JP7399868B2 - がんを処置するための感染性核酸の使用 - Google Patents
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Description
本出願は、2018年3月12日に出願された米国特許出願第62/641,814号の利益を主張する。先行出願の開示は、本出願の開示の一部と考えられる(および参照により本明細書に組み込まれる)。
1.技術分野
本願は、ウイルス核酸(例えば、ピコルナウイルスをコードする感染性核酸)を用いたがんの処置に関する方法および材料に関する。
エンテロウイルス属は、ピコルナウイルス科のメンバーであり、ヒトエンテロウイルスの4つの種、HEV-A~-Dを含む。エンテロウイルスは、約7500ヌクレオチド長であるプラスセンス一本鎖RNAゲノムを有する小さい非エンベロープウイルスである。細胞内在化の後、ビリオンは脱殻し、ゲノムRNAは、単一の大きいポリタンパク質にすぐに翻訳され、ウイルスによりコードされたプロテアーゼ(3C)によってプロセッシングされ、キャプシドタンパク質およびウイルス複製に関与する非構造タンパク質をもたらす。マイナスセンス鎖RNAは、ウイルスによりコードされたRNA依存的RNAポリメラーゼ(RdRp-3D)によってプラスセンスウイルスRNAから合成される。マイナス鎖RNAは、翻訳、複製またはパッケージングされ得る、より多くのプラスセンスRNA分子を合成するための鋳型として働く。ウイルスの子孫は、ウイルスが細胞溶解を誘導し、その子孫を環境中に放出するまで、細胞質内に蓄積する。
がんを処置するために使用することができる感染性核酸の生成
エンテロウイルスおよびライノウイルスは、ウイルス翻訳を調節するためにI型内部リボゾーム進入部位(IRES)を使用する。ポリオウイルスIRESの構造を予測し、消化/化学的精査および変異原性分析によって検証した(Riveraら、Virology, 165:42-50 (1988); Pilipenkoら、Virology, 168:201-209 (1989); Skinnerら、J. Mol. Biol., 207:379-392 (1989); およびBurrillら、J. Virol., 87:11670-11683 (2013))。CVA21は、ポリオ様ウイルスであり、ポリオウイルスIRESとの相対的に86%の相同性を共有する。ポリオウイルス5'UTRは、6個のドメイン(I~VI)を含有する。ドメインIは、プラス鎖とマイナス鎖の両方の合成にとって必要とされるクローバーの葉の構造を形成する(Andinoら、Cell, 63:369-380 (1990); Andinoら、EMBO J., 12:3587-3598 (1993); Bartonら、EMBO J., 20:1439-1448 (2001); およびVogtら、PLoS Pathog., 6:e1000936 (2010))。ドメインII~VIは、IRES活性に関与する。ウイルスの複製および翻訳には、宿主IRES-trans作用因子(ITAF)および開始因子の動員を含む、RNA-RNAおよびRNA-タンパク質複合体相互作用が必要である(Leeら、Trends Microbiol., 25:546-561 (2017))。これらのドメインの破壊は、弱毒化またはウイルスにとって致死的な表現型をもたらし得る。ポリオウイルスと同様、CVA21は、リボソーム量に関与するドメインVI中にクリプティックなAUG部位を有する(Vermaら、J. Gen. Virol., 92:2310-2319 (2011))。一次AUG部位での翻訳の開始は、「走査領域」と呼ばれる長い可変リンカーを介するリボソーム走査に依存する。
1つの目標は、非改変ウイルスと同様の速度で標的感染性核酸からの拡散性ウイルス感染の核となり得る感染性核酸を取得することであった。ウイルス子孫を産生する標的感染性RNAの能力を分析するために、miR-133もmiR-206も発現しないH1-HeLa細胞(ATCC、Manassas、VA)に、それぞれのmiRT-CVA21をコードする感染性RNAをトランスフェクトした。制限エンドヌクレアーゼMluI-HF (New England Biolabs、Ipswich、MA)を用いて、非改変またはmiRT-CVA21をコードするプラスミドDNAを線状化した後、エタノール沈降を行い、ヌクレアーゼを含まない水に再懸濁することによって、感染性RNAを調製した。1μgの線状化DNAを、Ambion MEGAscript T7転写キットを用いてRNA転写物に転写し、MEGAclear転写クリーンアップキット(Thermo Fisher Scientific Inc.、Waltham、MA)を用いてRNAを精製した;両方とも製造業者の指示書に従った。転写物のサイズおよび完全性を、RNA Flashゲル(Lonza、Basel、Switzerland)上でRNAを泳動することによって検証した。6ウェル組織培養プレート中に、ウェルあたり4x105個の細胞を播種し、24時間後にトランスフェクトした。TransIT-mRNAトランスフェクションキット(Mirus Bio LLC、Madison、WI)を用いて、各ウェルに2.5μgの精製T7 RNAをトランスフェクトした。細胞変性効果(CPE)が観察されたら、細胞を上清中に擦り取り、個々のクライオチューブ中に試料を採取した。試料を3回の凍結-解凍サイクルにかけ、4℃で5分間、2500rpmでの遠心分離によって明澄化し、0.22μmのシリンジフィルターを通して濾過した。50μLの明澄化された溶解物を使用して、6ウェル組織培養プレートのウェル中で新鮮なH1-HeLa細胞を感染させた。 無血清培地中、37℃で2時間、細胞を感染させた。培地および取り込まれなかったウイルスを除去し、ウェルあたり2mLの新鮮な完全増殖培地を添加した。感染後24時間で、細胞をCPEについて観察した。Kellyらの構築物CVA21-3'miRTを除いて、全てのmiRT-CVA21は、目に見えるCPEをもたらす十分なウイルス子孫を生成した(図2A)。
ウイルス保存液を生成するために、上記のようにウイルスRNAを産生させた。ウェルあたり2.5μgのRNAを、上記のように6ウェルプレート中に播種されたH1-HeLa細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクション後48~72時間で、細胞を上清中に擦り取り、試料を採取した。試料を3回の凍結-解凍サイクルにかけ、4℃で5分間、2500rpmでの遠心分離によって明澄化し、0.22μmのシリンジフィルターを通して濾過した。T75フラスコ中のH1-HeLa細胞に、無血清培地中、37℃で明澄化された溶解物を感染させた。感染の2時間後、培地および取り込まれなかったウイルスを除去し、細胞に完全増殖培地を補充した。CPEが観察されたら、試料を同じ様式でプロセッシングした。明澄化された溶解物のウイルス保存液をアリコートし、-80℃で保存した。ウイルスをH1-HeLa細胞上で滴定した。ウェルあたり1x104個の細胞を、96ウェル組織培養プレート中に播種し、24時間後、感染させた。ウイルスの2倍連続希釈液(1x10-2~1x10-10)を、無血清培地中で作製し、100μLの各希釈液を、8個の複製ウェルのそれぞれに添加した。細胞を37℃で2時間感染させた後、培地を除去し、100μLの完全増殖培地と交換した。細胞を37℃で72時間インキュベートした後、ウェルをCPEについて視覚的に検査した。各試料1mLあたりのTCID50を、Spearman-Karber式を用いて決定した。
