CN110669740B - 溶瘤病毒及其应用和治疗癌症的药物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了溶瘤病毒及其应用和治疗癌症的药物，涉及癌症治疗技术领域。本发明公开的溶瘤病毒其基因组上插入有第一调控元件和第二调控元件；第一调控元件包括癌细胞特异性启动子序列和由该癌细胞特异性启动子驱动在癌细胞中表达特异性蛋白酶的第一核酸序列；第二调控元件包括用于编码胞外牵引信号肽的第二核酸序列和用于编码特异性切割位点的第三核酸序列。该溶瘤病毒可以在癌细胞中以较强的复制能力进行复制以杀死宿主癌细胞，对非癌细胞具有可靠的安全性。

Description

溶瘤病毒及其应用和治疗癌症的药物
技术领域
本发明涉及癌症治疗技术领域，具体而言，涉及溶瘤病毒及其应用和治疗癌症的药物。
背景技术
癌症已成为影响健康的第一杀手。我国是癌症尤其是肺癌，胃癌，肝癌及直肠癌高发区。据统计，仅2016年一年全国新增各类癌症患者480万例，230万病人死于各种癌症。随着技术进步，各种新的治疗手段尤其是生物药物治疗不断投入临床使用。但药物的安全性，有效性及病人的生活质量等方面的需求远未得以满足。发展新药或治疗手段是势在必行。
1991年，Martuza等人在《Science》杂志发表文章，证明转基因单纯疱疹病毒在恶性胶质瘤治疗中有一定的效果。至此以后，发展溶瘤病毒治疗癌症就日益受到关注。溶瘤病毒治疗癌症的原理是通过对自然界存在的一些致病力较弱的病毒进行基因改造制，让其选择性地感染肿瘤细胞，在其内大量复制并最终摧毁肿瘤细胞。同时它还能激发免疫反应，吸引免疫细胞来继续杀死残余癌细胞或通过免疫反应杀灭已迁移的癌细胞。近几十年来，溶瘤病毒相关研究取得了巨大进展。
人们先后用新城疫病毒(newcastle disease virus，NDV)、1型单纯疱疹病毒(HSV-1)、呼肠孤病毒(reovirus)、溶瘤腺病毒(oncolytic adenovirus)发展溶瘤病毒，且动物试验表明安全有效。但临床表现都远低于预期。不佳的临床表现与目前的溶瘤病毒设计策略有关。目前的溶瘤病毒主要通过消除一个或多个病毒非必须基因或把一个或多个必须基因置于癌症特异性启动子驱动下表达的策略来达到溶瘤病毒在癌细胞选择性的繁殖的目的。删除非必须基因或把必须基因置于癌症特异性启动子驱动下表达都会影响病毒在体内繁殖。简而言之，目前的溶瘤病毒在临床上的不佳表现归功于现有的设计策略。为了增加溶瘤病毒的有效性和广谱性，设计溶瘤病毒时保持病毒基因组完整同时不影响病毒基因表达的时间上的高度协调性至关重要。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种溶瘤病毒，该溶瘤病毒为野生型病毒经遗传工程改造后的重组溶瘤病毒，其可以在癌细胞中以较强的复制能力进行复制以杀死宿主癌细胞，对非癌细胞具有可靠的安全性。
本发明的另一目的在于提供制备上述溶瘤病毒的核酸分子。
本发明的另一目的在于提供含有上述核酸分子的载体。
本发明的另一目的在于提供一种制备上述溶瘤病毒的方法。
本发明的另一目的在于提供上述溶瘤病毒在癌症治疗中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种治疗癌症的药物。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供了一种溶瘤病毒，其基因组上插入有第一调控元件；所述第一调控元件包括：癌细胞特异性启动子序列和由所述癌细胞特异性启动子驱动在目标癌细胞中表达特异性蛋白酶的第一核酸序列；
所述溶瘤病毒的基因组上还插入第二调控元件，所述第二调控元件包括：用于编码胞外牵引信号肽的第二核酸序列和用于编码特异性切割位点的第三核酸序列；所述特异性切割位点被所述特异性蛋白酶识别并切割；
所述第二调控元件位于所述溶瘤病毒的必需基因的5’末端。
本发明所提供的溶瘤病毒受癌细胞特异性启动子调控，当其感染非癌细胞如正常细胞时，其下游的特异性蛋白酶不表达，因此，胞外牵引信号肽将下游的必需基因序列表达的对病毒复制来说是必需的蛋白牵引至细胞外，导致溶瘤病毒缺乏必要元件，而不能在非癌细胞中复制；而当在其感染癌细胞时，该溶瘤病毒的癌细胞特异性启动子驱动表达特异性蛋白酶，特异性蛋白酶切割位于胞外牵引信号肽与由上述必需基因表达的蛋白之间的特异性切割位点，导致对病毒复制来说所必需的蛋白留在癌细胞内，溶瘤病毒可正常复制，通过其复制杀死癌细胞。
本发明提供的重组溶瘤病毒没有删除其原始基因组上的任何基因(无论是必需基因还是非必需基因)，其能够以较强的复制能力进行复制，杀死癌细胞。
本发明这一方面提供的溶瘤病毒的基因组结构示意图可参考图1中A。
需要说明的是，第一调控元件的插入位置位于溶瘤病毒的两个基因间(可以是两个必需基因之间，也可以是两个非必需基因，还可以是一个必需基因与一个非必需基因之间)而不影响基因的正常功能。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述特异性蛋白酶为人类鼻病毒3C蛋白酶(HRV 3C蛋白酶)、凝血酶、Xa因子蛋白酶、烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEV蛋白酶)或重组PreScission蛋白酶。
当然，需要说明的是，本发明的特异性蛋白酶并不限于如上所描述的蛋白酶，在其他的一些实施例中，本领域技术人员可以根据需要选择适宜的蛋白酶应用到本发明中，其均属于本发明的保护范围。
相应地，本领域技术人员可以根据需要，选择合适的可以被特异性蛋白酶所识别并切割的特异性切割位点应用到本发明中。例如：
当所述特异性蛋白酶为人类鼻病毒3C蛋白酶时，所述特异性切割位点的氨基酸序列为：LEVLFQGP；
当所述特异性蛋白酶为凝血酶时，所述特异性切割位点的氨基酸序列为：LVPRGS；
当所述特异性蛋白酶为Xa因子蛋白酶时，所述特异性切割位点的氨基酸序列为：IE/DGR(IEDGR or IDGR)；
当所述特异性蛋白酶为烟草蚀纹病毒蛋白酶时，所述特异性切割位点的序列为：ENLYFQG；
当所述特异性蛋白酶为重组PreScission蛋白酶时，所述特异性切割位点的序列为：LEVLFQGP。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述胞外牵引信号肽为干扰素α2、白介素2、人血清白蛋白、人免疫球蛋白重链或源自海洋桡脚类动物的萤光素酶胞外分泌信号肽。
当然，需要说明的是，本发明的胞外牵引信号肽并不限于如上所描述的类型，在其他的一些实施例中，本领域技术人员可以根据需要选择适宜的胞外牵引信号肽应用到本发明的技术方案中，只要其具有牵引与其融合的蛋白至细胞外均可，其均属于本发明的保护范围。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述第二调控元件位于所述溶瘤病毒的必需基因的开放阅读框的起始密码子(ATG)与第二三联体密码的之间。
当胞外牵引信号肽和必需基因表达时，胞外牵引信号肽通过特异性切割位点序列与必需蛋白融合(由上述必需基因表达)，在特异性切割位点序列未被切割的情况下，必需蛋白被牵引至细胞外，导致溶瘤病毒不能正常复制。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述第一调控元件还包括有增强子序列，所述增强子序列位于所述癌细胞特异性启动子序列和所述特异性蛋白酶编码序列之间，所述增强子序列用于增强所述特异性蛋白酶的表达。
本发明对增强子序列的具体类型不作限定，只要是能够增强下游基因序列表达的增强子均可以用于本发明。优选的，增强子序列为CMV增强子序列或SV40增强子序列。当然，在本发明的其他实施例中，本领域技术人员可以根据需要选择合适的增强子序列，无论选用何种增强子只要其目的是用于在癌细胞尤其是癌细胞特异性启动子转录活性低的癌细胞中增强特异性蛋白酶的表达即属于本发明的保护范围。
通过引入增强子可以提高特异性蛋白酶的表达水平，当溶瘤病毒感染癌细胞时，特异性蛋白酶大量表达，进而可以高效率地切割特异性切割位点，使更多的表达的必需蛋白(由上述必需基因表达)留在细胞内，进而增强溶瘤病毒的复制能力，有利于提高对癌细胞的杀伤能力。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述目标癌细胞为肺癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、胃癌细胞、前列腺癌细胞、脑肿瘤细胞、人结肠癌细胞、宫颈癌细胞、肾癌细胞、卵巢癌细胞、头颈部癌细胞、黑色素瘤细胞、胰腺癌细胞或食道癌细胞。
