMEM 배지에 4℃에서 현탁한 다음, 상기 플라크 현탁액 500 μL를 A549 세포가 2×10⁶ 세포/웰로 배양된 100 mm² 페트리디쉬에 첨가하였다. 감염 후 약 3일 또는 5일째에 세포변성효과가 나타나면, 세포와 배지를 회수한 후, 동결 및 해동을 2회 반복하여 세포를 용해시켰다. 상기 세포 용해물을 3000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 얻어진 상층액을 0.45 μm 실린지 필터(Millex-GV, Millipore)를 이용하여 여과시키고, 얻어진 바이러스를 "A(0) 바이러스"로 명명하였다(각각 rAd-8DS-1~10_A(0), rAd-8ED-1~10_A(0), rAd-8E2F-1~10_A(0), rAd-DS-1~10_A(0)).

A(0) 바이러스의 아데노바이러스 농도(titer)를 퀵타이터(QuickTiter)^TM 아데노바이러스 농도 면역분석 키트(Cell Biolabs)에 의해 측정하였다. 구체적으로, 각 바이러스를 10^-4 내지 10^{- 7}으로 10배 연속 희석하고, HEK293 세포가 4×10⁴ 세포/웰로 배양된 24-웰 플레이트에 감염시켰다. 2일간 배양 후, 배지를 제거하고, 0.5 mL의 100% 메탄올(Merck)을 첨가하여 세포를 고정시킨 다음, 1×PBS로 5회 세척하였다. 그리고 나서, 1% BSA/PBS를 첨가하여 1시간 동안 세포를 블로킹하고, 0.25 mL의 1×항-헥손(anti-Hexon) 항체 용액를 첨가한 후 1시간 동안 배양하였다. 세포를 1×PBS로 3회 세척하고, 0.25 mL의 1×HRP-접합 2차 항체 용액을 첨가한 후 1시간 동안 배양하였다. 세포를 다시 1×PBS로 3회 세척하고, 염색을 위해 0.25 mL의 1×DAB 작업액을 첨가한 후, 10분~30분간 배양하였다. 현미경을 이용하여 염색된 세포의 수를 측정하였다. 아데노바이러스 농도(감염성 단위/mL; IFU/mL)를 하기 식에 의해 계산하였고, 상기 식에서 N은 24-웰 플레이트(웰 면적: 2.0 ㎠)에서 총 100배 배율(필드 면적: 2.54 ㎟)을 갖는 현미경에 의해 관찰된 염색된 세포의 수를 가리킨다.

IFU/mL = (N × 79(웰 면적/필드 면적) × 희석배수)/(0.1 mL)

24-웰 플레이트에 4×10⁴ 세포/웰로 배양된 A549 및 MRC-5 세포를 rAd-8DS-1~10A(0)(상기 측정된 IFU 기준, MOI=10)으로 감염시켰다. 감염 1일 후, 각각의 세포를 회수하고, 아데노바이러스 E1A 유전자의 발현을 Ad5 E1A 항체(BD Pharmingen)를 이용하여 웨스턴 블롯법에 의해 검출하였다. rAd-8DS-1~10_A(0)에서의 검출된 E1A 발현을 비교하여, MRC-5 세포(정상 세포) 대비 A549 세포(종양 세포)에서 높은 E1A 발현 수준을 나타내는 바이러스 클론, rAd-8DS-6_A(0)를 선정하였다(도 10). 마찬가지로, 다른 바이러스의 경우, 웨스턴 블롯법에 의한 E1A 발현에 기초하여 클론 rAd-DS-7_A(0), rAd-8ED-6_A(0) 및 rAd-8E2F-1_A(0)를 선정하였다. 상기 선발된 바이러스를 하기 대량 생산에 사용하였다.

30개의 T175 ㎟ 플라스크에 2×10⁷ 세포수로 배양된 A549 세포를 상기 선발된 A(0) 바이러스(MOI=5)로 감염시켰다. 감염 2일 후 세포변성효과가 나타나면, 모든 세포를 회수하여 20 mL의 세포 용해 완충액(500mM Tris, 1mM MgCl₂, pH 8.0)에 현탁시킨 다음, 동결 및 해동을 3회 반복하여 세포를 용해시켰다. 상기 세포 용해물을 3000 rpm에서 5분간 원심분리하였다. 얻어진 상층액을 0.8 μm(Millex-AA, Millipore) 및 0.22 μm(Millex-GV, Millipore) 실린지 필터를 통해 순차 여과하고, 벤조나제(benzonase, 250 U/μL, Novagene)를 최종농도 10 U/mL로 처리한 후, 37℃에서 30분간 배양하였다.

