KR102341583B1 - 스플릿 인테인을 접목한 가용성 향상 이중 기능성 융합 태그를 이용한 재조합 섬유아세포 성장인자 수용체의 제조방법, 정제방법, 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 스플릿 인테인을 접목한 가용성-향상 이중-기능성 융합 태그(solubility-enhancing bifunctional fusion tag)를 이용한 인간 재조합 섬유아세포 성장인자 수용체의 제조방법, 정제방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 스플릿 인테인의 카르복실 말단 영역을 가용성 향상을 위한 퓨전 파트너와 융합해 가용성이 향상된 이중 기능성 태그를 제작하고, 이를 인간 섬유아세포 성장인자 수용체의 세포 외 도메인(extracellular domain)의 아미노 말단에 융합함으로써 가용성이 향상된 재조합 인간 섬유아세포 성장인자 수용체를 제조하고, 이로부터 스플릿 인테인의 아미노 말단 영역을 처리하여 이중 기능성 융합 태그 제거 및 단백질 정제를 동시에 수행하는 방법에 관한 것으로, 본 발명을 통해 가용성이 향상된 섬유아세포 성장인자 수용체의 세포 외 도메인(Ec-FGFR)의 생산과 친화성 태그 제거를 동시적으로 이루어지도록 함으로써, 종래 방법 대비 공정이 단순화되어 경제적이며, 도메인의 구조적인 균일성 확보가 가능하여, 다양한 질병의 진단 및 치료를 위한 약제학적 조성물 등의 개발에 유용하게 활용할 수 있다.
Description
본 발명은 스플릿 인테인을 접목한 가용성-향상 이중-기능성 융합 태그(solubility-enhancing bifunctional fusion tag)를 이용한 인간 재조합 섬유아세포 성장인자 수용체의 제조방법, 정제방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 스플릿 인테인의 카르복실 말단 영역을 가용성 향상을 위한 퓨전 파트너와 융합해 가용성이 향상된 이중 기능성 태그를 제작하고, 이를 인간 섬유아세포 성장인자 수용체의 세포 외 도메인(extracellular domain)의 아미노 말단에 융합함으로써 가용성이 향상된 재조합 인간 섬유아세포 성장인자 수용체를 제조하고, 이로부터 스플릿 인테인의 아미노 말단 영역을 처리하여 이중 기능성 융합 태그 제거 및 단백질 정제를 동시에 수행하는 방법에 관한 것이다.
섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor, FGF)는 세포 증식, 배아 발생 과정에서의 분화, 혈관 생성, 신경재생 조절 및 상처 치유 등 광범위한 생물학적 기능을 조절하는 신호 단백질로 현재까지 22종 정도가 보고되었다. 섬유아세포 성장인자의 상기 기능은 세포 표면에 발현된 섬유아세포 성장인자 수용체(fibroblast growth factor receptor, FGFR)와의 결합을 통해 유도된다.
상기 섬유아세포 성장인자 수용체는 면역글로블린(immunogloblin, Ig) 유사 구조를 갖는 세포 외 도메인(Ec), 세포막에서의 위치 지지를 위한 막 통과 도메인(transmembrane domain) 및 세포 내 신호 전달을 위한 티로신 키나아제 도메인(tyrosine kinase domain)의 3개의 도메인으로 구성되어 있다.
섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor, FGF)는 상기 섬유아세포 성장인자 수용체의 3게 도메인 중, 세포 외 도메인(Ec-FGFR)이 섬유아세포 성장인자(FGF)와 상호작용하여 세포 내로 신호를 전달한다. 상기 섬유아세포 성장인자 수용체는 다양한 질병에 대한 지표 역할을 수행하며, 일예로, 암세포의 표면에서 과발현(overexpression)되는 것으로 알려져 있으며, 암세포의 종류 및 발생 위치에 따라 과발현되는 섬유아세포 성장인자 수용체의 종류는 상이한 것으로 알려져 있다.
이와 같은 섬유아세포 성장인자 수용체의 질병과의 연관성을 기반으로, 최근 다수의 연구자들이 상기 수용체의 작용제(agonist) 또는 길항제(antagonist)로 활용 가능한 물질을 발굴하는 연구를 수행하고 있다. 그러나, 섬유아세포 성장인자 수용체 구조의 복잡성으로 인해 연구에 활용하기 위한 수용체 단백질 자체를 고순도로 분리하기에는 어려움이 많이 존재한다.
이에 대한 해결을 위해 세포 외 면역글로블린 유사 도메인과 세포 내 티로신 키나아제 도메인을 분리하여 생산하는 방법 등이 대체 방법으로 활용되고 있으나, 세포 외 면역글로불린 유사 도메인은 불용성 응집체의 형태로 발현되어 본래의 기능을 갖는 것이 어렵다.
또한, 말토오스 결합 단백질(maltose-binding protein, MBP)을 이용하여 섬유아세포 성장인자 수용체 와 막 통과 도메인(transmembrane domain) 의 정제를 대장균을 이용하여 수행한 결과가 보고된 바 있다(Bajinting and Ng, Bio-protocol 9(11):e3261, 2019). 그러나, 상기 보고에서도 섬유아세포 성장인자 수용체의 정제는 불용성 응집체로부터 수행되었으며, 가용성 발현율 및 고수율로 정제하는 기법에 대한 언급이 없어, 상기와 같은 문제점에 대한 해결방안의 도출이 절실한 상황이며, 이를 통해 다양한 질병의 진단 및 치료 방법 개발을 위해 고순도의 균일한 섬유아세포 성장인자 수용체를 대량생산이 가능할 것으로 보인다.
Bajinting and Ng, Bio-protocol 9(11):e3261, 2019.
Volkmann et al., FEBS Lett 586(1):79-84, 2012.
상기와 같은 문제의 해결을 위해, 본 발명에서는 섬유아세포 성장인자 수용체의 세포 외 도메인(Extracellular domin - fibroblast growth factor receptor, Ec-FGFR)의 가용성이 향상된 발현과 발현된 단백질의 고수율 정제를 동시에 수행할 수 있는 방법으로 가용성-향상 이중-기능성 융합 태그(solubility-enhancing bifunctional fusion tag)를 이용하여, 정제과정에서의 아미노산 서열 특이적 효소의 처리 없이 정제 과정이 동시에 이루어지도록 하는 방법을 제공하고자 하였다.
본 발명의 벡터는 목적 단백질을 코딩하는 핵산 서열 및 가용성-향상 이중-기능성 융합 태그(solubility-enhancing bifunctional fusion tag)를 코딩하는 핵산 서열이 접목된 핵산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 예에 따른 벡터에 있어서, 상기 가용성-향상 이중-기능성 융합 태그(solubility-enhancing bifunctional fusion tag)는 융합 파트너 및 스플릿 인테인(split intein)을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 벡터에 있어서, 상기 스플릿 인테인은 노스톡 펑티포르메(Nostoc punctiforme) 유래 DnaE 단백질의 카르복시 말단(Ic)을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 벡터에 있어서, 상기 가용성-향상 이중-기능성 융합 태그(solubility-enhancing bifunctional fusion tag)는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 벡터에 있어서, 상기 융합 파트너는 말토오스 결합 단백질(Maltose binding protein; MBP), 글루타치온-S-전이효소(Glutathione-S-transferase; GST), 티오레독신(Thioredoxin; Trx), NusA(N-utilization substance protein A), SUMO(Small Ubiquitin-like modifier)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 벡터에 있어서, 상기 목적 단백질은 호르몬류 및 이의 수용체, 생물학적반응 조절물질(biological response modifier) 및 이의 수용체, 사이토카인류 및 이의 수용체, 효소류, 항체류, 항체 단편류를 포함하는 생리활성 단백질일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 벡터에 있어서, 상기 목적 단백질은 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor, FGF), 인간 성장 호르몬(hGH), 인슐린, 난포자극호르몬(follicle-stimulating hormone, FSH), 인간 융모성 성선자극호르몬(human chorionic gonadotropin), 부갑상선호르몬(parathyroid hormone, PTH), 적혈구 촉진인자(EPO), 혈소판생성 촉진인자(TPO), 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF), 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(GM-CSF), 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터루킨, 대식세포 (marophage) 활성화 인자, 종양괴사인자(tumor necrosis factor), 조직플라스미노겐 활성체(tissue plasminogen activator), 혈액응고인자 Ⅶ/Ⅶa, hBMP2 (human bone morphogenic protein 2), KGF(keratinocyte growth factor), PDGF (platelet-derived growth factor), 알파-갈락토시다제 A(α-galactosidase A), 이두로네이트-2-설파타제(iduronate-2-sulfatase), 락타제(lactase), 아데노신 데아미나제(adenosine deaminase), 부티릴콜린에스터라제(butyrylcholinesterase), 키티나제(chitinase), 글루타메이트 디카복실라제(glutamate decarboxylase), 이미글루세라제(imiglucerase), 리파제(lipase), 유리카제(uricase), 혈소판-활성인자 아세틸하이드롤라제(platelet-activating factor acetylhydrolase), 중성 엔도펩티다제(neutral endopeptidase), 유로키나제, 스트렙토키나제, 마이엘로퍼옥시다제 (myeloperoxidase), 수퍼옥사이드디스뮤타제(superoxide dismutase), 보톨리늄 독소, 콜라게나제, 히알루로니다제 (hyaluronidase), L-아스파라기나제(L-asparaginase), 단일클론항체, 다클론항체, scFv, Fab, Fab', F(ab')2, Fd 및 이들의 단편으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 벡터에 있어서, 상기 목적 단백질은 서열번호 8 내지 서열번호 12로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 가용성이 향상된 재조합 융합 단백질의 제조방법은 목적 단백질을 코딩하는 핵산 서열 및 가용성-향상 이중-기능성 융합 태그(solubility-enhancing bifunctional fusion tag)를 코딩하는 핵산 서열이 접목된 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제작하는 단계; 상기 벡터를 숙주 세포에 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및 상기 형질전환체를 배양하여 가용성-향상 이중-기능성 융합 태그가 접목된 재조합 융합 단백질을 수득하는 단계;를 포함한다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성이 향상된 재조합 융합 단백질의 제조방법에 있어서, 상기 가용성-향상 이중-기능성 융합 태그(solubility-enhancing bifunctional fusion tag)는 융합 파트너 및 스플릿 인테인(split intein)을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성이 향상된 재조합 융합 단백질의 제조방법에 있어서, 상기 숙주 세포는 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 바실러스 속(Bacillus sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.), 클렙시엘라 속(Klebsiella sp.), 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.) 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 자이모모나스 속(Zymomonas sp.), 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.), 또는 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.)의 미생물일 수 있다.
