CN115003815A - 小麦转基因事件ind-øø412-7 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含事件IND‑ØØ412‑7的小麦植物、种子或其部分，从所述种子得到的商品产品，在事件IND‑ØØ412‑7中包含的重组DNA分子，可用于检测事件IND‑ØØ412‑7的DNA引物和探针，DNA检测试剂盒，用于产生耐受非生物胁迫的小麦植物的方法和用于检测属于小麦事件IND‑ØØ412‑7的DNA在样品中的存在的方法。
Description
发明领域
本发明涉及植物生产、植物育种和农业的领域。更具体地，它涉及小麦转基因事件IND-ØØ412-7、与小麦转基因事件IND-ØØ412-7有关的核苷酸序列、植物、植物的部分、种子、细胞、农业产物、以及检测和生产方法。
发明背景
提高作物产量及其特征已成为满足食物需求所必需的。由于与农业结合的生物技术发展，已经开发出能够适应不同环境和/或生态条件的新作物。
在植物生长时，植物暴露于各种非生物胁迫：干旱、盐度、低温和高温、过度辐射、低营养物可用性、阻碍根发育的土壤压实等(Duque等人, 2013; Sayed, 2003)。它们都能够在某个时候影响植物生长和发育以及产量。合理推测任何这些环境因素可能在田间作物生命周期期间发生。当是这种情况时，复杂响应机制被触发，这将以后反映在执行的测量中，因为它们起因于这样的胁迫效应的整合。
减轻对作物的环境负面影响的最常用技术之一是基于转基因事件，即在目标作物的基因组中插入感兴趣的基因。但是，商业上合适的转基因事件的产生和选择需要对大量个体转化事件进行广泛的研究、分析和表征。这导致有可能选择含有所需性状的事件，能够开发这类事件所需的表型和农业特征以适合商业目的，而对其它作物特征没有负面影响。
该过程需要产生转基因事件，所述事件将在分子上和表型上进行表征，以鉴于要获得的所需表型，鉴定和选择表达感兴趣的异源基因的事件。
事件选择意味着在田间和/或在温室中在受控条件下进行的实验室开发以及试验的阶段。有必要按年份在多个地点和在各种环境条件下分析对事件的响应，以选择满足所需表型和遗传特征以及所需商业特征的事件。
本发明的特征在于这种类型的商业上合适的事件，这使得小麦中的新有利性状成为可能。
有多种基因可用于产生商业上合适的事件。对其表达特别感兴趣的基因是编码转录因子HAHB4的基因。
HAHB4 (其代表向日葵（Helianthus annuus）同源框-4)是一种属于HD-Zip家族的向日葵转录因子。HaHB4基因表达在转录水平上受外部环境因素（诸如水可用性和土壤盐度）以及与这些因素相关的植物激素脱落酸和乙烯调节。
专利AR81216B2公开了可由缺水和脱落酸诱导并编码向日葵转录因子类型HD-Zip的基因HaHB4。该专利还公开了基因分离和表征，并将其引入模型植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）中。但是，它没有报道携带本发明的事件的具有商业利益的转基因植物，也没有报道它们关于在农业条件下发生的伴随非生物胁迫的有利特性。
在专利AR81216B2中没有提及表达基因HaHB4的事件的特定选择以保留感兴趣的主要性状，即耐旱性，而不影响其它农业特征。
此外，申请AR090110A1公开了可由缺水和脱落酸诱导并编码修饰的向日葵转录因子类型HD-Zip (特别是mod1HaHB4)的修饰基因HaHB4 (特别是HaHB4.2)。该出版物公开了修饰的HaHB4.2表达构建体的产生和表征及其在模型植物拟南芥中的引入。广义上，该出版物还公开了含有基因HaHB4.2的大豆、小麦和玉米转基因事件的产生和选择。
发明详述
本发明提供了包含事件IND-ØØ412-7的非生物胁迫抗性小麦植物。这些植物提供了其在不利环境条件下生长的优势，从而允许更高的产量。
更具体地，本发明涉及称为IND-ØØ412-7的小麦事件，其具有以登录号PTA-126141在美国典型培养物保藏中心(ATCC)登记的代表性种子及其后代。
本发明还包括包含由序列SEQ ID No.: 1和SEQ ID No.: 2表示的事件IND-ØØ412-7的小麦植物。
在本发明的事件中和在登记的种子中存在的转基因插入物包含可选择的bar标志基因和提供非生物胁迫耐受性的基因HaHB4。源自吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）的bar基因编码PAT (草胺膦乙酰基转移酶)蛋白。基因HaHB4源自向日葵植物向日葵物种（sp.Helianthus annuus），并编码具有同源结构域类型的蛋白结构域的蛋白类型HD-Zip I，该蛋白结构域与主要向干旱提供非生物胁迫耐受性的亮氨酸拉链相关。感兴趣的基因的调节可以由具有不同表达水平、敏感性和组织特异性的不同启动子序列指导。本领域的专家知道，在不影响本发明本质的情况下，可以使用引导或调节感兴趣的基因的表达的任何启动子或核酸终止子。具体地，在本发明中开发的事件包含用于提供草铵膦除草剂抗性的bar基因的玉米泛素1基因启动子(prUBI-1)以及Tnos终止子。此外，该事件再次包含玉米泛素1基因启动子(prUBI-1)和Tnos终止子以调节HaHB4编码区的表达(图1和图2)。
本发明的其它方面包含含有小麦事件IND-ØØ412-7的小麦植物的后代、植物的种子和/或可再生部分、种子和后代，以及由它们衍生的用于人类或动物消费的食物产品。本发明还包括包含事件IND-ØØ412-7的植物的部分，包括但不限于，包含事件IND-ØØ412-7的花粉、胚珠、花、芽、根、叶、细胞营养核和其它植物细胞。本发明还涉及包含小麦事件IND-ØØ412-7的小麦植物，其特征在于对多种非生物胁迫的耐受性，所述非生物胁迫例如干旱、盐度、低温和高温、辐射过量、低营养物可用性、土壤压实等和这些因素的不同组合。
本发明部分地涉及非生物胁迫耐受性植物的培养。此外，它包括小麦植物转化的新事件，其包含插入小麦基因组内的特定位点的如本文所述的多核苷酸，所述多核苷酸提供特定的遗传和表型特征。
在某些实施方案中，该事件/多核苷酸可以与其它性状“叠加”，所述其它性状包括例如农学性状和除草剂和/或昆虫耐受性。但是，本发明包括含有如本文所述的单个事件的植物。
额外的性状可以堆叠在植物基因组内或与事件IND-ØØ412-7相同的基因座中，例如，这通过植物杂交、包含事件IND-ØØ412-7的转基因植物的再转化或通过同源重组指导的整合添加新的性状来进行。
在一个实施方案中，本发明包括位于染色体2中的两个小麦染色体位点。在某些实施方案中，定向位点包含异源核酸。小麦染色体位点位于图3中定义的侧翼序列(SEQ IDNo: 7、8、9和10)之间。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于生产小麦转基因植物的方法，所述方法包括在染色体2内的一个或几个特定位置插入异源核酸。
具体地，该方法包括用SEQ ID No.: 1和SEQ ID No.: 2所述的DNA序列转化细胞或细胞培养物，并以稳定的方式再生所述细胞，以开始新的完整植物。
该植物细胞的转化可以通过多种技术进行，无论是物理的，病毒的，还是化学的，其中包括生物弹道、电穿孔、细菌转化或这些技术的组合。所有这些技术都是本领域的专家众所周知的。
具体地，本发明使用基因枪来推进具有感兴趣的序列的DNA质粒分子(图2)，更准确地，用质粒pIND4-HB4和pIND4-BAR (图1和图2；SEQ ID No: 3和SEQ ID No: 4)轰击。
此外，本发明提供了用于检测本事件在小麦样品中的存在的试验。试验可以基于插入小麦基因组内的重组构建体的DNA序列，以及基于侧接插入位点的基因组序列。还提供了可用于进行试验的试剂盒和条件。
因此，本发明部分地涉及属于所有插入物或其部分和侧翼区域的DNA序列（在转基因小麦品系中）的克隆和分析。这些序列是独特的。可以基于这些插入物和侧翼（和联合）序列产生事件特异性引物。PCR技术证明，通过分析由事件特异性引物的这些集合产生的扩增子，可以鉴定这些事件。因此，这些和其它相关程序可用于以明确的方式鉴定包含本发明事件的小麦品系。
本发明还涉及PCR测定试验。这些试验其中包括定量实时(qPCR)或终点PCR，以检测IND-ØØ412-7事件、扩增子及其片段。
本发明还提供了DNA分子，其包含SEQ ID No.: 5和SEQ ID No.: 6的一部分连续核苷酸序列，该部分连续核苷酸序列足以使其作为DNA探针起作用，所述探针在严格条件下与包含选自SEQ ID No.: 5和SEQ ID No.: 6的核苷酸序列的DNA分子杂交并且在严格条件下不与不包含选自SEQ ID No.: 5和SEQ ID No.: 6的核苷酸序列的DNA分子杂交。
在一些情况下，所使用的探针可以用发出可检测信号的分子标记。这样的分子的例子是荧光染料。也就是说，在两端呈现荧光染料并且具有与待扩增的DNA片段的一部分互补的序列的寡核苷酸。其中，FAM、TET、HEX、JOE、CAL Fluor®、Quasar®和Pulsar®染料。
本发明还公开了DNA分子对，其由第一DNA分子和不同于第一DNA分子的第二DNA分子组成，其中第一和第二DNA分子各自包含SEQ ID No.: 5和SEQ ID No.: 6的一部分连续核苷酸，该部分连续核苷酸足以作为DNA探针起作用，所述DNA探针如果与源自事件IND-ØØ412-7的DNA一起用于扩增反应中，则产生用于样品中小麦转基因事件IND-ØØ412-7的诊断性DNA扩增子。
本发明还描述了一种用于检测样品中从事件IND-ØØ412-7获得的DNA的存在的方法。所述方法包括将样品与用作探针和引物的DNA分子进行匹配，使它们经受相同的严格杂交条件，然后检测DNA探针与使用特异性引物扩增的样品中的DNA的杂交。该杂交指示源自小麦转基因事件IND-ØØ412-7的DNA在该样品中的存在。
本发明还提供了一种检测得自小麦转基因事件IND-ØØ412-7的DNA分子在样品中的存在的方法，其将源自该样品的DNA制备物与用作引物的寡核苷酸对进行匹配以产生扩增反应，所述反应足以产生包含选自SEQ ID No.: 5和SEQ ID No.: 6的序列的DNA扩增子，以检测DNA扩增子在反应中的存在，其中所述DNA扩增子的存在指示源自IND-ØØ412-7的DNA分子在所述样品中的存在。
此外，本发明提供了一种DNA检测试剂盒，其包含至少一种DNA分子，所述DNA分子具有SEQ ID No.: 5和SEQ ID No.: 6的一定数量的连续核苷酸，所述数量足以使其作为引物或特异性DNA探针起作用，以检测源自小麦转基因事件IND-ØØ412-7的DNA的存在，其中DNA检测证明该事件在样品中的存在。
本发明的特征还在于包含选自SEQ ID No.: 5和SEQ ID No.: 6的核酸分子的小麦植物、种子、细胞或该植物的部分。本发明进一步提供了耐受非生物胁迫的小麦植物、种子、细胞或植物部分。此外，本发明的特征在于小麦植物、种子、细胞或植物部分，其基因组当用DNA扩增方法试验时，产生包含选自SEQ ID No.: 5和SEQ ID No.: 6的DNA分子的扩增子。
本发明进一步提供了小麦植物或种子，其中所述小麦植物或种子从小麦转基因事件IND-ØØ412-7产生，或者是具有至少一个源自小麦转基因事件IND-ØØ412-7的亲本的杂种或杂合体。
本发明进一步提供了包含选自SEQ ID No.: 5和SEQ ID No.: 6的重组DNA分子的无生命植物材料。
此外，本发明提供了从小麦转基因事件IND-ØØ412-7产生的商品产品，所述事件包含选自SEQ ID No.: 5和SEQ ID No.: 6的核酸分子，其中对源自所述商品产品的样品中核苷酸序列的检测规定了商品产品源自小麦转基因事件IND-ØØ412.7。本发明进一步提供了商品产品，其选自完整的或加工过的种子、粗粉、面粉、絮片、生物乙醇、生物气或其它生物材料等。本发明的特征还在于通过如下生产商品产品的方法：获得包含小麦转基因事件IND-ØØ412-7的小麦植物或其部分，和从该小麦植物或其部分生产小麦商品产品。
本发明提供了通过如下生产耐受非生物胁迫的小麦植物的方法：将具有包含选自SEQ ID No.: 5和SEQ ID No.: 6的核酸分子的小麦转基因事件IND-ØØ412-7的植物与第二小麦植物杂交，以产生种子，收集从杂交产生的种子，培育所述种子以产生多株后代植物，和选择耐受非生物胁迫的后代植物。
附图说明
图1：IND-ØØ412-7获得中使用的质粒pIND4-HB4和pIND-Bar的设计图。在设计图中显示了HaHB4 (左)和bar (右)的CDS，以及它们的调控元件和质粒骨架。prUbi-1：玉米Ubi-1基因启动子区。prUbi-1外显子：玉米Ubi-1基因第一外显子。prUbi-1内含子：玉米Ubi-1基因第一内含子。HaHB4：HaHB4的CDS。Bar：bar的CDS。Tnos：nos基因的终止子序列。pBR322起点：ColE1复制起点。bla：bla基因。
图2：质粒序列和感兴趣的序列。
图3：通过illumina和PacBio读数以及通过Sanger测序的PCR扩增产物支持的所得接合点序列(JP)。从所述JP，显示了完全获得的小麦序列，而对于质粒仅显示前100 bp。数字表示在插入序列上的绝对位置。
图4：从2009年到2011年进行的6个现场试验的转基因系(事件)和亲本对照(野生型)的产量。细条代表均值的标准误差(SEM)。
图5：用HindIII、BamHI和AseI消化的IND-ØØ412-7植物DNA的DNA印迹。印迹与DIG-标记的探针杂交以供HaHB4检测。在IND-ØØ412-7消化物中与探针杂交的DNA条带用白色箭头指出。HB4大豆转基因植物(IND-ØØ41Ø-5)用作阳性，并且杂交条带用红色箭头指出。DIG-标记的标志物VII和III阶梯条带大小分别在印迹的左侧和右侧以kb示出。
图6：用HindIII、BamHI和AseI消化的IND-ØØ412-7植物DNA的DNA印迹。印迹与DIG-标记的探针杂交以供bar检测。在IND-ØØ412-7消化物中与探针杂交的DNA条带用白色箭头指出。HB4大豆转基因植物(IND-ØØ41Ø-5)用作阳性，并且杂交条带用红色箭头指出。DIG-标记的标志物VII和III阶梯条带大小分别在印迹的左侧和右侧以kb示出。
图7：通过染色体2D分选产生的DNA样品的完整性和大小分布的评价。平均片段大小5951 bp。
图8：PacBio读数长度分布。直方图表示以1000bp读数长度的间隔的绝对频率(读数个数)。
图9：PacBio读数的质量评分。上图表示作为读数位置(以百分数计)的函数的基础调用的质量评分，和下图作为读数位置(以bp计)的函数。
图10：含有HaHB4 (红色)和bar (浅蓝色)完全(c)和不完全(i)编码区的IND-ØØ412-7长插入物的DNA序列设计图。为了对其更好理解，该插入物被细分为四个片段。a)HaHB4不完全(i)编码区位于Ubi-1内含子的两个不完全片段之间。此外有两个bar编码区，完全(c)和不完全(i)。bar (i)在两个Tnos区之间。Bar (c)以正确位置位于其调控元件之间。b) HaHB4 (c)编码区位于ubi-1内含子的邻近区和5'启动子区的下游以及其Tnos上游。Bar (i)位于两个内含子ubi-1区之间。c) Bar (c)位于反转Ubi-1启动子区和Tnos区之间。Bar (i)位于ubi-1部分启动子区和bla基因之间。d) 两个bar (c)编码区位于其完全调控元件之间。
图11：含有HaHB4和bar完全(c)编码区的IND-ØØ412-7短插入物的DNA序列设计图。为了对其更好理解，该插入物被细分为三个片段。b) Bar (c)位于反转和短序列prGBL-1区和Tnos区之间。c) HaHB4完全(c)编码区位于Ubi-1内含子的不完全片段和Tnos之间。
图12：针对小麦(T. aestivum)进行blast的JP中的覆盖度(在http://plants.ensembl.org/)。
序列简述
SEQ ID No. 1：没有侧翼区的长插入物
SEQ ID No. 2：没有侧翼区的短插入物
SEQ ID No. 3：pIND4+HB4
SEQ ID No. 4：pIND4+BAR
SEQ ID No. 5：具有侧翼区的长插入物
SEQ ID No. 6：具有侧翼区的短插入物
SEQ ID No. 7：5´侧翼区(长插入物)
SEQ ID No. 8：3´侧翼区(长插入物)
SEQ ID No. 9：5´侧翼区(短插入物)
SEQ ID No. 10：3´侧翼区(短插入物)
SEQ ID No. 11：HB4正向引物
SEQ ID No. 12：HB4反向引物
SEQ ID No. 13：Bar正向引物
SEQ ID No. 14：Bar反向引物
详细描述
提供以下定义和方法以更好定义本发明和指导经过该技术培训的人员对其实施。除非另外说明，本文使用的术语应被解释为经过相关技术培训的人员通常给予其的相同含义。
实施例
实施例1：质粒pIND4-HB4和pIND4-Bar的构建
用于获得小麦IND-ØØ412-7的载体基于一系列使用玉米泛素启动子来指导植物中的基因表达的质粒(Christensen和Quail, 1996)。已证明该启动子在单子叶植物中非常有效(Christensen等人, 1992)。这些质粒使用载体基础pUC8进行克隆，并且由于克隆1992pb的Ubi-1玉米泛素基因的Pst1片段而产生。该片段是功能性启动子，并且由以下组成：899pb的基因Ubi-1序列、83pb的来自第一外显子的5’-非翻译区序列和1010pb的第一内含子序列，以重建Pst1位点结尾。存在于基因Ubi-1的5’-非翻译区的原始内含子在所有这些载体中被保留，这是因为之前的研究表明内含子刺激谷类植物中的转基因表达(Vasil等人,1993)。
基于该系列的两种质粒，pIND4-HB4和pIND4-Bar，已用于IND-ØØ412-7中存在的遗传修饰。
pIND4-HB4 (SEQ ID NO:3)
该质粒具有多克隆位点，其中位点BamHI用于克隆基因HaHB4的编码区。该限制位点位于该基因的玉米Ubi-1基因启动子、第一外显子和第一内含子的序列后。该构建体prUbi-1/Ubi1-Exon/Ubi-1Intron/HaHB4被设计为获得HAHB4的组成型表达。在多克隆位点之后和HaHB4的CDS之后，该载体具有根癌土壤杆菌(A. tumefaciens)的胭脂碱合酶基因终止子的序列，其包括多腺苷酸化信号。
pIND4-Bar (SEQ ID NO: 4)
该质粒也已通过在BamHI位点将Ubi-1调控区结合到吸水链霉菌(S. hygroscopicus)的bar基因的编码区来构建。该构建体prUbi-1/Ubi1-Exon/Ubi-1Intron/ bar允许选择表达PAT和耐受草铵膦除草剂的转基因植物，所述除草剂由于该酶而变成无活性(Thompson等人, 1987)。在bar编码区之后，该载体还含有根癌土壤杆菌(A. tumefaciens)的胭脂碱合酶基因终止子，其包括多腺苷酸化信号。
实施例2：小麦植物的转化和事件IND-ØØ412-7的选择
用于获得事件IND-ØØ412-7的共转化方法基于Barcelo和Lazzeri (1995)，Pastori等人(2001)以及Rasco-Gaunt等人(2001)开发的方法。这些方法也在数个研究中心中使用。
首先，收获小麦谷粒并灭菌。从麦穗收集谷粒并灭菌。然后，分离胚芽，并去除它们的茎轴以避免早期萌发。将盾片置于培养皿中间的合适培养基中，其中外植体的未损伤区域朝上以使其经历微粒冲击。
对于轰击，使用基因枪PDS-1000/He (Biolistic® PDS-1000/He ParticleDelivery System, BIO-RAD)，将用来自两种感兴趣的质粒pIND4-HB4和pIND4-Bar的DNA覆盖的金颗粒推进到外植体的细胞内部。
轰击后，在对于产生胚性愈伤组织所必需的激素条件下将经处理的外植体置于新鲜培养基中。一旦胚芽已经发育，三周后开始选择过程。该情况下使用的选择试剂是草铵膦。
由于PAT表达在选择轮次中存活并发育了良好根系的幼苗被转移和置于生长室中。此时，获得样品，使用PCR证明bar和HaHb4的存在。一旦植物发育，将它们转移到较大的盆中，它们在其中生长直到收获。
事件选择
在使用British variety Cadenza的生物弹射方案后，产生转基因植物。在2007年8月和12月之间将第一次倍增(T1种子)转移到生长室。对源自各转基因事件的大约20个单株采样，通过PCR测定用于分离试验(表1)。
表1. 分离试验。将p值> 0.15的品系转移至下一代。
在2008年8月在冰雹避难所下将源自所选事件的自交的品系(T1中3:1分离)播种。在整个生长季节对这些品系的生长和发育进行表征(表2)。
表2. 物候学。
表2. 物候学(续)。
在营养阶段期间，对植物采样用于PCR分析以鉴定纯合品系。使用三个选择的纯合品系，在2009和2011期间在Monte Buey (Córdoba, 2009)、Gutenberg (Córdoba, 2010)、Camet (Buenos Aires, 2011)、Corral de Bustos (Córdoba, 2011)、Daireaux (BuenosAires, 2011)和Villa Saboya (Buenos Aires, 2011)进行6个现场试验。
试验包括三个纯合品系(事件)和野生型(亲本对照)。使用Infostat (Di Rienzo等人, 2010)，使用95%置信水平、完全随机区组设计的ANOVA分析产量数据。在该分析中，合并各场所的数据，并且变量源包括基因型、环境和基因型-环境相互影响。用Fisher最小显著性检验(α=0.05)后验比较均值。
对于基因型的影响，方差分析表明统计学显著差异(p=0.0003，图4)。此外，检测到统计学显著的基因型-环境相互影响(p<0.0001)。该相互影响通过品系Ta.IV.ii.a.4的交换和在一个场所的对照产量(图4)来解释。在合并的分析中，所有转基因品系提供了高于亲本对照的产量。在品系中，Ta.IV.ii.a.12提供了在所有场所中最高的均值产量。选择该转基因品系以供进一步表征，并重命名为代码：IND-ØØ412-7。
实施例3：小麦事件IND- ØØ 412-7中DNA序列的表征
由于小麦基因组的复杂性质，设计了在小麦基因组中减少背景基因组信息以解释插入结构、序列和其侧翼序列的策略。使用DArT技术平台(Diversity Arrays Technology,Jaccoudy等人, 2001)，鉴定载体染色体。一旦鉴定了HaHB4载体染色体，应用染色体分选技术(Doležel等人, 1989; JanVra'na等人, 2000; Suchánková等人, 2006; Šimková等人,2008)，将其分离。在分离的染色体中鉴定IND-ØØ412-7的插入区的测序策略由使用以下两种互补测序技术的组合NGS方法组成：Illumina和Pacific Biosciencies。Illumina从500bp-片段测序文库的两侧产生高通量的100 bp短读数。另一方面，PacBio从15-20 kb-片段文库产生低通量的单分子读数。
随着插入物大小增加，聚合酶经过序列多于一次的可能性降低。为此，较大序列具有高于较小序列的误差率。为了解决这个问题，已经开发了使用通过Illumina获得的较小序列来纠正这些序列的特定算法。使用该算法，PacBio RSII序列被纠正，并且获得了准确和可靠的样品组装(Koren等人, 2012)。
a) DNA印迹分析。
在纯合IND-ØØ412-7植物中通过DNA印迹分析测定感兴趣的基因的拷贝数。
