CN109943538B

CN109943538B - 一种肿瘤特异性提升的重组病毒及其改造方案和应用

Info

Publication number: CN109943538B
Application number: CN201910193006.8A
Authority: CN
Inventors: 李玉霞; 高鹏; 谢国明
Original assignee: Beijing Lingke Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Lingke Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-03-14
Filing date: 2019-03-14
Publication date: 2021-05-25
Anticipated expiration: 2039-03-14
Also published as: CN109943538A

Abstract

本发明提供了一种重组的小RNA病毒构建方法，将小RNA病毒多聚蛋白酶切位点替换为肿瘤特异性高表达蛋白酶的底物序列。本发明提供的重组柯萨奇病毒，将多聚蛋白酶切位点替换为肿瘤组织特异性高表达的基质金属蛋白酶2(MMP‑2)的底物序列，重组病毒成熟具有肿瘤细胞依赖性，降低了对正常组织的感染。本发明形成的病毒，可用于溶瘤病毒或病毒载体，安全性得到提升，施用途径得到拓展。

Description

一种肿瘤特异性提升的重组病毒及其改造方案和应用

技术领域

本发明涉及病毒生物学、肿瘤生物学领域，具体涉及一种重组柯萨奇病毒及其基因载体和抗肿瘤应用。

背景技术

柯萨奇病毒是一种基因长度约为7.4kb的单链正义RNA病毒，可以在多种肿瘤细胞内复制，溶解肿瘤，现已形成溶瘤病毒进入临床阶段。柯萨奇病毒应用于溶瘤有良好的优势：（1）安全。柯萨奇病毒是一类几乎无致病性的病毒，正常情况下，仅在免疫力尚未完全建立的儿童可表现明显的感染症状。同时，柯萨奇病毒遗传物质为RNA，整合宿主风险低，基因毒性小；（2）高效。柯萨奇病毒是一款自我增殖非常快速高效的溶瘤病毒，仅6小时左右即可更新一代，上市的T-vec单纯疱疹溶瘤病毒则需要约18小时之久，柯萨奇病毒抗肿瘤响应快且子代“活药”更多；（4）抗肿瘤类型多。临床研究已知对黑色素瘤有明确疗效，临床前研究表明对宫颈癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、消化道癌症、乳腺癌、膀胱癌、肝癌有巨大治疗潜力；（5）使用方案多。柯萨奇溶瘤病毒不仅可以采用与现有上市药物T-vec同样的瘤内注射使用方案，还可以通过静脉注射方案治疗肿瘤，大大提高了使用的便利性。

肿瘤细胞相对正常细胞具有很多特性，例如分裂旺盛。利用肿瘤细胞特性，改造抗肿瘤药物，提升特异性并降低毒性，是抗肿瘤药物的重要研发思路。在溶瘤病毒方面也有应用，例如，专利CN108004216A报道的单纯疱疹溶瘤病毒删除了胸苷激酶（thymidinekinase，TK）、核苷酸还原酶（ribonucleotide reductase，RR）和尿嘧啶DNA糖基化酶（uracil DNA glycosylase，UNG），转而只能利用肿瘤细胞中这些DNA合成相关的酶，具有肿瘤细胞选择性。柯萨奇病毒天然不具有这些DNA合成酶，肿瘤特异性改造需要另寻思路，尚未见根据肿瘤活性较高的酶改造的柯萨奇病毒的报道。

发明内容

本发明提供了一种具有肿瘤特异性的小RNA病毒改造方案。

本发明提供的改造方案的特征是，小RNA病毒成熟过程中的多聚蛋白的蛋白酶酶切位点被替换为肿瘤特异性高表达蛋白酶的底物序列。

本发明提供了一种重组小RNA病毒，其特征在于：具有肿瘤特异性；小RNA病毒成熟过程中的多聚蛋白的蛋白酶酶切位点被替换为肿瘤特异性高表达蛋白酶的底物序列；本发明优选的方案中，小RNA病毒包括柯萨奇病毒、艾柯病毒、脊髓灰质炎病毒和未分类的肠道病毒、鼻病毒属、副肠孤病毒属、肝病毒属、心病毒属、口蹄病毒属、马鼻病毒属、嵴病毒属中的任意一种或多种。