需要说明的是，目标癌细胞的类别本领域技术人员可以根据实际情况选择。相应地，癌细胞特异性启动子可以是在所选择的目标癌细胞特异性表达的启动子，也可以是在多种癌细胞中特异驱动表达(但不在非癌细胞中驱动表达)的启动子。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述癌细胞特异性启动子序列为端粒酶逆转录酶启动子(hTERT)、人表皮生长因子受体-2启动子(HER-2)、E2F1启动子、骨钙蛋白启动子、癌胚抗原启动子、Survivin启动子和血浆铜蓝蛋白启动子中的任意一种。
当然，本发明的癌细胞特异性启动子序列并不限于如上所描述的类别，在其他的一些实施例中，本领域技术人员可以根据需要，选择合适的可在癌细胞中特异性驱动下游基因表达的启动子。无论选用何种癌细胞特异性启动子，均属于本发明的保护范围。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述溶瘤病毒选自单纯疱疹病毒(如1型单纯疱疹病毒)、腺病毒、牛痘病毒、新城疫病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、水泡性口炎病毒和流感病毒中的任意一种。
需要说明的是，本发明的溶瘤病毒的类型并不限于上述的类型，在其他的实施例中，本领域技术人员可以根据实际情况选择合适的溶瘤病毒，只要其具有感染癌细胞抑制或杀死癌细胞的能力均可作为本发明的溶瘤病毒。无论选用何种溶瘤病毒，其均属于本发明的保护范围。
此外，不同的溶瘤病毒具有不同的必需基因，本领域技术人员可以根据本发明的内容以及实际情况选择适宜的溶瘤病毒和必需基因。
例如：当所述溶瘤病毒为单纯疱疹病毒时，必需基因选自包膜糖蛋白L、尿嘧啶dna糖基化酶、衣壳蛋白、螺旋酶原酶亚基、DNA复制起始结合解旋酶、肉豆蔻酸衍生物蛋白、脱氧核糖核酸酶、外被丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、DNA包装末端酶亚基1、外被蛋白UL16、DNA包装蛋白UL17、衣壳三链亚基2、主要衣壳蛋白、包膜蛋白UL20、核蛋白UL24、DNA包装蛋白UL25、衣壳成熟蛋白酶、衣壳蛋白、包膜糖蛋白B、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶催化亚基、核出口层蛋白、DNA包装蛋白UL32、DNA包装蛋白UL33、核出口膜蛋白、大衣壳蛋白、衣壳三链亚基1、核糖核苷酸还原酶亚基1、核糖核苷酸还原酶亚基2、被膜宿主关闭蛋白、DNA聚合酶加工性亚基、膜蛋白UL45、外被蛋白VP13/14、反式激活蛋白VP16、外被蛋白VP22、包膜糖蛋白N、外被蛋白UL51、解旋酶-引发酶引物酶亚基、包膜糖蛋白K、ICP27、核蛋白UL55、核蛋白UL56、转录调节因子ICP4、调节蛋白ICP22、包膜糖蛋白D和膜蛋白US8A中的一种或多种；
或者，当所述溶瘤病毒为腺病毒时，必需基因选自早期蛋白1A、早期蛋白1B 19K、早期蛋白1B 55K、壳体化蛋白Iva2、DNA聚合酶、末端蛋白前体pTP、壳体化蛋白52K、衣壳蛋白前体pIIIa、五邻体基质、核心蛋白pVII、核心蛋白前体pX、核心蛋白前体pVI、六邻体、蛋白酶、单链DNA结合蛋白、六聚体组装蛋白100K、蛋白33K、壳体化蛋白22K、衣壳蛋白前体、蛋白U、纤维蛋白、调控蛋白E4开放阅读框6/7、调控蛋白E4 34K、调控蛋白E4开放阅读框4、调控蛋白E4开放阅读框3、调控蛋白E4开放阅读框2和调控蛋白E4开放阅读框1中的一种或多种；
又或者，当所述溶瘤病毒为牛痘病毒时，必需基因选自核苷酸还原酶小亚基、丝氨酸/苏氨酸激酶、DNA结合病毒核心蛋白、聚合酶大亚基、RNA聚合酶亚基、DNA聚合酶、巯基氧化酶、假定DNA结合病毒核蛋白、DNA结合磷蛋白、病毒核心半胱氨酸蛋白酶、RNA螺旋酶NPH-II、假定金属蛋白酶、转录延伸因子、谷胱甘肽类蛋白、RNA聚合酶、假定病毒核蛋白、晚期转录因子VLTF-1、DNA结合病毒核蛋白、病毒衣壳蛋白、聚合酶小亚基、依赖于DNA的RNA聚合酶亚单元rpo22、依赖于DNA的RNA聚合酶亚单元rpo147、丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶、IMV肝素结合表面蛋白、DNA依赖性RNA聚合酶、晚期转录因子VLTF-4、DNA拓扑异构酶1型、mRNA盖酶大亚基、病毒核心蛋白107、病毒核心蛋白108、尿嘧啶-DNA糖基酶、三磷酸酶、早期基因转录因子VETF的70kDa小亚基、依赖于DNA的RNA聚合酶亚单元rpo18、核苷三磷酸水解酶-I、mRNA盖酶小亚基、利福平靶点、晚期转录因子VLTF-2、晚期转录因子VLTF-3、二硫键形成途径、核心蛋白4b前体p4b、核心蛋白39kDa、依赖于DNA的RNA聚合酶亚单元rpo19、早期基因转录因子VETF的82kDa大亚基、转录因子VITF-3的32kDa小亚基、IMV膜蛋白128、核心蛋白4a前体P4a、IMV膜蛋白131、磷酸化IMV膜蛋白、IMV膜蛋白A17L、DNA解旋酶、病毒DNA聚合酶加工因子、IMV膜蛋白A21L、棕榈酰蛋白、中间基因转录因子VITF-3的45kDa大亚基、依赖于DNA的RNA聚合酶亚单元rpo132、依赖于DNA的RNA聚合酶rpo35、IMV蛋白A30L、假定的ATP酶、丝氨酸/苏氨酸激酶、EEV成熟蛋白、棕榈酰化的EEV膜糖蛋白、IMV表面蛋白A27L、EEV膜磷酸糖蛋白、IEV和EEV膜糖蛋白、EEV膜糖蛋白、二硫键形成途径蛋白、假定的病毒核蛋白、IMV膜蛋白I2L、痘病毒肉豆蔻酰基蛋白、IMV膜蛋白L1R、晚期16kDa假定的膜蛋白、假定的病毒膜蛋白H2R、IMV膜蛋白A21L、趋化因子结合蛋白、表皮生长因子样蛋白和IL-18结合蛋白中的一种或多种；
又或者，当所述溶瘤病毒为柯萨奇病毒时，必需基因选自蛋白Vpg、核心蛋白2A、蛋白2B、RNA解旋酶2C、蛋白3A、蛋白酶3C、逆转录酶3D、外壳蛋白Vp4和蛋白Vp1中的一种或多种；
或者，当所述溶瘤病毒为麻疹病毒时，必需基因选自核蛋白N、磷蛋白P、基质蛋白M、跨膜糖蛋白F、跨膜糖蛋白H和RNA依赖性RNA聚合酶L中的一种或多种；
又或者，当所述溶瘤病毒为腮腺炎病毒时，必需基因选自核蛋白N、磷蛋白P、融合蛋白F、RNA聚合酶L中的一种或多种；
又或者，当所述溶瘤病毒为水泡性口炎病毒时，必需基因选自糖蛋白G、核蛋白N、磷酸蛋白P和RNA聚合酶L中的一种或多种；
又或者，当所述溶瘤病毒为脊髓灰质炎病毒时，必需基因选自衣壳蛋白VP1、衣壳蛋白VP2、衣壳蛋白VP3、半胱氨酸蛋白酶2A、蛋白2B、蛋白2C、蛋白3A、蛋白3B、蛋白酶3C、蛋白3D和RNA指导RNA聚合酶中的一种或多种；
又或者，当所述溶瘤病毒为流感病毒时，必需基因选自血凝素、神经氨酸酶、核蛋白、膜蛋白M1、膜蛋白M2、聚合酶PA、聚合酶PB1-F2和聚合酶PB2中的一种或多种。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述溶瘤病毒的一个或多个必需基因的开放阅读框的起始密码子ATG与第二三联体密码之间插入所述第二调控元件。
也就是说，在本发明的一些实施例中，必需基因的数量可以是一个或多个，当为多个时，那么，这些必需基因的类别可以不同，每种类别的必需基因的开放阅读框ATG与第二三联体密码之间插入有第二调控元件，此外，第二调控元件的拷贝数也得到增加。这种情况下，当该溶瘤病毒感染非癌细胞时，溶瘤病毒的多个对复制来说是必需的必需基因所表达的蛋白被牵引至细胞外，溶瘤病毒的复制能力得到大大地减弱，进而提高了其对非癌细胞的安全性。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述溶瘤病毒为1型单纯疱疹病毒，必需基因为ICP27，所述癌细胞特异性启动子为端粒酶逆转录酶启动子，所述特异性蛋白酶为人类鼻病毒3C蛋白酶，所述胞外牵引信号肽为干扰素α2信号肽，所述特异性切割位点的氨基酸序列为LEVLFQGP；所述第二调控元件位于所述必需基因的开放阅读框的起始密码子与第二三联体密码之间；所述第一调控元件位于所述必需基因的下游。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，
所述端粒酶逆转录酶启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述人类鼻病毒3C蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述人类鼻病毒3C蛋白酶的开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述干扰素α2信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述第二核酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
所述第三核酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
