CN104080913A - 经修饰的向日葵转录因子能够提高产量 - Google Patents

经修饰的向日葵转录因子能够提高产量 Download PDF

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Abstract

本发明涉及编码一种经修饰HaHB4转录因子的多核苷酸和编码一种经修饰HaHB4转录因子的功能活性片段和变体的多核苷酸以及包含所述多核苷酸和由所述多核苷酸编码的多肽的载体和宿主细胞。本发明还包括包含本发明的多肽和/或多核苷酸的转基因宿主细胞、植物、种子、花粉和植物部分。本发明进一步包括生产转基因宿主细胞、植物、种子、花粉和植物部分的方法以及由这些转基因宿主产生的植物产品。

Description

经修饰的向日葵转录因子能够提高产量

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求2012年2月21日提交的美国临时申请号61/601,335的优先权,其通过引用全文纳入本文。

[0003] 关于以文本文件形式提交的序列表

[0004] 本发明涉及下文所列“序列表”,以文本文件形式提供。该文本文件包含一个标题为 “HAHB4_SEQID_Listing_ascii_NA.txt” 的文件(25,010 字节,创建于 2013 年 2 月 20日),其通过引用全文纳入本文。

[0005] 发明背景

技术领域

[0006] 本发明涉及编码一种经修饰HaHB4转录因子的多核苷酸和编码一种经修饰HaHB4转录因子的功能活性片段和变体的多核苷酸以及包含这些多核苷酸和由所述多核苷酸编码的多肽的载体和宿主细胞。本发明还包括包含本发明的多肽和/或多核苷酸的转基因宿主细胞(包括植物细胞)、植物、种子、花粉和植物部分。本发明进一步包括生产转基因宿主细胞、植物、种子、花粉和植物部分的方法以及由所述转基因宿主生产的植物制品。

背景技术

[0007] 已知同源异型结构域是存在于一类真核细胞转录因子中保守的含61个氨基酸的DNA结合基序,参与调节高等生物的发育过程(Gehring,Science 236:1245-1252 (1987))。已从包括真菌、哺乳动物和植物的许多真核生物中分离到了编码含同源异型结构域蛋白的基因(Gehring 等,Annu.Rev.B1chem.63:487-526(1994))。然而,目前仅在植物中发现了包含与蛋白互作亮氨酸拉链结构域连接的同源异型结构域的蛋白(通常称为HD-Zip蛋白)。通常认为同源异型结构域-亮氨酸拉链蛋白参与调节与植物对环境应答相关的发育过程(Chan 等,B1chim.B1phys.Acta 1442 (I): 1-19 (1998) ;CarabelIi 等,PlantJ.4:469-479(1993) ;Schena 等,Genes Dev.7:367-379 (1993))。

[0008] HaHB4是一种向日葵(Helianthus annuus)转录因子,属于HD-Zip蛋白亚家族I且与该亚家族中其他成员的同源异型结构域在氨基酸序列上存在约50%的相同性,其中拟南芥转录因子AtHB7和AtHB12是两个例外,其与相应的HaHB4同源异型结构域序列分别有60 %和53 %的相同性。在受控和正常的环境条件下生长的向日葵植物中HaHB4的内源性表达水平很低。在缺水和暴露于脱落酸(ABA)条件下内源性HaHB4表达的上调被认为导致向日葵植株对于水胁迫的耐受性提高。类似地,有报道指出表达重组HaHB4的转基因拟南芥对水胁迫(干旱)环境的耐受性提高。具体而言,美国专利号7,674,955指出,在相同条件下与野生型拟南芥植物相比,过表达HaHB4的转基因拟南芥植物对干旱的耐受性升高。然而,美国专利号7,674,955并未公开本发明所描述的经修饰HaHB4转录因子,也未公开在相同条件下与野生型植物相比,在水胁迫和非水胁迫环境下含有这些经修饰HaHB4转录因子的转基因植物的产量提高。

[0009] 增加的农业产量和作物对更宽范围环境条件的耐受能力为解决全世界农业生产所面临的用持续缩水的可耕种土地资源喂养持续增加的人口的严峻挑战提供了两种方法。相应地,需要提供产量增加并对环境胁迫具有耐受性的新作物和其他植物品种。

发明内容

[0010] HaHB4是一种植物转录因子亚家族的成员,被认为参与调节与植物对环境应答相关的发育过程。已有报道转基因植物中经遗传工程改造的向日葵转录因子HaHB4的表达能够提高农作物对于干旱和高盐环境的耐受性。标准生产条件下没有产量提高的报道,但当HaHB4受组成型启动子驱动而表达量过高时,有报道产量会略有减少。这里,我们报道了使用经修饰HaHB4序列对增产的转基因植物进行的遗传工程改造。更具体地,基于对增产的小麦、玉米和大豆株系中HaHB4转基因的测序,发明人意外地确定,相比于天然HaHB4(SEQID NO:2)的序列,转基因含有独特的序列变化。此外,发明人制备了另一种经修饰HaHB4序列,其含有相互重叠的编码天然和经修饰HaHB4蛋白的不同片段。

[0011] 相应地,在一个实施方式中,本发明涉及编码一种经修饰HaHB4转录因子的多核苷酸,与类似环境下生长的野生型植物相比,在水胁迫或非水胁迫条件下所述多核苷酸在转基因植物中的表达均能使产量或对环境胁迫的耐受性提高。在另一个实施方式中,本发明涉及编码一种经修饰HaHB4转录因子的多核苷酸,所述多核苷酸在转基因植物中的表达能加快光合作用速率。本发明还涉及编码经修饰的HaHB4(modHaHB4(如modlHaHB4、mod2HaHB4、mod3HaHB4和mod4HaHB4))的多核苷酸和编码modHaHB4的功能活性片段和变体的多核苷酸以及含有这些多核苷酸和由这些多核苷酸编码的蛋白的载体和宿主细胞。本发明还包括含有本发明的多肽和/或多核苷酸的转基因宿主细胞(包括植物细胞)、植物、种子、花粉和植物部分。本发明还包括使用本发明的多核苷酸生产转基因宿主细胞、植物、种子、花粉和植物部分的方法以及由这些转基因宿主细胞、植物、种子、花粉和植物部分所产生的种子、后代和经加工的植物制品。

[0012] 根据一个实施方式,本发明涉及一种核酸分子,所述核酸分子包含编码HaHB4 (SEQID NO:2) 片段或变体的多核苷酸序列,其特征在于,相比于类似环境下生长的作为对照的野生型植物,在水胁迫或非水胁迫条件下生长的含有所述核酸分子的转基因植物的产量均有提高。在另一个实施方式中,本发明涉及一种核酸分子,所述核酸分子包含编码HaHB4(SEQ ID NO:2)片段或变体的多核苷酸序列,其特征在于,含有所述核酸分子的转基因植物的光合作用速率加快。另一个实施方式涉及一种核酸分子,所述核酸分子包含编码HaHB4(SEQ ID NO:2)片段或变体的多核苷酸序列,其特征在于,与同种的转基因HaHB4(SEQID NO:2)植物相比,在水胁迫或非水胁迫条件下生长的含有所述核酸分子的转基因植物的产量均有提高,其中重组HaHB4的表达受同一启动子控制。另一个实施方式涉及一种核酸分子,所述核酸分子包含编码HaHB4(SEQ ID NO:2)片段或变体的多核苷酸序列,其特征在于,含有所述核酸分子的转基因植物的光合作用速率加快。在另一个实施方式中,本发明的核酸分子包括一种编码HaHB4变体modlHaHB4(HaHB4.2(SEQ ID NO:4))的多核苷酸序列,其特征在于,与类似环境下生长的作为对照的野生型植物相比,在水胁迫或非水胁迫条件下生长的含有所述核酸分子的转基因植物的产量提高。在另一个实施方式中,本发明的核酸分子包括一种编码HaHB4变体modlHaHB4(HaHB4.2(SEQ ID NO:4))的多核苷酸序列,其特征在于,与类似环境下生长的作为对照的野生型植物相比,在水胁迫或非水胁迫条件下生长的包含所述核酸分子的转基因植物的光合作用速率加快。另一个实施方式涉及一种核酸分子,所述核酸分子包含编码modlHaHB4(HaHB4.2(SEQ ID N0:4))片段或变体的多核苷酸序列,其特征在于,与同种的转基因HaHB4(SEQ ID NO:2)植物相比,在水胁迫或非水胁迫条件下生长的含有所述核酸分子的转基因植物表现出产量提高和/或光合作用速率加快,其中重组HaHB4的表达受同一启动子控制。另一个实施方式涉及一种核酸分子,所述核酸分子包含编码modlHaHB4(HaHB4.2(SEQ ID N0:4))片段或变体的多核苷酸序列,其特征在于,与同种的转基因HaHB4(SEQ ID NO:2)植物相比,在水胁迫或非水胁迫条件下生长的含有所述核酸分子的转基因植物的光合作用速率加快,其中重组HaHB4的表达受同一启动子控制。

[0013] 在另一个实施方式中,本发明的核酸分子包括一种编码HaHB4变体mod2HaHB4(HaHB4.3 (SEQ ID N0:8))的多核苷酸序列,其特征在于,与类似环境下生长的作为对照的野生型植物相比,在水胁迫或非水胁迫条件下生长的含有所述核酸分子的转基因植物的产量提高。在另一个实施方式中,本发明的核酸分子包括一种编码HaHB4变体mod2HaHB4 (HaHB4.3 (SEQ ID NO: 8))的多核苷酸序列,其特征在于,与类似环境下生长的作为对照的野生型植物相比,在水胁迫或非水胁迫条件下生长的含有所述核酸分子的转基因植物的光合作用速率加快。另一个实施方式涉及一种核酸分子,所述核酸分子包含编码mod2HaHB4(HaHB4.3(SEQ ID NO:8))片段或变体的多核苷酸序列,其特征在于,与同种的转基因HaHB4(SEQ ID N0:2)植物相比,在水胁迫或非水胁迫条件下生长的含有所述核酸分子的转基因植物的产量提高,其中重组HaHB4的表达受同一启动子控制。另一个实施方式涉及一种核酸分子,所述核酸分子包含编码mod2HaHB4(HaHB4.3(SEQ ID NO:8))片段或变体的多核苷酸序列,其特征在于,与同种的转基因HaHB4(SEQ ID NO:2)植物相比,在水胁迫或非水胁迫条件下生长的含有所述核酸分子的转基因植物的光合作用速率加快,其中重组HaHB4的表达受同一启动子控制。

[0014] 在另一个实施方式中,本发明的核酸分子包括一种编码HaHB4变体mod3HaHB4(HaHB4.4(SEQ ID NO:38))的多核苷酸序列,其特征在于,与类似环境下生长的作为对照的野生型植物相比,在水胁迫或非水胁迫条件下生长的含有所述核酸分子的转基因植物表现出产量提高和/或光合作用速率加快。另一个实施方式涉及一种核酸分子,所述核酸分子包含编码mod3HaHB4(HaHB4.4(SEQ ID NO:38))片段或变体的多核苷酸序列,其特征在于,与同种的转基因HaHB4(SEQ ID NO:2)植物相比,在水胁迫或非水胁迫条件下生长的含有所述核酸分子的转基因植物表现出产量提高和/或光合作用速率加快,其中重组HaHB4的表达受同一启动子控制。

[0015] 在另一个实施方式中,本发明的核酸分子包括一种编码HaHB4变体mod4HaHB4 (HaHB4.5 (SEQ ID NO: 39))的多核苷酸序列,其特征在于,与类似环境下生长的作为对照的野生型植物相比,在水胁迫或非水胁迫条件下生长的含有所述核酸分子的转基因植物表现出产量提高和/或光合作用速率加快。另一个实施方式涉及一种核酸分子,所述核酸分子包含编码mod4HaHB4(SEQ ID NO:39)片段或变体的多核苷酸序列,其特征在于,与同种的转基因HaHB4(SEQ ID NO:2)植物相比,在水胁迫或非水胁迫条件下生长的含有所述核酸分子的转基因植物表现出产量提高和/或光合作用速率加快,其中重组HaHB4的表达受同一启动子控制。

[0016] 本发明还提供了一种核酸分子,所述核酸分子包含编码以下蛋白的多核苷酸序列:(a)HaHB4 变体 modlHaHB4(HaHB4.2(SEQ ID NO:4)) ; (b)modlHaHB4 的功能活性片段,其特征在于,所述片段的氨基酸序列不存在于相应的HaHB4(SEQ ID NO:2)序列中;或(c)modlHaHB4(SEQ ID NO:4)的功能活性变体,其特征在于,所述变体包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列至少存在80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同性的氨基酸序列,且其特征在于,所述变体的氨基酸序列不存在于相应的HaHB4(SEQ ID N0:2)序列中。本发明还包括分离后的核酸分子,所述核酸分子包含SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 12、SEQ IDNO: 13,SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 16或其互补链以及这些核酸分子片段和变体的多核苷酸序列,其序列不存在于相应的HaHB4(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 18)多核苷酸序列中。

[0017] 在另一个实施方式中,本发明提供了一种核酸分子,所述核酸分子包含编码以下蛋白的多核苷酸序列:(a)HaHB4 变体 mod2HaHB4(HaHB4.3(SEQ ID NO:8)) ; (b)mod2HaHB4的功能活性片段,其特征在于,所述片段的氨基酸序列不存在于相应的HaHB4(SEQ IDNO:2)序列中;或(c)mod2HaHB4(HaHB4.3 (SEQ ID NO:8))的功能活性变体,其特征在于,所述变体包含与SEQ ID N0:8的氨基酸序列至少存在80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同性的氨基酸序列,且其特征在于,所述变体的氨基酸序列不存在于相应的HaHB4(SEQ ID NO:2)序列中。本发明还包括分离后的核酸分子,所述核酸分子包含SEQ IDNO: 14或SEQ ID NO: 17或其互补链以及这些核酸分子片段和变体的多核苷酸序列,其序列不存在于相应的HaHB4(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 18)多核苷酸序列中。

[0018] 在一个实施方式中,本发明提供了一种核酸分子,所述核酸分子包含编码HaHB4变体mod3HaHB4(HaHB4.4(SEQ ID N0:38))的多核苷酸序列。在另一个实施方式中,本发明提供了一种核酸分子,所述核酸分子包含编码HaHB4变体mod4HaHB4(HaHB4.5(SEQ IDNO:39))的多核苷酸序列。

[0019] 根据一些实施方式,本发明的多核苷酸所编码的功能活性多肽变体或片段能够在体外结合DNA序列5’-CAAT(A/T)ATTG-3’(SEQ ID N0:11)。在其他实施方式中,本发明的多核苷酸所编码的功能活性多肽变体或片段能够在24°C下在由20mM HEPES-NaOH(pH7.6)、50mM KCl、2mM MgCl2、0.5mM EDTAU.0mM DTT、0.5 % 曲通 X-100、10 % 甘油和 1.0yg 聚(dl-dC)组成的溶液中结合DNA序列5’-CAAT(A/T)ATTG-3’ (SEQ ID NO: 11)。在其他实施方式中,表达本发明的功能活性多肽变体或片段的转基因植物细胞的基因表达概况不同于处于可比发育阶段且生长于可比环境中的可比组织的野生型对照细胞(如亲本)。在其他实施方式中,表达本发明功能活性多肽片段或变体的转基因植物细胞的转录概况不同于处于可比发育阶段且生长于可比环境中的可比组织的转基因HaHB4细胞,且其中转基因HaHB4与modHaHB4片段或变体编码序列受同一启动子控制。在其他实施方式中,与类似环境下生长的野生型植物相比,在水胁迫或非水胁迫条件下生长时,表达本发明的功能活性多肽片段或变体的转基因植物的产量提高。在其他实施方式中,与类似环境下生长的野生型植物相比,在水胁迫或非水胁迫条件下生长时,表达本发明的功能活性多肽片段或变体的转基因植物的光合作用速率加快。在其他实施方式中,与类似环境下生长的转基因HaHB4植物相比,在水胁迫或非水胁迫条件下生长时,表达本发明的功能活性多肽片段或变体的转基因植物的产量提高,其中转基因HaHB4与modHaHB4片段或变体编码序列的表达受同一启动子控制。在其他实施方式中,与类似环境下生长的转基因HaHB4植物相比,在水胁迫或非水胁迫条件下生长时,表达本发明的功能活性多肽片段或变体的转基因植物的光合作用速率加快,其中转基因HaHB4与modHaHB4片段或变体编码序列的表达受同一启动子控制。

[0020] 本发明还包括核酸(包括载体和表达盒),所述核酸包含与启动子可操作连接的本发明的多核苷酸。根据一些实施方式,本发明的多核苷酸可操作连接于组成型启动子。在特定实施方式中,所述组成型启动子是35SCaMV启动子或Ubil启动子。根据其他实施方式,本发明的多核苷酸可操作连接于可诱导启动子。在特定实施方式中,所述可诱导启动子是与拟南芥COX5c-2的第一个内含子融合的经修饰的HaHB4启动子。

[0021] 本发明还涉及包含本发明的核酸的宿主细胞。根据本发明,所使用的示例性宿主细胞包括但不限于细菌、真菌、昆虫、植物和动物细胞。在特定实施方式中,所述宿主细胞是植物细胞。根据一些实施方式,所述宿主细胞是单子叶植物细胞。其他实施方式中,所述宿主细胞是小麦(Triticum aestivum)、玉米(Zea mays)或水稻(Oryza sativa)。根据其他实施方式,所述宿主细胞是双子叶植物细胞。在特定实施方式中,所述宿主细胞是大豆(Glycine max)。在其他实施方式中,所述宿主细胞是拟南芥(Arabidopsis thaliana)。

[0022] 本发明还包括包含本发明的多核苷酸序列的转基因植物、种子、花粉、植物部分和转基因植物细胞。在一个实施方式中,转基因植物、种子、花粉、植物部分或转基因植物细胞包含编码modlHaHB4(SEQ ID NO:4)的多核苷酸。在其他实施方式中,所述编码modlHaHB4的多核苷酸包含选自以下序列的多核苷酸序列:SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 12, SEQ IDNO: 13, SEQ ID N0:15和SEQ ID N0:16。在另一个实施方式中,转基因植物、种子、花粉、植物部分或转基因植物细胞包含编码mod2HaHB4(SEQ ID NO:8)的多核苷酸。在其他实施方式中,所述编码mod2HaHB4的多核苷酸包含选自SEQ ID N0:14和SEQ ID N0:17的多核苷酸序列。

[0023] 在另一个实施方式中,转基因植物、种子、花粉、植物部分或转基因植物细胞包含编码mod3HaHB4(SEQ ID NO:38)的多核苷酸序列。在另一个实施方式中,转基因植物、种子、花粉、植物部分或转基因植物细胞包含编码mod4HaHB4(SEQ ID NO:39)的多核苷酸序列。

[0024] 在另一个实施方式中,本发明包括一种转基因植物、种子、花粉或植物部分,其包含编码以下蛋白的多核苷酸序列:modlHaHB4(SEQ ID NO:4) ; (b)modlHaHB4(SEQ IDNO:4)的功能活性片段,其特征在于,所述片段的氨基酸序列不存在于相应的HaHB4(SEQID NO:2)的序列中;或(c)modlHaHB4(SEQ ID NO:4)的功能活性变体,其特征在于,所述变体包含与SEQ ID N0:4的氨基酸序列至少存在80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同性的氨基酸序列,且其特征在于,所述变体的氨基酸序列不存在于相应的HaHB4 (SEQ ID NO:2)序列中。