상기에서 제작된 바이러스를 이중 CsCl 구배법에 의해 정제하였다. 먼저, 원심분리 튜브에 비중 1.4의 염화세슘 용액(53g CsCl, 87mL 10mM Tris-HCl, pH 7.9) 8 mL, 비중 1.2의 염화세슘 용액(26.8g CsCl, 92mL 10mM Tris-HCl, pH 7.9) 6 mL 및 상기 세포 용해액을 순서대로 중층하였다. 그리고 나서, 튜브를 SW28 로터(rotor, Beckman)와 초원심분리기(XL-70, Beckman)를 이용하여 23,000 rpm(100,000×g), 4℃에서 90분간 원심분리하였다. 원심분리 후, 18G 바늘을 이용하여 백색의 바이러스 밴드를 회수하였다. 다시 동일한 부피 이상의 1×TE 완충액를 첨가하여 상기 기재된 초원심분리를 수행하였다. 상기 바이러스 분리액을 PBS로 평형화한 반투과막 투석카세트(Slide-A-Lyzer10K, Pierce Biotechnology)에 주입한 후, 저장 완충액(1mM MgCl₂, 10% 글리세롤/PBS)에서 종일 투석하였다. 새로운 저장 완충액으로 교환한 후, 바이러스를 다시 약 4시간 동안 투석한 다음, 18G 바늘을 이용하여 분주한 것을 "A(1) 바이러스"로 명명하였다(rAd-8DS-6_A(1), rAd-8ED-6_A(1), rAd-8E2F-1_A(1) 및 rAd-DS-7_A(1)).

상기에서 정제된 바이러스의 물리적 입자(physical particle) 농도를 광학 밀도 측정법에 의해 계산하였다. 30% 및 80% 바이러스 희석액을 조제하고, 상온에서 20분간 배양한 후, 자외선 흡광기(DU650, Beckman)를 이용하여 260 nm에서 OD 값을 측정하였다. 아데노바이러스의 물리적 입자 농도(VP/mL)를 하기 식에 의해 계산하였다.

VP/mL = A₂₆₀×(1.1×10¹² 입자/mL)×(1/희석배수)

실시예 3: 재조합 아데노바이러스의 시험관내 종양살상 효과

실시예 <2-2>에서 제작된 재조합 아데노바이러스의 종양살상 효과를 세포변성효과(Cytopathic effect, CPE)법에 의해 조사하였다. 구체적으로, 48-웰 플레이트에 1×10⁴ 세포/웰로 배양된, 정상 세포주, 예컨대 MRC-5, WI38 및 SAEC 및 종양 세포, 예컨대 A549, H358, H460, H596, H2172, C33A, Hep3B, DU145, Miapaca-2, MDA-MB231 및 U2OS를 순차희석에 의한 IFU 기준 20 내지 0.005 MOI의 재조합 바이러스로 감염시켰다. 정상 세포주의 경우 감염 10일째에 그리고 종양 세포주의 경우 감염 7일째에 크리스탈 바이올렛 용액으로 생존 세포를 염색하여 바이러스의 종양살상 효과를 조사하였다. 대조군으로, 아데노바이러스 rAd-mE1A_ΔE1B19K(rAd-Rb7Δ19)(대한민국 특허등록 제432953호 및 제746122호 참조)와 E1A를 LacZ로 치환시킨 rAd-LacZ를 사용하였다.

도 11에서 보는 바와 같이, rAd-8DS의 세포 살상능(세포 독성)은 정상 세포에서 rAd-mE1A_ΔE1B19K(rAd-Rb7Δ19)보다 5 내지 10배 낮았지만, 종양 세포에서는 동등한 세포 살상능을 유도하여, 이는 DS 프로모터의 도입에 의해 종양 특이적 살상능이 5 내지 10배 증가하였음을 입증한다. 한편, 도 12에서 보는 바와 같이, DS 프로모터는 정상 세포에서 E2F 프로모터보다 동등하거나 2배에서 5배 낮은 세포 독성을 유도하지만, 종양 세포에서는 5배에서 10배 높은 세포 살상능을 유도하였다. 또한, 5'ED 프로모터는 정상 세포에서 E2F 프로모터보다 약 10배 낮은 세포 살상능을 나타낸 반면, 종양 세포주에서는 동등한 세포 살상능을 보여주었다. 이 결과들은 DS 프로모터와 5'ED 프로모터의 종양 세포 선택성이 기존에 확립된 E2F 프로모터보다 약 10배 이상 우수함을 보여준다.