另一方面，本发明提供了一种用于制备如上任一项所述的溶瘤病毒的核酸分子，所述核酸分子具有插入至溶瘤病毒目标位点的插入序列，所述插入序列包括所述第一调控元件和所述第二调控元件，所述第一调控元件目标位点位于重组溶瘤病毒的两个基因间，所述第二调控元件位于所述溶瘤病毒的必需基因的起始密码与第二三联体密码之间。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述插入序列的5’端具有与所述目标位点的上游序列同源的5’端同源臂序列，所述插入序列的3’端具有与所述目标位点的下游序列同源的3’端同源臂序列。
该核酸分子可以通过同源重组的方式将插入序列插入到野生型的溶瘤病毒基因组中，进而得到本发明的溶瘤病毒。
另一方面，本发明提供了含有如上所述的核酸分子的载体。
另一方面，本发明提供了制备如上任一项所述的溶瘤病毒的方法，其包括：将上述载体与亲本病毒和互补寄主细胞共培养，从培养物中收集得到所述重组溶瘤病毒；
其中，所述亲本病毒的基因组序列相对野生型病毒的基因组序列缺失所述必需基因；
所述互补寄主细胞含有表达所述必需基因的表达序列。
另一方面，本发明提供了如上任一项所述的溶瘤病毒在制备用于治疗癌症的药物中的应用。
另一方面，本发明提供了一种治疗癌症的药物，其包括如上任一项所述的溶瘤病毒以及药学上可接受的辅料。
本领域技术人员可以根据需要选择适宜的药学上可接受的辅料，本发明对此不作限定。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述药物还包括基因治疗药物或疫苗。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1：为本发明提供的重组溶瘤病毒的基因组序列上的所插入的调控元件的结构以及调控关系示意图。A：为本发明提供的溶瘤病毒的的一种实施方式，第一调控元件位于必需基因3’端非编码区前，第二调控元件位于必需基因开放阅读框起始密码子与第二三联体密码的之间；B：为A的更具体的一种实施方式，病毒为HSV-1，癌细胞特异性启动为hTERT启动子，增强子为CMV增强子，特异性蛋白酶为HRV-3C蛋白酶，必需基因为ICP27，胞外信号牵引肽为干扰素α2信号肽；特异性切割位点受HRV-3C蛋白酶特异性切割。据此构建的溶瘤病毒定名为oHSV-BJS。
图2：质粒pcDNA3.1-EGFP的结构示意图。
图3：在非洲绿猴肾细胞(Vero，正常细胞)中ICP27 mRNA从重组病毒oHSV-BJS中正常表达但ICP27蛋白质在细胞内积累甚少。Vero细胞用3MOI(病毒数/细胞)HSV-1野生型病毒KOS或溶瘤病毒oHSV-BJS感染，一天后，收集细胞，分离RNA和提取蛋白质，用逆转录结合半定量PCR检测ICP27mRNA(图中A)，用西点印记(Western blotting)检测HSV ICP27蛋白质(图中B)。
图4：HRV-3C mRNA在四种癌细胞中表达到易检测水平，ICP27蛋白从重组病毒oHSV-BJS和野生型病毒KOS基本无差异地表达。图中A：HRV-3C mRNA表达检测结果，B：ICP27蛋白质表达检测结果。
图5：野生型病毒KOS和溶瘤病毒oHSV-BJS在癌细胞中的繁殖动力学。用0.1MOI的KOS或oHSV-BJS感染各种癌细胞，不同天后，收取细胞和培养基，通过三个冻融循环让存留于细胞中的病毒释放到培养基中。用病毒感染互补细胞CICP27，通过空斑法测定病毒滴度(空斑形成单位/毫升，PFU/ml)。图中，A：子宫颈瘤Hela细胞；B：子宫颈鳞癌siHa细胞；C：乳腺癌SK-BR3细胞；D：乳腺癌ME-180细胞。
图6：重组溶瘤病毒oHSV-BJR在动物上显著抑制肺癌，胃癌，肝癌及直肠癌增生。建立人源肿瘤小鼠动物模型。成模后，瘤内注射溶瘤病毒，每3天注射一次共3次。以注射PBS(不含溶瘤病毒)为阴性对照。溶瘤病毒注射后，每周测试肿瘤大小2次。阴性对照动物需安乐处死时，实验结束。根据肿瘤大小制作肿瘤生长曲线(图中A：肺癌；B：胃癌；C：直肠癌；D：直肠癌)，试验结束时，测试肿瘤大小，与阴性对照比较，分析计算相对抑制率(E)。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供的溶瘤病毒，其由野生型的1型单纯疱疹病毒KOS改造得到，该重组溶瘤病毒的基因组具有如下结构(可参考图1中B)：
(1)该重组溶瘤病毒的必需基因ICP27的3’端的非编码区前具有第一调控元件；第一调控元件包括：癌细胞特异性启动子即hTERT、增强子即CMV增强子、编码特异性蛋白酶即人类鼻病毒3C蛋白酶(HRV-3C蛋白酶)的核酸序列以及BGH Poly(A)；
其中，hTERT的碱基序列如SEQ ID NO.4所示；
CMV增强子的碱基序列如SEQ ID NO.10所示：
编码HRV-3C蛋白酶的核酸序列如SEQ ID NO.6所示；
HRV-3C蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
(2)该重组溶瘤病毒在必需基因ICP27的开放阅读框的起始密码子(ATG)与第二三联体密码之间具有第二调控元件；该第二调控元件包括：编码胞外牵引信号肽即干扰素α2信号肽的第二核酸序列和编码特异性切割位点序列的第三核酸序列；
其中，干扰素α2信号肽的氨基酸序列SEQ ID NO.7所示；
编码干扰素α2信号肽的第二核酸如SEQ ID NO.8所示；
特异性切割位点序列的氨酸序列如下：
LEVLFQGP；
特异性切割位点序列的编码序列即第三核酸序列如下：
TTAGAAGTTCTTTTTCAAGGTCCT。
当ICP27表达时，干扰素α2胞外牵引信号肽通过特异性切割位点序列与ICP27蛋白的N端连接。该溶瘤病毒感染正常细胞时，HRV-3C蛋白酶不表达，特异性切割位点不被切割，干扰素α2胞外牵引信号引导ICP27蛋白分泌至胞外，导致溶瘤病毒复制受阻或失败，进而对正常细胞安全，不造成杀伤。该溶瘤病毒感染癌细胞时，HRV-3C蛋白酶在hTERT的驱动表达特异性表达，特异性切割位点被表达出的HRV-3C蛋白酶识别并切割，ICP27蛋白可以在癌细胞内正常地分区定位，该溶瘤病毒正常复制，进而可对目标癌细胞造成杀伤。
另外，本实施例提供的上述重组溶瘤病毒的制备方法如下：
(1)建立表达ICP27的Vero细胞株
(a)以野生型1型疱疹病毒KOS的DNA为模板，用PCR扩增ICP27基因的编码区，将扩增片段插入至表达抗新霉素基因的质粒pcDNA3.1-EGFP(见图2)的HindIII和Xba位点以替代EGFP。该重组质粒命名为ICP27表达质粒，ICP27基因在CMV启动子驱动下表达。
(b)用不同浓度的G418处理Vero细胞，每3天换取含有G418培养基，10天后，观察细胞死亡情况，以确定细胞死亡所需的最低G418浓度，并以此作为建立细胞株G418的施用浓度。
(c)向6孔细胞培养板每孔植入3.5×105Vero细胞，在无抗生素培养液中隔夜培养，用Lipofectamine 2000每孔转导步骤(a)得到的4μg ICP27表达质粒。24小时后，按1：20，1：40及1：60稀释转板并培养于含G418的培养液中，每三天换一次含有G418的培养液。经6-7次换液，收集克隆，并从24孔板逐级放大。然后，分离蛋白质，用西点印迹法(Westernblotting)检测ICP27的表达。选择高表达ICP27的克隆起源的细胞，得到表达ICP27的Vero细胞，命名为互补细胞CICP27。
该互补细胞于2019年4月24日保藏于位于武汉市武昌珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO.C201974。
(2)构建EGFP替代其ICP27的重组病毒；
亲本病毒建造以野生型1型疱疹病毒KOS为基础材料，用EGFP替代其ICP27得到的重组病毒，作为过渡疱疹病毒，即命名亲本病毒。具体方法如下：
(a)人工合成第1核酸片段，如SEQ ID NO.1所示，其上游至下游(5’-3’)依次包括如下元件：ICP27 5’末端序列、CMV启动子、Kozak序列、EGFP编码框、BGH Poly(A)及ICP273’末端序列；
SEQ ID NO.1中：
第1-6位：无关序列，增加末端长度利于酶切；
第7-12位：Xho1位点，C/TCGAG；
第13-575位：ICP27 5’末端序列；
第576-1163位：CMV启动子；
第1164-1174位：间隔序列；
第1175-1180位：Kozak序列，增加蛋白表达；
第1181-1900位：EGFP编码框；
第1901-2144位：BGH Poly(A)；
第2145-2667位：ICP27 3’末端序列；
第2668-2673位：HindIII位点A/AGCTT；
第2674-2679位：无关序列，增加末端长度利于酶切。
(b)用XhoI和HindIII酶切第1核酸片段，将其连接至pcDNA3.1-EGFP质粒的Xho1和HindIII位点。得到的重组质粒命名为EGFP表达质粒。