本发明提供了一种重组小RNA病毒，其特征在于：小RNA病毒是柯萨奇病毒；优选的是B组柯萨奇病毒；优选的B组柯萨奇病毒选自CVB1、CVB2、CVB3、CVB4、CVB5、CVB6，其改良形式或其组合。

本发明提供了一种重组柯萨奇B3病毒，其特征在于：病毒基因组的蛋白酶切割位点被替换；蛋白酶酶切位点是2A蛋白酶或者3C蛋白酶的切割位点；蛋白酶是指表达量与肿瘤具有显著正相关的蛋白水解酶，包括但不限于：组织蛋白酶、尿激酶型纤溶酶原激活物、基质金属蛋白酶、成纤维细胞激活蛋白、透明质酸酶。

本发明提供了一种重组柯萨奇B3病毒，其特征在于：其特征在于：病毒基因组的3C蛋白酶的切割位点被基质金属蛋白酶MMP2特异切割位点替换。

本发明提供了一种重组柯萨奇B3病毒，其中，病毒基因组的蛋白酶切割位点被替换。

优选的，被替换的蛋白酶酶切位点可以是2A蛋白酶或者3C蛋白酶的切割位点。

本发明所述的肿瘤特异性高表达的蛋白酶是指表达量与肿瘤具有显著正相关的蛋白水解酶，包括，但不限于组织蛋白酶、尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）、基质金属蛋白酶（MMP）、成纤维细胞激活蛋白（FAPα）、透明质酸酶。

本发明提供了一种重组柯萨奇病毒，其中，病毒基因组的3C蛋白酶的切割位点被基质金属蛋白酶MMP2特异切割位点替换。

本发明提供的CVB3被替换的3C蛋白酶酶切位点可以是蛋白VP2与VP3之间、蛋白VP3与VP1之间、蛋白2A与2B之间、蛋白2B与2C之间、蛋白2C与3A之间、蛋白3A与3B之间、蛋白3B与3C之间、蛋白3C与3D之间的酶切位点，也可以是其它小RNA病毒的蛋白L与VP4之间位点。也可以是上述位点之间的任意组合。

优选的，本发明提供的是蛋白VP3与VP1之间、蛋白2A与2B之间、蛋白2C与3A之间、蛋白3B与3C之间的酶切位点被替换，以及上述4种酶切位点的三种组合方式，包括，蛋白2C与3A之间和蛋白VP3与VP1之间的组合、蛋白2A与2B之间和蛋白3B与3C之间的组合、蛋白VP3与VP1之间和蛋白2A与2B之间和蛋白3B与3C之间的组合。

本发明优选的肿瘤特异性高表达的蛋白酶是基质金属蛋白酶。基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinase，MMP）家族是一类依赖Zn²⁺的蛋白水解酶，在癌症等疾病的发病机理中扮演着十分重要的角色，参与多种恶性肿瘤的产生、侵袭和转移，在胰腺癌、乳腺癌、结肠癌等肿瘤组织中表达上调，而在正常组织中表达量极少，如结直肠癌患者的病变组织中，MMP-1、2、3、7、9、13过度表达，其中MMP-2的表达比在癌旁组织中高20倍。

本发明优选的MMP是MMP-2。

MMP-2底物序列具有一定的特征性，又具有一定的可变性。所谓特征性，是指分析MMP-2底物序列，可以发现其具有规律性，众多文献已进行了报道，如Anna Prudova,，2010,9 (5) 894-911。所谓可变性，是指在遵守一定的规律的情况下，MMP-2底物序列的氨基酸序列并不唯一，而具有多种可行性。例如-PAGLLG-，-IPVSLRSG-，-PVGLIG-，-GPLGMLSQ-等非常众多。

同时，MMP家族底物序列具有一定的通用性。所谓通用性是指某些底物序列可同时被多种MMP蛋白酶识别并水解，如-PVGLIG-可同时被MMP2和MMP9识别并水解。

在这些肿瘤高表达水解酶的底物序列中，有一类在本发明应用中需要避免。具体是指，其序列插入原有序列后，再次形成病毒天然成熟所需切割位点的序列。如-GPLGMLSQ-插入CVB3的3C酶切位点后再次形成天然成熟所需切割位点。

本发明优选的MMP-2的底物序列是- IPVGLIGK-。

优选的对应的核苷酸序列是5‘-ATCCCCGTGGGCCTGATCGGCAAG-3’