실시예 4: 재조합 아데노바이러스의 생체내 항암 효과

<4-1> 폐암 이소성 이식모델에서의 종양 특이적 프로모터의 종양살상 효과

5×10⁶ 세포수의 비소세포폐암 세포주 NCI-H2172를 면역결핍 마우스의 옆구리 피하에 주입하여 50-100 ㎣의 종양을 형성시켰다. 종양 형성 후, 마우스를 각각 14마리씩 4개의 그룹으로 나누었다. 각 그룹의 마우스에 각각 1×10⁹ IFU/mL의 rAd-LacZ, rAd-8E2F, rAd-8DS 및 rAd-8ED를 이틀 간격으로 세 번 투여한 다음, 종양의 크기와 마우스의 생존율을 관찰하였다. 상기 결과가 도 13a 및 13B에 나타나 있다. 종양 세포 성장의 경우, 바이러스 투여 후 29일째에 rAd-8E2F, rAd-8ED 및 rAd-8DS는 각각 대조군과 비교하여 종양 세포 형성의 59%, 65% 및 77%의 억제율을 나타내었다. 스튜던트 t-검정에 의해, rAd-8E2F와 rAd-8ED는 유의성을 보이지 않았으나, rAd-8DS는 rAd-8E2F 및 rAd-8ED에 대해 각각 P<0.016 및 P<0.006의 유의성을 보였다(도 13a). 생존율의 경우, rAd-LacZ, rAd-8E2F, rAd-8ED 및 rAd-8DS 그룹에서의 중간생존일(median survival time)은 각각 60일, 78일, 81일 및 95일이었다. 특히 rAd-8DS는 rAd-LacZ 대비 중간생존일의 증가율이 58%라는 점에서 가장 우수하였다. 통계적 유의성 면에서, rAd-8DS는 rAd-8E2F 및 rAd-8ED에 대해 모두 P<0.001로 유의한 값을 나타내었다(도 13b).

또한, 마우스의 종양 조직을 다음의 면역화학염색법을 이용하여 분석하였다. H&E 염색법에 의해 세포질과 핵을 확인하였고, TUNEL 분석법에 의해 사멸세포의 수를 확인하였으며, CD34 항체를 사용하여 혈관 내피세포를 확인하였고, PCNA 염색법에 의해 증식세포를 검출하였다(Wada H et al., Oncology Report, (2007) 18:801). 도 14에서 보는 바와 같이, 각각 rAD-8DS, rAd-8E2F 및 rAd-8ED를 투여한 마우스는 rAd-LacZ 투여 마우스와 비교하여 종양 세포에서 세포사멸 촉진, 혈관형성 억제 및 세포증식 억제를 나타내었다. 특히 rAd-8E2F 및 rAd-8ED를 투여한 마우스와 비교하여 rAD-8DS를 투여한 마우스에서, 세포사멸이 보다 촉진되었다.

<4-2> 폐암 이소성 이식모델에서의 LK8 도입에 의한 항종양 효과

실시예 <4-1>에 기재된 방법에 따라, 비소세포폐암 세포주 NCI-H2172를 면역결핍 마우스 내로 이식하고, 그룹 당 14마리의 종양 이식 마우스에 1×10⁹ IFU/mL 농도의 rAd-LacZ, rAd-DS 및 rAd-8DS를 각각 이틀 간격으로 세 번 투여한 다음, 종양의 크기와 생존율을 관찰하였다. 상기 결과가 도 15a 및 15B에 나타나 있다. 종양 세포 성장의 경우, 바이러스 투여 후 29일째에, rAd-DS 및 rAd-8DS는 대조군 rAd-LacZ와 비교하여 57% 및 77%의 종양 세포 형성의 억제율을 나타내었으며, 이는 LK8의 도입에 의하여 억제율이 약 20% 증가하였음을 입증한다. 또한, rAd-8DS는 rAd-DS에 대해 P<0.004의 유의성을 나타내었다(도 15a). 생존율의 경우, rAd-LacZ, rAd-DS 및 rAd-8DS 그룹에서의 중간생존일은 각각 60일, 74일 및 95일이었으며, 이는 LK8의 도입에 의하여 중간생존일이 약 35% 증가하였음을 입증한다. 마찬가지로, rAd-8DS는 rAd-DS에 대하여 P<0.001로 유의한 값을 나타내었다(도 15b).