来自温室或现场生长的纯合IND-ØØ412-7植物或Cadenza植物的叶组织用于DNA分离。使用液氮将1克来自IND-ØØ412-7或Cadenza的叶组织快速冷冻，并使用预冷的研杵和研钵研磨成细粉。用Qiagen DNeasy Maxi Prep Kit按照制造商的方案提取DNA。洗脱后，通过添加1/10体积的3M乙酸钠和2-3倍体积的100%乙醇将DNA沉淀。沉淀物用70%乙醇洗涤并悬浮于80 µL的1x TE缓冲液。DNA使用QuBit荧光计定量。对于IND-ØØ412-7的DNA浓度是1100ng/µL，和对于Cadenza是900 ng/µL。
来自事件IND-ØØ412-7的基因组DNA用三种酶消化：HindIII、BamH1和AseI。对于每个50 µL消化反应，将5 µg基因组DNA与HindIII、BamHI或AseI酶以10 U/µg DNA的浓度混合。在37℃下将样品消化过夜(~16小时)。对于对照质粒的消化物，使用100-200皮克的质粒DNA。
将IND-ØØ412-7和Cadenza基因组DNA的限制性消化物以及DIG标记的分子量标志物VII (Roche目录号1669940910)加载到0.7%琼脂糖凝胶中。将样品在50 V运行过夜。将凝胶在变性缓冲液中孵育两次，每次30分钟。变性的凝胶在转移缓冲液中洗涤15分钟，然后进行碱性转移(下述)。
在pIND-4质粒中具有一个HindIII位点，位置非常接近5´ prUBI-1末端。在该质粒中没有其它HindIII位点存在(图1)。如果存在包含IND-ØØ412-7基因组中感兴趣的序列的单个完整插入物，HaHB4探针杂交的最小片段大小将是2.842kbp，并且bar探针杂交的最小片段大小将是2.860 kbp。
另外，在pIND-4质粒中具有一个BamHI位点，位置非常接近HaHB4和bar CDS的起始密码子。在该质粒中没有其它BamHI位点存在(图1)。再次，如果存在包含IND-ØØ412-7基因组中感兴趣的序列的单个完整插入物，HaHB4探针杂交的最小片段大小将是825 bp，并且bar探针杂交的最小片段大小将是843 bp。
最后，在该质粒中具有五个AseI限制位点(图1)，两个在UBI-1内含子中感兴趣的序列内，并且三个在载体中，其中两个靠近Tnos的末端和另一个在bla基因内部。在插入物中的完全AseI消化应释放1.313kbp长的DNA区段，其包含HaHB4探针的结合靶标。bar探针将检测到1.331kbp的DNA片段。这种考虑是假设单一完整插入。
按照Roche PCR DIG探针合成试剂盒(目录号11636090910)中概述的程序并使用表3中提到的寡核苷酸，合成用于HaHB4和bar CDS的分子探针。
表3. 用于制备在DNA印迹分析中使用的探针的引物列表。
使用Turboblotter-Rapid向下转移系统(Whatman)，从琼脂糖凝胶碱性转移DNA。将DNA转移到12x21cm尼龙膜(Nytran™ SuPer Charge, Sigma-Aldrich Co., St. Louis,MO)，持续4小时。在中和缓冲液(0.2M磷酸钠, pH 6.8)中洗涤膜。通过Ultraviolet Crosslinker (CL-1000)，进行2次1500 mJ曝光，将DNA永久交联到膜上。
将膜在50 ml的Roche DIG EasyHyb杂交缓冲液(目录号11 603 558 001)中在预先计算的杂交温度（bar基因和HaHB4基因探针分别为45℃、55℃）在定轨摇床上温育。
通过分别添加65和55µl的1x TE缓冲液来稀释35µl和45µl bar和HaHB4探针的等分试样。将探针溶液在95℃温育10分钟，并冷却至4℃保持2分钟。将它们添加到8.75 mlDIG杂交缓冲液中并倒入杂交瓶的底部。将膜在带有定轨摇床的分子杂交仪(VWRscientific products)中在所描述的杂交温度下温育16小时。
杂交后，根据与Roche, DIG Luminescent检测试剂盒一起提供的说明书，用洗涤缓冲液洗涤膜。用1x封闭试剂封闭1小时后，将膜在含有50ml 1x封闭试剂和5µl抗地高辛配基-AP的溶液中温育30分钟。将膜用洗涤缓冲液洗涤两次，每次30分钟，最后用检测缓冲液处理5分钟。在此时将膜置于KPL杂交袋(KPL目录号60-00-51)中。将来自DIG Luminescent检测试剂盒的5ml CSPD溶液均匀地施加在膜上。将膜与CSPD溶液一起在室温下温育5分钟。将带有膜的杂交袋热封并在37℃温育15分钟。将杂交袋在暗室中放入装有Kodak BiomaxLight Film (目录号178 8207)的盒中并曝光20分钟。使用Konika QX-60A X-射线胶片处理器在暗处使胶片显影。根据需要在1小时或2小时进行后续曝光。
用HaHB4探针获得的杂交条带的分析允许假设该CDS的三个拷贝的存在(图5)。
另一方面，用bar探针获得的杂交条带的分析允许我们假设具有BamHI的该CDS的七个拷贝的存在(图6)。然而，当考虑HindIII和AseI时数量较低，表明可能的内部DNA重排(图6)。
简言之，DNA印迹结果表明具有可能的内部DNA重排的复杂插入模式，提示基因组测序方法对于解析IND-ØØ412-7事件中的插入结构应该是必需的。
b) 含有IND-ØØ412-7中的插入序列的染色体的鉴定和分离
DArT用于鉴定位于小麦基因组的染色体2D中的HaHB4基因。每个多态DNA片段(其对应于板上的点)实际是可用于成对杂交分离群的基因分型(在分离材料中存在或不存在标志物)和这些标志物与农艺学利益特性(多态性的区域)的关联的检测的分子标志物。在IND-ØØ412-7事件的情况下，该技术用于基因分型杂交IND-ØØ412-7 x Bag17的F2代，和搜寻这些标志物与HaHB4转基因的可能关联。在每个F2个体中确定HaHB4的存在或不存在，并且在基因分型后，确定DArT标志物和HaHB4之间的关联。该转基因呈现了与位于2D染色体中的一种标志物的关联(http://www.cerealab.unimore.it/)。仅一种标志物呈现与HaHB4关联的事实可能是因为没有对于该特定染色体可用的饱和标志物图(Jia等人, 2013;http://ccg.murdoch.edu.au/cmap/ccg-live/cgi-bin/cmap/viewer)。
HaHB4 CDS最可能位于与标志物Gpw3105关联的着丝粒附近的长臂中。
使用该信息，获得5 ug的染色体2D DNA，其适合于Illumina文库制备。然而，由于分选后DNA扩增过程的性质，DNA部分地适合于PacBio文库(图7)。
使用来自IND-ØØ412-7和野生基因型Cadenza的DNA，产生多样性小组。
从幼苗提取基因组DNA。约5 ng来自各基因型的DNA经过在37℃以终体积8 µL用2U的限制酶(EcoRI、PstI和MspI)消化评价1小时。消化后，加入2 uL的连接混合物，并在37℃将样品孵育3小时。连接混合物包含0.2 µL T4连接酶(New England Biolabs)、0.2 µL 50mM ATP、1.2 µL MilliQ水(MQ)和0.1 µL浓度为50 pmol/µL (MspI)和5 pmol/µL (EcoRI和PstI)的合适特异性酶。连接后，使用MQ水将混合物稀释至终体积500 µL，并且2 µL作为模板用于PCR反应。在终体积50 µL、2 U Red Taq聚合酶(Sigma)和引物中进行反应。在95℃初始孵育3分钟后，反应遵循以下方案：94℃持续30秒、60℃持续45秒和72℃持续1分钟，30个循环。最终延伸在72℃进行8分钟。
由此产生的扩增子连接至PCR2.1TOPO载体(Invitrogen)中，并随后按照制造商的说明书，通过热休克大肠杆菌TOP10F '(Invitrogen)的细胞转化。在包含氨苄青霉素和X-gal的培养基上选择转化子。通过接种环将单个白色菌落(包含重组质粒)转移至包含20 µL的10%甘油的试管中。从甘油中的各样品获得5 µL等分试样，并转移至包含45 µL的PCRmaster mix RedTaq tube (Sigma)和15 pmol的各M13正向和M13反向引物的试管。使用的分析循环仪是95℃持续5分钟，1个循环；94℃持续30秒、52℃持续30秒和72℃持续1分钟，35个循环。扩增后，在室温下使用1倍体积的异丙醇将PCR产物沉淀，并用100 µL的70%乙醇洗涤。除去乙醇，并将产物在室温下干燥。
将产物以终浓度~ 20 ng/µL重悬浮于MQ水、3x SSC或1x SSC + 0.01% sarkosyl(Sigma)中。将纯化的片段转移至384-孔板(Genetix)，并使用Affymetrix™ 417 System对于Polysine™芯片(Menzel Glazer)中的通道设置6个重复。固定1天后，根据http://microarrays.org/protocols.html公布的程序(2001)处理芯片，略微不同之处是使用硼氢化钠(Sigma)代替使用琥珀酸酐和1-甲基-2-吡咯烷酮作为封闭溶液，该封闭溶液在PBS缓冲液pH 7.4 (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM NaHPO, KHHPO 2 mM)中制备。将芯片浸入沸水中30秒以变性DNA，然后立即浸入冰冷的100%乙醇中10秒。将芯片在室温下干燥。
PCR扩增后，产物使用柱(Qiagen)纯化，或通过加入异丙醇沉淀，以除去过量的dNTP。使用标记试剂盒Deca-random-prime DNA (Fermentas)根据制造商的说明书掺入Cy3和Cy5 (Pharmacia)荧光染料。
将用Cy3和Cy5 (各自5 µL)染料标记的样品与2 µL在Express杂交溶液(Clontech)中溶解的20 ug/uL来自鲱鱼精的DNA (Sigma)的溶液混合，并在96℃变性3分钟。变性的探针与10-15 µL的杂交溶液混合，直接转移至微阵列的表面，并用玻璃(24 x 24mm, Mediglass)覆盖。立刻将芯片置于湿化室，在65℃下过夜进行杂交。杂交后，芯片用含0.1% SDS的1x SSC洗涤5分钟，1x SSC洗涤2分钟，0.2x SSC洗涤2分钟以及0.02x SSC洗涤20秒。
使用Affymetrix 418™扫描仪扫描芯片。使用Scanalyse v.2.44 (StandfordUniversity)和GenePix Pro v.3 (Axon instruments)程序分析各信号的强度。
c) 使用Illumina和PacBio测序进行的在IND-ØØ412-7中的接合序列分析和插入结构
DNA印迹分析结果提示转基因插入的复杂模式。因此，使用Illumina Hiseq平台对分离的染色体2D DNA文库进行测序。我们产生了超过12亿呈2x100bp配对末端配置的读数，代表了超过124 Gb的测序数据。基于在位于染色体2D内的单拷贝基因例如PpoD1b上的非冗余可映射读数，整个染色体的测序覆盖度估计在40和50X之间(He 等人, 2009)。通过将读数映射到位于染色体外的已知单拷贝基因例如LOXs来验证染色体2D的样品富集(Feng等人, 2012)。在这些情况下，覆盖度估计在1和5X之间，从而证实了染色体2D序列中的高度富集DNA。
在用于转化的质粒上映射的读数允许我们验证DNA印迹结果。得出结论，我们已经获得了基于100X覆盖度的3个完全或接近完全拷贝的HaHB4 CDS，和基于400X覆盖度的8个完全或接近完全拷贝的bar CDS。
几个其它质粒元件以高达1200X的覆盖度得到验证。
使用Illumina读数的接合序列分析(JSA)方案(Kovalic等人, 2012)鉴定了多达4个不同的侧翼序列，其具有小麦DNA和几个包含质粒元件的嵌合接合序列。简言之，Illumina数据也表明IND-ØØ412-7中包含内部质粒重排的插入事件的复杂模式。
因此，产生了PacBio长测序读数，以辅助Illumina读数组装的支架过程。PacBio长读数将允许经过复杂内部结构和重排来读数。
由于染色体分选后获得的DNA样品质量允许我们产生大约5 Kb平均大小的文库，使用PacBio的P4-C2化学。该化学产生平均5.5 Kb长的读数。使用20个SMART池以产生1,806,197个读数，总共3.5 Gb的测序数据，平均读数长度为大约2 Kb和最大为13 Kb。基于800 Mb的染色体2D大小，估计整个染色体的覆盖度为4.7X。PacBio统计学显示在表4中，并且读数长度分布和Q评分显示在图8和图9中。
表4. PacBio统计学。
基于来自Illumina和PacBio的测序数据的合并分析，首先定义了插入的侧翼序列。
建立了四参数集作为截止以确定侧翼序列的真实身份：
1. 由Illumina数据支持，
2. 由PacBio数据支持，
3. 由作为单拷贝的Illumina覆盖度支持，和
4. 由从IND-ØØ412-7 DNA的PCR扩增支持。
四个不同的侧翼序列通过所有过滤器以满足称为JPLa、JPLb、JPSa和JPSb的所选标准。
使用类似的方法来确定所有内部嵌合质粒-质粒接合序列，但考虑了对于包含的单个质粒元件的Illumina覆盖度。使用Illumina数据扩展通过所有过滤器的内部接合序列，并映射在长PacBio读数上以产生最终组装。最终组装的质量后验到初始DNA印迹数据，并且结果得到验证。
简言之，描述了在小麦基因组的染色体2D的高度重复区中质粒的两个不同插入。一个插入是47,611 bp长，另一个是20,418 bp长，在IND-ØØ412-7事件中总共68,029 bp插入(图10和11)。插入导致三个拷贝的HaHb4 CDS，七个拷贝的bar CDS，16个拷贝的bla基因和四个拷贝的gus CDS。在较长的插入(图10)中，有可能鉴定可能的功能性调控元件下游的完全HaHB4编码区(红) (子图b)。另一方面，完全bar编码区(浅蓝)在子图a、b、c和d中观察到。在子图(a)和(d)中有可能鉴定bar的调控元件是完全和正确位置的。完全拷贝的BarCDS潜在编码功能性蛋白。因此，仅鉴定了一个HaHB4拷贝和一个bar拷贝，没有完全调控元件。
d) 与感兴趣的基因无关的载体序列的检测、结构和拷贝数
从插入事件分析显然的是质粒载体序列和与小麦转化过程中引入的感兴趣的基因和调控区无关的其它编码区的存在。
在IND-ØØ412-7的插入中检出的质粒骨架的元件是在细菌中赋予氨苄青霉素抗性的bla基因，和pBR322质粒的细菌复制起点(图10和11)。关于bla，重要的是提及它没有用于在小麦中表达的调控元件，以及所述bla拷贝都没有定位在真核调控元件附近。
IND-ØØ412-7插入中的所有质粒骨架序列具有在用于转化的载体pIND4-HB4和pIND4-Bar中确认的起源，如使用blast通过核苷酸序列的同一性证实的。
然而，检出了对应于gus基因的序列(Jefferson等人, 1987)和导致其表达的小麦gbl1基因的启动子(Jones, 2005)。这些序列源自用于监测转化效率的第三质粒；然而，这些元件在整合过程中已被掺入。gus CDS以四个拷贝存在，而gbl1启动子以五个拷贝存在(图10和11)。该第三质粒也是用于将HaHB4和bar掺入小麦的系列的衍生物。
e) IND-ØØ412-7插入在小麦基因组中的定位
插入位于小麦染色体2D中。这些插入在非注释序列中检出，并且非常可能的是它们因为下述原因而中断编码序列。
所有侧翼小麦序列对应于与反转录转座子具有高度相似性的DNA区段，表明在高度重复DNA区中的插入事件(Mayer 等人, 2014)。
为了证实这一点，通过EnsemblPlants网站(http://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Info/Index)，针对IWGSC项目数据库对JP (接合点)进行blast。在每种情况下观察到针对多个小麦(T. aestivum)染色体位点的多次命中。尽管在一些情况下参差不齐，对于各JP观察到全序列覆盖度(图12)。因为该IWGSC项目仍处于开发中，针对在EnsemblPlants数据库中存在的所有剩余测序的谷类基因组(乌拉尔图小麦(Triticumurartu)、节节麦(Aegilops tauschii)和大麦(Hordeum vulgare))，进行另一个blast，产生相同的针对多个染色体位点的多次命中模式。在多个染色体位点中存在并且在不同生物中保守的序列趋于是重复序列。
还针对NCBI非冗余数据库对JP序列进行blast。这些序列中的两个(JP短，JPSa和JPSb)与已知的反转录转座子元件相配(表5)。尽管另外两个JP序列(JP长，JPLa和JPLb)针对NCBI数据库没有显著命中，但它们在小麦数据库中高度保守和在多个染色体中重复多次，强烈表明未知的重复DNA元件。
表5. JP序列针对NCBI非冗余数据库进行blast的最佳命中实例
L.：长度
IND-ØØ412-7插入的稳定性和完整性
插入物随着性转移而分离
对于插入IND-ØØ412-7的纯合植物与商业品种Baguette 17杂交，得到F1代。在F1植物自交后，获得349个F2种子。从这些种子生长的植物用于分离分析。从幼叶中DNA提取。在DNA提取之前，将叶组织在液氮中冷冻并用研杵在研钵中或在用于微量制备的“96磨”中在管中处理成细粉。根据为实验目的所需的DNA的量，使用以下技术提取植物DNA：
CTAB方法：
按照基于十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的方法提取基因组DNA (http://irc.igd.cornell.edu/Protocols/DoyleProtocol.pdf)。简言之，将600 μL的CTAB缓冲液(2% w/v CTAB, 100 mM TrisHCl, 20 mM EDTA, 1.4 M NaCl和β-巯基乙醇)和5 μg RNaseA加入约100 mg的经研磨的叶组织，并在55-60℃孵育15-20分钟，同时间歇混合。将600 μL氯仿加入样品并用手混合2-3分钟，然后以10,000 rpm离心8分钟。将上部水相放入干净的微管中，并用400 μL异丙醇将DNA沉淀。将样品以12,500 rpm离心10分钟，以获得沉淀的DNA。通过以12,500 rpm离心样品5分钟，DNA沉淀用300 μL的70%乙醇洗涤。将DNA沉淀空气干燥，然后重悬浮于100 μL的TE缓冲液(10 mM TrisHCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)。所有提取的DNA在4℃冰箱中或-20℃冰柜中储存。
为了确保样品的完整性，用特异性引物进行小麦内源对照的终点PCR。然后，使用不同引物组合进行终点PCR以确定HaHB4和bar CDS的存在。卡方(χ2)分析用于评估预期的3:1分离(存在或不存在感兴趣的CDS)。
表6概述了通过PCR分析获得的结果。
表6. 通过PCR的分离分析的结果。
| 总计 | <i>HaHB4</i>+<i>bar</i>+ | <i>HaHB4</i>+<i>bar</i>- | <i>HaHB4</i>-<i>bar</i>+ | <i>HaHB4</i>-<i>bar</i>- |
| 349 | 259 | 0 | 0 | 90 |
总计：试验的个体数量；
HaHB4+bar+：对于HaHB4和bar CDS阳性的个体数量；
bar-HaHB4+：对于HaHB4 CDS阳性的个体数量；
HaHB4-bar+：对于bar CDS阳性的个体数量；
HaHB4-bar-：对于HaHB4和bar CDS阴性的个体数量。
表7显示了统计学分析。
表7. 分离结果的统计学分析。
χ2 (自由度= 1, α = 0.05)的值没有显示在预期结果和观察结果之间的统计学显著差异，表明对于分析的各CDS (HaHB4和bar)，孟德尔分离为3:1。
F2代获得的结果表明，两种转基因在性转移期间均稳定遗传。根据孟德尔准则，在分离群中两个基因具有3:1分离。最后，即使两个CDS来自通过轰击的共转化过程，这两个基因也有关联，因为每个分析的个体F2对于两个CDS，即bar和HaHB4，提供了相同结果。
用几乎检出整个CDS的寡核苷酸进行之前的分析。
在证实bar和HaHB4的完全CDS的稳定性后，决定继续表征其它遗传元件或其部分以及侧翼序列。为了检测IND-ØØ412-7中存在/不存在HaHB4、bar和bla转基因拷贝的目的，设计与所有拷贝(完全和不完全)杂交的寡核苷酸。此外，检测四个插入植物接合处以确定它们在F2代中的分离。在F2群的92个个体中进行这些研究。结果显示在表8中。
表8. 分离结果的统计学分析
对于分析的数据，F2代中的χ2值(d.f.=1, α=0,05)没有显示观察和预期的3:1分离率之间的统计学显著差异。
对于检测的IND-ØØ412-7的三个元件(HaHB4、bar和bla)和对于四个插入植物接合处(JPSa、JPSb、JPLa和JPLb)，分析的所有转基因植物提供了一致结果。这些结果支持了IND-ØØ412-7构建体位于小麦基因组内的单基因座和根据孟德尔遗传准则进行遗传的结论。
实施例4：产量增加作为非生物胁迫耐受性的指示物
在多个试验场所和种植日期进行15个现场试验以评价转基因事件IND-ØØ412-7和亲本非转基因对照品系(栽培变种Cadenza)的产量和产量组分。场所位于阿根廷的主要小麦生产区域内，范围在维度32° S和38° S之间。该区域覆盖了阿根廷小麦作物生产的不同环境条件。试验包括来自Kugler和Godoy (1974)所述的pampa小麦区的代表性位置：IIN (7个试验)、IIS (6个试验)和IV (2个试验)。在每个场所，种植日期根据农民的通常实践调整，北方场所在5月/6月开始和南方场所在7月开始。种植和收获日期在表9中报告。
对于每个场所在生长季节期间登记天气条件。在场所中登记的年降雨量的范围从分别对于试验H13和G12的424 mm至1497 mm (表10)，表明在场所和年份中宽泛的天气变化。在2013年期间生长期(6月至12月)期间累积降雨量登记值对于所有场所都低于500 mm。2013年种植的试验具有比2012年种植的试验更高概率的干旱胁迫条件。对于2012年，在所有场所对于相同时间的降雨量值高于500 mm (表10)。
在每个场所按照完全随机区组设计建立现场试验。在所有位置评价四个重复。田地由相隔0.2 m和长度5米的7列组成。所有现场试验与7列和5米长度的田地毗邻。在种植之前，通过PCR测试IND-ØØ412-7和Cadenza的种子库以分别确认Hahb4的存在和不存在。所有种子用杀虫剂(噻虫嗪, 0.4 mL kg-1)和杀真菌剂(苯醚甲环唑(Difenoconazole), 0.2 mLkg-1和精甲霜灵(Metalaxyl-M), 0.15 mL kg-1)使用相应产品标签上说明的方案处理。
应用于作物的所有化学品根据农民的通常实践进行。在秋天播种之前应用的除草剂由草甘膦(2.0 L ha-1)和甲磺隆(6.8 g ha-1)组成。在试验P12、D12、A12-1、A12-2、F12、H12、G12-1、G12-2和I12应用杀真菌剂以控制叶面真菌病。当50%的田地达到生长阶段5.1，在每个试验喷洒杀真菌剂一次(Zadoks, 1974)。在试验A12-1、A12-2、D12、F12、P12，在Zadoks生长阶段3.1应用杀虫剂喷洒以控制椿象(绿蝽属物种(Nezara sp.)、壁蝽属物种(Piezodorus sp.)和Dichelops sp.)。相反地，由于低的疾病和害虫压力，试验P13、D13、A13、F13、H13和I13无需杀真菌剂或杀虫剂喷洒而生长。在每个试验应用的肥料和化学品描述于表11。
评价各现场试验的农艺学数据。农艺学变量由以下组成：早立(NPL)、麦穗数量m-2(NE)、谷粒数量/麦穗(NGE)、千粒重(PMG)、测试重量(PH)、产量(REND)、空中生物量(BMA)和收获指数(IC)。
早立通过计算在分蘖之前在0.6 m2的中央田地区域浮现的植物来评价。NE、BMA、谷粒重(PG)、PMG和IC在收获时基于0.6 m2的中央田地样品评价。PMG基于每个田地收获的10 g谷粒样品评价。NGE根据以下计算：
NGE= (PG/NE) x 1000/PMG 等式[1]
