CN111867609A - 用感染性核酸治疗癌症 - Google Patents

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Abstract

本文提供用编码病毒的感染性核酸减少哺乳动物内活的癌细胞数量的相关方法和材料。例如，提供用感染性核酸治疗癌症的方法，工程病毒核酸以及制造工程病毒核酸的方法。

Description

用感染性核酸治疗癌症
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年3月12日提交的美国专利申请第62/641,814号的权益。该在先申请的公开内容视为本申请公开的一部分(且通过引用纳入本文)。
背景
1.技术领域
本文涉及用核酸(例如编码小核糖核酸病毒的感染性核酸)治疗癌症的相关方法和材料。
2.背景信息
肠病毒属是小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)的成员，包括四种人肠病毒(HEV-A至-D)。肠病毒是无被膜的小病毒，具有正义单链RNA基因组，长度约7500个核苷酸。细胞内化后，病毒体去包被，基因组RNA立即翻译成单个大型多蛋白，该多蛋白被病毒编码的蛋白酶(3C)加工得到衣壳蛋白和参与病毒复制的非结构蛋白。由病毒编码的RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp-3D)从正义病毒RNA合成反义链RNA。负链RNA作为模板用于合成更多可翻译、复制或包装的正义RNA分子。病毒后代在细胞质中积累，直到病毒诱导的细胞裂解将后代释放到环境中。
柯萨基病毒A21(CVA21)是一种天然HEV-C小核糖核酸病毒，已知会引起人上呼吸道感染或在更严重的情况下会引起人肌炎。婴儿和免疫低下的人更有可能发生更严重的并发症。细胞内粘附分子1(ICAM-1)是病毒的主要受体，CVA21对多种表达ICAM-1的癌细胞显示出强溶瘤活性。然而，携带人黑素瘤和骨髓瘤异种移植物的免疫低下小鼠在用配制为病毒颗粒或感染性核酸的CVA21治疗后很快发生致死性肌炎发作(表现为松弛性肢体麻痹)。
发明内容
本文提供用编码病毒的感染性核酸减少哺乳动物内活的癌细胞数量的相关方法和材料。例如，本发明提供用感染性核酸治疗癌症的方法，工程病毒核酸以及工程病毒核酸的制备方法。
可用微小RNA(microRNA)靶向策略来调控正义RNA病毒的向性。这一技术利用在不希望病毒复制的宿主细胞中表达的组织特异性微小RNA(miRNA)(Kelly等，Nat.Med.,14:1278-1283(2008)；Barnes等，Cell Host Microbe,4:239-248(2008)；和Ruiz等，J.Virol.,90:4078-4092(2016))。可将miRNA靶序列插入病毒基因组，使基因组和mRNA被宿主miRNA识别，随后降解或翻译抑制，从而阻止病毒复制和毒性。癌细胞通常miRNA水平失调，允许病毒自由复制继而破坏肿瘤细胞。
RNA分子(包括病毒基因组)的形状经专门设计来调节稳定性、分子内和分子间的相互作用以及活性。所以，有理由推测，在病毒基因组内任何地方插入其他核苷酸(例如miRNA靶标)可能严重妨害病毒的多种生物学特性。例如，据其他文献记载(Kelly等，Nat.Med.,14:1278-1283(2008))，可将微小RNA靶序列插入病毒基因组的3'UTR中，获救病毒的复制动力学与无修饰病毒相近，保留了对人异种移植物的体内溶瘤活性并降低了在正常组织中的毒性。但是，编码该修饰病毒基因组的RNA转录本转染后该病毒的拯救大大延迟。
此外，野生型病毒可表现出显著的毒性。例如，据其他文献记载(Hadac等，Molecular Therapy,19(6):1041-1047(2011))，给人黑素瘤或骨髓瘤异种移植小鼠注射编码野生型病毒基因组的RNA转录本引发弥漫性病毒感染，导致肿瘤消退和致死毒性。相比之下，注射编码Kelly等的miRNA-靶向病毒基因组的RNA转录本不造成弥漫性感染，因此不是具有治疗价值的感染性核酸。
如本文所述，用柯萨基病毒A21骨架将微小RNA-靶向溶瘤病毒配制成感染性核酸。设计了各种不同的插入机制，并构建了病毒基因组。此外，评价了RNA转录本的病毒拯救动力学、获救病毒的复制动力学、微小RNA靶标稳定性、溶瘤活性和毒性；每一项均与无修饰基因组和Kelly等的miRNA-靶向基因组进行比较。测试的每一构建体的病毒拯救动力学表现都强于Kelly等的构建体，并保留了溶瘤活性。此外，测试构建体之一(本文称之为CVA21-ΔV2x)毒性降低且使总存活期显著延长。
CVA21-ΔV2x构建体是配制成感染性核酸的微小RNA-靶向病毒基因组的一个例子，表现出经实验验证的可接受的治疗指数。本文提供的构建体可用于抗癌治疗，安全性提高的疫苗接种或各种生产者和靶细胞中的病毒生长隔离，促进生产和发病机理中病毒生命周期以及不同细胞作用的实验评估。此外，本文提供的微小RNA-靶向技术可与其他编码I型IRES的小核糖核酸病毒联用。
总体上说，本文一个方面内容的是一种核酸构建体，其包含感染性核酸(或基本上由其组成或由其组成)，该感染性核酸包含小核糖核酸病毒基因组(或基本上由其组成或由其组成)，该小核糖核酸病毒基因组包含一个或多个20或更多个碱基的异源序列元件(或基本上由其组成或由其组成)，其中，所述构建体的特异性感染力足以在给药到活体哺乳动物时引发弥漫性小核糖核酸病毒感染，其中，所述构建体的特异性感染力与缺少所述一个或多个异源序列元件的可比构建体量级相似。哺乳动物可以是人。所述构建体可以配制成质粒DNA。所述构建体可以配制成RNA分子。所述一个或多个异源序列元件中至少一个可以是微小RNA反应元件。微小RNA反应元件的微小RNA靶元件可以至少包含与非癌细胞中的微小RNA互补的区域(或可基本上由其组成或可由其组成)。所述一个或多个异源序列元件中至少一个可以是组织特异性微小RNA反应元件。所述一个或多个异源序列元件中至少一个可以是肌肉特异性、脑特异性或心脏特异性微小RNA反应元件。所述一个或多个异源序列元件中至少一个可插入所述小核糖核酸病毒基因组的5’非编码区取代扫描区内的核苷酸。所述小核糖核酸病毒基因组可包含I型内部核糖体进入位点。所述小核糖核酸病毒基因组可以是柯萨基病毒、脊髓灰质炎病毒、艾柯病毒、鼻病毒或肠病毒基因组。小核糖核酸病毒基因组可以是柯萨基病毒A21基因组。小核糖核酸病毒基因组可包含针对miR-133的微小RNA靶元件。小核糖核酸病毒基因组可包含超过一个针对miR-133的微小RNA靶元件。小核糖核酸病毒基因组可包含针对miR-206的微小RNA靶元件。小核糖核酸病毒基因组可包含超过一个针对miR-206的微小RNA靶元件。小核糖核酸病毒基因组可包含超过一个针对miR-133的微小RNA靶元件和超过一个针对miR-206的微小RNA靶元件。小核糖核酸病毒基因组可以是柯萨基病毒A21基因组，所述小核糖核酸病毒基因组可缺少野生型柯萨基病毒A21基因组第631位至第698位至少20个核苷酸。小核糖核酸病毒基因组可以是柯萨基病毒A21基因组，所述小核糖核酸病毒基因组可缺少野生型柯萨基病毒A21基因组的第631位至第698位核苷酸。一些情形中，核酸构建体可以是DNA，且所述核酸构建体可编码核酶。所述核酶可设计成切割由所述核酸构建体转录所得RNA分子的RNA 5’部分，由此形成经核酶切割的RNA。经核酶切割的RNA的5’端可以没有小核糖核酸病毒基因组中不存在的核糖核苷酸。一些情形中，核酸构建体可以是RNA，且所述核酸构建体可包括核酶。所述核酶可设计成切割所述核酸构建体的RNA 5’部分，由此形成经核酶切割的RNA。经核酶切割的RNA的5’端可以没有小核糖核酸病毒基因组中不存在的核糖核苷酸。一些情形中，核酸构建体可以是DNA，且所述核酸构建体可包括限制性核酸内切酶切割位点。所述限制性内切酶切割位点可设计成允许由限制性核酸内切酶切割所述核酸构建体的3’部分，由此形成经限制性核酸内切酶切割的核酸构建体。所述经限制性核酸内切酶切割的核酸构建体可编码3’端少于10个小核糖核酸病毒基因组中不存在的核糖核苷酸的病毒(例如3’端没有小核糖核酸病毒基因组中不存在的核糖核苷酸的小核糖核酸病毒基因组)。一些情形中，核酸构建体可以是DNA，所述核酸构建体可编码核酶，且所述核酸构建体可包括限制性核酸内切酶切割位点。所述核酶可设计成切割由所述核酸构建体转录所得RNA分子的RNA5’部分，由此形成经核酶切割的RNA。经核酶切割的RNA的5’端可以没有小核糖核酸病毒基因组中不存在的核糖核苷酸。限制性内切酶切割位点可设计成允许由限制性核酸内切酶切割核酸构建体的3’部分，由此形成经限制性核酸内切酶切割的核酸构建体。经限制性核酸内切酶切割的核酸构建体可编码3’端少于10个小核糖核酸病毒基因组中不存在的核糖核苷酸的病毒(例如3’端没有小核糖核酸病毒基因组中不存在的核糖核苷酸的病毒)。
另一方面，本文记载了降低活体哺乳动物中癌细胞数量的方法。所述方法包括向所述哺乳动物给以构建体(或基本由此组成或由此组成)。哺乳动物可以是人。所述构建体可以配制成质粒DNA。所述构建体可以配制成RNA分子。所述一个或多个异源序列元件中至少一个可以是微小RNA反应元件。微小RNA反应元件的微小RNA靶元件可以至少包含与非癌细胞中的微小RNA互补的区域(或可基本上由其组成或可由其组成)。所述一个或多个异源序列元件中至少一个可以是组织特异性微小RNA反应元件。所述一个或多个异源序列元件中至少一个可以是肌肉特异性、脑特异性或心脏特异性微小RNA反应元件。所述一个或多个异源序列元件中至少一个可插入所述小核糖核酸病毒基因组的5’非编码区取代扫描区内的核苷酸。所述小核糖核酸病毒基因组可包含I型内部核糖体进入位点。所述小核糖核酸病毒基因组可以是柯萨基病毒、脊髓灰质炎病毒、艾柯病毒、鼻病毒或肠病毒基因组。小核糖核酸病毒基因组可以是柯萨基病毒A21基因组。小核糖核酸病毒基因组可包含针对miR-133的微小RNA靶元件。小核糖核酸病毒基因组可包含超过一个针对miR-133的微小RNA靶元件。小核糖核酸病毒基因组可包含针对miR-206的微小RNA靶元件。小核糖核酸病毒基因组可包含超过一个针对miR-206的微小RNA靶元件。小核糖核酸病毒基因组可包含超过一个针对miR-133的微小RNA靶元件和超过一个针对miR-206的微小RNA靶元件。小核糖核酸病毒基因组可以是柯萨基病毒A21基因组，所述小核糖核酸病毒基因组可缺少野生型柯萨基病毒A21基因组第631位至第698位至少20个核苷酸。小核糖核酸病毒基因组可以是柯萨基病毒A21基因组，所述小核糖核酸病毒基因组可缺少野生型柯萨基病毒A21基因组的第631位至第698位核苷酸。癌细胞可以是黑素瘤、骨髓瘤、胰腺癌、前列腺癌，膀胱癌，非小细胞肺癌或乳腺癌细胞。相比将所述可比构建体给药到可比哺乳动物时发生裂解的非癌细胞数量，所述给药步骤使得所述给药步骤后所述哺乳动物内发生细胞裂解的非癌细胞数量降低。相比将所述可比构建体给药到可比哺乳动物时发生裂解的癌细胞数量，所述给药步骤使得所述给药步骤后所述活体哺乳动物内发生细胞裂解的癌细胞数量与之相近或升高。
另一方面，本文记载了降低活体哺乳动物中癌细胞数量的方法。所述方法包括向所述哺乳动物给以构建体，其中，癌细胞由于来自所述构建体的相应小核糖核酸病毒不受阻碍的合成而发生裂解，由此减少了所述活哺乳动物中的癌细胞数量。哺乳动物可以是人。所述构建体可以配制成质粒DNA。所述构建体可以配制成RNA分子。所述一个或多个异源序列元件中至少一个是微小RNA反应元件。微小RNA反应元件的微小RNA靶元件可以至少包含与非癌细胞中微小RNA互补的区域(或可基本上由其组成或可由其组成)。所述一个或多个异源序列元件中至少一个是组织特异性微小RNA反应元件。所述一个或多个异源序列元件中至少一个可以是肌肉特异性、脑特异性或心脏特异性微小RNA反应元件。所述一个或多个异源序列元件中至少一个可插入所述小核糖核酸病毒基因组的5’非编码区取代扫描区内的核苷酸。所述小核糖核酸病毒基因组可包含I型内部核糖体进入位点。所述小核糖核酸病毒基因组可以是柯萨基病毒A21、脊髓灰质炎病毒、艾柯病毒、鼻病毒或肠病毒基因组。小核糖核酸病毒基因组可以是柯萨基病毒A21基因组。小核糖核酸病毒基因组可包含针对miR-133的微小RNA靶元件。小核糖核酸病毒基因组可包含超过一个针对miR-133的微小RNA靶元件。小核糖核酸病毒基因组可包含针对miR-206的微小RNA靶元件。小核糖核酸病毒基因组可包含超过一个针对miR-206的微小RNA靶元件。小核糖核酸病毒基因组可包含超过一个针对miR-133的微小RNA靶元件和超过一个针对miR-206的微小RNA靶元件。小核糖核酸病毒基因组可以是柯萨基病毒A21基因组，所述小核糖核酸病毒基因组可缺少野生型柯萨基病毒A21基因组第631位至第698位至少20个核苷酸。小核糖核酸病毒基因组可以是柯萨基病毒A21基因组，所述小核糖核酸病毒基因组可缺少野生型柯萨基病毒A21基因组的第631位至第698位核苷酸。癌细胞可以是黑素瘤、骨髓瘤或乳腺癌细胞。相比将所述可比构建体给药到可比哺乳动物时发生裂解的非癌细胞数量，所述给药步骤使得所述给药步骤后所述哺乳动物内发生细胞裂解的非癌细胞数量降低。相比将所述可比构建体给药到可比哺乳动物时发生裂解的癌细胞数量，所述给药步骤使得所述给药步骤后所述活体哺乳动物内发生细胞裂解的癌细胞数量与之相近或升高。
另一方面，本文记载了一种分离的编码柯萨基病毒的感染性核酸，其中，所述感染性核酸缺少野生型柯萨基病毒A21基因组(例如Kuykendall CVA21毒株)从第631位至698位至少20个核苷酸，并且，所述感染性核酸包含位于所述感染性核酸的VI结构域和本真翻译起始位点之间的针对肌肉特异性微小RNA的微小RNA靶元件。感染性核酸可缺少第631位至第698位核苷酸。肌肉特异性微小RNA可以是miR-133或miR-206。感染性核酸可包含位于第一位置和第二位置之间的微小RNA靶元件，其中，所述第一位置对应于所述野生型柯萨基病毒A21基因组的第631位，所述第二位置对应于所述野生型柯萨基病毒A21基因组的第699位。一些情形中，感染性核酸可以是DNA，且所述感染性核酸可包括限制性核酸内切酶切割位点。限制性内切酶切割位点可设计成允许由限制性核酸内切酶切割感染性核酸的3’部分，由此形成经限制性核酸内切酶切割的感染性核酸。经限制性核酸内切酶切割的感染性核酸可编码3’端少于10个小核糖核酸病毒基因组中不存在的核糖核苷酸的柯萨基病毒(例如3’端没有小核糖核酸病毒基因组中不存在的核糖核苷酸的柯萨基病毒)。一些情形中，感染性核酸可以是RNA，所述感染性核酸可编码核酶，且所述感染性核酸可包括限制性核酸内切酶切割位点。所述核酶可设计成切割由所述感染性核酸转录所得RNA分子的RNA 5’部分，由此形成经核酶切割的RNA。经核酶切割的RNA的5’端可以没有小核糖核酸病毒基因组中不存在的核糖核苷酸。限制性内切酶切割位点可设计成允许由限制性核酸内切酶切割感染性核酸的RNA 3’部分，由此形成经限制性核酸内切酶切割的感染性核酸。经限制性核酸内切酶切割的感染性核酸可编码3’端少于10个小核糖核酸病毒基因组中不存在的核糖核苷酸的柯萨基病毒(例如3’端没有小核糖核酸病毒基因组中不存在的核糖核苷酸的柯萨基病毒)。
在另一个方面，本文记载了一种治疗哺乳动物中癌症的方法。所述方法包括向所述哺乳动物给以有效量的编码柯萨基病毒的感染性核酸(或基本上由此组成或由此组成)，其中，所述感染性核酸缺少野生型柯萨基病毒A21基因组从第631位至698位至少20个核苷酸，并且，所述感染性核酸包含位于所述感染性核酸的VI结构域和本真翻译起始位点之间的针对肌肉特异性微小RNA的微小RNA靶元件。哺乳动物可以是人。癌症可以是黑色素瘤、骨髓瘤、胰腺癌、前列腺癌，膀胱癌，非小细胞肺癌或乳腺癌。感染性核酸可缺少第631位至第698位核苷酸。肌肉特异性微小RNA可以是miR-133或miR-206。感染性核酸可包含位于第一位置和第二位置之间的微小RNA靶元件，其中，所述第一位置对应于所述野生型柯萨基病毒A21基因组的第631位，所述第二位置对应于所述野生型柯萨基病毒A21基因组的第699位。
另一方面，本文记载了一种制造感染性RNA的方法，所述感染性RNA包含小核糖核酸病毒基因组，所述小核糖核酸病毒基因组包含一个或多个20个或更多个碱基的异源序列元件，所述感染性RNA的特异性感染力足以在给药到活体哺乳动物时引发弥漫性小核糖核酸病毒感染，所述感染性RNA的特异性感染力与缺少所述一个或多个异源序列元件的可比感染性RNA的特异性感染力量级相似。所述方法包括以下所述内容(或基本有以下所述内容组成或有以下所述内容组成)：提供编码感染性RNA的DNA构建体，所述DNA构建体编码核酶，且所述核酸构建体包含限制性核酸内切酶切割位点；和在一定条件下使所述DNA构建体与限制性核酸内切酶接触，所述条件下至少部分所述DNA构建体被去除，由此产生经限制性核酸内切酶切割的DNA构建体；所述经限制性核酸内切酶切割的DNA构建体编码5’端具有非小核糖核酸病毒RNA的感染性RNA，并且，所述核酶切割所述5’端的非小核糖核酸病毒RNA从而形成所述感染性RNA。所述经限制性核酸内切酶切割的DNA构建体编码的感染性RNA其3’端可少于10个小核糖核酸病毒基因组中不存在的核糖核苷酸。所述经限制性核酸内切酶切割的DNA构建体编码的感染性RNA其3’端可没有小核糖核酸病毒基因组中不存在的核糖核苷酸。感染性RNA的5’端可以没有小核糖核酸病毒基因组中不存在的核糖核苷酸。
另一方面，本文记载了免疫健全模型，它能够被编码病毒的感染性核酸感染，其中，所述免疫健全模型包含表达人细胞内粘附分子1(ICAM-1)的小鼠细胞。所述小鼠细胞可以是鼠黑素瘤B16-F10细胞。
术语“特异性感染力”在本文中指感染性病毒与总核酸分子之间的比率(即指定拷贝数的病毒基因组产生的噬斑形成单位数)。
术语“扫描区”在本文中指内部核糖体进入位点中的沉默或隐匿AUG位点与本真AUG之间的区间。核糖体在翻译起始之前扫描该区域。在小核糖核酸病毒中，该区间通常为35-160个核苷酸。
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语的意义与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同。虽然可用与本文所述类似或等同的方法和材料来实施本发明，但在下文描述合适的方法和材料。本文中述及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都通过引用全文纳入本文。若有抵触，以本说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实施例都仅是说明性的，并不意在构成限制。