본 발명의 가용성이 향상된 재조합 융합 단백질은 상기 제조방법으로 제조된다.
본 발명의 목적 단백질의 정제방법은 상기 제조방법으로 가용성이 향상된 재조합 융합 단백질을 제조하는 단계; 및 노스톡 펑티포르메(Nostoc punctiforme) 유래 DnaE 단백질의 아미노 말단(IN) 펩타이드를 첨가하는 단계;를 포함한다.
본 발명의 일 예에 따른 목적 단백질의 정제방법에 있어서, 상기 노스톡 펑티포르메(Nostoc punctiforme) 유래 DnaE 단백질의 아미노 말단(IN) 펩타이드의 서열은 PCR 증폭시 부반응의 방지를 위해 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 목적 단백질의 정제방법에 있어서, 상기 아미노산 돌연변이는 아미노 말단 1번 위치의 시스테인(Cystein)을 치환하는 것일 수 있다.
본 발명을 통해 가용성이 향상된 섬유아세포 성장인자 수용체의 세포 외 도메인(Ec-FGFR)의 생산과 친화성 태그 제거를 동시적으로 이루어지도록 함으로써, 종래 방법 대비 공정이 단순화되어 경제적이며, 도메인의 구조적인 균일성 확보가 가능하여, 다양한 질병의 진단 및 치료를 위한 약제학적 조성물 등의 개발에 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 섬유아세포 성장인자 수용체를 pQE30 벡터의 도입하여 발현한 결과를 나타낸 것이다(T: 전체 단백질, S: 가용성 분획).
도 2는 섬유아세포 성장인자 수용체에 말토오스 결합 단백질을 접목한 융합 단백질 MBP-FGFR-1, MBP-FGFR-2b, MBP-FGFR-2c, MBP-FGFR-3b, MBP-FGFR-3c, 및 MBP-FGFR-4를 코딩하는 염기서열을 각각 pMal-c2x에 도입하여 대장균에서 발현한 결과를 나타낸 것이다(T: 전체 단백질, S: 가용성 분획).
도 3은 가용성-향상 이중-기능성 융합 태그(solubility-enhancing bifunctional fusion tag)를 이용한 섬유아세포 성장인자 수용체(FGFR)의 정제과정을 도식화 한 것이다.
도 4는 MBP-FGFR1 및 MBP-FGFR2b를 이용하여 FGF1을 정제한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 가용성-향상 이중-기능성 융합 태그(solubility-enhancing bifunctional fusion tag)를 융합한 섬유아세포 성장인자 수용체의 세포 외 도메인(Ec-FGFR) 구초체의 모식도를 나타낸 것이다.
도 6은 가용성-향상 이중-기능성 융합 태그(solubility-enhancing bifunctional fusion tag)가 섬유아세포 성장인자 수용체의 세포 외 도메인 1(Ec-FGFR1)의 아미노 말단에 융합한 구조체를 갖는 플라스미드 pMSNC_FGFR1의 벡터 맵(vector map)이다.
도 7은 섬유아세포 성장인자 수용체의 세포 외 도메인(Ec-FGFR)으로부터 가용성-향상 이중-기능성 융합 태그(solubility-enhancing bifunctional fusion tag)의 절단을 위한 DnaE Npu 인테인의 아미노 말단 영역을 갖는 플라스미드 pQE30-N_Npu C1A의 벡터 맵이다.
도 8은 가용성-향상 이중-기능성 융합 태그(solubility-enhancing bifunctional fusion tag)를 갖는 섬유아세포 성장인자 수용체의 세포 외 도메인(Ec-FGFR) 들 및 DnaE Npu 인테인의 아미노 말단 영역(Npu IN)의 발현 결과를 나타낸 것이다(T: 전체 단백질, S: 가용성 분획).
도 9는 MSNC_FGFR1과 아미노 말단 영역 히스티딘 태그(6 x His N_Npu)의 정제 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 가용성-향상 이중-기능성 융합 태그(solubility-enhancing bifunctional fusion tag)의 절단 기능을 검증한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 가용성-향상 이중-기능성 융합 태그(solubility-enhancing bifunctional fusion tag)의 절단 효율을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 가용성-향상 이중-기능성 융합 태그(solubility-enhancing bifunctional fusion tag) 제거 후, 섬유아세포 성장인자 수용체의 세포 외 도메인 1(Ec-FGFR1)의 기능성 유지 확인을 위해 헤파린 컬럼(heparin column)을 이용하여 정제한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 섬유아세포 성장인자 수용체에 말토오스 결합 단백질을 접목한 융합 단백질 MBP-FGFR-1, MBP-FGFR-2b, MBP-FGFR-2c, MBP-FGFR-3b, MBP-FGFR-3c, 및 MBP-FGFR-4를 코딩하는 염기서열을 각각 pMal-c2x에 도입하여 대장균에서 발현한 결과를 나타낸 것이다(T: 전체 단백질, S: 가용성 분획).
도 3은 가용성-향상 이중-기능성 융합 태그(solubility-enhancing bifunctional fusion tag)를 이용한 섬유아세포 성장인자 수용체(FGFR)의 정제과정을 도식화 한 것이다.
도 4는 MBP-FGFR1 및 MBP-FGFR2b를 이용하여 FGF1을 정제한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 가용성-향상 이중-기능성 융합 태그(solubility-enhancing bifunctional fusion tag)를 융합한 섬유아세포 성장인자 수용체의 세포 외 도메인(Ec-FGFR) 구초체의 모식도를 나타낸 것이다.
도 6은 가용성-향상 이중-기능성 융합 태그(solubility-enhancing bifunctional fusion tag)가 섬유아세포 성장인자 수용체의 세포 외 도메인 1(Ec-FGFR1)의 아미노 말단에 융합한 구조체를 갖는 플라스미드 pMSNC_FGFR1의 벡터 맵(vector map)이다.
도 7은 섬유아세포 성장인자 수용체의 세포 외 도메인(Ec-FGFR)으로부터 가용성-향상 이중-기능성 융합 태그(solubility-enhancing bifunctional fusion tag)의 절단을 위한 DnaE Npu 인테인의 아미노 말단 영역을 갖는 플라스미드 pQE30-N_Npu C1A의 벡터 맵이다.
도 8은 가용성-향상 이중-기능성 융합 태그(solubility-enhancing bifunctional fusion tag)를 갖는 섬유아세포 성장인자 수용체의 세포 외 도메인(Ec-FGFR) 들 및 DnaE Npu 인테인의 아미노 말단 영역(Npu IN)의 발현 결과를 나타낸 것이다(T: 전체 단백질, S: 가용성 분획).
도 9는 MSNC_FGFR1과 아미노 말단 영역 히스티딘 태그(6 x His N_Npu)의 정제 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 가용성-향상 이중-기능성 융합 태그(solubility-enhancing bifunctional fusion tag)의 절단 기능을 검증한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 가용성-향상 이중-기능성 융합 태그(solubility-enhancing bifunctional fusion tag)의 절단 효율을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 가용성-향상 이중-기능성 융합 태그(solubility-enhancing bifunctional fusion tag) 제거 후, 섬유아세포 성장인자 수용체의 세포 외 도메인 1(Ec-FGFR1)의 기능성 유지 확인을 위해 헤파린 컬럼(heparin column)을 이용하여 정제한 결과를 나타낸 것이다.
이하 첨부한 도면들을 참조하여 본 발명에 따른 스플릿 인테인을 접목한 가용성 향상 이중 기능성 융합 태그를 이용한 재조합 섬유아세포 성장인자 수용체의 제조방법, 정제방법, 및 이의 용도 에 대해 상세히 설명한다.
다음에 소개되는 도면들은 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이다. 따라서 본 발명은 이하 제시되는 도면들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있으며, 이하 제시되는 도면들은 본 발명의 사상을 명확히 하기 위해 과장되어 도시될 수 있다.
본 발명의 명세서에서 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
또한 본 발명의 명세서에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 특별한 지시가 없는 한 복수 형태도 포함하는 것으로 의도할 수 있다.
또한 본 발명의 명세서에서 특별한 언급 없이 사용된 단위는 중량을 기준으로 하며, 일 예로 % 또는 비의 단위는 중량% 또는 중량비를 의미한다.
본 발명에서 “목적 단백질(target protein)”은 당업자가 대량으로 생산하고자 하는 단백질로서, 재조합 발현벡터에 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하여 형질전환체에서 발현이 가능한 모든 단백질을 의미한다.
또한, "재조합 단백질(recombinant protein)“또는 ”융합 단백질(fusion protein)"은 최초 목적 단백질 서열의 N-말단 또는 C-말단에 다른 단백질이 연결되거나 다른 아미노산 서열이 부가된 단백질을 의미한다. 본 발명의 융합파트너와 목적단백질이 연결된 재조합 융합 단백질 형태 또는 단백질 절단 효소에 의해 융합파트너가 제거된 목적 단백질의 재조합 단백질을 의미한다.
“벡터(vector)” 또는 "발현 벡터(expression vector)"는 유전자 전사와 번역에 제공되는 요소와 추가 단편으로 구성되어 작동 가능하도록 연결된 폴리펩티드를 암호화하는 단편으로 구성되는 선형 또는 원형의 DNA 분자이다. 추가 단편은 프로모터 및 전사 종료 신호서열을 포함한다. 벡터 또는 발현벡터는 하나 이상의 복제 개시점과 하나 이상의 선택 마커 등을 포함한다. 벡터 또는 발현벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유도되거나, 또는 둘 다의 요소를 포함한다.
또한 본 발명의 명세서에서, “포함한다”는 표현은 “구비한다”, “함유한다”, “가진다” 또는 “특징으로 한다” 등의 표현과 등가의 의미를 가지는 개방형 기재이며, 추가로 열거되어 있지 않은 요소, 재료 또는 공정을 배제하지 않는다. 또한 “실질적으로…로 구성된다”는 표현은 특정된 요소, 재료 또는 공정과 함께 열거되어 있지 않은 다른 요소, 재료 또는 공정이 발명의 적어도 하나의 기본적이고 신규한 기술적 사상에 허용할 수 없을 만큼의 현저한 영향을 미치지 않는 양으로 존재할 수 있는 것을 의미한다. 또한 “구성된다”는 표현은 기재된 요소, 재료 또는 공정만이 존재하는 것을 의미한다.