以用于小麦商业化的阿根廷标准方案(购买者的谷粒秤)评价PH。基于试验A12-1、A12-2、D12、F12和H12的每个田地的中间5列评价产量。在剩余试验中，基于整个田地(7列)评价产量。产量通过谷粒湿度(13.5 %)进行校正并表示为kg ha-1。
转基因事件和对照Cadenza的数据使用Infostat (Di Rienzo等人, 2010)，使用95%置信水平、完全随机区组设计的ANOVA进行分析。在组合场所分析中对于REND、PMG、PH、NPL、NE、NGE、BMA和IC，在转基因事件和Cadenza之间进行比较。在该分析中，将各场所的数据合并，并且变量源包括基因型(转基因和对照)、环境和基因型-环境相互影响。
在组合场所分析中，从IND-ØØ412-7和对照之间的8个比较中检出了3个统计学显著差异(表12)。对于REND (p=0,0103)、PMG (p=0,0039)和PH (p=0,0430)，在IND-ØØ412-7和常规对照之间检出了统计学显著差异。此外，未检出统计学显著的试验-基因型相互影响。
IND-ØØ412-7的REND高于对照133 kg ha-1，这代表了平均产量增加5%。相反，IND-ØØ412-7的PMG和PH值显示低于对照。在事件和亲本对照之间未观察到周期或生物胁迫反应的一致差异。总之，在IND-ØØ412-7和对照之间产量的显著差异表明，转基因事件产生了更多种子/单位土地面积。由于在种子填充期间较低的源-汇比(这也导致较低PH)，可能出现较小的种子大小。在IND-ØØ412-7和对照之间的差异对于PMG和PH分别表现为5%和2%。
<110> 百塞生技有限公司
<120> 小麦转基因事件IND-ØØ412-7
<130> 22108
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 47126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 没有侧翼区的长插入物
<400> 1
tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa 60
aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact 120
catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg 180
atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg 240
aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag 300
gcgtatcacg aggccctttc gtctcgcgcg tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca 360
catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc 420
ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc tggcttaact atgcggcatc 480
agagcagatt gtactgagag tgcaccatat gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag 540
gagaaaatac cgcatcaggc gccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt gggaagggcg 600
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cattgcatgt ctaagttata aaaaattacc acatattttt tttgtcacac ttgtttgaag 840
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tgttctcctt tttttttgca aatagcttca cctatataat acttcatcca ttttattagt 1080
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aataatttag atataaaata gaataaaata aagtgactaa aaattaaaca aatacccttt 1260
aagaaattaa aaaaactaag gaaacatttt tcttgtttcg agtagataat gccagcctgt 1320
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cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg 3660
taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt 3720
atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga 3780
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cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga 3900
ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg 3960
ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct 4020
tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt 4080
aaacttggtc tgacagtttt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat 4140
gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat 4200
tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt 4260
aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag 4320
cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa 4380
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tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca 4620
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agtcccgcaa ttatacattt aatacgcgat agaaaacaaa atatagcgcg caaactagga 5400
taaattatcg cgcgcggtgt catctatgtt actagatcgg atccatgagc ccagaacgac 5460
gcccggccga catccgccgt gccaccgagg cggacatgcc ggcggtctgc accatcgtca 5520
accactacat cgagacaagc acggtcaact tccgtaccga gccgcaggaa ccgcaggagt 5580
ggacggacga cctcgtccgt ctgcgggagc gctatccctg gctcgtcgcc gaggtggacg 5640
gcgaggtcgc cggcatcgcc tacgcgggcc cctggaaggc acgcaacgcc tacgactgga 5700
cggccgagtc gaccgtgtac gtctcccccc gccaccagcg gacgggactg ggctccacgc 5760
tctacaccca cctgctgaag tccctggagg cacagggctt caagagcgtg gtcgctgtca 5820
tcgggctgcc caacgacccg agcgtgcgca tgcacgaggc gctcggatat gccccccgcg 5880
gcatgctgcg ggcggccggc ttcaagcacg ggaactggca tgacgtgggt ttctggcagc 5940
tggacttcag cctgccggta ccgccccgtc cggtcctgcc cgtcaccgag atcgatcgtt 6000
caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt gcgatgatta 6060
tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa tgcatgacgt 6120
tatttatgag atgggttttt atgattagag tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag 6180
aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca tctatgttac 6240
tagatcggaa ttcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca 6300
caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag 6360
tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt 6420
cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc 6480
gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg 6540
tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa 6600
agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg 6660
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catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg 12300
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ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 34020
gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 34080
cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 34140
agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 34200
catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 34260
tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 34320
cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 34380
gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 34440
taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc 34500
ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 34560
tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 34620
ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 34680
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gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 34860
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cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 35160
cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 35220
acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 35280
cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 35340
accatgatta cgaattccga tcgttcaaac atttggcaat aaagtttctt aagattgaat 35400
cctgttgccg gtcttgcgat gattatcata taatttctgt tgaattacgt taagcatgta 35460
ataattaaca tgtaatgcat gacgttattt atgagatggg tttttatgat tagagtcccg 35520
caattataca tttaatacgc gatagaaaac aaaatatagc gcgcaaacta ggataaatta 35580
tcgcgcgcgg tgtcatctat gttactagat cgatctcggt gacgggcagg accggacggg 35640
gcggtaccgg caggctgaag tccagctgcc agaaacccac gtcatgccag ttcccgtgct 35700
tgaagccggc cgcccgcagc atgccgcggg gggcatatcc gagcgcctcg tgcatgcgca 35760
cgctcgggtc gttgggcagc ccgatgacag cgaccacgct cttgaagccc tgtgcctcca 35820
gggacttcag caggtgggtg tagagcgtgg agcccagtcc cgtccgctgg tggcgggggg 35880
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gcagacggac gaggtcgtcc gtccactcct gcggttcctg cggctcggta cggaagttga 36060
ccgtgcttgt ctcgatgtag tggttgacga tggtgcagac cgccggcatg tccgcctcgg 36120
tggcacggcg gatgtcggcc gggcgtcgtt ctgggctcat ggatccaagc ttgcatgcct 36180
gcagtgcagc gtgacccggt cgtgcccctc tctagagata atgagcattg catgtctaag 36240
ttataaaaaa ttaccacata ttttttttgt cacacttgtt tgaagtgcag tttatctatc 36300
tttatacata tatttaaact ttactctacg aataatataa tctatagtac tacaataata 36360
tcagtgtttt agagaatcat ataaatgaac agttagacat ggtctaaagg acaattgagt 36420
attttgacaa caggactcta cagttttatc tttttagtgt gcatgtgttc tccttttttt 36480
ttgcaaatag cttcacctat ataatacttc atccatttta ttagtacatc catttagggt 36540
ttagggttaa tggtttttat agactaattt ttttagtaca tctattttat tctattttag 36600
cctctaaatt aagaaaacta aaactctatt ttagtttttt tatttaataa tttagatata 36660
aaatagaata aaataaagtg actaaaaatt aaacaaatac cctttaagaa attaaaaaaa 36720
ctaaggaaac atttttcttg tttcgagtag ataatgccag cctgttaaac gccgtcgacg 36780
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gcacggcatc tctgtcgctg cctctggacc cctctcgaga gttccgctcc accgttggac 36900
ttgctccgct gtcggcatcc agaaattgcg tggcggagcg gcagacgtga gccggcacgg 36960
caggcggcct cctcctcctc tcacggcacc ggcagctacg ggggattcct ttcccaccgc 37020
tccttcgctt tcccttcctc gcccgccgta ataaatagac accccctcca caccctcttt 37080
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tggctctagc cgttccgcag acgggatcga tttcatgatt ttttttgttt cgttgcatag 37440
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cttttcatgc ttttttttgt cttggttgtg atgatgtggt ctggttgggc ggtcgttcta 37560
gatcggagta gaattctgtt tcaaactacc tggtggattt attaattttg gatctgtatg 37620
tgtgtgccat acatattcat agttacgaat tgaagatgat ggatggaaat atcgatctag 37680
gataggtata catgttgatg cgggttttac tgatgcatat acagagatgc tttttgttcg 37740
cttggttgtg atgatgtggt gtggttgggc ggtcgttcat tcgttctaga tcggagtaga 37800
atactgtttc aaactacctg gtgtatttat taattttgga actgtatgtg tgtgtcatac 37860
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tgatgtgggt tttactgatg catatacatg atggcatatg cagcatctat tcatatgctc 37980
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tacgctattt atttgcttgg tactgtttct tttgtcgatg ctcaccctgt tgtttggtgt 38160
tacttctgca gggatccatg agcccagaac gacgcccggc cgacatccgc cgtgccaccg 38220
aggcggacat gccggcggtc tgcaccatcg tcaaccacta catcgagaca agcacggtca 38280
acttccgtac cgagccgcag gaaccgcagg agtggacgga cgacctcgtc cgtctgcggg 38340
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gcccctggaa ggcacgcaac gcctacgact ggacggccga gtcgaccgtg tacgtctccc 38460
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gtccggtcct gcccgtcacc gagatctgat ccgtcgacct gcagatcgtt caaacatttg 38760
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tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa tgcatgacgt tatttatgag 38880
atgggttttt atgattagag tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag aaaacaaaat 38940
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ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg 39360
agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca 39420
taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa 39480
cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc 39540
tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc 39600
gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct 39660
gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg 39720
tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag 39780
gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta 39840
cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg 39900
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tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt 40020
ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag 40080