[0025] 在另一个实施方式中,本发明包括一种转基因植物种子、花粉或植物部分,其包含编码以下蛋白的多核苷酸序列:(a)mod2HaHB4(SEQ ID NO:8) ; (b)mod2HaHB4的功能活性片段,其特征在于,所述片段的氨基酸序列不存在于相应的HaHB4(SEQ ID N0:2)序列中;或(c)mod2HaHB4(SEQ ID NO:8)的功能活性变体,其特征在于,所述变体包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少存在80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同性的氨基酸序列,且其特征在于,所述变体的氨基酸序列不存在于相应的HaHB4(SEQ ID NO:2)序列中。

[0026] 在另一个实施方式中,本发明包括一种转基因植物种子、花粉或植物部分,其包含编码以下蛋白的多核苷酸序列:(a)mod3HaHB4(SEQ ID NO:38) ; (b)mod3HaHB4的功能活性片段,其特征在于,所述片段的氨基酸序列不存在于相应的HaHB4(SEQ ID N0:2)序列中;或(c)mod3HaHB4(SEQ ID NO:38)的功能活性变体,其特征在于,所述变体包含与SEQ IDNO:38的氨基酸序列至少存在80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同性的氨基酸序列,且其特征在于,所述变体的氨基酸序列不存在于相应的HaHB4(SEQ ID N0:2)序列中。

[0027] 在另一个实施方式中,本发明包括一种转基因植物种子、花粉或植物部分,其包含编码mod4HaHB4 (SEQ ID NO: 39)的多核苷酸序列。

[0028] 根据一些实施方式,与野生型植物相比,表达本发明的多核苷酸的转基因植物的产量提高。在其他实施方式中,与野生型植物相比,在水胁迫或非水胁迫环境下生长时,表达本发明的多核苷酸的转基因植物的产量提高。在其他实施方式中,与野生型植物相比,在水胁迫或非水胁迫环境下生长时,表达本发明的多核苷酸的转基因植物的光合作用速率加快。在另外的实施方式中,与野生型植物相比,表达本发明中多核苷酸的转基因植物对于一种或多种环境胁迫的耐受性提高。本发明中转基因植物所应答的且耐受性提高的环境胁迫包括但不限于干旱、盐分、渗透压胁迫、低温暴露、热暴露、氮养分可用性减少、磷养分可用性减少和高植物密度。

[0029] 在另外的实施方式中,与相应野生型植物的HaHB4转基因品种相比,表达本发明的多核苷酸的转基因植物的产量提高,其中重组HaHB4和本发明的编码多核苷酸的表达受同一启动子控制。在其他实施方式中,与相应野生型植物的HaHB4转基因品种相比,在水胁迫或非水胁迫条件下生长时,表达本发明的多核苷酸的转基因植物的产量提高,其中重组HaHB4和本发明的编码多核苷酸的表达受同一启动子控制。在其他实施方式中,与相应野生型植物的HaHB4转基因品种相比,在水胁迫或非水胁迫条件下生长时,表达本发明的多核苷酸的转基因植物的光合作用速率加快,其中重组HaHB4和本发明的编码多核苷酸的表达受同一启动子控制。在另外的实施方式中,与相应野生型植物的HaHB4转基因品种相比,表达本发明的多核苷酸的转基因植物对于一种或多种环境胁迫的耐受性提高。

[0030] 根据一些实施方式,所述转基因植物、种子或植物部分是单子叶植物。在一些实施方式中,所述转基因植物、种子或植物部分是小麦(Triticum aestivum)。在另外的实施方式中,所述转基因植物、种子或植物部分是玉米(Zea mays)。在其他实施方式中,所述转基因植物、种子或植物部分是水稻(Oryza sativa)。在另外的实施方式中,本发明中所述转基因植物、种子或植物部分是双子叶植物。在一些实施方式中,所述转基因植物、种子或植物部分是大豆(Glycine max)。在另外的实施方式中,所述转基因植物、种子或植物部分是拟南芥(Arabidopsis thaliana)。本发明还包括转基因植物细胞和转基因植物的种子和后代,以及这些转基因植物、其种子和其后代所生产的种子和经加工的植物制品。

[0031] 本发明还涉及生产转基因宿主的方法,所述转基因宿主包括但不限于包含本发明的多核苷酸的细菌、真菌和植物细胞及转基因植物。根据这些方法生产的转基因宿主细胞和转基因植物的后代和种子,以及这些转基因宿主、其种子和其后代所生产的经加工的植物制品。

[0032] 附图简要说明

[0033] 图1A提供了 HaHB4转录因子(SEQ ID NO:2),经修饰HaHB4转录因子I (modlHaHB4/HaHB4.2 (SEQ ID NO: 4))和经修饰 HaHB4 转录因子 2 (mod2HaHB4 (SEQID N0:8))之间的序列比对。方框中显示了同源异型结构域-亮氨酸拉链区域。图1B 提供了 HaHB4 转录因子(SEQ ID NO: 2), modlHaHB4 (HaHB4.2 (SEQ ID NO: 4))、mod2HaHB4(HaHB4.3 (SEQ ID NO: 8))、mod3HaHB4(HaHB4.4 (SEQ ID NO:38))和mod4HaHB4 (HaHB4.5 (SEQ ID NO:39))之间的序列比对。

[0034] 图2A-2J提供了用于使用本发明的多核苷酸转化宿主细胞的示例性载体和构建的示意图。图2A-C分别描述了用于转化大豆和其他植物的构建pGmHaHB4.2、PGmPrHB4.2和pGmPrInHB4.2。图2D-G分别描述了用于转化小麦和其他植物的构建pTaBAR、pTaHaHB4.2、pTaPrHB4.2 和 pTaPrInHB4.2。图 2H-J 分别描述了用于转化玉米和其他植物的构建pZmHaHB4.2、pZMPrHB4和pZmPrInHB4.2。缩写:aadA(福氏志贺菌(S.flexneris) 2a的氨基糖苷3’ -腺苷转移酶基因,产生对链霉素的抗性),bar(来自吸水链霉菌(S.Hygroscopicus)的草胺膦乙酰转移酶基因,产生对除草剂草铵膦及其衍生物的抗性),P35S (花椰菜花叶病毒35S启动子),Tnos (NOS-Term ;农杆菌(A.tumefaciens)胭脂碱合成酶基因的3’终止子);TvSp (大豆营养贮藏蛋白基因3’终止子),TEV(烟草蚀刻病毒的转录增强子);RB(农杆菌(A.tumefaciens)胭脂碱菌株的T-DNA右边界片段);LB(农杆菌(A.tumefaciens)胭脂碱菌株的T-DNA左边界片段);pVSl (假单胞菌(Pseudomonas)的宽宿主范围质粒);AmpR(氨苄青霉素抗性基因);KanR(卡那霉素抗性基因);ori (细菌中的复制起点);HaHB4.2(实施例部分所述经修饰的HaHB4序列(pTHaHB4.2c插入));LPF (带有实施例所述修饰的HaHB4启动子);以及C0X5c_2内含子(C0X5c_2的第一个内含子)。

[0035] 图3A-3D中的柱状图显示了高产环境中在经灌溉的田野条件下(不限制供水,处于非水胁迫条件下)转基因作物中产量的提高。图3A-3B所描述的转基因玉米数据显示了两种纯合转基因玉米株系(组成型表达HaHB4.2 (SEQ ID NO: 4))和野生型对照玉米(WT)相应的谷物产量(kg/ha)。数据采集自两个不同土壤类型地区的平行试验点:种植期间接收626mm降雨量的砂壤土(图3A)和作物周期内接收545mm降雨量的排水良好的砂壤土(图3B)。图3C所描述的转基因小麦数据显示了一种纯合转基因小麦株系(组成型表达HaHB4.2 (SEQ ID NO:4))和野生型对照小麦(WT)相应的谷物产量(kg/ha)。图3C中的数据获得自排水良好的砂壤土地区(PH7.14%,0M1.57% )的平行试验点。使用补充灌溉以在作物周期内提供755mm的水。图3D所描述的转基因大豆数据显示了两种纯合转基因大豆株系(组成型表达HaHB4.2 (SEQ ID NO: 4))和野生型对照大豆(WT)相应的谷物产量(kg/ha)。图3D中的数据获得自排水良好的砂壤土地区(pH5.99%,0M1.41% )的平行试验点。使用补充灌溉以在作物周期内提供579mm的水。

[0036] 图4中的柱状图显示了一个简单酵母杂交试验中多种经修饰的HaHB4的反式激活因子活性。

[0037] 图5的柱状图显示了两个使用转化了含有与编码modlHaHB4(HaHB4.2(SEQ IDNO: 4))的核酸序列可操作连接的35S组成型启动子的表达盒(例如,35S.H4.2)的拟南芥植物进行的2个独立实验中测得的光合作用速率。

[0038] 发明详述

[0039] 定义

[0040] 除非另有说明,本文所用的所有科技术语与本发明所属领域普通技术人员所理解的通常含义相同。在抵触的情况下,以本申请(包括定义在内)为准。此外,除非本文另外要求,单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。本文中述及的所有出版物、专利和其他参考文献都通过引用全文纳入本文。

[0041] 术语“多核苷酸”包括单个核酸分子以及核酸分子中存在的任何一个或多个核酸片段(如DNA或RNA片段),且表示经分离的核酸分子或构建(例如,载体)(如与本发明的多核苷酸相关的信使RNA (mRNA)或质粒DNA (pDNA))。术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用。“经分离的”核酸或多核苷酸指从其天然环境中提取的核酸分子、DNA或RNA。例如,经分离的多核苷酸包括存在于异源宿主细胞中的重组多核苷酸或溶液中的纯化(部分或基本上纯化)多核苷酸。经分离的RNA分子包括本发明的多核苷酸的体内或体外RNA转录物。此外,多核苷酸或核酸可以是或可包括调控元件,如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。

[0042] 本文所用的术语“编码区”指由能够被翻译成氨基酸的密码子组成的核酸分子。虽然“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)不翻译成氨基酸,但可认为它是编码区的一部分,而任何旁侧序列如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子等均不是编码区的一部分。此外,本发明的载体、多核苷酸或核酸可编码异源编码区域。

[0043] 在某些实施方式中,所述多核苷酸或核酸是DNA。在DNA的情况中,包含多肽编码核酸的多核苷酸包含启动子和/或其它转录或翻译控制元件,这些元件与一个或多个编码区可操作连接。可操作连接指当基因产物(如多肽)的编码区与一个或多个调控序列以此方式连接时,该基因产物的表达将置于该调控序列的影响或控制下。如果启动子功能的诱导使编码所需基因产物的mRNA转录,且如果两个DNA片段间连接的属性不干扰表达调控序列指导基因产物表达或不干扰转录DNA模板的能力,则两个DNA片段(如多肽编码区及其相连的启动子)“可操作连接”或“可操作相连”。因此,如果启动子能够影响核酸的转录,则启动子区域与多肽编码核酸可操作连接。通常,可操作相连表示相连接的多核苷酸序列相邻且必要时可在阅读框中连接两个相邻的蛋白编码区域以形成“融合蛋白”。“融合蛋白”是一种包含源自两种或多种异源多肽的氨基酸序列的蛋白。

[0044] 本文所用术语“启动子”指一段功能为控制一个或多个基因转录的调控性核酸片段,位于基因的转录起始位点的上游(相对于转录方向),且在结构上包含一个DNA依赖的RNA聚合酶的结合位点(转录起始位点)和其他DNA序列,包括但不限于转录因子结合位点、抑制子和激活蛋白结合位点和本领域已知的直接或间接从启动子调控转录量的任何其他多核苷酸序列。

[0045] “植物启动子”是一种能够在植物细胞中起始转录的启动子,而不论其来源是否是植物细胞,例如已知农杆菌启动子能在植物中发挥作用。相应地,植物启动子包括来源于植物、植物病毒和细菌(如农杆菌)的启动子DNA序列。发育控制的启动子示例包括仅仅或优选在某些细胞类型或组织(如叶、根或种子)中起始转录的启动子;以及环境条件下(包括例如厌氧环境、暴露于某些化学品和暴露于光照时间的变化)的“可诱导”或“可抑制”的启动子。本发明的启动子包括在多数生理和发育条件下在多数组织中活跃的“组成型”启动子以及生理(例如通过外源性使用某些化合物)或发育调控的“非组成型”或“可诱导”启动子。本文所公开的组成型启动子的示例包括但不限于35SCaMV启动子(参见例如 pGmHaHB4.2 (图 2A)和 pZmHaHB4.2 (图 2H))以及 Ubi 启动子(参见例如 pTaHaHB4.2 (图2E))。本文还公开了本发明中使用的可诱导启动子的示例,包括但不限于经修饰的HaHB4启动子(参见例如 pGmPrHB4.2 (图 2B)、pTaPrHB4.2 (图 2F)和 pZMPrHB4.2 (图 21))以及由经修饰的HaHB4启动子与拟南芥COX5c-2基因的第一个内含子融合形成的可诱导启动子(参见例如 pGmPrInHB4.2 (图 2C),和 pTaPrInHB4.2 (图 2G),和 pZmPrInHB4.2 (图 2J))。

[0046] “调控序列”或“调控元件”指位于编码序列上游(5’非编码序列)、之内或下游(3’非编码序列)的核苷酸序列,其影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性,或翻译。调控序列可包含启动子、增强子、操纵子、抑制子、转录终止信号、翻译前导序列、内含子、聚腺苷酸识别序列、RNA加工位点、效应物结合位点和茎环结构。

[0047] 术语“质粒”、“载体”和“表达盒”可在本文中互换使用并表示一种通常带有不是细胞中心代谢部分的额外染色质元件。这些元件可以是自主复制序列、基因整合序列、噬菌体或核苷酸序列、线性或环状的单链或双链DNA或RNA,源自任何来源,其中大量核苷酸序列已连接或重组进能够将选定基因产物的启动子片段和DNA序列与合适的3’未翻译序列引入细胞的独特结构。为应用本发明中的方法和制备本发明中的组合物,可使用任何双链或单链、线性或环状形式的载体(包括质粒、粘粒、噬菌体或农杆菌双元载体),其可以是也可以不是自主转移或可移动的,可以通过整合至细胞基因组的方式转化原核或真核宿主或者存在于染色体外(如带有复制起始点的自动复制质粒)。具体包括穿梭质粒,表示一种天然的或设计的能够在两种不同宿主(可选自例如细菌、高等植物、酵母或真菌细胞)体内复制的DNA载体。

[0048] 或者,术语“表达盒”可表示表达一种或多种特定蛋白的核酸片段,包括蛋白编码序列之前(5’非编码序列)和之后(3’终止序列)的调控序列。

[0049] 本文所用术语“转化”指将核酸转移到宿主生物体中,引起具有遗传稳定性的遗传。含有转化核酸片段的宿主生物体称为“转基因”或“重组”或“转化”生物体。

[0050] 本文所用术语“表达”表示源自本发明的核酸片段的正义(mRNA)或反义RNA的转录和累积。表达也可以指mRNA翻译形成多肽。该过程包括细胞内表达的多核苷酸、基因或多肽的功能性存在的任何体现,包括但不限于基因敲除以及瞬时表达和稳定表达。

[0051 ] 本文所用的术语“多肽”意在包括单数形式“多肽”和复数形式“多肽”,指通过酰胺键(也称肽键)线性连接的单体(氨基酸)所组成的分子。术语“多肽”指任何一条或多条由两个或多个氨基酸形成的链,而不表示产物或产物的翻译后修饰类型的具体长度。术语“多肽”和“蛋白”在本文中可互换使用。

[0052] 本文所用术语“宿主细胞”表示能够经基因工程改造以表达本发明的多肽的任何类型的细胞系统。宿主细胞包括培养的细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞等,以及转基因生物体(如转基因植物或培养的植物组织)内所包含的细胞。

[0053] 本文所用术语“植物”包括整株植物、植物部分(如叶、茎、根等)、种子、花粉和植物细胞及其后代。本文中的植物细胞包括但不限于种子、悬浮培养物、胚胎、分生组织区域、胼胝体、叶、根、枝、配子、孢子、花粉和小孢子。

[0054] 本文中使用的“转基因植物细胞”表示经转化带有稳定整合的本发明的多核苷酸序列或者带有包含本发明中多核苷酸序列的自动复制载体的植物细胞。本文所用术语“稳定整合”表示整合至染色质、遗传上稳定且可通过后续世代遗传的多核苷酸。本文所描述或者本领域已知转化植物细胞的方法并且其包括但不限于农杆菌介导的转化、电穿孔和DNA包被的微粒轰击。本发明中的转基因植物细胞包括以细胞培养物或生物体形式存在的初始转化的植物细胞、再生和/或分化组织(如带有本发明中稳定整合的、非天然重组多核苷酸序列的转基因植物)中存在的后代植物细胞。转基因植物细胞还包括来源于转基因植物后代的种子或花粉。出于本发明的目的,术语“谷物”、“种子”和“谷粒”可互换使用。

[0055] 本文所用“转基因植物”包括基因组内含有本发明的多核苷酸的植物。通常,本发明的多核苷酸稳定整合入宿主的基因组,从而使所述多核苷酸能够传递至后续世代。所述异源多核苷酸可以单独或作为重组表达盒的部分整合入基因组。本文所用“转基因”包括任何含有本发明的多核苷酸的细胞、细胞系、胼胝体、植物部分或植物,包括初始即如此改变的转基因体以及从初始转基因体通过有性杂交或无性繁殖所产生的转基因体。

[0056] 本文所用术语“功能活性”表示能够呈现HaHB4或经修饰HaHB4转录因子的至少一种功能性活性的多核苷酸和多肽(包括片段和变体)。在一个实施方式中,本发明中的功能活性多肽(包括片段和变体)能够在体外结合DNA序列5’-CAAT(A/T)ATTG-3’ (SEQID NO: 11)。在另外的实施方式中,本发明的功能活性多肽能够在24 °C下在由20mMHEPES-NaOH(ρΗ7.6)、50mM KCl、2mM MgCl2、0.5mM EDTAU.0mM DTT、0.5% 曲通 X-100、10%甘油和1.0 μ g聚(dl-dC)组成的溶液中结合DNA序列5’ -CAAT (A/T) ATTG-3’ (SEQ IDNO: 11)。用于鉴定由本发明的多核苷酸编码的功能活性多肽的DNA结合试验是本领域中已知的,并可常规应用或按需要进行改良。根据一个实施例,可使用人工合成的包含序列5’-CAAT(A/T)ATTG-3’ (SEQ ID NO: 11)的双链寡核苷酸进行电泳迁移率变动分析(EMSA),用于测定功能修饰的HaHB4 DNA结合蛋白是否存在。例如,可将纯化后的细菌(如大肠杆菌)蛋白或纯化后的植物细胞核蛋白与含有序列5’-AATTCAGATCTCAATAATTGAGAG-3’ (SEQID NO: 36)和 5’-GATCCTCTCAA TTATTGAGATCTG-3’ (SEQ ID NO: 37)的放射性标记双链 DNA在结合介质(含有 20mM HEPES-NaOH(pH7.6)、50mM KCl、0_2mM EDTA、1.0mM 二硫苏糖醇(DTT)、0.5%曲通X-100、20%甘油和1.0ug聚(dl-dC))中在25°C下孵育20分钟,补充加入2.5% (wAOFicoll,随后将反应物加载至丙烯酰胺凝胶中并评价凝胶中DNA迁移率的变化,以此作物DNA结合的结果。其他评价转录因子与DNA序列基序结合以及蛋白质与DNA结合亲和性的技术和试验是本领域已知的。