可変位置でのREの遺伝的安定性を、miR-133およびmiR-206を発現するTE671筋肉細胞中でmiRT-CVA21を強制継代することによって評価した。より高レベルのmiR-133およびmiR-206を発現するミオチューブ中での細胞の分化を誘導する、TE-671細胞を、2%ウマ血清中で4日間培養した。6ウェル組織培養プレート中の分化したTE-671細胞(dTE-671)に、無血清培地中、37℃で2時間、10のMOIでCVA21-ΔV(1x)、CVA21-ΔV(2x)、CVA21-686(2x)、CVA21-3’TR(1x)、またはCVA21-3’TR(2x)を感染させた。2時間後、培地および取り込まれなかったウイルスを除去し、細胞を完全培地で洗浄した。ウェルあたり1.5mLの完全培地を添加し、細胞を37℃でインキュベートした。トランスフェクション後24時間で、細胞を上清中に擦り取り、試料を採取した。全ての試料を、3回の凍結-解凍サイクルにかけ、溶解物を4℃で5分間、2500rpmでの遠心分離によって明澄化し、0.22μmのフィルターを通して濾過した。明澄化された溶解物中のウイルスを、それぞれの回で、2容量の新鮮な培地に対して1容量の明澄化された溶解物を用いて、dTE-671細胞中で7回、連続的に継代した。製造業者の指示書に従ってQIAampウイルスRNAミニキット(Qiagen、CA)を用いて、それぞれの継代の明澄化された溶解物からウイルスRNAを単離した。cDNAを合成し、REを含有する領域を増幅した。アンプリコンを、ネステッドプライマーを用いて配列決定した。このアッセイを、2回行った。エスケープ変異体は、早ければ継代2でCVA21-686(2x)試料中で観察された。他の全てのmiRT-CVA21感染は、継代4~7の間でエスケープ変異体を生じた。
in vitroでの結果に基づいて、CVA21-3'TR(2x)構築物はin vivoで評価しなかった。4~5週齢のメスのCB17 ICR-SCIDマウスを、Envigo (Huntingdon、Cambridgeshire、UK)から購入した。マウスを照射し、24時間後、右脇腹に5e6個のMel624細胞を皮下的に埋め込んだ。腫瘍が0.5cm x 0.5cmの平均に達した時、腫瘍を、50μLの食塩水中の30μgのRNAで腫瘍内的に処置した。手持ち式ノギスを使用して測定される腫瘍体積、体重、および全体的な健康を日常的にモニタリングした。RNA処置後、7日目に全てのマウスから血液を採取した。イソフルランの吸入によってマウスを麻酔し、血清分離ゲルを含むBDマイクロテイナーチューブ中に、顎下腺静脈から血液を採取した。血液を、室温で30分間凝固させた後、4℃で5分間、8000rpmでの遠心分離によって血清を分離した。血清を-80℃で保存した。血清中のウイルスを、H1-HeLa細胞上でウイルス保存液について記載されたように滴定した。血清(心穿刺によって出血させた)および骨格筋組織を、安楽死の時点で全てのマウスから取得した。骨格筋切片をすぐに簡易凍結し、-80℃で保存したか、または10%ホルマリン中で固定した。製造業者の指示書に従ってRNeasy Plus Universalミニキット(Qiagen、CA)を用いて、簡易凍結組織切片から全RNAを単離した。製造業者の指示書に従ってQIAampウイルスRNAミニキット(Qiagen、CA)を用いて、血清からウイルスRNAを単離した。cDNAを合成し、REを含有する領域を、製造業者の指示書に従ってTitan One-Tube RT-PCRシステム(Sigma Aldrich、St.Louis、MO)を用いて増幅した。アンプリコンを、ネステッドプライマーを用いて配列決定した。
Envigo (Huntingdon,Cambridgeshire,UK)からの4~5週齢のメスのCB17 ICR-SCIDマウスを照射し、24時間後、右脇腹に5e6個のMel624細胞を皮下的に埋め込んだ。腫瘍が0.5cm x 0.5cmの平均に達した時、腫瘍を、50μLの食塩水中の1~32μgのCVA21-ΔV (2x)RNAで腫瘍内的に処置した。手持ち式ノギスを使用して測定される腫瘍体積、体重、および全体的な健康を日常的にモニタリングした。RNA処置後、9日目に全てのマウスから血液を採取した。腫瘍サイズ、体重、血液、血清単離、組織採取、およびゲノム配列決定を全て、以前のin vivo実験について記載されたように測定、取得、プロセッシングおよび分析した。
4~5週齢のメスのCB17 ICR-SCIDマウスを照射し、24時間後、右脇腹に5e6個のMel624細胞および左脇腹に5e6個のMel624細胞を皮下的に埋め込む。腫瘍が0.5cm x 0.5cmの平均に達した時、マウスを処置する。それぞれのマウスの右脇腹腫瘍に、2、10、または30μgのCVA21-ΔV(2x) RNAの単回注射を与える。手持ち式ノギスを使用して測定される腫瘍体積、体重、および全体的な健康を日常的にモニタリングする。血液を、処置後、2、4、6、8または10日目に、1群あたり2匹のマウスから採取する。腫瘍サイズ、体重、血液、血清単離、組織採取、およびゲノム配列決定を、以前のin vivo実験について記載されたように測定、取得、プロセッシングおよび分析する。
感染性核酸製剤の例としては、限定されるものではないが、ピコルナウイルスゲノムをコードする感染性cDNAクローンまたはRNA転写物が挙げられる。感染性cDNAからウイルスRNAゲノムを合成するために用いられる技術は、5'および/または3'末端上のさらなるヌクレオチド(ウイルスゲノムの部分ではない)をもたらし得る。ポリオウイルスを含む、いくつかのプラス鎖およびマイナス鎖RNAウイルスは、効率的な複製のために正確な末端を必要とすることが示されている(Boyerら、Virology, 198:415-426 (1994); Herold and Andino, J. Virol., 74(14):6394-6400 (2000))。これらの残基を複製中に除去して、真正ウイルスゲノムを生成することができるが、その初期の存在は、治療用核酸の比感染性に対する有害な効果を有し得る。CVA21-ΔV(2x)感染性核酸療法を、真正ウイルスゲノムを迅速に生成するための機構を用いることによって改善することができる。1つのそのような機構は、5'および/または3'末端でリボザイム配列をコードすることである。リボザイムは、触媒特性を有するRNA分子(構造)である。ある特定のリボザイムは、非常に特異的な位置でcisまたはtransにRNA分子を切断することができる。CVA21-ΔV(2x)をコードする感染性核酸製剤中のウイルスゲノムの5'および/または3'末端でのリボザイムのコードは、治療効能をさらに改善することができる。
CVA21-ΔV(2x)感染性核酸療法を用いて、限定されるものではないが、メラノーマ、ミエローマ、前立腺がん、乳がん、肺がん(例えば、非小細胞肺がん)、および膵がんなどの様々ながん型を処置することができる。ウェルあたり1x104個のこれらのがん型の代表的な腫瘍細胞系を、96ウェル組織培養皿に播種した。細胞に、無血清培地中、37℃で2時間、CVA21またはCVA21-ΔV2を、0.001~1の増大するMOIで感染させた。感染後、培地および取り込まれなかったウイルスを除去し、100μLの完全増殖培地と交換し、細胞を37℃でインキュベートした。感染の72時間後、細胞を、3-(4,5-ジメチルチアゾリル-2)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)キット(ATCC、Manassas、VA)を用いて増殖についてアッセイした。試験した全ての細胞系は、CVA21に対してと同様、CV21-ΔV2に対して感受性であった(図6)。
がんを処置するために用いることができる核酸の感染性および安定性
ドメインY中への2x REの挿入はCVA21-3'miRTゲノムをコードする感染性RNAの比感染性を低下させ、治療効能を除去する