본 발명의 명세서에서 사용된 용어, "성분", "조성물", "화합물의 조성물", "화합물", "약물", "약학적 활성제", "활성제", "치유" "치료법" "치료" 또는 "약제"는 대상체(인간 또는 동물)에 투여될 때 국소 및/또는 전신 작용에 의해 원하는 약학적 및/또는 생리학적 효과를 유도하는 화합물 또는 화합물(들) 또는 물질의 조성물을 의미하기 위해 상호교환적으로 사용된다.
본 발명의 명세서에서 사용된 용어 "치료" 또는 "치료법"(뿐만 아니라 그의 상이한 형태)는 예방적 (예: 예방적 치료), 치유적 또는 경감성 치료를 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "치료하는"은 상태, 질환 또는 장애의 적어도 하나의 유해 또는 부정적 효과 또는 증상을 경감시키거나 감소시키는 것을 포함한다.
본 발명에 있어 “샘플” 또는 “시료”는 분석을 위한 대상을 나타내는 것으로, 명세서에 걸쳐 동일한 의미로 사용되었다.
이하 본 발명의 벡터에 대해 상세히 설명한다.
본 발명의 벡터는 목적 단백질을 코딩하는 핵산 서열 및 가용성-향상 이중-기능성 융합 태그(solubility-enhancing bifunctional fusion tag)를 코딩하는 핵산 서열이 접목된 핵산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 예에 따른 벡터에 있어서, 상기 가용성-향상 이중-기능성 융합 태그(solubility-enhancing bifunctional fusion tag)는 융합 파트너 및 스플릿 인테인(split intein)을 포함할 수 있다.
단백질 스플라이싱(protein splicing)은 mRNA의 성숙 과정에서 발생하는 RNA 스플라이싱(RNA splicing)과 유사한 과정이 단백질에서 발생하는 현상으로, 인테인(intein) 단백질에 의해 유도된다.
인테인 단백질의 자발적인 펩타이드 결합 및 절단 능력은 단백질의 환영화, 단백질 정제, 단백질 절단 또는 단백질의 접합 등 다양한 분야에서 활용된다. 단백질의 절단으로의 활용에 있어서, 인테인은 서열 특이적인 단백질 절단효소로 사용될 수 있다.
상기 인테인의 아미노 말단 영역 중 단백질 스플라이싱 효율이 우수하고 카르복실 말단 영역이 짧은 서열을 활용하는 것이 좋으며, 이를 위해 본 발명의 일 실시예에서와 같이 노스톡 펑티포르메(Nostoc punctiforme) 유래 DnaE 단백질의 카르복시 말단 서열(Npu IC) 등을 이용할 수 있으나, 이는 융합 파트너 및 목적 단백질의 종류 등에 따라 달라질 수 있으며, 상기 서열에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예에 따른 벡터에 있어서, 상기 스플릿 인테인은 노스톡 펑티포르메(Nostoc punctiforme) 유래 DnaE 단백질의 카르복시 말단(Ic)을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
상기 스플릿 인테인의 카르복시 말단은 본 발명의 목적인 가용성의 향상 및 목적 단백질의 분리 정제가 가능하다면 그 서열의 길이 또는 아미노산의 종류에 특별한 제한이 있는 것은 아니나, 본 발명의 일 실시예(도 5 등)로부터, 일예로 “IKIATRKYLGKQNVYDIGVERDHNFALKNGFIASNCFNK” 등의 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니며, 필요에 따라 상기 아미노산 삭제, 첨가, 치환 등의 돌연변이를 도입할 수도 있다. 이를 통해 목적 단백질의 아미노 말단에 최대 1개의 아미노산 추가로 융합 단백질의 구성이 가능하고, 상기 아미노 말단의 아미노산이 시스테인(cystein, CYS)인 경우, 아미노산의 추가 없이 절단 위치의 지정이 가능하여, 효율성을 크게 향상시킬 수 있어 바람직하다.
상기 스플릿 인테인은 융합 태그의 용이한 절제 등의 필요에 따라 카르복시 말단에 익스테인(extein) 서열을 추가로 접목할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예(도 5 등)으로부터, 일예로 야생형의 “CFNKTSGS” 등의 서열로 이루어질 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니며, 필요에 따라 상기 아미노산 삭제, 첨가, 치환 등의 돌연변이를 도입할 수도 있다.
본 발명의 일 예에 따른 벡터에 있어서, 상기 가용성-향상 이중-기능성 융합 태그(solubility-enhancing bifunctional fusion tag)는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 벡터에 있어서, 상기 융합 파트너는 말토오스 결합 단백질(Maltose binding protein; MBP), 글루타치온-S-전이효소(Glutathione-S-transferase; GST), 티오레독신(Thioredoxin; Trx), NusA(N-utilization substance protein A), SUMO(Small Ubiquitin-like modifier)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있으며, 일예로 말토오스 결합 단백질(MBP)을 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 일 예에 따른 벡터에 있어서, 상기 목적 단백질은 호르몬류 및 이의 수용체, 생물학적반응 조절물질(biological response modifier) 및 이의 수용체, 사이토카인류 및 이의 수용체, 효소류, 항체류, 항체 단편류를 포함하는 생리활성 단백질일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 벡터에 있어서, 상기 목적 단백질은 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor, FGF), 인간 성장 호르몬(hGH), 인슐린, 난포자극호르몬(follicle-stimulating hormone, FSH), 인간 융모성 성선자극호르몬(human chorionic gonadotropin), 부갑상선호르몬(parathyroid hormone, PTH), 적혈구 촉진인자(EPO), 혈소판생성 촉진인자(TPO), 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF), 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(GM-CSF), 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터루킨, 대식세포 (marophage) 활성화 인자, 종양괴사인자(tumor necrosis factor), 조직플라스미노겐 활성체(tissue plasminogen activator), 혈액응고인자 Ⅶ/Ⅶa, hBMP2 (human bone morphogenic protein 2), KGF(keratinocyte growth factor), PDGF (platelet-derived growth factor), 알파-갈락토시다제 A(α-galactosidase A), 이두로네이트-2-설파타제(iduronate-2-sulfatase), 락타제(lactase), 아데노신 데아미나제(adenosine deaminase), 부티릴콜린에스터라제(butyrylcholinesterase), 키티나제(chitinase), 글루타메이트 디카복실라제(glutamate decarboxylase), 이미글루세라제(imiglucerase), 리파제(lipase), 유리카제(uricase), 혈소판-활성인자 아세틸하이드롤라제(platelet-activating factor acetylhydrolase), 중성 엔도펩티다제(neutral endopeptidase), 유로키나제, 스트렙토키나제, 마이엘로퍼옥시다제 (myeloperoxidase), 수퍼옥사이드디스뮤타제(superoxide dismutase), 보톨리늄 독소, 콜라게나제, 히알루로니다제 (hyaluronidase), L-아스파라기나제(L-asparaginase), 단일클론항체, 다클론항체, scFv, Fab, Fab', F(ab')2, Fd 및 이들의 단편으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있다.
또한, 상기 목적 단백질은 상기 단백질의 일부일 수 있으며, 구체적으로 가능한 수용체, 생물학적 조절물질 및 이의 수용체, 효소, 항체의 단편 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 목적 단백질은 일예로, 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor, FGF)의 수용체(fibroblast growth factor, FGFR)의 일부로 세포 외 도메인(Extracellular domain)인 Ec-FGFR일 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니며, 상기 섬유아세포 성장인자 세포 외 도메인은 별도의 링커(linker)를 사용하거나 또는 사용하지 않고 직접 카르복시 말단에 융합할 수 있으며, 좋게는 별도의 링커 없이 융합하는 것이 좋으며, 이를 통해 가용성이 향상된 발현 효과 및 종래의 기능을 유지한 채로 고순도의 목적 단백질을 정제할 수 있는 효과가 있어 바람직하나, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예에 따른 벡터에 있어서, 상기 목적 단백질은 서열번호 8 내지 서열번호 12로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
이하 본 발명의 가용성이 향상된 재조합 융합 단백질의 제조방법에 대해 상세히 설명한다.
본 발명의 가용성이 향상된 재조합 융합 단백질의 제조방법은 목적 단백질을 코딩하는 핵산 서열 및 가용성-향상 이중-기능성 융합 태그(solubility-enhancing bifunctional fusion tag)를 코딩하는 핵산 서열이 접목된 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제작하는 단계; 상기 벡터를 숙주 세포에 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및 상기 형질전환체를 배양하여 가용성-향상 이중-기능성 융합 태그가 접목된 재조합 융합 단백질을 수득하는 단계;를 포함한다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성이 향상된 재조합 융합 단백질의 제조방법에 있어서, 상기 가용성-향상 이중-기능성 융합 태그(solubility-enhancing bifunctional fusion tag)는 융합 파트너 및 스플릿 인테인(split intein)을 포함할 수 있다.
단백질 스플라이싱(protein splicing)은 mRNA의 성숙 과정에서 발생하는 RNA 스플라이싱(RNA splicing)과 유사한 과정이 단백질에서 발생하는 현상으로, 인테인(intein) 단백질에 의해 유도된다.
인테인 단백질의 자발적인 펩타이드 결합 및 절단 능력은 단백질의 환영화, 단백질 정제, 단백질 절단 또는 단백질의 접합 등 다양한 분야에서 활용된다. 단백질의 절단으로의 활용에 있어서, 인테인은 서열 특이적인 단백질 절단효소로 사용될 수 있다.
상기 인테인의 아미노 말단 영역 중 단백질 스플라이싱 효율이 우수하고 카르복실 말단 영역이 짧은 서열을 활용하는 것이 좋으며, 이를 위해 본 발명의 일 실시예에서와 같이 노스톡 펑티포르메(Nostoc punctiforme) 유래 DnaE 단백질의 카르복시 말단 서열(Npu IC) 등을 이용할 수 있으나, 이는 융합 파트너 및 목적 단백질의 종류 등에 따라 달라질 수 있으며, 상기 서열에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성이 향상된 재조합 융합 단백질의 제조방법에 있어서, 상기 융합 파트너는 말토오스 결합 단백질(Maltose binding protein; MBP), 글루타치온-S-전이효소(Glutathione-S-transferase; GST), 티오레독신(Thioredoxin; Trx), NusA(N-utilization substance protein A), SUMO(Small Ubiquitin-like modifier)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있으며, 일예로 말토오스 결합 단백질(MBP)을 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성이 향상된 재조합 융합 단백질의 제조방법에 있어서, 상기 스플릿 인테인은 노스톡 펑티포르메(Nostoc punctiforme) 유래 DnaE 단백질의 카르복시 말단(Ic)을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
이를 통해 3차원 접힘(3-dimensional folding)이 진행된 후, 상기 인테인의 아미노 말단 도메인을 가하여, 융합 태그가 저절로 분리될 수 있는 효과를 얻을 수 있어 바람직하다.