[0057] 在另一个实施方式中,本发明的功能活性多肽(包括片段和变体)在生理条件下结合一种或多种不同于HaHB4转录因子(SEQ ID NO:2)的内源性宿主植物蛋白。在一些实施方式中,本发明的功能活性多肽能够结合未与HaHB4的相应多肽部分结合的内源性宿主植物蛋白。在其他实施方式中,本发明的功能活性多肽不能够结合与HaHB4的相应多肽部分结合的内源性宿主植物蛋白。确定蛋白-蛋白相互作用的方法和材料(包括例如酵母双杂交系统)是本领域已知的,且可常规适用和应用以评价本发明的多肽间的蛋白-蛋白相互作用。在一个实施方式中,本发明的功能活性多肽(包括片段和变体)在生理条件下结合一种或多种不同于HaHB4转录因子(SEQ ID NO:2)的拟南芥蛋白。用于分析本发明的多肽和拟南芥蛋白之间蛋白-蛋白相互作用的示例性方法包括拟南芥原生质体双杂交(P2H)系统(公开于:Ehlert 等,Plant J.46:890-900 (2006))。

[0058] 在另外的实施方式中,含有本发明的功能活性多核苷酸或多肽(包括片段和变体)的宿主细胞呈现出与不含本发明的多核苷酸或多肽的对照细胞(如野生基因型)不同的转录概况。在一个的实施方式中,在干旱、高盐条件或乙烯暴露下,含有本发明的功能活性多核苷酸或多肽的宿主细胞呈现出与不含本发明中多核苷酸或多肽的对照细胞(如野生基因型)不同的转录概况。

[0059] 可使用本领域已知的试剂和技术进行转录概况分析。这些技术包括但不限于微阵列、RT-PCR> RNA酶保护、Northern和Western分析。通常由微阵列分析进行的表达概况分析可用于同时测量多种不同基因的表达差异或诱导产生的变化。微阵列分析技术和其他用于评价编码序列表达水平的技术(如Northern、Western、PCR和RNA酶保护分析)是本领域已知的(Schena 等,Science270:467-470 (1995) ;Baldwin 等,Curr.0pin.Plant B1l.2 (2):96-103 (1999) ;Dangond F, Phys1l.Genomics2:53-58(2000) ;vanHal 等,J.B1technol.78:271-280(2000) ;Richmond 和 Somerville, Curr.0pin.PlantB1l.3:108-116(2000) ;Almoguera 等,Plant Mol.B1l.19:781-792 (1992);以及 Ausubel等主编,1998,《分子生物学试验指南》(Current Protocols in Molecular B1logy),纽约约翰韦利森出版社(John Wiley & Sons))。

[0060] 在一个实施方式中,所述转录概况分析在本发明的转基因拟南芥植物、植物部分或植物细胞中进行。用于本发明的转基因植物、植物部分或植物细胞的转录概况分析的不例性方法见于 Manavella 等,Plant Journal 48:125-137 (2006)和 Hilson 等,Gen.Res.14:2176-2189,上述文献均通过引用全文纳入本文。例如,根据一种方法,使用含有来自拟南芥的24,576个基因特异性标签的CATMA阵列进行转录组分析。在另外的方法中,使用根据公共渠道获得的序列所设计的寡核苷酸引物进行实时PCR(参见例如Arabidopsis.0rg ;和 Crowe 等,Nucl.Acids.Res.31:156-158 (2003))。

[0061] 在另一个实施方式中,与不含本发明中多核苷酸或多肽的对照组(例如野生型)相比,含有本发明的功能活性多核苷酸或多肽的宿主细胞表现出不同的mRNA或蛋白质的转录或表达概况,所述mRNA或蛋白质选自由L0X2、CSD1、ERF2、ERF5、AC0、SAM、EIN1和EIN3组成的组。在另一个实施方式中,与同一启动子控制下表达HaHB4(SEQ ID NO: 2)的转基因HaHB4宿主细胞相比,含有本发明的功能活性多核苷酸或多肽(包括片段和变体)的宿主细胞表现出不同的转录概况。在另一个实施方式中,与同一启动子控制下表达HaHB4(SEQ IDNO:2)的转基因HaHB4宿主细胞相比,在干旱条件、高盐条件或乙烯暴露条件下,含有本发明的功能活性多核苷酸或多肽的宿主细胞表现出不同的转录概况。在另一个实施方式中,与同一启动子控制下表达HaHB4(SEQ ID NO:2)的转基因HaHB4宿主细胞相比,含有本发明的功能活性多核苷酸或多肽的宿主细胞呈现出不同的mRNA或蛋白质表达概况,所述mRNA或蛋白质选自由 L0X2、CSD1、ERF2、ERF5、AC0、SAM、EINl 和 EIN3 组成的组。

[0062] 在另一个实施方式中,与不含本发明的多核苷酸或多肽的对照组(例如野生型基因型)相比,含有本发明的功能活性多核苷酸或多肽(包括片段和变体)的转基因植物表现出不同的产量。在另一个实施方式中,与不含本发明的多核苷酸或多肽的对照组(例如野生型基因型)相比,含有本发明的功能活性多核苷酸或多肽(包括片段和变体)的转基因植物表现出不同的光合作用速率。在具体实施方式中,与不含本发明的多核苷酸或多肽的对照组(例如野生型基因型)相比,含有本发明的功能活性多核苷酸或多肽(包括片段和变体)的转基因植物的产量提高。在具体实施方式中,与不含本发明的多核苷酸或多肽的对照组(例如野生型基因型)相比,含有本发明的功能活性多核苷酸或多肽(包括片段和变体)的转基因植物的光合作用速率加快。在具体实施方式中,在相同的非水胁迫条件下,与不含本发明的多核苷酸或多肽的对照组(例如野生型基因型)相比,含有本发明的功能活性多核苷酸或多肽(包括片段和变体)的转基因植物的产量提高。在具体实施方式中,在相同的非水胁迫条件下,与不含本发明的多核苷酸或多肽的对照组(例如野生型基因型)相比,含有本发明的功能活性多核苷酸或多肽(包括片段和变体)的转基因植物的光合作用速率加快。

[0063] 在另一个实施方式中,与同一启动子控制下表达HaHB4(SEQ ID NO:2)的转基因植物相比,含有本发明的功能活性多核苷酸或多肽(包括片段和变体)的转基因植物呈现不同的产量。在另一个实施方式中,与同一启动子控制下表达HaHB4(SEQ ID NO: 2)的转基因植物相比,含有本发明的功能活性多核苷酸或多肽(包括片段和变体)的转基因植物呈现不同的光合作用速率。

[0064] 在具体实施方式中,与同一启动子控制下表达HaHB4(SEQ ID NO:2)的转基因植物相比,含有本发明的功能活性多核苷酸或多肽的转基因植物的产量提高。在具体实施方式中,与同一启动子控制下表达HaHB4(SEQ ID NO:2)的转基因植物相比,含有本发明的功能活性多核苷酸或多肽的转基因植物的光合作用速率加快。

[0065] 在一些实施方式中,在相同的水条件和同一启动子控制下,与表达HaHB4 (SEQ IDNO: 2)的转基因植物相比,含有本发明的功能活性多核苷酸或多肽的转基因植物在非水胁迫条件下生长时的产量提高。在一些实施方式中,在相同的水条件和同一启动子控制下,与表达HaHB4(SEQ ID NO:2)的转基因植物相比,含有本发明的功能活性多核苷酸或多肽的转基因植物在非水胁迫条件下生长时的光合作用速率加快。在一些实施方式中,在同一水条件和同一启动子控制下,与表达HaHB4 (SEQ ID NO: 2)的转基因植物相比,含有本发明的功能活性多核苷酸或多肽的转基因植物在水胁迫条件下生长时的产量提高。在一些实施方式中,在相同的水条件和同一启动子控制下,与表达HaHB4(SEQ ID NO:2)的转基因植物相比,含有本发明的功能活性多核苷酸或多肽的转基因植物在水胁迫条件下生长时的光合作用速率加快。

[0066] 在另外的实施方式中,在同一启动子控制和相同的水条件下,与表达HaHB4(SEQID NO:2)的转基因植物相比,含有本发明的功能活性多核苷酸或多肽的转基因植物在水胁迫和非水胁迫条件下生长时的产量提高。在另外的实施方式中,在同一启动子控制和相同的水条件下,与表达HaHB4(SEQ ID NO: 2)的转基因植物相比,含有本发明的功能活性多核苷酸或多肽的转基因植物在水胁迫和非水胁迫条件下生长时的光合作用速率加快。

[0067] 在其他实施方式中,在相同的水条件下,与不含本发明的多核苷酸或多肽的对照组(例如野生型基因型)相比,含有本发明的功能活性多核苷酸或多肽(包括片段和变体)的转基因植物在水胁迫或非水胁迫条件下生长时的产量提高。在其他实施方式中,在相同的水条件下,与不含本发明的多核苷酸或多肽的对照组(例如野生型基因型)相比,含有本发明的功能活性多核苷酸或多肽(包括片段和变体)的转基因植物在水胁迫或非水胁迫条件下生长时的光合作用速率加快。在具体实施方式中,在同一启动子控制和相同的水条件下,与表达HaHB4(SEQ ID NO: 2)的转基因植物相比,含有本发明的功能活性多核苷酸或多肽的转基因植物在水胁迫或非水胁迫条件下生长时的产量提高。在具体实施方式中,在同一启动子控制和相同的水条件下,与表达HaHB4(SEQ ID NO:2)的转基因植物相比,含有本发明的功能活性多核苷酸或多肽的转基因植物在水胁迫或非水胁迫条件下生长时的光合作用速率加快。

[0068] 具体实施方式涉及使用本发明的多核苷酸以生产植物的方法,所述植物处于不限水条件下、限水条件下或不限水条件和限水条件下时产量提高,所述方法包含以下步骤:将本发明的多核苷酸导入宿主植物细胞,选择多核苷酸分子存在以生成转基因植物细胞,并从转基因植物细胞再生成转基因植物,从而使得转基因植物在不限水条件或限水条件下的产量高于可比较的野生型植物或转基因HaHB4植物,其中HaHB4处于同一启动子控制下。具体实施方式涉及使用本发明的多核苷酸以生产植物的方法,所述植物处于不限水条件下、限水条件下或不限水条件和限水条件下时光合作用速率加快,所述方法包含以下步骤:将本发明的多核苷酸导入宿主植物细胞,选择多核苷酸分子存在以生成转基因植物细胞,并从转基因植物细胞再生成转基因植物,从而使得转基因植物在不限水条件或限水条件下的光合作用速率高于可比较的野生型植物或转基因HaHB4植物,其中HaHB4处于同一启动子控制下。

[0069] 举例来说,对于核苷酸序列与本发明的参照核苷酸序列至少95% “相同”的的核酸分子或多核苷酸而言,除多核苷酸序列中每100个核苷酸可包含至多五个相对于参照序列的点突变外,多核苷酸分子的核苷酸序列与参照序列相同。换言之,为了获得核苷酸序列与参照核苷酸序列至少95%相同的多核苷酸,可删除或用其它核苷酸替换参照序列中多至5%的核苷酸,或者可将长度最多为参照序列总核苷酸5%的核苷酸插入到参照序列中。

[0070] 实际上,一般通过已知的计算机程序确定任何特定核酸分子或多肽与本发明的核苷酸序列或多肽序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同。本领域所知的术语“相同百分数”指,由序列比对所确定的两个或多个多肽序列或者两个或多个多核苷酸序列之间的关系。本领域中“相同性”也指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关程度,视情况通过此类序列串之间的匹配进行确定。可使用已知方法容易地计算“相同性”和“相似性”,所述方法包括但不限于以下所述:1.)Computat1nal Molecular B1logy (《计算分子牛.物学》)(Lesk, A.M.主编)牛津大学出版社(Oxford University):纽约(I988);

2.) B1computing:Informatics and Genome Pro iects (《牛.物计算:信息学和基因组计划》)(Smith, D.W.主编)学术出版社(Academic):纽约(1993):3.) Computer Analysisof Sequence Data, Part I (《序歹"数据的计算坑分析》,第一部分)(Griffin, A.Μ.和Griffin, H.G.主编)人类出版社(Humania):新泽西州(1994):4.) Sequence Analysis inMolecular B1logy (《分子牛.物学中的序歹"分析》)(von Heinje, G.主编)学术出版社(Academic) (1987):以及 5.) Sequence Analysis Primer (《序列分析引物》)(Gribskov,Μ.和Devereux, J.主编)斯托克顿出版社(Stockton):纽约(1991)。

[0071] 设计了用于测定相同性的优选方法以完成所测试序列间的最佳匹配。测定相同性和相似性的方法在公共可用计算机程序中编码。序列比对和百分比相同性的计算可以使用LASERGENE生物信息学计算套件的MegAlign™程序(威斯康星州麦迪逊的DNASTAR公司(DNASTAR Inc.))实施。序列的多重比对使用“序列比对的Clustal法”,其包含多种算法,包括“序列比对的Clustal V法”,对应于Clustal V标记的比对方法(参见Higgins和Sharp, CAB1S 5:151-153(1989) ;Higgins 等,Comput.Appl.B1sc1.,8:189-191(1992)),并可在LASERGENE生物信息学计算套件的MegAlign™程序中找到(DNASTAR公司(DNASTARInc.))。对于多重比对,默认值相对于缺口罚分(GAP PENALTY) = 10且缺口长度罚分(GAP LENGTH PENALTY) =10。使用Clustal法进行成对比对和蛋白序列相同百分数计算的默认参数为K元组(KTUPLE) = 1,缺口罚分(GAP PENALTY) = 3,窗口(WINDOW) = 5且对角线保留(DIAGONALS SAVED) = 5。对于核酸,这些参数是K元组(KTUPLE) = 2,缺口罚分(GAP PENALTY) = 5,窗口(WINDOW) = 4 且对角线保留(DIAGONALS SAVED) = 4。使用Clustal V程序进行序列比对后,通过查看相同程序中的“序列距离”表即可获得“相同百分数”。此外,可以使用“序列比对的Clustal W法”,其对应于标记为Clustal W的比对方法(参见 Higgins 和 Sharp, CAB10S.5:151-153 (1989) ;Higgins 等,Comput.Appl.B1sc1.8:189-191 (1992)),并可在 LASERGENE 生物信息学计算套件的 MegAlign™ v6.1 程序中找到(DNASTAR公司(DNASTAR Inc.))。多重比对的默认参数(缺口罚分(GAP PENALTY)=10,缺口长度罚分(GAP LENGTH PENALTY) = 0.2,延迟趋散序列(Delay Divergen Seqs)(% ) = 30, DNA 转换比重(DNA Transit1n Weight) = 0.δ,蛋白质比重矩阵(ProteinWeight Matrix) = Gonnet 系列(Gonnet Series), DNA 比重矩阵(DNA Weight Matrix)=IUB)。使用Clustal W程序进行序列比对后,通过查看相同程序中的“序列距离”表即可获得“相同百分数”。

[0072] 举例来说,对于氨基酸序列与本发明中查询氨基酸序列至少95%“相同”的多肽而言,除对象多肽序列中每100个氨基酸可包含至多五个相对于查询氨基酸序列的氨基酸变化外,对象多肽的氨基酸序列与查询多肽相同。换言之,为得到氨基酸序列与查询氨基酸序列至少有95%相同的多肽,对象序列中最多有5%的氨基酸残基可被插入、缺失或用其它氨基酸取代。参照序列的这些变化可以发生在参照氨基酸序列的氨基或羧基端或这些端位置之间的任何位置,可以分散在参照序列上,或者在参照序列内的一个或多个邻接基团中。

[0073] 实际上,一般使用已知的计算机程序确定任何特定多肽与参照多肽序列至少有80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同。确定查询序列(本发明的某序列)与对象序列之间最佳总体匹配的一个方法是采用基于Brutlag等,Comp.App.B1sc1.6:237245(1990)的算法的FASTDB计算机程序来确定,该方法也称为整体序列比对。在序列比对中,查询和对象序列或者都是核苷酸序列,或者都是氨基酸序列。所述整体序列比对的结果表示为相同百分数。FASTDB氨基酸比对中优选的参数为:矩阵(Matrix)= PAM 0,k_ 元组(k-tuple) = 2,错配罚分(Mismatch Penalty) = 1,连接罚分(JoiningPenalty) = 20,随机分组长度(Randomizat1n Group Length) = O,截断分值(CutoffScore) =1,窗口尺寸(Window Size)=序列长度,缺口罚分(Gap Penalty) =5,缺口尺寸罚分(Gap Size Penalty) =0.05,窗口尺寸(Window Size) = 500或对象氨基酸序列的长度中较短者。

[0074] 若对象序列比查询序列短是由于N-或C-端缺失而非中间的缺失,必须对结果进行人工校正。这是因为FASTDB程序在计算整体相同百分数时并不考虑对象序列的N-和C-端截断。对于相对查询序列在N-和C-端有截断的对象序列,通过计算查询序列中在对象序列N-和C-末端而不与相应的对象残基匹配/对齐的残基数占查询序列总碱基数的百分数来校正相同百分数。通过FASTDB序列比对的结果确定残基是否匹配/对齐。然后由上述FASTDB程序采用特定参数计算所得相同百分数中减去该百分值,获得最终的相同百分数得分。该最终相同百分数得分即被用于本发明的目的。为了人工调整相同百分数得分,仅考虑对象序列N-和C-末端与查询序列不匹配/对齐的残基。也就是说,只查询对象序列N-和C-末端残基远端外侧的残基位置。

[0075] 例如,将有90个氨基酸残基的对象序列与有100个残基的查询序列比对以确定相同百分数。缺失发生在对象序列的N-末端,因此FASTDB对齐并不显示N-末端最初10个残基的匹配/对齐。这10个未配对残基代表序列的10% (N-和C-末端未匹配残基数/查询序列的总残基数),因此需从FASTDB程序计算得到的相同百分数中减去10%。若其余90个残基为理想匹配,那么最终的相同百分数将是90%。在另一示例中,比较了 90个残基的对象序列与100个残基的查询序列。这次缺失为内部缺失,因此对象序列的N-或C-末端没有未与查询相匹配/对齐的残基。该情况下,FASTDB计算所得相同百分数不用人工校正。如上所述,只对在FASTDB比对中显示为对象序列N-和C-末端外侧,未与查询序列匹配/对齐的残基位置进行人工校正。为本发明目的,无需进行其它人工校正。

[0076] 也可使用国家生物技术信息中心(Nat1nal Center for B1technologyInformat1n,NCBI)中可用的BLAST程序(使用程序内的默认参数)确定多核苷酸和/或多肽的相同百分比。

[0077] 本文所用术语“相同百分数”表示最优化比对后,通过组分(例如核苷酸序列或氨基酸序列)比对窗口观察到的两条DNA或蛋白质片段之间没有差异的程度。测试序列和参照序列经比对后片段的“相同分数”等于在全长测试序列或全长参照序列中较小的排列窗口上两条排列后片段的序列所共有相同组分数目除以参考片段中的序列组分总数。“相同百分数”(“相同%”)等于相同分数乘以100。应将这类最优化比对理解为DNA序列的局部比对。对于蛋白质比对,蛋白质序列的局部比对应允许加入缺口以实现最优化比对。相同百分比的计算所基于的比对后序列长度并不包含每条序列中通过比对引入的缺口。