CVA21-3'miRTをコードする1μgのin vitro由来感染性RNAのトランスフェクション後の感染性ウイルスの回収は、非改変CVA21をコードするRNAと比較して、H1-HeLa細胞とMel624細胞の両方において大幅に遅延した(図2)。4~5週齢のメスのCB17 ICR-SCIDマウスを、Envigo (Huntingdon、Cambridgeshire、UK)から購入した。マウスを照射し、24時間後、右脇腹に5e6個のMel624細胞を皮下的に埋め込んだ。腫瘍が0.5cm x 0.5cmの平均に達した時、腫瘍を、50μLの食塩水中の非改変CVA21またはCVA21-3'miRTをコードする30μgのRNAで腫瘍内的に処置した。手持ち式ノギスを使用して測定される腫瘍体積、体重、および全体的な健康を日常的にモニタリングした。RNA処置後、7日目に全てのマウスから血液を採取した。イソフルランの吸入によってマウスを麻酔し、血清分離ゲルを含むBDマイクロテイナーチューブ中に、顎下腺静脈から血液を採取した。血液を、室温で30分間凝固させた後、4℃で5分間、8000rpmでの遠心分離によって血清を分離した。血清を-80℃で保存した。血清中のウイルスを、H1-HeLa細胞上でウイルス保存液について記載されたように滴定した。図4AおよびDに示されるように、CVA21-3'miRTをコードするRNAは、いかなる腫瘍溶解活性も示さず、ウイルス血症も誘導しなかった。RNA二次構造予測は、oriRのYドメインの破壊およびin vitro由来RNAの比感染性の低下および治療効能の欠如におそらく寄与するシュードノット形成の確率の低下を示す(図13)。
安楽死の時点で、ウイルスゲノムを、血清ならびにCVA21-ΔV(2x)で処置したマウスおよび毒性の臨床兆候を示すマウスの骨格筋から単離した。ウイルスまたは全RNAを、それぞれ、試料から単離し、cDNAを合成した。マイクロRNA応答エレメントを含有する領域を増幅し、アンプリコンを配列決定した。復帰変異体が、後肢麻痺を発症したCVA21-ΔV(1x)で処置した1匹のマウスの骨格筋において、および後肢麻痺を発症したCVA21-686(2x)で処置した3匹全部のマウスにおいて検出された。対照的に、復帰またはエスケープ変異体は、CVA21-ΔV(2x)で処置したマウスのいずれにおいても検出された。注目すべきことに、復帰変異体はまた、CVA21-TR(1x)で処置した両方の評価可能なマウスにおいても検出された。in vitroでのマイクロRNA応答エレメントの安定性を決定するための努力において、miR-133およびmiR-206を発現する分化したTE671(dTE-671)筋肉細胞中で、それぞれのマイクロRNA脱標的化CVA21の連続継代を行った。dTE671細胞を、最初に10のMOIで感染させた。感染後24時間で、試料を採取し、新鮮なdTE671細胞に50%の明澄化された溶解物を感染させた。ウイルスRNAを、7回の連続継代の明澄化された溶解物から単離し、cDNAを合成し、応答エレメントを含有する領域を配列決定のために増幅させた。両方の実験において、復帰変異体が、CVA21-ΔV(2x)およびCVA21-ΔV(1x)試料中での検出の前に2~3回継代したCVA21-686(2x)試料中で検出された。このデータは、マイクロRNA応答エレメントを直接挿入した走査領域の伸長が、遺伝的安定性を低下させることを示し、in vivoでより顕著な効果である。
3'NCRの複雑な構造環境とは対照的に、CVA21の5'NCRは、IRESのすぐ下流に不規則な走査領域を含有すると予測される。CVA21複製におけるこのドメインの役割は未知である。この領域はin vitroおよびin vivoでポリオウイルス複製にとって重要ではないことが示されているが、それは、エンテロウイルス71の翻訳を増強するIRES trans作用因子の結合において示されている。RNA二次構造分析は、CVA21-ΔV(2x)構成が、IRES内のドメインVIの維持をもたらし、したがって、リボソーム量および翻訳に有意に影響しないはずであると予測した(図13)。3'NCR内の任意の場所での挿入と同様、5'NCR内での挿入によって、シュードノット形成は影響されない。図13D~Fに示されるように、TR(2x)構築物はoriRループからマイクロRNA応答エレメントを分離するが(ドメインYおよびX)、ドメインYとドメインXとの予測されるシュードノット相互作用は、ループ間接続線によって描写されるように、依然として失われている。
CVA21-ΔV(2x)感染性核酸療法を、真正ウイルスゲノムを迅速に生成するための機構を用いることによって改善することができる。1つのそのような機構は、5'および3'末端でリボザイム配列をコードすることである。リボザイムは、触媒特性を有するRNA分子(構造)である。ある特定のリボザイムは、非常に特異的な位置でcisまたはtransにRNA分子を切断することができる。CVA21-ΔV(2x)をコードする感染性核酸製剤中のウイルスゲノムの5'および/または3'末端でのリボザイムのコードは、治療効能をさらに改善することができる。
マウスメラノーマB16-F10細胞は、ウイルス受容体を発現しないため、CVA21に対する感受性がない。hICAM-1を安定に発現するB16-F10細胞系を、レンチウイルス形質導入、抗生物質選択、単一細胞選別およびクローン集団の拡大によって生成した。1のMOIでのCVA21-ΔV(2x)による感染の24時間後のこの細胞系B16-F10-hICAM1からのウイルス回収は、親細胞系と比較して有意に増強された(図16)。また、この効果を、ウイルス進入のための受容体を発現しない他の細胞系に適用して、in vivoモデルのレパートリーを拡大することもできる。感染性核酸を用いて、ウイルス産生後の拡散の特異性を維持しながら、ウイルスの受容体を発現しない細胞を含むように腫瘍細胞の初期播種を拡大することができる。細胞型特異性を、異なるマイクロRNA標的配列の組込みによってさらにモジュレートすることができる。
前臨床試験は、in vitro RNA転写キットを用いて、RNA転写物を生成した。それぞれ10マイクロリットルの反応液は、約100マイクログラムのRNAをもたらし、これをin vivo試験において用いた。市販のキットを用いずに生産方法を拡大する実現可能性を証明するために、同様の反応を設定し、1mL(100倍)に拡大し、得られる転写物を、塩化リチウム沈降を用いて精製した。この拡大された反応は、RNAゲル電気泳動によって観察されたように、10マイクロリットルの反応液と同様の完全性で7ミリグラムを超えるRNAをもたらした(図17)。
様々な機構を用いて、血液中でのRNAの安定性および細胞内での内在化後の翻訳可能性を増強することができる。これらの技術としては、限定されるものではないが、処置される宿主内に通常存在するRNAに非常によく似ているRNAを生成するためのin vitroでの転写における修飾塩基(例えば、N-メチルシュードウリジン)の使用、キャッピング機構、および転写物のポリアデニル化が挙げられる。これらの機構ならびに核酸に基づく治療剤の安定性、送達、取込み、および発現を増強する他の機構は全て、感染性核酸療法に適用することができる。また、これらの機構を用いて、患者あたりベースで感染性核酸の免疫原性をモジュレートすることもできる。さらに、核酸と、限定されるものではないが、脂質ベース、ポリマーベース、ナノ粒子ベース、および他の生合成分子を含む様々な異なる担体分子とを複合体化することによって、感染性核酸の送達を増強することができる。
コストの低減および製造の単純化
製造プロセスはそれぞれの腫瘍溶解ウイルスについて変化するが、十分な力価の感染性粒子を含む大量のウイルスを生産および精製するのに必要な手順の一般的概略は類似している。GMPマスターセルバンクおよびマスターシードウイルスを生成し、適格化する。これらの細胞を播種し、十分な数の細胞が確立されるまで、最適化された培地製剤を用いて拡大する。これらの細胞は、さらなる拡大および感染のために大きなバイオリアクター中に播種されることが多い。ウイルスを収獲し、一般には、細胞破片の溶解および/または明澄化、次いで、残留核酸の酵素的消化および溶解物の精製を要する。下流の精製プロセスは、様々な限外濾過および透析濾過ステップならびにクロマトグラフィー(例えば、イオン交換およびゲル浸透)に基づく精製を含んでもよい。この後、別の濾過ステップを行った後、バイアルに注入し、保存する。RNAに基づく治療剤の生産はより少ないステップを必要とし、より低容量(すなわち、より小さいバイオリアクター)でより高収量を生産するためにスケーリングすることができる。感染性RNAの生産に関与するステップは、より少なく、より単純である。ウイルスゲノムをコードする線状化プラスミドDNAのマスターバンクを作製する。これをin vitroでの転写反応(一般的には、ストックあたり約1L)のために用いて、感染性RNAを生産する。DNase消化を用いて、残留プラスミドDNAを除去した後、感染性RNAを沈降またはカラム濾過によって精製する。HPLCまたはFPLC精製を用いて、さらなる夾雑物を除去して、純度を確保することができる。現在のmRNAに基づく治療剤とは対照的に、CVA21-ΔV(2x)転写物は、in vitro転写GMPプロトコールを使用する合成および精製のコスト/ステップを減少させるキャッピングまたはテーリングを必要としない。腫瘍溶解性CVA21ウイルスを、免疫療法と組み合わせて臨床的に使用することができる。
