CN117835830A - 霉菌毒素在发酵期间和发酵后的酶促降解 - Google Patents

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Abstract

提供了用于浸泡、扩培和发酵，具体地用于生产淀粉和乙醇以及发酵产品流的大规模操作的方法、组合物和系统。将霉菌毒素减轻酶或表达霉菌毒素减轻酶的微生物添加到浸泡罐、扩培罐和/或发酵罐和/或添加到发酵后产品流减轻了从受霉菌毒素污染的原料获得的发酵副产物中的霉菌毒素水平。

Description

霉菌毒素在发酵期间和发酵后的酶促降解
技术领域
本文提供了用于减轻生物加工和食品和饲料产品中使用的玉米和其它原料的霉菌毒素污染的方法、组合物和经基因修饰的微生物。
序列表
序列表的正式副本作为ASCII格式的序列表通过EFS-Web以电子方式与本说明书同时提交，文件名为PT-141-WO01_SEQ_LIST_ST25，创建日期为2021年9月8日，并且大小为约59千字节。此ASCII格式文件中含有的序列表是本说明书的一部分，并且通过引用整体并入本文。
背景技术
霉菌毒素是由真菌产生的天然存在的毒素，导致受污染的食物和饲料，特别是谷物、饲料、谷物、水果和制成品。监测霉菌毒素污染，并且增加的霉菌毒素负荷导致较低的价格和/或作物或食品的损失，并且产生相当大的经济后果。食用受污染的谷物或饲料可能导致家畜的增重与生殖的效率降低。在人类中，效应的范围可以从轻度胃肠道症状到肝损伤、神经毒性和癌症。
许多常见的霉菌毒素对大多数形式的食物和饲料加工具有抗性，并且实际上，在加工期间可能变得更浓缩。例如，当原料中的组分分离或消耗时，剩余材料中霉菌毒素的分数可能增加。在一个说明性实例中，原料中的淀粉通过发酵转化成化学品和CO2，并且剩余的未发酵材料中的霉菌毒素的分数大于原料中的霉菌毒素的分数，从而导致如具有可溶物的经干燥的酒糟(DDGS)等发酵副产物中的霉菌毒素水平较高。将谷物加工成人类食物也导致霉菌毒素水平增加。因此，重要的是，在设计用于人类食用的食物和家畜饲料中减轻霉菌毒素污染。
本发明旨在克服上述问题中的一个或多个。
发明内容
本文提供了减轻在干磨或湿磨谷物加工设施中产生的饲料或食品中的霉菌毒素污染的方法。在一些方面，所述方法包括：(i)使干磨或湿磨谷物加工设施的原料或工艺流与选自由以下组成的组的酶接触：黄曲霉毒素氧化酶、3-O乙酰转移酶、过氧化物酶、F420H2依赖性还原酶、Ery4、UDP-糖基转移酶、漆酶、锰过氧化物酶、脱氧瓜萎镰菌醇羟化酶、内酯水解酶、玉米烯酮水解酶、木聚糖酶、DepA/DepB和2cys-过氧化物还原酶；以及(ii)从所述接触步骤下游的工艺流生产食品或饲料产品。
在一些方面，所述接触包括使全谷物、粗碎谷物、浸泡的谷物、浸渍水、浸液、面粉、浆液、啤酒、完整酒糟、湿饼、酒槽水、浓缩的酒槽水、脱脂浓缩的酒槽水(例如糖浆)、细菌、油、纤维、蛋白质、淀粉或其组合与表达酶的微生物接触。在一些方面，所述接触包括使全谷物、粗碎谷物、浸泡的谷物、浸渍水、浸液、面粉、浆液、啤酒、完整酒糟、湿饼、酒槽水、浓缩的酒槽水、脱脂浓缩的酒槽水(例如糖浆)、细菌、油、纤维、蛋白质、淀粉或其组合与从表达酶的微生物获得的裂解物接触。
在一些方面，所述接触包括使所述原料或工艺流与以下接触：表达选自由以下组成的组的酶的微生物：黄曲霉毒素氧化酶、3-O乙酰转移酶、过氧化物酶、F420H2依赖性还原酶、Ery4、UDP-糖基转移酶、漆酶、锰过氧化物酶、脱氧瓜萎镰菌醇羟化酶、内酯水解酶、玉米烯酮水解酶、木聚糖酶、DepA/DepB和2cys-过氧化物还原酶；含有此类微生物的发酵液；通过裂解此类微生物形成的裂解物；此类微生物或裂解物的浓缩物或其组合。
在一些实施例中，本文提供了来源于受霉菌毒素污染的谷物的谷物和组合物，其中将受污染的谷物或组合物暴露于酶以减轻霉菌毒素污染。相对于未暴露于所述酶的组合物，所得组合物的霉菌毒素的水平降低。暴露于所述酶可以通过暴露于表达酶的微生物来减轻霉菌毒素污染。暴露于所述酶可以通过暴露于从裂解表达霉菌毒素减轻酶的微生物获得的材料，即裂解物。
在一些实施例中，提供了一种人类食物组合物，所述人食品组合物来源于暴露于霉菌毒素减轻酶或表达酶以减轻霉菌毒素污染的微生物的受霉菌毒素污染的谷物。在一些方面，相对于来源于未暴露于霉菌毒素减轻酶或表达酶以减轻霉菌毒素污染的微生物的受霉菌毒素污染的谷物的人类食物组合物中的霉菌毒素的水平，所述人类食物组合物中的霉菌毒素的水平降低。
在一些实施例中，提供了来源于暴露于霉菌毒素减轻酶或表达酶以减轻霉菌毒素污染的微生物的受霉菌毒素污染的谷物的玉米淀粉。在一些方面，相对于来源于未暴露于霉菌毒素减轻酶或表达酶以减轻霉菌毒素污染的微生物的受霉菌毒素污染的谷物的玉米淀粉中的霉菌毒素的水平，所述玉米淀粉中的霉菌毒素的水平降低。
在一些实施例中，提供了来源于暴露于霉菌毒素减轻酶或表达酶以减轻霉菌毒素污染的微生物的受霉菌毒素污染的谷物的玉米糖浆。在一些方面，相对于来源于未暴露于霉菌毒素减轻酶或表达酶以减轻霉菌毒素污染的微生物的受霉菌毒素污染的谷物的玉米糖浆中的霉菌毒素的水平，所述玉米糖浆中的霉菌毒素的水平降低。
在一些实施例中，提供了一种家畜饲料组合物，其包括来源于在存在酶以减轻霉菌毒素污染或存在表达酶以减轻霉菌毒素污染的微生物的情况下发酵的原料的酒糟。在一些方面，相对于从在不存在表达酶以减轻霉菌毒素污染的微生物的情况下发酵的原料获得的家畜饲料组合物中的霉菌毒素的水平，所述家畜饲料组合物中的霉菌毒素的水平降低。
在一些实施例中，提供了一种家畜饲料组合物，其包括来源于用酶处理以减轻霉菌毒素污染或用表达酶以减轻霉菌毒素污染的微生物处理的发酵后完整酒糟、湿饼、酒槽水和/或浓缩的酒槽水(例如糖浆)流的酒糟。在一些方面，相对于从未经处理的发酵后完整酒糟、湿饼、酒槽水和/或浓缩的酒槽水(例如糖浆)流获得的家畜饲料组合物中的霉菌毒素的水平，所述家畜饲料组合物中的霉菌毒素的水平降低。
在一些实施例中，提供了一种家畜饲料组合物，其包括来源于用酶处理以减轻霉菌毒素污染或用表达酶以减轻霉菌毒素污染的微生物处理的啤酒的酒糟。在一些方面，相对于从未经处理的啤酒获得的家畜饲料组合物中的霉菌毒素的水平，所述家畜饲料组合物中的霉菌毒素的水平降低。
在一些方面，所述霉菌毒素选自由以下组成的组：黄曲霉毒素、赭曲霉素A、棒曲霉素、T-2、HT-2、白僵菌素、新茄镰孢菌醇、瓜萎镰菌醇、脱氧瓜萎镰菌醇(DON)、3-ADON、15-ADON、单端孢霉烯、赭曲霉素和玉米烯酮。
在一些方面，所述酶选自由以下组成的组：黄曲霉毒素氧化酶、3-O乙酰转移酶、过氧化物酶、F420H2依赖性还原酶、Ery4、UDP-糖基转移酶、漆酶、锰过氧化物酶、脱氧瓜萎镰菌醇羟化酶和内酯水解酶、木聚糖酶、过氧化物酶和2cys-过氧化物还原酶。在一些方面，所述酶可以是酶的组合，例如，在两个或更多个步骤中起作用以使霉菌毒素解毒的酶系统。例如，所述酶系统可以是DepA/DepB，其中DepA将DON转化为3-酮-DON，并且DepB，即NADPH依赖性脱氢酶催化3-酮-DON还原为3-epi-DON。
在一些方面，所述微生物是细菌。在一些方面，所述微生物是酵母。在一些方面，所述微生物被工程化以表达和/或分泌霉菌毒素减轻酶。在一些方面，所述微生物是酵母，如酿酒酵母(S.cerevisiae)或毕赤酵母(Pichia pastoris)。在一些方面，所述微生物是经基因修饰的商品酵母或经基因修饰的合并的生物加工酵母，其中所述酵母被基因修饰以表达霉菌毒素减轻酶。
在一些实施例中，所述霉菌毒素减轻酶由酵母宿主细胞表达。
在一些方面，所述人类食物组合物或所述家畜饲料组合物中含有的霉菌毒素的水平为小于约10ppm、小于约8ppm、小于约5ppm、小于约3ppm或小于约2ppm。
在一些实施例中，提供了一种产生玉米淀粉的方法。在一些方面，所述方法包括在浸泡之前或期间用一种或多种酵母菌株接种受霉菌毒素污染的玉米，其中至少一种酵母菌株表达霉菌毒素减轻酶。在一些方面，所述霉菌毒素减轻酶是脱氧瓜萎镰菌醇羟化酶。在一些方面，所述方法进一步包括加工所述玉米以产生玉米淀粉。在一些方面，所述方法进一步包括加工所述玉米淀粉以产生玉米糖浆。
在一些实施例中，提供了一种产生玉米淀粉的方法。在一些方面，所述方法包括在浸泡之前或期间用从表达霉菌毒素减轻酶的微生物获得的裂解物暴露受霉菌毒素污染的玉米。在一些方面，所述霉菌毒素减轻酶是脱氧瓜萎镰菌醇羟化酶。在一些方面，所述方法进一步包括加工所述玉米以产生玉米淀粉。在一些方面，所述方法进一步包括加工所述玉米淀粉以产生玉米糖浆。
在一些实施例中，提供了一种发酵方法。在一些方面，所述方法包括用一种或多种酵母菌株接种受霉菌毒素污染的原料，其中至少一种酵母菌株表达霉菌毒素减轻酶。在一些方面，所述霉菌毒素减轻酶是脱氧瓜萎镰菌醇羟化酶。所述原料可以在酵母扩培期间被接种和/或可以在发酵期间被接种。在一些方面，所述方法进一步包括发酵所述原料以产生乙醇和酒糟。
在一些实施例中，提供了一种发酵方法。在一些方面，所述方法包括用从表达霉菌毒素减轻酶的微生物获得的裂解物暴露受霉菌毒素污染的原料。在一些方面，所述霉菌毒素减轻酶是脱氧瓜萎镰菌醇羟化酶。所述原料暴露于所述裂解物可以在发酵之前或期间发生。在一些方面，所述方法进一步包括发酵所述原料以产生乙醇和酒糟。
在一些方面，所述原料被霉菌毒素，例如脱氧瓜萎镰菌醇污染。相对于在不存在酶暴露，如暴露于表达如脱氧瓜萎镰菌醇羟化酶等霉菌毒素减轻酶的酵母或暴露于含有霉菌毒素减轻酶的酵母裂解物的情况下从加工的原料获得的副产物中的霉菌毒素的水平，在发酵期间暴露于所述霉菌毒素减轻酶，例如，通过表达霉菌毒素减轻酶的微生物或暴露于含有所述酶的裂解物后，在所得发酵副产物，例如，酒糟中的霉菌毒素，例如脱氧瓜萎镰菌醇的水平降低。
在一些实施例中，提供了一种减轻人类食物组合物中的霉菌毒素污染的方法。在一些方面，所述方法包括在存在霉菌毒素减轻酶或表达酶的微生物的情况下加工谷物，其中所述酶选自由以下组成的组：黄曲霉毒素氧化酶、3-O乙酰转移酶、过氧化物酶、F420H2依赖性还原酶、Ery4、UDP-糖基转移酶、漆酶、锰过氧化物酶、脱氧瓜萎镰菌醇羟化酶、内酯水解酶、木聚糖酶和2cys-过氧化物还原酶。在一些方面，所述酶可以是酶的组合，例如，在两个或更多个步骤中起作用以使霉菌毒素解毒的酶系统。例如，所述酶系统可以是DepA/DepB，其中DepA将DON转化为3-酮-DON，并且DepB，即NADPH依赖性脱氢酶催化3-酮-DON还原为3-epi-DON。
在一些实施例中，提供了一种减轻家畜饲料中的霉菌毒素污染的方法。在一些方面，所述方法包括在存在霉菌毒素减轻酶或表达酶的微生物的情况下加工原料，其中所述酶选自由以下组成的组：黄曲霉毒素氧化酶、3-O乙酰转移酶、过氧化物酶、F420H2依赖性还原酶、Ery4、UDP-糖基转移酶、漆酶、锰过氧化物酶、脱氧瓜萎镰菌醇羟化酶、内酯水解酶、木聚糖酶和2cys-过氧化物还原酶。在一些方面，所述方法包括在存在两种或更多种霉菌毒素减轻酶，例如DepA和DepB的情况下加工原料。在一些方面，所述方法包括在存在表达两种或更多种酶，例如DepA和DepB的微生物的情况下加工原料。
在一些实施例中，提供了一种减轻家畜饲料中的霉菌毒素污染的方法。在一些方面，所述方法包括使发酵后完整酒糟、湿饼、酒槽水和/或浓缩的酒槽水(例如糖浆)流与酶接触以减轻霉菌毒素污染，其中相对于从未经处理的发酵后完整酒糟、湿饼、酒槽水和/或浓缩的酒槽水(例如糖浆)流获得的家畜饲料组合物中的霉菌毒素的水平，所述家畜饲料组合物中的霉菌毒素的水平降低。
在一些实施例中，提供了一种减轻家畜饲料中的霉菌毒素污染的方法。在一些方面，所述方法包括使啤酒与酶接触以减轻霉菌毒素污染，其中相对于从未经处理的啤酒获得的家畜饲料组合物中的霉菌毒素的水平，所述家畜饲料组合物中的霉菌毒素的水平降低。
在一些实施例中，提供了一种载体，其包括编码霉菌毒素减轻酶的核酸序列。例如，包括SEQ ID NO:1的核酸序列、或与SEQ ID NO:1具有至少约95％、至少约98％或至少约99％序列同一性的核酸序列的载体编码脱氧瓜萎镰菌醇羟化酶。在一些实施例中，所述载体进一步包括一个或多个编码KdR基因或KdX基因的核酸序列。在一些实施例中，ddnA基因(SEQ ID NO:1)在一个载体中，所述KdR基因在另一个载体中，并且所述KdX基因在又一个载体中。在一些实施例中，所有三个基因都在一个载体中。在一些实施例中，所述ddnA基因、所述KdR基因和所述KdX基因中的至少两个在同一载体中。在一些实施例中，载体包括DepA和DepB中的一者或两者的核酸序列。
在一些方面，载体选自由pYEDP60(酿酒酵母)或pPINK(毕赤酵母(P.pastoris))组成的组，但其它可商购获得的载体是本领域技术人员已知的。
在一些实施例中，例如经由同源重组将霉菌毒素减轻酶的核酸序列整合到微生物的基因组中。
在一些实施例中，提供了表达由本文所述的载体编码的一种或多种蛋白质的微生物。在一些方面，所述微生物选自酵母或细菌。在一些方面，所述微生物被工程化以表达和/或分泌霉菌毒素减轻酶。在一些方面，所述微生物是经基因修饰的商品酵母或经基因修饰的合并的生物加工酵母，其中所述酵母被基因修饰以表达霉菌毒素减轻酶。一些方面，所述微生物是酿酒酵母。在一些方面，所述酵母是毕赤酵母。
在一些实施例中，提供了一种经工程化以包括编码霉菌毒素减轻酶的核酸序列的微生物的用途。在一些方面，在本文所述的载体中提供了所述核酸序列。在一些方面，将所述核酸序列整合到所述微生物的基因组中。在一些方面，所述用途包括在发酵期间，在啤酒中和/或在来源于发酵后酒糟的酒糟中表达霉菌毒素减轻酶，其中发酵原料被霉菌毒素污染。在一些方面，所述霉菌毒素减轻酶是脱氧瓜萎镰菌醇羟化酶，并且所述原料被脱氧瓜萎镰菌醇污染。