(c)按3.5×105个/孔的量，将上述互补细胞CICP27植于6孔细胞培育板，在无抗生素培养液中隔夜培养。
(d)分别用0.1、0.5、1、3MOI(病毒/细胞)野生型病毒KOS感染互补细胞CICP27，1小时后，借助Lipofectamine 2000向细胞转导上述EGFP表达质粒(4μg DNA/孔)。4小时后，用完全培养基替换转导溶液。待所有细胞感染后，收集细胞及培养液，经过三次冻融，离心收集上清液，稀释上清液，将其感染上述的互补细胞CICP27。
(e)采用空斑分离法分离病毒。4-5天后，在荧光显微镜下，选取绿色病毒斑，然后对得到的病毒斑进行2或3轮筛选至得到纯的病毒斑，繁殖扩大病毒，即得到EGFP替代ICP27的重组病毒，命名为亲本病毒HSV-EGFP。
(3)构建含第一表达调控元件和第二调控元件的重组质粒
(a)通过遗传工程改造TA克隆质粒，让其多克隆位点仅包括XhoI位点，命名为TA-XhoI质粒，备用。
(b)人工合成第2核酸片段，如SEQ ID NO.2所示，其上游至下游(5’-3’)依次包括如下元件：
含天然ICP27启动子的ICP27 5’末端非编码区序列、编码干扰素α2胞外牵引信号肽的第二核酸序列、编码受HRV-3C蛋白酶切割的特异性切割位点序列的第三核酸序列、ICP27开放阅读框序列、SV40Poly(A)、ICP27 3’末端非编码区序列，其中，SV40Poly(A)与ICP27 3’末端非编码区序列间具有一个HindIII位点，用于插入构建第一调控元件；
SEQ ID NO.2中：
第1-第6位：Xho 1位点；
第7-第677位：含天然ICP27启动子的ICP27 5’末端非编码区序列；
第678-第746位：编码干扰素α2信号肽的第二核酸序列；
第747-第770位：编码受HRV-3C蛋白酶切割的特异性切割位点序列的第三核酸序列；
第771-第2306位：ICP27开放阅读框序列(无起始密码ATG)；
第2307-第2753位：SV40 Poly(A)；
第2754-第2759位：HindIII位点；
第2760-3279位：ICP27 3’末端非编码区序列；
第3280-3285位：Xho 1位点。
将第2核酸片段用Xho1酶切后，插入至TA-XhoI质粒，得到的重组质粒命名为TA-XhoI-S-ICP27质粒，备用。
(c)人工合成第3核酸片段，如SEQ ID NO.3所示，其上游至下游(5’-3’)依次包括如下元件：hTERT启动子、CMV增强子、Kozak序列、编码HRV-3C蛋白酶的核酸序列和SV40Poly(A)；
第3核酸片段的序列如SEQ ID NO.3所示，其中包含的各元件如下：
第1-第6位：HindIII位点；
第7-第432位：hTERT启动子；
第433-第527位：CMV增强子；
第528-第539位：Kozak序列；
第540-第1088位：编码HRV-3C蛋白酶的核酸序列；
第1089-第1544位：SV40 Poly(A)；
第1545-第1550位：HindIII位点。
将第3核酸片段用HinIII酶切，插入经同样酶切后的TA-XhoI-S-ICP27质粒，得到的重组质粒命名为TA-XhoI-S-ICP27-3C质粒，备用。
(4)构建重组溶瘤疱疹病毒
(a)按3.5×105个/孔的量，将上述互补细胞CICP27植于6孔细胞培育板，在无抗生素培养液中隔夜培养。
(b)分别用0.1、0.5、1、3MOI(病毒/细胞)亲本病毒HSV-EGFP感染互补细胞CICP27，1小时后，借助Lipofectamine 2000向细胞转导上述TA-XhoI-S-ICP27-3C质粒(4μg DNA/孔)。4小时后，用完全培养基替换转导溶液。等所有细胞感染后，收集细胞及培养液，经过三次冻融，离心收集上清液，稀释上清液，将其感染上述的互补细胞CICP27。采用空斑分离法分离病毒。4-5天后，在荧光显微镜下，选取无绿色荧光的病毒斑，然后对得到的病毒斑进行2或3轮筛选至得到纯的病毒斑，繁殖扩大病毒，分离感染细胞DNA，用特异性引物，PCR放大检测片段并测序确证，得到本实施例的重组溶瘤病毒，命名为oHSV-BJS。
该重组溶瘤病毒保藏于2019年4月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：201920。
实验例1
检测实施例1的重组溶瘤疱疹病毒oHSV-BJS的ICP27在正常细胞Vero中的表达
方法：分别用野生型KOS和重组溶瘤病毒oHSV-BJS感染Vero(3MOI)，一天后，收集细胞，分离RNA和提取蛋白质，用逆转录结合半定量PCR检测ICP27 mRNA的表达水平，用西点印记(Western blotting)检测ICP27蛋白的表达水平。mRNA和蛋白检测，均以β-actin为上样对照。
结果：如图3中A所示，在oHSV-BJS和KOS感染的Vero细胞中，ICP27 mRNA水平差异不大。但oHSV-BJS感染的Vero细胞中ICP27蛋白量显著低于KOS感染的Vero细胞(见图3中B)。这预示，上述实施例1提供的重组溶瘤病毒oHSV-BJS在正常细胞中ICP27表达后被干扰素α2胞外牵引信号肽引导分泌到细胞外。
实验例2
检测HRV-3C蛋白酶和ICP27在癌细胞中的表达
方法：用3MOI重组溶瘤病毒oHSV-BJS或KOS感染四种不同的癌细胞，24小时后，分离总RNA和蛋白质。用半定量PCR分析HRV-3C mRNA表达，用西点印记法检测ICP27蛋白量。mRNA和蛋白检测，均以β-actin为上样对照。
结果显示，在oHSV-BJS感染的四种不同癌细胞中，HRV-3C mRNA都表达到可检测水平(见图4中A)。在受重组溶瘤病毒oHSV-BJS感染的四种癌细胞中，ICP27蛋白都积累到可检测水平，且在溶瘤病毒oHSV-BJS感染的每种癌细胞中，ICP27蛋白的量与KOS感染的细胞都无显著性差异(见图4中B)。结果表明，HRV-3C特异地在癌细胞中表达，并切割特异性切割位点(LEVLFQGP)，以使ICP27蛋白保留细胞内以支持病毒繁殖。
实验例3
重组溶瘤疱疹病毒oHSV-BJ的繁殖动力学
方法：分别用0.1MOI的KOS和oHSV-BJS感染不同癌细胞，不同天后，收取细胞和培养基，通过三个冻融循环让存留于细胞中的病毒释放到培养基中。再用病毒感染互补细胞CICP27，通过空斑法测定病毒滴度(空斑形成单位/毫升，PFU/ml)。
结果显示：oHSV-BJS感染不同的癌细胞其繁殖差异较大，但同一类型的癌细胞，oHSV-BJS的繁殖动力学与KOS差异不显著(见图5中A-D)，这表明oHSV-BJS在癌细胞中的繁殖能力或复制能力与野生型的KOS一致或相当，表明该oHSV-BJS的复制能力未减弱。
实验例4
重组溶瘤疱疹病毒oHSV-BJ对癌症细胞的杀灭能力
方法：分别用0.25或0.5MOI的KOS或oHSV-BJS感染不同癌细胞，不同天后，测定细胞存活率。结果见表1-4。
从表1-4的数据可以看出，0.25或0.5MOI oHSV-BJS杀灭不同癌细胞的能力不同，但同一癌细胞而言，oHSV-BJS杀灭细胞的效率与KOS基本一致(表1-4)。表明重组溶瘤疱疹病毒oHSV-BJ能具有一定广谱性且能以接近KOS的杀死效率杀死目标癌细胞。
表1受不同MOI的oHSV-BJS感染后的Hela细胞存活率(％)
病毒(MOI 0.25) oHSV-BJS KOS
第一天 58±3.0 46±2.0
第二天 38±2.0 29±1.4
第三天 17±0.8 11±0.6
第四天 4±0.3 0
病毒(MOI 0.5) oHSV-BJS KOS
第一天 52±2.7 39±1.8
第二天 28±1.8 22±1.1
第三天 9±0.1 5±0.3
第四天 0 0
表2受不同MOI的oHSV-BJS感染后的siHA细胞存活率(％)
病毒(MOI 0.25) oHSV-BJS KOS
第一天 22±1.4 16±1.0
第二天 6±0.4 0
第三天 0 0
病毒(MOI 0.5) oHSV-BJS KOS
第一天 8±0.4 4±0.3
第二天 1±0.1 0
第三天 0 0
表3受不同MOI的oHSV-BJS感染后的SK-BR3细胞存活率(％)
病毒(MOI 0.25) oHSV-BJS KOS
第一天 21±1.3 6±0.4
第二天 0 0
第三天 0 0
病毒(MOI 0.5) oHSV-BJS KOS
第一天 3±0.1 5±0.3
第二天 0 0
第三天 0 0
表4受不同MOI的oHSV-BJS感染后的ME-180细胞存活率(％)
Figure BDA0002132466190000161
Figure BDA0002132466190000171
实验例5
重组溶瘤疱疹病毒oHSV-BJ对正常细胞存活力的影响
