CN108026538B - 猪圆环病毒2型的外鞘蛋白质的制备方法及含该外鞘蛋白质的医药组合物 - Google Patents

猪圆环病毒2型的外鞘蛋白质的制备方法及含该外鞘蛋白质的医药组合物 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种猪圆环病毒2型的外鞘蛋白质的制备方法及含该外鞘蛋白质的医药组合物。所述制备方法通过使用阿拉伯糖诱导表达载体进行猪圆环病毒2型的外鞘蛋白质的表达。

Description

猪圆环病毒2型的外鞘蛋白质的制备方法及含该外鞘蛋白质 的医药组合物
技术领域
本发明关于一种猪圆环病毒2型的外鞘蛋白质的制备方法；尤指一种使用原核细胞表达系统的猪圆环病毒2型的外鞘蛋白质的制备方法。
背景技术
猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2；PCV2)为影响全球养猪产业甚巨的病毒性病原，其主要造成猪离乳后多系统消耗症候群(post-weaning multisystemicwasting syndrome,PMWS)，临床症状为发烧、淋巴结肿大、体重减轻或消弱、呼吸困难、下痢、苍白及偶发黄疸等症状。另可能引发猪皮肤炎肾病症候群(porcine dermatitis andnephropathy syndrome,PDNS)、先天性震颤(infectious congenital tremor,ICT)及繁殖障碍。此外，PCV2与其他病毒性或细菌性病原混合感染猪只则会引起呼吸道疾病综合症(porcine respiratory disease complex,PRDC)。猪只感染PCV2所引发的疾病会造成育成率与饲料换肉率降低，进而造成养猪业者的严重经济损失。
领域中针对PCV2的预防与控制提出20点饲养管理要点，如统进统出、良好卫生管理、病情严重者淘汰或隔离及疫苗接种等。其中疫苗接种可有效降低PCV2感染率，进而提升育成率。目前领域中的PCV2疫苗分为三类，包括灭活PCV2疫苗、灭活杆状病毒亚单位疫苗及灭活猪圆环病毒1型与2型(PCV1-PCV2)嵌合病毒疫苗(Beach and Meng,2012；Chanhee,2012)。
灭活PCV2疫苗是将PCV2感染猪肾细胞株PK-15后，收取病毒液经灭活处理与混合佐剂所制成；灭活杆状病毒亚单位苗是将带有PCV2外鞘蛋白质(capsid protein)ORF2基因的杆状病毒转染昆虫细胞后，进行免疫原ORF2的表达。若抗原表达于细胞内，疫苗制备的方式是将含有细胞的培养液进行超声波破碎处理，再经灭活处理与混合佐剂制成。若抗原分泌至胞外，则进行细胞培养上清液的收集，再经病毒载体的灭活处理与混合佐剂制成疫苗；灭活PCV1-PCV2嵌合病毒疫苗是将PCV1中的ORF2置换为PCV2的ORF2并进行细胞感染、病毒液收取、病毒灭活及混合佐剂所制成。
综观目前PCV2疫苗的生产方式皆是以培养病毒的方式进行，因而具有制备时间长且生产成本高的缺点。为降低疫苗成本，领域中研究人员尝试利用培养成本较低的重组大肠杆菌进行疫苗抗原ORF2的生产，但仍遭遇ORF2产量低落、重组ORF2无法形成类病毒颗粒(virus-like particle)、制备过程复杂或免疫效果不佳的瓶颈。
发明内容
爰是，本发明的一个目的为提供一种制备猪圆环病毒2型的外鞘蛋白质的方法，以降低PCV2疫苗的生产时间及成本。
本发明的另一个目的为提供一种防治猪圆环病毒2型感染的组合物，其以猪圆环病毒2型的外鞘蛋白质作为活性成分，并包含合适的佐剂，从而提供产业防治猪圆环病毒2型感染的工具。
本发明的又一个目的为提供一种制备猪干扰素的方法，以降低生产猪干扰素所需的时间及成本，而有利于应用猪干扰素于防治猪圆环病毒2型感染的组合物。