한편, 면역화학 염색법의 결과, rAd-8DS를 투여한 마우스는 rAd-DS를 투여한 마우스와 비교하여 종양 세포에서 세포사멸 증가, 혈관형성 억제 및 세포 증식 억제를 나타내었다(도 16a 및 16B). 이 결과는 LK8의 도입이 항종양 활성을 증가시켰음을 확인시켜준다.

<4-3> 폐암 동소성 이식모델에서의 rAd -8 DS 의 항종양 효과

1×10⁶ 세포수의 비소세포폐암 세포주 NCI-H2172를 꼬리 정맥 주사를 통해 면역 결핍 마우스에 주입하였고, 일주일 후 그룹 당 10마리씩 3개의 그룹으로 피검체를 나누었다. 각 그룹에 1×10¹⁰ vp/mL의 rAd-LacZ, rAd-DS 및 rAd-8DS를 각각 이틀 간격으로 세 번 투여한 다음, 6주 후에 폐를 적출하여 종양 결절(nodule)의 수를 조사하였다.

그 결과, rAd-LacZ, rAd-DS 및 rAd-8DS를 투여한 그룹에서 각각 평균 28개, 17개 및 12개의 종양 결절이 발견되었다. 통계 분석 결과, rAd-LacZ를 투여한 그룹에 대해 rAd-DS는 유의성을 나타내지 않았지만, rAd-8DS는 유의성을 나타내었다(도 17a). 면역화학 염색법 분석 결과, rAd-8DS를 투여한 마우스는 rAd-DS를 투여한 마우스와 비교하여 종양 세포에서 세포사멸 증가, 혈관형성 억제 및 세포 증식 억제를 나타내었다(도 17b). 이 결과는 rAd-8DS가 rAd-DS보다 더 우수한 항종양 효과를 가짐을 보여주었다.

<4-4> 흑색종 동소성 이식모델에서의 rAd -8 DS 의 항종양 효과

1×10⁶ 세포수의 흑색종 세포주 A373SM을 면역결핍 마우스의 옆구리에 피하주입하여 50-100 ㎣ 크기의 종양을 형성시키고, 그룹 당 15마리씩 3개의 그룹으로 피검체를 나누었다. 각 그룹의 마우스에 각각 1×10¹⁰ vp/mL의 rAd-LacZ, rAd-DS 및 rAd-8DS를 이틀 간격으로 세 번 투여한 다음, 종양의 크기와 생존율을 관찰하였다. 종양 세포 성장의 경우, 바이러스 투여 후 34일째에, rAd-DS는 대조군 rAd-LacZ와 비교하여 각각 47% 및 65%의 종양 세포 형성의 억제율을 나타내었다(도 18a). 생존율의 경우, rAd-LacZ, Ad-DS 및 Ad-LK8-DS 그룹에서의 중간생존일은 각각 66일, 72.5일 및 94일이었으며, 이는 LK8의 도입에 의해 rAd-DS를 투여한 그룹과 비교하여 중간생존일이 32.6% 증가하였음을 보여준다(도 18b). 면역화학 염색법의 경우, rAd-8DS를 투여한 마우스는 rAd-DS를 투여한 마우스와 비교하여 종양 세포에서 세포사멸 증가, 혈관형성 억제 및 세포 증식 억제를 나타내었다. 이 결과는 rAd-8DS의 그룹이 다른 그룹보다 더 우수한 항종양 활성을 가짐을 확인시켜준다(도 18c).

실시예 5: 혈청형 35( Ad35 )의 파이버( fiber ) 단백질로 치환된 아데노바이러스 제조 및 유전자 전달 효율의 측정

현재 알려진 인간 아데노바이러스들은 감염 경로가 상이하며, 지금까지 가장 연구가 많이 된 아데노바이러스 혈청형 5(Ad5)는 세포 표면에서 발현되는 CAR(Coxsackievirus-adenovirus receptor)라고 불리는 세포 수용체와 아데노바이러스의 파이버 단백질 간의 결합에 의해 세포를 감염시키는 것으로 알려져 있다. 바이러스는 아데노바이러스의 캡시드 단백질인 펜톤(penton)의 RGD 모티프(Arg-Gly-Asp)와 세포 내 인테그린 단백질과의 상호작용에 의해 세포 내로 들어간다. 따라서, 아데노바이러스 혈청형 5의 감염 효율은 세포내 아데노바이러스 수용체인 CAR와 인테그린의 발현 수준에 의존한다. 하지만, 말초 혈액 줄기 세포, 수지상 세포, 내피세포 및 악성 종양 세포를 비롯한 많은 세포에서 CAR 및 인테그린의 발현 수준이 낮기 때문에, 아데노바이러스 혈청형 5의 감염 효율 역시 상대적으로 낮은 문제점이 있다. 이러한 이유로, 다른 아데노바이러스 혈청형을 이용한 연구가 계속 진행중이다.