[0078] 本文所用术语“变体”多核苷酸或多肽表示使用例如重组DNA技术对氨基酸残基和多核苷酸位点分别进行插入、缺失、突变和取代,从而生成的与本发明中具体指出的多核苷酸或多肽不同的多核苷酸或多肽。具体而言,可以利用遗传密码的“冗余性”合成或选择编码这些相同或相似多肽的重组变体。可引入多种密码子取代(如形成多种限制性位点的沉默改变)以最优化克隆进入质粒或病毒载体或在特定原核或真核系统中的表达(即涉及宿主的“密码子最优化”)。多核苷酸序列中的突变会反映在多肽或者用于修改多肽任意部分的性质而添加至多肽的其他肽段结构域中,从而改变特征(如DNA和其他配体结合亲和性或降解/转换速率)。根据一些实施方式,本发明的多核苷酸是密码子最优化的,能够最优化多肽在转基因宿主中的表达。

[0079] 术语“密码子最优化”指用于多种宿主转化的基因或核酸分子编码区时,表示基因或核酸分子编码区中的密码子变化,以反映在不改变DNA所编码多肽的情况下宿主生物中通常使用的密码子。这类最优化包括使用该生物的基因中较频繁使用的一个或多个密码子代替至少一个或超过一个或大量密码子。

[0080] 包括编码任何多肽链氨基酸的密码子的核苷酸序列偏差允许编码该基因的序列不同。由于各密码子由三个核苷酸组成,且含DNA的核苷酸局限于四种特异碱基,所以有64种可能的核苷酸组合,其中61种编码氨基酸(剩余三种密码子编码终止翻译的信号)。因此,许多氨基酸被一种以上密码子指定。例如,氨基酸丙氨酸和脯氨酸由4种三联体编码,丝氨酸和精氨酸由6种编码,而色氨酸和甲硫氨酸仅由一种三联体编码。这种简并性使得在不改变DNA所编码蛋白质氨基酸序列的条件下,DNA碱基组成能够在较广范围内变化。

[0081] 许多生物体对使用具体密码子编码生长肽链中插入的具体氨基酸存在偏好。密码子优选或密码子偏好、生物体之间密码子使用的差异,基于遗传密码的简并性,且在许多生物体中详细记载。密码子偏好常和信使RNA(mRNA)的翻译效率相关,继而认为其依赖被翻译的密码子性质和具体转移RNA(tRNA)分子的有效性等。所选tRNA在细胞中的优势通常反映了肽合成中使用最频繁的密码子。因此,可基于密码子优化就给定生物体中最佳的基因表达来调整基因。

[0082] 基于各种动物、植物和微生物物种可获得的大量基因序列,可计算密码子使用的相对频率。密码子使用表可获自例如http: //www.kazusa.0r.1p/codon/ (2008年3月20日访问)的“密码子使用数据库”,这些表可适用于许多方面。参见Nakamura等,Nucl.AcidsRes.28:292(2000)。

[0083] 使用密码子使用表,本领域普通技术人员可将所述频率应用于任何给定的多肽序列,并产生编码区密码子优化的核酸片段,所述编码区编码多肽但使用最优密码子,用于在感兴趣的宿王中表达感兴趣的序列。

[0084] 可以手动完成以最优化频率随机分配密码子以编码给定多肽序列,通过计算每个氨基酸的密码子频率,随后向多肽序列随机分配密码子。此外,本领域普通技术人员能够容易地获得多种算法和计算机软件程序。例如,威斯康星州麦迪逊的DNASTAR公司的Lasergene软件包中的“编辑序列(EditSeq) ”功能,马里兰州贝塞斯达的InforMax公司VectorNTI套件中的回译(backtranslat1n)功能,以及加利福尼亚州圣地亚哥的Accelrys公司GFG-Wisconsin软件包中的回译(backtranslate)功能。此外,可从公共渠道使用多种资源以对编码区序列进行密码子最优化,例如http =^entelechon.com/b1 informat ics/backtrans Iat 1n.php ? Iang = eng 中的“回译(backtranslat1n),,功能以及 http〃b1inf0.pb1.nrc.ca:8090/EMB0SS/index.html〃 中的“回译序列(backtranseq) ”功能。本领域普通技术人员还可使用基础的数学功能容易地完成基础算法的构建,以基于给定频率分配密码子。此外,可通过本领域已知的多种方法设计密码子优化的编码区,所述方法包括软件包,如“合成基因设计者(synthetic gene designer) ”,网址为 http:^phenotype, b1sc1.umbc.edu/codon/sgd/index.php〃。

[0085] 在一些实施方式中,本发明包括密码子最优化的多核苷酸,用于在感兴趣的宿主中表达感兴趣的多肽。因此,举例来说,虽然本发明的多核苷酸既可以在单子叶植物物种也可以在双子叶植物物种中表达,但仍可对多核苷酸的序列进行修改以形成针对感兴趣的一种单子叶植物或双子叶植物的特定密码子偏好和GC含量偏好。可以容易地获得并使用本文所述技术或本领域中已知技术常规地使用密码子用法表和软件程序,用于指导对任意给定序列进行密码子最优化从而使其在感兴趣的宿主细胞中表达。示例性密码子用法指导请参见例如Murray等,Nucleic Acids Res.17:477-98 (1989),该文献已通过引用全文纳入本文。也可通过重组设计编码本发明的多肽的多核苷酸以去除使用本领域已知技术即可容易地完成鉴定和修改的潜在的减稳序列和潜在的二级结构。

[0086] 本文所用术语“对照植物”表示不含本发明的多肽序列的植物。合适的对照植物包括用于生成转基因植物的亲本系中的非转基因植物或与转基因植物同一种类的非转基因植物,本文中这类植物通常被称作“野生型”植物。

[0087] 本文所用术语“增强性状”表示转基因植物的一种特征,包括但不限于以增强的植物形态、生理、生长和发育、产量、营养提升、疾病或害虫抗性或者环境或化学耐受性为特征的增强的农艺学性状。在本发明的更具体方面,所述增强性状选自一组增强性状,包括增强的水使用效率(如“干旱抗性”)、增强的盐耐受性、增强的低温耐受性、产量提高和增强的氮使用效率。

[0088] 本文中交替使用“减水条件”或“非水胁迫”条件,用以表示植物或细胞在没有水限制的条件下生长且细胞、植物或植物的大部分未表现出可见的与缺水条件相关的迹象或症状。相反地,本文中交替使用“限水条件”、“缺水条件”和“水胁迫条件”,用以表示植物或细胞在水限制的条件下生长且细胞、植物或植物的大部分表现出可见的与干旱和水胁迫相关的迹象或症状。

[0089] 本文交替使用“减水环境”或“非水胁迫”环境,用以表示植物或细胞在没有水限制的条件下生长且细胞、植物或植物的大部分未表现出可见的与缺水条件相关的迹象或症状。相反地,本文中交替使用“限水条件”、“缺水条件”和“水胁迫条件”,用以表示植物或细胞在水限制的条件下生长且细胞、植物或植物的大部分表现出可见的与干旱和水胁迫相关的迹象或症状。

[0090] 本文所用术语“产量提高”的含义与在农业和/或研究领域中通常使用和理解该术语时表达的含义相同。本发明的转基因植物的产量提高可以通过一系列方法测定,包括测试重量、每株植物的种子数、种子重量、每单位面积的种子数或重量(如每英亩种子数或种子重量)。在一个具体实施方式中,产量提高表示一株植物或一个植物群(每单位面积)的种子或谷粒生产重量统计学上显著增加。根据一个实施方式,与可比数目对照植物的种子或谷粒生产重量相比,本发明的转基因植物的一个统计学显著的样本规模(如η = 10或更多)的种子或谷粒重量产量增加了至少5%。

[0091] 本文所用术语“光合作用速率加快”的含义与在农业和/或研究领域中通常使用和理解该术语时表达的含义相同。本发明的转基因植物的光合作用速率加快可以通过一系列方法测定,包括叶CO2气体交换测定。在一个具体实施方式中,光合作用速率加快表示一株植物或一个植物群(每单位面积)的叶CO2气体交换统计学上显著增加。根据一个实施方式,与可比数目对照植物的光合作用速率相比,本发明的转基因植物的一个统计学显著的样本规模(如η = 10或更多)的光合作用速率加快了至少5%。

[0092] 经修饰的HaHB4多核苷酸和多狀

[0093] 本发明涉及以下发现,即对HaHB4转录因子的序列修饰会令人惊讶地导致已经转化了编码经修饰HaHB4蛋白质的多核苷酸序列的转基因植物呈现增强性状。HaHB4基因(包括启动子和调节序列)、蛋白质和HaHB4转基因宿主还在美国专利号7,674,955中详细描述,该文献通过引用全文纳入本文。

[0094] 在一些实施方式中,本发明所提供的核酸分子包括编码经修饰HaHB4蛋白的多核苷酸序列。在另外的实施方式中,本发明所提供的核酸分子包括编码带有与HaHB4(SEQ IDNO:2)不同序列的经修饰HaHB4的功能活性片段或变体的多核苷酸序列。本发明还包括上述这些和本发明的其他多核苷酸所编码的蛋白质。

[0095] 如本文所公开的,转化有带SEQ ID N0:4和SEQ ID NO:8氨基酸序列的经修饰HaHB4 (modHaHB4)蛋白质的转基因植物出乎意料地表现出增强性状,包括在水胁迫和非水胁迫条件下生长时产量高于对照组植物。相似地,如本文所述,转化有带SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:8氨基酸序列的经修饰HaHB4(modHaHB4)蛋白质的转基因植物出乎意料地表现出增强性状,包括在水胁迫和非水胁迫条件下生长时的光合作用快于对照组植物。因此,在一个实施方式中,本发明涉及的核酸分子包括编码带SEQ ID NO:4氨基酸序列的经修饰向日葵(Helianthus annuus)HB-4(modlHaHB4)的多核苷酸序列。在一个具体实施方式中,核酸包括 SEQ ID NO:3、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15 或 SEQ ID NO: 16 的多核苷酸序列。在另一个实施方式中,本发明涉及的核酸分子包括编码带SEQ ID N0:8氨基酸序列的经修饰向日葵(Helianthus annuus)HB-4(mod2HaHB4)的多核苷酸序列。在具体实施方式中,核酸包括SEQ ID N0:14或SEQ ID NO: 17的多核苷酸序列。

[0096] 本发明还包括转化有带SEQ ID N0:38和SEQ ID NO:39氨基酸序列的经修饰HaHB4(modHaHB4)蛋白的转基因植物。在具体实施方式中,这些植物表现出增强性状,包括在水胁迫或非水胁迫条件下生长时相比于对照组植物产量提高和/或光合作用加快。因此,在一个实施方式中,本发明涉及的核酸分子包括编码带SEQ ID N0:38氨基酸序列的经修饰向日葵(Helianthus annuus)HB-4 (mod3HaHB4)的多核苷酸序列。在另一个实施方式中,本发明涉及的核酸分子包括编码带SEQ ID N0:39氨基酸序列的经修饰向日葵(Helianthus annuus)HB-4(mod4HaHB4)的多核苷酸序列。

[0097] 本发明进一步提供了一种编码modlHaHB4(HaHB4.2(SEQ ID N0:4))的功能活性片段的多核苷酸,其包含不存在于HaHB4 (SEQ ID NO:2)中的相应序列的modlHaHB4序列。在一些实施方式中,所述功能活性片段包含modlHaHB4(SEQ ID NO:4)氨基酸序列中的至少15、20、25、30、40、50、60、75、100、125、150或175个连续氨基酸残基。在其他实施方式中,所述片段包含 modlHaHB4(SEQ ID NO:4)氨基酸序列中的至少 10-50、25-75、50-100、75_125或100-175个连续氨基酸残基。在其他实施方式中,所述片段包括SEQ ID NO:4的氨基酸残基2-10、SEQ ID: 4的氨基酸残基13-25或SEQ ID: 4的氨基酸残基150-170的序列。

[0098] 本发明进一步提供了一种编码mod2HaHB4(HaHb4.3(SEQ ID N0:8))的功能活性片段的多核苷酸,其包含不存在于HaHB4 (SEQ ID NO:2)中的相应序列的mod2HaHB4序列。在一些实施方式中,所述功能活性片段包含mod2HaHB4(SEQ ID NO:8)氨基酸序列中的至少

15、20、25、30、40、50、60、75、100、125、150或175个连续氨基酸残基。在其他实施方式中,所述片段包含 mod2HaHB4(SEQ ID NO:8)氨基酸序列中的至少 10-50、25-75、50-100、75_125或100-175个连续氨基酸残基。在其他实施方式中,所述片段包含SEQ ID NO:8的氨基酸残基2-10的序列。

[0099] 本发明进一步提供了一种编码mod3HaHB4(HaHB4.4(SEQ ID NO: 38))的功能活性片段的多核苷酸,其包含不存在于HaHB4 (SEQ ID N0:2)中的相应序列的mod3HaHB4序列。在一些实施方式中,所述功能活性片段包含SEQ ID NO: 38的氨基酸残基2-15或165-175的序列,且包含 mod3HaHB4(SEQ ID NO: 38)氨基酸序列中的至少 15、20、25、30、40、50、60、75、100、125、150或175个连续氨基酸残基。在其他实施方式中,所述功能活性片段包含SEQ IDNO: 38的氨基酸残基2-15或165-175的序列,且包含mod3HaHB4 (SEQ ID NO: 38)氨基酸序列中的至少10-50、25-75、50-100、75-125、100-175个连续氨基酸残基。

[0100] 本发明进一步提供了一种编码mod4HaHB4(SEQ ID NO: 39)的功能活性片段的多核苷酸,其包含不存在于HaHB4(SEQ ID NO: 2)中的相应序列的mod4HaHB4序列。在一些实施方式中,所述功能活性片段包含SEQ ID N0:39的氨基酸残基2-10的序列,且包含mod4HaHB4 (SEQ ID NO:39)的氨基酸序列中的至少 15、20、25、30、40、50、60、75、100、125、150或175个连续氨基酸残基。在其他实施方式中,所述功能活性片段包含SEQ ID NO: 39的氨基酸残基2-10的序列,且包含mod4HaHB4(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列中的至少10-50、25-75,50-100,75-125,100-175 个连续氨基酸残基。

[0101] 在另一个实施方式中,本发明的多核苷酸编码相当于modlHaHB4(SEQ ID NO:4)N端和/或C端缺失的功能活性片段。因此,根据一些实施方式,本发明的多核苷酸编码modlHaHB4的功能活性片段,所述modlHaHB4(SEQ ID NO: 4)的N端有至少I个但少于5、10、15或20个氨基酸缺失。在其他实施方式中,本发明的多核苷酸编码modlHaHB4(SEQ IDNO: 4)的功能活性片段,所述modlHaHB4(SEQ ID NO: 4)的C端有至少I个但少于10、25、50、75或100个氨基酸缺失。在其他实施方式中,本发明的多核苷酸编码modlHaHB4的功能活性片段,所述modlHaHB4(SEQ ID NO: 4)的N端有至少I个但少于5、10、15或20个氨基酸缺失且C端有至少I个但少于10、25、50、75或100个氨基酸缺失。

[0102] 在另一个实施方式中,本发明的多核苷酸编码相当于mod2HaHB4(SEQ ID NO:8)N端和/或C端缺失的功能活性片段。因此,根据一些实施方式,本发明的多核苷酸编码mod2HaHB4的功能活性片段,所述mod2HaHB4(SEQ ID NO: 8)的N端有至少I个但少于5、10、15或20个氨基酸缺失。在其他实施方式中,本发明的多核苷酸编码mod2HaHB4(SEQ IDNO: 8)的功能活性片段,所述mod2HaHB4(SEQ ID NO: 8)的C端有至少I个但少于10、25、50、75或100个氨基酸缺失。在其他实施方式中,本发明的多核苷酸编码mod2HaHB4的功能活性片段,所述mod2HaHB4(SEQ ID NO: 8)的N端有至少I个但少于5、10、15或20个氨基酸缺失且C端有至少I个但少于10、25、50、75或100个氨基酸缺失。

[0103] 在另一个实施方式中,本发明的多核苷酸编码相当于mod3HaHB4(HaHB4.3(SEQ IDNO:38)) N端和/或C端缺失的功能活性片段。因此,根据一些实施方式,本发明的多核苷酸编码mod3HaHB4的功能活性片段,所述mod3HaHB4 (SEQ ID NO:38)的N端有至少I个但少于

9、10、15或20个氨基酸缺失。在其他实施方式中,本发明的多核苷酸编码mod3HaHB4(SEQID NO: 38)的功能活性片段,所述mod3HaHB4(SEQ ID NO: 38)的C端有至少I个但少于9个氨基酸缺失。在其他实施方式中,本发明的多核苷酸编码mod3HaHB4的功能活性片段,所述mod3HaHB4 (SEQ ID NO:38)的N端有至少I个但少于5、10、15或20个氨基酸缺失且C端有至少I个但少于10、25、50、75或100个氨基酸缺失。

[0104] 在另一个实施方式中,本发明的多核苷酸编码相当于mod4HaHB4(SEQ ID NO: 39)N端和/或C端缺失的功能活性片段。因此,根据一些实施方式,本发明的多核苷酸编码mod4HaHB4的功能活性片段,所述mod4HaHB4 (SEQ ID NO:39)的N端有至少I个但少于5、

10、 15或20个氨基酸缺失。在其他实施方式中,本发明的多核苷酸编码mod4HaHB4(SEQ IDNO: 39)的功能活性片段,所述mod4HaHB4(SEQ ID NO: 39)的C端有至少I个但少于10、25、50、75或100个氨基酸缺失。在其他实施方式中,本发明的多核苷酸编码mod4HaHB4的功能活性片段,所述mod4HaHB4(SEQ ID NO: 39)的N端有至少I个但少于5、10、15或20个氨基酸缺失且C端有至少I个但少于7个氨基酸缺失。

[0105] modHaHB4 蛋白(例如,modlHaHBll (SEQ ID NO:4)和 mod2HaHBll (SEQ ID NO:8))的区域包括氨基末端区域(“NTR”:SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:9);同源异型结构域(“HD”:SEQ ID NO:4的氨基酸残基13-78 ;SEQ ID NO:8的氨基酸残基12-77);亮氨酸拉链(“LZ”:SEQ ID NO:4的氨基酸残基79-108 ;SEQ ID NO:8的氨基酸残基78-107);以及羧基末端区域(“CTR”:SEQ ID NO:4的氨基酸残基109-177 ;SEQ ID NO:8的氨基酸残基108-176)。根据一些实施方式,多核苷酸包括含有modlHaHB4蛋白的一个或多个区域的蛋白质,所述区域选自以下组:NTR(SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:9);同源异型结构域(SEQ ID NO:4的氨基酸残基13-78或SEQ ID NO:8的氨基酸残基12-77);亮氨酸拉链(SEQ ID NO:4的氨基酸残基79-108 ;或SEQ ID NO:8的氨基酸残基78-107);以及CTR(SEQ ID N0:4的氨基酸残基109-177或SEQ ID NO: 8的氨基酸残基108-176)。还提供了编码两个或多个modHaHB4区域组合的多核苷酸,所述区域选自以下组:NTR(SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:9);同源异型结构域(SEQ ID NO: 4的氨基酸残基13-78);亮氨酸拉链(SEQ ID NO: 4的氨基酸残基79-108);以及CTR(SEQ ID NO:4的氨基酸残基109-177)。