상기 스플릿 인테인의 카르복시 말단은 본 발명의 목적인 가용성의 향상 및 목적 단백질의 분리 정제가 가능하다면 그 서열의 길이 또는 아미노산의 종류에 특별한 제한이 있는 것은 아니나, 본 발명의 일 실시예(도 5 등)로부터, 일예로 “IKIATRKYLGKQNVYDIGVERDHNFALKNGFIASNCFNK” 등의 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니며, 필요에 따라 상기 아미노산 삭제, 첨가, 치환 등의 돌연변이를 도입할 수도 있다. 이를 통해 목적 단백질의 아미노 말단에 최대 1개의 아미노산 추가로 융합 단백질의 구성이 가능하고, 상기 아미노 말단의 아미노산이 시스테인(cystein, CYS)인 경우, 아미노산의 추가 없이 절단 위치의 지정이 가능하여, 효율성을 크게 향상시킬 수 있어 바람직하다.
상기 스플릿 인테인은 융합 태그의 용이한 절제 등의 필요에 따라 카르복시 말단에 익스테인(extein) 서열을 추가로 접목할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예(도 5 등)으로부터, 일예로 야생형의 “CFNKTSGS” 등의 서열로 이루어질 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니며, 필요에 따라 상기 아미노산 삭제, 첨가, 치환 등의 돌연변이를 도입할 수도 있다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성이 향상된 재조합 융합 단백질의 제조방법에 있어서, 상기 숙주 세포는 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 원핵생물, 고세균 또는 진핵생물 중에서 선택될 수 있는 것으로 특별히 제한되지는 않으나, 일예로, 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 바실러스 속(Bacillus sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.), 클렙시엘라 속(Klebsiella sp.), 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.) 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 자이모모나스 속(Zymomonas sp.), 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.), 또는 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.)의 미생물일 수 있으며, 바람직하게는 에스케리치아 속에 속하는 종일 수 있으며, 보다 바람직하게는 대장균(Escherichia coli)일 수 있고, 더욱 바람직하게는 대장균 (Escherichia coli) XL1-blue일 수 있다. 상기 숙주 세포를 이용함으로써, 본 발명의 Ec-EGFR 단백질의 가용성 발현량이 현저히 우수하고, 목적 단백질의 분리 정제를 보다 간편한 과정으로 수행할 수 있어 바람직하다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성이 향상된 재조합 융합 단백질의 제조방법에 있어서, 상기 가용성-향상 이중-기능성 융합 태그(solubility-enhancing bifunctional fusion tag)는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, 이를 통해 목적 단백질을 포함하는 재조합 융합 단백질의 가용성을 향상시키고, 숙주 세포에서의 발현을 통해 궁극적으로 목적 단백질의 정제 효과를 향상시킬 수 있어 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성이 향상된 재조합 융합 단백질의 제조방법에 있어서, 상기 목적 단백질은 호르몬류 및 이의 수용체, 생물학적반응 조절물질(biological response modifier) 및 이의 수용체, 사이토카인류 및 이의 수용체, 효소류, 항체류, 항체 단편류를 포함하는 생리활성 단백질일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성이 향상된 재조합 융합 단백질의 제조방법에 있어서, 상기 목적 단백질은 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor, FGF), 인간 성장 호르몬(hGH), 인슐린, 난포자극호르몬(follicle-stimulating hormone, FSH), 인간 융모성 성선자극호르몬(human chorionic gonadotropin), 부갑상선호르몬(parathyroid hormone, PTH), 적혈구 촉진인자(EPO), 혈소판생성 촉진인자(TPO), 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF), 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(GM-CSF), 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터루킨, 대식세포 (marophage) 활성화 인자, 종양괴사인자(tumor necrosis factor), 조직플라스미노겐 활성체(tissue plasminogen activator), 혈액응고인자 Ⅶ/Ⅶa, hBMP2 (human bone morphogenic protein 2), KGF(keratinocyte growth factor), PDGF (platelet-derived growth factor), 알파-갈락토시다제 A(α-galactosidase A), 이두로네이트-2-설파타제(iduronate-2-sulfatase), 락타제(lactase), 아데노신 데아미나제(adenosine deaminase), 부티릴콜린에스터라제(butyrylcholinesterase), 키티나제(chitinase), 글루타메이트 디카복실라제(glutamate decarboxylase), 이미글루세라제(imiglucerase), 리파제(lipase), 유리카제(uricase), 혈소판-활성인자 아세틸하이드롤라제(platelet-activating factor acetylhydrolase), 중성 엔도펩티다제(neutral endopeptidase), 유로키나제, 스트렙토키나제, 마이엘로퍼옥시다제 (myeloperoxidase), 수퍼옥사이드디스뮤타제(superoxide dismutase), 보톨리늄 독소, 콜라게나제, 히알루로니다제 (hyaluronidase), L-아스파라기나제(L-asparaginase), 단일클론항체, 다클론항체, scFv, Fab, Fab', F(ab')2, Fd 및 이들의 단편으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있다.
또한, 상기 목적 단백질은 상기 단백질의 일부일 수 있으며, 구체적으로 가능한 수용체, 생물학적 조절물질 및 이의 수용체, 효소, 항체의 단편 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 목적 단백질은 일예로, 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor, FGF)의 수용체(fibroblast growth factor, FGFR)의 일부로 세포 외 도메인(Extracellular domain)인 Ec-FGFR일 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니며, 상기 섬유아세포 성장인자 세포 외 도메인은 별도의 링커(linker)를 사용하거나 또는 사용하지 않고 직접 카르복시 말단에 융합할 수 있으며, 좋게는 별도의 링커 없이 융합하는 것이 좋으며, 이를 통해 가용성이 향상된 발현 효과 및 종래의 기능을 유지한 채로 고순도의 목적 단백질을 정제할 수 있는 효과가 있어 바람직하나, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예에 따른 가용성이 향상된 재조합 융합 단백질의 제조방법에 있어서, 상기 목적 단백질은 서열번호 8 내지 서열번호 12로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 상기 목적 단백질을 이용함으로써, 단백질의 가용성 발현이 향상되고, 간단하고 효율적인 정제를 통해 고순도의 단백질을 수득할 수 있는 효과가 있어 바람직하다.
본 발명의 가용성이 향상된 재조합 융합 단백질은 상기 제조방법으로 제조된다.
본 발명의 목적 단백질의 정제방법은 상기 제조방법으로 가용성이 향상된 재조합 융합 단백질을 제조하는 단계; 및 노스톡 펑티포르메(Nostoc punctiforme) 유래 DnaE 단백질의 아미노 말단(IN) 펩타이드를 첨가하는 단계;를 포함한다.
본 발명의 일 예에 따른 목적 단백질의 정제방법에 있어서, 상기 노스톡 펑티포르메(Nostoc punctiforme) 유래 DnaE 단백질의 아미노 말단(IN) 펩타이드의 서열은 PCR 증폭시 부반응의 방지를 위해 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
상기 스플릿 인테인의 아미노 말단은 본 발명의 목적인 가용성의 향상 및 목적 단백질의 분리 정제가 가능하다면 그 서열의 길이 또는 아미노산의 종류에 특별한 제한이 있는 것은 아니나, 본 발명의 일 실시예로부터, 일예로 “ATKALSYETEILTVEYGLLPIGKIVEKRIECTVYSVDNNGNIYTQPVAQWHDRGEQEVFEYCLEDGSLIRATKDHKFMTVDGQMLPIDEIFERELDLMRVDNLPN” 등의 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니며, 필요에 따라 상기 아미노산 삭제, 첨가, 치환 등의 돌연변이를 도입할 수도 있다.
본 발명의 일 예에 따른 목적 단백질의 정제방법에 있어서, 상기 아미노산 돌연변이는 아미노 말단 1번 위치의 시스테인(Cystein)을 치환하는 것일 수 있다. 치환되는 아미노산은 일예로 알라닌(alanine, ALA) 등일 수 있으나, 이에 한정하는 것이다.
이하, 본 발명의 내용을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
[시약, 재료 및 프로토콜]
- 대장균(Escherichia coli) XL1-Blue는 Stratagene (CA, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- 대장균(Escherichia coli) BL21(DE3)은 Stratagene (CA, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- pMal-c2x 플라스미드는 New England Biolabs (MA, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- pGEM-Npu_PCC73102 플라스미드는 Bioneer Corp. (대전, 대한민국)에서 구입하여 사용하였다.
- pET24a 플라스미드는 New England Labs. (UK)에서 구입하여 사용하였다.
- pQE30 플라스미드는 Qiagen (US)에서 구입하여 사용하였다.
- pET24a-FGFR1, pET24a-FGFR2b pET24a-FGFR2c, pET24a-FGFR3b, pET24a-FGFR3c, pET24a-FGFR4, pET24a-FGF1 플라스미드는 한국해양과학기술원(KIOST)에서 제작하여 사용하였다.
- pET24a-FGFR1, pET24a-FGFR2b, pET24a-FGFR2c, pET24a-FGFR3b, pET24a-FGFR3c, pET24a-FGFR4의 증폭을 위한 프라이머는 (Bionics, 대한민국)에서 합성하여 사용하였다.
- Phusion high fidelity polymerase는 New England Biolabs (MA, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- BamHI, HindIII, SacI 제한효소는 New England Labs. (UK)에서 구입하여 사용하였다.
- 기타 시약은 Sigma Aldrich (US) 등에서 구입하여 사용하였다.
[실시예 1] 대장균에서 섬유아세포 성장인자 수용체 세포 외 도메인(Ec-FGFR)의 가용성 발현
FGFR의 D2와 D3 도메인의 발현을 시도한 대부분의 보고에서는, 무정형 구조를 갖는 acid box 영역에 인접한 아미노산(N148)에서부터 발현시키고 있다. 단백질의 번역과 접힘이 동 시·공간에서 일어나는 원핵세포에서 아미노 말단 부위에 나타나는 긴 무정형 구조는 단백질이 불용성 응집체로 발현될 가능성을 높이는 원인으로 작용할 수 있다. 이러한 문제를 제거하고자, FGFR의 아미노산 서열들의 alignment 및 2차 구조 예측을 통해 무정형 구조가 나타나는 영역을 줄일 수 있는지 검토해 보았다. 그 결과 FGFR들 사이에서 N147부터 K160까지 영역의 아미노산이 비교적 잘 보존되어 있으면서도 random coil을 형성하는 것이 확인돼, 최종적으로 D2와 D3 도메인을 온전하게 포함하며 2차 구조를 형성하기 시작하는 M161번부터 R365까지의 영역을 Ec-FGFR1의 발현영역으로 선정하였다.