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ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc 40200
tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat 40260
aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc 40320
acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag 40380
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ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg 40560
agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt 40620
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caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag 40980
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acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac 41220
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ccgcatcagg cgccattcgc cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg 41520
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tttagcctct aaattaagaa aactaaaact ctattttagt ttttttattt aataatttag 42120
atataaaata gaataaaata aagtgactaa aaattaaaca aatacccttt aagaaattaa 42180
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tggacttgct ccgctgtcgg catccagaaa ttgcgtggcg gagcggcaga cgtgagccgg 42420
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tctttcccca acctcgtgtt gttcggagcg cacacacaca caaccagatc tcccccaaat 42600
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gtatgtgtgt gccatacata ttcatagtta cgaattgaag atgatggatg gaaatatcga 43140
tctaggatag gtatacatgt tgatgcgggt tttactgatg catatacaga gatgcttttt 43200
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gtagaatact gtttcaaact acctggtgta tttattaatt ttggaactgt atgtgtgtgt 43320
catacatctt catagttacg agtttaagat ggatggaaat atcgatctag gataggtata 43380
catgttgatg tgggttttac tgatgcatat acatgatggc atatgcagca tctattcata 43440
tgctctaacc ttgagtacct atctattata ataaacaagt atgttttata attattttga 43500
tcttgatata cttggatgat ggcatatgca gcagctatat gtggattttt ttagccctgc 43560
cttcatacgc tatttatttg cttggtactg tttcttttgt cgatgctcac cctgttgttt 43620
ggtgttactt ctgcaggtcg actctagagg atccatcgat taggaagtaa ccatgagccc 43680
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catcgtcaac cactacatcg agacaagcac ggtcaacttc cgtaccgagc cgcaggaacc 43800
gcaggagtgg acggacgacc tcgtccgtct gcgggagcgc tatccctggc tcgtcgccga 43860
ggtggacggc gaggtcgccg gcatcgccta cgcgggcccc tggaaggcac gcaacgccta 43920
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ctccacgctc tacacccacc tgctgaagtc cctggaggca cagggcttca agagcgtggt 44040
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caattataca tttaatacgc gatagaaaac aaaatatagc gcgcaaacta ggataaatta 44460
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ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata 46500
agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt 46560
tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa 46620
ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt 46680
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ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg 46800
taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt tggcgggtgt 46860
cggggctggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca ccatatgcgg 46920
tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgcca ttcgccattc 46980
aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg 47040
gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca 47100
cgacgttgta aaacgacggc cagtgc 47126
<210> 2
<211> 19598
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 没有侧翼区的短插入物
<400> 2
ttggaacacc acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga 60
actacttact ctagcttccc ggtaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgt 120
aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc 180
cggactctag gcttcccggg caacaaatta attagactgg atggagggat aaagtttgca 240
gaccactttc tgcgctcggc ccttccgctg ggctgttcta tgcccgctga aatcaccagt 300
ctctctctac aaatctatct ctctctataa taatgtgtga gtagttccca gataagggaa 360
ttagggttct tatagggttt cgctcatgtg ttgagcatat aagaaaccct tagtatgtat 420
ttgtatttgg gctggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat 480
atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgccattcg 540
ccattcaggc tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc gctattacgc 600
cagctggcga aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc agggttttcc 660
cagtcacgac gttgtaaaac gacggccagt gcaagcttgc atgcctgcag tgcagcgtga 720
cccggtcgtg cccctctcta gagataatga gcattgcatg tctaagttat aaaaaattac 780
cacatatttt ttttgtcaca cttgtttgaa gtgcagttta tctatcttta tacatatatt 840
taaactttac tctacgaata atataatcta tagtactaca ataatatcag tgttttagag 900
aatcatataa atgaacagtt agacatggtc taaaggacaa ttgagtattt tgacaacagg 960
actctacagt tttatctttt tagtgtgcat gtgttctcct ttttttttgc aaatagcttc 1020
acctatataa tacttcatcc attttattag tacatccatt tagggtttag ggttaatggt 1080
ttttatagac taattttttt agtacatcta ttttattcta ttttagcctc taaattaaga 1140
aaactaaaac tctattttag tttttttatt taataattta gatataaaat agaataaaat 1200
aaagtgacta aaaattaaac aaataccctt taagaaatta aaaaaactaa ggaaacattt 1260
ttcttgtttc gagtagataa tgccagcctg ttaaacgccg tcgacgagtc taacggacac 1320
caaccagcga accagcagcg tcgcgtcggg ccaagcgaag cagacggcac ggcatctctg 1380
tcgctgcctc tggacccctc tcgagagttc cgctccaccg ttggacttgc tccgctgtcg 1440
gcatccagaa attgcgtggc ggagcggcag acgtgagccg gcacggcagg cggcctcctc 1500
ctcctctcac ggcaccggca gctacggggg attcctttcc caccgctcct tcgctttccc 1560
ttcctcgccc gccgtaataa atagacaccc cctccacacc ctctttcccc aacctcgtgt 1620
tgttcggagc gcacacacac acaaccagat ctcccccaaa tccacccgtc ggcgtacgcc 1680
gctcgtcctc cccccccccc cctctctacc ttctctagat cggcgttccg gtccatggtt 1740
agggcccggt agttctactt ctgttcatgt ttgtgttaga tccgtgtttg tgttagatcc 1800
gtgctgctag cgttcgtaca cggatgcgac ctgtacgtca gacacgttct gattgctaac 1860
ttgccagtgt ttctctttgg ggaatcctgg gatggctcta gccgttccgc agacgggatc 1920
gatttcatga ttttttttgt ttcgttgcat agggtttggt ttgccctttt cctttatttc 1980
aatatatgcc gtgcacttgt ttgtcgggtc atcttttcat gctttttttt gtcttcctgt 2040
ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg 2100
agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga 2160
agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg 2220
tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt 2280
tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg 2340
cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg 2400
aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga 2460
tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc 2520
tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactgtt attgccggga aaagtgtacg 2580
tatcaccgtt tgtgtgaaca acgaactgaa ctggcagact atcccctgca gaagtaacac 2640
caaacaacag ggtgagcatc gacaaaagaa acagtaccaa gcaaataaat agcgtatgaa 2700
ggcagggcta aaaaaatcca catatagctg ctgcatatgc catcatccaa gtatatcaag 2760
atcaaaataa ttataaaaca tacttgttta ttataataga taggtactca aggttagagc 2820
atatgaatag atgctgcata tgccatcatg tatatgcatc agtaaaaccc acatcaacat 2880
gtatacctat cctagatcga tatttccatc catcttaaac tcgtaactat gaagatgtat 2940
gacacacaca tacagttcca aaattaataa atacaccagg tagtttgaaa cagtattcta 3000
ctccgatcta gaacgaatga acgaccgccc aaccacacca catcatcaca accaagcgaa 3060
caaaaagcat ctctgtatat gcatcagtaa aacccgcatc aacatgtata cctatcctag 3120
aagtactata gattatatta ttcgtagagt aaagtttaaa tatatgtata aagatagata 3180
aactgcactt caaacaagtg tgacaaaaaa aatatgtggt aattttttat aacttagaca 3240
tgcaatgctc attatctcta gagaggggca cgaccgggtc acgctgcact gcaggcatgc 3300
aagcttggca ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca 3360
acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg 3420
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ttttctcctt acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata tggtgcactc tcagtacaat 3540
ctgctctgat gccgcatagt taagccagcc ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc 3600
ctgacgggct tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg tctccgggag 3660
ctgcatgtgt cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcgagacgaa agggcctcgt 3720
gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttaga cgtcaggtgg 3780
cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattacca 3840
atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc 3900
ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc 3960
tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc 4020
agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat 4080
taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt 4140
tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc 4200
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ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt 4320
tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac 4380
tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg 4440
cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat 4500
tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc 4560
gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc 4620
tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa 4680
atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg 4740
tctcatgagc ggatacatat ttgaaaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag 4800
attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat 4860
ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa 4920
aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taagccaata gaaggcagaa 4980
accctagccg tcatttttct tgaagaatat agagcgacgt cgataggaag atacttaaat 5040
gttgaatcca agcacctaga ataatgagtt agattagaag aaaactatca acttcgaaat 5100
caagaagaaa tgttttattc tgttgcataa aactttcgcg tggagaagct ctgttcagag 5160
cccgggtagc cactgggcac gtctcctaga tactggactc atcggacgct ctcctcgagt 5220
tgtccatcga gctctgtacc aagcaccgca tcgcaatcca ctcaaccagc tccgccgcga 5280
gcaggagcgc tccacgacac gcgacgccca agctggcacg cacctcgccg atggcccgat 5340
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agccgcgcca gggcgccacg tacagcggcg cgcgcgctac aaatacggtg ccccgagctc 5460
cattccccag caccagcaga gtcacacaca ctgagcgagc taaaccatca ggaagtgatg 5520
gagcatcagg gcggctatac gccatttgaa gccgatgtca cgccgtatgt tattgccggg 5580
aaaagtgtac gtatcaccgt ttgtgccgga atccatcgca gcgtaatgct ctacaccacg 5640
ccgaacacct gggtggacga tatcaccgtg gtgacgcatg tcgcgcaaga ctgtaaccac 5700
gcgtctgttg actggcaggt ggtggccaat ggtgatgtca gcgttgaact gcgtgatgcg 5760
gatcaacagg tggttgcaac tggacaaggc actagcggga ctttgcaagt ggtgaatccg 5820
cacctctggc aaccgggtga aggttatctc tatgaactgt gcgtcacagc caaaagccag 5880