[0106] mod3HaHB4蛋白(SEQ ID NO:38)的区域包括同源异型结构域(“HD”:SEQ ID NO:38的氨基酸残基13-78);羧基末端区域(“CTR”:SEQ ID NO:38的氨基酸残基109-177)。根据一些实施方式,多核苷酸包括含有mod3HaHB4蛋白一个或多个区域的蛋白质,所述区域选自以下组:同源异型结构域(SEQ ID NO: 38的氨基酸残基13-78);以及CTR(SEQ ID NO: 38的氨基酸残基109-177)。

[0107] 在其他实施方式中,本发明包括编码modlHaHB4(SEQ ID NO: 4)或mod2HaHB4 (SEQID NO:8)的功能活性变体的多核苷酸,其中所述变体的序列不是HaHB4 (SEQ ID NO:2)的序列。在其他实施方式中,本发明包括编码mod3HaHB4(SEQ ID NO: 38)或mod4HaHB4 (SEQID NO:39)的功能活性变体的多核苷酸,其中所述变体的序列不是HaHB4 (SEQ ID NO:2)的序列。本发明的变体包括modlHaHB4或mod2HaHB4序列中的添加、取代。本发明中的变体包括mod3HaHB4或mod4HaHB4序列中的添加、取代。氨基酸“取代”指将某一氨基酸替换为另一结构和/或化学特性相似的氨基酸,例如保守性氨基酸替换。可根据所涉及残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲特性的相似性,进行“保守性”氨基酸取代。例如,非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸;极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷胺酰胺;带正电(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸;带负电(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。通常“插入”或“缺失”的范围为约I个至约20个氨基酸,优选为约I个至约10个氨基酸,更优选为约2个至约5个氨基酸。非保守性取代指将一种类型的成员更换为另一种类型的成员。例如,氨基酸取代也可以指将某一氨基酸替换为另一结构和/或化学特性不同的氨基酸,例如将一组中的一个氨基酸(例如极性)替换为不同组的另一个氨基酸(例如碱性)。可以使用重组DNA技术系统性地对多肽分子中的氨基酸进行插入、缺失或替代并测定所生成的重组变体的活性,从而通过试验确定变体。

[0108] 在具体实施方式中,本发明中的多核苷酸编码了 modlHaHB4或mod2HaHB4的功能活性变体,其与modlHaHB4蛋白(SEQ ID NO:4)或mod2HaHB4蛋白(SEQ ID NO:8)的相应序列相比含有1、2、3、4、5、10或更多个取代、插入或缺失,其中所述变体不含HaHB4 (SEQ IDNO:2)的相应氨基酸序列。在一些实施方式中,多核苷酸编码了 modlHaHB4或mod2HaHB4的功能活性变体,其与modlHaHB4蛋白(SEQ ID NO:4)或mod2HaHB4蛋白(SEQ ID NO:8)的相应序列相比含有1、2、3、4、5、10或更多个保守性取代。在其他实施方式中,多核苷酸编码了 modlHaHB4或mod2HaHB4的功能活性变体,其与modlHaHB4蛋白(SEQ ID NO: 4)或mod2HaHB4蛋白(SEQ ID NO:8)的相应序列相比含有1、2、3、4、5、10或更多个非保守性取代。

[0109] 在其他实施方式中,多核苷酸编码了 modlHaHB4或mod2HaHB4蛋白的功能活性变体,其与modlHaHB4蛋白(SEQ ID NO:4)或mod2HaHB4蛋白(SEQ ID NO:8)的相应序列相比含有1-10、1-20或1-25个取代、插入或缺失,其中所述变体不含HaHB4(SEQ ID NO:2)的相应氨基酸序列。在一些实施方式中,多核苷酸编码了 modlHaHB4或mod2HaHB4蛋白的功能活性变体,其与modlHaHB4蛋白(SEQ ID NO:4)或mod2HaHB4蛋白(SEQ ID NO:8)的相应序列相比含有1-10、1-20或1-25个保守性取代。在其他实施方式中,多核苷酸编码了 modlHaHB4或mod2HaHB4蛋白的功能活性变体,其与modlHaHB4蛋白(SEQ ID NO:4)或mod2HaHB4蛋白(SEQ ID NO:8)的相应序列相比含有1_10、1_20或1_25个非保守性取代。

[0110] 在具体实施方式中,多核苷酸编码了 modlHaHB4蛋白的功能活性变体,其包含第7位的一个丝氨酸插入、第9位的苏氨酸被丝氨酸取代、第18位的精氨酸被赖氨酸取代或第155位的赖氨酸被苯丙氨酸取代。

[0111] 在具体实施方式中,功能活性的经修饰HaHB4蛋白包含天然HaHB4蛋白(SEQ IDNO:2)第9位的苏氨酸被丝氨酸取代、天然HaHB4蛋白(SEQ ID NO:2)第13位的苏氨酸被丝氨酸取代、天然HaHB4蛋白(SEQ ID NO: 2)第22位的赖氨酸被精氨酸取代、天然HaHB4蛋白(SEQ ID NO:2)第159位的苯丙氨酸被赖氨酸取代、天然HaHB4蛋白(SEQ ID NO:2)第175位的亮氨酸被取代。

[0112] 在其他实施方式中,本发明包括编码mo d I HaHB4蛋白的功能活性变体的多核苷酸,其中所述变体包含与modlHaHB4蛋白(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列至少80 %、85%、90%、92%、95%、95%、96%、97%、98%或99%相同的序列,且其中所述变体不含HaHB4(SEQ ID NO: 2)的相应氨基酸序列。此外,带有上述同源物的合适的多核苷酸片段编码了含有至少50个氨基酸、至少100个氨基酸、至少150个氨基酸的多肽,并且其中相应序列不存在于HaHB4(SEQ ID NO:2)中。带有上述同源物的合适的多核苷酸片段编码了含有至少50个氨基酸、至少100个氨基酸、至少150个氨基酸的多肽,且不含HaHB4 (SEQ ID NO: 2)的相应氨基酸序列。

[0113] 在其他实施方式中,本发明包括编码mod2HaHB4蛋白的功能活性变体的多核苷酸,其中所述变体包含与mod2HaHB4蛋白(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列至少80 %、85%、90%、92%、95%、95%、96%、97%、98%或99%相同的序列,且其中所述变体不含HaHB4(SEQ ID NO: 2)的相应氨基酸序列。带有上述同源物的合适的多核苷酸片段编码了含有至少50个氨基酸、至少100个氨基酸或至少150个氨基酸的多肽,且不含HaHB4(SEQ IDNO:2)的相应氨基酸序列。

[0114] 在其他实施方式中,本发明包括与SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 15 或 SEQ ID NO: 16 的多核苷酸序列有至少 80%、85%、90%、92%、95%、95%、96%、97%、98%或99%相同的多核苷酸变体、SEQ ID NO: 14、或SEQ ID NO: 17、或这些序列中任意一条的互补链或其片段,其中多核苷酸序列不存在于HaHB4 (SEQ ID NO:1)的相应多核苷酸序列中且不编码HaHB4(SEQ ID NO: 2)。带有上述同源物的合适的多核苷酸片段包括长度为至少20个核苷酸、至少30个核苷酸、至少40个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸或至少100个核苷酸的片段。

[0115] 在另一个实施方式中,本发明包括一种核酸分子,所述核酸分子包含编码以下蛋白的多核苷酸序列:(a)modlHaHB4(SEQ ID NO:4) ; (b)所述经修饰蛋白的功能活性片段,其中所述片段的氨基酸序列不存在于HaHB4(SEQ ID NO:2)中;或(c)经修饰HaHB4蛋白的功能活性变体,其包含与SEQ ID N0:4的氨基酸序列至少存在80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同性的氨基酸序列;其中所述片段或变体的氨基酸序列不存在于HaHB4(SEQ ID NO: 2)的氨基酸序列中。

[0116] 在另一个实施方式中,本发明包括一种核酸分子,所述核酸分子包含编码以下蛋白的多核苷酸序列:(a)modlHaHB4(SEQ ID NO:4) ; (b)modlHaHB4的功能活性片段,其中所述片段的氨基酸序列不存在于HaHB4 (SEQ ID NO: 2)中;或(c)modlHaHB4蛋白的功能活性变体,其中所述变体包含与SEQ ID N0:4的氨基酸序列至少存在80%、85%、90%、95%、96 %、97 %、98 %或99 %相同性的氨基酸序列,且其中所述片段或变体的氨基酸序列不存在于 HaHB4(SEQ ID NO:2)中。

[0117] 本发明进一步提供了包含一种多核苷酸序列的核酸(包括编码本文所描述的多核苷酸的modHaHB4片段),其在严格杂交条件下与含有编码modlHaHB4(SEQ ID NO:4)或mod2HaHB4(SEQ ID NO:8)的多核苷酸互补链的核酸杂交,其中杂交的多核苷酸编码一种不同于HaHB4(SEQ ID NO: 2)的功能活性多肽。在其他实施方式中,多核苷酸在严格的杂交条件下与含有SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 14的多核苷酸序列互补链的核酸杂交,其中杂交多核苷酸编码一种不同于HaHB4(SEQ ID NO: 2)的功能活性多肽。

[0118] 在本文中,当单链形式的多核苷酸或核酸片段可在合适的温度和溶液离子强度条件下与其它核酸片段退火时,则称该多核苷酸与其它多核苷酸或核酸片段(如cDNA、基因组DNA或RNA分子)是“可杂交的”。杂交和洗涤条件众所周知且示例于Sambrook,J.、Fritsch, E.F.和 Maniatis, Τ.Molecular Cloning:A Laboratory Manual (《分子克隆:实验室手册》),第二版,冷泉湾实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory):纽约冷泉港(1989),具体为其中的第11章和表11.1 (该文献通过引用全文纳入本文)。温度和离子强度条件确定了杂交的“严谨性”。可调整严谨性条件以筛选中等相似的片段(如来自亲缘关系较远生物体的同源序列),到高度相似的片段(如使来自亲缘关系较近生物体的复制功能性酶的基因)。杂交后的洗涤决定了严谨条件。一组条件使用一系列的洗涤,始于6XSSC,0.5% SDS室温15分钟,然后用2X SSC, 0.5% SDS 45°C重复洗涤30分钟,再用0.2XSSC,0.5% SDS 50°C洗涤30分钟重复两次。另一组严谨条件使用更高的温度,其中洗涤同上,除了最后两次用0.2X SSC、0.5% SDS洗涤30分钟的温度升高到60°C。而另一组高严谨条件中使用的两次最终洗涤为0.1X SSC、0.1% SDS、65°C。另一组高严谨条件例如包括在

0.1X SSC,0.1% SDS、65°C杂交并且用 2X SSC,0.1% SDS 然后 0.1X SSC,0.1% SDS 洗涤。

[0119] 杂交需要包含互补序列的两个核酸,尽管根据所述杂交的严谨性,可以有碱基之间的错配。杂交核酸的合适严谨性取决于核酸的长度和互补的程度,这是本领域熟知的变量。两个核苷酸序列之间相似性或同源性的程度越高,有这些序列的核酸杂交体的Tm值越高。核酸杂交的相对稳定性(对应于较高的Tm)按以下顺序依次减弱:RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。对于长度多于100个核苷酸的杂交体,已经推导出计算Tm的方程(见Sambrook等,同上,9.50-9.51)。对更短核酸(如寡核苷酸)的杂交而言,错配的位置变得更加重要,且寡核苷酸的长度决定其特异性(见Sambrook等,同上,11.7-11.8)。在一个实施方式中,可杂交核酸的长度为至少约10个核苷酸。在另一个实施方式中,可杂交核酸的最短长度为至少约15个核苷酸。而在另一个实施方式中,可杂交核酸的最短长度为至少约20个核苷酸或至少约30个核苷酸。另外,技术人员会认识到,根据诸如探针长度等因素,必要时可以调整温度和洗液盐浓度。

[0120] 本文所使用的标准重组DNA和分子克隆技术在本领域中众所周知,且描述于 Sambrook, J.、Fritsch, E.F.和 Maniatis, T., Molecular Cloning:A LaboratoryManual (《分子克隆:实验室手册》),第二版,冷泉湾实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press),纽约冷泉港(1989)(下文称作 “Maniatis” );以及 Silhavy, T.J.、Bennan, M.L.和 Enquist, L.ff., Experiments with Gene Fus1ns (《基因融合实验》),冷泉湾实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),纽约冷泉港(1984);以及 Ausubel, F.Μ.等,Current Protocols in Molecular B1logy (《分子生物学实验指南》,格林出版集团和威力出版公司(Greene Publish.Assoc.& Wiley Interscience)出版(1987) ;Frohman (Frohman克隆PCR产品。在聚合酶链式反应中,K.B.Mullis, F.Fre和R.A.Gibas主编,第14-37页;每篇文献均通过引用全文纳入本文),用于生成带有不同氨基酸序列的蛋白,例如产生氨基酸的取代、缺失和/或插入。

[0121] 载体和宿主细胞

[0122] 本发明还包括含有modHaHB4多核苷酸的载体(包括表达盒)。

[0123] 本发明的载体可由DNA或RNA组成,可以是线状或闭合环状质粒。所述载体可以是克隆、扩增、穿梭或表达载体。载体系统可以是单个载体或质粒或者两个或多个共同包含或控制本发明的多核苷酸在宿主细胞中的复制、整合和/或表达的载体。根据载体中所含任意特定启动子序列,可以以正向或反向的取向将本发明的多核苷酸插入载体中。

[0124] 用于宿主细胞转化(如细菌或植物)的载体组分通常包括但不限于以下一项或多项:一个信号序列、一个复制起始点、一个或多个选择性标记基因以及任选的一个启动子(如诱导型启动子),用于使外源性DNA表达。通常,选择性标记基因编码一种转化后宿主细胞在选择性培养基中存活或生长所必须的蛋白质。典型的选择基因编码赋予对抗生素或其他毒素(如氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、新霉素、甲氧苄啶、大观霉素、磺酰胺或氨甲喋呤)抗性的蛋白,(b)补充营养缺陷型缺陷,或(c)供应无法从复杂培养基中获得的关键营养素。这些成功转化了异源性蛋白或其片段的细胞生成一种蛋白,所述蛋白赋予细胞对药物的抗性,从而在选择方案中存活下来。

[0125] 凭借标准的重组DNA技术,可以构建包含上文所列一个或多个组分和本发明的多核苷酸的适当载体,并可使用本领域中可用的方法和试剂容易地制备。参见例如Sambrook等,同上以及Ausubel等,同上。通常,可常规切割、调整并重新连接分离后的核酸质粒或DNA片段以形成包含所需相关组分的载体构建,从而赋予该构建需要的功能和特性。多种适当的载体和启动子市售可得和/或是本领域中已知的,可根据本发明常规地进行使用或修饰。细菌载体的代表性示例包括:pQE70、pQE80L、pQE81L、pQE82L、pQE60和pQE_9 (凯杰公司(Qiagen)) ;pBS、pD1、phagescript、psiX174、pBS.RTM.SK、pBS.RTM.KS、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A ;pGEX-3X、pGEX-4T_l 至 pGEX-4T-3、pGEX-5X_l 至 pGEX_5X_3、以及pGEX_6P_l 至 pGEX_6P_3 ;pBluescript SK 和 pBluescript KS 和 pBluescript II (司查塔基公司(Stratagene),加利福尼亚州拉由拉市)、pIN载体(Van Heeke和Schuster, 1989)、pTRC99a、pKK223_3、pKK233_3、pDR540 和 pRIT5 (法玛西亚生物技术(Pharmacia),瑞典乌普萨拉)。真核载体的代表性示例包括:pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXTl、pSG(司查塔基公司(Stratagene))、pSG5、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL、GEMl (普洛麦格生物技术公司(PromegaB1tec),威斯康星州麦迪逊)和pSVLSV40。

[0126] 在一些实施方式中,本发明的多核苷酸被插入到载体内,与合适的启动子可操作地连接以在宿主植物中发挥功能,驱动多核苷酸序列的表达。适用于该目的的许多载体是本领域已知的,可常规地选择以用于构建并基于一些因素按照本发明使用,所述因素包括例如插入载体的多核苷酸序列的大小和载体所转化的特定宿主细胞。本发明的植物转化载体还在编码序列上游或甚至在本发明的多核苷酸的编码序列内部位置含有一段有功能的HaHB4或异源性内含子序列,还可在启动子和翻译起始点之间位置含有一段5’末端(5,)非翻译前导序列(即UTR或5’ -UTR)。

[0127] 本发明的载体优选包含一个选择性标记,所述标记赋予选择性表型,能够鉴定转化后表达和/或含有本发明的多核苷酸的细胞。例如,在多个实施方式中,选择性标记基因编码一种蛋白,赋予杀生物剂抗性、抗生素抗性(如卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素等)或除草剂抗性(如草甘膦等)。可根据本发明的组合物和方法使用的选择性标记的示例包括但不限于编码卡那霉素抗性并可使用卡那霉素选择的neo基因、赋予卡那霉素和相关抗生素抗性的nptll基因(Messing等,Gene 19:259-268(1982) ;Bevan等,Nature 304:184-187 (1983))、赋予除草剂草胺膦抗性的 bar 基因(White 等,Nucl.AcidsRes.18:1062 (1990),Spencer 等,Theor.Appl.Genet.79:625-631 (1990))、赋予对抗生素潮霉素抗性的 hph 基因(Blochinger 等,Mol.Cell.B1l.4:2929-2931 (1984)) ;G418,编码草甘膦抗性的突变EPSP合成酶基因(美国专利号4,940,835和5,188,642);赋予咪唑啉酮或磺脲抗性的突变乙酰乳酸合成酶基因(ALS);赋予溴苯腈抗性的腈水解酶基因;和甲氨蝶呤抗性DHFR基因。此外,可使用多种选择性标记以赋予对氨苄青霉素、博来霉素、氯霉素、庆大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、氨甲蝶呤、草胺膦、嘌呤霉素、大观霉素、利福平和四环素。这类选择性标记的示例列于美国专利号5,550,318 ;5,633,435 ;5,780,708和6,118,047,上述各专利的全部内容均通过引用全文纳入本文。

[0128] 根据一些实施方式,本发明涉及核酸(包括载体和表达盒),所述核酸包含与启动子可操作地连接的本发明的多核苷酸。在一些实施方式中,本发明的多核苷酸与组成型启动子可操作地连接。在具体实施方式中,所述组成型启动子是35S CaMV启动子或Ubi启动子。根据其他实施方式,本发明的多核苷酸与诱导型启动子可操作地连接。在具体实施方式中,所述诱导型启动子是胁迫诱导型启动子。在其他实施方式中,所述诱导型启动子是与拟南芥Cox2-C的第一个内含子融合的经修饰的HaHB4启动子。