아데노바이러스 혈청형 35는 CAR 대신에 유방암, 대장암 및 간암과 같은 악성종양 세포에서 발현이 높은 CD46을 통해 세포를 감염시킨다. 따라서, 본 발명자들은 아데노바이러스의 파이버 단백질을 아데노바이러스 혈청형 35의 파이버 단백질로 치환하였을 때의 유전자 전달효율을 측정하였다.

<5-1> 아데노바이러스 혈청형 35의 파이버 단백질로 치환된 아데노바이러스 제조

아데노바이러스 혈청형 35의 파이버 단백질이 삽입된 파이버 셔틀벡터를 제작하였다. 파이버 단백질의 치환에 의한 종양 세포에 대한 감염능을 시각화하기 위해, 표지 유전자로서 LacZ 유전자가 E1 부위에 삽입되고 파이버 단백질이 아데노바이러스 혈청형 35로 치환된 Ad-ΔE1/LacZ/35K 복제불능 아데노바이러스를 제조하였다.

<5-2> 다양한 세포주에서의 아데노바이러스의 전달효율 비교

실시예 <5-1>에서 제조된 아데노바이러스의 암세포 감염능을 측정하기 위하여, 다양한 정상 및 종양 세포들을 Ad-△E1/LacZ 및 Ad-△E1/LacZ/35K로 감염시켰다. 감염 48시간 후, LacZ의 발현 수준을 조사하였다. 상기 결과가 도 19 내지 21에 나타나 있다.

그 결과, CAR의 발현이 높은 HepI 및 U343 세포주에서 유전자 전달 효율이 약 3배 증가하였고, CAR의 발현이 낮은 A549 세포주에서는 약 10배 증가하였다(도 19). 또한, CAR의 발현이 낮은 세포주 및 정상 세포주에서의 유전자 전달 효율을 분석한 결과, CAR의 발현이 낮아 아데노바이러스 혈청형 5의 감염율이 낮은 종양 세포주인 FaDu와 MCF-7 세포주가 Ad35의 파이버 단백질의 치환에 의해 약 10배 이상 유전자 전달 효율이 증가하였음이 밝혀졌다. Ad35의 파이버 단백질로 치환된 아데노바이러스는 CAR 발현이 낮은 정상 세포주인 CBHEL 세포주에서 약 30배의 유전자 전달효율의 증가를 나타내었다. 상기 결과는 Ad35 파이버 단백질로 치환된 아데노바이러스가 Ad35 아데노바이러스에 대해 낮은 감염율을 갖는 세포주 또는 생체에 효과적으로 이용될 수 있음을 보여준다(도 20).

마지막으로, CAR의 발현이 전혀 없는 CHO-K1, Pro5 및 Lec3 세포주를 Ad5 아데노바이러스 및 Ad35 파이버 단백질로 치환된 아데노바이러스로 각각 감염시키고, 유전자 전달 효율을 분석하였다. 그 결과, 두 종류의 아데노바이러스는 Pro5 세포에서 비슷한 유전자 전달 효율을 나타내었지만, Ad35 파이버 단백질로 치환된 아데노바이러스는 Lec2와 CHO-K1 세포에서 Ad5 아데노바이러스와 비교하여 3배 높은 유전자 전달 효율을 나타내었다(도 21).

결론적으로, Ad35 파이버 단백질로 치환된 아데노바이러스는, 아데노바이러스 혈청형 5의 세포 수용체인 CAR 발현과 관계없이, 대부분의 세포주에서 Ad5 아데노바이러스보다 약 3 내지 30배 높은 유전자 전달 효율을 보였다. 따라서, 파이버 단백질의 치환만으로도 아데노바이러스 혈청형 5의 낮은 감염율을 극복할 수 있을 것이다.