acagagtgtg atatctaccc gcttcgcgtc ggcatccggt cagtggcagt gaagggcgaa 5940
cagttcctga ttaaccacaa accgttctac tttactggct ttggtcgtca tgaagatgcg 6000
gacttgcgtg gcaaaggatt cgataacgtg ctgttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc 6060
tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat 6120
aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc 6180
acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag 6240
aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag 6300
agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt 6360
ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg 6420
agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt 6480
tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc 6540
tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc 6600
attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa 6660
taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg 6720
aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc 6780
caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag 6840
gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt 6900
cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt 6960
tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc 7020
acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac 7080
gaggcccttt cgtctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct 7140
cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg 7200
cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat 7260
tgtactgaga gtgcaccata tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata 7320
ccgcatcagg cgccattcgc cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg 7380
ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg 7440
ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg caagcttgca 7500
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ctaagttata aaaaattacc acatattttt tttgtcacac ttgtttgaag tgcagtttat 7620
ctatctttat acatatattt aaactttact ctacgaataa tataatctat agtactacaa 7680
taatatcagt gttttagaga atcatataaa tgaacagtta gacatggtct aaaggacaat 7740
tgagtatttt gacaacagga ctctacagtt ttatcttttt agtgtgcatg tgttctcctt 7800
tttttttgca aatagcttca cctatataat acttcatcca ttttattagt acatccattt 7860
agggtttagg gttaatggtt tttatagact aattttttta gtacatctat tttattctat 7920
tttagcctct aaattaagaa aactaaaact ctattttagt ttttttattt aataatttag 7980
atataaaata gaataaaata aagtgactaa aaattaaaca aatacccttt aagaaattaa 8040
aaaaactaag gaaacatttt tcttgtttcg agtagataat gccagcctgt taaacgccgt 8100
cgacgagtct aacggacacc aaccagcgaa ccagcagcgt cgcgtcgggc caagcgaagc 8160
agacggcacg gcatctctgt ctgaatagaa tacaaaccct agaaaaacaa ggcacatctc 8220
ggcgccgcca atagaaggca gaaaccctag ccgtcatttt tcttgaagaa tatagagcga 8280
cgtcgatagg aagatactta aatgttgaat ccaagcacct agaataatga gttagattag 8340
aagaaaacta tcaacttcga aatcaagaag aaatgtttta ttctgttgca taaaactttc 8400
gcgtggagaa gctctgttca gagcccgggt agccactggg cacgtctcct agatactgga 8460
ctcatcggac gctctcctcg agttgtccat cgagctctgt accaagcacc gcatcgcaat 8520
ccactcaacc agctccgccg cgagcaggag cgctccacga cacgcgacgc ccaagctggc 8580
acgcacctcg ccgatggccc gataagcacg gccgtgcgac gtggcggccc gcctcccctc 8640
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tacaaatacg gtgccccgag ctccattccc cagcaccagc agagtcacac acactgagcg 8760
agctaaacca tggtatagcc gccctgatgc tccatcactt cctgattatt gacccacact 8820
ttgccgtaat gagtgaccgc atcgaaacgc agcacgatac gctggcctgc ccaacctttc 8880
ggtataaaga cttcgcgctg ataccagacg ttgcccgcat aattacgaat atctgcatcg 8940
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tcccaccaac gctgatcaat tccacagttt tcgcgatcca gactgaatgc ccacaggccg 9060
tcgagttttt tgatttcacg ggttggggtt tctacaggac gctattaatt gttgccggga 9120
agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg 9180
catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc 9240
aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc 9300
gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttcact gtcagaccaa 9360
gtttactcat atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag 9420
gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac 9480
tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc 9540
gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat 9600
caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat 9660
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acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt 9780
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cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg 9960
gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg 10020
tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc 10080
tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg 10140
gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat 10200
aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc 10260
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cgttggccga ttcattaatg cagctggcac gacaggtttc ccgactggaa agcgggcagt 10380
gagcgcaacg caattaatgt gagttagctc actcattagg caccccaggc tttacacttt 10440
atgcttccgg ctcgtatgtt gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac 10500
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tgcttaacgt aattcaacag aaattatatg ataatcatcg caagaccggc aacaggattc 10740
aatcttaaga aactttattg ccaaatgttt gaacgatctg caggtcgacg gatcagatct 10800
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ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt 12300
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tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg 12780
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ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtctcgcg cgtttcggtg atgacggtga 12900
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atagacaccc cctccacacc ctctttcccc aacctcgtgt tgttcggagc gcacacacac 14220
acaaccagat ctcccccaaa tccacccgtc ggcgtacgcc gctcgtcctc cccccccccc 14280
cctctctacc ttctctagat cggcgttccg gtccatggtt agggcccggt agttctactt 14340
ctgttcatgt ttgtgttaga tccgtgtttg tgttagatcc gtgctgctag cgttcgtaca 14400
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gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa 3360
agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg 3420
cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca 3480
cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa 3540
ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg 3600
gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg 3660
tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg 3720
acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc 3780
tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag 3840
attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac 3900
gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc 3960
ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag 4020
taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt 4080
ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag 4140
ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca 4200
gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact 4260
ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca 4320
gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg 4380
tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc 4440
atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg 4500
gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca 4560
tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt 4620
atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc 4680
agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc 4740
ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca 4800
tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa 4860
aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat 4920
tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa 4980
aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtctaagaa 5040
accattatta tcatgacatt aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc ctttcgtctc 5100
gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca 5160
gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt 5220
ggcgggtgtc ggggctggct taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac 5280
catatgcggt gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgccat 5340
tcgccattca ggctgcgcaa ctgttgggaa gggcgatcgg tgcgggcctc ttcgctatta 5400
cgccagctgg cgaaaggggg atgtgctgca aggcgattaa gttgggtaac gccagggttt 5460
tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtgcc 5496
<210> 5
<211> 47611
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有侧翼区的长插入物
<400> 5
taatggtgag tgtatgcgct tgcgtctgta ttgtgtttaa aaaactcatt ctaagaaact 60
cgtcatacag tgtccaccgt caaggagcca tctagtaggg tgtggatggg catgtgacag 120
gaaccttgtc gtgtgcacgt tgtatgtcgg tcttgttcaa tatgtcgtct gtttcctcgg 180
cttacatgct cttttacgtg tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc 240
agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg 300
acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag 360
ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg 420
gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg 480
acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtctcgcgcg tttcggtgat 540
gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg 600
gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc 660
tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag tgcaccatat gcggtgtgaa 720
ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gccattcgcc attcaggctg 780
cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca gctggcgaaa 840
gggggatgtg ctgcaaggcg attaagttgg gtaacgccag ggttttccca gtcacgacgt 900
tgtaaaacga cggccagtgc caagcttgca tgcctgcagt gcagcgtgac ccggtcgtgc 960
ccctctctag agataatgag cattgcatgt ctaagttata aaaaattacc acatattttt 1020
tttgtcacac ttgtttgaag tgcagtttat ctatctttat acatatattt aaactttact 1080
ctacgaataa tataatctat agtactacaa taatatcagt gttttagaga atcatataaa 1140
tgaacagtta gacatggtct aaaggacaat tgagtatttt gacaacagga ctctacagtt 1200
ttatcttttt agtgtgcatg tgttctcctt tttttttgca aatagcttca cctatataat 1260
acttcatcca ttttattagt acatccattt agggtttagg gttaatggtt tttatagact 1320
aattttttta gtacatctat tttattctat tttagcctct aaattaagaa aactaaaact 1380
ctattttagt ttttttattt aataatttag atataaaata gaataaaata aagtgactaa 1440
aaattaaaca aatacccttt aagaaattaa aaaaactaag gaaacatttt tcttgtttcg 1500
agtagataat gccagcctgt taaacgccgt cgacgagtct aacggacacc aaccagcgaa 1560