方法：溶瘤病毒oHSV-BJS(2MOI)及野生病毒KOS(0.5MOI)感染Vero细胞或原代人角膜上表皮细胞。oHSV-BJS感染及无处理的细胞三天后测活性，野生病毒KOS感染的细胞二天后测活性。KOS感染细胞二天后，Vero细胞或原代人角膜上表皮细胞全部死亡，但溶瘤病毒oHSV-BJS感染的细胞活力基本与无处理基本一致(表5)。结果表明，溶瘤病毒oHSV-BJS对正常细胞安全。
表5 oHSV-BJS后第三天和KOS感染后的第二天的正常细胞存活率(％)
病毒 oHSV-BJS KOS 无处理
Vero细胞 95±2 0 98±2
角膜上表皮细胞 97±2 0 97±1
实验例6
检测重组溶瘤疱疹病毒oHSV-BJ在体内抑制肿瘤的效果
方法：
4-8周鼠龄体重14-16克雄性小鼠用于构建肿瘤模型。人源肺癌，胃癌，肝癌小鼠癌症模型分别用体外培养的人非小细胞肺癌A549细胞，胃癌NCI-N87细胞，肝癌SK-HEP-1细胞皮下接种BALb/c(肺癌及胃癌)或NPG小鼠(肝癌)，当肿瘤增生到一定大小时，取出肿瘤，切成小块，再植入相应小鼠，让肿瘤长到40-120mm3，开始向瘤内注射病毒。直肠癌模型直接向BALb/c小鼠皮下接种直肠腺癌细胞株HCT-8而构建，当肿瘤长到40-120mm3，开始向瘤内注射溶瘤病毒。溶瘤病毒瘤内每3天注射一次，共3次，每次1.2×107感染单位(悬浮于40μlPBS)多点注射。以注射PBS(不含溶瘤病毒)为阴性对照，每实验组8只动物。溶瘤病毒注射后，每周测试肿瘤大小2次(第一次注射时肿瘤相对大小定义为1)，共测试17-32天(根据阴性对照动物需安乐处死的时间而定)。根据肿瘤大小制作肿瘤生长曲线，试验结束时，测试组肿瘤大小，与阴性对照比较，分析计算相对抑制率。
相对抑制率(％)＝(阴性对照组肿瘤体积-实验组肿瘤体积)/阴性对照组肿瘤体积x100％。
结果表明，oHSV-BJS不同程度地减缓肺癌，胃癌，肝癌及直肠癌的增生(图6中A-D)。oHSV-BJS分别对肺癌，胃癌，肝癌及直肠癌的抑制率分别是45％，37％，26％及49％(图6中E)。结果说明oHSV-BJS能广泛抑制各种癌症增生，具有广谱性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 伍泽堂
<120> 溶瘤病毒及其应用和治疗癌症的药物
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2679
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aaataactcg agctgcgggc gctgttgttc catcatcctg tcgggcatcg caatgcgatt 60
gtgttatatc gccgtggtgg ccggggtggt gctcgtggcg cttcactacg agcaggagat 120
ccagaggcgc ctgtttgatg tatgacgtca catccaggcc ggcggaaacc ggaacggcat 180
atgcaaactg gaaactgtcc tgtcttgggg cccacccacc cgacgcgtca tatgtaaatg 240
aaaatcgttc ccccgaggcc atgtgtagcc tggatcccaa cgaccccgcc catgggtccc 300
aattggccgt cccgttacca agaccaaccc agccagcgta tccacccccg cccgggtccc 360
cgcggaagcg gaacggtgta tgtgatatgc taattaaata catgccacgt acttatggtg 420
tctgattggt ccttgtctgt gccggaggtg gggcgggggc cccgcccggg gggcggaact 480
aggaggggtt tgggagagcc ggccccggca ccacgggtat aaggacatcc accacccggc 540
cggtggtggt gtgcagccgt gttccaacca cggtcgttga cattgattat tgactagtta 600
ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac 660
ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc 720
aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt 780
ggactattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac 840
gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac 900
cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt 960
gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc 1020
aagtctccac cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt 1080
tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg 1140
ggaggtctat ataagcagag ctctctggct aactgccacc atggtgagca agggcgagga 1200
gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac ggcgacgtaa acggccacaa 1260
gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac ggcaagctga ccctgaagtt 1320
catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc ctcgtgacca ccctgaccta 1380
cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag cagcacgact tcttcaagtc 1440
cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc ttcaaggacg acggcaacta 1500
caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg gtgaaccgca tcgagctgaa 1560
gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac aagctggagt acaactacaa 1620
cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac ggcatcaagg tgaacttcaa 1680
gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc gaccactacc agcagaacac 1740
ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac tacctgagca cccagtccgc 1800
cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc ctgctggagt tcgtgaccgc 1860
cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa cgggcctcga ctgtgccttc 1920
tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc 1980
cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg 2040
tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa 2100
tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatggcttct gaggtacaat aaaaacaaaa 2160
catttcaaac aaatcgcccc acgtgttgtc cttctttgct catggccggc ggggcgtggg 2220
tcacggcaga tggcgggggt gggcccggcg tacggcctgg gtgggcggag ggaactaacc 2280
caacgtataa atccgtcccc gctccaaggc cggtgtcata gtgcccttag gagcttcccg 2340