在一些实施例中，提供了一种用于在酵母宿主细胞中表达霉菌毒素减轻酶的方法。在一些方面，所述方法包括：用整合载体转化宿主细胞，所述整合载体包括：具有一个或多个表达盒的核酸，所述一个或多个表达盒包括编码霉菌毒素减轻酶的核酸；以及靶向核酸，所述靶向核酸通过同源重组引导整合载体插入到宿主细胞的基因组的特定位置中，其中所转化的宿主细胞产生霉菌毒素调节酶。
附图说明
图1描绘了与在不存在酶的情况下发酵期间未观察到变化相比，通过经纯化的酶添加以及裂解物添加到高DON玉米的发酵所实现的令人惊讶的结果。
图2a是示出了其中可以进行霉菌毒素减轻添加的干磨生物精制工艺步骤的实例的示例性工艺的示意图。
图2b是示出了其中可以进行霉菌毒素减轻添加的包含任选的单独烹饪、液化和糖化步骤在内的干磨生物精制工艺步骤的实例的示例性工艺的示意图。
图2c是示出了其中可以进行霉菌毒素减轻添加的湿磨生物精制工艺步骤的实例的示例性工艺的示意图。发酵步骤可以伴有如图2a和2b中所示的一个或多个另外的步骤，例如烹饪液化、糖化和酵母扩培。
图3示出了与在不存在酶的情况下的对照发酵相比，含有脱氧瓜萎镰菌醇羟化酶的酵母裂解物随时间推移(0至88小时发酵)的DON水平(ppm)。
具体实施方式
如本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包含复数指示物，除非上下文另有明确说明。因此，例如，对“方法”的提及包含本文所述和/或本领域技术人员在阅读本公开等后将变得显而易见的一种或多种方法和/或类型的步骤。
词语“示例性”用于意指充当实例、实例或图示。描述为“示例性”的任何实施例或设计不一定被解释为比其它实施例或设计优选或有利，也不意味着排除本领域普通技术人员已知的等效示例性结构和技术。相反，示例性词语的使用旨在以具体方式呈现概念，并且所公开的主题不受此类实例的限制。
术语“或”旨在意指包含性“或”而不是排他性“或”。就术语“包括”、“具有”、“包含”和其它类似词语在具体实施方式或权利要求书中使用而言，为了避免疑问，此类术语旨在以类似于术语“包括”的方式包含为开放过渡词语，而不排除任何另外或其它要素。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。尽管在本发明的实践或测试中可以使用类似于或等效于本文所述的方法和材料的任何方法和材料，但现在描述了优选的方法和材料。本说明书中提及的所有专利、申请和非专利出版物均通过引用整体并入本文。
在生物精制中用生物催化剂，例如经由发酵产生靶化学品。一个实例是玉米到乙醇，但本文还设想了其它原料的发酵和其它产品的生产。在生物精制中，在生物精制的产品中可以浓缩污染物，例如霉菌毒素。
霉菌毒素由真菌产生并且存在于许多农业作物中，但特别存在于包含玉米、大麦、黑麦、黑小麦和小麦在内的谷物中。在收获后和储存期间或者甚至在加工成食品和家畜饲料期间在田间可能发生污染。表1中提供了示例性霉菌毒素和产生其的真菌。
表1：
任何对于人和动物食物链而言重要的霉菌毒素都被认为是靶霉菌毒素，包含表1中包含的霉菌毒素。“霉菌毒素减轻酶”或“霉菌毒素调节酶”包含能够使谷物中存在的霉菌毒素解毒的任何酶。本文已确定，霉菌毒素减轻酶可以由微生物表达，并且在将谷物加工成食物或饲料产品期间，例如，在如用于将谷物加工成食物或饲料产品的存储、浸泡、研磨、混合、烹饪、液化、糖化、发酵、蒸馏、泵送、分离、浓缩、蒸发、过滤、干燥、精制、去胚芽和/或其它工艺等此类非限制性实例之前、期间或之后，谷物和/或中间谷物加工流可以暴露于此类微生物和/或表达的酶。原料、中间流和/或产品也可以暴露于此类微生物和/或表达的酶。非限制性实例包含全谷物、粗碎谷物、浸泡的谷物、浸渍水、浸液、面粉、浆液、啤酒、完整酒糟、湿饼、酒槽水、浓缩的酒槽水(例如糖浆)、脱脂浓缩的酒槽水(例如糖浆)、细菌、油、纤维、蛋白质、淀粉、生物化学品、糖浆和干燥的酒糟。此类暴露可以是例如暴露于生物体、含有生物体的发酵液、通过裂解生物体形成的裂解物；生物体或裂解物的浓缩物和/或暴露于单独的和/或浓缩的酶。取决于生物体或酶的热耐受性，一些流可能不太适合于暴露。
食品和饲料产品的霉菌毒素污染可能导致不利的结果。例如，在家畜饲料中，霉菌毒素的存在可能导致动物饲料被拒绝，从而导致缺乏增重。在将谷物加工成饲料和食品时，霉菌毒素可能变浓缩。例如，生物精制中的发酵、固体液体分离、蒸发和干燥过程可能导致副产物流，如酒糟，如用于动物饲料的麦芽酒糟、酿酒谷物、冷凝的可溶酒粕、干燥的可溶酒粕、湿酒糟、具有可溶物的湿酒糟、麸质粉(例如蛋白质)和麸质饲料等中的霉菌毒素的浓缩。类似地，在将谷物加工成人类食品，如将玉米加工成玉米淀粉或玉米糖浆时，霉菌毒素可能变浓缩并威胁人体健康。
脱氧瓜萎镰菌醇(DON)由包含禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌在内的镰刀菌属(Fusarium genus)中的若干真菌产生。瓜萎镰菌醇(NIV)、3-ADON、15-ADON和T-2毒素也由镰刀菌真菌产生。以下示出了DON的化学结构：
分子上的三个游离羟基与其毒性相关。在人体中，DON在食用后引发强烈的致吐作用，因为毒素降低血清素的脑水平并与脑中的多巴胺能受体相互作用。DON可以存在于包含燕麦、大麦、小麦、玉米、荞麦、高粱、大米和爆米花，以及面粉、面包、早餐谷物、面条、婴儿食品、薄饼混合物、面条、啤酒和麦芽在内的谷物中。
脱氧瓜萎镰菌醇羟化酶是示例性霉菌毒素减轻酶(由DdnA编码，SEQ ID NO:1)。所述酶修饰DON中的C-16碳，从而催化DON的烯丙基甲基的单氧化。这种酶还可以与NIV和3-ADON相互作用，从而将霉菌毒素修饰成更可耐受、毒性更小的形式。本文提供了在净化用于人类或动物食用的谷物中使用此酶的方法。其它霉菌毒素减轻酶包含但不限于黄曲霉毒素氧化酶、3-O乙酰转移酶、过氧化物酶、F420H2依赖性还原酶、Ery4、UDP-糖基转移酶、漆酶、锰过氧化物酶和内酯水解酶、木聚糖酶、DepA/DepB和2cys-过氧化物还原酶。微生物被工程化以表达可用于本文公开的方法中的这些酶。
黄曲霉毒素是由霉菌黄曲霉(Aspergillus flavus)产生的毒素，所述毒素可以在如玉米、花生和其它谷物等食物成分上生长。在高水平下，黄曲霉毒素可能导致疾病(黄曲霉毒素中毒)、肝损伤和死亡。酶黄曲霉毒素氧化酶可用于减轻使用受污染的谷物所产生的谷物和食品的黄曲霉毒素污染。
玉米烯酮是由一些镰刀菌和赤霉菌属物种产生的有效雌激素代谢物。霉菌毒素是热稳定的，并且是如玉米、大麦、燕麦、小麦、大米和高粱等谷物作物的污染物。玉米烯酮浓度在田间受污染的谷物中较低，但在水分大于30％-40％的储存条件下水平增加。玉米烯酮对于猪行业来说是成问题的，并且具体地影响雄性和雌性的繁殖。酶内酯水解酶或玉米烯酮水解酶使玉米烯酮解毒。
组合物
提供了根据本文公开的方法生产的组合物，其用于人类食用和动物食用两者，所述组合物的霉菌毒素污染的水平降低。所述组合物可以是人类食品，例如含有来源于受霉菌毒素污染的谷物的谷物产品的任何食物。示例性食品包含含有谷物的大多数加工食品，包含面粉、面包、谷类食品、面条、婴儿食品、薄饼混合物、啤酒和麦芽。所述组合物可以是动物饲料，例如，用于如肉牛、奶牛、猪、绵羊、山羊、家禽等家畜的饲料；用于马、驴、马驹、骡子、骡子等的饲料；用于反刍动物园动物的饲料，或者可以是用于如狗、猫、鸟等伴侣动物的饲料。可接受的霉菌毒素的水平取决于动物物种和霉菌毒素。例如，DON的最大水平通常小于20ppm，例如小于约15ppm、或小于12ppm、或小于10ppm、或小于9ppm、或小于8ppm、或小于7ppm、或小于6ppm、或小于5ppm、或小于4ppm、或小于3ppm、或小于2ppm或小于1ppm。例如，在用于肉牛的饲料组合物中，许多来源建议DON的水平为10ppm或更低；在用于奶牛的饲料组合物中，DON的水平被建议为2ppm或更低；在用于家禽的饲料组合物中，DON的水平被建议为2ppm或更低。
家畜饲料组合物可以包括来源于在原料加工期间，例如在发酵期间暴露于酶以减轻霉菌毒素污染或暴露于表达酶以减轻霉菌毒素污染的微生物的原料的酒糟。家畜饲料组合物可以包括来源于用酶处理以减轻霉菌毒素污染或用表达酶以减轻霉菌毒素污染的微生物处理的酒糟、湿饼和/或糖浆流的酒糟。在一些方面，相对于从未经处理的酒糟、湿饼和/或糖浆流获得的家畜饲料组合物中的霉菌毒素的水平，所述家畜饲料组合物中的霉菌毒素的水平降低。家畜饲料组合物可以包括用酶处理以减轻霉菌毒素污染或用表达酶以减轻霉菌毒素污染的微生物处理的酒糟，如麦芽酒糟、酿酒谷物、冷凝的可溶酒粕、干燥的可溶酒粕、湿酒糟、具有可溶物的湿酒糟、麸质粉和麸质饲料。
典型的原料可以包含任何谷物或谷物作物，例如小麦、玉米、高粱、啤酒花、燕麦、大麦、黑麦、荞麦等。
系统和方法
可以将表达霉菌毒素减轻酶的微生物接种到任何合适的工艺流中并原位生长。在说明性实例中，微生物可以接种到混合、浸泡、扩培、糖化、发酵、酒糟、糖浆或其它流中。
表达霉菌毒素减轻酶的微生物可以单独生长并用作整个发酵液以处理一种或多种或原料、工艺流或产品。培养物可以在使用前浓缩，例如通过过滤、蒸发、膜分离、沉降、离心或其它浓缩方法。微生物可以被裂解以增强酶暴露。裂解可以通过本领域已知的任何合适的方法完成。在说明性实例中，裂解通过均质化来实现。在说明性实例中，在生长之后并且在整个进一步加工过程中，将温度维持在150℉以下，甚至130℉以下。在说明性实例中，将裂解物在40℉或以下使用或储存。
微生物可以补料分批或连续发酵方法生长，这取决于所使用的生物体以及对生长和稳健酶表达(例如1-10000mg/L)的要求。在大多数情况下，这些生物体将在促进酶促系统的表达的条件下生长到后期固定相。这取决于表达的显式系统，即组成型表达与诱导型表达。
在说明性实例中，例如，如图2a和2b中所示，将干磨工厂中的原料、工艺流和/或产品中的一种或多种暴露于一种或多种霉菌毒素减轻酶可以使工厂产品的污染水平降低。此类暴露可以是暴露于表达酶的微生物、含有生物体的发酵液、通过裂解生物体形成的裂解物、生物体的浓缩物、发酵液或裂解物和/或暴露于单独的和/或浓缩的酶。例如，在干磨乙醇工厂中，如玉米等谷物被用作原料，并且通过发酵谷物内所含的淀粉来产生乙醇。发酵产物包含乙醇、水和可溶性组分以及残余未发酵颗粒物质(等等)。发酵产物被蒸馏并脱水以回收乙醇。包括水、可溶性组分、油和未发酵固体的残余物质(例如，完整酒糟)可以被进一步加工以分离用于动物饲料的所需发酵副产物，例如，具有可溶物的经干燥的酒糟(DDGS)、醪液、啤酒、完整酒糟、酒槽水、湿饼、糖浆等。
在说明性实例中，例如，如图2c中所示，将湿磨工厂中的原料、工艺流和/或产品中的一种或多种暴露于一种或多种霉菌毒素减轻酶可以使工厂产品的污染水平降低。此类暴露可以是暴露于表达酶的微生物、含有生物体的发酵液、通过裂解生物体形成的裂解物、生物体的浓缩物、发酵液或裂解物和/或暴露于单独的和/或浓缩的酶。例如，在玉米湿磨机中，浸泡实际上是受控发酵，对于高产率和高淀粉质量至关重要。将清洁的玉米放入大的浸泡罐(浸泡液)中，其中将玉米浸入热水中以开始破坏淀粉和蛋白质键。玉米内的麸质键开始松动并释放淀粉。二氧化硫的添加可以通过增强如乳酸杆菌等有利的微生物的生长，同时抑制有害细菌、霉菌、真菌和酵母来改善发酵。将可溶物萃取并且将核软化。除如乙醇等生物化学品之外的示例性产品包含玉米纤维、玉米和酵母蛋白、玉米淀粉、玉米糖浆和玉米油。
用于表达可用于例如通过暴露原料和加工流来减轻人和动物饲料组合物的霉菌毒素污染的酶的系统包含含有编码霉菌毒素减轻酶的基因的载体和表达基因的微生物。表达这些酶的微生物可以被添加到浸泡罐、扩培罐和/或发酵罐中，可以被添加到啤酒中，和/或可以被添加到发酵后酒糟、湿饼和/或糖浆流中。例如，表达这些酶的微生物可以被添加到用于制备丸粒、狗食和猫食的醪液中。作为另外的益处，微生物可以增加动物饲料中的蛋白质的氨基酸谱，例如DDGS或高蛋白质产物。
在一些方面，表达可以被裂解的酶以及被添加到浸泡罐、扩培罐和/或发酵罐的酶的微生物可以被添加到啤酒中，和/或可以被添加到发酵后酒糟、湿饼和/或糖浆流中。例如，含有这些酶的裂解物可以被添加到用于制备丸粒、狗食和猫食的醪液中。经裂解的浆液可以被直接添加，或者可以被进一步纯化以在添加之前浓缩霉菌毒素减轻酶。在一些方面，酶被纯化并以浓缩的量添加到工艺中，例如，在醪液、啤酒、完整酒糟、酒槽水、湿饼、糖浆、DDGS等中。可以将经纯化的酶给药，从而允许在发酵过程的不同部分根据需要的受控活性。
相对于减轻霉菌毒素污染的其它方法，本文所公开的方法是有益的，因为没有将加工设备暴露于通常用于降低霉菌毒素水平的腐蚀剂。此外，这种方法提供了营养值、质地、味道和外观具有更高一致性的更营养的产品，因为用于减轻霉菌毒素的其它系统可能改变饲料颜色、非蛋白质氮、改变脂肪分布或以其它方式导致最终饲料营养值的损害。
编码霉菌毒素减轻酶的基因可以被工程化成乙醇生产酵母，使得其在扩培和/或发酵期间表达酶，以减轻原料中存在的霉菌毒素污染。
编码霉菌毒素减轻酶的基因可以被工程化成与生产酵母共发酵的单独的微生物，例如酵母或细菌。
编码霉菌毒素减轻酶的基因可以被工程化成独立扩培的单独微生物，并且然后在蒸馏之前与受污染的发酵液合并，或与发酵后酒糟、湿饼和/或糖浆流合并。