本发明提供了一种重组柯萨奇B3病毒，其蛋白VP3与VP1之间的3C蛋白酶酶切位点被替换为MMP2的特异性识别和切割底物序列- IPVGLIGK-。

本发明所述的重组小RNA病毒具有抗肿瘤、杀伤肿瘤细胞的作用。

本发明所述的重组小RNA病毒在制备抗肿瘤或杀伤肿瘤细胞的组合物上的应用。

本发明所述的重组柯萨奇B3病毒具有抗肿瘤、杀伤肿瘤细胞的作用。

本发明所述的重组柯萨奇B3病毒在制备抗肿瘤或杀伤肿瘤细胞的组合物上的应用。

本发明所述的重组CVB3-H3病毒在制备抗肿瘤或杀伤肿瘤细胞的组合物上的应用。

针对病毒进行肿瘤特异性的改造，现有技术改造溶瘤病毒主要集中在利用肿瘤高复制、高转录的特点，从病毒的复制、转录的节点入手，但本发明的发明人突破原有的常规思路，反复探索后发现，结合利用肿瘤细胞蛋白酶高表达的特性和小RNA病毒多聚蛋白切割成熟的特性，获得肿瘤细胞特异性提升的病毒。

本发明所述肿瘤细胞是选自骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、阴户癌、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统的癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病（其包括急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、儿童期实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤）、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统（CNS）的赘生物、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、和上述癌症的组合类型的癌症的肿瘤细胞。

本发明的溶瘤病毒既可以用作单一药剂进行抗肿瘤治疗，也可以与手术切除、放疗、化疗、靶向药物治疗和其它免疫治疗联合使用进行抗肿瘤治疗。并且可以通过优选的联合实施方案，改善抗肿瘤效果。

此外，现有技术还认为，溶瘤病毒采用瘤内注射的局部应用方式，比静脉注射的全身应用方式具有安全性。但同时，瘤内注射在具体实施应用时，受技术、场地、设备等局限，限制了应用。本发明发现，经过改造重组后，溶瘤病毒同样可以在静脉输注使用方案中，兼具安全性和便利性。

本发明的溶瘤病毒及其联合治疗药物可以使用各种已知的途径给予人体或动物受试者。例如，可以通过常规针头或影像辅助的体内定点给药方式，给药到肿瘤内、肠胃内外、皮下、口腔、表皮、皮内、肌肉内、腹膜内和血管内。亦可通过喷雾、液体制剂、膏剂、片剂等已知剂型等给予鼻腔、气管内、肠内、耳内等。

本发明的重组病毒在制备抗肿瘤或杀伤肿瘤细胞的组合物上的应用，其特征在于：制备成注射剂、冻干制剂、喷雾制剂、液体制剂、膏剂、片剂中的任意一种剂型。

本发明的目的是克服现有野生柯萨奇病毒及其突变株，作为载体和抗肿瘤药物肿瘤细胞特异性不足的缺点，提供一种肿瘤特异性提升的柯萨奇重组病毒。

本发明具有如下显著特征：

本发明更改了柯萨奇病毒野生株多聚蛋白转变为成熟蛋白的关键酶切位点，替换为肿瘤细胞特异性高活性的蛋白酶对应的酶切位点，提升了病毒对肿瘤细胞的特异性，加强了病毒作为基因载体或治疗药物在人体施用的安全性。特别地，肿瘤依赖性相应的安全性提升，可以将目前略有局限的瘤内注射方式，扩展到便利的静脉注射方式。

本发明将关键酶切位点更换为基质金属蛋白酶的酶切位点，即可以利用进入临床阶段的金属蛋白酶抑制剂作为溶瘤病毒的活性抑制剂，一方面可以避免意外的、不可控的体内病毒增殖，另一方面可以避免溶瘤太快而造成细胞因子释放综合征等问题。