이를 분석결과를 기반으로 선정한 영역의 Ec-FGFR1, Ec-FGFR2b, Ec-FGFR2c, Ec-FGFR3b, Ec-FGFR3c, 및 Ec-FGFR4의 PCR 증폭을 위해 하기와 같이 각각의 프라이머를 합성하여 사용하였다.
프라이머 명칭 | 서열 (5' 3') |
FGFR1 BamHI Forward | 5'- ATA GGATCC GAAAAGAAATTGCATGCAGTG -3' |
FGFR1 HindIII Reverse | 5'- ATA AAGCTT TTACCTCTCTTCCAGGGCTTCC -3' |
FGFR2b BamHI Forward | 5'- ATA GGATCC GAAAAGCGGCTCCATGCTG -3' |
FGFR2b HindIII Reverse | 5'- ATA AAGCTT GACTCCTTTTCTCTTCCAGGCGC - 3' |
FGFR2c BamHI Forward | 5'- ATA GGATCC GAAAAGCGGCTCCATGCTG -3' |
FGFR2c HindIII Reverse | 5'- ATA AAGCTT GACTCCTTTTCTCTTCCAGGCGC - 3' |
FGFR3b BamHI Forward | 5'- ATA GGATCC GACAAGAAGCTGCTGGCCG -3' |
FGFR3b HindIII Reverse | 5'- ATA AAGCTT TTACTCCACCAGCTCCTCCTCG -3' |
FGFR3c BamHI Forward | 5'- ATA GGATCC GACAAGAAGCTGCTGGCCG -3' |
FGFR3c HindIII Reverse | 5'- ATA AAGCTT TTACTCCACCAGCTCCTCCTCG -3' |
FGFR4 BamHI Forward | 5'- ATA GGATCC GAGAAGAAACTGCATGCAGTACC -3' |
FGFR4 HindIII Reverse | 5'- ATA AAGCTT AGTCCTCCTCTGGCAGCAC -3' |
상기 프라이머 쌍을 이용하여, 각각의 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 도입된 플라스미드 pET24a-FGFR1, pET24a-FGFR2b, pET24a-FGFR2c, pET24a-FGFR3b, pET24a-FGFR3c, pET24a-FGFR4에 대하여 Phusion high fidelity polymerase를 이용하여 PCR을 수행하였다.
수득한 DNA 단편은 각각 BamHI, HindIII 제한효소 처리한 후, 동일한 제한효소 처리한 pQE30 플라스미드 및 pMal-c2x 플라스미드에 각각 클로닝하여, pQE30-His-FGFR1, pQE30-His-FGFR2b, pQE30-His-FGFR2c, pQE30-His-FGFR3b, pQE30-His-FGFR3c, pQE30-His-FGFR4 및 pMal-FGFR1, pMal-FGFR2b, pMal-FGFR2c, pMal-FGFR3b, pMal-FGFR3c, pMal-FGFR4를 각각 제작하였다.
Ec-FGFR1, Ec-FGFR2b, Ec-FGFR2c, Ec-FGFR3b, Ec-FGFR3c, 및 Ec-FGFR4 단백질의 발현 분석을 위해, 상기와 같이 제작한 플라스미드를 통상의 방법으로 대장균 XL1-Blue에 형질전환한 후, 100 ug/mL의 앰피실린(ampicillin)을 포함하는 LB(Luria bertani) 아가 배지에 도말하였다.
이어서, 상기 플라스미드가 도입된 대장균 XL1-Blue를 각각 100 ug/mL의 앰피실린(ampicillin)을 포함하는 LB(Luria bertani) 액체 배지에 접종하고, 37℃에서 200 rpm으로 교반하면서 배양하였다.
배양액의 흡광도가 600 nm에서 2.0~2.5에 도달하였을 때, 동일한 조성을 갖는 LB 배지에 접종하여, 600 nm에서 흡광도가 0.5~0.6에 도달할 때까지 배양하였다. 이후, 200 mM IPTG(Isopropyl β)를 최종 농도가 0.2 mM이 되도록 첨가하고, 동일 조건에서 2시간 추가 배양하였다.
배양 종료 후, 600 nm에서의 흡광도가 2.0이 되도록 보정하여 세포를 수득하였다. 이를 20 mM Tris-HCl(pH 8.0) 200 uL에 현탁한 후, 초음파를 조사하여 세포를 파괴하였다. 파쇄 직후 전체 단백질 시료를 취하여, 4℃에서 16,100xg로 30분간 원심분리하여 불용성 응집체를 제거한 후, 가용성 분획을 분리하였다.
각 단계에서 취한 시료에 5x샘플 로딩 버퍼(sample loading buffer)를 첨가하고, 100℃에서 15분간 가열하여 모든 단백질의 변성을 유도하였다. 이어서, 각 시료를 천천히 냉각한 후, 12% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)에 로딩하여, 각 Ec-FGFR1, Ec-FGFR2b, Ec-FGFR2c, Ec-FGFR3b, Ec-FGFR3c, 및 Ec-FGFR4 단백질의 발현 양상을 분석하였다.
도 1 및 도 2는 이 중 Ec-FGFR1에 대한 전기영동 결과를 나타내는 것으로, 아미노 말단에 히스티딘 태그(6xHis)가 융합된 경우, 대부분 불용성 응집체로 발현된 반면, pMal-c2x에 클로닝되어 말토오스 결합 단백질이 아미노 말단에 융합된 MBP-Ec-FGFR1은 대부분 가용성 발현되는 것을 확인하였다.
같은 방법으로 다른 Ec-FGFR에 대한 발현 양상을 분석한 결과, 말통오스 결합 단백질의 융합을 통해 가용성 발현이 현저히 증가하는 효과가 있음을 확인하였다.
[실시예 2] 섬유아세포 성장인자 수용체 세포 외 도메인(Ec-FGFR)의 기능성
융합 파트너인 말토오스 결합 단백질(maltose binding protein, MBP)와의 융합을 통해 가용성 발현된 Ec-FGFR1 및 Ec-FGFR2b에 대하여, 이들의 기능성(funcionality)을 확인하기 위해, 상기 단백질에 결합하는 FGF1의 상호 작용을 도 3의 모식도에 나타난 방법을 이용하여 측정하였다.
보다 구체적으로, pMal-FGFR1, pMal-FGFR2b가 각각 도입된 대장균 XL1-Blue을 상기 실시예 1에서 배양액의 부피를 200 mL로 증가시켜 수행하는 것을 제외하고, 동일한 방법으로 수행하여 과량의 단백질을 수득하였다.
배양 종료 시점에서 4℃에서 8,000 rpm으로 각 배양액을 원심분리하여 세포를 회수하고, 40 mL PBS(phosphate-buffered saline)을 첨가하여 현탁하였다. 이후, 현탁된 세포를 초음파 처리하여 파쇄하고, 4℃에서 12,000 rpm으로 1시간 동안 원심분리하여, 불용성 응집체가 제거된 상등액(supernatant)을 분리하였다.
40 mL의 가용성 단백질이 포함된 분획을 각각 회수한 후, 멸균 증류수로 세척하고, PBS로 평형화한 500 uL의 아밀로스 레진(amylose resin; new England Biolabs, UK)을 첨가하였다. 이후, 아밀로스 레진과 MBP-FGFR1 또는 MBP-FGFR2b의 결합을 유도하기 위해, 4℃에서 1시간 정치한 후, 빈 컬럼(empty column; Bio-Rad, CA, USA)에 로딩하여 아밀로스 레진을 회수하였다.
이후, 50 mM SPB(sodium phosphate buffer, pH 6.7) 10 mL로 아밀로스 레진을 세척하여, MBP-FGFR1 또는 MBP-FGFR2b가 결합된 아밀로스 레진을 제조하였다.
이후, 상기 융합 단백질의 기능성 확인을 위해 FGF1 단백질을 제조하였다.
pET24a-FGF1 플라스미드를 통상의 방법으로 대장균 BL21(DE3)에 형질전환한 후 수득한 콜로니를 50 ug/mL 카나마이신을 포함하는 LB 배지에 접종하여 전배양한 후, 동일 조성의 LB 배지에 접종하였다. 이후, 상기 MBP-FGFR1 또는 MBP-FGFR2b의 발현시와 동일한 방법으로 발현을 유도하였다.
상기 방법으로 유도한 세포를 20 mM SPB(pH 6.7)로 현탁한 후, 초음파 처리하여 파쇄하고, 원심분리를 통해 FGF1 단백질을 포함하는 가용성 분획을 수득하였다.
상기 FGF1 단백질을 포함하는 가용성 분획을 MBP-FGFR1 또는 MBP-FGFR2b가 결합된 아밀로스 레진이 충진된 컬럼에 로딩하여 단백질 간의 결합을 유도하였다.
이후, 20 mM SPB(pH 6.7)로 세척하고, 50, 100, 200, 400 및 600 mM의 염화나트륨(NaCl)을 각각 포함하는 20 mM SPB(pH 6.7)을 흘려보내 MBP-FGFR1 또는 MBP-FGFR2b에 결합된 FGF1이 용출되는지의 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 염화나트륨의 농도 증가에 따라, FGF1 단백질의 용출량이 증가하다가 200 mM을 기점으로 감소하는 것을 확인하였다.
상기 결과로부터 염화나트륨의 농도에 따라 FGF1의 용출량의 변화는 FGF1 단백질이 말토오스 결합 단백질과 융합된 Ec-FGFR1 또는 Ec-FGFR2b와 친화성 결합을 하고 있기 때문인 것으로 추정할 수 있다. 즉, MBP 단백질의 융합으로 가용성 발현된 Ec-FGFR1 또는 Ec-FGFR2b는 정상적인 기능을 갖는 온전한 폴딩 구조를 갖는 것을 확인하였다.
[실시예 3] 가용성-향상 이중-기능성 융합 태그(solubility-enhancing bifunctional fusion tag)의 제작
Npu DnaE 인테인을 이용한 절단 위치의 지정과 이를 이용한 Ec-FGFR 단백질의 정제 확인을 위해, 먼저 도 5의 모식도와 같이 야생형 익스테인(extein)의 카르복시 말단 서열 “CFNK”을 포함하도록, 가용성-향상 이중-기능성 융합 태그(solubility-enhancing bifunctional fusion tag)를 제작하였다.
인테인 카르복실 말단영역(Npu Ic)을 Phusion high fidelity polymerase를 이용한 PCR로 증폭한 후, 수득한 Npu IC 영역을 SacI, BamHI 제한효소로 절단하고, 동일한 제한 효소로 절단한 pMal-FGFR1 플라스미드에 클로닝하였다. 상기 방법으로 제작한 플라스미드를 pMSNC_FGFR1로 명명하였다(도 6).