ウイルス単剤療法を増強する能力
感染性核酸としてのCVA21の製剤化は、その単剤療法としての効力を安全に増強する能力を有する。核酸は、反復投与中に中和抗体を回避する機構を提供するウイルス粒子よりも免疫原性が低い。感染性核酸送達は、反復注入の間に療法の腫瘍溶解期を強化する中和抗体の存在下であっても細胞に感染することができ、処置の全体的な効能を増強し得る。さらに、感染性核酸は、ウイルス受容体(例えば、ヒト細胞内接着分子I)を発現する腫瘍細胞に限定されない。腫瘍細胞の初期播種は、通常はウイルス感染に対して不応性の細胞を含み、腫瘍不均一性の障壁を克服するであろう。この戦略を、他の腫瘍溶解性ピコルナウイルスにも適用することができる。
安全性の改善は患者の適格性を拡大する
CVA21の許容性は、いくつかの進行悪性腫瘍を有する患者における第I相および第II相臨床試験において証明されている。しかしながら、現在までの試験は、機能的な免疫系を有する患者に限定されていた。ヒトにおいては稀であるが、CVA21は、特に脆弱である免疫不全宿主に関して筋炎を引き起こし得る。かくして、筋肉細胞中で複製することができないCVA21の開発は、免疫系の障害がある患者への臨床分析の拡大を可能にするであろう。CVA21-ΔV(2x)は、筋肉組織内で富化されたマイクロRNAによって認識される配列を含むマイクロRNA応答エレメントを有する。このエレメントは、同種マイクロRNAを発現する細胞中でのウイルス複製を減少させ、CVA21で処置された皮下腫瘍を担持する免疫不全マウスにおいて観察される毒性を改善する。CVA21-ΔV(2x)を含むマイクロRNA脱標的化ウイルスを用いて、免疫障害がある患者における腫瘍溶解療法の安全性を改善することができる。
本発明をその詳細な説明と共に説明してきたが、前記説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される、本発明の範囲を例示することを意図するものであり、それを制限することを意図するものではないことが理解されるべきである。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲内にある。
(付記)
(付記1)
20個以上の塩基の1つ以上の異種配列エレメントを含むピコルナウイルスゲノムを含む感染性核酸を含む核酸構築物であって、前記構築物の比感染性が、生きている哺乳動物に投与した場合に拡散性ピコルナウイルス感染を開始させるのに十分なものであり、前記構築物の前記比感染性が、前記1つ以上の異種配列エレメントを欠く同等の構築物の比感染性と類似する規模のものである、前記核酸構築物。
(付記2)
前記哺乳動物がヒトである、付記1に記載の構築物。
(付記3)
プラスミドDNAとして製剤化される、付記1または2に記載の構築物。
(付記4)
RNA分子として製剤化される、付記1~3のいずれか一項に記載の構築物。
(付記5)
前記1つ以上の異種配列エレメントのうちの少なくとも1つが、マイクロRNA応答エレメントである、付記1~4のいずれか一項に記載の構築物。
(付記6)
前記マイクロRNA応答エレメントのマイクロRNA標的エレメントが、非がん細胞中に存在するマイクロRNAと相補的な少なくともある領域を含む、付記5に記載の構築物。
(付記7)
前記1つ以上の異種配列エレメントのうちの少なくとも1つが、組織特異的マイクロRNA応答エレメントである、付記1~6のいずれか一項に記載の構築物。
(付記8)
前記1つ以上の異種配列エレメントのうちの少なくとも1つが、筋肉特異的、脳特異的、または心臓特異的マイクロRNA応答エレメントである、付記1~7のいずれか一項に記載の構築物。
(付記9)
前記1つ以上の異種配列エレメントのうちの少なくとも1つが、走査領域内のヌクレオチドの置換として前記ピコルナウイルスゲノムの5'非コード領域中に挿入される、付記1~8のいずれか一項に記載の構築物。
(付記10)
前記ピコルナウイルスゲノムが、I型内部リボソーム進入部位を含む、付記1~9のいずれか一項に記載の構築物。
(付記11)
前記ピコルナウイルスゲノムが、コクサッキーウイルス、ポリオウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、またはエンテロウイルスゲノムである、付記1~10のいずれか一項に記載の構築物。
(付記12)
前記ピコルナウイルスゲノムが、コクサッキーウイルスA21ゲノムである、付記1~11のいずれか一項に記載の構築物。
(付記13)
前記ピコルナウイルスゲノムが、miR-133のためのマイクロRNA標的エレメントを含む、付記1~12のいずれか一項に記載の構築物。
(付記14)
前記ピコルナウイルスゲノムが、miR-133のための1つより多いマイクロRNA標的エレメントを含む、付記1~13のいずれか一項に記載の構築物。
(付記15)
前記ピコルナウイルスゲノムが、miR-206のためのマイクロRNA標的エレメントを含む、付記1~14のいずれか一項に記載の構築物。
(付記16)
前記ピコルナウイルスゲノムが、miR-206のための1つより多いマイクロRNA標的エレメントを含む、付記1~15のいずれか一項に記載の構築物。
(付記17)
前記ピコルナウイルスゲノムが、miR-133のための1つより多いマイクロRNA標的エレメントおよびmiR-206のための1つより多いマイクロRNA標的エレメントを含む、付記1~16のいずれか一項に記載の構築物。
(付記18)
前記ピコルナウイルスゲノムが、コクサッキーウイルスA21ゲノムであり、且つ、前記ピコルナウイルスゲノムが、野生型コクサッキーウイルスA21ゲノムの631位から698位までの少なくとも20ヌクレオチドを欠く、付記1~17のいずれか一項に記載の構築物。
(付記19)
前記ピコルナウイルスゲノムが、コクサッキーウイルスA21ゲノムであり、且つ、前記ピコルナウイルスゲノムが、野生型コクサッキーウイルスA21ゲノムのヌクレオチド631~698を欠く、付記1~18のいずれか一項に記載の構築物。
(付記20)
前記核酸構築物がDNAであり、且つ、前記核酸構築物がリボザイムをコードする、付記1~19のいずれか一項に記載の構築物。
(付記21)
前記リボザイムが、前記核酸構築物から転写されるRNA分子から、RNAの5'部分を切断することによって、リボザイム切断RNAを作出するように設計される、付記20に記載の構築物。
(付記22)
前記リボザイム切断RNAが、ピコルナウイルスゲノム中には存在しないリボヌクレオチドを含まない5'末端を含む、付記20に記載の構築物。
(付記23)
前記核酸構築物がRNAであり、且つ、前記核酸構築物がリボザイムを含む、付記1~19のいずれか一項に記載の構築物。
(付記24)
前記リボザイムが、前記核酸構築物から、RNAの5'部分を切断することによって、リボザイム切断RNAを作出するように設計される、付記23に記載の構築物。
(付記25)
前記リボザイム切断RNAが、ピコルナウイルスゲノム中には存在しないリボヌクレオチドを含まない5'末端を含む、付記24に記載の構築物。
(付記26)
前記核酸構築物がDNAであり、且つ、前記核酸構築物が制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む、付記1~19のいずれか一項に記載の構築物。