cccgggcgca tccccccttt tgcactatga cagcgacccc cctcaccaac ctgttcttac 2400
gggccccgga cataacccac gtggcccccc cttactgcct caacgccacc tggcaggccg 2460
aaacggccat gcacaccagc aaaacggact ccgcttgcgt ggccgtgcgg agttacctgg 2520
tccgcgcctc ctgtgagacc agcggcacaa tccactgctt tttctttgcg gtatacaagg 2580
acacccacca tacccctccg ctgattaccg agctccgcaa ctttgcggac ctggttaacc 2640
acccgccggt cctacgcgaa ctggtcgaag ctttttata 2679
<210> 2
<211> 3285
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctcgagctgc gggcgctgtt gttccatcat cctgtcgggc atcgcaatgc gattgtgtta 60
tatcgccgtg gtggccgggg tggtgctcgt ggcgcttcac tacgagcagg agatccagag 120
gcgcctgttt gatgtatgac gtcacatcca ggccggcgga aaccggaacg gcatatgcaa 180
actggaaact gtcctgtctt ggggcccacc cacccgacgc gtcatatgta aatgaaaatc 240
gttcccccga ggccatgtgt agcctggatc ccaacgaccc cgcccatggg tcccaattgg 300
ccgtcccgtt accaagacca acccagccag cgtatccacc cccgcccggg tccccgcgga 360
agcggaacgg tgtatgtgat atgctaatta aatacatgcc acgtacttat ggtgtctgat 420
tggtccttgt ctgtgccgga ggtggggcgg gggccccgcc cggggggcgg aactaggagg 480
ggtttgggag agccggcccc ggcaccacgg gtataaggac atccaccacc cggccggtgg 540
tggtgtgcag ccgtgttcca accacggtca cgcttcggtg cctctccccg attcgggccc 600
ggtcgcttgc taccggtgcg ccaccaccag aggccatatc cgacacccca gccccgacgg 660
cagccgacag cccggtcatg gccttgacct ttgctttact ggtggccctc ctggtgctca 720
gctgcaagtc aagctgctct gtgggcttag aagttctttt tcaaggtcct gcgactgaca 780
ttgatatgct aattgacctc ggcctggacc tctccgacag cgatctggac gaggaccccc 840
ccgagccggc ggagagccgc cgcgacgacc tggaatcgga cagcaacggg gagtgttcct 900
cgtcggacga ggacatggaa gacccccacg gagaggacgg accggagccg atactcgacg 960
ccgctcgccc ggcggtccgc ccgtctcgtc cagaagaccc cggcgtaccc agcacccaga 1020
cgcctcgtcc gacggagcgg cagggcccca acgatcctca accagcgccc cacagtgtgt 1080
ggtcgcgcct cggggcccgg cgaccgtctt gctcccccga gcggcacggg ggcaaggtgg 1140
cccgcctcca acccccaccg accaaagccc agcctgcccg cggcggacgc cgtgggcgtc 1200
gcaggggtcg gggtcgcggt ggtcccgggg ccgccgatgg tttgtcggac ccccgccggc 1260
gtgcccccag aaccaatcgc aacccggggg gaccccgccc cggggcgggg tggacggacg 1320
gccccggcgc cccccatggc gaggcgtggc gcggaagtga gcagcccgac ccacccggag 1380
gcccgcggac acggagcgtg cgccaagcac cccccccgct aatgacgctg gcgattgccc 1440
ccccgcccgc ggacccccgc gccccggccc cggagcgaaa ggcgcccgcc gccgacacca 1500
tcgacgccac cacgcggttg gtcctgcgct ccatctccga gcgcgcggcg gtcgaccgca 1560
tcagcgagag cttcggccgc agcgcacagg tcatgcacga cccctttggg gggcagccgt 1620
ttcccgccgc gaatagcccc tgggccccgg tgctggcggg ccaaggaggg ccctttgacg 1680
ccgagaccag acgggtctcc tgggaaacct tggtcgccca cggcccgagc ctctatcgca 1740
cttttgccgg caatcctcgg gccgcatcga ccgccaaggc catgcgcgac tgcgtgctgc 1800
gccaagaaaa tttcatcgag gcgctggcct ccgccgacga gacgctggcg tggtgcaaga 1860
tgtgcatcca ccacaacctg ccgctgcgcc cccaggaccc cattatcggg acggccgcgg 1920
cggtgctgga taacctcgcc acgcgcctgc ggccctttct ccagtgctac ctgaaggcgc 1980
gaggcctgtg cggcctggac gaactgtgtt cgcggcggcg tctggcggac attaaggaca 2040
ttgcatcctt cgtgtttgtc attctggcca ggctcgccaa ccgcgtcgag cgtggcgtcg 2100
cggagatcga ctacgcgacc cttggtgtcg gggtcggaga gaagatgcat ttctacctcc 2160
ccggggcctg catggcgggc ctgatcgaaa tcctagacac gcaccgccag gagtgttcga 2220
gtcgtgtctg cgagttgacg gccagtcaca tcgtcgcccc cccgtacgtg cacggcaaat 2280
atttttattg caactccctg ttttagtgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac 2340
aactagaatg cagtgaaaaa aatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt 2400
tgtaaccatt ataagctgca ataaacaagt taacaacaac aattgcattc attttatgtt 2460
tcaggttcag ggggaggtgt gggaggtttt ttaaagcaag taaaacctct acaaatgtgg 2520
tatggctgat tatgatcctg caagcctcgt cgtcctggcc ggaccacgct atctgtgcaa 2580
ggtccccggc cccggacgcg cgctccatga gcagagcgcc cgccgccgag gcgaagactc 2640
gggcggcgcc ctgcccgtcc caccaggtca acaggcggta accggcctct tcatcgggaa 2700
tgcgcgcgac cttcagcatc gccggcatgt ccccctggcg gacgggaagt atcaagcttg 2760
tacaataaaa acaaaacatt tcaaacaaat cgccccacgt gttgtccttc tttgctcatg 2820