附图和以下说明进一步详细说明了本发明的一种或多种实施方式。从本文说明、附图以及权利要求书还可清楚地看出本发明的其他特征、目的和优势。
附图说明
图1：微小RNA反应元件(RE)潜在UTR内插入位点的示意图。(A)肌肉靶向反应元件的序列。上方＝SEQ ID NO:1；下方＝SEQ ID NO:2。1X构建体各含一拷贝与miR-133(下划线)和miR-206(斜体)互补的靶序列，2X构建体各含两拷贝所述靶序列。(B)具有在研RE插入位点的CVA21基因组图。标出了5’UTR的结构域I至VI和反应元件插入位点。结构域VI内的隐匿AUG以双线表示。(C)左：Kelly等构建的CVA21WT 3’UTR的RNA二级结构模型和RE位置(SEQID NO:3)。右：CVA21-3’TR构建体的二级结构模型(SEQ ID NO:4)。参与形成“轻触域(kissing domain)”的残基以连线表示。标出了重复形成TR的残基。(D)全部在研微小RNA-靶向CVA21构建体的命名。
图2：miRT-CVA21感染性RNA转染产生病毒后代的速度接近野生型CVA21 RNA。(A)上方组：以2.5μg编码CVA21或miRT-CVA21的感染性RNA转染后72小时的H1-HeLa细胞。下方组：以采自转染细胞的澄清裂解液感染24小时后的H1-HeLa细胞。(B-C)以1μg编码CVA21或miRT-CVA21的感染性RNA转染的H1-HeLa细胞(B)和Mel624细胞(C)中感染性病毒产生的时间进程。所有实验都至少重复三次。数据表示为平均病毒滴度+/-标准差。
图3：RE定位在5’UTR增强病毒向性调控。(A)无修饰和新miRT-CVA21的一步生长曲线。(B)上方：经100nM miRNA模拟物预处理的H1-HeLa细胞以未修饰或新miRT-CVA21(在x轴上标出)按MOI为1感染后24小时的细胞活力。下方：采自对应感染的上清液的病毒滴度。实验都重复三次，数据表示为平均活力或平均病毒滴度+/-标准差。
图4：CVA21-ΔV(2x)RNA处理得到完全肿瘤消退且未引起毒性。(A)带有皮下Mel624肿瘤的SCID小鼠经盐水(n＝5)或30μg编码CVA21(n＝5)、CVA21-3’miRT(n＝5)、CVA21-ΔV(1x)(n＝5)、CVA21-ΔV(2x)(n＝5)、CVA21-686(2x)(n＝5)或CVA21-3’TR(1x)(n＝4)的RNA转录本IT处理后的肿瘤体积和重量测量值。(B)各组中发生毒性小鼠的比率和总体存活百分比。(C)受治小鼠的Kaplan-Meier存活图。用对数秩检验比较盐水处理小鼠与CVA21-ΔV(2x)RNA处理小鼠之间存活率差异的统计学显著性。(D)治疗后第7天采自受治小鼠的血清中的病毒载量。水平线表示平均病毒滴度。
图5：CVA21-ΔV(2x)RNA的溶瘤活性是剂量依赖性的。(A)带有皮下Mel624肿瘤的SCID小鼠经盐水(n＝4)、1μg(n＝5)、4μg(n＝5)、8μg(n＝5)、16μg(n＝5)或32μg(n＝5)CVA21-ΔV(2x)RNA一次IT注射后的肿瘤体积和重量测量值。(B)RNA给药后第9天采自A中受治小鼠的血清中的病毒载量。(C)受治小鼠的Kaplan-Meier存活图。
图6：CVA21和CVA21-ΔV(2x)在一组肿瘤细胞系中的细胞毒性。Mel624人黑素瘤(A)、DU145人前列腺癌(B)、Panc1人胰腺导管腺癌(C)、U266、RPMI-8226、MM-1、Kas6.1、JJN-3或ARh77人骨髓瘤(D)细胞按照每孔1×104个细胞接种于96孔组织培养皿。细胞用CVA21或CVA21-ΔV(2x)按照0.001、0.01、0.1、1或10的MOI在无血清培养基中37℃感染2小时。感染后，去除培养基和未吸收的病毒，更换以100μL完全生长培养基，于37℃培养细胞。感染后72小时，用3-(4,5-二甲基噻唑基-2)-2,5-二苯基溴化四氮唑(MTT)试剂盒(ATCC，弗吉尼亚州马纳萨斯)检测细胞扩增。骨髓瘤组(n＝5)。其他细胞系(n＝3)。数据表示为相对于空白感染细胞归一化的平均细胞活力百分比+/-标准差。
图7是编码野生型CVA21的感染性核酸及其编码的RNA的DNA的序列表(SEQ ID NO:5)。
图8是编码CVA21-ΔV(1x)的感染性核酸及其编码的RNA的DNA的序列表(SEQ IDNO:6)。下划线标出了miRT(1x)。
图9是编码CVA21-ΔV(2x)的感染性核酸及其编码的RNA的DNA的序列表(SEQ IDNO:7)。下划线标出了miRT(2x)。
图10是编码CVA21-686(2x)的感染性核酸及其编码的RNA的DNA的序列表(SEQ IDNO:8)。下划线标出了miRT(2x)。
图11是编码CVA21-3’TR(1x)的感染性核酸及其编码的RNA的DNA的序列表(SEQ IDNO:9)。下划线标出了miRT(1x)。
图12是编码CVA21-3’TR(2x)的感染性核酸及其编码的RNA的DNA的序列表(SEQ IDNO:10)。下划线标出了miRT(2x)。
图13：微小RNA-靶向的CVA21与无修饰CVA21相比的非编码区预测二级RNA结构。用环间连线表示预测的假结相互作用。用IPknot Web服务器(rtips.dna.bio.keio.ac.jp/ipknot/，可获自日本奈良科学技术大学信息科学研究科(Graduate School ofInformation Science,Nara Institute of Science and Technology Japan))生成二级RNA结构。5'非编码区域预测跨结构域VI和扫描区，采用2级预测(嵌套假结)、带改进的CONTRAfold评分模型。3'非编码区域的预测跨3D与带有20核苷酸长的聚A尾的整个3'非编码区之间的交界区，采用3级预测(含嵌套假结的假结)、带改进的CONTRAfold评分模型。5'非编码区域预测包括(A)无修饰CVA21；(B)CVA21-ΔV(2x)；和(C)CVA21-686(2x)。3'非编码区域预测包括(D)CVA21；(E)CVA21-3’miRT；和(F)CVA21-TR(2x)。
图14：本真病毒基因组末端提高编码CVA21-ΔV(2x)的体外来源(in vitro-derived)RNA转录本的病毒回收率。(A)每孔1×105个H1-HeLa细胞以0.5μg编码CVA21-ΔV(2x)的体外来源RNA转录本转染，其有或没有基因组5’端核酶(Rz-CVA21-ΔV(2x))、3’端处聚A尾直接邻接的限制酶位点(CVA21-ΔV(2x)-3’NheI)或另一不同的核酶(CVA21-ΔV(2x)-3’Rz)、或具有5’核酶与3’端限制酶位点(Rz-CVA21-ΔV(2x)-3’NheI)或核酶(Rz-CVA21-ΔV(2x)-3’Rz)的组合。转染后24小时，对细胞进行台盼蓝染色和CPE成像。如(A)所述处理的细胞用3-(4,5-二甲基噻唑基-2)-2,5-二苯基溴化四氮唑(MTT)试剂盒(ATCC，弗吉尼亚州马纳萨斯)检测细胞活力。(C)(A)中所述以0.5μg编码构建体的感染性RNA转染的H1-HeLa细胞中感染性病毒生产的时间进程。实验重复两次，数据表示为平均病毒滴度±标准差。
图15：编码具有本真末端修饰的CVA21-ΔV(2x)的体外来源RNA转录本引发弥漫性溶瘤性感染。带有皮下Mel624异种移植体的CB-17SCID小鼠接受盐水(n＝5)、30μg(n＝5)或1μg(n＝6)CVA21-ΔV(2x)、30μg(n＝6)或1μg(n＝6)Rz-CVA21-ΔV(2x)-3’NheI或30μg(n＝6)或1μg Rz-CVA21-ΔV(2x)-3’Rz RNA瘤内处理。(A)全体受治小鼠的肿瘤体积(黑)和重量(灰线)。(B)RNA给药后第2天或第7天采自A中受治小鼠的血清中的病毒滴度。所有数据点表示不同的动物。
图16：CVA21-ΔV(2x)能够在稳定表达人细胞内粘附分子1(hICAM-1)的B16-F10细胞中复制，hICAM-1是CVA21受体。用CVA21-ΔV(2x)按MOI为1感染B16-F10-hICAM-1细胞或亲本B16-F10细胞。感染后24小时，测定全体病毒滴度。CVA21-ΔV(2x)复制在表达hICAM-1的细胞中相比亲本细胞系显著增强(p＝0.029)。实验重复三次，数据表示为平均病毒滴度±标准差。
图17：CVA21-ΔV(2x)体外转录反应可升级到毫克水平且仍然运行良好。同时进行小规模(10μl)反应和大规模(1mL)反应，用氯化锂沉淀进行纯化。取各反应的1μg纯化RNA在RNA Flash凝胶(隆萨(Lonza))上电泳。泳道1：10μl反应#1。泳道2：1mL反应#1。泳道3：10μl反应#2。泳道4：1mL反应#2。各反应的总得率分别为150.55μg、7.1768mg、146.55μg和7.3192mg。
具体实施方式
本文提供用编码病毒(例如基因组包含I型内部核糖体进入位点的小核糖核酸病毒)的核酸(例如感染性核酸)减少哺乳动物内活的癌细胞数量的相关方法和材料。例如，本文提供用编码病毒的感染性核酸减少哺乳动物内活的癌细胞数量的方法。本文提供的核酸可编码任何合适的病毒并用于减少哺乳动物体内活的癌细胞数量。一些情形中，本文所述核酸编码的病毒能在癌细胞内复制。一些情形中，可采用编码小核糖核酸病毒的感染性核酸。小核糖核酸病毒可以是肠病毒属(例如牛肠病毒、人肠病毒A、人肠病毒B、人肠病毒C、人肠病毒D、人肠病毒E、脊髓灰质炎病毒、猪肠病毒A和猪肠病毒B)，鼻病毒属(例如人鼻病毒A和人鼻病毒B)，心病毒属(例如脑心肌炎病毒和泰勒病毒(Theilovirus))，鹅口疮病毒属(Aphthovirus)(例如马甲型鼻炎病毒和口蹄疫病毒)，肝病毒属(例如甲型肝炎病毒)，副肠孤病毒属(Parechovirus)(例如人副肠孤病毒(Human parechovirus)和永安河病毒(Ljungan virus))，鼻病毒属(Erbovirus)(例如马乙型鼻炎病毒)，嵴病毒属(Kobuvirus)(例如爱知病毒)或捷申病毒属(Teschovirus)(例如猪捷申病毒1-7和猪捷申病毒)。一些情形中，本文提供的感染性核酸可编码柯萨基病毒A21(Shafren等，Clin.Cancer Res.,10(1Pt.1):53-60(2004))，柯萨基病毒B3(Suskind等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,94(2):309-318(1957))，III型脊髓灰质炎病毒(Pond和Manuelidis，Am.J.Pathol.,45:233-249(1964))，I型艾柯病毒(Shafren等，Int.J.Cancer,115(2):320-328(2005))或E型脑心肌炎病毒(Adachi等，J.Neurooncol.,77(3):233-240(2006))。
编码病毒的核酸(例如感染性核酸)可以是任何合适的核酸(例如DNA、RNA或其组合)。一些情形中，编码病毒的核酸可以是核酸构建体。例如，编码病毒的核酸构建体可以是质粒DNA。例如，编码病毒的核酸构建体可以是RNA分子。
一些情形中，本文提供的核酸(例如感染性核酸)可以编码基因组包含I型内部核糖体进入位点的小核糖核酸病毒。肠病毒和鼻病毒具有I型IRES。基因组具有I型内部核糖体进入位点的小核糖核酸病毒的例子包括但不限于柯萨基病毒(例如柯萨基病毒A21)、脊髓灰质炎病毒、艾柯病毒，肠病毒(例如肠病毒70)和鼻病毒。
可以将本文提供的编码病毒(例如小核糖核酸病毒，如柯萨基病毒A21)的核酸(例如感染性核酸)直接给药到癌细胞(例如通过肿瘤内给药)，或者可以全身性给药(例如通过静脉内、腹膜内、胸膜内或动脉内给药)。感染性核酸对哺乳动物的给药量可以是每公斤(kg)体重约10ng至约1mg(例如100ng至500μg、约250ng至约250μg、约500ng至约200μg、或约1μg至约100μg)。一些情形中，可将约100ng至约500μg编码病毒(例如小核糖核酸病毒，如柯萨基病毒A21)的感染性核酸作为单个瘤内剂量给药。一些情形中，给哺乳动物给药的感染性核酸量可以等于约3×1010至约3×1014基因组拷贝的病毒基因组拷贝数(例如约3×1010至约3×1013、约3×1010至约3×1012、约3×1011至约3×1014、约3×1011至约3×1013或约3×1011至约3×1012基因组拷贝)。例如，本文提供的感染性核酸可以按照令约3×1011病毒基因组拷贝递送到哺乳动物的量来给药。一些情形中，感染性核酸给药的量可以是每公斤体重约3×1010至约3x1014病毒基因组拷贝。
可将编码病毒(例如小核糖核酸病毒，如柯萨基病毒A21)的核酸(例如感染性核酸)设计成缺少一个或多个(例如一个、两个、三个、四个或更多)相应病毒野生型中长度为10个或更多核苷酸的连续核苷酸序列。例如，编码病毒(例如小核糖核酸病毒，如柯萨基病毒A21)的感染性核酸可以缺少常见于病毒多蛋白5’UTR的VI结构域与翻译起点(例如AUG起点)之间的至少10个(例如至少10、20、30、40、50、60个或更多)连续核苷酸。当感染性核酸编码柯萨基病毒A21时，感染性核酸可以缺少野生型柯萨基病毒A21基因组第631位至第698位的至少10个(例如至少10、20、30、40、50、60个或更多)连续核苷酸。一些情形中，编码柯萨基病毒A21的感染性核酸可以设计成缺少野生型柯萨基病毒A21基因组第631位至第698位的全部核苷酸。
如本文所述，可将编码病毒(例如小核糖核酸病毒，如柯萨基病毒A21)的核酸(例如感染性核酸)设计成包含微小RNA靶元件从而使非癌细胞中的相应微小RNA(miRNA，具体的miRNA表示为miR-#)能够降低所述非癌细胞中病毒基因的表达、病毒复制或病毒稳定性。微小RNA是21-23核苷酸的高度保守的调节性的小RNA，它们能够介导翻译抑制或者有时是RISC诱导的切割所致mRNA破坏。微小RNA存在于众多哺乳动物细胞中，具有组织特异性的组织分布。因此，微小RNA可用于调节复制病毒的向性从而提供针对任意病毒的靶向手段。可用至少具有与非癌细胞内微小RNA互补的区域的微小RNA靶元件来降低编码病毒(例如小核糖核酸病毒，例如柯萨基病毒A21)的感染性核酸致使非癌细胞裂解的能力。例如，野生型柯萨基病毒A21能感染肌肉细胞。因此，可将与肌肉细胞中微小RNA互补的微小RNA靶元件掺入柯萨基病毒A21感染性核酸从而减少肌肉细胞裂解。类似地，可通过调解病毒向性来提高疫苗的安全性。例如，可将神经元和/或大脑微小RNA靶元件掺入脊髓灰质炎病毒以减少口服脊髓灰质炎疫苗引起的脊髓灰质炎的发生率。
该同一方法可用于降低其他病毒核酸导致的非癌细胞裂解。例如，至少具有与表1所列微小RNA互补的区域的微小RNA靶元件可用于降低所列病毒及其他病毒介导的指定组织细胞裂解。可设计成降低病毒介导细胞裂解的微小RNA靶元件的其他例子包括但不限于至少具有与表2中组织特异性微小RNA互补的区域的那些。一些情形中，本文提供的感染性核酸可编码病毒并含有微小RNA靶元件，所述微小RNA靶元件至少具有与已分类组织特异性微小RNA互补的区域。微小RNA靶元件可以与微小RNA完全互补。一些情形中，微小RNA靶元件与微小RNA的互补中可含有错配，但需与微小RNA的种子序列(例如第2-7位碱基对)完全互补。参见例如Lim等，Nature,433(7027):769-73(2005))。
表1：通过掺入微小RNA靶元件的沉默
Figure BDA0002677979210000121
Figure BDA0002677979210000131
Figure BDA0002677979210000141
表2：已分类组织特异性微小RNA
Figure BDA0002677979210000142
Figure BDA0002677979210000151
Figure BDA0002677979210000161
Figure BDA0002677979210000171
可用分子克隆技术将微小RNA靶元件插入编码病毒(例如小核糖核酸病毒，如柯萨基病毒A21)的核酸(例如感染性核酸)。本文提供的感染性核酸可含有一个微小RNA靶元件或多个微小RNA靶元件(例如两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、15个、20个、25个、30个或更多个微小RNA靶元件)。例如，本文提供的感染性核酸可包含两种不同的微小RNA靶元件，例如一种是miR-133的靶标，另一种是miR-206的靶标。一些情形中，本文提供的感染性核酸可包含两个或更多个相同的微小RNA靶元件。例如，本文提供的感染性核酸可包含两个微小RNA靶元件各自都是miR-133的靶标或两个微小RNA靶元件各自都是miR-206的靶标。一些情形中，本文提供的感染性核酸可包含两个或更多个(例如两个、三个、四个或更多)微小RNA靶元件、各自都是miR-133的靶标，并且包含两个或更多个(例如两个、三个、四个或更多)微小RNA靶元件、各自都是miR-206的靶标。
如本文所述，可将一个或多个(例如一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多)微小RNA靶标元件插入编码病毒(例如小核糖核酸病毒，如柯萨基病毒A21)的核酸(例如感染性核酸)，插在病毒多蛋白5'UTR的VI结构域与翻译起点(例如AUG起点)之间。当感染性核酸编码柯萨基病毒A21时，感染性核酸可包含一个或多个(例如一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多)微小RNA靶元件，插入在野生型柯萨基病毒A21基因组第631位与第698位之间。一些情形中，编码病毒(例如小核糖核酸病毒，如柯萨基病毒A21)的感染性核酸可以缺少之间的至少10个(例如至少10、20、30、40、50、60个或更多)病毒多蛋白5’UTR的VI结构域与翻译起点(例如AUG起点)连续核苷酸，并可在此位置具有一个或多个(例如一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多)微小RNA靶元件。一些情形中，编码柯萨基病毒A21的感染性核酸可设计成缺少野生型柯萨基病毒A21基因组(例如Kuykendall CVA21毒株)第631至第698位的全部核苷酸，并以一个或多个(例如一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多)微小RNA靶元件替换这些缺失的核苷酸。此类感染性核酸的例子见图8和图9。本文提供的此类感染性核酸的其他例子见图10和图11。