(付記27)
前記制限エンドヌクレアーゼ切断部位が、前記核酸構築物の3'部分の、制限エンドヌクレアーゼを介する切断を可能にすることによって、制限エンドヌクレアーゼ切断核酸構築物を作出するように設計される、付記26に記載の構築物。
(付記28)
前記制限エンドヌクレアーゼ切断核酸構築物が、ピコルナウイルスゲノム中には存在しない10個未満のリボヌクレオチドを含む3'末端を含むウイルスをコードする、付記27に記載の構築物。
(付記29)
前記制限エンドヌクレアーゼ切断核酸構築物が、ピコルナウイルスゲノム中には存在しないリボヌクレオチドを含まない3'末端を含むウイルスをコードする、付記27に記載の構築物。
(付記30)
前記核酸構築物がDNAであり、前記核酸構築物がリボザイムをコードし、且つ、前記核酸構築物が制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む、付記1~19のいずれか一項に記載の構築物。
(付記31)
前記リボザイムが、前記核酸構築物から転写されるRNA分子から、RNAの5'部分を切断することによって、リボザイム切断RNAを作出するように設計される、付記30に記載の構築物。
(付記32)
前記リボザイム切断RNAが、ピコルナウイルスゲノム中には存在しないリボヌクレオチドを含まない5'末端を含む、付記30に記載の構築物。
(付記33)
前記制限エンドヌクレアーゼ切断部位が、前記核酸構築物の3'部分の、制限エンドヌクレアーゼを介する切断を可能にすることによって、制限エンドヌクレアーゼ切断核酸構築物を作出するように設計される、付記30に記載の構築物。
(付記34)
前記制限エンドヌクレアーゼ切断核酸構築物が、ピコルナウイルスゲノム中には存在しない10個未満のリボヌクレオチドを含む3'末端を含むウイルスをコードする、付記30に記載の構築物。
(付記35)
前記制限エンドヌクレアーゼ切断核酸構築物が、ピコルナウイルスゲノム中には存在しないリボヌクレオチドを含まない3'末端を含むウイルスをコードする、付記30に記載の構築物。
(付記36)
生きている哺乳動物内のがん細胞の数を減少させる方法であって、付記1~35のいずれか一項に記載の構築物を哺乳動物に投与することを含む、前記方法。
(付記37)
前記哺乳動物がヒトである、付記36に記載の方法。
(付記38)
前記がん細胞が、メラノーマ、膵がん、前立腺がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、ミエローマ、または乳がん細胞である、付記36または37に記載の方法。
(付記39)
前記投与ステップが、同等の構築物が同等の哺乳動物に投与された場合に溶解を受ける非がん性細胞の数と比較して、前記投与ステップ後に細胞溶解を受けている前記哺乳動物内に存在する非がん性細胞の数の減少をもたらす、付記36~38のいずれか一項に記載の方法。
(付記40)
前記投与ステップが、同等の構築物が同等の哺乳動物に投与された場合に溶解を受けるがん性細胞の数と比較して、前記投与ステップ後に細胞溶解を受けている前記生きている哺乳動物内に存在する、同様の数または増加した数のがん性細胞をもたらす、付記36~39のいずれか一項に記載の方法。
(付記41)
生きている哺乳動物内のがん細胞の数を減少させる方法であって、付記1~35のいずれか一項に記載の構築物を前記哺乳動物に投与することを含み、前記がん細胞が、前記構築物からの対応するピコルナウイルスの邪魔されない合成の結果として溶解を受けることによって、前記生きている哺乳動物内のがん細胞の数を減少させる、前記方法。
(付記42)
前記哺乳動物がヒトである、付記41に記載の方法。
(付記43)
前記がん細胞が、メラノーマ、ミエローマ、または乳がん細胞である、付記41または42に記載の方法。
(付記44)
前記投与ステップが、同等の構築物が同等の哺乳動物に投与された場合に溶解を受ける非がん性細胞の数と比較して、前記投与ステップ後に細胞溶解を受けている前記哺乳動物内に存在する非がん性細胞の数の減少をもたらす、付記41~43のいずれか一項に記載の方法。
(付記45)
前記投与ステップが、同等の構築物が同等の哺乳動物に投与された場合に溶解を受けるがん性細胞の数と比較して、前記投与ステップ後に細胞溶解を受けている前記生きている哺乳動物内に存在する、同様の数または増加した数のがん性細胞をもたらす、付記41~44のいずれか一項に記載の方法。
(付記46)
抗がん剤を前記哺乳動物に投与することをさらに含む、付記41~45のいずれか一項に記載の方法。
(付記47)
前記抗がん剤が、チェックポイント阻害剤である、付記46に記載の方法。
(付記48)
前記チェックポイント阻害剤が、CTLA-4阻害剤、PD-1阻害剤、およびPD-L1阻害剤からなる群から選択される、付記47に記載の方法。
(付記49)
コクサッキーウイルスをコードする単離された感染性核酸であって、野生型コクサッキーウイルスA21ゲノムの631位から698位までの少なくとも20ヌクレオチドを欠き、且つ、前記感染性核酸のVIドメインと真正翻訳開始部位との間に位置する筋肉特異的マイクロRNAのためのマイクロRNA標的エレメントを含む、前記感染性核酸。
(付記50)
631位から698位までの前記ヌクレオチドを欠く、付記49に記載の単離された感染性核酸。
(付記51)
前記筋肉特異的マイクロRNAが、miR-133またはmiR-206である、付記49または50に記載の単離された感染性核酸。
(付記52)
前記感染性核酸が、第1の位置と第2の位置の間に前記マイクロRNA標的エレメントを含み、前記第1の位置が前記野生型コクサッキーウイルスA21ゲノムの631位に対応し、且つ、前記第2の位置が前記野生型コクサッキーウイルスA21ゲノムの699位に対応する、付記49~51のいずれか一項に記載の単離された感染性核酸。
(付記53)
前記感染性核酸がDNAであり、且つ、前記感染性核酸がリボザイムをコードする、付記49~52のいずれか一項に記載の単離された感染性核酸。
(付記54)
前記リボザイムが、前記感染性核酸から転写されるRNA分子から、RNAの5'部分を切断することによって、リボザイム切断RNAを作出するように設計される、付記53に記載の単離された感染性核酸。
(付記55)
前記リボザイム切断RNAが、ピコルナウイルスゲノム中には存在しないリボヌクレオチドを含まない5'末端を含むコクサッキーウイルスをコードする、付記54に記載の単離された感染性核酸。
(付記56)
前記単離された感染性核酸がRNAであり、且つ、前記単離された感染性核酸がリボザイムを含む、付記49~52のいずれか一項に記載の単離された感染性核酸。
(付記57)
前記リボザイムが、前記感染性核酸からRNAの5'部分を切断することによって、リボザイム切断RNAを作出するように設計される、付記56に記載の単離された感染性核酸。
(付記58)
前記リボザイム切断RNAが、ピコルナウイルスゲノム中には存在しないリボヌクレオチドを含まない5'末端を含むコクサッキーウイルスをコードする、付記56に記載の単離された感染性核酸。
(付記59)
前記感染性核酸がDNAであり、且つ、前記感染性核酸が制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む、付記49~52のいずれか一項に記載の単離された感染性核酸。
(付記60)
前記制限エンドヌクレアーゼ切断部位が、前記感染性核酸の3'部分の、制限エンドヌクレアーゼを介する切断を可能にすることによって、制限エンドヌクレアーゼ切断感染性核酸を作出するように設計される、付記59に記載の単離された感染性核酸。
(付記61)
前記制限エンドヌクレアーゼ切断感染性核酸が、ピコルナウイルスゲノム中には存在しない10個未満のリボヌクレオチドを含む3'末端を含むコクサッキーウイルスをコードする、付記60に記載の単離された感染性核酸。
(付記62)
前記制限エンドヌクレアーゼ切断感染性核酸が、ピコルナウイルスゲノム中には存在しないリボヌクレオチドを含まない3'末端を含むコクサッキーウイルスをコードする、付記60に記載の単離された感染性核酸。