[0129] 在其他实施方式中,本发明的载体包含HaHB4小等位基因启动子序列(SEQ IDN0:20)、HaHB4大等位基因启动子序列(SEQ ID N0:21)或HaHB4启动子大或小等位基因启动子序列的功能活性片段或衍生物。根据一个实施方式,所述启动子包含HaHB4小等位基因启动子序列(SEQ ID NO:20)的第805至1221、904至1221、1011至1221或15至622核苷酸序列。根据另一个实施方式,所述启动子包含HaHB4大等位基因启动子序列(SEQ IDN0:21)的第15-409或805至1221核苷酸序列。根据另一个实施方式,所述启动子包含HaHB4大等位基因启动子序列(SEQ ID N0:21)的第15-409或805至1221核苷酸序列。在另一个实施方式中,所述启动子包含HaHB4小等位基因启动子序列(SEQ ID NO: 20)的至少50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700 或 800 个核苷酸的片段序列。在另一个实施方式中,所述启动子包含HaHB4大等位基因启动子序列(SEQ ID NO:21)的至少50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700 或 800 个核苷酸的片段序列。

[0130] 活跃于植物细胞中的多种其他启动子是本领域已知的,并可根据本发明的多个实施方式在植物表达载体中提供。这些启动子包括植物基因组中存在的启动子和来自病毒、细菌和其他来源的启动子,包括农杆菌的肿瘤诱导质粒上携带的胭脂碱合成酶(NOS)启动子和章鱼碱合酶(OCS)启动子以及花椰菜花叶类病毒启动子(如花椰菜花叶病毒或玄参花叶病毒启动子)。参见例如公开了来源于花椰菜花叶病毒(CaMV35S)的组成型启动子的美国专利号5,858,742和5,322,938、公开了玄参花叶病毒(FMV) 35S启动子的美国专利号5,378,619、公开了玉米RS81启动子的美国专利号6,437,217、公开了水稻肌动蛋白启动子的美国专利号5,641,876、公开了玉米RS324启动子的美国专利号6,426,446、公开了玉米PR-1启动子的美国专利号6,429,362、公开了玉米A3启动子的美国专利号6,232,526、公开了组成型玉米启动子的美国专利号6,177,611、公开了玉米L3油质蛋白启动子的美国专利号6,433,252、公开了水稻肌动蛋白2启动子和内含子的美国专利号6,429,357、公开了根特异性启动子的美国专利号5,837,848、公开了冷诱导型启动子的美国专利号6,084,089、公开了光诱导型启动子的美国专利号6,294,714、公开了盐诱导型启动子的美国专利号6,140,078、公开了病原体诱导型启动子的美国专利号6,252,138、公开了磷缺乏诱导型启动子的美国专利号6,175,060、公开了用于设计有效植物表达载体的5’、3’和内含子元件的美国申请公开号2002/0192813A1、公开了一种coixin启动子的美国申请公开号09/078,972、公开了一种玉米叶绿体醛缩酶启动子的美国申请公开号09/757,089以及公开了水缺陷诱导型启动子的美国申请公开号10/739,565,上述文献均通过引用纳入本文。这些和多种其他在植物细胞中发挥功能的启动子是本领域已知的,并可与本发明的多核苷酸可操作地连接和/或用于本发明的载体中以驱动或控制转基因植物细胞中多核苷酸序列的表达。

[0131] 在其他实施方式中,本发明的多核苷酸(单独或同载体序列一起)与来源于在缺水条件下过表达的植物基因的调控区域的启动子可操作地连接。在具体实施方式中,本发明的多核苷酸与来源于对应某一基因5’调控区域的启动子可操作地连接,所述基因选自:热激蛋白17.5 (HSP17.5)、HVA22 (HVA22)、Rab17或肉桂酸4-羟化酶(CA4H)。美国申请公开号10/739,565中公开了示例性缺水诱导型启动子,其通过引用全文纳入本文。

[0132] 在其他实施方式中,本发明的多核苷酸与一种启动子操作性连接,并进而与一个或多个“增强子序列”可操作地连接,所述增强子能够提升该启动子所驱动的基因表达。通常可以正向或反向的取向将这类增强子插入编码序列的5’或3’位置,也可以存在于内含子中。多种增强子是已知的和/或可以使用本领域已知的试剂或技术容易地进行鉴定。能够与本发明的多核苷酸可操作地连接的示例性增强子包括水稻肌动蛋白I和水稻肌动蛋白2基因的5’内含子和来自CaMV 35S启动子的元件(Odell等,Nature6:810-812(1985))、章鱼碱合酶基因、玉米醇脱氢酶基因、玉米收缩I (shrunkenl)基因、Adh 内含子 I (Callis 等,Genes and Develop., 1:1183 (1987))、鹿糖合成酶内含子(Vasil 等,Plant Phys1l.91:1575 (1989))和 TMV omega 兀件(Gallie 等,Plant Cell1:301(1989))。

[0133] 在其他实施方式中,本发明的多核苷酸(单独或同载体序列一起)与转录终止子可操作地连接,所述转录终止子负责终止超出本发明的多核苷酸的转录并纠正mRNA聚腺苷酸化。已知在植物中有功能的适当转录终止子的示例包括但不限于CaMV 35S终止子、tml终止子、来源于农杆菌的胭脂碱合成酶终止子(Bevan等,Nucl.Acids Res.,11:369 (1983),Depicker 等,J.Mol.Appl.Genet.1:561-573 (1982))、pea rbcS E9 终止子、来自农杆菌的章鱼碱合酶基因和来自土豆或番茄的蛋白酶抑制因子I或II基因的3’端的T7转录本终止子。

[0134] 优选的植物转化载体包括来源于农杆菌Ti质粒的载体(例如美国专利号5,981,840、5,501,967、4,536,475、4,658,082、4,693,977 和 4,886,937 中所述,以及Simpson 等,Plant Mol.B1l.6:403-15 (1986)和 EP O 122 791),上述各文献的内容均通过引用全文纳入本文。其他优选植物转化载体包括例如Herrera-Estrella等,Nature303:209-213(1983) ;Bevan,M.,Nucl.Acids Res.12:8711-8721(1984)和 EP 0 120516中所公开的载体,上述各文献的内容均通过引用全文纳入本文。对于基于农杆菌的植物转化系统,转化载体构建中存在的其他元件包括T-DNA左和右边界序列,促进重组多核苷酸整合至植物基因组中。用于农杆菌介导基因转移的农杆菌载体系统和方法的描述可参见例如Gruber等,"Vectors for Plant Transformat1n"(《用于植物转化的载体》),植物分子生物学和生物技术中的方法,同上以及Moloney等,Plant Cell Reports 8:238(1989)。根据其他实施方式,所述载体是双元载体系统的一部分,如pBinl9、pC22、pGA482、pCVOOl、PJJ1881、pPZPlll、pPVP、pGreen0029、pCGN1547、pM0N10098、pBI121 (Bevan, Nucl.AcidsRes.12:8711-8721 (1984)、pBIlOl (Jefferson 等,EMBO J.6:3901-3907 (1987)) Risch 等,Plant Mol.B1l.27:405-409(1995)、以及 Rothstein 等,Gene 53:153-161 (1987),也可参见 Becker 等,Plant Mol.B1l.20:1195-1197 (1992)和 Hajdukiewicz 等,Plant Mol.B1l.25:989-994(1994),上述各文献均通过引用全文纳入本文)。

[0135] 其他载体(包括表达盒)和用于植物细胞或组织转化及植物再生的体外培养方法和试剂是本领域已知的,并可容易地应用或修改以用于本发明。制造和使用本发明中多核苷酸、多肽、宿主细胞和转基因植物所必需的克隆、核酸操纵与合成、载体构建和其他重组技术通常是本领域中已知的,例如可参见Sambrook等,Molecular Cloning:A LaboratoryManual (《分子克隆:实验室手册》),第二版,纽约冷泉港,冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press) (1989);以及 Ausubel 等,Current Protocols inMolecular B1logy (《分子生物学实验指南》),约翰韦利森出版社(John Wiley&Sons),纽约(1989);以及 Kriegler, Gene Transfer and Express1n:A Laboratory Manual (〈〈基因转移和表达:实验室手册》)(1990),其通过引用全文纳入本文。

[0136] 通常优选在植物基因组中的非特异性位点引入功能性重组DNA。在具体情况下,可以采用通过位点特异性整合插入重组DNA构建。已知在植物中有功能的数种位点特异性重组系统包括例如美国专利号4,959,317公开的cre-lox和美国专利号5,527,695公开的FLP-FRT,这两篇文献的内容均通过引用全文纳入本文。

[0137] 本发明还提供了包含本发明的载体(包括表达盒)和/或多核苷酸的宿主细胞。包含本发明的多核苷酸的宿主细胞包括但不限于细菌(如大肠杆菌)、真菌、昆虫、植物和动物细胞。可将本发明的多核苷酸整合至宿主细胞基因组中或使其存在于宿主染色体外(如带有一个复制起始点的自主复制质粒)。根据一些实施方式,本发明的多核苷酸序列与一个启动子可操作地连接。

[0138] 用于宿主细胞转化并适用于本发明的适当方法被认为包括本领域已知的、能够将DNA(瞬时或稳定地)导入细胞中的几乎任意方法。例如,可将本发明的多核苷酸常规地转化至细菌宿主细胞中,如通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或电穿孔的方式转化至大肠杆菌和其他宿主中(Davis等,Basic Methods in Molecular B1logy (《分子生物学的基础方法》)(1986))。

[0139] 或者,可使用其他技术(如使用CaCl2沉淀、聚乙烯醇或聚-L-鸟氨酸将DNA直接摄入原生质体)将本发明的多核苷酸转化至宿主细胞中,(参见例如Hain等,Mol.Gen.Genet.199:161(1985);和 Draper 等,Plant Cell Phys1l.23:451 (1982))。

[0140] 在其他实施方式中,使用了本领域中已知的一项技术将本发明的多核苷酸转化至宿主细胞中。转化宿主细胞的示例性技术包括原生质体转化(参见例如美国专利号 5,508,184)、微注射(Crossway 等,B1techniques 4:320-334(1986);和美国专利号 6,300,543)、电穿孔 (Riggs 等,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 83:5602-5606(1986),Fromm 等,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 82:5824-5828 (1985))、直接基因转移(Paszkowski等,EMBO J.3:2717-2722(1984))、超声法(Bao 等,Ultrasound in Medicine&B1logy23:953-959 (1997) ;Finer 等,Lett.Appl.Microb1l.30: 406-10 (2000) ; Amo ah 等,J.Exp.Bot.52:1135-42(2001));聚乙二醇法(Krens 等,Nature 296:72-77(1982));脱水/抑制介导的DNA摄取(Potrykus等,Molec.Genet.199:183 (1985))、电穿孔(美国专利号5,384,253)、碳化硅纤维搅拌(美国专利号5,302,523和5,464,765)、农杆菌介导的转化(美国专利号 5,563,055 ;5,591,616 ;5,693,512 ;5,824,877 ;5,981,840 ;6,384,301)以及 DNA 包被的微粒轰击(美国专利号 6, 399,861 ;6,160, 208 ;6,403,865 ;5,015,580 ;5,550, 318 ;5,538,880 ;4,945,050 ;国际申请公开号 TO 91/10725 ;以及McCabe 等,B1technology 6:923-926 (1988)), Sanford, Phys1l.Plant 79:206 (1990);以及 Klein 等,B1technology 10:268 (1992))、Tomes 等,Plant Cell, Tissue andorgan Culture, Fundamental Methods (《植物细胞、组织和器官培养,基础方法》)中第197-213 页"Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells Via MicroprojectileBombardment〃(通过微粒轰击将DNA直接转移之完整的植物细胞中),0.L.Gamborg和G.C.Phillips主编,斯普林格弗莱格出版社(Springer-Verlag),柏林海德尔堡,纽约,1995 ;Padgette 等,1995)。

[0141] 对于多细胞物种,可使用本领域已知的技术使转基因细胞重生为转基因生物,所述技术描述于 Christou 等,Plant Phys1l.87:671-674 (1988)(大豆);Datta等,B1technology 8: 736-740 (1990)(水稻);Klein 等,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:4305-4309 (1988)(玉米);Klein 等,B1technology 6:559-563 (1988)(玉米);国际申请公开号 W091/10725 (玉米);Klein 等,Plant Phys1l.91:440-444 (1988)(玉米);和 Gordon-K amm 等,Plant Cell 2:603-618 (1990)(玉米)。

[0142] 一般可使用通常用于向细胞直接传递的一种或多种技术将本发明的多核苷酸(瞬时或稳定地)导入植物中。这类方法会根据植物类型(如单子叶或双子叶)和进行基因修饰的植物部分的不同而有所变化。多种使用重组DNA形成植物细胞核的方法是已知的且可根据本发明使用。两种通常使用的植物转化方法为农杆菌介导的转化和微粒轰击。示例性微粒轰击法公开于美国专利号5,015,580 (大豆);5,550,318 (玉米);5,538,880 (玉米);5,914,451 (大豆);6,160,208 (玉米);6,399,861 (玉米)和 6,153,812 (小麦)。示例性农杆菌介导的转化法描述于美国专利号5,159,135(棉花);5,824,877 (大豆);5,591,616 (玉米);和 6,384,301 (大豆),以及 Horsch 等,Science 227:1229-31 (1985),上述文献的内容均通过引用全文纳入本文。在其他实施方式中,农杆菌介导的转化是根据Hofgen等,Nucleic Acid Research 16:9977 (1998)中公开的方法或使用浸溃法(浸花法)(如Clough等,Plant J.16:735-743(1998)中所描述的)进行的,上述文献的内容均通过引用全文纳入本文。

[0143] 本发明的多核苷酸的植物细胞接收者包括但不限于植物细胞培养液、分生组织细胞、愈伤组织、不成熟的胚胎和花粉和卵细胞。根据一些实施方式,宿主植物细胞是双子叶植物细胞。根据其他实施方式,宿主植物细胞是单子叶植物细胞。一旦完成转化,植物细胞即可用于再生转基因植物。用于制备转基因植物的示例性转化试剂和方法描述于例如美国专利号 6,194,636,6, 232,526 和 4,658,082 以及 Shahin, Theor.Appl.Genet.69:235-40(1985);上述文献的内容均通过引用全文纳入本文。

[0144] 本发明包括含有本发明的多核苷酸或多肽的转基因植物种子、花粉和植物部分。在一些实施方式中,本发明的多核苷酸整合至转基因植物DNA中。在特定实施方式中,本发明的多核苷酸稳定整合至宿主基因组DNA中。在其他实施方式中,本发明的多核苷酸在植物宿主细胞中存在于染色体外(例如带有一个转录起始点的自主复制质粒)。根据一些实施方式,本发明的多核苷酸与一个启动子可操作地连接。在其他实施方式中,转基因植物、植物细胞、种子、花粉或植物部分中的至少一个细胞表达或能够表达本发明的多肽。而在另一个实施方式中,转基因植物、植物细胞、种子、花粉或植物部分中的至少一个细胞表达或能够表达本发明的一种蛋白,所述蛋白能够在体外结合宿主细胞的内源性非编码DNA序列。

[0145] 可以根据本发明的方法使用并生成的“宿主”植物、植物细胞、种子、花粉和植物部分(以及其有性或无性生殖后代)包括本发明的多核苷酸所能(瞬时或稳定地)导入的几乎任何植物物种。本发明的宿主植物和宿主植物细胞包括作物植物或用于生产食物或饲料的植物。根据一些实施方式,宿主植物、植物细胞、种子、花粉和植物部分是单子叶植物。在一些实施方式中,宿主植物、植物细胞、种子、花粉、植物部分或其转基因产品是大豆(Glycine max)。在一些实施方式中,宿主植物、植物细胞、种子、花粉、植物部分或其转基因产品是小麦(Triticum aestivum)。在其他实施方式中,宿主植物、植物细胞、种子、花粉、植物部分或其转基因产品是玉米(Zea mays)。在其他实施方式中,宿主植物、植物细胞、种子、花粉、植物部分或其转基因产品是水稻(Oryza sativa)。在其他实施方式中,宿主植物、植物细胞、种子、花粉、植物部分或其转基因产品是棉花(Gossypium barbadense, Gossypiumhirsutum)。在其他实施方式中,宿主植物、植物细胞、种子、花粉、植物部分或其转基因产品是甘鹿(Saccharum spp.)。在其他实施方式中,宿主植物、植物细胞、种子、花粉、植物部分或其转基因产品是拟南芥(如Arabidopsis thaliana)。

[0146] 根据其他实施方式,宿主植物、植物细胞、种子、花粉、植物部分或其转基因产品选自以下组:苜猜(Medicago sativa)、油菜(如 B.napus、B.rapa、B.juncea):尤其是用作籽油来源的油菜品种(包括芸苔)、向日葵(Helianthus annuus)、红花(Carthamustinctorius)、花生(Arachis hypogaea)、高梁(Sorghum bicolor, Sorghum vulgare)、燕麦、黑麦(Secale cereale)、粟(如珍珠粟(Pennisetum glaucum)、黍(Panicummiliaceum)、小米(Setaria italica)、龙爪稷(Eleusine coracana)、烟草(Nicotianatabacum)、大麦(Hordeum)、燕麦(Avena sativa)、番煎(Lycopersicon esculentum)、南瓜、瓜(如甜瓜(C.melon)和哈密瓜(C.cantalupensis))、甘鹿(Saccharum spp.)、非大豆的豆类作物、以及含淀粉的块莖和块根,如土豆(Solanum tuberosum)、甜土豆(Ipomoeabatatus)、木薯(Manihot esculenta)、芋头、美人蕉和甜菜(Beta vulgaris)。

[0147] 在其他实施方式中,宿主植物、植物细胞、种子、花粉、植物部分或其转基因产品是蔬菜。本发明的蔬菜宿主细胞(植物)包括例如莴苣(如Lactuca sativa)、青豆(Phaseolus vulgaris)、菜豆(Phaseolus Iimensis)、豌豆(Lathyrus spp.)和香瓜属成员(如黄瓜(C.sativus)) ο

[0148] 在其他实施方式中,宿主植物、植物细胞、种子、花粉、植物部分或其转基因产品选自以下组:咖啡(Cofea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、凤梨(Ananas comosus)、柑橘树(Citrus spp.)、可可(Theobroma cacao)、荼(Camellia sinensis)、香蕉(Musa spp.)、avocado (Persea ameericana)、无花果(Ficus casica)、番石槽(Psidium guajava)、芒果(Mangijera indica)、撤揽(Olea europaea)、木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardiumoccidentale)、澳洲坚果(Macadamia integrifolia)和扁桃(Prunus amygdalus)。

[0149] 种子、花粉、组织、细胞和转基因植物后代和本发明的细胞也在本发明的范围内。

[0150] 在一个实施方式中,本发明包括使用一种核酸分子转化的转基因植物,所述核酸分子包含本发明的多核苷酸序列,其中多核苷酸序列表达以在植物中生成重组蛋白,且在相同条件下,重组蛋白使得植物的产量高于该植物的野生型品种。根据一些实施方式,所述植物是单子叶植物。在另一个实施方式中,所述植物是玉米。在另一个实施方式中,所述植物是小麦。在另一个实施方式中,所述植物是水稻。根据其他实施方式,所述转基因植物是双子叶植物。在一个实施方式中,所述转基因植物是大豆。在另一个实施方式中,所述转基因植物是拟南芥。

[0151] 在另一个实施方式中,本发明包括使用一种核酸分子转化的转基因植物种子,所述核酸分子包含本发明的多核苷酸序列,其中多核苷酸序列表达以在植物种子中生成重组蛋白,且在相同条件下,所述重组蛋白使得植物对干旱的抗性强于该植物的野生型品种。根据一些实施方式,所述转基因植物种子是单子叶植物。在一个实施方式中,所述转基因植物种子是玉米。在一个实施方式中,所述转基因植物种子是小麦。在另一个实施方式中,所述转基因植物种子是水稻。根据其他实施方式,所述转基因植物种子是双子叶植物。在一个实施方式中,所述转基因植物种子是大豆。在另一个实施方式中,所述转基因植物种子是拟南芥。