本发明应用了肿瘤特异性高表达的蛋白酶。酶是高效的催化剂，一个酶分子可以催化多个病毒分子的成熟，导致信号的高效放大。

附图说明

图1 ：为本发明所述的可被替换的3C蛋白酶的切割位点分布示意图，箭头所指即为可被替换的位点。

图2 ：为本发明具体实施例中重组病毒的致细胞病变效应的连续观察结果，结果输出设备为艾森的细胞实时活性监测系统（RTCA）。

图3 ：为本发明具体实施例中重组病毒对肿瘤细胞和非肿瘤细胞的感染杀伤后细胞活性的终点测量结果，具体结果为CCK-8试剂盒测量所得细胞活性统计学数据。

图3的图A为：对肿瘤细胞HeLa细胞的杀伤能力评价，图3的图B为：对非肿瘤细胞HEK-293细胞的杀伤能力评价。

具体实施方式

通过以下具体实施例，进一步说明本发明，但不用来限制本发明的范围。领域内专业人员对本发明具体实施条件或方案的修改或替代，均属于本发明的范围。

实施例1

从标准株感染性克隆出发，构建插入MMP2底物序列的重组感染性克隆。

利用已有的CVB3-H3感染性克隆，构建插入MMP2底物序列的重组感染性克隆。已知现有的CVB3-H3感染性克隆是病毒株H3（Genbank accession：U57056.1）的全长序列构建在载体pBluescript II SK上所得，H3的全基因序列的上下游仅保留了Not I和Cal I两个酶切位点。pBluescript II SK载体可以通过体外转录的方案，获得病毒株H3及其突变株、重组株的RNA。

本实施例通过定点突变的方式，在柯萨奇B3病毒感染性克隆质粒的特殊位点引入MMP2的底物酶切序列- IPVGLIGK-，氨基酸序列为SEQ ID No：1。

SEQ ID No：2是其对应的核苷酸序列，序列为5’-atccccgtgggcctgatcggcaag-3’。

酶切序列引入位置与序列插入引物列表如下：

SEQ ID NO.3（引物A-F）：atccccgtgggcctgatcggcaagggtccaccagtatacagag

SEQ ID NO.4（引物A-R）：

cttgccgatcaggcccacggggatctggaacagtgcctcaaggg

SEQ ID NO.5（引物B-F）：atccccgtgggcctgatcggcaagggccccgtggaagacgcg

SEQ ID NO.6（引物B-R）：cttgccgatcaggcccacggggatctggaaaaagttttgctgcg

SEQ ID NO.7（引物C-F）：atccccgtgggcctgatcggcaagggagtgaaggactatgtgg

SEQ ID NO.8（引物C-R）：cttgccgatcaggcccacggggatctgttccattgcatcatc

SEQ ID NO.9（引物D-F）：atccccgtgggcctgatcggcaagggtcctgcatttgaatttgc

SEQ ID NO.10（引物D-R）：

cttgccgatcaggcccacggggatctgcacttttgcttgccttag

使用Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit（美国 New England Biolabs #E0554S）试剂盒，配合上述PCR模板和引物，直接PCR插入长的酶切底物序列。

PCR体系如下：12.5 µl Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix，1.25 µl10 µM Forward Primer，1.25 µl 10 µM Reverse Primer，1 µl Template DNA (1–25 ng/µl)，9.0 µl Nuclease-free water，最终反应总体积为25 µl。

PCR反应条件如下：起始退火：98°C 30 s；25个扩增循环：98°C 10 s，68°C 20 s，72°C 5min；终延伸：72°C 2 m；低温保持：4°C。

PCR结束后，使用试剂盒中的Kinase-Ligase-DpnI (KLD)体系去除PCR模板并进行连接反应。反应体系如下：1 µl PCR产物，5 µl 2X KLD Reaction Buﬀer，1 µl 10X KLDEnzyme Mix，3 µl Nuclease-free Water。反应条件为室温孵育5min。

然后取KLD体系的产物直接进行感受态转化。采用常规的DH5α感受态细胞作为转化载体。转化产物涂布在抗性筛选平板上，37℃过夜培养。挑取克隆后测序鉴定。多次转化后发现，片段存在丢失情况。经电泳反复确认转化前全基因组片段不存在大片段丢失的情况下，多次验证转化条件。尝试了多种实验室常用感受态细胞，包括DH5α菌株、BL21菌株、JM109菌株、TOP10菌株、HB101菌株和JM110菌株。多番尝试后发现，TOP10菌株用于转化时，没有片段丢失情况。

选用TOP10菌株作为转化细胞，经过抗性平板筛选、过夜培养和单克隆测序，每个样品选取1个正确的重组克隆。正确的重组克隆保存甘油菌，并通过摇菌扩大培养和质粒抽提，获得重组的感染性克隆质粒。