(付記63)
前記感染性核酸がRNAであり、前記感染性核酸がリボザイムをコードし、且つ、前記感染性核酸が制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む、付記49~52のいずれか一項に記載の単離された感染性核酸。
(付記64)
前記リボザイムが、前記感染性核酸から転写されるRNA分子から、RNAの5'部分を切断することによって、リボザイム切断RNAを作出するように設計される、付記63に記載の単離された感染性核酸。
(付記65)
前記リボザイム切断RNAが、ピコルナウイルスゲノム中には存在しないリボヌクレオチドを含まない5'末端を含む、付記63に記載の単離された感染性核酸。
(付記66)
前記制限エンドヌクレアーゼ切断部位が、前記感染性核酸からのRNAの3'部分の、制限エンドヌクレアーゼを介する切断を可能にすることによって、制限エンドヌクレアーゼ切断感染性核酸を作出するように設計される、付記63に記載の単離された感染性核酸。
(付記67)
前記制限エンドヌクレアーゼ切断感染性核酸が、ピコルナウイルスゲノム中には存在しない10個未満のリボヌクレオチドを含む3'末端を含むコクサッキーウイルスをコードする、付記66に記載の単離された感染性核酸。
(付記68)
前記制限エンドヌクレアーゼ切断感染性核酸が、ピコルナウイルスゲノム中には存在しないリボヌクレオチドを含まない3'末端を含むコクサッキーウイルスをコードする、付記66に記載の単離された感染性核酸。
(付記69)
哺乳動物中に存在するがんを処置するための方法であって、前記哺乳動物に、コクサッキーウイルスをコードする有効量の感染性核酸を投与することを含み、前記感染性核酸が、野生型コクサッキーウイルスA21ゲノムの631位から698位までの少なくとも20ヌクレオチドを欠き、且つ、前記感染性核酸が、前記感染性核酸のVIドメインと、真正翻訳開始部位との間に位置する筋肉特異的マイクロRNAのためのマイクロRNA標的エレメントを含む、前記方法。
(付記70)
前記哺乳動物がヒトである、付記69に記載の方法。
(付記71)
前記がんが、メラノーマ、ミエローマ、または乳がんである、付記69または70に記載の方法。
(付記72)
前記感染性核酸が、631位から698位までの前記ヌクレオチドを欠く、付記69~71のいずれか一項に記載の方法。
(付記73)
前記筋肉特異的マイクロRNAが、miR-133またはmiR-206である、付記69~72のいずれか一項に記載の方法。
(付記74)
前記感染性核酸が、第1の位置と第2の位置の間に前記マイクロRNA標的エレメントを含み、前記第1の位置が前記野生型コクサッキーウイルスA21ゲノムの631位に対応し、且つ、前記第2の位置が前記野生型コクサッキーウイルスA21ゲノムの699位に対応する、付記69~73のいずれか一項に記載の方法。
(付記75)
抗がん剤を前記哺乳動物に投与することをさらに含む、付記69~74のいずれか一項に記載の方法。
(付記76)
前記抗がん剤が、チェックポイント阻害剤である、付記75に記載の方法。
(付記77)
前記チェックポイント阻害剤が、CTLA-4阻害剤、PD-1阻害剤、およびPD-L1阻害剤からなる群から選択される、付記76に記載の方法。
(付記78)
20個以上の塩基の1つ以上の異種配列エレメントを含むピコルナウイルスゲノムを含む感染性RNAを作製するための方法であって、前記感染性RNAの比感染性が、生きている哺乳動物に投与された場合に拡散性ピコルナウイルス感染を開始させるのに十分なものであり、前記感染性RNAの前記比感染性が、前記1つ以上の異種配列エレメントを欠く同等の感染性RNAの比感染性と類似する規模のものであり、前記方法が、
(a)前記感染性RNAをコードするDNA構築物であって、前記DNA構築物がリボザイムをコードし、且つ、前記核酸構築物が制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む、前記DNA構築物を提供するステップ、および
(b)前記DNA構築物の少なくとも一部が除去される条件下で、前記DNA構築物と、制限エンドヌクレアーゼとを接触させることによって、制限エンドヌクレアーゼ切断DNA構築物を産生するステップを含み、
前記制限エンドヌクレアーゼ切断DNA構築物が、5'末端に位置する非ピコルナウイルスRNAを有する感染性RNAをコードし、且つ、前記リボザイムが、5'末端に位置する前記非ピコルナウイルスRNAを切断して、前記感染性RNAを生成する、前記方法。
(付記79)
前記制限エンドヌクレアーゼ切断DNA構築物によってコードされる前記感染性RNAが、ピコルナウイルスゲノム中には存在しない10個未満のリボヌクレオチドを含む3'末端を含む、付記78に記載の方法。
(付記80)
前記制限エンドヌクレアーゼ切断DNA構築物によってコードされる前記感染性RNAが、ピコルナウイルスゲノム中には存在しないリボヌクレオチドを含まない3'末端を含む、付記78に記載の方法。
(付記81)
前記感染性RNAが、ピコルナウイルスゲノム中には存在しないリボヌクレオチドを含まない5'末端を含む、付記78に記載の方法。
(付記82)
ウイルスをコードする感染性核酸によって感染させることができる免疫応答性モデルであって、ヒト細胞内接着分子1(ICAM-1)を発現するマウス細胞を含む、前記免疫応答性モデル。
(付記83)
前記マウス細胞が、マウスメラノーマB16-F10細胞である、付記82に記載の免疫応答性モデル。
Claims (83)
- 20個以上の塩基の1つ以上の異種配列エレメントを含むピコルナウイルスゲノムを含む感染性核酸を含む核酸構築物であって、前記ピコルナウイルスゲノムが、野生型コクサッキーウイルスA21ゲノムの631位から698位までの少なくとも20ヌクレオチドを欠いているコクサッキーウイルスA21ゲノムであり、前記構築物の比感染性が、生きている哺乳動物に投与した場合に拡散性ピコルナウイルス感染を開始させるのに十分なものであり、前記構築物の前記比感染性が、前記1つ以上の異種配列エレメントを欠く同等の構築物の比感染性と類似する規模のものである、前記核酸構築物。
- 前記哺乳動物がヒトである、請求項1に記載の構築物。
- プラスミドDNAとして製剤化される、請求項1または2に記載の構築物。
- RNA分子として製剤化される、請求項1~3のいずれか一項に記載の構築物。
- 前記1つ以上の異種配列エレメントのうちの少なくとも1つが、マイクロRNA応答エレメントである、請求項1~4のいずれか一項に記載の構築物。
- 前記マイクロRNA応答エレメントのマイクロRNA標的エレメントが、非がん細胞中に存在するマイクロRNAと相補的な少なくともある領域を含む、請求項5に記載の構築物。
- 前記1つ以上の異種配列エレメントのうちの少なくとも1つが、組織特異的マイクロRNA応答エレメントである、請求項1~6のいずれか一項に記載の構築物。
- 前記1つ以上の異種配列エレメントのうちの少なくとも1つが、筋肉特異的、脳特異的、または心臓特異的マイクロRNA応答エレメントである、請求項1~7のいずれか一項に記載の構築物。
- 前記1つ以上の異種配列エレメントのうちの少なくとも1つが、走査領域内のヌクレオチドの置換として前記ピコルナウイルスゲノムの5'非コード領域中に挿入される、請求項1~8のいずれか一項に記載の構築物。
- 前記ピコルナウイルスゲノムが、I型内部リボソーム進入部位を含む、請求項1~9のいずれか一項に記載の構築物。
- 前記ピコルナウイルスゲノムが、コクサッキーウイルス、ポリオウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、またはエンテロウイルスゲノムである、請求項1~10のいずれか一項に記載の構築物。
- 前記ピコルナウイルスゲノムが、コクサッキーウイルスA21ゲノムである、請求項1~11のいずれか一項に記載の構築物。