在可用于允许微生物表达霉菌毒素减轻酶的任何生长条件下，添加铁源以改善酶的功能可能是有用的。示例性铁源包含FeCl3。5-氨基乙酰丙酸是血红素前体，并且可以用作辅助Ddna酶的细菌表达和活性的辅因子。
发酵方法可以包括任何典型发酵的步骤，无论是在生产生物燃料还是用于人类和动物食用的食物和饮料中。然而，本文示出，将表达霉菌毒素减轻酶的微生物添加到发酵过程中的添加步骤降低了食品和饮料产品和家畜饲料中的霉菌毒素的水平。
减轻家畜饲料组合物和/或人类食物中的霉菌毒素污染的方法可能需要在存在表达选自由以下组成的组的酶的微生物的情况下发酵原料：黄曲霉毒素氧化酶、3-O乙酰转移酶、过氧化物酶、F420H2依赖性还原酶、Ery4、UDP-糖基转移酶、漆酶、锰过氧化物酶、脱氧瓜萎镰菌醇羟化酶、内酯水解酶、木聚糖酶、DepA/DepB和2cys-过氧化物还原酶。
减轻家畜饲料组合物和/或人类食物中的霉菌毒素污染的方法可以包括使包含发酵后啤酒、酒糟、湿饼和/或糖浆流在内的发酵后产物与酶接触以减轻霉菌毒素污染。相对于从未经处理的发酵后产物获得的家畜饲料组合物中的霉菌毒素的水平，所述家畜饲料组合物和/或人类食物中的霉菌毒素的水平降低。
减轻家畜饲料中的霉菌毒素污染的方法可以包括使啤酒与酶接触以减轻霉菌毒素污染。相对于从未经处理的啤酒获得的家畜饲料组合物中的霉菌毒素的水平，所述家畜饲料组合物中的霉菌毒素的水平降低。
含有霉菌毒素减轻酶的裂解物可以根据需要过量使用以净化特定霉菌毒素。在一些方面，受霉菌毒素污染的组合物可以用约50mg裂解物至约150mg裂解物/经处理的材料中的克固体进行处理。在一些方面，所述组合物可以用约80至约120mg裂解物/克固体进行处理。在一些方面，所述组合物可以用约100mg裂解物/克固体进行处理。在纯化形式中，霉菌毒素减轻酶将以约5mg酶至约15mg酶/克固体、甚至约8mg酶至约12mg酶/g固体、甚至约10mg酶/克固体进行给药。酶剂量还可以取决于酵母表达和特定酶的活性。在一些方面，剂量为超过污染性霉菌毒素的浓度的约0至100倍。
在一些方面，将受霉菌毒素污染的组合物用高剂量的霉菌毒素减轻酶，例如，含有约100至约1000mg裂解物的酶/克固体的受污染的组合物进行处理。在一些方面，将受霉菌毒素污染的组合物用低剂量的霉菌毒素减轻酶，例如约5至约50mg酶/克固体进行处理。
剂量可以与上述参数不同，这取决于受污染的组合物中的霉菌毒素的原始浓度。例如，高度受污染的材料可能需要比受较低污染的材料对应较高的剂量。污染的水平可以通过以百万分比测量原料中的污染来确定，并且可以基于污染的水平来确定剂量。例如，在用细胞裂解物处理源自受污染的原料的组合物时，剂量可以表示为裂解物的毫克数/经处理的组合物中的克固体/原料的百万分比污染物水平。剂量可以是1-1000mg裂解物、甚至10-500g裂解物、甚至50-500mg裂解物，甚至10-50mg裂解物/经处理的组合物中的克固体/原料中的百万分比污染物。例如，玉米发酵设施中的发酵组合物可以如下用10mg剂量的裂解物处理。例如，玉米原料中的DON的污染水平可测量为例如5ppm。然后剂量将计算为10mg/g固体/ppm污染x#固体克数x 5ppm污染，以在发酵器中产生50mg/g固体的剂量。
载体和宿主细胞
用于在酵母宿主细胞中表达霉菌毒素调节酶的方法可以包括用整合载体转化宿主细胞，所述整合载体包括：具有一个或多个表达盒的核酸，所述一个或多个表达盒包括编码霉菌毒素调节酶的核酸；以及靶向核酸，所述靶向核酸通过同源重组引导整合载体插入到宿主细胞的基因组的特定位置中。经转化的宿主细胞产生霉菌毒素调节酶。
提供了用于将微生物转化成经工程化的微生物以产生霉菌毒素减轻酶的载体。载体可以包括编码一种或多种霉菌毒素减轻酶的核酸序列，所述一种或多种霉菌毒素减轻酶选自由以下组成的组：黄曲霉毒素氧化酶、3-O乙酰转移酶、过氧化物酶、F420H2依赖性还原酶、Ery4、UDP-糖基转移酶、漆酶、锰过氧化物酶、脱氧瓜萎镰菌醇羟化酶、内酯水解酶、木聚糖酶、DepA/DepB和2cys-过氧化物还原酶。例如，载体可以包含SEQ ID NO:1的核酸序列，所述核酸序列编码脱氧瓜萎镰菌醇羟化酶。在一些实施例中，所述载体进一步包括一个或多个编码KdX基因(SEQ ID NO:2或KdR基因(SEQ ID NO:3)的核酸序列。可替代地，载体可以包含核酸序列，所述核酸序列包括启动子、终止子、标记和编码霉菌毒素减轻酶的基因(SEQID NO:10)。在一些方面，载体选自由pYEDP60(酿酒酵母)、pPINK(毕赤酵母)或pCWori(细菌)组成的组。
本文所用的微生物用包括编码霉菌毒素减轻酶的核酸序列的载体转化。所述微生物可以是酵母或细菌。所述微生物可以被工程化以表达和/或分泌霉菌毒素减轻酶。所述微生物可以仅用于净化原料、工艺流或产品。所述微生物可以是也被用于执行原料到所需产物的初级转化的生物体。所述微生物可以是与另一种微生物共培养的辅助微生物，使得其提供净化酶，而另一种生物体产生所需产物。所述微生物可以被单独培养并作为整个微生物、整个发酵液、作为裂解物或分离的酶添加。示意性地，所述微生物可以是用于在生物乙醇生产设施中发酵原料的酵母，或者可以是用于浸泡玉米以生产玉米淀粉的酵母。例如，酵母可以是经基因修饰的商品酵母或经基因修饰的合并的生物加工酵母。酵母可以是例如酿酒酵母或毕赤酵母。
包括此类载体的微生物可用于在发酵期间，例如在啤酒中和/或在来源于发酵后酒糟的酒糟中表达脱氧瓜萎镰菌醇羟化酶或另一种霉菌毒素减轻酶，其中发酵原料被如脱氧瓜萎镰菌醇等霉菌毒素污染。
实例
以下实例仅出于说明性目的提供，并且不旨在限制本发明的范围。
实例1：毕赤酵母和酿酒酵母中的脱氧瓜萎镰菌醇羟化酶表达
DNA重悬：
将从GenScript获得的DdnA DNA、KdX DNA和KdR DNA在4℃下以6,000x g离心1分钟。添加20μL灭菌去离子水以溶解DNA。将小瓶涡旋1分钟。然后将溶液在50℃下加热15分钟以确保DNA溶解在液体中，然后在-20℃下储存直到使用。
质粒大肠杆菌(E.coli)转化
将具有化学能力的DH5α细胞在冰上解冻20-30分钟。将DdnA DNA(1-2μL)添加到化学感受态细胞中，并通过轻弹管底部轻轻混合。将混合物在冰上温育20-30分钟，然后在42℃下热冲击30-60秒。将混合物放回冰上2分钟，并使细胞恢复。将250-1000μL的不含抗生素的LB或SOC培养基添加到混合物中并在37℃下温育45-60分钟。温育后，将样品在4℃下以4,000x g轻轻离心1分钟。去除剩余液体的四分之三，并将细胞沉淀物用剩余液体重悬。将液体用选择性抗生素铺在室温LB琼脂板上，并置于37℃温育箱中过夜(在12-18小时内拉动板)。选择菌落并在液体培养物中生长。制备冷冻库并检查DNA序列。
将基因从大肠杆菌质粒转移到酵母质粒：
DdnA、KdX和KdR序列被密码子偏倚以在酵母宿主中表达，并且具有朝向C末端侧的组氨酸或FLAG标记。分泌信号也可以被添加到DNA的5'侧以指示酵母中的分泌。
限制酶消化：用EcoRI切割5'末端(基因开始)以及用RsrII、SphI、StuI、KpnI、NaeI、FseI或SwaI切割3'末端(基因结束)。将酶和DNA在37℃下混合(酵母质粒和大肠杆菌质粒两者[单独])持续2-24小时。
·2μL DNA
·1μL 10X限制酶缓冲液
·5μL无菌水
·1μL EcoRI
·1μL RE2*(*或任何适当的第2限制酶)
运行1.5％琼脂糖凝胶以将裂解的基因与质粒分离，并清除质粒，以使其不自身回连。
然后连接纯化的切割件：
·2μL 5X连接缓冲液
·0.5μL T4 DNA连接酶
·1μL酵母质粒
·1μL插入基因
·5.5μL无菌水
将成分轻轻混合，然后离心以使所有液体到达管底部，并在25℃下温育1-2小时或在16℃下温育过夜。将酵母质粒转化成大肠杆菌，生长，测序，并且纯化以用于将质粒DNA转化成酵母。
用于构建最终酵母载体的另外的方法：
门控克隆方案被用于将所有三个基因合并到单个构建体中，以置于待整合到酵母基因组中的酵母载体中。通常，协议如下：
混合以下溶液：
·1uL目标载体
·75ng的以2:1比率的每个基因或插入物，取决于插入物溶液的来源
·2uL T4 DNA连接酶缓冲液
·1-2uL金门控组件混合物
·无核酸酶水至20uL
一旦充分混合，就将反应在热循环仪中经历以下方案：要么：37C持续1小时，随后60℃持续5分钟；要么(37℃持续1分钟，16℃持续1分钟)持续30-35个循环，随后60℃温育5分钟。然后将这些构建体转化成大肠杆菌，以在转化成酵母之前进行初步筛选。
质粒酵母转化：
将来自YPD板的酵母接种到100mL无菌烧瓶中的20mL的YPD培养基中，并在30℃下伴随振荡(200-250rpm)生长过夜以达到固定相。将培养物稀释到500mL烧瓶中的100mL的YPD培养基中到OD600为约0.3，并在30℃下伴随振荡生长3-6小时，OD600。培养物应加倍且不超过1.5(OD600)。通过在室温下以5,000rpm离心5分钟来收获细胞。丢弃上清液，并将细胞重悬于50mL无菌水中。重复离心。丢弃上清液，并将细胞沉淀物重悬于1mL的转化缓冲液中(细胞现在准备好转化)。将鲑鱼睾丸DNA以10μL的10mg/mL与0.1μg的酵母质粒DNA一起等分到每个转化管中。添加100μL的感受态细胞，并将混合物涡旋。添加600μL的板缓冲液，并将混合物再次涡旋。将混合物在30℃下伴随振荡温育30分钟。添加10％ DMSO，并将混合物在42℃下热冲击15分钟。将混合物旋转以使细胞沉淀，并去除上清液。将细胞重悬于500μL无菌水中，并在适当的SC选择性板上以100μL铺板，而不需要补充。然后将板在30℃下温育2-3天，直到出现集落。
蛋白质表达测试的蛋白质印迹：
将脱氧瓜萎镰菌醇羟化酶用在蛋白质印迹中被探测到的C末端组氨酸或FLAG标记进行标记。蛋白质印迹分析被用于监测细菌或酵母生长期间的蛋白质(酶)表达。
离心细胞生长，并且将细胞沉淀物(固体)和上清液(水性)分离并单独保存。将细胞沉淀物重悬于一般低摩尔TRIS缓冲液中并处理以破开细胞(例如，通过珠磨、超声处理、均质化、化学处理)。在细胞破裂后，将溶液在超离心机中离心以分离细胞碎片和可溶性蛋白，并且保留两种级分。
可溶性水相可以按原样运行，或通过使可溶性蛋白在用于His-标记或FLAG-标记的亲和柱(镍或FLAG柱)上运行来进一步富集。使用增加的盐浓度从柱上洗脱蛋白质，从而得到富集的级分。然后在SDS-PAGE蛋白凝胶上运行此级分或任何先前级分—例如12％-18％丙烯酰胺凝胶。一旦凝胶已在标准条件下运行，就将蛋白质转移到膜(PVDF)并用再水化的奶粉封闭。在阻断后，添加针对His-标记或FLAG-标记的一抗，并使其在16℃下温育过夜。
在初次温育后，将膜洗涤若干次，然后添加附接有辣根过氧化物酶的二抗。二次温育为在室温下1至3小时。
再次洗涤膜，然后添加信号化合物以在抗体所附接的任何条带处产生光。经标记的蛋白质在凝胶盒上可视化。
实例2：向玉米浆添加表达脱氧瓜萎镰菌醇羟化酶的毕赤酵母或酿酒酵母
将被DON污染的整个玉米填充到三个大的浸泡罐(浸泡液)中，并浸泡在热水中30至48小时，以开始破坏淀粉和蛋白质键。向浸泡罐中的每一个添加表达脱氧瓜萎镰菌醇羟化酶的毕赤酵母和表达脱氧瓜萎镰菌醇羟化酶的酿酒酵母，并且在两个浸泡罐中的每个中监测酶水平以确保正确表达。将第三浸泡罐在相同条件下保持，但不添加任一微生物。在浸泡的持续时间内以6小时的增量获得水样品，并且在每个样品中评估DON水平。随着时间推移，来自经处理的罐的浸渍水中的DON水平降低。
实例3：向发酵罐中添加表达脱氧瓜萎镰菌醇羟化酶的酿酒酵母
将磨碎的玉米或其它原料与水合并以形成浆液，并且根据需要调节浆液混合物的pH。向发酵器中添加经工程化以表达脱氧瓜萎镰菌醇羟化酶的酿酒酵母以及有效产生商业上显著量的乙醇的量的酵母起始剂。发酵进行约88小时。监测酶水平以确保表达和适当的水平，以减轻DON污染。定期获得固体的样品以评估DON水平。所得发酵后产物示出商业上可接受的DON水平(ppm)。
实例4：在发酵中经由裂解物添加脱氧瓜萎镰菌醇羟化酶
在存在或不存在经基因修饰以产生脱氧瓜萎镰菌醇羟化酶(Ddna，主要催化酶)、Kdr或Kdx(后两者是辅助再循环酶)的酵母的细胞裂解物的情况下，对受DON污染的玉米进行72小时发酵。使酵母培养物生长到后期对数生长阶段或早期静止生长阶段，同时产生霉菌毒素减轻酶，并且然后裂解。将酵母裂解物混合到1:1:1的比率，使得每种酶的最终剂量等于5-10mg蛋白质(所述蛋白质含有酶)/克固体，并添加到发酵中。
分析了霉菌毒素浓度和乙醇滴度的结果。在发酵88小时后，通过LC/MS在所有发酵固体上测量以ppm为单位的DON并干燥。基于与经处理的发酵同时进行的未经处理的对照发酵来进行比较测量。图1中的数据示出，酶在酵母裂解物中是活性的并且可用于玉米，因此减少DON污染，并且对最终乙醇滴度没有损害。与未经处理的对照相比，经处理的样品中的DON水平降低了94％。减轻的％是相对于未经处理的对照发酵，而不是基于开始到结束的发酵DON浓度(ppm)。
在类似的实验中，在存在或不存在从经基因修饰以产生脱氧瓜萎镰菌醇羟化酶的酵母获得的细胞裂解物的情况下，对受DON污染的玉米进行88小时发酵。在发酵期间的不同时间点，使用LC/MS在未经处理的对照和经处理的发酵器中评估DON水平。图3示出了在88小时发酵期间的DON减轻动力学。随着时间推移，经酶处理的发酵中的DON的水平降低至小于2ppm。
实例5：完整酒糟处理