一些情形中，可用与正常细胞中普遍表达而癌细胞中有限表达的微小RNA互补的微小RNA靶元件将细胞裂解定向到癌细胞而不是非癌细胞。例如，用编码病毒的核酸来治疗B淋巴细胞白血病时，可将核酸(例如感染性核酸)设计成包含与正常组织中普遍表达而在B淋巴细胞白血病细胞中下调的微小RNA互补的微小RNA靶元件。此类微小RNA的例子包括但不限于miR-15和miR-16。
可以将编码病毒(例如小核糖核酸病毒，如柯萨基病毒A21)的核酸(例如感染性核酸)设计成包含核酶或编码核酶的核酸。例如，一些情形中，可将编码病毒(例如小核糖核酸病毒，如柯萨基病毒A21)的感染性RNA设计成包含核酶，所述核酶设计成切割自身的部分RNA，一些情形中，可将编码病毒(例如小核糖核酸病毒，如柯萨基病毒A21)的感染性DNA设计成包含编码核酶的DNA序列，所述核酶设计成切割由所述感染性DNA转录所得RNA分子的部分RNA。这样的核酶可以是锤头状核酶、肝炎三角洲病毒核酶、发夹状核酶，Varkud卫星核酶、glmS核酶、Twister核酶、Twister姐妹核酶、Hatchet核酶、手枪核酶或合成核酶。可将核酶设计成从感染性RNA中去除任意RNA部分。例如，可将核酶设计成从编码病毒的感染性RNA中去除RNA的5'端部分或3'端部分。一些情形中，可将编码病毒(例如小核糖核酸病毒，如柯萨基病毒A21)的感染性核酸(DNA或RNA)设计成包括(a)感染性核酸为DNA时的第一核酶编码核酸或感染性核酸为RNA时的第一核酶和(b)感染性核酸为DNA时的第二核酶编码核酸或感染性核酸为RNA时的第二核酶。一些情形中，可将第一核酶设计成去除病毒编码RNA的5’端部分并将第二核酶设计成去除3’端部分。一些情形中，限制性核酸内切酶切割病毒编码核酸后，由病毒编码核酸编码的病毒可包含少于88个(例如少于63或少于10，例如5、4、3、2、1或0)非病毒核苷酸(例如在本真末端附近)。一些情形中，核酶切割后的所得编码病毒的感染性RNA可包含没有非病毒序列的病毒编码序列(例如本真末端)。
可以将编码病毒(例如小核糖核酸病毒，如柯萨基病毒A21)的核酸(例如感染性核酸)设计成包含限制性核酸内切酶切割位点。列如，可将编码病毒(例如小核糖核酸病毒，如柯萨基病毒A21)的核酸(例如DNA)设计成包含限制性核酸内切酶切割位点，所述切割位点设计成切割感染性核酸的部分核酸。一些情形中，可将编码病毒(例如小核糖核酸病毒，如柯萨基病毒A21)的DNA(例如感染性DNA)设计成包含特定的DNA序列以使所述感染性DNA包含这样的限制性核酸内切酶切割位点，所述限制性核酸内切酶切割位点能被在限制性核酸内切酶切割位点切割RNA的限制性核酸内切酶切割。一些情形中，可将编码病毒(例如小核糖核酸病毒，如柯萨基病毒A21)的RNA(例如感染性RNA)设计成包含这样的限制性核酸内切酶切割位点，所述限制性核酸内切酶切割位点能被在限制性核酸内切酶切割位点切割RNA和/或DNA的限制性核酸内切酶切割。可采用任意合适的限制性核酸内切酶切割位点和能够在限制性核酸内切酶切割位点切割核酸的限制性核酸内切酶。限制性核酸内切酶切割位点和能够在这些限制性核酸内切酶切割位点切割核酸的限制性核酸内切酶例如表3中所述。
表3：限制性核酸内切酶/切割位点配对。R是嘌呤(A或G)。Y是嘧啶(A或T)。
限制性核酸内切酶 切割位点
NsiI ATGCA^T
BmtI GCTAG^C
FseI GGCCGG^CC
AsiSI GCGAT^CGC
BstBI TT^CGAA
NheI G^CTAGC
MluI A^CGCGT
HaeII RGCGC^Y
NspI RCATG^Y
可设计限制性核酸内切酶切割位点从而在所述切割位点的切割去除病毒(例如小核糖核酸病毒，如柯萨基病毒A21)编码核酸(例如感染性核酸)的任意核酸部分。例如，限制性核酸内切酶切割位点可定位成去除病毒编码核酸的5’端部分核酸和/或3’端部分核酸。一些情形中，可将编码病毒(例如小核糖核酸病毒，如柯萨基病毒A21)的感染性核酸设计成包含一个、两个、三个、四个或更多个限制性核酸内切酶切割位点。例如，可将第一限制性核酸内切酶切割位点定位成从编码病毒的感染性RNA中去除RNA的5'端部分，并将第二核酸内切酶切割位点定位成去除3'端部分。包括两个或更多个限制性核酸内切酶切割位点时，这些切割位点可以相同(例如两个NheI切割位点)从而由相同的限制性核酸内切酶(例如NheI)切割这些位点，或者这些切割位点可以不同(例如NheI切割位点和非NheI切割位点)从而由不同的限制性核酸内切酶(例如NheI和非NheI切割位点)切割不同的位点。一些情形中，限制性核酸内切酶切割病毒编码核酸后，由病毒编码核酸编码的病毒可包含少于88个(例如少于63或少于10，例如5、4、3、2、1或0)非病毒核苷酸(例如在本真末端附近)。一些情形中，限制性内切核酸酶切割后的所得编码病毒的感染性RNA可包含没有非病毒序列的病毒编码序列(例如本真末端)。
一些情形中，如果是感染性RNA，编码病毒(例如小核糖核酸病毒，如柯萨基病毒A21)的核酸(例如感染性核酸)可设计成包括一个(或一种)或多个(或多种)核酶的组合(或为感染性DNA时的一个(或一种)或多个(或多种)核酶的编码序列的组合或一个(或一种)或多个(或多种)限制性核酸内切酶的编码序列的组合)。例如，病毒编码核酸可包含编码核酶的DNA序列，所述核酶设计成去除所编码病毒的5'端部分，并可包含限制性核酸内切酶切割位点，所述切割位点设计成由限制性核酸内切酶切割而去除核酸的3'端部分从而使得编码的病毒不含非病毒序列(例如本真末端)。
一些情形中，采用限制性核酸内切酶切割位点时，可将能够切割一个或多个所述限制性核酸内切酶切割位点的限制性核酸内切酶外源地添加到含有待切割核酸(例如感染性核酸，如感染性RNA)的溶液中。例如，可在允许限制性核酸内切酶切割感染性核酸的条件下将外源添加的限制性核酸内切酶添加到含有待切割感染性核酸的溶液中。一些情形中，可将包含限制性核酸内切酶和待切割感染性核酸的溶液孵育约60分钟至约300分钟(例如约60分钟至约240分钟、约60分钟至约200分钟、约60分钟至约180分钟、约60分钟至约150分钟、约60分钟至约120分钟、约60分钟至约100分钟、约60分钟至约90分钟、约90分钟至约300分钟、约100分钟至约300分钟、约120分钟至约300分钟、约150分钟至约300分钟、约180分钟至约300分钟、约200分钟至约300分钟、约240分钟至约300分钟、约90分钟至约240分钟、约120分钟至约210分钟、约150分钟至约180分钟、约60分钟至约90分钟、约90分钟至约120分钟、约120分钟至约150分钟、约150分钟至约180分钟、约180分钟至约210分钟、约210分钟至约240分钟或约240分钟至约270分钟)来让限制性核酸内切酶切割所述感染性核酸。一些情形中，可将包含限制性核酸内切酶和待切割感染性核酸的溶液于约37℃至约60℃(例如约37℃、约42℃、约45℃、约50℃或约55℃)孵育来让限制性核酸内切酶切割所述感染性核酸。例如，当限制性核酸内切酶是NheI时，可将包含NheI和待切割感染性核酸的溶液于约37℃孵育约60至约80分钟从而让NheI切割感染性核酸。一些情形中，在允许限制性内切核酸酶切割感染性核酸的条件下孵育含有外源添加的限制性核酸内切酶和待切割感染性核酸的溶液后，可以从溶液中分离经切割的感染性核酸。可采用任意合适的技术来从溶液中分离经切割的感染性核酸。例如，可采用乙醇沉淀或柱纯化来从溶液中分离经切割的感染性核酸。
当将编码病毒(例如小核糖核酸病毒，如柯萨基病毒A21)的核酸(例如感染核酸)给药到哺乳动物以治疗癌症(例如B淋巴细胞白血病)时，所述哺乳动物还可接受一种或多种其他癌症治疗。所述一种或多种其他癌症治疗可包括任意合适的癌症治疗。一些情形中，癌症治疗可包括手术。一些情形中，癌症治疗可包括放疗。一些情形中，癌症治疗可包括一种或多种抗癌药给药，例如化学治疗药，检查点抑制剂(例如CTLA-4抑制剂，PD-1抑制剂和PD-L1抑制剂)，溶瘤病毒，基因疗法，组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂，抗菌剂，免疫疗法，疫苗，蛋白激酶抑制剂，第二线粒体来源的半胱天冬蛋白酶(Caspases)活化剂(SMAC)模拟物和/或整体治疗。抗癌药可以是任何适当类型的分子(例如多肽(如抗体)或小分子)。抗癌药的例子包括但不限于：易普利姆玛(ipilimumab)、纳武利尤单抗(nivolumab)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、度伐鲁单抗(durvalumab)、西普利单抗(cemiplimab)、司帕利珠单抗(spartalizuma)、塔利兰帕(talimogene laherparepvec，(T-vec))、古抑菌素A(TSA)、帕比司他(panobinostat)、恩替诺特(entinostat)、罗米地辛(romidepsin)、伏立诺他(vorinostat)、吉凡诺特(givinostat)、阿达弗替(adavosertib)、阿法替尼(afatinib)、阿西替尼(axitinib)、博舒替尼(bosutinib)、西妥昔单抗(cetuximab)、考比替尼(cobimetinib)、克唑替尼(crizotinib)、卡博替尼(cabozantinib)、达沙替尼(dasatinib)、恩曲替尼(entrectinib)、厄达替尼(erdafitinib)、厄洛替尼(erlotinib)、福他替尼(fostamatinib)、吉非替尼(gefitinib)、依鲁替尼(ibrutinib)、伊马替尼(imatinib)、拉帕替尼
(lapatinib)、乐伐替尼(lenvatinib)、尼罗替尼(mubritinib)、尼罗替尼(nilotinib)、帕唑帕尼
(pazopanib)、哌加他尼(pegaptanib)、鲁索利替尼(ruxolitinib)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)、凡德他尼(vandetanib)、维罗非尼(vemurafenib)，及其组合物。例如，患有癌症(例如B淋巴细胞白血病)的哺乳动物可以通过编码小核糖核酸病毒(如柯萨基病毒A21)的核酸给药和一种或多种检查点抑制剂(例如CTLA-4抑制剂，PD-1抑制剂和/或PD-L1抑制剂)给药来治疗。
当患有癌症的哺乳动物接受编码病毒(例如小核糖核酸病毒，如柯萨基病毒A21)的核酸(例如感染性核酸)治疗并接受一种或多种癌症疗法治疗(例如一种或多种抗癌药给药)时，癌症治疗可以同时或各自独立给用。例如，可以首先以编码病毒的核酸给药，然后施以一种或多种癌症疗法，或者反之。
本文还提供免疫健全模型，所述模型可被编码病毒(例如小核糖核酸病毒，如柯萨基病毒A21)的核酸(例如感染性核酸)感染。例如，可用编码病毒(例如小核糖核酸病毒，如柯萨基病毒A21)的感染性核酸感染表达病毒受体(例如ICAM-1)的细胞。当病毒受体是ICAM-1，ICAM-1可以是任何来源的。例如，ICAM-1可以是人ICAM-1。一些情形中，免疫健全模型不内源性表达病毒受体。表达病毒受体的免疫健全模型可稳定表达所述病毒受体或可瞬时表达所述病毒受体。一些情形中，本文所述的免疫健全模型可用来复制编码病毒的核酸所编码的病毒。一些情形中，本文所述的免疫健全模型可用作评价和/或监测感染特异性(例如病毒生产之后)的模型。
一些情形中，能被病毒编码核酸(例如感染性核酸)感染的免疫健全模型可以是表达病毒受体(例如ICAM-1，如人ICAM-1)的细胞(如细胞系)。任意合适的细胞都可用来制造本文所述的免疫健全模型。一些情形中，用来制造本文所述免疫健全模型的细胞可以获自哺乳动物(例如，可以是原代细胞)。一些情形中，用来制造本文所述免疫健全模型的细胞可以获自细胞系(例如哺乳动物细胞系，如鼠黑素瘤B16-F10细胞)。
一些情形中，能被病毒编码核酸(例如感染性核酸)感染的免疫健全模型可以是非人动物模型(例如小鼠模型)，所述模型具有一个或多个表达病毒受体(例如ICAM-1)的细胞。任意合适的非人动物细胞都可用来制造本文所述的免疫健全模型。一些情形中，用来制造本文所述免疫健全模型的非人动物可以是哺乳动物(例如小鼠或大鼠)。
可采用任意合适的方法来制造本文所述的免疫健全模型。当免疫健全模型是细胞时，可将编码病毒受体的核酸导入细胞从而由所述细胞表达所述病毒受体。例如，可将编码病毒受体的慢病毒载体导入细胞从而由所述细胞表达所述病毒受体。当免疫健全模型是非人类动物时，可将编码病毒受体的核酸引入非人类动物内的一个或多个细胞中从而由所述非人类动物内的一个或多个细胞表达所述病毒受体。以下通过实施例进一步说明本发明，这些实施例对于权利要求书描述的本发明范围不构成约束。
实施例
实施例1–可用于治疗癌症的感染性核酸的产生
肠病毒和鼻病毒使用I型内部核糖体进入位点(IRES)来调节病毒翻译。通过消化/化学探测和诱变分析预测并检验了脊髓灰质炎病毒IRES的结构(Rivera等，Virology,165:42-50(1988)；Pilipenko等，Virology,168:201-209(1989)；Skinner等，J.Mol.Biol.,207:379-392(1989)；和Burrill等，J.Virol.,87:11670-11683(2013))。CVA21是一种脊髓灰质炎病毒样(polio-like)病毒，与脊髓灰质炎病毒IRES具有86％的同源性。脊髓灰质炎病毒5’UTR有六个结构域(I至VI)。结构域I形成一三叶草结构，该结构为正链和负链合成所必需(Andino等，Cell,63:369-380(1990)；Andino等，EMBO J.,12:3587-3598(1993)；Barton等，EMBO J.,20:1439-1448(2001)；和Vogt等，PLoS Pathog.,6:e1000936(2010))。第II至第VI结构域参与IRES活性。病毒复制和翻译需要复杂的RNA-RNA和RNA-蛋白质相互作用，包括募集宿主IRES反式作用因子(ITAF)和起始因子(Lee等，Trends Microbiol.,25:546-561(2017))。这些结构域破坏会造成病毒减毒表型或致死表型。与脊髓灰质炎病毒类似，CVA21在结构域VI中有一个隐匿AUG位点，该位点参与核糖体加载(Verma等，J.Gen.Virol.,92:2310-2319(2011))。主AUG位点的翻译启动依赖于核糖体对整个长链可变接头(亦称“扫描区”)的扫描。
将感染性核酸设计成在该扫描区内包含微小RNA反应元件(RE)。将RE设计成缺失可能会在本真AUG之前启动翻译的AUG位点。
致死性肌炎是需要消除的主要毒性，由此方可将CVA21的安全性提高到足可用于治疗免疫低下患者的水平。本文提供的RE定向为消除肌肉组织内的病毒复制。选取miR-133和miR-206。它们在肌肉组织中高度富集，且已有报道称将它们插入CVA21的3’UTR可消除毒性(Kelly等，Nat.Med.,14:1278-1283(2008))。
虽然单个微小RNA靶足以下调病毒复制，但有许多变量会影响靶向效率。此外，由于RdRp的保真度低，RNA病毒会迅速积累突变，这可能导致RE在感染后不久即失效。所以，将RE设计成编码每序列一拷贝(miRT-1x)或每序列两拷贝(miRT-2x)的miR-133和miR-206互补序列。这些RE序列如图1A所示。通过重叠延伸PCR、定点诱变或先合成基因组片段再亚克隆成全长构建体(pGEM-CVA21)将AscI位点插入pGEM-CVA21且插在RE所期望的位置。通过寡核苷酸超聚物退火将全部RE插入病毒基因组中，所述寡核苷酸超聚物编码的RE两侧是可经AscI酶促消化产生的突出序列，然后可籍此连接到相应消化并纯化的AscI全长载体中。
制造了三种5’UTR内编码RE的不同构建体。第一种具有插入在扫描区内第686位核苷酸处的2x-RE(CVA21-686(2x))。此外，制造了两种构建体，其中缺失了扫描区的残基631至698而加入了RE。其中之一含miRT-1x RE(CVA21-ΔV(1x))，另一个含miRT-2x RE(CVA21-ΔV(2x))。图1B显示CVA21病毒基因组、URT结构元件和被测RE插入位点。
大多数先前测试的细胞微小RNA靶序列位于目标mRNA的3'UTR内。基于经实验验证的脊髓灰质炎病毒3'UTR建模(Pilipenko等，EMBO J.,15:5428-5436(1996))认为CVA21(脊髓灰质炎病毒样病毒)3'UTR的二级结构含有两个发夹结构(Y和X)，它们的环区形成被称为“轻触域”的假结相互作用(van Ooij等，J.Gen.Virol.,87:689-695(2006))。这些结构包括负链合成的复制起点(oriR)。其他肠病毒中轻触域的失稳严重抑制病毒RNA合成，造成温敏性突变体或致死表型(van Ooij等，J.Gen.Virol.,87:689-695(2006)；Melchers等，J.Virol.,71:686-696(1997)；Wang等，Nucleic Acids Res.,27:485-490(1999)；和Melchers等，RNA,6:976-987(2000))。在脊髓灰质炎病毒和柯萨基病毒B3中，失稳病毒的连续传代产生回复突变体，其中恢复了假结相互作用(Pilipenko等，EMBO J.,15:5428-5436(1996)；和van Ooij等，J.Gen.Virol.,87:689-695(2006))。这两个结构域缺失造成聚(A)尾截短(van Ooij等，Nucleic Acids Res.,34:2953-2965(2006))。然而，从这些缺失突变体中收获到了病毒，它们获得了对应于细胞聚腺苷酸化信号的聚(AU)串。X和Y结构域的长度在肠道病毒中高度保守，据报道结构域Y应该为12bp并与结构域X的8bp茎区形成组合。此外，Y结构域中距离“轻触域”最远的两个碱基必需是Watson-Crick的CG配对(Melchers等，J.Virol.,71:686-696(1997))。两个茎环结构之间接头区的长度对于螺旋的正确方向及其相互作用的能力非常重要。最后，还提示存在S结构域，其中，在3D基因中，聚(A)尾碱基与终止密码子上游的四个尿苷残基串配对。该结构域关闭oriR结构，由此形成更为刚性的3'UTR结构(Pilipenko等，Nucleic Acids Res.,20:1739-1745(1992))。因此，需要正确折叠的3'UTR来确保负链合成中核糖核蛋白复合物相关蛋白质的正确对接和定向。