또한, 인테인의 단백질 스플라이싱으로 융합 태그 절단이 가능하도록 하기 위해 DnaE Npu 인테인의 아미노 말단 “ATKALSYETEILTVEYGLLPIGKIVEKRIECTVYSVDNNGNIYTQPVAQWHDRGE
QEVFEYCLEDGSLIRATKDHKFMTVDGQMLPIDEIFERELDLMRVDNLPN” (Npu IN)을 PCR을 이용하여 증폭하였다.
PCR 과정에서 DnaE Npu 인테인의 스플라이싱으로, 아미노 말단이 절단되고 융합되는 것을 방지하기 위해, C1A 돌연변이를 도입하였다(C1A Npu IN). 돌연변이를 도입한 인테인의 아미노 말단을 BamHI 및 HindIII로 제한효소로 절단하고, 동일한 제한효소로 절단한 pQE30 플라스미드에 클로닝하여, 아미노 말단에 히스티틴 태그(6xHis)가 융합된 Npu IN을 발현하는 pQE30-N_Npu C1A를 제작하였다(도 7).
상기 PCR 증폭을 위한 프라이머쌍 서열을 표 2에 도시하였다.
프라이머 명칭 | 서열 (5' 3') |
Mal_C-Npu SacI Forward | 5'- ATA GAGCTC GATCAAAATTGCGACCCGCAAG -3' |
Mal_C-Npu BamHI Reverse | 5'- ATA GGATCC ACTAGTCTTGTTAAAGCAGTTGCTTG -3' |
QE_N-Npu BamHI Forward | 5'- ata GGATCC GCGACTAAAGCNCTGAGCTATG -3' |
QE_N-Npu HindIII Reverse | 5'- ata AAGCTT TTAATTGGGCAGATTGTCAACGC -3' |
[실시예 4] 가용성-향상 이중-기능성 융합 태그(solubility-enhancing bifunctional fusion tag)가 도입된 Ec-FGFR 단백질 및 C1A Npu IN 발현
상기 실시예 3에서의 pMSNC_FGFR1의 제조방법과 동일한 방식으로, FGFR2b, FGFR2c, FGFR3b, FGFR3c, 및 FGFR4의 발현을 위한 벡터 pMSNC_FGFR1, pMSNC_FGFR2b, pMSNC_FGFR2c, pMSNC_FGFR3b, pMSNC_FGFR3c, pMSNC_FGFR4를 각각 제작하였다.
상기 pMSNC_FGFR1, pMSNC_FGFR2b, pMSNC_FGFR2c, pMSNC_FGFR3b, pMSNC_FGFR3c, pMSNC_FGFR4 및 pQE30-N_Npu C1A 벡터를 각각 대장균 XL1-Blue에 형질전환한 후, 이들 형질전환체를 각각 100 ug/mL 앰피실린이 첨가된 LB 배지에 접종하여, 성장 곡선이 정체기에 도달할 때까지 37℃에서 220 rpm으로 교반하여 배양하였다.
배양이 끝난 후, 동일한 조성의 배지에 계대배양하여 600 nm에서의 흡광도가 0.5~0.6에 도달할 때까지 배양한 후, 최종 농도가 0.2 mM가 되도록 IPTG를 첨가하고 2시간 동안 동일 조건에서 추가배양하였다.
배양 종료 후, 600 nm에서의 흡광도가 2.0이 되도록 보정하여 세포를 수득하였다. 이를 20 mM SPB(pH 6.7) 200 uL에 현탁한 후, 초음파를 조사하여 세포를 파괴하였다. 파쇄 직후 30 uL를 분취하여, 4℃에서 16,100xg로 15분간 원심분리하여 불용성 응집체를 제거한 후, 가용성 분획을 분리하였다.
분취한 전체 및 가용성 단백질 시료에 단백질 샘플 로딩 버퍼(protein sample loading buffer)를 첨가하고, 15분간 끓여 단백질 발현 분석을 위한 시료를 준비하였다. 준비된 각 시료를 15% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)에 로딩하여, 각 Ec-FGFR1, Ec-FGFR2b, Ec-FGFR2c, Ec-FGFR3b, Ec-FGFR3c, 및 Ec-FGFR4 단백질의 발현 양상을 분석하였다.
그 결과를 도 8에 도시하였다. 이로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 도 2에서 MBP만 융합된 경우에 비해 대부분의 단백질이 가용성으로 발현되는 것을 확인할 수 있었고, 특히, Ec-FGFR4의 경우, MBP-FGFR4 대비 가용성 단백질의 비용이 현저히 증가한 것을 확인하였다.
또한, C1A Npu 1N 단백질 또한 가용성 분획에서 발현되는 것을 확인하였다.
[실시예 5] 가용성-향상 이중-기능성 융합 태그(solubility-enhancing bifunctional fusion tag)의 가용성 향상 및 친화성 태그로써의 기능 및 C1A Npu IN을 이용한 정제
가용성-향상 이중-기능성 융합 태그(solubility-enhancing bifunctional fusion tag)의 가용성 향상 및 친화성 태그로써의 기능 확인을 위해, 상기 실시예에서 제조한 벡터 중, Ec-FGFR1을 클로닝한 pMSNC_FGFR1을 대상으로 기능성을 확인하였다.
먼저, pMSNC_FGFR1 플라스미드 또는 pQE30-N_Npu C1A가 도입된 대장균 XL1-Blue 세포를 실시예 2에서와 같이 배양 부피를 200 mL로 증가시키는 것을 제외하고, 다른 조건은 동일하게 하여 배양하였다.
수득한 각 세포를 40 mL PBS(phosphate-buffered saline)을 첨가하여 현탁하였다. 이후, 현탁된 세포를 초음파 처리하여 파쇄하고, 4℃에서 12,000 rpm으로 1시간 동안 원심분리하여, 불용성 응집체가 제거된 상등액(supernatant)을 분리하였다.
이후, 40 mL의 PBS를 각각 추가하여, MBP-C_Npu-FGFR1 또는 6xHis_N_Npu_C1A 단백질을 포함하는 80 mL의 가용성 단백질 용액을 1 mL MBP 트랩 컬럼 또는 1 mL Histrap 컬럼(GE healthcare Life Science, US)에 각각 로딩하였다.
각 가용성 단백질 분획의 로딩을 완료한 후, MBP 트랩 컬럼은 PBS로 컬럼 부피의 10 배 이상의 양으로 충분히 세척하고, Histrap 컬럼은 20 mM 이미다졸(imidazole)을 포함하는 PBS로 충분히 세척하였다.
이후, 전자는 10 mM의 말토오스를 포함하는 PBS, 후자는 500 mM 이미다졸을 포함하는 PBS를 이용하여, 농도 구배를 이용한 MBP-C_Npu-FGFR1 또는 6xHis_N_Npu_C1A 단백질의 용출을 수행하였다.
그 결과를 도 9에 도시하였다.
그 결과, 본 발명의 가용성-향상 이중-기능성 융합 태그(solubility-enhancing bifunctional fusion tag)를 이용하여 목적 단백질을 가용성 발현 시킨 결과, 약 80% 이상의 고순도로 정제가 이루어진 것을 확인하였다. 이로부터, 융합 파트너인 말토오스 단백질과 인테인을 이용한 융합 태그를 이용하였을 때, FGF 단백질을 대장균 안에서 발현하더라도, 높은 가용성을 유지하며, 80% 이상의 고순도로 정제가 가능한 친화성 태그로서의 역할을 수행하고 있음을 확인하였다.
[실시예 6] 단백질 스플라이싱을 이용한 정제 활성
상기 실시예들로부터, 본 발명의 가용성-향상 이중-기능성 융합 태그(solubility-enhancing bifunctional fusion tag)는 가용성 향상 효과가 있음을 확인하였다.
상기 융합 태그의 두 번째 기능인 절제 능력(splicing capability) 을 이용한 단백질의 정제 활성을 측정하였다.
상기 정제된 MSNC_FGFR1 단백질에 C1A Npu 1N 단백질을 여러 비율로 혼합한 후 100 mM DTT(Dithiothreitol)를 각각 처리한 후 12시간 동안 정치하였다.
그 결과를 도 10~11에 도시하였다. 이로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 단백질 정제 후 말토오스 또는 이미다졸 등의 염 제거 및 순도 향상을 위한 추가 절차 없이, MSNC-FGFR1 및 C1A Npu IN의 혼합만으로 단백질 스플라이싱을 유도하였음에도, 융합 태그와 목적 단백질인 Ec-FGFR1의 분리가 이루어지기 시작하여, 12시간 경과 후, 50% 수준까지 이루어진 것을 확인하였다.
[실시예 7] 가용성-향상 이중-기능성 융합 태그(solubility-enhancing bifunctional fusion tag)로 정제한 Ec-FGFR1의 기능성
상기 실시예를 통해 정제한 Ec-FGFR1의 기능성이 유지되고 있는지 확인하기 위해, 헤파린 컬럼을 이용하여 정제 결과를 검증하였다.
실시예 6을 통해 융합 태그가 절단된 시료를 이동상인 20 mM SPB(pH 6.7)로 20배 희석하여, 반응 용액에 포함된 염을 희석하고, 용액의 pH를 보정하였다.
이후, 1 mL Hitrap heparin column(GE Healthcare Life Science, US)에 로딩한 후, 20 mM SPB(pH 6.7)로 세척하였다.
세척이 완료된 후, 2 M 염화나트륨을 포함하는 20 mM SPB(pH 6.7)을 이용하여, 농도 구배를 가하여, 상기 컬럼으로부터 단백질을 용출시켰다.
그 결과를 도 12에 도시하였다. 이로부터, 약 800 mM의 염화나트륨으로부터 Ec-FGFR1 단백질이 용출되기 시작하는 것을 확인하였다.