- 前記ピコルナウイルスゲノムが、miR-133のためのマイクロRNA標的エレメントを含む、請求項1~12のいずれか一項に記載の構築物。
- 前記ピコルナウイルスゲノムが、miR-133のための1つより多いマイクロRNA標的エレメントを含む、請求項1~13のいずれか一項に記載の構築物。
- 前記ピコルナウイルスゲノムが、miR-206のためのマイクロRNA標的エレメントを含む、請求項1~14のいずれか一項に記載の構築物。
- 前記ピコルナウイルスゲノムが、miR-206のための1つより多いマイクロRNA標的エレメントを含む、請求項1~15のいずれか一項に記載の構築物。
- 前記ピコルナウイルスゲノムが、miR-133のための1つより多いマイクロRNA標的エレメントおよびmiR-206のための1つより多いマイクロRNA標的エレメントを含む、請求項1~16のいずれか一項に記載の構築物。
- 前記ピコルナウイルスゲノムが、コクサッキーウイルスA21ゲノムであり、且つ、前記ピコルナウイルスゲノムが、野生型コクサッキーウイルスA21ゲノムの631位から698位までの少なくとも30ヌクレオチドを欠く、請求項1~17のいずれか一項に記載の構築物。
- 前記ピコルナウイルスゲノムが、コクサッキーウイルスA21ゲノムであり、且つ、前記ピコルナウイルスゲノムが、野生型コクサッキーウイルスA21ゲノムのヌクレオチド631~698を欠く、請求項1~18のいずれか一項に記載の構築物。
- 前記核酸構築物がDNAであり、且つ、前記核酸構築物がリボザイムをコードする、請求項1~19のいずれか一項に記載の構築物。
- 前記リボザイムが、前記核酸構築物から転写されるRNA分子から、RNAの5'部分を切断することによって、リボザイム切断RNAを作出するように設計される、請求項20に記載の構築物。
- 前記リボザイム切断RNAが、ピコルナウイルスゲノム中には存在しないリボヌクレオチドを含まない5'末端を含む、請求項21に記載の構築物。
- 前記核酸構築物がRNAであり、且つ、前記核酸構築物がリボザイムを含む、請求項1~19のいずれか一項に記載の構築物。
- 前記リボザイムが、前記核酸構築物から、RNAの5'部分を切断することによって、リボザイム切断RNAを作出するように設計される、請求項23に記載の構築物。
- 前記リボザイム切断RNAが、ピコルナウイルスゲノム中には存在しないリボヌクレオチドを含まない5'末端を含む、請求項24に記載の構築物。
- 前記核酸構築物がDNAであり、且つ、前記核酸構築物が制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む、請求項1~19のいずれか一項に記載の構築物。
- 前記制限エンドヌクレアーゼ切断部位が、前記核酸構築物の3'部分の、制限エンドヌクレアーゼを介する切断を可能にすることによって、制限エンドヌクレアーゼ切断核酸構築物を作出するように設計される、請求項26に記載の構築物。
- 前記制限エンドヌクレアーゼ切断核酸構築物が、ピコルナウイルスゲノム中には存在しない10個未満のリボヌクレオチドを含む3'末端を含むウイルスをコードする、請求項27に記載の構築物。
- 前記制限エンドヌクレアーゼ切断核酸構築物が、ピコルナウイルスゲノム中には存在しないリボヌクレオチドを含まない3'末端を含むウイルスをコードする、請求項27に記載の構築物。
- 前記核酸構築物がDNAであり、前記核酸構築物がリボザイムをコードし、且つ、前記核酸構築物が制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む、請求項1~19のいずれか一項に記載の構築物。
- 前記リボザイムが、前記核酸構築物から転写されるRNA分子から、RNAの5'部分を切断することによって、リボザイム切断RNAを作出するように設計される、請求項30に記載の構築物。
- 前記リボザイム切断RNAが、ピコルナウイルスゲノム中には存在しないリボヌクレオチドを含まない5'末端を含む、請求項31に記載の構築物。
- 前記制限エンドヌクレアーゼ切断部位が、前記核酸構築物の3'部分の、制限エンドヌクレアーゼを介する切断を可能にすることによって、制限エンドヌクレアーゼ切断核酸構築物を作出するように設計される、請求項30に記載の構築物。
- 前記制限エンドヌクレアーゼ切断核酸構築物が、ピコルナウイルスゲノム中には存在しない10個未満のリボヌクレオチドを含む3'末端を含むウイルスをコードする、請求項33に記載の構築物。
- 前記制限エンドヌクレアーゼ切断核酸構築物が、ピコルナウイルスゲノム中には存在しないリボヌクレオチドを含まない3'末端を含むウイルスをコードする、請求項33に記載の構築物。
- 生きている哺乳動物内のがん細胞の数を減少させるための製剤であって、請求項1~35のいずれか一項に記載の構築物を含む、前記製剤。
- 前記哺乳動物がヒトである、請求項36に記載の製剤。
- 前記がん細胞が、メラノーマ、膵がん、前立腺がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、ミエローマ、または乳がん細胞である、請求項36または37に記載の製剤。
- 前記製剤の投与ステップが、同等の構築物が同等の哺乳動物に投与された場合に溶解を受ける非がん性細胞の数と比較して、前記投与ステップ後に細胞溶解を受けている前記哺乳動物内に存在する非がん性細胞の数の減少をもたらす、請求項36~38のいずれか一項に記載の製剤。
- 前記製剤の投与ステップが、同等の構築物が同等の哺乳動物に投与された場合に溶解を受けるがん性細胞の数と比較して、前記投与ステップ後に細胞溶解を受けている前記生きている哺乳動物内に存在する、同様の数または増加した数のがん性細胞をもたらす、請求項36~39のいずれか一項に記載の製剤。
- 生きている哺乳動物内のがん細胞の数を減少させる製剤であって、請求項1~35のいずれか一項に記載の構築物を含み、前記がん細胞が、前記構築物からの対応するピコルナウイルスの邪魔されない合成の結果として溶解を受けることによって、前記生きている哺乳動物内のがん細胞の数を減少させる、前記製剤。
- 前記哺乳動物がヒトである、請求項41に記載の製剤。
- 前記がん細胞が、メラノーマ、ミエローマ、または乳がん細胞である、請求項41または42に記載の製剤。
- 前記製剤の投与ステップが、同等の構築物が同等の哺乳動物に投与された場合に溶解を受ける非がん性細胞の数と比較して、前記投与ステップ後に細胞溶解を受けている前記哺乳動物内に存在する非がん性細胞の数の減少をもたらす、請求項41~43のいずれか一項に記載の製剤。
- 前記製剤の投与ステップが、同等の構築物が同等の哺乳動物に投与された場合に溶解を受けるがん性細胞の数と比較して、前記投与ステップ後に細胞溶解を受けている前記生きている哺乳動物内に存在する、同様の数または増加した数のがん性細胞をもたらす、請求項41~44のいずれか一項に記載の製剤。
- 抗がん剤を前記哺乳動物に投与することをさらに含む、請求項41~45のいずれか一項に記載の製剤。
- 前記抗がん剤が、チェックポイント阻害剤である、請求項46に記載の製剤。
- 前記チェックポイント阻害剤が、CTLA-4阻害剤、PD-1阻害剤、およびPD-L1阻害剤からなる群から選択される、請求項47に記載の製剤。
- コクサッキーウイルスをコードする単離された感染性核酸であって、野生型コクサッキーウイルスA21ゲノムの631位から698位までの少なくとも20ヌクレオチドを欠き、且つ、前記感染性核酸のVIドメインと真正翻訳開始部位との間に位置する筋肉特異的マイクロRNAのためのマイクロRNA標的エレメントを含む、前記感染性核酸。
- 631位から698位までの前記ヌクレオチドを欠く、請求項49に記載の単離された感染性核酸。
- 前記筋肉特異的マイクロRNAが、miR-133またはmiR-206である、請求項49または50に記載の単離された感染性核酸。
- 前記感染性核酸が、第1の位置と第2の位置の間に前記マイクロRNA標的エレメントを含み、前記第1の位置が前記野生型コクサッキーウイルスA21ゲノムの631位に対応し、且つ、前記第2の位置が前記野生型コクサッキーウイルスA21ゲノムの699位に対応する、請求項49~51のいずれか一項に記載の単離された感染性核酸。