图1C左分图显示CVA21 oriR的二级结构模型以及Kelly等的构建体(CVA21-3’miRT)中所用RE的位置即第7343位核苷酸处。在该位点的插入打断了Y结构域的长度，对远端CG碱基对构成干扰，且可能破坏结构域X与结构域Y之间的接头区，干扰螺旋取向。3'UTR中的所有残基和编码序列中的几个残基参与oriR结构的维持，这限制了RE的潜在插入位点。为了避免任何结构破坏，直接在终止密码子的下游插入AscI限制性位点和其后的末端重复(TR)元件。该TR元件包括核苷酸7325至7340，包含被认为参与结构域S的四个尿苷残基。假设TR将oriR结构与插入AscI位点的RE隔开，同时保留编码序列(图1C，右)。制造了含miRT-1x(CVA21-3’TR(1x))和含miRT-2x(CVA21-3’TR(2x))的构建体。
通过对插入区测序验证微小RNA靶插入元件完整性。
RNA转录本的病毒拯救动力学
目的之一是获得由靶向性感染性核酸引发弥漫性病毒感染的速度接近未修饰病毒的感染性核酸。为了分析靶向性感染RNA产生病毒后代的能力，用编码各种miRT-CVA21的感染性RNA转染不表达miR-133和miR-206的后代H1-HeLa细胞(ATCC，弗吉尼亚州马纳萨斯)。用限制性核酸内切酶MluI-HF(新英格兰实验室公司(New England Biolabs)，马萨诸塞州伊普斯威奇)将编码未修饰或miRT-CVA21的质粒DNA线性化，然后乙醇沉淀并重悬于无核酸酶的水中，由此制备感染性RNA。用Ambion MEGAscript T7转录试剂盒将1μg线性化DNA转录成RNA转录本，用MEGAclear转录纯化试剂盒(赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific Inc.)，马萨诸塞州沃尔瑟姆)纯化RNA，两试剂盒均按照制造商说明使用。通过RNA在RNA Flash凝胶(隆萨(Lonza)，瑞士巴塞尔)上电泳来检验转录本的大小和完整性。在6孔组织培养板中，每孔接种4×105个细胞，培养24小时后转染。用TransIT-mRNA转染试剂盒(Mirus生物有限责任公司(Mirus Bio LLC)，威斯康星州麦迪逊)每孔转染2.5μg纯化T7RNA。观察到细胞病变效应(CPE)后，将细胞刮入上清液，并将样品收集到各个冷冻管中。对样品进行3轮冻融循环，4℃、2500rpm离心澄清5分钟，0.22μm针式过滤器过滤。在6孔组织培养板孔内用50μL澄清裂解液感染新鲜的H1-HeLa细胞。细胞在无血清培养基中37℃培养2小时。去除培养基和未被吸收的病毒，每孔加入2mL新鲜完全生长培养基。感染后24小时，观察细胞的CPE。所有miRT-CVA21，除了Kelly等的构建体CVA21-3’miRT，都产生足以造成可见的CPE的病毒量(图2A)。
为了评估从编码这些目标病毒基因组的RNA转录本产生病毒后代的速度，在H1-HeLa细胞中进行生长曲线时间进程分析。在12孔组织培养板中，每孔接种2.5×105个H1-HeLa细胞，培养24小时后转染。用TransIT-mRNA转染试剂盒(Mirus生物有限责任公司(Mirus Bio LLC)，威斯康星州麦迪逊)每孔转染1μg纯化T7 RNA。转染后6小时，去除培养基，细胞用完全培养基洗三次。每孔加入1mL完全生长培养基，37℃培养细胞直至所需时间点。转染后6、12、24和48小时，将细胞刮入上清液，并将样品收集到各个冷冻管中，直至完成全部采用。对样品进行3轮冻融循环，4℃、2500rpm离心澄清5分钟。用H1-HeLa细胞测定澄清裂解液的滴度，用
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方程测定每一样品的每毫升(mL)TCID50。Kelly等的构建体CVA21-3’miRT其病毒生产严重受阻。CVA21-TR(2x)RNA的拯救速度与无修饰CVA21 RNA相比略有延迟。其他miRT-CVA21 RNA拯救病毒的速度和水平都接近无修饰RNA基因组(图2B)。在人黑素瘤细胞系Mel624(Imanis生命科学(Imanis Life Sciences)，明尼苏达州罗切斯特)进行时间进程分析时可见相似结果(图2C)。
miRT-CVA21病毒特征鉴定
为了产生病毒储备(virus stock)，如上所述生产病毒RNA。如前所述用每孔2.5μgRNA转染接种在6孔板中的H1-HeLa细胞。转染后48-72小时，将细胞刮入上清液，收集样品。对样品进行三轮冻融循环，4℃、2500rpm离心澄清5分钟，0.22μm针式过滤器过滤。在T75烧瓶中，在无血清培养基中，37℃，用澄清的裂解液感染H1-HeLa细胞。感染后2小时，去除培养基和未被吸收的病毒，给细胞补充完全生长培养基。观察到CPE后以相同方式处理样品。澄清裂解液病毒储备液分成小份存放于-80℃。用H1-HeLa细胞测定病毒滴度。在96孔组织培养板中，按每孔1×104个细胞接种，培养24小时后感染。在无血清培养基中制做病毒的10倍连续稀释液(1×10-2至1×10-10)，每个稀释度取100μL加至一式八孔。细胞于37℃下感染2小时，然后去除培养基，换成100μL完全生长培养基。细胞于37℃培养72小时，然后目测观察CPE。用
Figure BDA0002677979210000261
方程测定每一样品的每毫升TCID50。
制做一步生长曲线来比较miRT-CVA21与无修饰病毒的复制动力学。在无血清培养基中，以无修饰miRT-CVA21感染H1-HeLa细胞，感染复数为3.0。感染后2小时，淋洗细胞，添加完全生长培养基。在转染后的特定时间点(2、4、6、8、12、24和48小时)采集样品存放于-80℃。全部时间点采用完成后，将样品冻融3次，4℃、2500rpm离心5分钟清除裂解液中的细胞碎片。测定澄清裂解液的滴度，用
Figure BDA0002677979210000262
方程测定病毒滴度。所有miRT-CVA21的复制动力学与无修饰病毒相似。
测定转染了互补或非互补合成miRNA模拟物(达马可公司(Dharmacon)，哥伦比亚拉斐特)的H1-HeLa细胞的细胞活力和病毒复制，由此分析微小RNA靶向的效率和特异性。用TransIT-mRNA转染试剂盒，按照制造商的方案，按各100nM的浓度将模拟物反向转染到H1-HeLa细胞中。简而言之，在96孔板中组装转染复合物并室温孵育5分钟。胰酶消化T75烧瓶中的H1-HeLa细胞，计数，重悬于完全生长培养基，浓度为每90μL中1×104个细胞。每孔添加90μL细胞，细胞/转染混合物于37℃孵育12小时。在无血清培养基中，每种miRT-CVA21按照MOI为1感染细胞，37℃感染2小时。感染后，除去培养基和未吸收的病毒，换以100μL完全生长培养基，细胞在37℃培养。感染后24小时，如前所述收集上清液并测定滴度。用3-(4,5-二甲基噻唑基-2)-2,5-二苯基溴化四氮唑(MTT)试剂盒(ATCC，弗吉尼亚州马纳萨斯)检测细胞扩增。CVA21-3’TR(2x)复制不受miR-133、miR-206或两模拟物组合的调控。病毒CVA21-686(2x)和CVA21-ΔV(2x)的复制受miR-133调控的程度极低。微小RNA-206在调控病毒复制方面有效得多，针对CVA21-ΔV(1x)、CVA21-ΔV(2x)、CVA21-686(2x)和CVA21-3’TR(1x)，提高了细胞活力、降低了病毒滴度。在miR-133和miR-206两者转染的H1-HeLa细胞中，病毒向性受到类似调控。miR-142对照模拟物转染的H1-HeLa细胞和非转染细胞中未观察到细胞活力和病毒滴度差异。值得注意的是，RE位于5’UTR内的病毒比CVA21-3’TR(1x)更易受调控。根据以上结果，不再继续CVA21-3’TR(2x)构建体的研究。
反应元件的体外遗传稳定性
通过miRT-CVA21在表达miR-133和miR-206的TE671肌肉细胞中受迫传代来评估RE在可变位置的遗传稳定性。TE-671细胞在2％马血清中培养4天，由此诱导细胞分化为表达更高水平miR-133和miR-206的肌管。在6孔组织培养板中，在无血清培养基中，以CVA21-ΔV(1x)、CVA21-ΔV(2x)、CVA21-686(2x)、CVA21-3’TR(1x)或CVA21-3’TR(2x)按MOI为10感染已分化TE-671细胞(dTE-671)，37℃感染2小时。2小时后，去除培养基和未被吸收的病毒，用完全生长培养基淋洗细胞。每孔添加1.5mL完全培养基，37℃培养细胞。感染后24小时，将细胞刮入上清液，收集样品。对全部样品进行3轮冻融循环，4℃、2500rpm离心5分钟澄清裂解液，0.22μm过滤。澄清裂解液中的病毒在dTE-671细胞中连续传代7次，每次每2体积新鲜培养基用1体积澄清裂解液。用QIAamp病毒RNA微型试剂盒(凯杰公司(Qiagen)，加利福尼亚州)按照制造商的说明从每次传代的澄清裂解液中分离病毒RNA。合成cDNA，扩增含RE区域。用嵌套引物对扩增子进行测序。试验重复两次。CVA21-686(2x)样品早在第2代就观察到逃逸突变体。其他miRT-CVA21感染都在第4至第7代产生逃逸突变体。
溶瘤活性体内分析
根据体外结果，未对CVA21-3’TR(2x)进行体内分析。4-5周龄雌性CB17 ICR-SCID小鼠购自Envigo(英国剑桥郡汉廷顿)。小鼠先接受照射，24小时后右侧腹皮下移植5E6个Mel624细胞。肿瘤长到平均尺寸0.5cm×0.5cm时，用含于50μL盐水内的30μg RNA对肿瘤进行瘤内处理。定期监测肿瘤体积、重量和整体健康状况，肿瘤体积用手持卡尺测量。RNA处理后第7天采集全体小鼠的血样。通过异氟烷吸入麻醉小鼠，从下颌下静脉采集血样，采在带有血清分离凝胶的BD microtainer采血管中。血液在室温下凝结30分钟，然后4℃、8000rpm离心5分钟分离血清。将血清存放于-80℃。如同就病毒储备液所述用H1-HeLa细胞测定血清中的病毒滴度。安乐死时获取全体小鼠的血清(通过心脏穿刺放血)和骨骼肌组织。将骨骼肌切片速冻并存放于-80℃或固定在10％福尔马林中。用RNeasy plus微型试剂盒(凯杰公司(Qiagen)，加利福尼亚)按照制造商的说明提取速冻组装切片的总RNA。用QIAamp病毒RNA微型试剂盒(凯杰公司(Qiagen)，加利福尼亚州)按照制造商的说明从血清中分离病毒RNA。用Titan单管RT-PCR系统(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)，密苏里州圣路易斯)按照制造商的说明合成cDNA并扩增包含RE的区域。用嵌套引物对扩增子进行测序。
图4A显示了全体小鼠整个实验过程中的肿瘤体积和重量。对照处理的小鼠和CVA21-3’miRT RNA给药的小鼠均表现出进行性肿瘤生长，并因肿瘤体积超过10％体重或肿瘤溃疡而被安乐死。发现一只CVA21-3’miRT处理的小鼠处于濒死状态，于是立即安乐死。该小鼠肌肉组织中病毒基因组的序列分析显示为野生型回复。接受CVA21、CVA21-ΔV(1x)、CVA21-ΔV(2x)、CVA21-686(2x)或CVA21-3’TR(1x)RNA处理的小鼠都观察到快速的肿瘤消退。在所有CVA21 RNA处理的小鼠和部分接受CVA21-ΔV(1x)(60％观察到毒性)、CVA21-686(2x)(60％观察到毒性)或CVA21-3’TR(1x)(75％观察到毒性)处理的小鼠中观察到表现为后肢瘫痪(HLP)、猝死(FD)或体重过多减轻(WL)的毒性。CVA21-ΔV(2x)处理的小鼠未见毒性。图4B显示各组观察到的毒性和比例。CVA21-ΔV(2x)处理的小鼠都表现健康，且研究结束的第90天表现为无肿瘤。分离自全体CVA21-ΔV(2x)处理小鼠血清和骨骼肌的病毒基因组保留RE没有突变。CVA21-ΔV(2x)处理小鼠的总体存活率为100％，相比对照处理小鼠显著提高总体存活率，p＝0.002(图4C)。
如图4D所示，处理后第7天从接受CVA21-3’miRT RNA处理小鼠分离的血清中没有回收到感染性病毒。相比之下，CVA21-ΔV(1x)、CVA21-ΔV(2x)、CVA21-686(2x)或CVA21-3’TR(1x)RNA处理小鼠的血清中所见病毒滴度水平与CVA21 RNA处理小鼠的相近。
CVA21-ΔV(2x)RNA的体内剂量递增
购自Envigo(英国剑桥郡汉廷顿)的4-5周龄雌性CB17 ICR-SCID小鼠接受照射，24小时后右侧腹皮下移植5E6个Mel624细胞。肿瘤长到平均尺寸0.5cm×0.5cm时，用含于50μL盐水内的1-32μg CVA21-ΔV(2x)RNA对肿瘤进行瘤内处理。定期监测肿瘤体积、重量和整体健康状况，肿瘤体积用手持卡尺测量。RNA处理后第9天采集全体小鼠的血样。如前文体内实验所述测量、获取、处理和分析肿瘤大小、重量、血液、血清分离、组织采集和基因组测序。
如图5A所示，对照处理的小鼠表现出进行性的肿瘤生长，并因肿瘤大小或溃疡而全部被安乐死。1μg CVA21-ΔV(2x)RNA处理的5只小鼠中有4只也表现出进行性肿瘤生长，但在一只小鼠中观察到肿瘤完全消退。在4至32μg CVA21-ΔV(2x)RNA处理的所有其他小鼠中均观察到完全肿瘤消退。仅一只8μg CVA21-ΔV(2x)RNA处理的小鼠观察到后肢瘫痪。骨骼肌的序列分析和组织学分析未发现反应元件序列的任何突变，也未见肌炎迹象。另一只32μg CVA21-ΔV(2x)RNA处理的小鼠在RNA处理后第78天死亡。4至32μg CVA21-ΔV(2x)RNA处理小鼠中大多数在RNA处理后第9天表现出血清高病毒载量，少数没有(图5B)。RNA处理后血清中病毒载量的时间进程分析可用来确定何时观察到病毒载量峰值。仅在1μg组的一只小鼠中观察到病毒血症，而该小鼠显示出完全肿瘤消退。
CVA21-ΔV(2x)RNA治疗后的双侧肿瘤破坏
4-5周龄雌性CB17 ICR-SCID小鼠接受照射，24小时后右侧腹皮下移植5E6个Mel624细胞并在左侧腹皮下移植5E6个Mel624细胞。肿瘤长到平均尺寸0.5cm×0.5cm时，对小鼠进行处理。每个小鼠右侧腹肿瘤瘤内注射一次2、10或30μg CVA21-ΔV(2x)RNA。定期监测肿瘤体积、重量和整体健康状况，肿瘤体积用手持卡尺测量。处理后第2、4、6、8或10日采集每组两只小鼠的血样。如前文体内实验所述测量、获取、处理和分析肿瘤大小、重量、血液、血清分离、组织采集和基因组测序。
潜在的用于CVA21-ΔV(2x)治疗的感染性核酸制剂
感染性核酸制剂的例子包括但不限于编码小核糖核酸病毒基因组的感染性cDNA克隆或RNA转录本。用于从感染性cDNA合成病毒RNA基因组的技术会在5'端和/或3'端产生附加核苷酸(不是病毒基因组的一部分)。有报道发现几种正链和负链RNA病毒(包括脊髓灰质炎病毒)需要准确的末端才能有效复制(Boyer等，Virology,198:415-426(1994)；Herold和Andino,J.Virol.,74(14):6394-6400(2000))。尽管可以在复制过程中去除这些残基来产生本真病毒基因组，但它们最初的存在会对治疗性核酸的特异性感染力产生不利影响。可采用快速产生本真病毒基因组的机制来改进CVA21-ΔV(2x)感染性核酸疗法。此类机制之一是在5’和/或3’末端编码核酶序列。核酶是具有催化活性的RNA分子(结构)。某些核酶能够在非常特异性的位点顺式(in cis)或反式(in trans)切割RNA分子。在编码CVA21-ΔV(2x)的感染性核酸制剂中在病毒基因组5’和/或3’末端编码核酶还可以进一步提高治疗效果。
制造了三种构建体来证实这一点。第一种包含紧接在CVA21-ΔV(2x)基因组上游的核酶(Rz-CVA21-ΔV(2x))。该核酶被改造成允许在CVA21-ΔV(2x)基因组准确5’末端的顺式切割。第二种构建体包含紧接在CVA21-ΔV(2x)基因组下游的另一不同核酶(CVA21-ΔV(2x)-Rz)，它顺式切割直接位于CVA21-ΔV(2x)的编码聚A尾下游的RNA。第三种构建体包含CVA21-ΔV(2x)基因组及其侧接的上述两种核酶(Rz-CVA21-ΔV(2x)-Rz)。合成RNA基因组，如同前文就无修饰CVA21-ΔV(2x)所述对其特异性感染力、靶向效果/特异性、遗传稳定性和治疗效果/安全性进行特征鉴定。确保本真或近乎本真3’末端的一种机制是紧邻编码的3’端(例如聚A尾)或在其后5个核苷酸内包含编码限制性位点的序列，限制性位点可被限制性核酸内切酶切割。在编码病毒基因组CVA21-ΔV(2x)的DNA内，紧邻编码的聚A尾编码NheI限制性酶位点。用NheI限制性核酸内切酶将该DNA线性化，于是，体外来源的编码CVA21-ΔV(2x)的RNA转录本具有聚A尾之后的5个非病毒核苷酸(CVA21-ΔV(2x)3’NheI)。制造另一构建体，其中，NheI位点位于CVA21-ΔV(2x)基因组的3’末端，与紧邻CVA21-ΔV(2x)基因组上游的核酶组合(Rz-CVA21-ΔV(2x)-3’NheI)。合成RNA基因组，如同前文就无修饰CVA21-ΔV(2x)所述对其特异性感染力、靶向效果/特异性、遗传稳定性和治疗效果/安全性进行特征鉴定。
在多种类型肿瘤中的治疗效果
CVA21-ΔV(2x)感染性核酸疗法可用于治疗多种癌症，包括但不限于黑素瘤、骨髓瘤、前列腺癌、乳腺癌、肺癌(例如非小细胞肺癌)和胰腺癌。将以上癌症类型的代表性肿瘤细胞系的细胞接种在96孔组织培养板内，每孔1×104个细胞。在无血清培养基中，用CVA21或CVA21-ΔV2按照0.001至1的递增MOI感染细胞，37℃感染2小时。感染后，除去培养基和未吸收的病毒，换以100μL完全生长培养基，细胞在37℃培养。感染后72小时，用3-(4,5-二甲基噻唑基-2)-2,5-二苯基溴化四氮唑(MTT)试剂盒(ATCC，弗吉尼亚州马纳萨斯)检测细胞扩增。所有被测细胞系都对CVA21-ΔV2如同对CVA21一样易感(图6)。
分析这一组肿瘤细胞对编码CVA21-ΔV2的感染性核酸制剂的易感性。在24孔组织培养板中按每孔6×104个细胞接种。将编码CVA21、CVA21-ΔV2、Rz-CVA21-ΔV2、CVA21-ΔV2-Rz或Rz-CVA21-ΔV2-Rz的RNA转录本转染到细胞中。用TransIT-mRNA转染试剂盒(Mirus生物有限责任公司(Mirus Bio LLC)，威斯康星州麦迪逊)每孔转染0.5μg纯化T7 RNA。没有用模板转染对照来考虑与转染方案相关的细胞活力变化。感染后24、48和72小时，用3-(4,5-二甲基噻唑基-2)-2,5-二苯基溴化四氮唑(MTT)试剂盒(ATCC，弗吉尼亚州马纳萨斯)检测细胞扩增。