实施例2

利用体外转录的方案，获得重组病毒RNA，并通过转染RNA的方式拯救病毒。

首先，将纯化好的质粒使用内切酶进行线性化操作。线性化后的质粒作为模板进行体外转录操作。根据试剂盒说明，配制体外转录体系。包括：10μl 5×Buffer，2.5μg 模板，4.5μl ATP，4.5μl CTP，4.5μl UTP，1.5μl GTP，3.75μl CAP，2μl RNA酶抑制剂，5μl 转录酶，最后用去离子水补齐50μl。37℃温育3h；然后加入5μl DNase，37℃作用5min，去除DNA模板。并使用RNeasy Plus Mini kit回收纯化RNA，分获得各个重组病毒的RNA，检测RNA的提取质量和浓度。

人宫颈癌细胞系HeLa细胞可以表达大量MMP2蛋白酶，本实施例使用HeLa细胞进行病毒拯救。

为了产生重组的柯萨奇病毒，我们使用了现有的重组病毒拯救方案。使用重组病毒的RNA转染HeLa细胞，拯救病毒。具体操作步骤为，使用完全培养基（10%FBS 100U/ml青霉素 0.1mg/ml链霉素 2mM L-谷氨酰胺高糖DMEM培养基）重悬消化成单个细胞的HeLa细胞，然后接种在6孔细胞培养板中，每孔的细胞接种数目是0.6×10⁶个。在37℃ 5%CO₂培养箱中过夜培养后，当汇合度达到80%左右时，使用转染试剂TurboFect Transfection Reagent（Thermo Scientific R0531）配制转染复合物（每孔）：200μl Opti-MEM培养基，2ug RNA，3μl Turbofect试剂。混匀转染复合物，室温静置15min左右。更换细胞培养板中培养基为新鲜的完全培养基，然后滴加静置后的转染复合物。转染后6小时更换为2%FBS 高糖DMEM培养基。继续在37℃ 5%CO₂培养箱培养2天，然后将细胞培养物反复冻融3次，直接接种到新种植的HeLa细胞中，在37℃ 5%CO₂培养箱中过夜培养。重复此“接种-培养-冻融”的盲传步骤2-3次，直到观察到细胞皱缩变圆的细胞病变现象，确认重组病毒拯救成功。此时收集细胞培养液上清，使用4℃ 12000rpm/min，30min离心去沉淀，取上清使用0.22μm滤器进行过滤除菌，获得病毒液，分装并冻存在-80℃环境中。

实施例3

使用实时活细胞监测系统（RTCA）实施重组病毒对非肿瘤细胞人胚肾细胞的致细胞病变效应分析。该系统通过检测细胞培养板E-Plate 96上种植的活细胞所传递的电信号的强弱，定义细胞活性。具体操作方案如下。提前一天在RTCA配套的E-Plate 96培养板中种好细胞。在E-Plate 96的孔中加入50 µl 完全培养基（10%FBS 100U/ml青霉素 0.1mg/ml链霉素 2mM L-谷氨酰胺高糖DMEM培养基）；放置到仪器中静置10min；然后通过仪器操作开始运行基线测定；基线测定结束后，从仪器中取出E-Plate 96培养板，使用完全培养基制备细胞HEK 293T细胞悬液，按照1.2万/100ul的细胞浓度，在E-Plate 96培养板的每个孔小心加入100ul细胞悬液；放置到仪器中静置10min后，运行仪器开始测量细胞活性指数，设定为每15min记录一次细胞活性指数。

HEK 293T细胞在RTCA仪器中过夜培养后，暂停RTCA仪器的测量，取出已经连续测量细胞活性指数的E-Plate 96培养板，吸出原有培养基100ul，加入100ul重组病毒或对照（包括阳性对照：病毒标准株和阴性对照：培养基），病毒感染复数控制为MOI=1，放置到仪器中静置10min，运行仪器开始测量细胞活性指数。连续测量48小时以上，收集数据进行分析。