ccagcagcgt cgcgtcgggc caagcgaagc agacggcacg gcatctctgt cgctgcctct 1620
ggacccctct cgagagttcc gctccaccgt tggacttgct ccgctgtcgg catccagaaa 1680
ttgcgtggcg gagcggcaga cgtgagccgg cacggcaggc ggcctcctcc tcctctcacg 1740
gcaccggcag ctacggggga ttcctttccc accgctcctt cgctttccct tcctcgcccg 1800
ccgtaataaa tagacacccc ctccacaccc tctttcccca acctcgtgtt gttcggagcg 1860
cacacacaca caaccagatc tcccccaaat ccacccgtcg gcgtacgccg ctcgtcctcc 1920
cccccccccc ctctctacct tctctagatc ggcgttccgg tccatggtta gggcccggta 1980
gttctacttc tgttcatgtt tgtgttagat ccgtgtttgt gttagatccg tgctgctagc 2040
gttcgtacac ggatgcgacc tgtacgtcag acacgtaacg tccggagagt tcgtaaaccg 2100
atcatccgat tcttcaccgc tgccactact actagttttc tcttgatgct tttcggctac 2160
atttctcagc acctccaatt gattgagtag ggcctgattc tctttcttta gagactcgga 2220
tttagacgca agcgtctcgt agttatgctt tagcgcgtta tactcttgct caatctgcct 2280
cgactttgat cgcgcgcgtt tgttctggaa ccatatcgcc acttgacgag gatgaagccc 2340
gagtttatgt gccaactggt gtttcatcct taactcgggt ctcgactgtg tctcaaacat 2400
gtactctagg aaacttattt gtttgtcggt aaatcgtctc cgcccctcgt ttcggttctt 2460
cctggtggtt gttacttgtt gaagagacat ggatccgggt gtgatcctct atagtcgacc 2520
tgcagaagta acaccaaaca acagggtgag catcgacaaa agaaacagta ccaagcaaat 2580
aaatagcgta tgaaggcagg gctaaaaaaa tccacatata gctgctgcat atgccatcat 2640
ccaagtatat caagatcaaa ataattataa aacatacttg tttattataa tagataggta 2700
ctcaaggtta gagcatatga atagatgctg catatgccat catgtatatg catcagtaaa 2760
acccacatca acatgtatac ctatcctaga tcgatatttc catccatctt aaactcgtaa 2820
ctatgaagat gtatgacaca cacatacagt tccaaaatta ataaatacac caggtagttt 2880
gaaacagtat tctactccga tctagaacga atgaacgacc gcccaaccac accacatcat 2940
cacaaccaag cgaacaaaaa gcatctctgt atatgcatca gtaaaacccg catcaacatg 3000
tatacctatc ctagatcgat atttccatcc atcatcttca attcgtaact atgaatatgt 3060
atggcacaca catacagatc caaaattaat aaatccacca ggtagtttga aacagaattg 3120
gaattcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc 3180
acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta 3240
actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca 3300
gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc 3360
cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc 3420
tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat 3480
gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt 3540
ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg 3600
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tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt 3720
ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa 3780
gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta 3840
tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa 3900
caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa 3960
ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt 4020
cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt 4080
ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat 4140
cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat 4200
gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc 4260
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agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa 4380
catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac 4440
ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac 4500
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gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca 4680
ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc 4740
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gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa 4860
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gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa 4980
ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg 5040
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cattggtaaa actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc 5280
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cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaagatcg ttcaaacatt 5400
tggcaataaa gtttcttaag attgaatcct gttgccggtc ttgcgatgat tatcatataa 5460
tttctgttga attacgttaa gcatgtaata attaacatgt aatgcatgac gttatttatg 5520
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taacatgtaa tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt atgattagag tcccgcaatt 6360
atacatttaa tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata aattatcgcg 6420
cgcggtgtca tctatgttac tagatcggaa ttcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt 6480
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agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc 6600
tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag 6660
aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt 6720
cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga 6780
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cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc 7680
catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg 7740
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ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg 7920
caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc 7980
attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa 8040
agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc 8100
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gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag 8340
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cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc 8460
gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca 8520
gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg 8580
ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca ttattatcat 8640
gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt cgtctcgcgc gtttcggtga 8700
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ctacgaataa tataatctat agtactacaa taatatcagt gttttagaga atcatataaa 9300
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ctacctggtg gatttattaa ttttggatct gtatgtgtgt gccatacata ttcatagtta 10560
cgaattgaag atgatggatg gaaatatcga tctaggatag gtatacatgt tgatgcgggt 10620
tttactgatg catatacaga gatgcttttt gttcgcttgg ttgtgatgat gtggtgtggt 10680
tgggcggtcg ttcattcgtt ctagatcgga gtagaatact gtttcaaact acctggtgta 10740
tttattaatt ttggaactgt atgtgtgtgt catacatctt catagttacg agtttaagat 10800
ggatggaaat atcgatctag gataggtata catgttgatg tgggttttac tgatgcatat 10860
acatgatggc atatgcagca tctattcata tgctctaacc ttgagtacct atctattata 10920
ataaacaagt atgttttata attattttga tcttgatata cttggatgat ggcatatgca 10980
gcagctatat gtggattttt ttagccctgc cttcatacgc tatttatttg cttggtactg 11040
tttcttttgt cgatgctcac cctgttgttt ggtgttactt ctgcagggat ccatgagccc 11100
agaacgacgc ccggccgaca tccgccgtgc caccgaggcg gacatgccgg cggtctgcac 11160
catcgtcaac cactacatcg agacaagcac ggtcaacttc cgtaccgagc cgcaggaacc 11220
gcaggagtgg acggacgacc tcgtccgtct gcgggagcgc tatccctggc tcgtcgccga 11280
ggtggacggc gaggtcgccg gcatcgccta cgcgggcccc tggaaggcac gcaacgccta 11340
cgactggacg gccgagtcga ccgtgtacgt ctccccccgc caccagcgga cgggactggg 11400
ctccacgctc tacacccacc tgctgaagtc cctggaggca cagggcttca agagcgtggt 11460
cgctgtcatc gggctgccca acgacccgag cgtgcgcatg cacgaggcgc tcggatatgc 11520
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cgatcgttca aacatttggc aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc 11700
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catgacgtta tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata 11820
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cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg 39480
cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat 39540
aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc 39600
gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 39660
tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga 39720
agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt 39780
ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg 39840
taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc 39900
gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg 39960
gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc 40020
ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg 40080
ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc 40140
gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct 40200
caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt 40260
taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa 40320
aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa 40380
tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc 40440
tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct 40500
gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca 40560
gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt 40620
aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt 40680
gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc 40740
ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc 40800
tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt 40860
atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact 40920
ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc 40980
ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt 41040
ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg 41100
atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct 41160
gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa 41220
tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt 41280
ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc 41340
acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc 41400
tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt cgtctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa 41460
aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg 41520
agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg ctggcttaac 41580
tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata tgcggtgtga aataccgcac 41640
agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg cgccattcgc cattcaggct gcgcaactgt 41700
tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt 41760
gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg 41820
acggccagtg caagcttgca tgcctgcagt gcagcgtgac ccggtcgtgc ccctctctag 41880
agataatgag cattgcatgt ctaagttata aaaaattacc acatattttt tttgtcacac 41940
ttgtttgaag tgcagtttat ctatctttat acatatattt aaactttact ctacgaataa 42000
tataatctat agtactacaa taatatcagt gttttagaga atcatataaa tgaacagtta 42060