实施例2–可用于治疗癌症的核酸的感染力和稳定性
Y结构域内插入2x RE降低编码CVA21-3’miRT基因组的感染性RNA的特异性感染力并消除其治疗效果
与编码无修饰CVA21的RNA相比，1μg体外来源的编码CVA21-3’miRT的感染性RNA转染后在H1-HeLa和Mel624细胞中感染性病毒的收获显著延迟(图2)。4-5周龄雌性CB17 ICR-SCID小鼠购自Envigo(英国剑桥郡汉廷顿)。小鼠先接受照射，24小时后右侧腹皮下移植5E6个Mel624细胞。肿瘤长到平均尺寸0.5cm×0.5cm时，用含于50μL盐水内的30μg无修饰CVA21或CVA21-3’miRT对肿瘤进行瘤内处理。定期监测肿瘤体积、重量和整体健康状况，肿瘤体积用手持卡尺测量。RNA处理后第7天采集全体小鼠的血样。通过异氟烷吸入麻醉小鼠，从下颌下静脉采集血样，采在带有血清分离凝胶的BD microtainer采血管中。血液在室温下凝结30分钟，然后4℃、8000rpm离心5分钟分离血清。将血清存放于-80℃。如同就病毒储备液所述的那样用H1-HeLa细胞测定血清中的病毒滴度。如图4A和D所示，编码CVA21-3’miRT的RNA没有表现出任何细胞毒性或诱导病毒血症。RNA二级结构预测显示oriR的Y结构域被破坏，假结形成概率降低，这很可能与体外来源RNA的特异性感染力降低和缺乏治疗功效有关(图13)。
扫描区域替换增强微小RNA反应元件的稳定性。
安乐死时，从CVA21-ΔV(2x)处理的小鼠和具有毒性临床表现的小鼠的血清和骨骼肌中分离病毒基因组。分别从样品中分离病毒或总RNA，合成cDNA。扩增含有微小RNA反应元件的区域，对扩增子进行测序。一只接受CVA21-ΔV(1x)处理的小鼠和另三只接受CVA21-686(2x)处理的小鼠发生后肢瘫痪，在它们的骨骼肌中检测到回复突变体。相比之下，CVA21-ΔV(2x)处理的小鼠中都没有检测到回复突变体或逃逸突变体。值得注意的是，CVA21-TR(1x)处理的两只有评价价值的小鼠中也检测到了回复突变体。为了体外测定微小RNA反应元件的稳定性，在表达miR-133和miR-206的已分化TE671(dTE-671)肌肉细胞中进行各微小RNA-靶向CVA21的连续传代。先按MOI为10感染dTE671细胞。感染后24小时，采集样品，用50％的澄清裂解液感染新鲜dTE671细胞。从连续传代七代的澄清裂解液中分离病毒RNA，合成cDNA，并扩增含有反应元件的区域进行测序。两个实验中，都比CVA21-ΔV(2x)和CVA21-ΔV(1x)样品早2-3代在CVA21-686(2x)样品中检测到回复突变体。这一数据提示用微小RNA反应元件直接插入来延迟扫描区降低遗传稳定性，该效应在体内更显著。
用微小RNA反应元件替换核糖体扫描区可最大程度地减少结构改变的可能性。
与3'NCR的复杂结构环境相比，CVA21的5'NCR预计紧接着IRES的下游有一个无序的扫描区。尚不知道该结构域在CVA21复制中的作用。尽管已知该区域对于脊髓灰质炎病毒的体外和体内复制都是可有可无的，但它被认为参与增强肠病毒71翻译的IRES反式作用因子结合。RNA二级结构分析预测，CVA21-ΔV(2x)构型可保留IRES内的结构域VI，因此应当不会显著影响核糖体的加载和翻译(图13)。5'NCR内插入不影响假结形成，不像3'NCR内任意位置插入那样。如图13D-F所示，虽然TR(2x)构建体将微小RNA反应元件与oriR环(Y和X结构域)隔开，但结构域Y与结构域X之间的预测拟假结相互作用仍然丢失，如环间连线所示。
潜在的用于CVA21-ΔV(2x)治疗的感染性核酸制剂
可采用快速产生本真病毒基因组的机制来改进CVA21-ΔV(2x)感染性核酸疗法。此类机制之一是在5’和3’末端编码核酶。核酶是具有催化活性的RNA分子(结构)。某些核酶能够在非常特异性的位点顺式(in cis)或反式(in trans)切割RNA分子。在编码CVA21-ΔV(2x)的感染性核酸制剂中在病毒基因组5’和/或3’末端编码核酶还可以进一步提高治疗效果。
制造了5种构建体来检测这一假设。第一种包含紧接在CVA21-ΔV(2x)基因组上游的核酶(Rz-CVA21-ΔV(2x))。该核酶被改造成允许在CVA21-ΔV(2x)基因组准确5’末端的顺式切割。第二种构建体包含紧接在CVA21-ΔV(2x)基因组下游的另一不同核酶(CVA21-ΔV(2x)-Rz)，它顺式切割直接位于CVA21-ΔV(2x)的编码聚A尾下游的RNA。第三种构建体包含NheI限制性酶切位点，所述位点紧邻质粒DNA中编码的病毒基因组的聚A尾。NheI切割位点用于产生线性转录本，使得聚A尾后只有少数残基。第四种构建体在CVA21-ΔV(2x)基因组5'末端有核酶，在聚A尾之后有NheI切割位点(Rz-CVA21-ΔV(2x)-3’NheI)。第五种构建体包含CVA21-ΔV(2x)基因组及其侧接的上述两种核酶(Rz-CVA21-ΔV(2x)-3’Rz)。合成RNA基因组，如同前文就无修饰CVA21-ΔV(2x)所述对其特异性感染力、靶向效果/特异性、遗传稳定性和治疗效果/安全性进行特征鉴定。如图14所示，具有两个本真或近乎本真末端的两个构建体(即分别为Rz-CVA21-ΔV(2x)-3’Rz和Rz-CVA21-ΔV(2x)-3’NheI)与无修饰CVA21-ΔV(2x)RNA相比均具有更高的特异性感染力，且转染H1-HeLa细胞后更快观察到细胞病变效应。在CB-17SCID小鼠中，这两种构建体都表现出对皮下Mel624异种移植瘤的溶瘤活性(图15A)。处理后第2天和第7天受治小鼠发生病毒血症，由此可见两种构建体也都能够产生弥漫性溶瘤感染(图15B)。
Rz-CVA21-ΔV(2x)-3’NheI比CVA21-ΔV(2x)和Rz-CVA21-ΔV(2x)-3’Rz更有效，Rz-CVA21-ΔV(2x)-3’NheI处理小鼠中的病毒血症更具有一致性。核酶编码序列和限制酶切割位点的不同组合(将外源添加的限制酶设计成在那些切割位点切割)可用于调节感染性RNA制剂的特异性感染力和治疗潜力。这可包括但不限于所述构建体在各种肿瘤微环境和递送途径中的免疫原性潜力。
异种肿瘤细胞的初始播种不依赖于病毒受体的表达，但扩散和安全性仍依赖于ICAM-1和/或衰变促进因子的表达。
鼠黑素瘤B16-F10细胞对CVA21不易感，因为它们不表达病毒受体。通过慢病毒转导、抗生素选择、单细胞分选和克隆种群扩增产生稳定表达hICAM-1的B16-F10细胞系。CVA21-ΔV(2x)按MOI为1感染后24小时该细胞系B16-F10-hICAM1的病毒收获显著高于亲本细胞系(图16)。这一作用也适用于不表达病毒进入受体的其他细胞系，可由此扩大体内模型储备。感染性核酸可用于扩大肿瘤细胞的初始播种范围使之包括不表达病毒受体的细胞，同时保持病毒产生后播散的特异性。细胞类型特异性可以通过掺入不同的微小RNA靶序列来进一步调节。
体外转录反应可升级到CVA21-ΔV(2x)感染性RNA的临床制备
临床前研究采用体外来源RNA转录试剂盒生成RNA转录本。每10微升反应将产生约100微克RNA用于体内研究。为了证明在没有市售试剂盒的情况下生产方法升级的可行性，建立了相似的反应并将其升级至1mL(100x)，并用氯化锂沉淀纯化所得转录本。通过RNA凝胶电泳观察到，这种升级反应产生了超过7毫克的RNA，完整性接近10微升反应(图17)。
对体外来源的感染性核酸的修饰可用于增强不同环境中的稳定性。
可采用多种机制来增强RNA在血液中的稳定性和细胞内化后的翻译能力。这些技术包括但不限于在体外转录中使用修饰碱基(例如N-甲基假尿嘧啶)来生成与正常存在于待治宿主中的RNA非常相似的RNA，加帽机制和转录物的聚腺苷酸化。所有这些机制以及其他增强核酸疗法稳定性、递送、摄取和表达的机制都可用于感染性核酸疗法。这些机制还可用于针对各个患者调节感染性核酸的免疫原性。另外，可以通过使核酸与多种不同的运载体分子复合来增强感染性核酸的递送，所述运载体分子包括但不限于基于脂质的、基于聚合物的、基于纳米粒子的运载体分子以及其他生物合成分子。
实施例3：制造的成本降低与简化
每种溶瘤病毒的制造方案各不相同，但是，生产和纯化具有足够感染性粒子滴度的大量病毒所需的一般程序是类似的。生成GMP主细胞库和主种子病毒并进行质量认证。使用优化的培养基配方对这些细胞进行接种和扩增，直到建立足够数量的细胞。通常将这些细胞接种到大型生物反应器中以进一步扩增和感染。收获病毒，这通常需要裂解和/或去除细胞碎片来澄清，然后酶消化残留核酸并纯化裂解物。下游纯化工艺可包括各种超滤和透析步骤以及色谱纯化(例如离子交换和凝胶渗透)。接下来是另一个过滤步骤，然后装瓶和储存。RNA治疗剂的生产所需步骤较少，并可升级为以较小的体积(即较小的生物反应器)获得更高的产量。生产感染性RNA的步骤较少且较简单。制备编码病毒基因组的线性质粒DNA主库。将其用于体外转录反应(通常每批约1L)来生产感染性RNA。用DNA酶消化去除残留质粒DNA，然后通过沉淀或柱过滤纯化感染性RNA。可用HPLC或FPLC纯化去除其他污染物以确保纯度。相比当前基于mRNA的治疗方法，CVA21-ΔV(2x)转录本不需要加帽和加尾，由此减少了采用体外转录GMP方案进行合成和纯化的成本/步骤。溶瘤性CVA21病毒可在临床上与免疫疗法联合使用。
实施例4：加强病毒单药疗法的潜力
将CVA21配制为感染性核酸具有安全增强其单药治疗效能的潜力。核酸的免疫原性低于病毒颗粒，从而提供了避免重复给药过程中中和抗体的机制。即使在重复注射期间中和抗体存在下感染性核酸递送也可以感染细胞，中和抗体的存在增强治疗的溶瘤阶段，这可以增强治疗的整体效果。此外，感染性核酸不局限于表达病毒受体(例如人细胞内粘附分子I)的肿瘤细胞。肿瘤细胞的初始播散将包括通常耐病毒感染的细胞，从而克服肿瘤异质性的障碍。该策略可以应用于其他溶瘤性小核糖核酸病毒。
实施例5：更高的安全性扩大了患者资格范围
数种晚期恶性肿瘤的患者中的I期和II期临床试验已显示CVA21的耐受性。然而，迄今为止的研究仅限于免疫系统功能健全的患者。尽管在人类中很少见，但CVA21会在特别脆弱的免疫缺陷宿主中引起肌炎。因此，开发不能在肌肉细胞中复制的CVA21将使临床分析能够扩展到免疫系统不全的患者。CVA21-ΔV(2x)具有微小RNA反应元件，该元件包括被肌肉组织中富含的微小RNA所识别的序列。该元件减少表达同源微小RNA的细胞中的病毒复制，并改善在接受CVA21处理的带有皮下肿瘤的免疫缺陷小鼠中观察到的毒性。包括CVA21-ΔV(2x)在内的微小RNA靶向病毒可用于提高免疫低下患者溶瘤疗法的安全性。
其它实施方式
应理解，虽然结合具体说明描述了本发明，但上述说明旨在阐释而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书来限定。其他方面、优点和改进也在下述权利要求书的范围内。
序列表
<110> 梅约医学教育与研究基金会（Mayo Foundation for Medical Education andResearch）
<120> 用感染性核酸治疗癌症
<130> 07039-1756WO1
<150> US 62/641,814
<151> 2018-03-12
<160> 69
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 肌肉靶向的反应元件
<400> 1
acagctggtt gaaggggacc aactggagcc acacacttcc ttacattcca 50
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acagctggtt gaaggggacc aacgatacag ctggttgaag gggaccaact ggagccacac 60
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<220>
<223> 柯萨基病毒 3' UTR
<400> 3
cgacucauuu uaguaacccu accucagucg gauuggauug gguuauacug uuguaggggu 60
aaauuuuucu uuaauucgga gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 100
<210> 4
<211> 123
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 柯萨基病毒 3'末端重复
<400> 4
cgacucauuu uaguaaggcg cgccgacuca uuuuaguaac ccuaccucag ucggauugga 60
uuggguuaua cuguuguagg gguaaauuuu ucuuuaauuc ggagaaaaaa aaaaaaaaaa 120
aaa 123
<210> 5
<211> 10477
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 编码感染性核酸的DNA
<400> 5
ttaaaacagc tctggggttg ttcccacccc agaggcccac gtggcggcta gtactctggt 60
attacggtac ctttgtacgc ctgttttgta tcccttcccc cgtaacttta gaagcttatc 120
aaaagttcaa tagcaggggt acaaaccagt acctctacga acaagcactt ctgtttcccc 180
ggtgatatca catagactgt acccacggtc aaaagtgatt gatccgttat ccgcttgagt 240
acttcgagaa gcctagtatc accttggaat cttcgatgcg ttgcgctcaa cactctgccc 300
cgagtgtagc ttaggctgat gagtctgggc actccccacc ggcgacggtg gcccaggctg 360
cgttggcggc ctacccatgg ctgatgccgt gggacgctag ttgtgaacaa ggtgtgaaga 420
gcctattgag ctactcaaga gtcctccggc ccctgaatgc ggctaatcct aaccacggag 480
caaccgctca caacccagtg agtaggttgt cgtaatgcgt aagtctgtgg cggaaccgac 540
tactttgggt gtccgtgttt ccctttatat tcatactggc tgcttatggt gacaatttac 600
aaattgttac catatagcta ttggattggc cacccagtat tgtgcaatat atttgagtgt 660
ttctttcata agccttatta acatcacatt tttaatcaca ataaacagtg caaatggggg 720
ctcaagtttc aacgcaaaag accggtgcgc acgagaatca aaacgtggca gccaatggat 780
ccaccattaa ttacactact atcaactatt acaaagacag tgcgagtaat tccgctacta 840
gacaagacct ctcccaagat ccatcaaaat tcacagaacc ggttaaggac ttaatgttga 900
aaacagcacc agctctaaac tcgcctaacg tggaagcatg tgggtacagt gaccgtgtga 960
ggcaaatcac tttaggcaac tcgactatta ctacacaaga agcagccaat gctattgttg 1020
cttacggtga atggcccact tacataaatg attcagaagc taatccggta gatgcaccca 1080
ctgagccaga cgttagtagc aaccggtttt acaccctaga atcggtgtct tggaagacca 1140
cttcaagggg atggtggtgg aagttaccag attgtttgaa ggacatggga atgtttggtc 1200
agaatatgta ctatcactac ttggggcgct ctggttacac cattcatgtc cagtgcaacg 1260
cttcaaaatt tcaccaaggg gcgttaggag ttttcctgat accagagttt gtcatggctt 1320
gcaacactga gagtaaaacg tcatacgttt catacatcaa tgcaaatcct ggtgagagag 1380
gcggtgagtt tacgaacacc tacaatccgt caaatacaga cgccagtgag ggcagaaagt 1440
ttgcagcatt ggattatttg ctgggttctg gtgttctagc aggaaacgcc tttgtgtacc 1500
cgcaccagat catcaaccta cgtaccaaca acagtgcaac aattgtggtg ccatacgtaa 1560
actcacttgt gattgattgt atggcaaaac acaataactg gggcattgtc atattaccac 1620
tggcaccctt ggcctttgcc gcaacatcgt caccacaggt gcctattaca gtgaccattg 1680
cacccatgtg tacagaattc aatgggttga gaaacatcac cgtcccagta catcaagggt 1740
tgccgacaat gaacacacct ggttccaatc aattccttac atctgatgac ttccagtcgc 1800
cctgtgcctt acctaatttt gatgttactc caccaataca catacccggg gaagtaaaga 1860