在蒸馏和去除乙醇级分后，将受霉菌毒素污染的完整酒糟在相对较短的时间内用高剂量，例如从经基因修饰以产生含有酶的霉菌毒素减轻酶的酿酒酵母获得的100-1000mg全细胞裂解物/克固体，或在相对较长的时间内以较低剂量，例如5-50mg全细胞裂解物酶/克固体进行处理。每2-4小时测试样品以确定霉菌毒素浓度。处理后的完整酒糟表现出商业上可接受的DON水平(ppm)。
实例6：二次完整酒糟发酵
将在乙醇蒸馏后获得的完整酒糟用表达一种或多种霉菌毒素减轻酶的乙醇原进行二次发酵。在发酵期间每4-6小时获得样品并评估霉菌毒素水平。在二次发酵期间，霉菌毒素减少。所得的饲料产品示出商业上可接受的霉菌毒素存在的水平。
实例7：可溶物和糖浆的处理
在第一桶中，将产生霉菌毒素减轻酶的微生物的裂解物给予到糖浆罐中，并且使得在保持时间内以及在干燥过程中给予饲料之前减轻霉菌毒素。
在第二桶中，表达霉菌毒素减轻酶的活微生物在糖浆或可溶物中生长。两个实验都证实了在分离两个流之后处理含有保留在湿饼或饲料固体中的霉菌毒素的部分流的有效性。
在另外的实验中，分别用来自产生霉菌毒素减轻酶的微生物或表达霉菌毒素减轻酶的活微生物的全细胞裂解物处理含有受霉菌毒素污染的酒槽水流的两个桶。使第三桶经受相同的条件，但不用酶处理。将三个桶温育48-60小时，并且每4-8小时从每个桶获得样品以跟踪霉菌毒素水平。随着时间的推移，霉菌毒素水平降低到可接受的水平。
实例8：向小麦浆添加表达黄曲霉毒素氧化酶的酿酒酵母和毕赤酵母
用黄曲霉毒素污染的小麦被填充到三个大的浸泡罐(浸泡液)中，并浸泡在热水中30至48小时，以开始破坏淀粉和蛋白质键。向浸泡罐中的每一个添加表达黄曲霉毒素氧化酶的毕赤酵母和表达黄曲霉毒素氧化酶的酿酒酵母，并且在两个浸泡罐中的每个中监测酶水平以确保正确表达。将第三浸泡罐在相同条件下保持，但不添加任一微生物。在浸泡的持续时间内以6小时的增量获得水样品，并且在每个样品中评估黄曲霉毒素水平。随着时间推移，来自经处理的罐的浸渍水中的黄曲霉毒素水平降低。
实例9：二次完整酒糟发酵
将在乙醇蒸馏后获得的完整酒糟用表达3-O乙酰转移酶的乙醇原进行二次发酵。在发酵期间每4-6小时获得样品并评估DON水平。在二次发酵期间，DON的水平降低。所得的饲料产品示出商业上可接受的霉菌毒素存在的水平。
实例10：向发酵罐中添加表达DepA和DepB的酿酒酵母
将磨碎的玉米或其它原料与水合并以形成浆液，并且根据需要调节浆液混合物的pH。向发酵器中添加经工程化以表达DepA和DepB的酿酒酵母以及有效产生商业上显著量的乙醇的量的酵母起始剂，即乙醇原。在发酵开始时添加辅因子，所述辅因子包含吡咯并喹啉醌(PQQ)或吡咯喹啉醌作为纯化粉末或水果萃取物。发酵进行约88小时。监测酶水平以确保表达和适当的水平，以减轻DON污染。定期获得固体的样品以评估DON水平。所得发酵后产物示出商业上可接受的DON水平(ppm)。
实例11：向发酵罐添加含有DepA和DepB的酵母裂解物
将磨碎的玉米或其它原料与水合并以形成浆液，并且根据需要调节浆液混合物的pH。将经工程化以表达DepA和DepB的酿酒酵母裂解，并向发酵器中添加裂解物以及有效产生商业上显著量的乙醇的量的酵母起始剂。在发酵开始时添加辅因子，所述辅因子包含吡咯并喹啉醌(PQQ)或吡咯喹啉醌作为纯化粉末或水果萃取物。发酵进行约88小时。监测酶水平并根据需要添加另外的裂解物以降低DON污染。定期获得固体的样品以评估DON水平。所得发酵后产物示出商业上可接受的DON水平(ppm)。
另外的实例：
1.一种家畜饲料组合物，其包括来源于在存在表达酶以减轻霉菌毒素污染的微生物或包括表达酶以减轻霉菌毒素污染的微生物的细胞裂解物的情况下发酵的原料的酒糟，其中相对于从在不存在表达酶以减轻霉菌毒素污染的微生物或包括表达酶以减轻霉菌毒素污染的微生物的细胞裂解物的情况下发酵的原料获得的家畜饲料组合物中的霉菌毒素的水平，所述家畜饲料组合物中的所述霉菌毒素的水平降低。
2.一种家畜饲料组合物，其包括来源于用酶处理以减轻霉菌毒素污染的发酵后酒糟、湿饼和/或糖浆流的酒糟，其中相对于从未经处理的发酵后酒糟、湿饼和/或糖浆流获得的家畜饲料组合物中的霉菌毒素的水平，所述家畜饲料组合物中的所述霉菌毒素的水平降低，并且其中所述酶是通过用表达酶以减轻霉菌毒素污染的微生物接种发酵后酒糟、湿饼和/或糖浆流或通过将包括表达酶以减轻霉菌毒素污染的微生物的细胞裂解物添加到所述发酵后酒糟、湿饼和/或糖浆流中来获得的。
3.一种家畜饲料组合物，其包括来源于用酶处理以减轻霉菌毒素污染的啤酒的酒糟，其中相对于从未经处理的啤酒获得的家畜饲料组合物中的霉菌毒素的水平，所述家畜饲料组合物中的所述霉菌毒素的水平降低，并且其中所述酶是通过用表达酶以减轻霉菌毒素污染的微生物接种啤酒或通过将包括表达酶以减轻霉菌毒素污染的微生物的细胞裂解物添加到所述啤酒中来获得的。
4.根据实例1至3中任一项所述的家畜饲料组合物，其中所述霉菌毒素选自由以下组成的组：黄曲霉毒素、赭曲霉素A、棒曲霉素、T-2、HT-2、白僵菌素、新茄镰孢菌醇、瓜萎镰菌醇、脱氧瓜萎镰菌醇、3-ADON、单端孢霉烯、赭曲霉素和玉米烯酮。
5.根据实例1至3中任一项所述的家畜饲料组合物，其中所述酶选自由以下组成的组：黄曲霉毒素氧化酶、3-O乙酰转移酶、过氧化物酶、F420H2依赖性还原酶、Ery4、UDP-糖基转移酶、漆酶、锰过氧化物酶、脱氧瓜萎镰菌醇羟化酶、木聚糖酶、DepA/DepB、内酯水解酶、玉米烯酮水解酶和2cys-过氧化物还原酶。
6.根据实例1所述的家畜饲料组合物，其中所述微生物是酵母。
7.根据实例6所述的家畜饲料组合物，其中所述酵母是酿酒酵母。
8.根据实例6所述的家畜饲料组合物，其中所述酵母是毕赤酵母。
9.根据权利要求6所述的家畜饲料组合物，其中所述酵母是未经基因修饰的商品酵母或合并的生物加工酵母。
10.根据实例1至3中任一项所述的家畜饲料，其中所述酶由酵母宿主细胞表达。
11.根据实例1至10中任一项所述的家畜饲料组合物，其中所述霉菌毒素的水平小于约10ppm。
12.根据实例1至10中任一项所述的家畜饲料组合物，其中所述霉菌毒素的水平小于约5ppm。
13.根据实例1至10中任一项所述的家畜饲料组合物，其中所述霉菌毒素的水平小于约2ppm。
14.一种发酵方法，所述方法包括用一种或多种酵母菌株接种原料，其中至少一种酵母菌株表达一种或多种霉菌毒素减轻酶。
15.根据实例14所述的方法，其进一步包括发酵所述原料以产生乙醇和酒糟。
16.根据实例14所述的方法，其中所述霉菌毒素减轻酶是脱氧瓜萎镰菌醇羟化酶。
17.根据实例16所述的方法，其中所述原料被脱氧瓜萎镰菌醇污染。
18.根据实例15所述的方法，其中相对于从在不存在表达脱氧瓜萎镰菌醇羟化酶的酵母的情况下发酵的原料获得的酒糟中的脱氧瓜萎镰菌醇的水平，所述酒糟中的所述脱氧瓜萎镰菌醇的水平降低。
19.一种减轻家畜饲料中的霉菌毒素污染的方法，所述方法包括在存在表达选自由以下组成的组的酶的微生物的情况下发酵原料：黄曲霉毒素氧化酶、3-O乙酰转移酶、过氧化物酶、F420H2依赖性还原酶、Ery4、UDP-糖基转移酶、漆酶、锰过氧化物酶、脱氧瓜萎镰菌醇羟化酶、内酯水解酶、玉米烯酮水解酶、木聚糖酶、DepA/DepB和2cys-过氧化物还原酶。
20.一种减轻家畜饲料中的霉菌毒素污染的方法，所述方法包括使发酵后酒糟、湿饼和/或糖浆流与酶接触以减轻霉菌毒素污染，其中相对于从未经处理的发酵后酒糟、湿饼和/或糖浆流获得的家畜饲料组合物中的霉菌毒素的水平，所述家畜饲料组合物中的所述霉菌毒素的水平降低，其中所述酶是通过用表达酶以减轻霉菌毒素污染的微生物接种发酵后酒糟、湿饼和/或糖浆流或通过将包括表达酶以减轻霉菌毒素污染的微生物的细胞裂解物添加到所述发酵后酒糟、湿饼和/或糖浆流中来获得的。
21.一种减轻家畜饲料中的霉菌毒素污染的方法，所述方法包括使啤酒与酶接触以减轻霉菌毒素污染，其中相对于从未经处理的蒸馏前完整酒糟获得的家畜饲料组合物中的霉菌毒素的水平，所述家畜饲料组合物中的所述霉菌毒素的水平降低，并且其中所述酶是通过用表达酶以减轻霉菌毒素污染的微生物接种啤酒或通过将包括表达酶以减轻霉菌毒素污染的微生物的细胞裂解物添加到所述啤酒中来获得的。
22.根据实例21所述的方法，其中所述使啤酒与酶接触的步骤包括裂解表达所述酶的酵母并将所述裂解物添加到所述啤酒中。
23.一种载体，其包括SEQ ID NO:1的核酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少约95％序列同一性的核酸，所述核酸序列或所述核酸编码脱氧瓜萎镰菌醇羟化酶(Ddna)。
24.根据实例23所述的载体，其进一步包括一个或多个编码KdR基因、KdX基因或Ddna基因的核酸序列。
25.根据实例23所述的载体，其选自由pYEDP60(酿酒酵母)、pPINK(毕赤酵母)或pCWori(细菌)或用于整合到酵母基因组中的其它定制载体组成的组。
26.一种微生物，其表达根据实例23所述的载体。
27.根据实例26所述的微生物选自酵母和细菌。
28.根据实例26所述的微生物，其中所述酵母是酿酒酵母。
29.根据实例26所述的微生物，其中所述酵母是毕赤酵母。
30.根据实例26所述的微生物，其中所述细菌是大肠杆菌(E.coli)、乳酸杆菌或发酵单胞菌(zymomonas)。
31.根据实例26所述的微生物，其中所述酵母是未经基因修饰的商品酵母或合并的生物加工酵母。
32.一种载体，其包括SEQ ID NO:10的核酸序列或与SEQ ID NO:10具有至少约95％序列同一性的核酸。
33.一种微生物，其表达根据权利要求32所述的载体。
34.根据实例33所述的微生物选自酵母和细菌。
35.根据实例33所述的微生物，其中所述酵母是酿酒酵母。
36.根据实例33所述的微生物，其中所述酵母是毕赤酵母。
37.根据实例33所述的微生物，其中所述细菌是大肠杆菌、乳酸杆菌或发酵单胞菌。
38.根据实例33所述的微生物，其中所述酵母是未经基因修饰的商品酵母或合并的生物加工酵母。
39.一种包括根据实例23至26中任一项所述的载体的微生物在发酵期间，在啤酒中和/或在来源于发酵后酒糟的酒糟中表达脱氧瓜萎镰菌醇羟化酶的用途，其中发酵原料被脱氧瓜萎镰菌醇污染。
40.一种用于在酵母宿主细胞中表达霉菌毒素调节酶的方法，所述方法包括：用整合载体转化所述宿主细胞，所述整合载体包括：具有一个或多个表达盒的核酸，所述一个或多个表达盒包括编码霉菌毒素调节酶的核酸；以及靶向核酸，所述靶向核酸通过同源重组引导整合载体插入到宿主细胞的基因组的特定位置中，其中经转化的宿主细胞产生霉菌毒素调节酶。
41.一种表达脱氧瓜萎镰菌醇脱羟基酶的微生物，其中所述微生物是毕赤酵母或酿酒酵母。
42.一种减轻在干磨或湿磨谷物加工设施中产生的饲料或食品中的霉菌毒素污染的方法，所述方法包括：
使干磨或湿磨谷物加工设施的原料或工艺流与选自由以下组成的组的酶接触：黄曲霉毒素氧化酶、3-O乙酰转移酶、过氧化物酶、F420H2依赖性还原酶、Ery4、UDP-糖基转移酶、漆酶、锰过氧化物酶、脱氧瓜萎镰菌醇羟化酶、内酯水解酶、玉米烯酮水解酶、木聚糖酶、DepA/DepB和2cys-过氧化物还原酶；以及从所述接触步骤下游的工艺流生产食品或饲料产品。
43.根据实例42所述的方法，其中接触包括接触全谷物、粗碎谷物、浸泡的谷物、浸渍水、浸液、面粉、浆液、啤酒、完整酒糟、湿饼、酒槽水、浓缩的酒槽水、脱脂浓缩的酒槽水(例如糖浆)、细菌、油、纤维、蛋白质、淀粉或其组合。
44.根据实例42所述的方法，其中接触包括使所述原料或工艺流与以下接触：表达选自由以下组成的组的酶的微生物：黄曲霉毒素氧化酶、3-O乙酰转移酶、过氧化物酶、F420H2依赖性还原酶、Ery4、UDP-糖基转移酶、漆酶、锰过氧化物酶、脱氧瓜萎镰菌醇羟化酶、内酯水解酶、玉米烯酮水解酶、木聚糖酶、DepA/DepB和2cys-过氧化物还原酶；含有此类微生物的发酵液；通过裂解此类微生物形成的裂解物；此类微生物或裂解物的浓缩物或其组合。
虽然已参考多个实施例具体示出和描述了本发明，但本领域技术人员将理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本文公开的各种实施例进行形式和细节的改变，并且本文公开的各种实施例不旨在充当对权利要求的范围的限制。
序列表
DdnA DNA SEQ ID NO:1
经kdX蛋白修饰的DNA序列SEQ ID NO:2
经kdR蛋白修饰的DNA序列SEQ ID NO:3
pUC57克隆载体SEQ ID NO:4
pPink-HC(高拷贝毕赤酵母载体)SEQ ID NO:5
pPink-LC(毕赤酵母的低拷贝载体)SEQ ID NO:6
pPink-αHC(高拷贝毕赤酵母载体)SEQ ID NO:7
pJKW1148(与pYEDP60质粒相同的主链)SEQ ID NO:8
pCWori SEQ ID NO:9
Ddna、Kdx、Kdr表达的单表达盒SEQ ID NO:10
序列表
<110> 波特研究公司（POET Research, Inc.）
A·J·曼宁
史蒂文·T·布莱
<120> 霉菌毒素在发酵期间和发酵后的酶促降解
<130> PT-141-WO01
<160> 10
<170> PatentIn第3.5版
<210> 1
<211> 1296
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 1
atggttgaag cattgacaat tgatagagtt ccagatcata ttgctagagc agttgttgat 60