gacatggtct aaaggacaat tgagtatttt gacaacagga ctctacagtt ttatcttttt 42120
agtgtgcatg tgttctcctt tttttttgca aatagcttca cctatataat acttcatcca 42180
ttttattagt acatccattt agggtttagg gttaatggtt tttatagact aattttttta 42240
gtacatctat tttattctat tttagcctct aaattaagaa aactaaaact ctattttagt 42300
ttttttattt aataatttag atataaaata gaataaaata aagtgactaa aaattaaaca 42360
aatacccttt aagaaattaa aaaaactaag gaaacatttt tcttgtttcg agtagataat 42420
gccagcctgt taaacgccgt cgacgagtct aacggacacc aaccagcgaa ccagcagcgt 42480
cgcgtcgggc caagcgaagc agacggcacg gcatctctgt cgctgcctct ggacccctct 42540
cgagagttcc gctccaccgt tggacttgct ccgctgtcgg catccagaaa ttgcgtggcg 42600
gagcggcaga cgtgagccgg cacggcaggc ggcctcctcc tcctctcacg gcaccggcag 42660
ctacggggga ttcctttccc accgctcctt cgctttccct tcctcgcccg ccgtaataaa 42720
tagacacccc ctccacaccc tctttcccca acctcgtgtt gttcggagcg cacacacaca 42780
caaccagatc tcccccaaat ccacccgtcg gcacctccgc ttcaaggtac gccgctcgtc 42840
ctcccccccc ccccctctct accttctcta gatcggcgtt ccggtccatg gttagggccc 42900
ggtagttcta cttctgttca tgtttgtgtt agatccgtgt ttgtgttaga tccgtgctgc 42960
tagcgttcgt acacggatgc gacctgtacg tcagacacgt tctgattgct aacttgccag 43020
tgtttctctt tggggaatcc tgggatggct ctagccgttc cgcagacggg atcgatttca 43080
tgattttttt tgtttcgttg catagggttt ggtttgccct tttcctttat ttcaatatat 43140
gccgtgcact tgtttgtcgg gtcatctttt catgcttttt tttgtcttgg ttgtgatgat 43200
gtggtctggt tgggcggtcg ttctagatcg gagtagaatt ctgtttcaaa ctacctggtg 43260
gatttattaa ttttggatct gtatgtgtgt gccatacata ttcatagtta cgaattgaag 43320
atgatggatg gaaatatcga tctaggatag gtatacatgt tgatgcgggt tttactgatg 43380
catatacaga gatgcttttt gttcgcttgg ttgtgatgat gtggtgtggt tgggcggtcg 43440
ttcattcgtt ctagatcgga gtagaatact gtttcaaact acctggtgta tttattaatt 43500
ttggaactgt atgtgtgtgt catacatctt catagttacg agtttaagat ggatggaaat 43560
atcgatctag gataggtata catgttgatg tgggttttac tgatgcatat acatgatggc 43620
atatgcagca tctattcata tgctctaacc ttgagtacct atctattata ataaacaagt 43680
atgttttata attattttga tcttgatata cttggatgat ggcatatgca gcagctatat 43740
gtggattttt ttagccctgc cttcatacgc tatttatttg cttggtactg tttcttttgt 43800
cgatgctcac cctgttgttt ggtgttactt ctgcaggtcg actctagagg atccatcgat 43860
taggaagtaa ccatgagccc agaacgacgc ccggccgaca tccgccgtgc caccgaggcg 43920
gacatgccgg cggtctgcac catcgtcaac cactacatcg agacaagcac ggtcaacttc 43980
cgtaccgagc cgcaggaacc gcaggagtgg acggacgacc tcgtccgtct gcgggagcgc 44040
tatccctggc tcgtcgccga ggtggacggc gaggtcgccg gcatcgccta cgcgggcccc 44100
tggaaggcac gcaacgccta cgactggacg gccgagtcga ccgtgtacgt ctccccccgc 44160
caccagcgga cgggactggg ctccacgctc tacacccacc tgctgaagtc cctggaggca 44220
cagggcttca agagcgtggt cgctgtcatc gggctgccca acgacccgag cgtgcgcatg 44280
cacgaggcgc tcggatatgc cccccgcggc atgctgcggg cggccggctt caagcacggg 44340
aactggcatg acgtgggttt ctggcagctg gacttcagcc tgccggtacc gccccgtccg 44400
gtcctgcccg tcaccgagat ctgatccgtc gacctgcaga tcgttcaaac atttggcaat 44460
aaagtttctt aagattgaat cctgttgccg gtcttgcgat gattatcata taatttctgt 44520
tgaattacgt taagcatgta ataattaaca tgtaatgcat gacgttattt atgagatggg 44580
tttttatgat tagagtcccg caattataca tttaatacgc gatagaaaac aaaatatagc 44640
gcgcaaacta ggataaatta tcgcgcgcgg tgtcatctat gttactagat cggaattcgt 44700
aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca 44760
tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat 44820
taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt 44880
aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct 44940
cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 45000
aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 45060
aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc 45120
tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 45180
caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 45240
cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 45300
ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct 45360
gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 45420
agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta 45480
gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct 45540
acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa 45600
gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt 45660
gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta 45720
cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat 45780
caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa 45840
gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct 45900
cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta 45960
cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct 46020
caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg 46080
gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa 46140
gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt 46200
cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta 46260
catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca 46320
gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta 46380
ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct 46440
gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg 46500
cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac 46560
tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact 46620
gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa 46680
atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt 46740
ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat 46800
gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg 46860
acgtctaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc 46920
cctttcgtct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg 46980
agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt 47040
cagcgggtgt tggcgggtgt cggggctggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac 47100
tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca 47160
tcaggcgcca ttcgccattc aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct 47220
cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa 47280
cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc cagtgcgtcg actctagagg 47340
tccctcgacc atggctgtaa ggtcgccgaa tacaagggca tgggtggcga ggcctaagag 47400
gagtataatt tcttagacat ttgtcaatta taaacttctt ggtaaaagag catgtaagcc 47460
gaggaaacag acgacatatt gaacaagacc gacatacaac gtgcacacga caaggttcct 47520
gtcacatgcc catccacacc ctactagatg gctccttgac ggtggacact gtatgacgag 47580
tttcttagaa tgagtttttt aaacacaata c 47611
<210> 6
<211> 20418
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有侧翼区的短插入物
<400> 6
gagcgcgctt tcctatttag gatccaaatt ggcactgata ctaaactgct tagacgaatc 60
gcctggagta aaatcaacaa gctcggtttc agcagccgac ttaaacttca tcgccgggtc 120
atgctcggtg gttggcttct ttagagacgt catatccgcc aggtcaacat tattttgata 180
aaaattcatc tcctctgccg cacaaacaga ctcagcataa gccgcatcgc cttcttcaca 240
ttctagggct acctttcgac tcccattgag ggagtcccgg attagggggt gtttggaaca 300
ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta 360
ctctagcttc ccggtaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gtaggaccac 420
ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggactct 480
aggcttcccg ggcaacaaat taattagact ggatggaggg ataaagtttg cagaccactt 540
tctgcgctcg gcccttccgc tgggctgttc tatgcccgct gaaatcacca gtctctctct 600
acaaatctat ctctctctat aataatgtgt gagtagttcc cagataaggg aattagggtt 660
cttatagggt ttcgctcatg tgttgagcat ataagaaacc cttagtatgt atttgtattt 720
gggctggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg agagtgcacc atatgcggtg 780
tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc aggcgccatt cgccattcag 840
gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct tcgctattac gccagctggc 900
gaaaggggga tgtgctgcaa ggcgattaag ttgggtaacg ccagggtttt cccagtcacg 960
acgttgtaaa acgacggcca gtgcaagctt gcatgcctgc agtgcagcgt gacccggtcg 1020
tgcccctctc tagagataat gagcattgca tgtctaagtt ataaaaaatt accacatatt 1080
ttttttgtca cacttgtttg aagtgcagtt tatctatctt tatacatata tttaaacttt 1140
actctacgaa taatataatc tatagtacta caataatatc agtgttttag agaatcatat 1200
aaatgaacag ttagacatgg tctaaaggac aattgagtat tttgacaaca ggactctaca 1260
gttttatctt tttagtgtgc atgtgttctc cttttttttt gcaaatagct tcacctatat 1320
aatacttcat ccattttatt agtacatcca tttagggttt agggttaatg gtttttatag 1380
actaattttt ttagtacatc tattttattc tattttagcc tctaaattaa gaaaactaaa 1440
actctatttt agttttttta tttaataatt tagatataaa atagaataaa ataaagtgac 1500
taaaaattaa acaaataccc tttaagaaat taaaaaaact aaggaaacat ttttcttgtt 1560
tcgagtagat aatgccagcc tgttaaacgc cgtcgacgag tctaacggac accaaccagc 1620
gaaccagcag cgtcgcgtcg ggccaagcga agcagacggc acggcatctc tgtcgctgcc 1680
tctggacccc tctcgagagt tccgctccac cgttggactt gctccgctgt cggcatccag 1740
aaattgcgtg gcggagcggc agacgtgagc cggcacggca ggcggcctcc tcctcctctc 1800
acggcaccgg cagctacggg ggattccttt cccaccgctc cttcgctttc ccttcctcgc 1860
ccgccgtaat aaatagacac cccctccaca ccctctttcc ccaacctcgt gttgttcgga 1920
gcgcacacac acacaaccag atctccccca aatccacccg tcggcgtacg ccgctcgtcc 1980
tccccccccc cccctctcta ccttctctag atcggcgttc cggtccatgg ttagggcccg 2040
gtagttctac ttctgttcat gtttgtgtta gatccgtgtt tgtgttagat ccgtgctgct 2100
agcgttcgta cacggatgcg acctgtacgt cagacacgtt ctgattgcta acttgccagt 2160
gtttctcttt ggggaatcct gggatggctc tagccgttcc gcagacggga tcgatttcat 2220
gatttttttt gtttcgttgc atagggtttg gtttgccctt ttcctttatt tcaatatatg 2280
ccgtgcactt gtttgtcggg tcatcttttc atgctttttt ttgtcttcct gtttttgctc 2340
acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt 2400
acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt 2460
ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg 2520
ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact 2580
caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg 2640
ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga 2700
aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg 2760
aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa 2820
tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg ttattgccgg gaaaagtgta cgtatcaccg 2880
tttgtgtgaa caacgaactg aactggcaga ctatcccctg cagaagtaac accaaacaac 2940
agggtgagca tcgacaaaag aaacagtacc aagcaaataa atagcgtatg aaggcagggc 3000
taaaaaaatc cacatatagc tgctgcatat gccatcatcc aagtatatca agatcaaaat 3060
aattataaaa catacttgtt tattataata gataggtact caaggttaga gcatatgaat 3120
agatgctgca tatgccatca tgtatatgca tcagtaaaac ccacatcaac atgtatacct 3180
atcctagatc gatatttcca tccatcttaa actcgtaact atgaagatgt atgacacaca 3240
catacagttc caaaattaat aaatacacca ggtagtttga aacagtattc tactccgatc 3300