<110> GREEN CROSS CORPORATION MOGAM BIOTECHNOLOGY RESEARCH INSTITUTE INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION, YONSEI UNIVERSITY <120> Tumor-specific promoter and oncolytic virus vector comprising the same <130> FPL201210-0068 <160> 17 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer for human DS promoter <400> 1 cttctcgctg ctttatcccc atc 23 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer for human DS promoter or DL promoter <400> 2 ctcggaggct tcagcagacg c 21 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer for human E2F promoter <400> 3 cctatgttcc ggtgtcccca cgcctccag 29 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer for human E2F promoter <400> 4 gacgctcacg gcccgcgcgg cccgg 25 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer for human DL promoter <400> 5 tcaccatgcc cagcaaatct ttg 23 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer for human 5'E2F promoter <400> 6 ccacttttac gcgccaaatc ctttttgccg cga 33 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer for human dDS or dDL promoter <400> 7 atggggaggg gcgatgagcg gag 23 <210> 8 <211> 342 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tumor specific DS promoter <400> 8 cttctcgctg ctttatcccc atcacacctg aaagaatgaa tgaatgaatg cctcgggcac 60 cgtgcccacc tcccagcaaa ccgtggagct tggacgagcc cactgctccg cgtggggggg 120 gtgtgtgccc gccttgcgca tgcgtgttcc ctgggcatgg ccggctccgt tccatccttc 180 tgcacagggt atcgcctctc tccgtttggt acatcccctc ctcccccacg cccggactgg 240 ggtggtagac gccgcctccg ctcatcgccc ctccccatcg gtttccgcgc gaaaagccgg 300 ggcgcctgcg ctgccgccgc cgcgtctgct gaagcctccg ag 342 <210> 9 <211> 411 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tumor specific E2F promoter <400> 9 cctatgttcc ggtgtcccca cgcctccagc aggggacgcc cgggctgggg gcggggagtc 60 acaccgcgcc tggtaccatc cggacaaagc ctgcgcgcgc cccgccccgc cattggccgt 120 accgccccgc gccgccgccc catcccgccc ctcgccgccg ggtccggcgc gttaaagcca 180 ataggaaccg ccgccgttgt tcccgtcacg gccggggcag ccaattgtgg cggcgctcgg 240 cggctcgtgg ctctttcgcg gcaaaaagga tttggcgcgt aaaagtggcc gggactttgc 300 aggcagcggc ggccgggggc ggagcgggat cgagccctcg ccgaggcctg ccgccatggg 360 cccgcgccgc cgccgccgcc tgtcacccgg gccgcgcggg ccgtgagcgt c 411 <210> 10 <211> 1108 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tumor specific DL promoter <400> 10 tcaccatgcc cagcaaatct ttgtattttt tgtagagatg gggtatccct atgttgctca 60 ggctggtctt gaactcctaa cctcaagcga tcctcccacc tgggcctctc aaagcactgg 120 gattacaggc gtgagccact gcgcctgaca tggtgcttct taatttattc ttacttttta 180 tttttatttt tttgagacaa ggtcttgctc tgtctcccag gctggaatgt agtggtacaa 240 tcatggctca ctgcaacctc tgcctctccg gttcaagtga tcttcctgcc tcaacctctg 300 gagtagtttg gactatgggc acatgccaca acgactagct aatttttgtt tttctttttt 360 tctttctttc tttctttctt tttttttttt tttgagatgc agtttctcta tgttacctag 420 gctggtctaa aactcctggg ctcaagcgat cctcccaccc tggcctccca aagtgctggg 480 atgacaggcg tgagccacgt ggtgcttaaa aaaggcaaca aaaaaccccc cacacactgg 540 gtatagaagt ggcatgggcc tctatacact gtgagattct tggtactagc tacaaattct 600 gtgtatactc aagattttct agagtaggtg caattacccc gttttacaga tgaggacaca 660 gaggctgagc cgtagtgacc cacctaaggt cgtatagcca gcaaatagat ggaggttgga 720 ttggaactga ggactttact caagggctct cacaaaccct tgggggcttc tcgctgcttt 780 atccccatca cacctgaaag aatgaatgaa tgaatgcctc gggcaccgtg cccacctccc 840 agcaaaccgt ggagcttgga cgagcccact gctccgcgtg gggggggtgt gtgcccgcct 900 tgcgcatgcg tgttccctgg gcatggccgg ctccgttcca tccttctgca cagggtatcg 960 cctctctccg tttggtacat cccctcctcc cccacgcccg gactggggtg gtagacgccg 1020 cctccgctca tcgcccctcc ccatcggttt ccgcgcgaaa agccggggcg cctgcgctgc 1080 cgccgccgcg tctgctgaag cctccgag 1108 <210> 11 <211> 288 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tumor specific 5'E2F promoter <400> 11 cctatgttcc ggtgtcccca cgcctccagc aggggacgcc cgggctgggg gcggggagtc 60 acaccgcgcc tggtaccatc cggacaaagc ctgcgcgcgc cccgccccgc cattggccgt 120 accgccccgc gccgccgccc catcccgccc ctcgccgccg ggtccggcgc gttaaagcca 180 ataggaaccg ccgccgttgt tcccgtcacg gccggggcag ccaattgtgg cggcgctcgg 240 cggctcgtgg ctctttcgcg gcaaaaagga tttggcgcgt aaaagtgg 288 <210> 12 <211> 692 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tumor