상기 결과로부터, 본 발명의 가용성-향상 이중-기능성 융합 태그(solubility-enhancing bifunctional fusion tag)를 이용하여 융합 단백질을 생산할 수 있는 벡터를 제작, 형질전환함으로써, 가용성 분획에 단백질의 함유량이 현저히 증가하였고, 인테인의 아미노 말단 단백질의 혼합만을 통해 융합 태그가 효과적으로 절제되어, 고순도의 가용성 단백질을 대량으로 생산할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
<110> University Industry Liaison Office Of Chonnam National University
Korea Institute of Ocean Science and Technology
<120> Preparation and purification method of recombinant human fibrost
growth factor receptor by using solubility-enhancing bifunctional
fusion tag combined with split intein and use thereof
<130> P19110981437
<160> 34
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 412
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MSNC solubility-enhancing bifunctional fusion tag
<400> 1
Met Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys
1 5 10 15
Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr
20 25 30
Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe
35 40 45
Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala
50 55 60
His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile
65 70 75 80
Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp
85 90 95
Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu
100 105 110
Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys
115 120 125
Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly
130 135 140
Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro
145 150 155 160
Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys
165 170 175
Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly
180 185 190
Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp
195 200 205
Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala
210 215 220
Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys
225 230 235 240
Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser
245 250 255
Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro
260 265 270
Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp
275 280 285
Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala
290 295 300
Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala
305 310 315 320
Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln
325 330 335
Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala
340 345 350
Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn
355 360 365
Ser Ser Ser Ile Lys Ile Ala Thr Arg Lys Tyr Leu Gly Lys Gln Asn
370 375 380
Val Tyr Asp Ile Gly Val Glu Arg Asp His Asn Phe Ala Leu Lys Asn
385 390 395 400
Gly Phe Ile Ala Ser Asn Cys Phe Asn Lys Thr Ser
405 410
<210> 2
<211> 618
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MBP-C-Npu-FGFR1
<400> 2
Met Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys
1 5 10 15
Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr
20 25 30
Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe
35 40 45
Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala
50 55 60
His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile
65 70 75 80
Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp
85 90 95
Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu
100 105 110
Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys
115 120 125
Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly
130 135 140
Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro
145 150 155 160
Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys
165 170 175
Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly
180 185 190
Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp
195 200 205
Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala
210 215 220
Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys
225 230 235 240
Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser
245 250 255
Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro
260 265 270
Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp
275 280 285
Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala
290 295 300
Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala
305 310 315 320
Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln
325 330 335
Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala
340 345 350
Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn
355 360 365
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370 375 380
Val Tyr Asp Ile Gly Val Glu Arg Asp His Asn Phe Ala Leu Lys Asn
385 390 395 400
Gly Phe Ile Ala Ser Asn Cys Phe Asn Lys Thr Ser Gly Ser Glu Lys
405 410 415
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420 425 430
Ser Ser Gly Thr Pro Asn Pro Thr Leu Arg Trp Leu Lys Asn Gly Lys
435 440 445
Glu Phe Lys Pro Asp His Arg Ile Gly Gly Tyr Lys Val Arg Tyr Ala
450 455 460
Thr Trp Ser Ile Ile Met Asp Ser Val Val Pro Ser Asp Lys Gly Asn
465 470 475 480
Tyr Thr Cys Ile Val Glu Asn Glu Tyr Gly Ser Ile Asn His Thr Tyr
485 490 495
Gln Leu Asp Val Val Glu Arg Ser Pro His Arg Pro Ile Leu Gln Ala
500 505 510
Gly Leu Pro Ala Asn Lys Thr Val Ala Leu Gly Ser Asn Val Glu Phe
515 520 525
Met Cys Lys Val Tyr Ser Asp Pro Gln Pro His Ile Gln Trp Leu Lys
530 535 540
His Ile Glu Val Asn Gly Ser Lys Ile Gly Pro Asp Asn Leu Pro Tyr
545 550 555 560
Val Gln Ile Leu Lys Thr Ala Gly Val Asn Thr Thr Asp Lys Glu Met
565 570 575
Glu Val Leu His Leu Arg Asn Val Ser Phe Glu Asp Ala Gly Glu Tyr
580 585 590
Thr Cys Leu Ala Gly Asn Ser Ile Gly Leu Ser His His Ser Ala Trp
595 600 605
Leu Thr Val Leu Glu Ala Leu Glu Glu Arg
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<211> 621
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MBP-C-Npu-FGFR2b
<400> 3
Met Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys
1 5 10 15
Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr
20 25 30
Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe
35 40 45
Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala
50 55 60
His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile
65 70 75 80
Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp
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Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu
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Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys
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130 135 140
Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro
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Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys
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Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly
180 185 190
Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp
195 200 205
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<223> pMal-FGFR2C
<400> 25
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gtcaattcag ggtggtgaat gtgaaaccag taacgttata cgatgtcgca gagtatgccg 120
gtgtctctta tcagaccgtt tcccgcgtgg tgaaccaggc cagccacgtt tctgcgaaaa 180
cgcgggaaaa agtggaagcg gcgatggcgg agctgaatta cattcccaac cgcgtggcac 240
aacaactggc gggcaaacag tcgttgctga ttggcgttgc cacctccagt ctggccctgc 300
acgcgccgtc gcaaattgtc gcggcgatta aatctcgcgc cgatcaactg ggtgccagcg 360
tggtggtgtc gatggtagaa cgaagcggcg tcgaagcctg taaagcggcg gtgcacaatc 420
ttctcgcgca acgcgtcagt gggctgatca ttaactatcc gctggatgac caggatgcca 480
ttgctgtgga agctgcctgc actaatgttc cggcgttatt tcttgatgtc tctgaccaga 540
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<210> 26
<211> 7253
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pMal-FGFR3b
<400> 26
ccgacaccat cgaatggtgc aaaacctttc gcggtatggc atgatagcgc ccggaagaga 60
gtcaattcag ggtggtgaat gtgaaaccag taacgttata cgatgtcgca gagtatgccg 120
gtgtctctta tcagaccgtt tcccgcgtgg tgaaccaggc cagccacgtt tctgcgaaaa 180
cgcgggaaaa agtggaagcg gcgatggcgg agctgaatta cattcccaac cgcgtggcac 240
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tggtggtgtc gatggtagaa cgaagcggcg tcgaagcctg taaagcggcg gtgcacaatc 420
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gacgtggagt tccactgcaa ggtgtacagt gacgcacagc cccacatcca gtggctcaag 540
cacgtggagg tgaatggcag caaggtgggc ccggacggca caccctacgt taccgtgctc 600
aagtcctgga tcagtgagag tgtggaggcc gacgtgcgcc tccgcctggc caatgtgtcg 660
gagcgggacg ggggcgagta cctctgtcga gccaccaatt tcataggcgt ggccgagaag 720
gccttttggc tgagcgttca cgggccccga gcagccgagg aggagctggt ggagtaaaat 780
tagctgagct tggactcctg ttgatagatc cagtaatgac ctcagaactc catctggatt 840
tgttcagaac gctcggttgc cgccgggcgt tttttattgg tgagaatcca agctagcttg 900
gcgagatttt caggagctaa ggaagctaaa atggagaaaa aaatcactgg atataccacc 960
gttgatatat cccaatggca tcgtaaagaa cattttgagg catttcagtc agttgctcaa 1020
tgtacctata accagaccgt tcagctggat attacggcct ttttaaagac cgtaaagaaa 1080
aataagcaca agttttatcc ggcctttatt cacattcttg cccgcctgat gaatgctcat 1140
ccggaatttc gtatggcaat gaaagacggt gagctggtga tatgggatag tgttcaccct 1200
tgttacaccg ttttccatga gcaaactgaa acgttttcat cgctctggag tgaataccac 1260
gacgatttcc ggcagtttct acacatatat tcgcaagatg tggcgtgtta cggtgaaaac 1320
ctggcctatt tccctaaagg gtttattgag aatatgtttt tcgtctcagc caatccctgg 1380
gtgagtttca ccagttttga tttaaacgtg gccaatatgg acaacttctt cgcccccgtt 1440
ttcaccatgg gcaaatatta tacgcaaggc gacaaggtgc tgatgccgct ggcgattcag 1500
gttcatcatg ccgtttgtga tggcttccat gtcggcagaa tgcttaatga attacaacag 1560
tactgcgatg agtggcaggg cggggcgtaa tttttttaag gcagttattg gtgcccttaa 1620
acgcctgggg taatgactct ctagcttgag gcatcaaata aaacgaaagg ctcagtcgaa 1680
agactgggcc tttcgtttta tctgttgttt gtcggtgaac gctctcctga gtaggacaaa 1740
tccgccctct agagctgcct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg 1800
cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt 1860
cagggcgcgt cagcgggtgt tggcgggtgt cggggcgcag ccatgaccca gtcacgtagc 1920
gatagcggag tgtatactgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 1980
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgct 2040
cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat 2100
cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga 2160
acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt 2220
ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt 2280
ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc 2340
gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa 2400
gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct 2460
ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta 2520
actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg 2580
gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc 2640
ctaactacgg ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta 2700
ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg 2760
gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt 2820
tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg 2880
tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta 2940
aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg 3000
aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg 3060
tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc 3120
gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg 3180
agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg 3240
aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag 3300
gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat 3360
caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc 3420
cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc 3480
ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa 3540
ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac 3600
gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt 3660
cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc 3720
gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa 3780
caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca 3840
tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat 3900
acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa 3960
aagtgccacc tgacgtctaa gaaaccatta ttatcatgac attaacctat aaaaataggc 4020
gtatcacgag gccctttcgt cttcac 4046
<210> 33
<211> 4040
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pQE30-His-FGFR3c