- 前記感染性核酸がDNAであり、且つ、前記感染性核酸がリボザイムをコードする、請求項49~52のいずれか一項に記載の単離された感染性核酸。
- 前記リボザイムが、前記感染性核酸から転写されるRNA分子から、RNAの5'部分を切断することによって、リボザイム切断RNAを作出するように設計される、請求項53に記載の単離された感染性核酸。
- 前記リボザイム切断RNAが、ピコルナウイルスゲノム中には存在しないリボヌクレオチドを含まない5'末端を含むコクサッキーウイルスをコードする、請求項54に記載の単離された感染性核酸。
- 前記単離された感染性核酸がRNAであり、且つ、前記単離された感染性核酸がリボザイムを含む、請求項49~52のいずれか一項に記載の単離された感染性核酸。
- 前記リボザイムが、前記感染性核酸からRNAの5'部分を切断することによって、リボザイム切断RNAを作出するように設計される、請求項56に記載の単離された感染性核酸。
- 前記リボザイム切断RNAが、ピコルナウイルスゲノム中には存在しないリボヌクレオチドを含まない5'末端を含むコクサッキーウイルスをコードする、請求項57に記載の単離された感染性核酸。
- 前記感染性核酸がDNAであり、且つ、前記感染性核酸が制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む、請求項49~52のいずれか一項に記載の単離された感染性核酸。
- 前記制限エンドヌクレアーゼ切断部位が、前記感染性核酸の3'部分の、制限エンドヌクレアーゼを介する切断を可能にすることによって、制限エンドヌクレアーゼ切断感染性核酸を作出するように設計される、請求項59に記載の単離された感染性核酸。
- 前記制限エンドヌクレアーゼ切断感染性核酸が、ピコルナウイルスゲノム中には存在しない10個未満のリボヌクレオチドを含む3'末端を含むコクサッキーウイルスをコードする、請求項60に記載の単離された感染性核酸。
- 前記制限エンドヌクレアーゼ切断感染性核酸が、ピコルナウイルスゲノム中には存在しないリボヌクレオチドを含まない3'末端を含むコクサッキーウイルスをコードする、請求項60に記載の単離された感染性核酸。
- 前記感染性核酸がRNAであり、前記感染性核酸がリボザイムをコードし、且つ、前記感染性核酸が制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む、請求項49~52のいずれか一項に記載の単離された感染性核酸。
- 前記リボザイムが、前記感染性核酸から転写されるRNA分子から、RNAの5'部分を切断することによって、リボザイム切断RNAを作出するように設計される、請求項63に記載の単離された感染性核酸。
- 前記リボザイム切断RNAが、ピコルナウイルスゲノム中には存在しないリボヌクレオチドを含まない5'末端を含む、請求項64に記載の単離された感染性核酸。
- 前記制限エンドヌクレアーゼ切断部位が、前記感染性核酸からのRNAの3'部分の、制限エンドヌクレアーゼを介する切断を可能にすることによって、制限エンドヌクレアーゼ切断感染性核酸を作出するように設計される、請求項63に記載の単離された感染性核酸。
- 前記制限エンドヌクレアーゼ切断感染性核酸が、ピコルナウイルスゲノム中には存在しない10個未満のリボヌクレオチドを含む3'末端を含むコクサッキーウイルスをコードする、請求項66に記載の単離された感染性核酸。
- 前記制限エンドヌクレアーゼ切断感染性核酸が、ピコルナウイルスゲノム中には存在しないリボヌクレオチドを含まない3'末端を含むコクサッキーウイルスをコードする、請求項66に記載の単離された感染性核酸。
- 哺乳動物中に存在するがんを処置するための製剤であって、コクサッキーウイルスをコードする有効量の感染性核酸を含み、前記感染性核酸が、野生型コクサッキーウイルスA21ゲノムの631位から698位までの少なくとも20ヌクレオチドを欠き、且つ、前記感染性核酸が、前記感染性核酸のVIドメインと、真正翻訳開始部位との間に位置する筋肉特異的マイクロRNAのためのマイクロRNA標的エレメントを含む、前記製剤。
- 前記哺乳動物がヒトである、請求項69に記載の製剤。
- 前記がんが、メラノーマ、ミエローマ、または乳がんである、請求項69または70に記載の製剤。
- 前記感染性核酸が、631位から698位までの前記ヌクレオチドを欠く、請求項69~71のいずれか一項に記載の製剤。
- 前記筋肉特異的マイクロRNAが、miR-133またはmiR-206である、請求項69~72のいずれか一項に記載の製剤。
- 前記感染性核酸が、第1の位置と第2の位置の間に前記マイクロRNA標的エレメントを含み、前記第1の位置が前記野生型コクサッキーウイルスA21ゲノムの631位に対応し、且つ、前記第2の位置が前記野生型コクサッキーウイルスA21ゲノムの699位に対応する、請求項69~73のいずれか一項に記載の製剤。
- 抗がん剤を前記哺乳動物に投与することをさらに含む、請求項69~74のいずれか一項に記載の製剤。
- 前記抗がん剤が、チェックポイント阻害剤である、請求項75に記載の製剤。
- 前記チェックポイント阻害剤が、CTLA-4阻害剤、PD-1阻害剤、およびPD-L1阻害剤からなる群から選択される、請求項76に記載の製剤。
- 20個以上の塩基の1つ以上の異種配列エレメントを含むピコルナウイルスゲノムを含む感染性RNAを作製するための方法であって、前記ピコルナウイルスゲノムが、野生型コクサッキーウイルスA21ゲノムの631位から698位までの少なくとも20ヌクレオチドを欠いているコクサッキーウイルスA21ゲノムであり、前記感染性RNAの比感染性が、生きている哺乳動物に投与された場合に拡散性ピコルナウイルス感染を開始させるのに十分なものであり、前記感染性RNAの前記比感染性が、前記1つ以上の異種配列エレメントを欠く同等の感染性RNAの比感染性と類似する規模のものであり、前記方法が、
(a)前記感染性RNAをコードするDNA構築物であって、前記DNA構築物がリボザイムをコードし、且つ、前記DNA構築物が制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む、前記DNA構築物を提供するステップ、および
(b)前記DNA構築物の少なくとも一部が除去される条件下で、前記DNA構築物と、制限エンドヌクレアーゼとを接触させることによって、制限エンドヌクレアーゼ切断DNA構築物を産生するステップを含み、
前記制限エンドヌクレアーゼ切断DNA構築物が、5'末端に位置する非ピコルナウイルスRNAを有する感染性RNAをコードし、且つ、前記リボザイムが、5'末端に位置する前記非ピコルナウイルスRNAを切断して、前記感染性RNAを生成する、前記方法(ただし、医療行為を除く)。 - 前記制限エンドヌクレアーゼ切断DNA構築物によってコードされる前記感染性RNAが、ピコルナウイルスゲノム中には存在しない10個未満のリボヌクレオチドを含む3'末端を含む、請求項78に記載の方法。
- 前記制限エンドヌクレアーゼ切断DNA構築物によってコードされる前記感染性RNAが、ピコルナウイルスゲノム中には存在しないリボヌクレオチドを含まない3'末端を含む、請求項78に記載の方法。
- 前記感染性RNAが、ピコルナウイルスゲノム中には存在しないリボヌクレオチドを含まない5'末端を含む、請求項78に記載の方法。
- 請求項1~35のいずれか一項に記載の核酸構築物、請求項36~48のいずれか一項に記載の製剤、請求項49~68のいずれか一項に記載の単離された感染性核酸、又は請求項69~77のいずれか一項に記載の製剤によって感染させられた免疫応答性モデルであって、ヒト細胞内接着分子1(ICAM-1)を発現するマウス細胞を含む、前記免疫応答性モデル。
- 前記マウス細胞が、マウスメラノーマB16-F10細胞である、請求項82に記載の免疫応答性モデル。
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