specific 5'ED promoter <400> 12 cctatgttcc ggtgtcccca cgcctccagc aggggacgcc cgggctgggg gcggggagtc 60 acaccgcgcc tggtaccatc cggacaaagc ctgcgcgcgc cccgccccgc cattggccgt 120 accgccccgc gccgccgccc catcccgccc ctcgccgccg ggtccggcgc gttaaagcca 180 ataggaaccg ccgccgttgt tcccgtcacg gccggggcag ccaattgtgg cggcgctcgg 240 cggctcgtgg ctctttcgcg gcaaaaagga tttggcgcgt aaaagtggaa gggcgaattc 300 tgcagatatc catcacactg gcggccgctc gacgcgtaga attcgccctt cttctcgctg 360 ctttatcccc atcacacctg aaagaatgaa tgaatgaatg cctcgggcac cgtgcccacc 420 tcccagcaaa ccgtggagct tggacgagcc cactgctccg cgtggggggg gtgtgtgccc 480 gccttgcgca tgcgtgttcc ctgggcatgg ccggctccgt tccatccttc tgcacagggt 540 atcgcctctc tccgtttggt acatcccctc ctcccccacg cccggactgg ggtggtagac 600 gccgcctccg ctcatcgccc ctccccatcg gtttccgcgc gaaaagccgg ggcgcctgcg 660 ctgccgccgc cgcgtctgct gaagcctccg ag 692 <210> 13 <211> 278 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tumor specific dDS promoter <400> 13 cttctcgctg ctttatcccc atcacacctg aaagaatgaa tgaatgaatg cctcgggcac 60 cgtgcccacc tcccagcaaa ccgtggagct tggacgagcc cactgctccg cgtggggggg 120 gtgtgtgccc gccttgcgca tgcgtgttcc ctgggcatgg ccggctccgt tccatccttc 180 tgcacagggt atcgcctctc tccgtttggt acatcccctc ctcccccacg cccggactgg 240 ggtggtagac gccgcctccg ctcatcgccc ctccccat 278 <210> 14 <211> 1044 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tumor specific dDL promoter <400> 14 tcaccatgcc cagcaaatct ttgtattttt tgtagagatg gggtatccct atgttgctca 60 ggctggtctt gaactcctaa cctcaagcga tcctcccacc tgggcctctc aaagcactgg 120 gattacaggc gtgagccact gcgcctgaca tggtgcttct taatttattc ttacttttta 180 tttttatttt tttgagacaa ggtcttgctc tgtctcccag gctggaatgt agtggtacaa 240 tcatggctca ctgcaacctc tgcctctccg gttcaagtga tcttcctgcc tcaacctctg 300 gagtagtttg gactatgggc acatgccaca acgactagct aatttttgtt tttctttttt 360 tctttctttc tttctttctt tttttttttt tttgagatgc agtttctcta tgttacctag 420 gctggtctaa aactcctggg ctcaagcgat cctcccaccc tggcctccca aagtgctggg 480 atgacaggcg tgagccacgt ggtgcttaaa aaaggcaaca aaaaaccccc cacacactgg 540 gtatagaagt ggcatgggcc tctatacact gtgagattct tggtactagc tacaaattct 600 gtgtatactc aagattttct agagtaggtg caattacccc gttttacaga tgaggacaca 660 gaggctgagc cgtagtgacc cacctaaggt cgtatagcca gcaaatagat ggaggttgga 720 ttggaactga ggactttact caagggctct cacaaaccct tgggggcttc tcgctgcttt 780 atccccatca cacctgaaag aatgaatgaa tgaatgcctc gggcaccgtg cccacctccc 840 agcaaaccgt ggagcttgga cgagcccact gctccgcgtg gggggggtgt gtgcccgcct 900 tgcgcatgcg tgttccctgg gcatggccgg ctccgttcca tccttctgca cagggtatcg 960 cctctctccg tttggtacat cccctcctcc cccacgcccg gactggggtg gtagacgccg 1020 cctccgctca tcgcccctcc ccat 1044 <210> 15 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E2F-1 siRNA <400> 15 cccuuaagag caaacaaggc ccgau 25 <210> 16 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-catenin siRNA <400> 16 ggccugguuu gauacugacc uguaa 25 <210> 17 <211> 986 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> muatant E1A <400> 17 atgagacata ttatctgcca cggaggtgtt attaccgaag aaatggccgc cagtcttttg 60 gaccagctga tcgaagaggt actggctgat aatcttccac ctcctagcca ttttgaacca 120 cctacccttc acggactgta tgatttagac gtgacggccc ccgaagatcc caacgaggag 180 gcggtttcgc agatttttcc cgactctgta atgttggcgg tgcaggaagg gattgactta 240 ctcacttttc cgccggcgcc cggttctccg gagccgcctc acctttcccg gcagcccgag 300 cagccggagc agagagcctt gggtccggtt tctatgccaa accttgtacc ggaggtgatc 360 ggtggtggcg gaggcggggg tggctttcca cccagtgacg acgaggatga agagggtgag 420 gagtttgtgt tagattatgt ggagcacccc gggcacggtt gcaggtcttg tcattatcac 480 cggaggaata cgggggaccc agatattatg tgttcgcttt gctatatgag gacctgtggc 540 atgtttgtct acagtaagtg aaaattatgg gcagtgggtg atagagtggt gggtttggtg 600 tggtaatttt ttttttaatt tttacagttt tgtggtttaa agaattttgt attgtgattt 660 ttttaaaagg tcctgtgtct gaacctgagc ctgagcccga gccagaaccg gagcctgcaa 720 gacctacccg ccgtcctaaa atggcgcctg ctatcctgag acgcccgaca tcacctgtgt 780 ctagagaatg caatagtagt acggatagct gtgactccgg tccttctaac acacctcctg 840 agatacaccc ggtggtcccg ctgtgcccca ttaaaccagt tgccgtgaga gttggtgggc 900 gtcgccaggc tgtggaatgt atcgaggact tgcttaacga gcctgggcaa cctttggact 960 tgagctgtaa acgccccagg ccataa 986