<400> 33
ctcgagaaat cataaaaaat ttatttgctt tgtgagcgga taacaattat aatagattca 60
attgtgagcg gataacaatt tcacacagaa ttcattaaag aggagaaatt aactatgaga 120
ggatcgcatc accatcacca tcacggatcc gacaagaagc tgctggccgt gccggccgcc 180
aacaccgtcc gcttccgctg cccagccgct ggcaacccca ctccctccat ctcctggctg 240
aagaacggca gggagttccg cggcgagcac cgcattggag gcatcaagct gcggcatcag 300
cagtggagcc tggtcatgga aagcgtggtg ccctcggacc gcggcaacta cacctgcgtc 360
gtggagaaca agtttggcag catccggcag acgtacacgc tggacgtgct ggagcgctcc 420
ccgcaccggc ccatcctgca ggcggggctg ccggccaacc agacggcggt gctgggcagc 480
gacgtggagt tccactgcaa ggtgtacagt gacgcacagc cccacatcca gtggctcaag 540
cacgtggagg tgaatggcag caaggtgggc ccggacggca caccctacgt taccgtgctc 600
aagacggcgg gcgctaacac caccgacaag gagctagagg ttctctcctt gcacaacgtc 660
acctttgagg acgccgggga gtacacctgc ctggcgggca attctattgg gttttctcat 720
cactctgcgt ggctggtggt gctgccagcc gaggaggagc tggtggagta aaattagctg 780
agcttggact cctgttgata gatccagtaa tgacctcaga actccatctg gatttgttca 840
gaacgctcgg ttgccgccgg gcgtttttta ttggtgagaa tccaagctag cttggcgaga 900
ttttcaggag ctaaggaagc taaaatggag aaaaaaatca ctggatatac caccgttgat 960
atatcccaat ggcatcgtaa agaacatttt gaggcatttc agtcagttgc tcaatgtacc 1020
tataaccaga ccgttcagct ggatattacg gcctttttaa agaccgtaaa gaaaaataag 1080
cacaagtttt atccggcctt tattcacatt cttgcccgcc tgatgaatgc tcatccggaa 1140
tttcgtatgg caatgaaaga cggtgagctg gtgatatggg atagtgttca cccttgttac 1200
accgttttcc atgagcaaac tgaaacgttt tcatcgctct ggagtgaata ccacgacgat 1260
ttccggcagt ttctacacat atattcgcaa gatgtggcgt gttacggtga aaacctggcc 1320
tatttcccta aagggtttat tgagaatatg tttttcgtct cagccaatcc ctgggtgagt 1380
ttcaccagtt ttgatttaaa cgtggccaat atggacaact tcttcgcccc cgttttcacc 1440
atgggcaaat attatacgca aggcgacaag gtgctgatgc cgctggcgat tcaggttcat 1500
catgccgttt gtgatggctt ccatgtcggc agaatgctta atgaattaca acagtactgc 1560
gatgagtggc agggcggggc gtaatttttt taaggcagtt attggtgccc ttaaacgcct 1620
ggggtaatga ctctctagct tgaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg 1680
ggcctttcgt tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc ctgagtagga caaatccgcc 1740
ctctagagct gcctcgcgcg tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc 1800
ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc 1860
gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc gcagccatga cccagtcacg tagcgatagc 1920
ggagtgtata ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata 1980
tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg cgctcttccg 2040
cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc 2100
actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt 2160
gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc 2220
ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa 2280
acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc 2340
ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg 2400
cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc 2460
tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc 2520
gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca 2580
ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact 2640
acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg 2700
gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt 2760
ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct 2820
tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga 2880
gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa 2940
tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac 3000
ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga 3060
taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc 3120
cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca 3180
gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta 3240
gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg 3300
tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc 3360
gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg 3420
ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt 3480
ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt 3540
cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata 3600
ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc 3660
gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac 3720
ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa 3780
ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct 3840
tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat 3900
ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc 3960
cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca 4020
cgaggccctt tcgtcttcac 4040
<210> 34
<211> 4022
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pQE30-His-FGFR4
<400> 34
ctcgagaaat cataaaaaat ttatttgctt tgtgagcgga taacaattat aatagattca 60
attgtgagcg gataacaatt tcacacagaa ttcattaaag aggagaaatt aactatgaga 120
ggatcgcatc accatcacca tcacggatcc gagaagaaac tgcatgcagt acctgcgggg 180
aacaccgtca agttccgctg tccagctgca ggcaacccca cgcccaccat ccgctggctt 240
aaggatggac aggcctttca tggggagaac cgcattggag gcattcggct gcgccatcag 300
cactggagtc tcgtgatgga gagcgtggtg ccctcggacc gcggcacata cacctgcctg 360
gtagagaacg ctgtgggcag catccgctat aactacctgc tagatgtgct ggagcggtcc 420
ccgcaccggc ccatcctgca ggccgggctc ccggccaaca ccacagccgt ggtgggcagc 480
gacgtggagc tgctgtgcaa ggtgtacagc gatgcccagc cccacatcca gtggctgaag 540
cacatcgtca tcaacggcag cagcttcgga gccgacggtt tcccctatgt gcaagtccta 600
aagactgcag acatcaatag ctcagaggtg gaggtcctgt acctgcggaa cgtgtcagcc 660
gaggacgcag gcgagtacac ctgcctcgca ggcaattcca tcggcctctc ctaccagtct 720
gcctggctca cggtgctgcc agaggaggac taaaattagc tgagcttgga ctcctgttga 780
tagatccagt aatgacctca gaactccatc tggatttgtt cagaacgctc ggttgccgcc 840
gggcgttttt tattggtgag aatccaagct agcttggcga gattttcagg agctaaggaa 900
gctaaaatgg agaaaaaaat cactggatat accaccgttg atatatccca atggcatcgt 960
aaagaacatt ttgaggcatt tcagtcagtt gctcaatgta cctataacca gaccgttcag 1020
ctggatatta cggccttttt aaagaccgta aagaaaaata agcacaagtt ttatccggcc 1080
tttattcaca ttcttgcccg cctgatgaat gctcatccgg aatttcgtat ggcaatgaaa 1140
gacggtgagc tggtgatatg ggatagtgtt cacccttgtt acaccgtttt ccatgagcaa 1200
actgaaacgt tttcatcgct ctggagtgaa taccacgacg atttccggca gtttctacac 1260
atatattcgc aagatgtggc gtgttacggt gaaaacctgg cctatttccc taaagggttt 1320
attgagaata tgtttttcgt ctcagccaat ccctgggtga gtttcaccag ttttgattta 1380
aacgtggcca atatggacaa cttcttcgcc cccgttttca ccatgggcaa atattatacg 1440
caaggcgaca aggtgctgat gccgctggcg attcaggttc atcatgccgt ttgtgatggc 1500
ttccatgtcg gcagaatgct taatgaatta caacagtact gcgatgagtg gcagggcggg 1560
gcgtaatttt tttaaggcag ttattggtgc ccttaaacgc ctggggtaat gactctctag 1620
cttgaggcat caaataaaac gaaaggctca gtcgaaagac tgggcctttc gttttatctg 1680
ttgtttgtcg gtgaacgctc tcctgagtag gacaaatccg ccctctagag ctgcctcgcg 1740
cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct 1800
tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc 1860
gggtgtcggg gcgcagccat gacccagtca cgtagcgata gcggagtgta tactggctta 1920
actatgcggc atcagagcag attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc 1980
acagatgcgt aaggagaaaa taccgcatca ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact 2040
cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac 2100
ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa 2160
aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg 2220
acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa 2280
gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc 2340
ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac 2400
gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac 2460
cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg 2520
taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt 2580
atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga 2640
cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct 2700
cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga 2760
ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg 2820
ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct 2880
tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt 2940
aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc 3000
tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg 3060
gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag 3120
atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt 3180
tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag 3240
ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt 3300
ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca 3360
tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg 3420
ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat 3480
ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta 3540
tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca 3600
gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct 3660
taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat 3720
cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa 3780
agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt 3840
gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa 3900
ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa 3960
ccattattat catgacatta acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc tttcgtcttc 4020
ac 4022
Claims (15)
- 목적 단백질을 코딩하는 핵산 서열 및 가용성-향상 이중-기능성 융합 태그(solubility-enhancing bifunctional fusion tag)를 코딩하는 핵산 서열이 접목된 핵산 서열을 포함하는, 벡터로서,
상기 목적 단백질은 섬유아세포 성장인자 수용체 세포 외 도메인(fibroblast growth factor receptor, Ec-FGFR)이고,
상기 가용성-향상 이중-기능성 융합 태그(solubility-enhancing bifunctional fusion tag)는 융합 파트너 및 스플릿 인테인(split intein)을 포함하고,
상기 융합 파트너는 말토오스 결합 단백질(Maltose binding protein; MBP)이며,
상기 스플릿 인테인은 노스톡 펑티포르메(Nostoc punctiforme) 유래 DnaE 단백질의 카르복시 말단(Ic)을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 벡터. - 삭제
- 삭제
- 제 1항에 있어서,
상기 가용성-향상 이중-기능성 융합 태그(solubility-enhancing bifunctional fusion tag)는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진, 벡터. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 1항에 있어서,
상기 목적 단백질은 서열번호 8 내지 서열번호 12로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어진, 벡터. - 목적 단백질을 코딩하는 핵산 서열 및 가용성-향상 이중-기능성 융합 태그(solubility-enhancing bifunctional fusion tag)를 코딩하는 핵산 서열이 접목된 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제작하는 단계;
상기 벡터를 숙주 세포에 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계;
상기 형질전환체를 배양하여 가용성-향상 이중-기능성 융합 태그가 접목된 재조합 융합 단백질을 수득하는 단계;
를 포함하는, 가용성이 향상된 재조합 융합 단백질의 제조방법으로서,
상기 목적 단백질은 섬유아세포 성장인자 수용체 세포 외 도메인(fibroblast growth factor receptor, Ec-FGFR)이고,
상기 가용성-향상 이중-기능성 융합 태그(solubility-enhancing bifunctional fusion tag)는 융합 파트너 및 스플릿 인테인(split intein)을 포함하고,
상기 융합 파트너는 말토오스 결합 단백질(Maltose binding protein; MBP)이며,
상기 스플릿 인테인은 노스톡 펑티포르메(Nostoc punctiforme) 유래 DnaE 단백질의 카르복시 말단(Ic)을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 가용성이 향상된 재조합 융합 단백질의 제조방법. - 삭제
- 제 9항에 있어서,
상기 숙주 세포는 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 바실러스 속(Bacillus sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.), 클렙시엘라 속(Klebsiella sp.), 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.) 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 자이모모나스 속(Zymomonas sp.), 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.), 또는 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.)의 미생물인, 가용성이 향상된 재조합 융합 단백질의 제조방법. - 제 9항 또는 제 11항 중 어느 한 항의 제조방법으로 제조된, 가용성이 향상된 재조합 융합 단백질.
- 제 9항 또는 제 11항 중 어느 한 항의 제조방법으로 가용성이 향상된 재조합 융합 단백질을 제조하는 단계; 및
노스톡 펑티포르메(Nostoc punctiforme) 유래 DnaE 단백질의 아미노 말단(IN) 펩타이드를 첨가하는 단계;
를 포함하는, 목적 단백질의 정제방법. - 제 13항에 있어서,
상기 노스톡 펑티포르메(Nostoc punctiforme) 유래 DnaE 단백질의 아미노 말단(IN) 펩타이드의 서열은 PCR 증폭시 부반응의 방지를 위해 아미노산 돌연변이를 포함하는, 목적 단백질의 정제방법. - 제 14항에 있어서,
상기 아미노산 돌연변이는 아미노 말단 1번 위치의 시스테인(Cystein)을 치환하는 것인, 목적 단백질의 정제방법.
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KR1020190158842A KR102341583B1 (ko) | 2019-12-03 | 2019-12-03 | 스플릿 인테인을 접목한 가용성 향상 이중 기능성 융합 태그를 이용한 재조합 섬유아세포 성장인자 수용체의 제조방법, 정제방법, 및 이의 용도 |
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2019
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