[0152] 在另一个实施方式中,本发明包括一种生产高产转基因宿主的方法,所述方法包括(a)使用包含本发明的多核苷酸序列的核酸分子稳定地转化植物细胞,其中所述核酸分子能够在植物细胞中表达,以及(b)将所述细胞再生为植物。根据一个实施方式,所述植物细胞是单子叶植物。在另一个实施方式中,所述植物细胞是玉米。在一个实施方式中,植物细胞是小麦。在另一个实施方式中,所述植物细胞是水稻。根据其他实施方式,所述植物细胞是双子叶植物。在一个实施方式中,所述植物细胞是大豆。在另一个实施方式中,所述植物细胞是拟南芥。

[0153] 从转基因细胞再生植物和植物组织的方法和试剂是本领域已知的,且根据植物物种的不同而有所变化。通常,细胞生长形成愈伤组织,从愈伤中诱导形成芽组织,随后生根。或者,可在愈伤组织中诱导形成胚胎。这些胚胎像天然胚胎一样萌发,形成植物。培养基通常含有足够的维持细胞生长和分裂的组分,且包括例如氨基酸和激素(如生长素和细胞因子)以维持生长并诱导细胞分化。

[0154] 预测在本发明的多核苷酸稳定整合至宿主基因组DNA中后,可以通过有性杂交的方式将该多核苷酸转移至其他植物。可使用任意数量的标准育种技术,这取决于待杂交物种。一旦形成这种类型的转基因植物,即可根据常规方法种植植物,使得核酸构建存在于所得到的植物中。或者,可从转基因植物中回收转基因种子或繁殖体(如切割)。随后可将这些种子种植在土壤中并使用常规方法培养以形成转基因植物。

[0155] 在一些实施方式中,本发明提供了种植转基因植物的方法,该方法包括(a)种植包括本发明的核酸、载体和/或表达盒的转基因种子和(b)从该转基因种子生长转基因植物。在一些实施方式中,该方法还包括收获转基因植物的步骤。在另外的实施方式中,该方法还包括再植来自转基因植物的种子的步骤。在一些实施方式中,所述转基因植物是单子叶植物。在另外的实施方式中,所述转基因植物是玉米。在其他实施方式中,所述转基因植物是小麦。在一些实施方式中,所述转基因植物是水稻。在其他实施方式中,所述转基因植物是双子叶植物。在一些实施方式中,所述转基因植物是大豆。

[0156] 使用农杆菌转化法形成的转基因植物通常包含单个简单的重组DNA序列,其插入染色质中,被称为一次转基因事件。可将这类转基因植物称作所插入外源性序列的杂合子。通过使含有单个外源性基因序列的独立隔离的转基因植物(例如H)代植物)同自身进行有性交配(“自交”)生成Fl代种子,即可获得关于一种转基因的转基因植物纯合子。所生成的Fl代种子中的四分之一是关于该种转基因的纯合子。萌发Fl代种子能够形成用于测试杂合性的植物,通常使用能够区分杂合子和纯合子的SNP测定或热扩增测定(即接合性测定)。将一株杂合子植物与自身或另一株杂合子植物杂交会产生杂合子后代,以及纯合转基因后代和纯合的空白后代。

[0157] 除了使用本发明的多核苷酸直接转化植物外,还可通过将带有本发明的多核苷酸的第一株植物与不含本发明的多核苷酸的第二株植物杂交以制备转基因植物。例如,可以将本发明的多核苷酸稳定地导入可进行转化的第一植物系中(即整合至基因组DNA)以生成转基因植物,将其与第二植物系杂交以使本发明的多核苷酸渐渗入第二植物系中。

[0158] 还提供了使用本发明的多核苷酸生成有增强性状植物的方法,所述方法包括以下步骤:将本发明的多核苷酸导入宿主植物细胞中,选择存在多核苷酸分子的细胞以生成转基因植物细胞,并由转基因植物细胞再生形成转基因植物,此时相比于可比较的野生型植物或转基因HaHB4植物,转基因植物拥有增强性状,其中HaHB4处于同一启动子的控制下。可根据本发明的方法选择转基因植物的增强性状,包括但不限于增强的用水效率(如“干旱耐受性”)、增强的盐耐受性、增强的渗透压耐受性、提高的产量及其组合。

[0159] 植物、种子和植物部分产品

[0160] 在其他实施方式中,本发明涉及生产植物商品和用于从本文所描述的植物或植物部分中生产植物商品的方法。含有本发明的多核苷酸或多肽序列的商品以及由含有本发明的多核苷酸序列的转基因植物或种子生产的商品被特别考虑作为本发明的实施方式。含有本发明的多核苷酸或多肽序列的商品包括但不限于谷物、油、压碎或完整的植物谷粒或种子、或者任何包含任何谷物、油或者压碎或完整的含有一种或多种本发明的序列的重组植物谷粒或种子。因此,根据一个实施方式,本发明包括含有可检测量的本发明的多核苷酸或多肽的加工后植物产品,其中所述植物产品包含来自植物的至少一个部分的饲料、谷物、面粉、提取物或匀浆。在另一个实施方式,本发明包括含有可检测量的本发明的多核苷酸或多肽的加工后植物产品,其中所述植物产品包含从种子中获得的饲料、谷物、面粉、提取物或匀浆。可使用本领域已知的技术和试剂检测加工后产品中所含的本发明的多核苷酸和多妝,包括例如 PCR 和 Northern、Southern 和 Western 分析。

[0161] 基因叠加

[0162] 本发明还包括含有一个或多个转基因事件的种子和植物。本发明还预期可将本发明的多核苷酸和多肽与其他转基因“事件”联合使用以生产带有多种所需性状或进一步强化性状的植物。这些“叠加”的转基因事件可以是涉及同一目标生物或性状的事件,或者涉及不同目标病原体、昆虫或性状的事件。此外,可使用任意方法生产叠加事件,包括但不限于转基因植物的杂交育种或多重遗传转化。

[0163] 在一些实施方式中,本发明的转基因种子或植物额外地带有提供除草剂耐受性的叠加转基因事件。重组表达提供耐受性的除草剂的示例包括但不限于麦草畏、草丁膦铵和草甘膦和N-(膦酰基甲基)甘氨酸(包括其异丙胺盐形式)。

[0164] 在其他实施方式中,本发明的转基因种子或植物额外地带有提供昆虫抗性的叠加转基因事件。重组表达提供了昆虫抗性的基因示例包括但不限于苏云金芽孢杆菌Cry变体(如 Cry 1A> CryIAc> Cry2A> CrylF-lAc、Cry3A> Cry3Bb> Cry35Abl)和 / 或 Cyt 基因家族。

[0165] 在其他实施方式中,本发明的转基因种子或植物额外地带有提供真菌疾病、病毒疾病或细菌疾病或侵扰(如线虫侵扰)抗性的叠加转基因事件。

[0166] 在其他实施方式中,本发明的转基因种子或植物额外地带有提供环境胁迫抗性的叠加转基因事件,所述环境胁迫选自以下组:干旱条件、盐条件、渗透压胁迫、低温暴露、热暴露、氮养分可用性减少、磷养分可用性减少和高植物密度。

[0167] 在其他实施方式中,本发明的转基因种子或植物额外地带有使得氮使用效率或产量提闻的置加转基因事件。

实施例

[0168] 在以下实施例中进一步解释本发明。应理解以下这些实施例仅以说明的方式提供。通过以上讨论和以下实施例,本领域技术人员可以确知本发明的主要特征,可以在不背离本发明精神和范围的情况下,对本发明进行各种改变和改良以使其适于各种应用和条件。

[0169] 实施例1

[0170] 经修饰的HaHB4.2表达构建的生成和鉴定

[0171] 将克隆至pBlueScript SK-载体(司查塔基公司(Stratagene),瑞典乌普萨拉)BamHl/Sacl位点编码全长HaHB4 (SEQ ID NO:1)的cDNA的开放阅读框用作一系列PCR反应的模板以生成经修饰的HaHB4。第一步中,使用H4m-F正向引物(-ATGTCTCTTCAACAAGTAACAACCACCAGG-3’ ;SEQ ID NO:22)和 Transf2 反向引物(5,-GCCGAGCTCTTAGAACTCCCACCACTTTTG-3’ ;SEQ ID NO: 23)进行PCR反应生成第一个扩增后PCR产物。为这一轮扩增所设计的引物扩增得到了含有新引入的转录起始位点为转录终止位点的产物。将该第一次PCR扩增产物克隆至-T-Easy载体(普洛麦格生物技术公司(Promega B1tec),威斯康星州麦迪逊)中并命名为“pTHaHB4.2a”。

[0172] 继而使用pTHaHB4.2a作物模板使用H4m_F正向引物(5,-ATGTCTCTTCAACAAGTAACAACC ACCAGG-3’ ;SEQ ID NO:22)和命名为 H4m_R 的反向引物(5-TTAGAACTCCC ACCACTTTTGAAGGTCTGG-3’ ;SEQ ID NO:24)进行第二次 PCR 扩增反应以生成第二次PCR扩增产物,随后将其克隆至pGEM® -T-Easy载体中并命名为pTHaHB4.2b。

[0173] 在第三次PCR扩增反应中,使用pTHaHB4.2b作物PCR反应的模板并使用两组引物,一组引物对应于 Transf-1 正向引物(5,-GCGGGATCCACCATGTCTCTTCAACAAGTA-3’ ;SEQID NO: 26)和命名为 H4m-Rl 的反向引物(5,-GTTTCCTTCTTCAAGGTACGCAAAAC CGTCGC-3’ ;SEQ ID NO: 27),而第二组引物由 H4m_Fl 正向引物(5’ -CGGTTTTGCGTACCTTGAAGAAGGAAACAGTTTG-3’ ;SEQ ID NO:25)和反向引物 Transf-2(5,-GCCGAGCTCTTAGAACTCCAACCACTTTTG-3’ ;SEQ ID NO:23)组成。随后使用常规重组技术将这两组引物的扩增产物融合为毗连的嵌合多核苷酸序列。参见例如 Silver J、Limjoco T、Feinstone S (1995) Site-specificmutagenesis using the polymerase chain react1n(〈<使用聚合酶链式反应进行位点特异性突变》)。于:Innis MA、Gelfand DH> Sninsky JJ 主编,PCR Strategies (《PCR 策略》),学术出版社有限公司(Academic Press Inc),圣地亚哥,179-188页。简单地说,该策略包括对两种PCR产物进行变性,随后混合并杂交的步骤。使用Klenow酶延伸杂交产物,随后使用嵌合多核苷酸序列作物模板,使用Transf-1正向引物(SEQ ID NO:26)和Transf-2反向引物(SEQ ID NO:23)进一步进行PCR反应。随后将该反应扩增后的PCR产物克隆至pGEM® -T-Easy 载体中并命名为 pTHaHB4.2c。

[0174] 在PTHaHB4.2c表达构建形成过程的各个步骤对扩增产物进行了序列分析,通过与SEQ ID NO:1的HaHB4多核苷酸序列比较,揭示了以下特点:(a)扩增后PCR产物编码了一个多肽,其在氨基末端区域有四个氨基酸缺失(SEQ ID NO:2的氨基酸残基7-10) ; (b)第二次扩增后的PCR产物在编码推定的HaHB4激活结构域的区域含有一个P175L突变,且在5’ UTR处有四个核苷酸的缺失;(c)第三次PCR反应的产物在HaHB4的羧基端部分的区域含有一个L159F突变;以及(d)上述最后一次PCR反应扩增后的产物包含一个保守的R22K突变。

[0175] 随后在PCR反应中进一步扩增pTHaHB4.2c中的插入以引入保守的氨基酸变化K22R。对扩增后pTHaHB4.2c中的插入所对应的序列进行测序并确定其对应多核苷酸SEQ ID NO:3且编码图1A-B所示多肽序列(SEQ ID NO:4) „图1A-B的序列比对显示了HaHB4 (SEQ ID NO: 2) ,HaHB4.2c (modlHaHB4 (SEQ ID NO: 4))和另一个经修饰的 HaHB4 转录因子(mod2HaHB4 (SEQ ID NO:8))之间的序列差异。

[0176] HaHB4.2 表汰构律

[0177] 将上文中所生成的pTHaHB4.2c(HaHB4.2)多核苷酸序列以可操作地连接的方式克隆至玉米、大豆和小麦的载体中以生成图2A-2J所系统性描述的大豆(图2A-2C)、小麦(图2D-2G)和玉米(图2H-2J)表达构建。图2A-2J所描述的每个表达构建均包含一条HaHB4.2序列,其编码177个氨基酸的全长modlHaHB4(即HaHB4.2(SEQ ID NO:4)) ^白,且与(a) —个组成型启动子(如35S CaMV启动子(pZmHaHB4.2、pGmHaHB4.2)或Ubi启动子(PTaHaHB4.2))或者(b) —个诱导型启动子(由经修饰的HaHB4启动子与拟南芥Cox5c-2 基因(LPF-Cox)的第一个内含子融合形成)(pZmPrInHBH4.2、pGmPrInHB4.2、andPTaPrInHB4.2)可操作地连接。图2A-2J所描述的每个表达构建还包含位于HaHB4.2 cDNA下游的一个选择性标记和一个nos终止子。

[0178] 实施例2

[0179] 经修饰的HaHB4转基因植物的生产

[0180] 大豆modlHaHB4转基因事件的牛.成和选择

[0181] 使用农杆菌介导法和Williams 82栽培种生产modlHaHB4大豆转基因事件并。使用反映一种组成型策略和两种诱导型策略的三种不同表达盒获得35个独立事件的Tl代种子。组成型事件中,modlHaHB4 cDNA编码序列的表达受35S CaMV启动子驱动。诱导型事件中,modlHaHB4 cDNA编码序列的表达是由天然HaHB4启动子长等位基因或含有相同HaHB4启动子长等位基因和AtC0X5c2内含子的嵌合多核苷酸序列驱动。

[0182] 转化后细胞的首次增殖在温室中进行,期间通过PCR对来源于每个事件的10个Tl代个体进行分离测试。将来源于所选事件的个体自交的植物系(Tl代3:1分离)播种并对植物进行取样,由PCR分析确定纯合系,表明所取样的后代中不含阴性分离子(每个植物系取至少5个个体)。筛选期间鉴定到的一些阴性分离子被保持作为对照“空白系”。

[0183] 在温室中进行单拷贝纯合子和空白系的种子扩增(T3代种子),期间使用所选modlHaHB4纯合系的种子确定乙烯不敏感性并对所选植物系中Hahb4和下游基因(L0X2和CSD-1)的表达水平进行定量。还在实验室条件下评价所选modlHaHB4纯合系对于干旱胁迫的耐受能力。鉴定了 22株单拷贝modlHaHB4纯合细胞系用于后续研究。

[0184] 经修饰HaHB-4转某闵大豆的田间试骀

[0185] 在阿根廷圣路易斯省Libor1 Luna地区(33° 35’15”S,65° 38’09”W),在田间条件下对大豆转基因(modlHaHB4(SEQ ID NO:4))和对照系进行了评价。土壤为砂壤土,pH

5.99且有机物含量为1.41%。年平均降雨量为800mm。

[0186] 以每平方米28株植物的比率共种植了 15株转基因系、7株阴性分离(空白)系和野生型(Williams 82)。实验设计为完全随机区组、分区并进行3个重复,主区为灌溉而子区为大豆系。使用了两种灌溉水平(低水平和高水平)。对于低水平灌溉方式,在植物繁殖阶段Rl至R6期间暂停供水。因此,该方式仅由两次水应用组成,一次在生长季节开始时,另一次在生长季节结束时。如表1所示,高水平灌溉方式由每月一次的水应用组成。

[0187] 分区长5m,共4排,间隔0.7m。根据当地实践使用杀虫剂和肥料。田间数据采集自每个分区的中间两排。手工收割植物并使用地面固定装置进行打谷。记录了种子重量和湿度。每个重复的产量列于表2。

[0188] 表1:田间试验生长季节期间的灌溉方式和降雨量

[0189]

Figure CN104080913AD00401

[0190] 使用GLM法(SAS软件)按分区对田间数据进行分析,该方法能够分析带缺失值的数据组之间的差异。显著性差异的标准是α水平为0.05。处理(高水平和低水平灌溉)是主区而大豆系是子区。田间数据见表2。

[0191] 存在显著的处理(P = 0.0079)和种系(ρ〈0.0001)主效应。与高水平灌溉方式相t匕,低水平灌溉方式导致田间产量下降35% (从2900 Kg ha4下降至1897 Kg ha’。由于并非所有纯合系都有相对应的空白对照,所以在构建内部或之间进行了纯合系和空白系间的比较。构建内部或之间以及同一系内的modlHaHB4纯合系的产量高于空白系,a3H系是个例外。该纯合系的产量低于6种空白系(a7N、a9N、blN、b8N、blON、c4N)。对于同一系内的诱导型转基因事件,转基因系和空白系之间不存在显著的产量差异。然而,组成型modlHaHB4转基因事件a7H和a9H的产量分别高于其空白对照,在高水平和低水平灌溉方式下均是如此。空白事件a9N、a7N和纯合(a3H)系的产量显著低于Williams 82。

[0192] 表2:低水平和高水平灌溉生长条件下所测试的组成型modlHaHB4转基因大豆系的产量(kg.ha—1)数据。(嫩=无)。

[0193]

Figure CN104080913AD00411

[0194] 图3A-3D中的柱状图显示了高产环境中在经灌溉的田野条件下(不限制供水,处于非水胁迫条件下)转基因作物产量的提高。图3A-3B中的柱状图描述了与野生型对照玉米(WT)的产量相比,两种纯合转基因玉米系(在35S组成型启动子控制下表达HaHB4.2(SEQ ID NO: 4))产量的提高。数据采集自两个不同土壤类型地区的平行试验点:种植期间接收626mm降雨量的砂壤土(图3A)和作物周期内接收545mm降雨量的排水良好的砂壤土(图3B)。图3C中的柱状图描述了与野生型对照小麦(WT)的产量相比,一种纯合转基因小麦系(在35S组成型启动子控制下表达HaHB4.2(SEQ ID NO:4))产量的提高。图3C中的数据获得自排水良好的砂壤土地区(pH 7.14%, OM 1.57%)的平行试验点。使用补充灌溉以在作物周期内提供755mm的水。图3D中的柱状图描述了与野生型对照大豆(WT)的产量相比,两种纯合转基因大豆系(在35S组成型启动子控制下表达HaHB4.2(SEQ IDN0:4))产量的提高。图3D中的数据获得自排水良好的砂壤土地区(pH 5.99%, OM 1.41%)的平行试验点。使用补充灌溉以在作物周期内提供579mm的水。