结果如图2所示，结果显示重组病毒株仍具有致细胞病变能力。结果还显示，重组病毒株的致细胞病变能力较典型株有所下降。

此外，结果显示，不同的重组病毒株，针对人胚肾细胞具有不同的致细胞病变能力，单酶切位点替换的重组病毒株病毒活性较高。其中，单酶切位点替换的重组病毒株中，重组病毒株H3B的致细胞病变拐点最先出现，表明毒性最高，其余依次是重组病毒株H3D、H3A和H3C。三酶切位点替换的重组病毒株致细胞病变能力在各种重组病毒株中最弱，基本与阴性对照相似。双酶切位点替换的重组病毒株致细胞病变能力介于单酶切位点替换重组病毒株和三酶切位点替换重组病毒株，重组病毒株H3AB的致细胞病变拐点较重组病毒株H3CD的拐点较早出现说明毒性稍强。该结果表明，重组病毒的致细胞病变能力能力与病毒被替换位点具有一定联系，且具有不确定性，通过实验方案验证各种重组病毒的病毒活性非常重要。

实施例4

使用细胞活性分析CCK-8法分析重组病毒对不同细胞的感染杀伤能力。具体操作步骤如下，使用能够大量表达MMP-2蛋白酶的肿瘤细胞人宫颈癌细胞HeLa，和几乎不表达MMP-2蛋白酶的非肿瘤细胞人胚肾细胞HEK-293细胞进行实验。第一天，在96孔细胞培养板中分别按照种1×10⁴cell/孔 HeLa细胞和1.2×10⁴cell/孔HEK-293细胞种植细胞。放置到CO2培养箱过夜培养。第二天，通过更换培养基的方法，加入MOI=0.1的重组病毒或对照（包括阳性对照：病毒标准株和阴性对照：培养基）。

具体方案为，将病毒稀释在2% FBS DMEM中，形成MOI=0.1的病毒液，然后对原有细胞液进行换液。加入病毒后，再次放置到CO2培养箱培养24小时，然后开始操作CCK-8测量。具体为，每孔加入10ul CCK-8溶液（尽量避免气泡），培养箱孵育2h，上酶标仪测定OD450nm吸光值。包括如下几组数据，As-实验孔（含有细胞的培养基、CCK-8、毒性物质）、Ac-阴性对照孔（含有细胞的培养基、CCK-8、没有毒性物质）、Ab-空白孔（不含细胞和毒性物质的培养基、CCK-8）。

然后通过以下公式进行计算细胞存活率，并以细胞存活率反应病毒毒性。

。

结果如图3所示，结果表明对于肿瘤细胞HeLa，重组的CVB-H3B和标准株CVB-H3均具高杀伤能力（图3A）；而对非肿瘤细胞HEK-293，重组的CVB-H3B的杀伤力较标准株CVB-H3大幅下降（图3B）。具体而言，标准株CVB-H3和重组的CVB-H3B对于HEK-293和HeLa细胞的CCK-8的测量值和平均值如下所示。

组别实验值1 实验值2 实验值3 平均值

CVB-H3感染HEK-293细胞 2.8 3.7 3 7.4 4.63

CVB-H3B感染HEK-293细胞 78.2 83.3 62.5 74.67

组别实验值1 实验值2 实验值3 平均值

CVB-H3感染HeLa细胞 3.5 5.2 1.6 3.43

CVB-H3B感染HeLa细胞 9.8 6.4 4.2 6.8

对于人宫颈癌HeLa细胞，野生株CVB-H3与重组株CVB-H3B杀伤细胞后，细胞活性均值仅为3.4%和6.8%，两组病毒对细胞的杀伤能力并无显著差异。感染重组CVB-H3B的人胚肾细胞HEK-293的细胞活性均值达到74.6%，远高于感染CVB-H3的人胚肾细胞HEK-293细胞的活性（均值仅为4.6%），且差异显著。结果提示，所获得的重组CVB溶瘤病毒具有肿瘤细胞选择性。