Claims (21)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 바이러스 게놈 유전자의 발현을 종양 특이적 프로모터로 조절하는 바이러스 발현 벡터로서,
    상기 바이러스 게놈 유전자는 E1A 및 E1B로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되고,
    상기 E1A는 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열을 갖는 변이형 E1A 유전자이고, 상기 E1B는 E1B의 19 kDa 영역이 결실된 E1B55K이며,
    상기 종양 특이적 프로모터는 (i) 서열번호 8 또는 10의 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 종양 특이적 프로모터, 또는 (ii) 서열번호 8 또는 10의 뉴클레오티드 서열 내에 삽입되거나 이에 연결되며, 종양 특이적 프로모터 활성을 나타내는 부가적인 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 종양 특이적 프로모터인, 바이러스 발현 벡터.
    
12. 제11항에 있어서, 상기 바이러스가 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 레트로바이러스(retrovirus), 렌티바이러스(lentivirus), 단순포진 바이러스(herpes simplex virus) 및 레오바이러스(reovirus)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 바이러스 발현 벡터.
    
13. 제11항에 있어서, 상기 바이러스가 영장류로부터 유래한 아데노바이러스인, 바이러스 발현 벡터.
    
14. 삭제
15. 제11항에 있어서, 외래 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, 바이러스 발현 벡터.
    
16. 제15항에 있어서, 상기 외래 뉴클레오티드 서열이 종양 억제 유전자, 세포독성 유전자, 세포증식 억제 유전자(cytostatic gene), 사이토카인-코딩 유전자, 자살 유전자(suicide gene) 및 항원-코딩 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는, 바이러스 발현 벡터.
    
17. 삭제
18. 삭제
19. 제11항의 바이러스 발현 벡터 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 암 치료용 약학적 조성물.
    
20. 제11항의 바이러스 발현 벡터를 인간을 제외한 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 암 치료 방법.
    
21. 삭제

Images