atatgatgga actagctgaa attgacacat tgatcccaat gaacgcagtg gacgggaagg 1920
tgaacacaat ggagatgtat caaataccat tgaatgacaa tttgagcaag gcacctatat 1980
tctgtttatc cctatcacct gcttctgata aacgactgag ccacaccatg ttgggtgaaa 2040
tcctaaatta ttacacccat tggacggggt ccatcaggtt cacctttcta ttttgtggca 2100
gtatgatggc cactggtaaa ctgctcctca gctattcccc accgggagct aaaccaccaa 2160
ccaatcgcaa ggatgcaatg ctaggcacac acatcatctg ggacctaggg ttacaatcca 2220
gttgttccat ggttgcaccg tggatctcca acacagtgta cagacggtgt gcacgtgatg 2280
acttcactga gggcggattt ataacttgct tctatcaaac tagaattgtg gtacctgctt 2340
caacccctac cagtatgttc atgttaggct ttgttagtgc gtgtccagac ttcagtgtca 2400
gactgcttag ggacactccc catattagtc aatcgaaact aataggacgt acacaaggca 2460
ttgaagacct cattgacaca gcgataaaga atgccttaag agtgtcccaa ccaccctcga 2520
cccagtcaac tgaagcaact agtggagtga atagccagga ggtgccagct ctaactgctg 2580
tggaaacagg agcatctggt caagcaatcc ccagtgatgt ggtggaaact aggcacgtgg 2640
taaattacaa aaccaggtct gaatcgtgtc ttgagtcatt ctttgggaga gctgcgtgtg 2700
tcacaatcct atccttgacc aactcctcca agagcggaga ggagaaaaag catttcaaca 2760
tatggaatat tacatacacc gacactgtcc agttacgcag aaaattagaa tttttcacgt 2820
attccaggtt tgatcttgaa atgacttttg tattcacaga gaactatcct agtacagcca 2880
gtggagaagt gcgaaaccag gtgtaccaga tcatgtatat tccaccaggg gcaccccgcc 2940
catcatcctg ggatgactac acatggcaat cctcttcaaa cccttccatc ttctacatgt 3000
atggaaatgc acctccacgg atgtcaattc cttacgtagg gattgccaat gcctattcac 3060
acttctacga tggctttgca cgggtgccac ttgagggtga gaacaccgat gctggcgaca 3120
cgttttacgg tttagtgtcc ataaatgatt ttggagtttt agcagttaga gcagtaaacc 3180
gcagtaatcc acatacaata cacacatctg tgagagtgta catgaaacca aaacacattc 3240
ggtgttggtg ccccagacct cctcgagctg tattatacag gggagaggga gtggacatga 3300
tatccagtgc aattctacct ctggccaagg tagactcaat taccactttt gggtttggtc 3360
atcagaacaa agcagtgtac gttgccggtt acaagatttg caactaccac ctagcaaccc 3420
caagtgatca cttgaatgca attagtatgt tatgggacag ggatttaatg gtggtggaat 3480
ctagagcccg gggaactgat accatcgcca gatgtagttg caggtgtgga gtttactatt 3540
gtgaatctag gaggaagtac taccctgtca cttttactgg cccaacgttt cgattcatgg 3600
aagcaaacga ctactatcca gcaagatacc agtctcacat gctgataggg tgcggatttg 3660
cagaacccgg ggactgcggt gggatactga ggtgcactca tggggtaatt ggtatcatta 3720
ctgcaggagg tgaaggggta gtagcctttg ctgacattag agacctctgg gtgtatgaag 3780
aggaggccat ggaacaggga ataacaagct acatcgaatc tctcggcaca gcctttggcg 3840
cagggttcac ccacacaatc agtgagaaag tgactgaatt gacaacgatg gttaccagca 3900
ctatcacaga aaaactactg aaaaacttgg tgaaaatagt gtcggctcta gtgattgttg 3960
tgagaaatta tgaggacact accacgatcc ttgcaacact agcactactc gggtgtgata 4020
tatctccttg gcaatggttg aagaagaagg catgtgactt actagagatt ccttatgtga 4080
tgcgccaagg tgatgggtgg atgaagaaat tcacagaggc gtgcaatgca gctaaaggct 4140
tagagtggat tagcaacaaa atttccaagt ttatagattg gttgaagtgt aaaattatcc 4200
cagacgctaa ggacaaggtg gaatttctca ccaagttgaa acagctagac atgttggaaa 4260
atcaaattgc aaccatccac caatcttgcc ccagccaaga acaacaagag attcttttca 4320
acaatgtgag atggttagca gtccagtccc gtcggtttgc accattatac gctgtggagg 4380
cacgccgaat taacaaaatg gagagcacaa taaacaatta tatacagttc aagagcaaac 4440
accgtattga accagtatgt atgctcattc atgggtcacc agggacgggt aaatctatag 4500
ctacttcatt aataggtaga gcaatagcag agaaggaaag cacatcagtc tattcaatgc 4560
cacctgaccc atctcacttt gatggctata aacaacaagg ggtagtgatt atggacgacc 4620
taaaccaaaa ccccgatggt atggacatga aactgttttg ccaaatggta tcaacagtgg 4680
agtttattcc tccaatggcc tcattagagg agaagggcat tttgtttaca tctgattatg 4740
tcctggcttc taccaactct cattcaattg taccacccac agtggctcac agtgatgcct 4800
taaccagacg atttgcattt gatgtggagg tttacacgat gtctgaacat tcagtcaaag 4860
gcaaactgaa tatggccacg gccactcaat tgtgtaagga ttgtccaaca cctgcaaatt 4920
ttaaaaagtg ttgccctctc gtttgtggaa aggccttgca attaatggac aggtacacca 4980
gacaaaggtt cactgtagat gagattacca cattaatcat gaatgagaaa aacagaaggg 5040
ccaatatcgg caattgcatg gaagccttgt ttcaaggacc actaaggtat aaagatttga 5100
agatcgatgt gaagacagtt cccccccctg agtgcatcag tgatttgtta caagcagtgg 5160
attctcaaga ggttagggat tactgtgaga agaaaggctg gatcgttaac gttactagcc 5220
agattcaact agaaaggaac atcaataggg ccatgactat actccaagct gttaccacat 5280
tcgcagcagt cgcaggagta gtgtatgtaa tgtacaaact cttcgccggt caacagggtg 5340
catacactgg cttgccaaac aaaaaaccca atgtccctac tatcagagtc gctaaagtcc 5400
aggggccagg atttgactac gcagtggcaa tggcaaaaag aaacatagtt actgcaacca 5460
ccaccaaggg tgaatttacc atgctagggg tgcatgataa tgtagcaata ttgccaaccc 5520
atgccgctcc aggagaaacc attattattg atgggaaaga agtagagatc ctagacgcca 5580
gagccttaga agatcaagcg ggaaccaatc ttgagatcac cattattact ctaaaaagaa 5640
atgagaagtt tagagacatc agatcacata ttcccaccca aattactgaa actaacgatg 5700
gagtgttgat cgtgaacact agcaagtacc ccaatatgta tgtccccgtt ggtgctgtga 5760
ccgaacaggg atatcttaat ctcagtggac gtcaaactgc tcgcacttta atgtacaact 5820
ttccaacaag ggcaggccag tgcggaggaa tcatcacttg tactggcaaa gtcattggga 5880
tgcatgttgg cgggaacggt tcacatgggt ttgctgcagc cctcaagcga tcatacttca 5940
ctcaaaatca gggcgaaatc cagtggatga ggtcatcaaa agaagtgggg taccccatta 6000
taaatgcccc atccaagaca aagttagaac ccagtgcttt ccactatgtt tttgaaggtg 6060
ttaaggaacc agctgtactc actaagaatg accccagact aaaaacagat tttgaagaag 6120
ccatcttttc taaatatgtg gggaacaaaa ttactgaagt ggacgagtac atgaaagaag 6180
cagtggatca ctatgcagga cagttaatgt cactggatat caacacagaa cagatgtgcc 6240
tggaggatgc catgtacggt accgatggtc ttgaggccct ggatcttagc actagtgctg 6300
gatatcctta tgttgcaatg gggaaaaaga aaagagacat tctagataaa cagaccagag 6360
atactaagga gatgcagaga cttttagata cctatggaat caatctacca ttagtcacgt 6420
acgtgaaaga tgaactcagg tcaaagacta aagtggaaca aggaaagtca agattgattg 6480
aagcttccag ccttaatgat tcagttgcaa tgagaatggc ctttggcaat ctttacgcag 6540
ctttccacaa gaatccaggt gtggtgacag gatcagcagt tggttgtgac ccagatttgt 6600
tttggagtaa gataccagtg ctaatggaag aaaaactctt cgcttttgac tacacagggt 6660
atgatgcctc actcagccct gcttggtttg aagctcttaa aatggtgtta gaaaaaattg 6720
gatttggcag tagagtagac tatatagact acctgaacca ctctcaccac ctttacaaaa 6780
acaagactta ttgtgtcaaa ggcggcatgc catccggctg ctctggcacc tcaattttca 6840
actcaatgat taacaacctg atcattagga cgcttttact gagaacctac aagggcatag 6900
acttggacca tttaaaaatg attgcctatg gtgatgacgt gatagcttcc tacccccatg 6960
aggttgacgc tagtctccta gcccaatcag gaaaagacta tggactaacc atgactccag 7020
cagataaatc agcaaccttt gaaacagtca catgggagaa tgtaacattt ctgaaaagat 7080
ttttcagagc agatgagaag tatccattcc tggtgcatcc agtgatgcca atgaaagaaa 7140
ttcacgaatc aatcagatgg accaaggacc ctagaaacac acaggatcac gtacgctcgt 7200
tgtgcctatt agcttggcac aacggtgaag aagaatacaa taaattttta gctaaaatca 7260
gaagtgtgcc aatcggaaga gctttattgc tcccagagta ctctacattg taccgccgat 7320
ggctcgactc attttagtaa ccctacctca gtcggattgg attgggttat actgttgtag 7380
gggtaaattt ttctttaatt cggagaaaaa aaaaaaaaaa aaaagagctc ccaatcacta 7440
gtgaattcgc ggccgcctgc aggtcgacca tatgggagag ctcccaacgc gttggatgca 7500
tagcttgagt attctatagt gtcacctaaa tagcttggcg taatcatggt catagctgtt 7560
tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa 7620
gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact 7680
gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc 7740
ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg 7800
ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc 7860
cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag 7920
gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca 7980
tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca 8040
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atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag 8160
gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt 8220
tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca 8280
cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg 8340
cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt 8400
tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc 8460
cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg 8520
cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg 8580
gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta 8640
gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg 8700
gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg 8760
ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc 8820
atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc 8880
agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc 8940
ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag 9000
tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat 9060
ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg 9120
caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt 9180
gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag 9240
atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg 9300
accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt 9360
aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct 9420
gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac 9480
tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat 9540
aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat 9600
ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca 9660
aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gatgcggtgt gaaataccgc 9720
acagatgcgt aaggagaaaa taccgcatca ggaaattgta agcgttaata ttttgttaaa 9780
attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc attttttaac caataggccg aaatcggcaa 9840
aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa 9900
caagagtcca ctattaaaga acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca 9960
gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg 10020
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<210> 6
<211> 10474
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 编码感染性核酸的DNA
<400> 6
ttaaaacagc tctggggttg ttcccacccc agaggcccac gtggcggcta gtactctggt 60
attacggtac ctttgtacgc ctgttttgta tcccttcccc cgtaacttta gaagcttatc 120
aaaagttcaa tagcaggggt acaaaccagt acctctacga acaagcactt ctgtttcccc 180
ggtgatatca catagactgt acccacggtc aaaagtgatt gatccgttat ccgcttgagt 240
acttcgagaa gcctagtatc accttggaat cttcgatgcg ttgcgctcaa cactctgccc 300
cgagtgtagc ttaggctgat gagtctgggc actccccacc ggcgacggtg gcccaggctg 360
cgttggcggc ctacccatgg ctgatgccgt gggacgctag ttgtgaacaa ggtgtgaaga 420
gcctattgag ctactcaaga gtcctccggc ccctgaatgc ggctaatcct aaccacggag 480
caaccgctca caacccagtg agtaggttgt cgtaatgcgt aagtctgtgg cggaaccgac 540
tactttgggt gtccgtgttt ccctttatat tcatactggc tgcttatggt gacaatttac 600
aaattgttac catatagcta ttggattggc gcgccgcaca gctggttgaa ggggaccaac 660
tggagccaca cacttcctta cattccacgg cgcgccaata aacagtgcaa atgggggctc 720
aagtttcaac gcaaaagacc ggtgcgcacg agaatcaaaa cgtggcagcc aatggatcca 780
ccattaatta cactactatc aactattaca aagacagtgc gagtaattcc gctactagac 840
aagacctctc ccaagatcca tcaaaattca cagaaccggt taaggactta atgttgaaaa 900
cagcaccagc tctaaactcg cctaacgtgg aagcatgtgg gtacagtgac cgtgtgaggc 960
aaatcacttt aggcaactcg actattacta cacaagaagc agccaatgct attgttgctt 1020
acggtgaatg gcccacttac ataaatgatt cagaagctaa tccggtagat gcacccactg 1080
agccagacgt tagtagcaac cggttttaca ccctagaatc ggtgtcttgg aagaccactt 1140
caaggggatg gtggtggaag ttaccagatt gtttgaagga catgggaatg tttggtcaga 1200
atatgtacta tcactacttg gggcgctctg gttacaccat tcatgtccag tgcaacgctt 1260
caaaatttca ccaaggggcg ttaggagttt tcctgatacc agagtttgtc atggcttgca 1320
acactgagag taaaacgtca tacgtttcat acatcaatgc aaatcctggt gagagaggcg 1380
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accagatcat caacctacgt accaacaaca gtgcaacaat tgtggtgcca tacgtaaact 1560
cacttgtgat tgattgtatg gcaaaacaca ataactgggg cattgtcata ttaccactgg 1620
cacccttggc ctttgccgca acatcgtcac cacaggtgcc tattacagtg accattgcac 1680
ccatgtgtac agaattcaat gggttgagaa acatcaccgt cccagtacat caagggttgc 1740
cgacaatgaa cacacctggt tccaatcaat tccttacatc tgatgacttc cagtcgccct 1800
gtgccttacc taattttgat gttactccac caatacacat acccggggaa gtaaagaata 1860
tgatggaact agctgaaatt gacacattga tcccaatgaa cgcagtggac gggaaggtga 1920
acacaatgga gatgtatcaa ataccattga atgacaattt gagcaaggca cctatattct 1980
gtttatccct atcacctgct tctgataaac gactgagcca caccatgttg ggtgaaatcc 2040
taaattatta cacccattgg acggggtcca tcaggttcac ctttctattt tgtggcagta 2100
tgatggccac tggtaaactg ctcctcagct attccccacc gggagctaaa ccaccaacca 2160
atcgcaagga tgcaatgcta ggcacacaca tcatctggga cctagggtta caatccagtt 2220
gttccatggt tgcaccgtgg atctccaaca cagtgtacag acggtgtgca cgtgatgact 2280
tcactgaggg cggatttata acttgcttct atcaaactag aattgtggta cctgcttcaa 2340
cccctaccag tatgttcatg ttaggctttg ttagtgcgtg tccagacttc agtgtcagac 2400
tgcttaggga cactccccat attagtcaat cgaaactaat aggacgtaca caaggcattg 2460
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attacaaaac caggtctgaa tcgtgtcttg agtcattctt tgggagagct gcgtgtgtca 2700
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tctacgatgg ctttgcacgg gtgccacttg agggtgagaa caccgatgct ggcgacacgt 3120
tttacggttt agtgtccata aatgattttg gagttttagc agttagagca gtaaaccgca 3180
gtaatccaca tacaatacac acatctgtga gagtgtacat gaaaccaaaa cacattcggt 3240
gttggtgccc cagacctcct cgagctgtat tatacagggg agagggagtg gacatgatat 3300
ccagtgcaat tctacctctg gccaaggtag actcaattac cacttttggg tttggtcatc 3360
agaacaaagc agtgtacgtt gccggttaca agatttgcaa ctaccaccta gcaaccccaa 3420
gtgatcactt gaatgcaatt agtatgttat gggacaggga tttaatggtg gtggaatcta 3480
gagcccgggg aactgatacc atcgccagat gtagttgcag gtgtggagtt tactattgtg 3540
aatctaggag gaagtactac cctgtcactt ttactggccc aacgtttcga ttcatggaag 3600
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gccaaggtga tgggtggatg aagaaattca cagaggcgtg caatgcagct aaaggcttag 4140
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acgctaagga caaggtggaa tttctcacca agttgaaaca gctagacatg ttggaaaatc 4260
aaattgcaac catccaccaa tcttgcccca gccaagaaca acaagagatt cttttcaaca 4320
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gtattgaacc agtatgtatg ctcattcatg ggtcaccagg gacgggtaaa tctatagcta 4500
cttcattaat aggtagagca atagcagaga aggaaagcac atcagtctat tcaatgccac 4560
ctgacccatc tcactttgat ggctataaac aacaaggggt agtgattatg gacgacctaa 4620
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ttattcctcc aatggcctca ttagaggaga agggcatttt gtttacatct gattatgtcc 4740
tggcttctac caactctcat tcaattgtac cacccacagt ggctcacagt gatgccttaa 4800
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agaagtttag agacatcaga tcacatattc ccacccaaat tactgaaact aacgatggag 5700
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cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat 8640
ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc 8700
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ctatagggcg aattgggccc gacgtcgcat gctcccggcc gccatggcgg ccgcgggaat 10440
tcgattgagg catgctaata cgactcacta tagg 10474
<210> 7
<211> 10526
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 编码感染性核酸的DNA
<400> 7
ttaaaacagc tctggggttg ttcccacccc agaggcccac gtggcggcta gtactctggt 60
attacggtac ctttgtacgc ctgttttgta tcccttcccc cgtaacttta gaagcttatc 120
aaaagttcaa tagcaggggt acaaaccagt acctctacga acaagcactt ctgtttcccc 180
ggtgatatca catagactgt acccacggtc aaaagtgatt gatccgttat ccgcttgagt 240
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tactttgggt gtccgtgttt ccctttatat tcatactggc tgcttatggt gacaatttac 600
aaattgttac catatagcta ttggattggc gcgccgcaca gctggttgaa ggggaccaac 660
gatacagctg gttgaagggg accaactgga gccacacact tccttacatt ccatcaccca 720
cacacttcct tacattccac ggcgcgccaa taaacagtgc aaatgggggc tcaagtttca 780
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tacactacta tcaactatta caaagacagt gcgagtaatt ccgctactag acaagacctc 900
tcccaagatc catcaaaatt cacagaaccg gttaaggact taatgttgaa aacagcacca 960
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ttaggcaact cgactattac tacacaagaa gcagccaatg ctattgttgc ttacggtgaa 1080
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tactatccag caagatacca gtctcacatg ctgatagggt gcggatttgc agaacccggg 3720
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aggaggccat ggaacaggga ataacaagct acatcgaatc tctcggcaca gcctttggcg 3840
cagggttcac ccacacaatc agtgagaaag tgactgaatt gacaacgatg gttaccagca 3900
ctatcacaga aaaactactg aaaaacttgg tgaaaatagt gtcggctcta gtgattgttg 3960
tgagaaatta tgaggacact accacgatcc ttgcaacact agcactactc gggtgtgata 4020
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tgcgccaagg tgatgggtgg atgaagaaat tcacagaggc gtgcaatgca gctaaaggct 4140