gccggcgggg cgtgggtcac ggcagatggc gggggtgggc ccggcgtacg gcctgggtgg 2880
gcggagggaa ctaacccaac gtataaatcc gtccccgctc caaggccggt gtcatagtgc 2940
ccttaggagc ttcccgcccg ggcgcatccc cccttttgca ctatgacagc gacccccctc 3000
accaacctgt tcttacgggc cccggacata acccacgtgg ccccccctta ctgcctcaac 3060
gccacctggc aggccgaaac ggccatgcac accagcaaaa cggactccgc ttgcgtggcc 3120
gtgcggagtt acctggtccg cgcctcctgt gagaccagcg gcacaatcca ctgctttttc 3180
tttgcggtat acaaggacac ccaccatacc cctccgctga ttaccgagct ccgcaacttt 3240
gcggacctgg ttaaccaccc gccggtccta cgcgaactgc tcgag 3285
<210> 3
<211> 1550
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aagcttgaat tcatggcccc tccctcgggt taccccacag cctaggccga ttcgacctct 60
ctccgctggg gccctcgctg gcgtccctgc accctgggag cgcgagcggc gcgcgggcgg 120
ggaagcgcgg cccagacccc cgggtccgcc cggagcagct gcgctgtcgg ggccaggccg 180
ggctcccagt ggattcgcgg gcacagacgc ccaggaccgc gctccccacg tggcggaggg 240
actggggacc cgggcacccg tcctgcccct tcaccttcca gctccgcctc ctccgcgcgg 300
accccgcccc gtcccgaccc ctcccgggtc cccggcccag ccccctccgg gccctcccag 360
cccctcccct tcctttccgc ggccccgccc tctcctcgcg gcgcgagttt caggcagcgc 420
tgcgtcctgc tgcgcacgtg ggaagccctg gccccggcca cccccgcgta ggcgtgtacg 480
gtgggaggcc tatataagca gagctcgttt agtgaaccgt cagatcgcct ggagccacca 540
tgggaccaaa cacagaattt gcactatccc tgttaaggaa aaacataatg actataacaa 600
cctcaaaggg agagttcaca gggttaggca tacatgatcg tgtctgtgtg atacccacac 660
acgcacagcc tggtgatgat gtactagtga atggtcagaa aattagagtt aaggataagt 720
acaaattagt agatccagag aacattaatc tagagcttac agtgttgact ttagatagaa 780
atgaaaaatt cagagatatc aggggattta tatcagaaga tctagaaggt gtggatgcca 840
ctttggtagt acattcaaat aactttacca acactatctt agaagttggc cctgtaacaa 900
tggcaggact tattaatttg agtagcaccc ccactaacag aatgattcgt tatgattatg 960
caacaaaaac tgggcagtgt ggaggtgtgc tgtgtgctac tggtaagatc tttggtattc 1020
atgttggcgg taatggaaga caaggatttt cagctcaact taaaaaacaa tattttgtag 1080
agaaacaata gtaatgatga taagatacat tgatgagttt ggacaaacca caactagaat 1140
gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat 1200
tataagctgc aataaacaag ttaacaacaa caattgcatt cattttatgt ttcaggttca 1260
gggggaggtg tgggaggttt tttaaagcaa gtaaaacctc tacaaatgtg gtatggctga 1320
ttatgatcct gcaagcctcg tcgtcctggc cggaccacgc tatctgtgca aggtccccgg 1380
ccccggacgc gcgctccatg agcagagcgc ccgccgccga ggcgaagact cgggcggcgc 1440
cctgcccgtc ccaccaggtc aacaggcggt aaccggcctc ttcatcggga atgcgcgcga 1500
ccttcagcat cgccggcatg tccccctggc ggacgggaag tatcaagctt 1550
<210> 4
<211> 426
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gaattcatgg cccctccctc gggttacccc acagcctagg ccgattcgac ctctctccgc 60
tggggccctc gctggcgtcc ctgcaccctg ggagcgcgag cggcgcgcgg gcggggaagc 120
gcggcccaga cccccgggtc cgcccggagc agctgcgctg tcggggccag gccgggctcc 180
cagtggattc gcgggcacag acgcccagga ccgcgctccc cacgtggcgg agggactggg 240
gacccgggca cccgtcctgc cccttcacct tccagctccg cctcctccgc gcggaccccg 300
ccccgtcccg acccctcccg ggtccccggc ccagccccct ccgggccctc ccagcccctc 360
cccttccttt ccgcggcccc gccctctcct cgcggcgcga gtttcaggca gcgctgcgtc 420
ctgctg 426
<210> 5
<211> 182
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Gly Pro Asn Thr Glu Phe Ala Leu Ser Leu Leu Arg Lys Asn Ile Met
1 5 10 15
Thr Ile Thr Thr Ser Lys Gly Glu Phe Thr Gly Leu Gly Ile His Asp
20 25 30
Arg Val Cys Val Ile Pro Thr His Ala Gln Pro Gly Asp Asp Val Leu
35 40 45
Val Asn Gly Gln Lys Ile Arg Val Lys Asp Lys Tyr Lys Leu Val Asp
50 55 60
Pro Glu Asn Ile Asn Leu Glu Leu Thr Val Leu Thr Leu Asp Arg Asn
65 70 75 80
Glu Lys Phe Arg Asp Ile Arg Gly Phe Ile Ser Glu Asp Leu Glu Gly
85 90 95
Val Asp Ala Thr Leu Val Val His Ser Asn Asn Phe Thr Asn Thr Ile
100 105 110
Leu Glu Val Gly Pro Val Thr Met Ala Gly Leu Ile Asn Leu Ser Ser
115 120 125
Thr Pro Thr Asn Arg Met Ile Arg Tyr Asp Tyr Ala Thr Lys Thr Gly
130 135 140
Gln Cys Gly Gly Val Leu Cys Ala Thr Gly Lys Ile Phe Gly Ile His
145 150 155 160