[0195] 鉴定来自玉米系和大豆系转基因的方法

[0196] 首先使用本领域已知的方法和材料进行Northern分析以确定转基因玉米系和大豆系中HaHB4的表达。随后使用本文一般描述的普通PCR方法和材料对纯合HaHB4所转化的植物系相应的转基因编码序列进行扩增。使用本领域已知的方法制备玉米和大豆转基因基因组DNA,并用作PCR反应的模板。使用35S PrimF正向引物(5,-TGACGCACAATCCCACTATC-3’(SEQ ID NO:34))和 N0S121R 反向引物(5-GAATTCCCGATCTAGTAACA TA-3’ (SEQ ID NO:35))扩增组成型(35S CaMV 启动子)表达盒相应的转基因。使用 TRANSFlXba 正向引物(5’-ATGTCTCTTCAACAAGTACCCAC-3’ (SEQ IDN0:32))、N0S121R 反向引物(5’-GAATTCCCGATCTAGTAACATA-3’ (SEQ ID N0:33)),并以玉米或大豆转基因基因组DNA作为模板,在PCR反应中扩增诱导型(TRANSFlXba启动子)表达盒相应的转基因。

[0197] 对扩增后HaHB4多核苷酸进行的序列分析鉴定了扩增后序列和天然HaHB4(SEQID NO:1)序列之间的多重差异。图1显示了该分析所鉴定到的天然HaHB4和modlHaHB4 (HaHB4.2 (SEQ ID NO:4))及 mod2HaHB4 (HaHB4.3 (SEQ ID NO:8))所编码序列之间的序列比对。

[0198] 实施例3

[0199] 酵母中经修饰HaHB4的反式激活

[0200]将编码经修饰 HaHB4 蛋白(HaHB4.2 (modlHaHB4)、HaHB4.3 (mod3HaHB4)或HaHB4.4 (mod4HaHB4))的多核苷酸克隆至pGBKT7载体中并与载体中的GAL4DNA结合结构域操作性连接,在酵母单杂交试验中测定转化有所得表达构建的酵母以确定所编码的经修饰HaHB4的反式激活。通过使用ONPG作物底物测定含经修饰HaHB4蛋白(和对照HaHB4蛋白)的酵母的β -半乳糖苷酶活性,可确定经修饰HaHB4 (和对照HaHB4蛋白)是否存在反式激活。图4的柱状图显示了在酵母单杂交试验系统中所有经修饰HaHB4蛋白均可作为激活因子。

[0201] 相似地,为确定经修饰HaHB4蛋白形成异源二聚体的能力,进行了酵母双杂交试验。将HaHB4.2 cDNA克隆至pGAD载体中并与酵母转录因子GAL4的激活结构域融合。随后将所得表达构建转化至酿酒酵母AH109株中,使用表达经修饰蛋白和四种已克隆至pGBK7载体并与其上GAL4结合结构域融合的拟南芥HD-Zip蛋白(C端缺失)进行酵母双杂交试验。通过(-HIS) SD培养基中的营养缺陷评价推定的相互作用。结果显示HaHB4.2可作为转录因子且能与AtHBl、AtHB7和AtHB12相互作用。(数据未显示)

[0202] 这些结果表明与内源性蛋白之间的相互作用可能是modlHaHB4(HaHB4.2)发挥其功能的部分机制。

[0203] 实施例4

[0204] 转基因拟南芥植物的形态和光合作用速率

[0205] 通过花序浸溃(floral dip)技术将35S::H4.2 (包括与35S组成型启动子可操作地连接的modlHaHB4(SEQ ID N0:4)的表达构建)转化至拟南芥植物以生产转基因拟南芥植物。每盆种植三株植物,进行叶片CO2气体交换测定。将每株取样的植物的一片离体叶片置于Licor 6400 XT光合作用系统的叶片样品池中。通过Licor 6400LED光源照射叶片,形成约1000 μ mol m_2 s—1的光合作用光子通量密度。

[0206] 在叶0)2摄取稳定时测量光合作用速率(μπιοί m_2 s—1),同时Licor 6400系统调节进入叶片样品池中的空气以维持温度为约24°C且CO2浓度为约500 μ mol mol'图5的柱状图显示了两个独立实验中表达空载体(pBI121)的转基因植物和表达modlHaHB4(HaHB4.2第30系)的转基因植物光合作用速率。可观察到表达modlHaHB4的转基因植物的光合作用速率显著高于表达空载体的对照植物。这一增高可能导致转化了经修饰modlHaHB4的作物的产量提高。

[0207] 本申请要求2012年2月21日提交的美国临时申请号61/601,335的优先权,其通过引用全文纳入本文。此外,本文中引用的所有出版物均通过引用全文纳入本文。

[0208] 以上具体实施方式的描述完全揭示了本发明的一般性质,通过应用本领域技术范围内的知识,他人无需过多实验即能很容易地在不背离本发明总体理念的前提下就各种应用改良和/或修改这些具体实施方式。因此,基于本文所列出的教导和指南,应理解为这些修改和改良落入所公开实施方式的等同形式的含义和范围内。应当理解本文中的措词和术语仅仅是描述性的而非限制性的,从而本说明书中的术语或措词可由本领域技术人员根据所述教导和指南解读。

Claims (134)

1.一种分离的核酸分子,包含编码modHaHB4(SEQ ID NO:4)的多核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的分离的核酸分子,其编码一种能够在体外结合DNA的多肽。
3.如权利要求1所述的分离的核酸分子,其提高转化了所述核酸分子的植物的产量。
4.如权利要求1所述的核酸分子,其与启动子可操作地连接。
5.如权利要求4所述的核酸分子,其与组成型启动子可操作地连接。
6.如权利要求5所述的核酸分子,所述启动子是35SCaMV启动子。
7.如权利要求5所述的核酸分子,所述启动子是35SCaMV启动子或Ubl启动子。
8.如权利要求4所述的核酸分子,其与诱导型启动子可操作地连接。
9.如权利要求8所述的核酸分子,所述启动子包含HaHB4启动子中的至少200个核苷酸。
10.如权利要求9所述的核酸分子,所述启动子与拟南芥Cox5c2的第一个内含子融合。
11.一种载体,包含权利要求1所述的核酸分子。
12.如权利要求11所述的载体,其还包含与所述核酸分子可操作地连接的启动子。
13.如权利要求12所述的载体,所述载体表达一种能够在体外结合DNA的重组多肽。
14.一种宿主细胞,包含权利要求1所述的核酸分子。
15.—种宿主细胞,包含权利要求11所述的载体。
16.—种宿主细胞,包含权利要求13所述的载体。
17.如权利要求14所述的宿主细胞,所述核酸分子整合至所述宿主细胞的DNA中。
18.如权利要求14所述的宿主细胞,所述宿主细胞是细菌、真菌、昆虫、植物或动物细胞。
19.如权利要求16所述的宿主细胞,所述宿主细胞是细菌、真菌、昆虫、植物或动物细胞。
20.如权利要求14所述的宿主细胞,所述宿主细胞是植物细胞。
21.如权利要求20所述的植物细胞,所述植物细胞是单子叶植物细胞。
22.如权利要求21所述的植物细胞,所述植物细胞是玉米细胞。
23.如权利要求21所述的植物细胞,所述植物细胞是小麦细胞。
24.如权利要求21所述的植物细胞,所述植物细胞是水稻细胞。
25.如权利要求20所述的植物细胞,所述植物细胞是双子叶植物细胞。
26.如权利要求25所述的植物细胞,所述植物细胞是大豆细胞。
27.如权利要求24所述的宿主植物细胞,所述核酸分子整合至所述植物细胞的DNA中。
28.一种组织培养物,包含权利要求20所述宿主植物细胞。
29.如权利要求20所述的宿主植物细胞,所述多核苷酸序列与启动子可操作地连接。
30.如权利要求29所述的宿主植物细胞,其表达一种重组蛋白。
31.如权利要求30所述的宿主植物细胞,所述重组蛋白能够在体外结合DNA。
32.—种转基因植物种子、花粉或植物部分,包含权利要求1所述的多核苷酸序列。
33.如权利要求32所述的转基因植物种子、花粉或植物部分,所述植物为单子叶植物。
34.如权利要求33所述的转基因植物种子、花粉或植物部分,所述植物为玉米。
35.如权利要求33所述的转基因植物种子、花粉或植物部分,所述植物为小麦。
36.如权利要求33所述的转基因植物种子、花粉或植物部分,所述植物为水稻。
37.如权利要求32所述的转基因植物种子、花粉或植物部分,所述植物为双子叶植物。
38.如权利要求37所述的转基因植物种子、花粉或植物部分,所述植物为大豆。
39.如权利要求32所述的转基因植物种子、花粉或植物部分,所述核酸分子整合至所述转基因植物细胞DNA中。
40.如权利要求32所述的转基因植物种子、花粉或植物部分,所述多核苷酸序列与启动子可操作地连接。
41.如权利要求32所述的转基因植物种子、花粉或植物部分,其表达一种重组蛋白。
42.如权利要求41所述的转基因植物种子、花粉或植物部分,其表达一种能够在体外结合DNA的重组蛋白。
43.如权利要求32所述的转基因植物种子、花粉或植物部分,其含有基因叠加。
44.一种转基因植物细胞,其稳定地转化有包含权利要求1所述多核苷酸序列的核酸分子,所述多核苷酸序列在所述植物细胞中表达以生产一种重组蛋白,所述重组蛋白能够在体外结合DNA。
45.如权利要求44所述的转基因植物细胞,所述转基因植物是单子叶植物。
46.如权利要求45所述的转基因植物细胞,所述转基因植物是玉米。
47.如权利要求45所述的转基因植物细胞,所述转基因植物是小麦。
48.如权利要求45所述的转基因植物细胞,所述转基因植物是水稻。
49.如权利要求44所述的转基因植物细胞,所述转基因植物是双子叶植物。
50.如权利要求49所述的转基因植物细胞,所述转基因植物是大豆。
51.如权利要求32所述的转基因植物细胞,其含有基因叠加。
52.一种转基因植物种子、花粉或植物部分,其稳定地转化有包含权利要求1所述多核苷酸序列的核酸分子,所述多核苷酸序列在所述植物种子、花粉或植物部分中表达以生产一种重组蛋白,并且所述重组蛋白能够在体外结合DNA。
53.如权利要求52所述的多核苷酸的转基因植物种子、花粉或植物部分,所述植物为单子叶植物。
54.如权利要求53所述的多核苷酸的转基因植物种子、花粉或植物部分,所述植物为玉米。
55.如权利要求53所述的多核苷酸的转基因植物种子、花粉或植物部分,所述植物为小麦。
56.如权利要求53所述的转基因植物种子、花粉或植物部分,所述植物为水稻。
57.如权利要求52所述的转基因植物种子、花粉或植物部分,所述植物为双子叶植物。
58.如权利要求57所述的转基因植物种子、花粉或植物部分,所述植物为大豆。
59.如权利要求52所述的转基因植物种子、花粉或植物部分,其含有基因叠加。
60.一种转基因植物,其转化有包含权利要求1所述多核苷酸序列的核酸分子,所述多核苷酸序列在所述植物中表达以生产一种重组蛋白,在相同条件下,所述重组蛋白使得所述植物的产量高于该植物的野生型品种。
61.如权利要求60所述的多核苷酸的转基因植物种子、花粉或植物部分,所述植物为单子叶植物。
62.如权利要求61所述的多核苷酸的转基因植物种子、花粉或植物部分,所述植物为玉米。
63.如权利要求61所述的多核苷酸的转基因植物种子、花粉或植物部分,所述植物为小麦。
64.如权利要求61所述的转基因植物种子、花粉或植物部分,所述植物为水稻。
65.如权利要求60所述的转基因植物种子、花粉或植物部分,所述植物为双子叶植物。
66.如权利要求65所述的转基因植物种子、花粉或植物部分,所述植物为大豆。
67.如权利要求60所述的转基因植物种子、花粉或植物部分,其含有基因叠加。
68.一种转基因植物种子,其转化有包含权利要求1所述多核苷酸序列的核酸分子,所述多核苷酸序列在所述植物种子中表达以生产一种重组蛋白,在相同条件下,所述重组蛋白使得所述植物种子对干旱的耐受性高于该植物种子的野生型品种。
69.如权利要求68所述的转基因植物种子,所述植物是单子叶植物。
70.如权利要求69所述的转基因植物种子,所述植物是玉米。
71.如权利要求69所述的转基因植物种子,所述植物是小麦。
72.如权利要求69所述的转基因植物种子,所述植物是水稻。
73.如权利要求68所述的转基因植物种子,所述植物是双子叶植物。
74.如权利要求73所述的转基因植物种子,所述植物是大豆。
75.如权利要求68所述的转基因植物种子,其含有基因叠加。
76.一种转基因植物,其包含多个细胞,所述细胞包含权利要求1所述的多核苷酸序列。
77.如权利要求76所述的转基因植物,所述植物是单子叶植物。
78.如权利要求77所述的转基因植物,所述植物是玉米。
79.如权利要求78所述的转基因植物,所述植物是小麦。
80.如权利要求78所述的转基因植物,所述植物是水稻。
81.如权利要求76所述的转基因植物,所述植物是双子叶植物。
82.如权利要求81所述的转基因植物,所述植物是大豆。
83.如权利要求76所述的转基因植物,所述核酸分子整合至所述植物的DNA中。
84.如权利要求76所述的转基因植物,所述多核苷酸序列与启动子可操作地连接。
85.如权利要求76所述的转基因植物,其表达一种重组蛋白。
86.如权利要求85所述的转基因植物,其表达一种能够在体外结合DNA的重组蛋白。
87.如权利要求76所述的转基因植物,其产量高于所述植物的野生型品种。
88.如权利要求87所述的转基因植物,在非水胁迫条件下其产量高于所述植物的野生型品种。
89.如权利要求87所述的转基因植物,在水胁迫条件下其产量高于所述植物的野生型品种。
90.一种种子或花粉粒,其特征在于是权利要求76所述转基因植物的种子或花粉粒。
91.一种转基因植物,所述转基因植物由权利要求76所述的种子生长而成。
92.一种后代植物,其特征在于是权利要求76所述转基因植物任何世代的后代植物,所述后代植物包含编码modlHaHB4(SEQ ID NO:4)的多核苷酸序列。
93.一种谷粒,其包含权利要求90所述的种子。
94.如权利要求76所述的转基因植物,其含有基因叠加。
95.一种蛋白质,其特征在于是权利要求1所述的核酸分子所编码的蛋白质。
96.一种经加工的植物产品,其包含可检出量的权利要求1所述的多核苷酸。
97.如权利要求96所述的经加工的植物产品,所述产品包含源自植物至少一个部分的饲料、谷物粗粉、面粉、提取物或匀浆。
98.如权利要求96所述的经加工的植物产品,所述产品包含源自植物种子的饲料、谷物粗粉、面粉、提取物或匀浆。
99.一种生产转基因植物细胞的方法,所述转基因植物细胞含有包含编码modlHaHB4(SEQ ID NO:4)的多核苷酸序列的核酸分子。
100.如权利要求99所述的方法,还包括使用Northern、Western、Southern或PCR分析筛选转化的植物细胞以确定所述植物细胞包含所述核酸分子。
101.如权利要求99中所述的方法,还包括在所述植物细胞中表达所述多核苷酸序列。
102.如权利要求99所述的方法,所述多核苷酸序列整合至所述植物细胞的DNA中。
103.如权利要求99所述的方法,所述植物细胞是单子叶植物细胞。
104.如权利要求10 3所述的方法,所述植物细胞是玉米细胞。
105.如权利要求103所述的方法,所述植物细胞是小麦细胞。
106.如权利要求103所述的方法,所述植物细胞是水稻细胞。
107.如权利要求99所述的方法,所述植物细胞是双子叶植物细胞。
108.如权利要求107所述的方法,所述植物细胞是大豆细胞。
109.如权利要求99所述的方法,所述多核苷酸序列与启动子可操作地连接。
110.如权利要求99所述的方法,所述植物细胞表达modlHaHB4(SEQ ID N0:4)。
111.如权利要求99所述的方法,所述植物细胞或所述细胞的后代表达一种能够在体外结合DNA的重组蛋白。
112.如权利要求99中所述的方法,还包括在所述转基因植物细胞中表达所述多核苷酸序列。
113.如权利要求99中所述的方法,还包括将所述植物细胞再生成植株。
114.一种转基因植物细胞,其特征在于是根据权利要求99所述的方法生产的。
115.如权利要求114所述的转基因植物细胞,其含有基因叠加。
116.一种生产较高产量转基因宿主的方法,所述方法包含 (a)使用核酸分子稳定转化植物细胞,所述核酸分子包含编码modlHaHB4 (SEQ IDNO:4)的多核苷酸序列,所述核酸能够在所述植物细胞内表达,以及 (b)将所述细胞再生成植株。
117.如权利要求116所述的方法,所述植物细胞是单子叶植物细胞。
118.如权利要求117所述的方法,所述植物细胞是玉米细胞。
119.如权利要求117所述的方法,所述植物细胞是小麦细胞。
120.如权利要求117所述的方法,所述植物细胞是水稻细胞。
121.如权利要求116所述的方法,所述植物细胞是双子叶植物细胞。
122.如权利要求121所述的方法,所述植物细胞是大豆细胞。
123.—种种植转基因植物的方法,所述方法包含(a)种植包含权利要求1-10中任一项所述核酸或权利要求11-13中任一项所述载体的转基因种子;和 (b)从所述转基因种子生长成转基因植物。
124.如权利要求123所述的方法,所述方法还包括收获所述转基因植物的步骤。
125.如权利要求124所述的方法,所述方法还包括再植从所述转基因植物中收获的种子的步骤。
126.如权利要求123-125中任一项所述的方法,所述植物是单子叶植物。
127.如权利要求126中任一项所述的方法,所述植物是玉米。
128.如权利要求126中任一项所述的方法,所述植物是小麦。
129.如权利要求126中任一项所述的方法,所述植物是水稻。
130.如权利要求123-125中任一项所述的方法,所述植物是双子叶植物。
131.如权利要求130所述的方法,所述植物是大豆。
132.权利要求1-10中任一项所述的核酸或权利要求11-13中任一项所述的载体用于转化植物细胞的用途。
133.权利要求1-10中任一项所述的核酸,权利要求11-13中任一项所述的载体或权利要求14-27、29-31、44-51、114或115中任一项所述的细胞用于生产转基因植物的用途。
134.如权利要求133所述的用途,所述转基因植物含有叠加的转基因事件。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5981729A (en) 1998-08-27 1999-11-09 Korea Kumho Petrochemical Co., Ltd. Transcription factor gene induced by water deficit and abscisic acid isolated from Arabidopsis thaliana
AT313635T (de) 1998-10-01 2006-01-15 Pioneer Hi Bred Int Methode zur pflanzentransformation
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BR122014032137B1 (pt) * 2003-05-02 2016-02-16 Carlos Alberto Dezar construção de ácido nucleico; célula hospedeira de fungo ou bactéria; método para expressar pelo menos uma proteína de interesse em uma célula hospedeira; e método para obter uma planta transgênica que expressa pelo menos uma proteína de interesse
US20080148432A1 (en) * 2005-12-21 2008-06-19 Mark Scott Abad Transgenic plants with enhanced agronomic traits

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
G. M. GAGO,ET AL: "Hahb-4,, a homeobox-leucine zipper gene potentially involved in abscisic acid-dependent responses to water stress in sunflower", 《PLANT, CELL AND ENVIRONMENT》, vol. 25, no. 5, 3 May 2002 (2002-05-03) *
GENBANK: "GenBank:AAA63768.2", 《GENBANK》, 26 March 2001 (2001-03-26) *
RAQUEL L,ET AL: "A cDNA Encoding an HD-Zip Protein from Sunflower", 《PLANT PHYSIOL》, 31 December 1994 (1994-12-31) *

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