实施例5：重组CVB溶瘤病毒的半成品组份及每毫升含量：

重组CVB溶瘤病毒 25微克

明胶 4毫克

蔗糖 40毫克

氯化钾 4毫克

谷氨酸钠 4毫克

氯化钠 4毫克

余量为注射用水

pH 7.0～7.2

实施例5：重组CVB溶瘤病毒的冻干粉组份及含量：

重组CVB溶瘤病毒 25微克

海藻糖 4毫克

赖氨酸 5毫克

重组CVB溶瘤病毒25微克加入5毫克精氨酸，5毫克赖氨酸，加入注射用水，加热溶解，稀释至1000ml，过滤、滤液超滤，分装、冷冻干燥，封装。

上述冷冻干燥分为四个阶段：

(1)预冻3小时，温度在-30℃；

(2)减压干燥14小时，温度在-32℃；

(3)升温干燥4小时，温度在-15℃

(4)二次升温干燥4小时，温度在20℃。

关于序列表中<130> “8888888”的说明，是制作序列表时的案卷参考号

序列表

<110> 北京领柯生物科技有限公司

<120> 一种肿瘤特异性提升的重组病毒及其改造方案和应用

<130> 8888888

<141> 2019-03-13

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 1

Ile Pro Val Gly Leu Ile Gly Lys

1 5

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 2

atccccgtgg gcctgatcgg caag 24

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 3

atccccgtgg gcctgatcgg caagggtcca ccagtataca gag 43

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 4

cttgccgatc aggcccacgg ggatctggaa cagtgcctca aggg 44

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 5

atccccgtgg gcctgatcgg caagggcccc gtggaagacg cg 42

<210> 6

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 6

cttgccgatc aggcccacgg ggatctggaa aaagttttgc tgcg 44

<210> 7

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 7

atccccgtgg gcctgatcgg caagggagtg aaggactatg tgg 43

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 8

cttgccgatc aggcccacgg ggatctgttc cattgcatca tc 42

<210> 9

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 9

atccccgtgg gcctgatcgg caagggtcct gcatttgaat ttgc 44

<210> 10

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 10

cttgccgatc aggcccacgg ggatctgcac ttttgcttgc cttag 45

序列表

<110> 北京领柯生物科技有限公司

<120> 一种肿瘤特异性提升的重组病毒及其改造方案和应用

<130> 8888888

<141> 2019-03-13

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> (人工合成序列)

<400> 1

Ile Pro Val Gly Leu Ile Gly Lys

1 5

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> (人工合成序列)

<400> 2

atccccgtgg gcctgatcgg caag 24

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> (人工合成序列)

<400> 3

atccccgtgg gcctgatcgg caagggtcca ccagtataca gag 43

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> (人工合成序列)

<400> 4

cttgccgatc aggcccacgg ggatctggaa cagtgcctca aggg 44

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> (人工合成序列)

<400> 5

atccccgtgg gcctgatcgg caagggcccc gtggaagacg cg 42

<210> 6

<211> 44

<212> DNA

<213> (人工合成序列)

<400> 6

cttgccgatc aggcccacgg ggatctggaa aaagttttgc tgcg 44

<210> 7

<211> 43

<212> DNA

<213> (人工合成序列)

<400> 7

atccccgtgg gcctgatcgg caagggagtg aaggactatg tgg 43

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> (人工合成序列)

<400> 8

cttgccgatc aggcccacgg ggatctgttc cattgcatca tc 42

<210> 9

<211> 44

<212> DNA

<213> (人工合成序列)

<400> 9

atccccgtgg gcctgatcgg caagggtcct gcatttgaat ttgc 44

<210> 10

<211> 45

<212> DNA

<213> (人工合成序列)

<400> 10

cttgccgatc aggcccacgg ggatctgcac ttttgcttgc cttag 45

Claims

1.一种重组小RNA病毒，其特征在于：

具有肿瘤特异性；

小RNA病毒是重组柯萨奇B3病毒；

小RNA病毒成熟过程中的多聚蛋白的蛋白酶酶切位点被替换为肿瘤特异性高表达蛋白酶的底物序列；

蛋白酶酶切位点是蛋白VP3与VP1之间的3C蛋白酶酶切位点；

肿瘤特异性高表达蛋白酶是MMP2蛋白酶。

2.根据权利要求1的一种重组小RNA病毒，其特征在于：

蛋白VP3与VP1之间的3C蛋白酶酶切位点被替换为MMP2的特异性识别和切割的底物序列IPVGLIGK；

MMP2的特异性识别和切割底物序列对应的核苷酸序列是：

5‘ -ATCCCCGTGGGCCTGATCGGCAAG-3’。

3.根据权利要求1-2的一种重组小RNA病毒在制备杀伤肿瘤细胞的组合物上的应用，所述肿瘤细胞是宫颈癌的肿瘤细胞。

4.根据权利要求1-2的一种重组小RNA病毒在制备抗肿瘤的组合物上的应用。