Val Gly Gly Asn Gly Arg Gln Gly Phe Ser Ala Gln Leu Lys Lys Gln
165 170 175
Tyr Phe Val Glu Lys Gln
180
<210> 6
<211> 552
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atgggaccaa acacagaatt tgcactatcc ctgttaagga aaaacataat gactataaca 60
acctcaaagg gagagttcac agggttaggc atacatgatc gtgtctgtgt gatacccaca 120
cacgcacagc ctggtgatga tgtactagtg aatggtcaga aaattagagt taaggataag 180
tacaaattag tagatccaga gaacattaat ctagagctta cagtgttgac tttagataga 240
aatgaaaaat tcagagatat caggggattt atatcagaag atctagaagg tgtggatgcc 300
actttggtag tacattcaaa taactttacc aacactatct tagaagttgg ccctgtaaca 360
atggcaggac ttattaattt gagtagcacc cccactaaca gaatgattcg ttatgattat 420
gcaacaaaaa ctgggcagtg tggaggtgtg ctgtgtgcta ctggtaagat ctttggtatt 480
catgttggcg gtaatggaag acaaggattt tcagctcaac ttaaaaaaca atattttgta 540
gagaaacaat ag 552
<210> 7
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Met Ala Leu Thr Phe Ala Leu Leu Val Ala Leu Leu Val Leu Ser Cys
1 5 10 15
Lys Ser Ser Cys Ser Val Gly
20
<210> 8
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
atggccttga cctttgcttt actggtggcc ctcctggtgc tcagctgcaa gtcaagctgc 60
tctgtgggc 69
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ttagaagttc tttttcaagg tcct 24
<210> 10
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gtaggcgtgt acggtgggag gcctatataa gcagagctcg tttagtgaac cgtcagatcg 60
cctgga 66

Claims (13)

1.一种溶瘤病毒，其特征在于，其基因组上插入有第一调控元件；所述第一调控元件包括：癌细胞特异性启动子序列和由所述癌细胞特异性启动子驱动在目标癌细胞中表达特异性蛋白酶的第一核酸序列；所述癌细胞特异性启动子序列位于所述第一核酸序列上游，第一调控元件的插入位置位于溶瘤病毒的两个基因间；
所述溶瘤病毒的基因组上还插入有第二调控元件，所述第二调控元件包括：用于编码胞外牵引信号肽的第二核酸序列和用于编码特异性切割位点的第三核酸序列；所述特异性切割位点被所述特异性蛋白酶识别并切割；所述第二核酸序列位于所述第三核酸序列的上游；
所述第二调控元件位于所述溶瘤病毒的必需基因的5’末端，所述第二调控元件位于所述溶瘤病毒的必需基因的开放阅读框的起始密码子与第二三联体密码之间；
所述癌细胞特异性启动子选自端粒酶逆转录酶启动子、人表皮生长因子受体-2启动子、E2F1启动子、骨钙蛋白启动子、癌胚抗原启动子、Survivin启动子和血浆铜蓝蛋白启动子中的任意一种；
所述目标癌细胞为肺癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、胃癌细胞、前列腺癌细胞、脑肿瘤细胞、人结肠癌细胞、宫颈癌细胞、肾癌细胞、卵巢癌细胞、头颈部癌细胞、黑色素瘤细胞、胰腺癌细胞或食道癌细胞；
所述特异性蛋白酶为人类鼻病毒3C蛋白酶、凝血酶、Xa因子蛋白酶、烟草蚀纹病毒蛋白酶或重组PreScission蛋白酶；
所述溶瘤病毒选自单纯疱疹病毒、腺病毒、牛痘病毒、新城疫病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、水泡性口炎病毒和流感病毒中的任意一种。
2.根据权利要求1所述的溶瘤病毒，其特征在于，当所述特异性蛋白酶为人类鼻病毒3C蛋白酶时，所述特异性切割位点的氨基酸序列为：LEVLFQGP；
当所述特异性蛋白酶为凝血酶时，所述特异性切割位点的氨基酸序列为：LVPRGS；
当所述特异性蛋白酶为Xa因子蛋白酶时，所述特异性切割位点的氨基酸序列为：IE/DGR；
当所述特异性蛋白酶为烟草蚀纹病毒蛋白酶时，所述特异性切割位点的序列为：ENLYFQG；
当所述特异性蛋白酶为重组PreScission蛋白酶时，所述特异性切割位点的序列为：LEVLFQGP。
3.根据权利要求1所述的溶瘤病毒，其特征在于，所述胞外牵引信号肽为干扰素α2、白介素2、人血清白蛋白、人免疫球蛋白的重链或源自海洋桡脚类动物的萤光素酶胞外分泌信号肽。
4.根据权利要求1所述的溶瘤病毒，其特征在于，所述第一调控元件还包括有增强子序列，所述增强子序列位于所述癌细胞特异性启动子序列和所述特异性蛋白酶编码序列之间，所述增强子序列用于增强所述特异性蛋白酶的表达。
5.根据权利要求4所述的溶瘤病毒，其特征在于，所述增强子序列为CMV增强子或SV40增强子序列。
6.根据权利要求1-5任一项所述的溶瘤病毒，其特征在于，所述溶瘤病毒的一个或多个必需基因的5’末端插入所述第二调控元件。
7.根据权利要求1-5任一项所述的溶瘤病毒，其特征在于，所述溶瘤病毒为1型单纯疱疹病毒，必需基因为ICP27，所述癌细胞特异性启动子为端粒酶逆转录酶启动子，所述特异性蛋白酶为人类鼻病毒3C蛋白酶，所述胞外牵引信号肽为干扰素α2信号肽，所述特异性切割位点的氨基酸序列为LEVLFQGP；所述第二调控元件位于所述必需基因的开放阅读框的起始密码子ATG与第二三联体密码之间；所述第一调控元件位于所述必需基因的下游。
8.根据权利要求7所述的溶瘤病毒，其特征在于，
所述端粒酶逆转录酶启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述人类鼻病毒3C蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述人类鼻病毒3C蛋白酶的开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述干扰素α2信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述第二核酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
所述第三核酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
9.一种用于制备如权利要求1-8任一项所述的溶瘤病毒的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子具有插入至溶瘤病毒目标位点的插入序列，所述插入序列包括所述第一调控元件和所述第二调控元件，所述第一调控元件目标位点位于所述溶瘤病毒的两个基因间，所述第二调控元件位于所述溶瘤病毒的必需基因的5’末端。
10.含有权利要求9所述的核酸分子的载体。
11.制备如权利要求1-8任一项所述的溶瘤病毒的方法，其特征在于，其包括：将权利要求10所述的载体与亲本病毒和互补寄主细胞共培养，从培养物中收集得到所述溶瘤病毒；
其中，所述亲本病毒的基因组序列相对野生型病毒的基因组序列缺失所述必需基因；
所述互补寄主细胞含有表达所述必需基因的表达序列。
12.权利要求1-8任一项所述的溶瘤病毒在制备用于治疗癌症的药物中的应用，其特征在于，所述癌症为肺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、脑肿瘤、人结肠癌、宫颈癌、肾癌、卵巢癌、头颈部癌、黑色素瘤、胰腺癌或食道癌。
13.一种治疗癌症的药物，其特征在于，其包括权利要求1-8任一项所述的溶瘤病毒以及药学上可接受的辅料。
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