tagaacgaat gaacgaccgc ccaaccacac cacatcatca caaccaagcg aacaaaaagc 3360
atctctgtat atgcatcagt aaaacccgca tcaacatgta tacctatcct agaagtacta 3420
tagattatat tattcgtaga gtaaagttta aatatatgta taaagataga taaactgcac 3480
ttcaaacaag tgtgacaaaa aaaatatgtg gtaatttttt ataacttaga catgcaatgc 3540
tcattatctc tagagagggg cacgaccggg tcacgctgca ctgcaggcat gcaagcttgg 3600
cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc 3660
gccttgcagc acatccccct ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc 3720
gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatggcg cctgatgcgg tattttctcc 3780
ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg 3840
atgccgcata gttaagccag ccccgacacc cgccaacacc cgctgacgcg ccctgacggg 3900
cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg agctgcatgt 3960
gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac gcgcgagacg aaagggcctc gtgatacgcc 4020
tatttttata ggttaatgtc atgataataa tggtttctta gacgtcaggt ggcacttttc 4080
ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattac caatgcttaa 4140
tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc 4200
ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga 4260
taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa 4320
gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt 4380
gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg 4440
ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc 4500
aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg 4560
gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag 4620
cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt 4680
actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt 4740
caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac 4800
gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac 4860
ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag 4920
caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa 4980
tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga 5040
gcggatacat atttgaaaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt 5100
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cgtcattttt cttgaagaat atagagcgac gtcgatagga agatacttaa atgttgaatc 5340
caagcaccta gaataatgag ttagattaga agaaaactat caacttcgaa atcaagaaga 5400
aatgttttat tctgttgcat aaaactttcg cgtggagaag ctctgttcag agcccgggta 5460
gccactgggc acgtctccta gatactggac tcatcggacg ctctcctcga gttgtccatc 5520
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ccgtgcgacg tggcggcccg cctcccctct ggcacgcagc tcccctccac gtagccgcgc 5700
cagggcgcca cgtacagcgg cgcgcgcgct acaaatacgg tgccccgagc tccattcccc 5760
agcaccagca gagtcacaca cactgagcga gctaaaccat caggaagtga tggagcatca 5820
gggcggctat acgccatttg aagccgatgt cacgccgtat gttattgccg ggaaaagtgt 5880
acgtatcacc gtttgtgccg gaatccatcg cagcgtaatg ctctacacca cgccgaacac 5940
ctgggtggac gatatcaccg tggtgacgca tgtcgcgcaa gactgtaacc acgcgtctgt 6000
tgactggcag gtggtggcca atggtgatgt cagcgttgaa ctgcgtgatg cggatcaaca 6060
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gcaaccgggt gaaggttatc tctatgaact gtgcgtcaca gccaaaagcc agacagagtg 6180
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gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac 6660
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atacatatat ttaaacttta ctctacgaat aatataatct atagtactac aataatatca 7980
gtgttttaga gaatcatata aatgaacagt tagacatggt ctaaaggaca attgagtatt 8040
ttgacaacag gactctacag ttttatcttt ttagtgtgca tgtgttctcc tttttttttg 8100
caaatagctt cacctatata atacttcatc cattttatta gtacatccat ttagggttta 8160
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caatagaagg cagaaaccct agccgtcatt tttcttgaag aatatagagc gacgtcgata 8580
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tatcaacttc gaaatcaaga agaaatgttt tattctgttg cataaaactt tcgcgtggag 8700
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atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat 9720
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gtttagggtt aatggttttt atagactaat ttttttagta catctatttt attctatttt 19500
agcctctaaa ttaagaaaac taaaactcta ttttagtttt tttatttaat aatttagata 19560
taaaatagaa taaaataaag tgactaaaaa ttaaacaaat accctttaag aaattaaaaa 19620
aactaaggaa acatttttct tgtttcgagt agataatgcc agcctgttaa acgccgtcga 19680
cgagtctaac ggacaccaac cagcgaacca gcagcgtcgc gtcgggccaa gcgaagcaga 19740
cggcacggca tctctgtcgc tgcctctgga cccctctcga gagttccgct ccaccgttgg 19800
acttgctccc tttattttat tctattttat atctaaatta ttaaataaaa aaactaaaat 19860
agagttttag ttttcttaat ttagaggcta gtcccgaaca gtgtcctgga ggccgcacac 19920
gcttcggccc cgaccctcga ttcggagccc gctgcgttcg ttgaggaaga acgattggac 19980
gtcacctcag aggctgcgac attaaaggcg gtcgagtcga acgccgaccc cgcactccgc 20040
gctgcccatt actccgagga gccggattct tctccggcct ccgggccttc catgcccctg 20100
ccgaccgaat ccgattgggc acctgtaatg gagttcaccg ccgcggacat ctttcagtgt 20160
tcacctttca gtgacatcct gaattatctc aagtctctct ctttatcagg agagcccagg 20220
ccggattatg gtctgcgagg ttgggattcg gacgatgaag aaattcaaag cccacccacc 20280
acccacttaa tagccactgt cgacgattta accgacatgc tcgacttcgg ctccgaagac 20340
ttcgacggta tggacgacga aggaggagac gaaccggaac cagcacccac agggcactgg 20400
atatccacca cacacaat 20418
<210> 7
<211> 300
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'侧翼区(长插入物)
<400> 7
taatggtgag tgtatgcgct tgcgtctgta ttgtgtttaa aaaactcatt ctaagaaact 60
cgtcatacag tgtccaccgt caaggagcca tctagtaggg tgtggatggg catgtgacag 120
gaaccttgtc gtgtgcacgt tgtatgtcgg tcttgttcaa tatgtcgtct gtttcctcgg 180
cttacatgct cttttacgtg tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc 240
agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg 300
<210> 8
<211> 385
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3'侧翼区(长插入物)
<400> 8
tattacgcca gctggcgaaa gggggatgtg ctgcaaggcg attaagttgg gtaacgccag 60
ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtgc gtcgactcta gaggtccctc 120
gaccatggct gtaaggtcgc cgaatacaag ggcatgggtg gcgaggccta agaggagtat 180
aatttcttag acatttgtca attataaact tcttggtaaa agagcatgta agccgaggaa 240
acagacgaca tattgaacaa gaccgacata caacgtgcac acgacaaggt tcctgtcaca 300
tgcccatcca caccctacta gatggctcct tgacggtgga cactgtatga cgagtttctt 360
agaatgagtt ttttaaacac aatac 385
<210> 9
<211> 392
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'侧翼区(短插入物)
<400> 9
gagcgcgctt tcctatttag gatccaaatt ggcactgata ctaaactgct tagacgaatc 60
gcctggagta aaatcaacaa gctcggtttc agcagccgac ttaaacttca tcgccgggtc 120
atgctcggtg gttggcttct ttagagacgt catatccgcc aggtcaacat tattttgata 180
aaaattcatc tcctctgccg cacaaacaga ctcagcataa gccgcatcgc cttcttcaca 240
ttctagggct acctttcgac tcccattgag ggagtcccgg attagggggt gtttggaaca 300
ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta 360
ctctagcttc ccggtaacaa ttaatagact gg 392
<210> 10
<211> 628
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3'侧翼区(短插入物)
<400> 10
ccaccgttgg acttgctccc tttattttat tctattttat atctaaatta ttaaataaaa 60
aaactaaaat agagttttag ttttcttaat ttagaggcta gtcccgaaca gtgtcctgga 120
ggccgcacac gcttcggccc cgaccctcga ttcggagccc gctgcgttcg ttgaggaaga 180
acgattggac gtcacctcag aggctgcgac attaaaggcg gtcgagtcga acgccgaccc 240
cgcactccgc gctgcccatt actccgagga gccggattct tctccggcct ccgggccttc 300
catgcccctg ccgaccgaat ccgattgggc acctgtaatg gagttcaccg ccgcggacat 360
ctttcagtgt tcacctttca gtgacatcct gaattatctc aagtctctct ctttatcagg 420
agagcccagg ccggattatg gtctgcgagg ttgggattcg gacgatgaag aaattcaaag 480
cccacccacc acccacttaa tagccactgt cgacgattta accgacatgc tcgacttcgg 540
ctccgaagac ttcgacggta tggacgacga aggaggagac gaaccggaac cagcacccac 600
agggcactgg atatccacca cacacaat 628
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HB4正向引物
<400> 11
gggcttcatc ctggtcaagt ggc 23
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HB4反向引物
<400> 12
tcttgatgct tttctgctac atttctcagc 30
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Bar正向引物
<400> 13
cacgcaacgc ctacgactgg acggcc 26
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Bar反向引物
<400> 14
gtaccggcag gctgaagtcc agct 24
PCT/RO/134表
Claims (29)
1.包含事件IND-ØØ412-7的小麦植物或其部分，其中包含事件IND-ØØ412-7的代表性小麦种子已经以ATCC PTA-126141登录号保藏。
2.根据权利要求1所述的植物的种子，其中所述种子包含事件IND-ØØ412-7。
3.从根据权利要求2所述的种子得到的商品产品。
4.根据权利要求3所述的商品产品，其额外定义为粗粉、面粉、絮片、生物乙醇、生物气或其它生物材料。
5.根据权利要求1所述的小麦植物的部分，其定义为细胞、花粉、胚珠、花、芽、根或叶。
6.根据权利要求1所述的植物，其中与在相同条件下没有所述事件的植物相比，所述植物在非生物胁迫条件下产生提高的产量。
7.根据权利要求1所述的小麦植物，还定义为包含事件IND-ØØ412-7的小麦植物的任何世代的后代植物。
8.根据权利要求1所述的小麦植物，其中植物基因组包含含有SEQ ID No: 1和SEQ IDNo: 2的DNA分子。
9.根据权利要求7所述的小麦植物，其中当在DNA扩增方法中试验时，源自所述植物的DNA产生事件IND-ØØ412-7的诊断性扩增子，其包含SEQ ID No: 7、8、9和10中的该扩增子序列。
10.根据权利要求2所述的小麦植物，其中当在DNA扩增方法中试验时，源自所述种子的DNA产生事件IND-ØØ412-7的诊断性扩增子，其包含SEQ ID No: 7、8、9和10中的该扩增子序列。
11.根据权利要求4所述的粗粉、面粉、絮片、生物乙醇、生物气或其它生物材料，额外定义为包含DNA分子，当在DNA扩增方法中试验时，所述DNA分子产生事件IND-ØØ412-7的诊断性扩增子，其包含扩增子SEQ ID No: 7、8、9和10。
12.被包含在事件IND-ØØ412-7中的重组DNA分子，其特征在于包含SEQ ID No: 7、8、9和10中的序列且由以登录号ATCC PTA-126141进行的保藏代表。
13.根据权利要求12所述的DNA分子，其特征在于在非生物胁迫条件下提高小麦作物的产量。
14.根据权利要求12所述的重组DNA分子，其特征在于通过剪接SEQ ID No: 7、8、9和10中的序列的异源核酸分子和小麦植物细胞或种子而形成。
15.根据权利要求12所述的重组DNA分子，其特征在于存在于源自小麦转基因事件IND-ØØ412-7的小麦植物、植物细胞、种子、后代植物、植物的部分或商品产品中。
16.包含核酸分子的DNA分子，所述核酸分子的核苷酸序列与SEQ ID No: 1或SEQ IDNo: 2的一部分连续核苷酸序列互补，所述部分足以使它们作为DNA探针起作用，所述DNA探针在严格条件下与包含SEQ ID No: 1或SEQ ID No: 2的核苷酸序列的DNA分子杂交并且在严格条件下不与不包含SEQ ID No: 1或SEQ ID No: 2的核苷酸序列的DNA分子杂交。
17.一种DNA多核苷酸引物分子，其包含SEQ ID No: 5和SEQ ID No: 6的至少15个连续核苷酸或其互补序列，其可用于DNA扩增方法中以产生用于事件IND-ØØ412-7的诊断性扩增子。
18.一种分离的DNA多核苷酸引物分子，其包含SEQ ID NO: 11、12、13和14的序列。
19.一种在植物中的功能性表达序列，其特征在于包含SEQ ID No: 3和SEQ ID No: 4的序列。
20.根据权利要求19所述的如SEQ ID No: 3和SEQ ID No: 4所示的序列转化植物的用途。
21.一种DNA检测试剂盒，其至少包含DNA分子，该DNA分子包含具有SEQ ID No: 5或SEQID No: 6的一段连续核苷酸的核苷酸序列，该段连续核苷酸的长度足以作为DNA引物或特异性探针起作用来检测源自小麦转基因事件IND-ØØ412-7的DNA的存在，其中该DNA的检测证明该小麦转基因事件IND-ØØ412-7在样品中的存在。
22.一种生产耐受非生物胁迫的小麦植物的方法，所述方法包括下述步骤：
(a) 将事件IND-ØØ412-7引入小麦细胞的基因组中；
(b) 选择含有bar标志基因的细胞；和
(c) 从项目(b)的细胞再生小麦植物。
23.一种生产耐受非生物胁迫的小麦植物的方法，所述方法包括下述步骤：
(a) 将包含事件IND-ØØ412-7的第一小麦植物与缺乏事件IND-ØØ412-7的第二小麦植物杂交以产生后代植物；和
(b) 至少选择耐受非生物胁迫的包含事件IND-ØØ412-7的第一后代植物。
24.根据权利要求23所述的方法，其还包括自交所述第一后代植物以产生来自第二代的后代植物，并对于事件IND-ØØ412-7选择至少第一纯合植物。
25.一种检测属于小麦事件IND-ØØ412-7的DNA在样品中的存在的方法，其特征在于：
(a)将包含小麦DNA的样品与一组引物进行匹配，当在具有小麦事件IND-ØØ412-7的基因组DNA的核酸的扩增反应中使用时，所述引物产生小麦事件IND-ØØ412-7的诊断性扩增子；和
(b)进行核酸扩增反应，从而产生诊断性扩增子；和
(c)检测诊断性扩增子。
26.一种生产由小麦制成的商品产品的方法，其包括，
(a) 获得根据权利要求1所述的小麦植物或其部分；和
(b) 从所述小麦植物或其部分制备商品产品。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述商品产品定义为粗粉、面粉、絮片、蛋白分离物、生物乙醇、生物气或其它生物材料。
28.一种无生命植物材料，其包含根据权利要求12所述的重组DNA分子。
29.一种分离的DNA多核苷酸探针分子，其使用SEQ ID No: 11、12、13和14的核酸序列获得。
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