ccacatgctt atgcagaatg ggatggttta catgctatgt tggcagaatt aagaagagaa 120
catccatttg ctagagcaga tttggaaggt tacgatccat tttgggttgc ttctaaacat 180
gcagatattc aagaagtttg tagaagacat gatttgtacc aaaacggtac ttacttcatc 240
ggtacaagaa aggttttgga attagaatat tcaactggta aagcatctca agaaagagtt 300
attcaagcta tgaatgcacc agaacacatg aaatacagaa gattaactca aggttggttc 360
caacctaaaa atttgagaaa attggatgaa agattcagaa gaatcgcaag aggttatgtt 420
gatcaaatgg ttgaattggg tggtgaatgt gaatttttcc atgctattgg tgttagatac 480
ccattgttag ttattatgtc aatcttgggt ttgccagatg atgctgaagc ctttatgatg 540
agattgactc aaaacgttac aaacatggat gatgctgaat tgacaggttt accagctcca 600
aaaactgcag aagaaagagc acaaagatca ttagcaatgt ctaacgaagc tagagtttac 660
ttcgatgaat tgtcaagagc tagaagagca tctccaactg atgatgtttc aacattgatc 720
gctaacgcaa caatcgaagg taaaccaatt tctgaaccag atattttggg ttactacatg 780
actgttgcta ttgcaggtca tgatactaca tctgcatcat tgtctggtgc tatttgggct 840
ttagcagaaa gaccagctga attggcaaaa gttaaggcag atttgtcatt aatcccaaat 900
ttggttgaag aagctgttag atggactaca ccaattactc atttcttgag aacagcagtt 960
agagatactg tttttagagg tcaaccaatt gctaagggtg actacgtttt gttgtcatac 1020
acttctggta acagagatga agaagttttc gatgatccat tcgagtttaa agttggtaga 1080
aagaaaaatg aacaagttgc attcggttat ggtccacatg tttgtttggg tcaacatttg 1140
gctagaatgg aaatgaacat tttctttgaa gaattgttgc caagattgaa atctttggaa 1200
ttagctggta caccacaaag aaagatcact tcttcaatgg gtggtccaaa atctgttcca 1260
attagatacc aaatgtcaca tcatcatcat catcat 1296
<210> 2
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 2
atggctaaat tgaatgttgt tactagagaa ggtcaagaag ttgttttgga aggtgaagaa 60
ggtttgtctg ttatggaaat catcagagat ggtggtatcg atgaattgtt agctttgtgt 120
ggtggttgtt gttcttgtgc aacatgtcat gttcatgttg atccagcttt tgcagataaa 180
ttaccaccaa tttcagaaga tgaaaacgat ttgttagatt cttcagatca tagaaacgat 240
caatcaagat tgtcatgtca attgactttt tcagctgaat tggatggttt aagagttaca 300
attgcaccag aagatcatca tcatcatcat cat 333
<210> 3
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的
<400> 3
atggatcatt acgatgtttt gatcgttggt gctggtcatg gtggtgcaca agctgcagtt 60
tctttaagac aattgaactt cgaaggttca atcggtttgt taggtgacga agctgatcca 120
ccatacgaaa gaccaccatt gtctaaggaa tacttctcag gtgaaaagac tttcgaaaga 180
attttgatca gaccagcttc tttttggggt gacagaaacg tttcattgtt attgaacaga 240
agagttactg ctgttgatgt tccaggtcat agagttacat tagcagatgg ttcttcatta 300
tcttacggta aattgatttg ggctactggt ggtgcaccaa gaagattatc atgtgttggt 360
ggtgacttga aaggtgttca tggtgttaga acaagagttg atgcagatgc tatgttgtct 420
gaaatcgaat cagttgaaca agttgttgtt attggtggtg gttatattgg tttagaagct 480
gcagctgttt tgtctaagtt cggtaaacat gttactgttt tggaagcatt ggatagagtt 540
ttagcaagag ttgctggtga accattgtca agattctacg aaaacgaaca tagagcacat 600
ggtgttgatg ttagattgaa tgcaatggtt actgaaattg agggtaaaga tggtcatgtt 660
tctggtgtta aattgggtga cggtacaatt ttgccagctc aaatggttat tgtcggtatc 720
ggtatcattc cagctgttga accattaatt gcagctggtg cagttggttc taatggtgtt 780
gatgttgatg aacattgtca aacatcattg ccagatatat atgctattgg tgactgtgca 840
gctcatgtta atggttttgc agctgatgct agaattagat tagaatctgt tcaaaacgca 900
aacgatcaag caactacagc tgttaaagca attgttggtc aaccacaacc atatcatgct 960
gttccttggt tttggtctaa tcaatacgat ttgagattgc aaactgttgg tttgtcaaca 1020
ggttttgatg aagttgttca aagaggtgac ccagcagcta gatcattttc tatcgtttat 1080
ttgagaaatg gtaaagttat tgctttggat tgtgttaacg cagttaagga ttacgttcaa 1140
ggtagagctt tagttactgg tggtattgca ccagctaaag atgcattggc taacccagaa 1200
atcccattga agacattggt tccagcacat catcatcatc atcat 1245
<210> 4
<211> 2710
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 4
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt acctcgcgaa 420
tgcatctaga tatcggatcc cgggcccgtc gactgcagag gcctgcatgc aagcttggcg 480
taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac 540
atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca 600
ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat 660
taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc 720
tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 780
aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 840
aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 900
ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 960
acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 1020
ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 1080
tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 1140
tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 1200
gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 1260
agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 1320
tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 1380
agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 1440
tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 1500
acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta 1560
tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa 1620
agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc 1680
tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact 1740
acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc 1800
tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt 1860
ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta 1920
agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg 1980
tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt 2040
acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc 2100
agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt 2160
actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc 2220
tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc 2280
gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa 2340
ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac 2400
tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa 2460
aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt 2520
tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa 2580
tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct 2640
gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg 2700
ccctttcgtc 2710
<210> 5
<211> 7667
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 5
agatctaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag 60
gtccattctc acacataagt gccaaacgca acaggagggg atacactagc agcagaccgt 120
tgcaaacgca ggacctccac tcctcttctc ctcaacaccc acttttgcca tcgaaaaacc 180
agcccagtta ttgggcttga ttggagctcg ctcattccaa ttccttctat taggctacta 240
acaccatgac tttattagcc tgtctatcct ggcccccctg gcgaggttca tgtttgttta 300
tttccgaatg caacaagctc cgcattacac ccgaacatca ctccagatga gggctttctg 360
agtgtggggt caaatagttt catgttcccc aaatggccca aaactgacag tttaaacgct 420
gtcttggaac ctaatatgac aaaagcgtga tctcatccaa gatgaactaa gtttggttcg 480
ttgaaatgct aacggccagt tggtcaaaaa gaaacttcca aaagtcggca taccgtttgt 540
cttgtttggt attgattgac gaatgctcaa aaataatctc attaatgctt agcgcagtct 600
ctctatcgct tctgaacccc ggtgcacctg tgccgaaacg caaatgggga aacacccgct 660
ttttggatga ttatgcattg tctccacatt gtatgcttcc aagattctgg tgggaatact 720
gctgatagcc taacgttcat gatcaaaatt taactgttct aacccctact tgacagcaat 780
atataaacag aaggaagctg ccctgtctta aacctttttt tttatcatca ttattagctt 840
actttcataa ttgcgactgg ttccaattga caagcttttg attttaacga cttttaacga 900
caacttgaga agatcaaaaa acaactaatt attcgaaacg gaattccgga ccggcatgcc 960
aaggcctcag gtaccggccg gccatttaaa tacaggcccc ttttcctttg tcgatatcat 1020
gtaattagtt atgtcacgct tacattcacg ccctcctccc acatccgctc taaccgaaaa 1080
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gcatgtaaca ttatactgaa aaccttgctt gagaaggttt tgggacgctc gaaggcttta 1260
atttgcaagc tggatccgcg gccgccttcc aaactctcat ggattctcag gtaataggta 1320
ttctaggagg aggccagcta ggccgaatga ttgttgaggc cgctagcagg ctcaatatca 1380
agaccgtgat tcttgatgat ggtttttcac ctgctaagca cattaatgct gcgcaagacc 1440
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ggactatggc ttatgatgga agaggcaatt ttgtagtgga gtctaaagag gacatcagta 1800
aggcattaga gttcttgaaa gatcgtccat tgtatgccga gaagtttgct ccttttgtta 1860
aagaattagc ggtaatggtt gtgagatcac tggaaggcga agtattctcc tacccaaccg 1920
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ctggaatctt cggagttgag atgttcctat tgtctgatgg agaacttctt gtaaatgaga 2100
ttgctccaag gccccacaat tctggtcact atacaatcga tgcatgtgta acatctcagt 2160
tcgaagcaca tgtaagagcc ataactggtc tgccaatgcc actagatttc accaaactat 2220
ctacttccaa caccaacgct attatgctca atgttttggg tgctgaaaaa tctcacgggg 2280
aattagagtt ttgtagaaga gccttagaaa cacccggtgc ttctgtatat ctgtacggaa 2340
agaccacccg attggctcgt aagatgggtc atatcaacat aataggatct tccatgttgg 2400
aagcagaaca aaagttagag tacattctag aagaatcaac ccacttacca tccagtactg 2460
tatcagctga cactaaaccg ttggttggag ttatcatggg ttcagactct gatctacctg 2520
tgatttcgaa aggttgcgat attttaaaac agtttggtgt tccattcgaa gttactattg 2580
tctctgctca tagaacacca cagagaatga ccagatatgc ctttgaagcc gctagtagag 2640
gtatcaaggc tatcattgca ggtgctggtg gtgctgctca tcttccagga atggttgctg 2700
ccatgactcc gttgccagtc attggtgttc ctgtcaaggg ctctacgttg gatggtgtag 2760
actcgctaca ctcgattgtc caaatgccta gaggtgttcc tgtggctacg gttgctatca 2820
acaacgccac caatgccgct ctgttggcca tcaggatttt aggtacaatt gaccacaaat 2880
ggcaaaagga aatgtccaag tatatgaatg caatggagac cgaagtgttg gggaaggcat 2940
ccaacttgga atctgaaggg tatgaatcct atttgaagaa tcgtctttga atttagtatt 3000
gttttttaat agatgtatat ataatagtac acgtaactta tctattccat tcataatttt 3060
attttaaagg ttcggtagaa atttgtcctc caaaaagttg gttagagcct ggcagttttg 3120
ataggcatta ttatagattg ggtaatattt accctgcacc tggaggaact ttgcaaagag 3180
cctcatgtgc ggcgcgccag gccataatgg ccaaacggtt tctcaattac tatatactac 3240
taaccattta cctgtagcgt atttcttttc cctcttcgcg aaagctcaag ggcatcttct 3300
tgactcatga aaaatatctg gatttcttct gacagatcat cacccttgag cccaactctc 3360
tagcctatga gtgtaagtga tagtcatctt gcaacagatt attttggaac gcaactaaca 3420
aagcagatac acccttcagc agaatccttt ctggatattg tgaagaatga tcgccaaagt 3480
cacagtcctg agacagttcc taatctttac cccatttaca agttcatcca atcagacttc 3540
ttaacgcctc atctggctta tatcaagctt accaacagtt cagaaactcc cagtccaagt 3600
ttcttgcttg aaagtgcgaa gaatggtgac accgttgaca ggtacacctt tatgggacat 3660
tcccccagaa aaataatcaa gactgggcct ttagagggtg ctgaagttga ccccttggtg 3720
cttctggaaa aagaactgaa gggcaccaga caagcgcaac ttcctggtat tcctcgtcta 3780
agtggtggtg ccataggata catctcgtac gattgtatta agtactttga accaaaaact 3840
gaaagaaaac tgaaagatgt tttgcaactt ccggaagcag ctttgatgtt gttcgacacg 3900
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gttgatgact cggacgaagc tattcttgag aaatattata agacaagaga agaagtggaa 4020
aagatcagta aagtggtatt tgacaataaa actgttccct actatgaaca gaaagatatt 4080
attcaaggcc aaacgttcac ctctaatatt ggtcaggaag ggtatgaaaa ccatgttcgc 4140
aagctgaaag aacatattct gaaaggagac atcttccaag ctgttccctc tcaaagggta 4200
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gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc 5460
gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag 5520
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agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg 6060
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aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta 6180
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cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga 6300
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cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc 6420
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gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac 6540
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gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc 900
tatctcgggc tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggcct attggttaaa 960
aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattttaac aaaatattaa cgtttacaat 1020
ttcatcgtca ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt 1080
ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata 1140
atattgaaaa aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt 1200
tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc 1260
tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat 1320
ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct 1380
atgtggcgcg gtattatccc gtgttgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca 1440
ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg 1500
catgacagta agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa 1560
cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg 1620
ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga 1680
cgagcgtgac accacgatgc ctgcagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg 1740
cgaactactt actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt 1800
tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg 1860
agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc 1920
ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca 1980
gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc 2040
atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat 2100
cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc 2160
agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg 2220
ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct 2280
accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct 2340
tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct 2400
cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg 2460
gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc 2520
gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga 2580
gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg 2640
cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta 2700
tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg 2760
ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg 2820
ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat 2880
taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc 2940
agtgagcgag gaagcggaag agcgcctgat gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg 3000
tatttcacac cgcataatgg tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa 3060
gccagtatac actccgctat cgctacgtga ctgggtcatg gctgcgcccc gacacccgcc 3120
aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc 3180
tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc 3240
gaggcagaac gccatcaaaa ataattcgcg tctggccttc ctgtagccag ctttcatcaa 3300
cattaaatgt gagcgagtaa caacccgtcg gattctccgt gggaacaaac ggcggattga 3360
ccgtaatggg ataggtcacg ttggtgtaga tgggcgcatc gtaaccgtgc atctgccagt 3420
ttgaggggac gacgacagta tcggcctcag gaagatcgca ctccagccag ctttccggca 3480
ccgcttctgg tgccggaaac caggcaaagc gccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt 3540
gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca gctggcgaaa gggggatgtg 3600
ctgcaaggcg attaagttgg gtaacgccag ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga 3660
cggccagtga atccgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc 3720
acaattccac acattatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga 3780
gtgagctaac ttacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg 3840
tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg 3900
cgccagggtg gtttttcttt tcaccagtga gacgggcaac agctgattgc ccttcaccgc 3960
ctggccctga gagagttgca gcaagcggtc cacgctggtt tgccccagca ggcgaaaatc 4020
ctgtttgatg gtggttaacg gcgggatata acatgagctg tcttcggtat cgtcgtatcc 4080
cactaccgag atatccgcac caacgcgcag cccggactcg gtaatggcgc gcattgcgcc 4140
cagcgccatc tgatcgttgg caaccagcat cgcagtggga acgatgccct cattcagcat 4200
ttgcatggtt tgttgaaaac cggacatggc actccagtcg ccttcccgtt ccgctatcgg 4260
ctgaatttga ttgcgagtga gatatttatg ccagccagcc agacgcagac gcgccgagac 4320
agaacttaat gggcccgcta acagcgcgat ttgctggtga cccaatgcga ccagatgctc 4380
cacgcccagt cgcgtaccgt cttcatggga gaaaataata ctgttgatgg gtgtctggtc 4440
agagacatca agaaataacg ccggaacatt agtgcaggca gcttccacag caatggcatc 4500
ctggtcatcc agcggatagt taatgatcag cccactgacg cgttgcgcga gaagattgtg 4560
caccgccgct ttacaggctt cgacgccgct tcgttctacc atcgacacca ccacgctggc 4620
acccagttga tcggcgcgag atttaatcgc cgcgacaatt tgcgacggcg cgtgcagggc 4680
cagactggag gtggcaacgc caatcagcaa cgactgtttg cccgccagtt gttgtgccac 4740
gcggttggga atgtaattca gctccgccat cgccgcttcc actttttccc gcgttttcgc 4800
agaaacgtgg ctggcctggt tcaccacgcg ggaaacggtc tgataagaga caccggcata 4860
ctctgcgaca tcgtataacg ttactggttt cacattcacc accctgaatt gactctcttc 4920
cgggcgctat catgccatac cgcgaaaggt tttgcaccat tcgatggtgt cctggcacga 4980
caggtttccc gactggaaag cgggcagtga gcgcaacgca atta 5024
<210> 10
<211> 6164
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 10
ggtctcaccc tgaattcgca tctagatggt agagccacaa acagccggta caagcaacga 60
tctccaggac catctgaatc atgcgcggat gacacgaact cacgacggcg atcacagaca 120
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tttaattctg ctgtaacccg tacatgccca aaataggggg cgggttacac agaatatata 360
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gctttttaag ctggcatcca gaaaaaaaaa gaatcccagc accaaaatat tgttttcttc 480
accaaccatc agttcatagg tccattctct tagcgcaact acagagaaca ggggcacaaa 540
caggcaaaaa acgggcacaa cctcaatgga gtgatgcaac ctgcctggag taaatgatga 600
cacaaggcaa ttgacccacg catgtatcta tctcattttc ttacaccttc tattaccttc 660
tgctctctct gatttggaaa aagctgaaaa aaaaggttga aaccagttcc ctgaaattat 720
tcccctactt gactaataag tatataaaga cggtaggtat tgattgtaat tctgtaaatc 780
tatttcttaa acttcttaaa ttctactttt atagttagtc ttttttttag ttttaaaaca 840
ccaagaactt agtttcgaat aaacacacat aaacaaacaa aagatcatgg ttgaagcatt 900
gacaattgat agagttccag atcatattgc tagagcagtt gttgatccac atgcttatgc 960
agaatgggat ggtttacatg ctatgttggc agaattaaga agagaacatc catttgctag 1020
agcagatttg gaaggttacg atccattttg ggttgcttct aaacatgcag atattcaaga 1080
agtttgtaga agacatgatt tgtaccaaaa cggtacttac ttcatcggta caagaaaggt 1140