tagagtggat tagcaacaaa atttccaagt ttatagattg gttgaagtgt aaaattatcc 4200
cagacgctaa ggacaaggtg gaatttctca ccaagttgaa acagctagac atgttggaaa 4260
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caacgcgttg gatgcatagc ttgagtattc tatagtgtca cctaaatagc ttggcgtaat 7680
catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac 7740
gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa 7800
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tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgatg 9840
cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggaa attgtaagcg 9900
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<212> RNA
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<212> RNA
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uguaaacauc cuacacucuc agc 23
<210> 64
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 微小RNA
<400> 64
uauugcacau uacuaaguug c 21
<210> 65
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 微小RNA
<400> 65
uuuguucguu cggcucgcgu ga 22
<210> 66
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 微小RNA
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uggaagacua gugauuuugu ug 22
<210> 67
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工
<220>
<223> 微小RNA
<400> 67
ucuuugguua ucuagcugua uga 23
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<211> 22
<212> RNA
<213> 人工
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<223> 微小RNA
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uucaacgggu auuuauugag ca 22
<210> 69
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工
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<223> 微小RNA
<400> 69
cacccguaga accgaccuug cg 22

Claims (83)

1.一种核酸构建体，所述构建体包含感染性核酸，所述感染性核酸包含小核糖核酸病毒基因组，所述小核糖核酸病毒基因组包含一个或多个20或更多个碱基的异源序列元件，所述构建体的特异性感染力足以在给活体哺乳动物给药时引发弥漫性小核糖核酸病毒感染，所述构建体的特异性感染力与缺少所述一个或多个异源序列元件的可比构建体的特异性感染力量级相似。
2.如权利要求1所述的构建体，其中，所述哺乳动物是人。
3.如权利要求1-2中任一项所述的构建体，其中，所述构建体配制成质粒DNA。
4.如权利要求1-3中任一项所述的构建体，其中，所述构建体配制成RNA分子。
5.如权利要求1-4中任一项所述的构建体，其中，所述一个或多个异源序列元件中至少一个是微小RNA反应元件。
6.如权利要求5所述的构建体，其中，所述微小RNA反应元件的微小RNA靶元件至少包含与非癌细胞中的微小RNA互补的区域。
7.如权利要求1-6中任一项所述的构建体，其中，所述一个或多个异源序列元件中至少一个是组织特异性微小RNA反应元件。
8.如权利要求1-7中任一项所述的构建体，其中，所述一个或多个异源序列元件中至少一个是肌肉特异性、脑特异性或心脏特异性微小RNA反应元件。
9.如权利要求1-8中任一项所述的构建体，其中，所述一个或多个异源序列元件中至少一个插入所述小核糖核酸病毒基因组的5’非编码区取代扫描区内的核苷酸。
10.如权利要求1-9中任一项所述的构建体，其中，所述小核糖核酸病毒基因组包含I型内部核糖体进入位点。
11.如权利要求1-10中任一项所述的构建体，其中，所述小核糖核酸病毒基因组是柯萨基病毒、脊髓灰质炎病毒、艾柯病毒、鼻病毒或肠病毒基因组。
12.如权利要求1-11中任一项所述的构建体，其中，所述小核糖核酸病毒基因组是柯萨基病毒A21基因组。
13.如权利要求1-12中任一项所述的构建体，其中，所述小核糖核酸病毒基因组包含针对miR-133的微小RNA靶元件。
14.如权利要求1-13中任一项所述的构建体，其中，所述小核糖核酸病毒基因组包含超过一个针对miR-133的微小RNA靶元件。
15.如权利要求1-14中任一项所述的构建体，其中，所述小核糖核酸病毒基因组包含针对miR-206的微小RNA靶元件。
16.如权利要求1-15中任一项所述的构建体，其中，所述小核糖核酸病毒基因组包含超过一个针对miR-206的微小RNA靶元件。
17.如权利要求1-16中任一项所述的构建体，其中，所述小核糖核酸病毒基因组包含超过一个针对miR-133的微小RNA靶元件和超过一个针对miR-206的微小RNA靶元件。
18.如权利要求1-17中任一项所述的构建体，其中，所述小核糖核酸病毒基因组是柯萨基病毒A21基因组，所述小核糖核酸病毒基因组缺少野生型柯萨基病毒A21基因组第631位至第698位至少20个核苷酸。
19.如权利要求1-18中任一项所述的构建体，其中，所述小核糖核酸病毒基因组是柯萨基病毒A21基因组，所述小核糖核酸病毒基因组缺少野生型柯萨基病毒A21基因组的第631位至第698位核苷酸。
20.如权利要求1-19中任一项所述的构建体，所述核酸构建体是DNA，且所述核酸构建体编码核酶。
21.如权利要求20所述的构建体，所述核酶设计成切割由所述核酸构建体转录所得RNA分子的RNA 5’部分，由此形成经核酶切割的RNA。
22.如权利要求20所述的构建体，所述经核酶切割的RNA的5’端没有小核糖核酸病毒基因组中不存在的核糖核苷酸。
23.如权利要求1-19中任一项所述的构建体，所述核酸构建体是RNA，且所述核酸构建体包含核酶。
24.如权利要求23所述的构建体，所述核酶设计成切割所述核酸构建体的RNA5’部分，由此形成经核酶切割的RNA。
25.如权利要求24所述的构建体，所述经核酶切割的RNA的5’端没有小核糖核酸病毒基因组中不存在的核糖核苷酸。
26.如权利要求1-19中任一项所述的构建体，所述核酸构建体是DNA，且所述核酸构建体包含限制性核酸内切酶切割位点。
27.如权利要求26所述的构建体，所述限制性核酸内切酶切割位点设计成允许由限制性核酸内切酶切割所述核酸构建体的3’部分，由此形成经限制性核酸内切酶切割的核酸构建体。
28.如权利要求27所述的构建体，所述经限制性核酸内切酶切割的核酸构建体编码3’端少于10个小核糖核酸病毒基因组中不存在的核糖核苷酸的病毒。
29.如权利要求27所述的构建体，所述经限制性核酸内切酶切割的核酸构建体编码3’端没有小核糖核酸病毒基因组中不存在的核糖核苷酸的病毒。
30.如权利要求1-19中任一项所述的构建体，所述核酸构建体是DNA，所述核酸构建体编码核酶，且所述核酸构建体包含限制性核酸内切酶切割位点。
31.如权利要求30所述的构建体，所述核酶设计成切割由所述核酸构建体转录所得RNA分子的RNA 5’部分，由此形成经核酶切割的RNA。
32.如权利要求30所述的构建体，所述经核酶切割的RNA的5’端没有小核糖核酸病毒基因组中不存在的核糖核苷酸。
33.如权利要求30所述的构建体，所述限制性核酸内切酶切割位点设计成允许由限制性核酸内切酶切割所述核酸构建体的3’部分，由此形成经限制性核酸内切酶切割的核酸构建体。
34.如权利要求30所述的构建体，所述经限制性核酸内切酶切割的核酸构建体编码3’端少于10个小核糖核酸病毒基因组中不存在的核糖核苷酸的病毒。
35.如权利要求30所述的构建体，所述经限制性核酸内切酶切割的核酸构建体编码3’端没有小核糖核酸病毒基因组中不存在的核糖核苷酸的病毒。
36.一种减少活体哺乳动物内癌细胞数量的方法，其中，所述方法包括将权利要求1-35中任一项所述的构建体给药到所述哺乳动物。
37.如权利要求36所述的方法，其中，所述哺乳动物是人。
38.如权利要求36或37所述的方法，所述癌细胞是黑素瘤、胰腺癌、前列腺癌，膀胱癌，非小细胞肺癌、骨髓瘤或乳腺癌细胞。
39.如权利要求36-38中任一项所述的方法，其中，相比将所述可比构建体给药到可比哺乳动物时发生裂解的非癌细胞数量，所述给药步骤使得所述给药步骤后所述哺乳动物内发生细胞裂解的非癌细胞数量降低。
40.如权利要求36-39中任一项所述的方法，其中，相比将所述可比构建体给药到可比哺乳动物时发生裂解的癌细胞数量，所述给药步骤使得所述给药步骤后所述活体哺乳动物内发生细胞裂解的癌细胞数量与之相近或升高。
41.一种减少活体哺乳动物中癌细胞数量的方法，其中，所述方法包括将权利要求1-35中任一项所述的构建体给药到所述哺乳动物，其中，所述癌细胞由于来自所述构建体的相应小核糖核酸病毒不受阻碍的合成而发生裂解，由此减少了所述活哺乳动物中的癌细胞数量。
42.如权利要求41所述的方法，其中，所述哺乳动物是人。
43.如权利要求41-42中任一项所述的方法，其中，所述癌细胞是黑素瘤、骨髓瘤或乳腺癌细胞。
44.如权利要求41-43中任一项所述的方法，其中，相比将所述可比构建体给药到可比哺乳动物时发生裂解的非癌细胞数量，所述给药步骤使得所述给药步骤后所述哺乳动物内发生细胞裂解的非癌细胞数量降低。
45.如权利要求41-44中任一项所述的方法，其中，相比将所述可比构建体给药到可比哺乳动物时发生裂解的癌细胞数量，所述给药步骤使得所述给药步骤后所述活体哺乳动物内发生细胞裂解的癌细胞数量与之相近或升高。
46.如权利要求41-45中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述哺乳动物给以抗癌药。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述抗癌药是检查点抑制剂。
48.如权利要求47所述的方法，所述检查点抑制剂选自：CTLA-4抑制剂、PD-1抑制剂和PD-L1抑制剂。
49.一种分离的编码柯萨基病毒的感染性核酸，其中，所述感染性核酸缺少野生型柯萨基病毒A21基因组第631位至698位至少20个核苷酸，并且，所述感染性核酸包含针对肌肉特异性微小RNA的微小RNA靶元件，所述微小RNA靶元件位于所述感染性核酸的VI结构域和本真翻译起始位点之间。
50.如权利要求49所述的分离的感染性核酸，其中，所述感染性核酸缺少所述第631位至第698位核苷酸。
51.如权利要求49-50中任一项所述的分离的感染性核酸，其中，所述肌肉特异性微小RNA是miR-133或miR-206。
52.如权利要求49-51中任一项所述的分离的感染性核酸，其中，所述感染性核酸包含位于第一位置和第二位置之间的所述微小RNA靶元件，其中，所述第一位置对应于所述野生型柯萨基病毒A21基因组的第631位，所述第二位置对应于所述野生型柯萨基病毒A21基因组的第699位。
53.如权利要求49-52中任一项所述的分离的感染性核酸，其中，所述感染性核酸是DNA，且所述感染性核酸编码核酶。
54.如权利要求53所述的分离的感染性核酸，所述核酶设计成切割由所述感染性核酸转录所得RNA分子的RNA 5’部分，由此形成经核酶切割的RNA。
55.如权利要求54所述的分离的感染性核酸，所述经核酶切割的RNA编码5’端没有小核糖核酸病毒基因组中不存在的核糖核苷酸的柯萨基病毒。
56.如权利要求49-52中任一项所述的分离的感染性核酸，其中，所述分离的感染性核酸是RNA，且所述分离的感染性核酸包含核酶。
57.如权利要求56所述的分离的感染性核酸，所述核酶设计成切割所述感染性核酸的RNA 5’部分，由此形成经核酶切割的RNA。
58.如权利要求56所述的分离的感染性核酸，所述经核酶切割的RNA编码5’端没有小核糖核酸病毒基因组中不存在的核糖核苷酸的柯萨基病毒。
59.如权利要求49-52中任一项所述的分离的感染性核酸，其中，所述感染性核酸是DNA，且所述感染性核酸包含限制性核酸内切酶切割位点。
60.如权利要求59所述的分离的感染性核酸，所述限制性核酸内切酶切割位点设计成允许由限制性核酸内切酶切割所述感染性核酸的3’部分，由此形成经限制性核酸内切酶切割的感染性核酸。
61.如权利要求60所述的分离的感染性核酸，所述经限制性核酸内切酶切割的感染性核酸编码3’端少于10个小核糖核酸病毒基因组中不存在的核糖核苷酸的柯萨基病毒。
62.如权利要求60所述的分离的感染性核酸，所述经限制性核酸内切酶切割的感染性核酸编码3’端没有小核糖核酸病毒基因组中不存在的核糖核苷酸的柯萨基病毒。
63.如权利要求49-52中任一项所述的分离的感染性核酸，其中，所述感染性核酸是RNA，所述感染性核酸编码核酶，且所述感染性核酸包含限制性核酸内切酶切割位点。
64.如权利要求63所述的分离的感染性核酸，所述核酶设计成切割由所述感染性核酸转录所得RNA分子的RNA 5’部分，由此形成经核酶切割的RNA。
65.如权利要求63所述的分离的感染性核酸体，所述经核酶切割的RNA的5’端没有小核糖核酸病毒基因组中不存在的核糖核苷酸。
66.如权利要求63所述的分离的感染性核酸，所述限制性核酸内切酶切割位点设计成允许由限制性核酸内切酶切割所述感染性核酸的RNA 3’部分，由此形成经限制性核酸内切酶切割的感染性核酸。
67.如权利要求66所述的分离的感染性核酸，所述经限制性核酸内切酶切割的感染性核酸编码3’端少于10个小核糖核酸病毒基因组中不存在的核糖核苷酸的柯萨基病毒。
68.如权利要求66所述的分离的感染性核酸，所述经限制性核酸内切酶切割的感染性核酸编码3’端没有小核糖核酸病毒基因组中不存在的核糖核苷酸的柯萨基病毒。
69.一种治疗哺乳动物中癌症的方法，所述方法包括向所述哺乳动物给以有效量的编码柯萨基病毒的感染性核酸，其中，所述感染性核酸缺少野生型柯萨基病毒A21基因组第631位至698位至少20个核苷酸，并且，所述感染性核酸包含针对肌肉特异性微小RNA的微小RNA靶元件，所述微小RNA靶元件位于所述感染性核酸的VI结构域和本真翻译起始位点之间。
70.如权利要求69所述的方法，其中，所述哺乳动物是人。
71.如权利要求69-70中任一项所述的方法，其中，所述癌症是黑素瘤、骨髓瘤或乳腺癌。
72.如权利要求69-70中任一项所述的方法，其中，所述感染性核酸缺少所述第631位至第698位核苷酸。
73.如权利要求69-72中任一项所述的分离的方法，其中，所述肌肉特异性微小RNA是miR-133或miR-206。
74.如权利要求69-73中任一项所述的方法，其中，所述感染性核酸包含位于第一位置和第二位置之间的所述微小RNA靶元件，其中，所述第一位置对应于所述野生型柯萨基病毒A21基因组的第631位，所述第二位置对应于所述野生型柯萨基病毒A21基因组的第699位。
75.如权利要求69-74中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述哺乳动物给以抗癌药。
76.如权利要求75所述的方法，其中所述抗癌药是检查点抑制剂。
77.如权利要求76所述的方法，所述检查点抑制剂选自：CTLA-4抑制剂、PD-1抑制剂和PD-L1抑制剂。
78.一种制造感染性RNA的方法，所述感染性RNA包含小核糖核酸病毒基因组，所述小核糖核酸病毒基因组包含一个或多个20或更多个碱基的异源序列元件，所述感染性RNA的特异性感染力足以在给药到活体哺乳动物时引发弥漫性小核糖核酸病毒感染，所述感染性RNA的特异性感染力与缺少所述一个或多个异源序列元件的可比感染性RNA的特异性感染力量级相似，所述方法包括：
(a)提供编码所述感染性RNA的DNA构建体，所述DNA构建体编码核酶，且所述核酸构建体包含限制性核酸内切酶切割位点，和
(b)在一定条件下使所述DNA构建体与限制性核酸内切酶接触，所述条件下至少部分所述DNA构建体被去除，由此产生经限制性核酸内切酶切割的DNA构建体，
其中，所述经限制性核酸内切酶切割的DNA构建体编码5’端具有非小核糖核酸病毒RNA的感染性RNA，并且，所述核酶切割所述5’端的非小核糖核酸病毒RNA从而形成所述感染性RNA。
79.如权利要求78所述的方法，其中，所述经限制性核酸内切酶切割的DNA构建体编码的所述感染性RNA其3’端少于10个小核糖核酸病毒基因组中不存在的核糖核苷酸。
80.如权利要求78所述的方法，其中，所述经限制性核酸内切酶切割的DNA构建体编码的所述感染性RNA其3’端没有小核糖核酸病毒基因组中不存在的核糖核苷酸。
81.如权利要求78所述的方法，所述感染性RNA的5’端没有小核糖核酸病毒基因组中不存在的核糖核苷酸。
82.一种免疫健全模型，它能够被编码病毒的感染性核酸感染，其中，所述免疫健全模型包含表达人细胞内粘附分子1(ICAM-1)的小鼠细胞。
83.如权利要求82所述的免疫健全模型，其中，所述小鼠细胞是鼠黑素瘤B16-F10细胞。
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