tttggaatta gaatattcaa ctggtaaagc atctcaagaa agagttattc aagctatgaa 1200
tgcaccagaa cacatgaaat acagaagatt aactcaaggt tggttccaac ctaaaaattt 1260
gagaaaattg gatgaaagat tcagaagaat cgcaagaggt tatgttgatc aaatggttga 1320
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aagagctaga agagcatctc caactgatga tgtttcaaca ttgatcgcta acgcaacaat 1620
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agctgaattg gcaaaagtta aggcagattt gtcattaatc ccaaatttgg ttgaagaagc 1800
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gaacattttc tttgaagaat tgttgccaag attgaaatct ttggaattag ctggtacacc 2100
acaaagaaag atcacttctt caatgggtgg tccaaaatct gttccaatta gataccaaat 2160
gtcagattac aaggacgatg atgataagga ctacaaagat gatgatgaca aagattataa 2220
ggacgatgat gataaaggtc atcatcatca tcatcactaa ctcgagataa agcaatcttg 2280
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gtgatgacgt aaataagtac atattacttt ttaagccaag acaagattaa gcattaactt 2400
tacccttttc tttctaagtt tcaatattag ttatcactgt ttaaaagtta tggcgagaac 2460
gtcggcggtt aaaatatatt accctgaacg gctgtgagac cagtagtgat tttcctaact 2520
ttatttagtc aaaaaattag ccttttaatt ctgctgtaac ccgtacatgc ccaaaatagg 2580
gggcgggtta cacagaatat ataacatcgt aggtgtctgg gtgaacagtt tattcctggc 2640
atccactaaa tataatggag cccgcttttt aagctggcat ccagaaaaaa aaagaatccc 2700
agcaccaaaa tattgttttc ttcaccaacc atcagttcat aggtccattc tcttagcgca 2760
actacagaga acaggggcac aaacaggcaa aaaacgggca caacctcaat ggagtgatgc 2820
aacctgcctg gagtaaatga tgacacaagg caattgaccc acgcatgtat ctatctcatt 2880
ttcttacacc ttctattacc ttctgctctc tctgatttgg aaaaagctga aaaaaaaggt 2940
tgaaaccagt tccctgaaat tattccccta cttgactaat aagtatataa agacggtagg 3000
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gtcttttttt tagttttaaa acaccaagaa cttagtttcg aataaacaca cataaacaaa 3120
caaaagatca tggctaaatt gaatgttgtt actagagaag gtcaagaagt tgttttggaa 3180
ggtgaagaag gtttgtctgt tatggaaatc atcagagatg gtggtatcga tgaattgtta 3240
gctttgtgtg gtggttgttg ttcttgtgca acatgtcatg ttcatgttga tccagctttt 3300
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gatgatgaca aagattataa ggacgatgat gataaaggtc atcatcatca tcatcactaa 3540
ctcgagataa agcaatcttg atgaggataa tgattttttt ttgaatatac ataaatacta 3600
ccgtttttct gctagatttt gtgatgacgt aaataagtac atattacttt ttaagccaag 3660
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ttaaaagtta tggcgagaac gtcggcggtt aaaatatatt accctgaacg gctgtgagac 3780
cagtagtgat tttcctaact ttatttagtc aaaaaattag ccttttaatt ctgctgtaac 3840
ccgtacatgc ccaaaatagg gggcgggtta cacagaatat ataacatcgt aggtgtctgg 3900
gtgaacagtt tattcctggc atccactaaa tataatggag cccgcttttt aagctggcat 3960
ccagaaaaaa aaagaatccc agcaccaaaa tattgttttc ttcaccaacc atcagttcat 4020
aggtccattc tcttagcgca actacagaga acaggggcac aaacaggcaa aaaacgggca 4080
caacctcaat ggagtgatgc aacctgcctg gagtaaatga tgacacaagg caattgaccc 4140
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caagagttga tgcagatgct atgttgtctg aaatcgaatc agttgaacaa gttgttgtta 4860
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cagctggtgc agttggttct aatggtgttg atgttgatga acattgtcaa acatcattgc 5220
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ttgttggtca accacaacca tatcatgctg ttccttggtt ttggtctaat caatacgatt 5400
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gcatatcaca acagtccaac tagtgcactg cagtacatga gacc 6164

Claims (20)

1.一种家畜饲料组合物，其包括来源于在存在表达酶以减轻霉菌毒素污染的微生物或包括表达酶以减轻霉菌毒素污染的微生物的细胞裂解物的情况下发酵的原料的酒糟，其中相对于从在不存在表达酶以减轻霉菌毒素污染的微生物或包括表达酶以减轻霉菌毒素污染的微生物的细胞裂解物的情况下发酵的原料获得的家畜饲料组合物中的霉菌毒素的水平，所述家畜饲料组合物中的所述霉菌毒素的水平降低。
2.一种家畜饲料组合物，其包括来源于用酶处理以减轻霉菌毒素污染的发酵后酒糟、湿饼和/或糖浆流的酒糟，其中相对于从未经处理的发酵后酒糟、湿饼和/或糖浆流获得的家畜饲料组合物中的霉菌毒素的水平，所述家畜饲料组合物中的所述霉菌毒素的水平降低，并且其中所述酶是通过用表达酶以减轻霉菌毒素污染的微生物接种发酵后酒糟、湿饼和/或糖浆流或通过将包括表达酶以减轻霉菌毒素污染的微生物的细胞裂解物添加到所述发酵后酒糟、湿饼和/或糖浆流中来获得的。
3.一种家畜饲料组合物，其包括来源于用酶处理以减轻霉菌毒素污染的啤酒的酒糟，其中相对于从未经处理的啤酒获得的家畜饲料组合物中的霉菌毒素的水平，所述家畜饲料组合物中的所述霉菌毒素的水平降低，并且其中所述酶是通过用表达酶以减轻霉菌毒素污染的微生物接种啤酒或通过将包括表达酶以减轻霉菌毒素污染的微生物的细胞裂解物添加到所述啤酒中来获得的。
4.根据权利要求1所述的家畜饲料组合物，其中所述霉菌毒素选自由以下组成的组：黄曲霉毒素、赭曲霉素A、棒曲霉素、T-2、HT-2、白僵菌素、新茄镰孢菌醇、瓜萎镰菌醇、脱氧瓜萎镰菌醇、3-ADON、单端孢霉烯、赭曲霉素和玉米烯酮。
5.根据权利要求1所述的家畜饲料组合物，其中所述酶选自由以下组成的组：黄曲霉毒素氧化酶、3-O乙酰转移酶、过氧化物酶、F420H2依赖性还原酶、Ery4、UDP-糖基转移酶、漆酶、锰过氧化物酶、脱氧瓜萎镰菌醇羟化酶、木聚糖酶、DepA/DepB、内酯水解酶、玉米烯酮水解酶和2cys-过氧化物还原酶。
6.根据权利要求1所述的家畜饲料组合物，其中所述微生物是酵母。
7.根据权利要求1所述的家畜饲料组合物，其中所述酶由酵母宿主细胞表达。
8.根据权利要求1所述的家畜饲料组合物，其中所述霉菌毒素的水平小于约10ppm。
9.一种发酵方法，所述方法包括用一种或多种酵母菌株接种原料，其中至少一种酵母菌株表达一种或多种霉菌毒素减轻酶。
10.根据权利要求9所述的方法，其进一步包括发酵所述原料以产生乙醇和酒糟。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述霉菌毒素减轻酶是脱氧瓜萎镰菌醇羟化酶。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述原料被脱氧瓜萎镰菌醇污染。
13.根据权利要求11所述的方法，其中相对于从在不存在表达脱氧瓜萎镰菌醇羟化酶的酵母的情况下发酵的原料获得的酒糟中的脱氧瓜萎镰菌醇的水平，所述酒糟中的所述脱氧瓜萎镰菌醇的水平降低。
14.一种减轻家畜饲料中的霉菌毒素污染的方法，所述方法包括：
(i)在存在表达选自由以下组成的组的酶的微生物的情况下发酵原料：黄曲霉毒素氧化酶、3-O乙酰转移酶、过氧化物酶、F420H2依赖性还原酶、Ery4、UDP-糖基转移酶、漆酶、锰过氧化物酶、脱氧瓜萎镰菌醇羟化酶、内酯水解酶、玉米烯酮水解酶、木聚糖酶、DepA/DepB和2cys-过氧化物还原酶；
(ii)使发酵后酒糟、湿饼和/或糖浆流与选自由以下组成的组的酶接触：黄曲霉毒素氧化酶、3-O乙酰转移酶、过氧化物酶、F420H2依赖性还原酶、Ery4、UDP-糖基转移酶、漆酶、锰过氧化物酶、脱氧瓜萎镰菌醇羟化酶、内酯水解酶、玉米烯酮水解酶、木聚糖酶、DepA/DepB和2cys-过氧化物还原酶；或
(iii)使啤酒与选自由以下组成的组的酶接触：黄曲霉毒素氧化酶、3-O乙酰转移酶、过氧化物酶、F420H2依赖性还原酶、Ery4、UDP-糖基转移酶、漆酶、锰过氧化物酶、脱氧瓜萎镰菌醇羟化酶、内酯水解酶、玉米烯酮水解酶、木聚糖酶、DepA/DepB和2cys-过氧化物还原酶。
15.根据权利要求14(b)所述的方法，其中相对于从未经处理的发酵后酒糟、湿饼和/或糖浆流获得的家畜饲料组合物中的霉菌毒素的水平，所述家畜饲料组合物中的所述霉菌毒素的水平降低，其中所述酶是通过用表达酶以减轻霉菌毒素污染的微生物接种发酵后酒糟、湿饼和/或糖浆流或通过将包括表达酶以减轻霉菌毒素污染的微生物的细胞裂解物添加到所述发酵后酒糟、湿饼和/或糖浆流中来获得的。
16.根据权利要求14(c)所述的方法，其中相对于从未经处理的蒸馏前完整酒糟获得的家畜饲料组合物中的霉菌毒素的水平，所述家畜饲料组合物中的所述霉菌毒素的水平降低，并且其中所述酶是通过用表达酶以减轻霉菌毒素污染的微生物接种啤酒或通过将包括表达酶以减轻霉菌毒素污染的微生物的细胞裂解物添加到所述啤酒中来获得的。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述使啤酒与酶接触的步骤包括裂解表达所述酶的酵母并将所述裂解物添加到所述啤酒中。
18.一种载体，其包括：
(i)SEQ ID NO:1的核酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少约95％序列同一性的核酸，所述核酸序列或所述核酸编码脱氧瓜萎镰菌醇羟化酶(Ddna)；或
(ii)SEQ ID NO:10的核酸序列或与SEQ ID NO:10具有至少约95％序列同一性的核酸。
19.根据权利要求18所述的载体，其进一步包括一个或多个编码KdR基因、KdX基因或Ddna基因的核酸序列。
20.一种微生物，其表达根据权利要求18所述的载体。
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