为了达到上述目的，本发明提供一种表达蛋白质的方法，其包含：(a)取得阿拉伯糖诱导表达载体；其中前述阿拉伯糖诱导表达载体包含表达元件及目标蛋白质的核苷酸序列；其中前述表达元件包含：启动子；T7噬菌体转译增强元件，其具有SEQ ID NO：01所示序列；及核糖体结合部位，其具有SEQ ID NO：02所示序列；(b)将前述阿拉伯糖诱导表达载体转化至大肠杆菌宿主中，并进行目标蛋白质的诱导表达；其中前述目标蛋白质为：猪圆环病毒2型的外鞘蛋白质或猪干扰素。
较佳地，前述启动子的-16部位具有SEQ ID NO：03所示序列。
较佳地，前述表达元件具有SEQ ID NO：04所示序列。
较佳地，前述阿拉伯糖诱导表达载体进一步包含融合伴侣的核苷酸序列、及/或标记分子的核苷酸序列。较佳地，前述融合伴侣为：大肠杆菌MsyB、大肠杆菌YjgD基因、λ(Lambda)噬菌体D蛋白质、面包酵母菌SUMO蛋白质、或其组合。较佳地，前述标记分子为：His标签、Strep II标签、FLAG标签、或其组合。
较佳地，前述目标蛋白质为猪圆环病毒2型的外鞘蛋白质，且其核苷酸序列具有SEQ ID NO：09或SEQ ID NO：24所示序列。较佳地，前述阿拉伯糖诱导表达载体具有SEQ IDNO：46所示序列。
较佳地，前述猪干扰素为猪干扰素α或猪干扰素γ。较佳地，前述目标蛋白质为猪干扰素，且其核苷酸序列具有SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：76所示序列。较佳地，前述阿拉伯糖诱导表达载体具有SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：87、或SEQ ID NO：95所示序列。较佳地，前述方法不包含前述猪干扰素的折叠步骤。
较佳地，前述步骤(b)之后进一步包含步骤(c)：纯化前述目标蛋白质。较佳地，前述步骤(c)之后进一步包含步骤(d)：以SUMO蛋白酶处理前述目标蛋白质。较佳地，步骤(d)的处理中，前述目标蛋白质与前述SUMO蛋白酶的重量比值为4至20。
本发明又提供一种防治猪圆环病毒2型感染的组合物，其包含：2.5至250μg/mL的猪圆环病毒2型的外鞘蛋白质；2.5至25μg/mL的猪干扰素α；2.5至25μg/mL的猪干扰素γ；及医药可接受的载剂。
较佳地，前述组合物进一步包含医药可接受的佐剂。较佳地，前述医药可接受的佐剂为：MONTANIDETM ISA 536VG佐剂、MONTANIDETM GEL 01佐剂、弗氏完全或不完全佐剂、铝胶、表面活性剂、阴离子型聚合物、肽、油乳液、或其组合。
较佳地，前述组合物包含：3.5至170μg/mL的猪圆环病毒2型的外鞘蛋白质；5至20μg/mL的猪干扰素α；5至20μg/mL的猪干扰素γ；及医药可接受的载剂。
综上所述，本发明主要提供一种表达蛋白质的方法，其通过使用阿拉伯糖诱导表达载体表达蛋白质。本发明方法有助于以更高的效率合成猪圆环病毒2型的外鞘蛋白质及疫苗中作为佐剂使用的猪干扰素。另一方面，本发明医药组合物以合适比例组合前述外鞘蛋白质及其他有利成分而取得优异的免疫诱发效果。据此，本发明揭露内容对于领域中猪圆环病毒2型的防治工作有显著助益。
附图说明
图1为实施例一所制得的5个猪圆环病毒2型的外鞘蛋白质表达载体的示意图。
图2显示以蛋白质电泳及蛋白质印迹法(Western Blot)观察实施例一所制得的5个表达载体转化至大肠杆菌宿主后的蛋白质诱导表达情形。(A)蛋白质电泳结果。(B)蛋白质印迹法结果；泳道1：BL21(DE3)/pET29a；泳道2：BL21(DE3)/pET-SUMO-ORF2；泳道3：BL21(DE3)/pET-OPTSUMO-ORF2；泳道4：Rosetta2/pET-SUMO-ORF2；泳道5：BL21(DE3)/pET-SUMO-OPTORF2；泳道6：BL21(DE3)/pET-OPTSUMO-OPTORF2；泳道7：BL21/pBA-OPTSUMO-OPTORF2。
图3显示利用蛋白质电泳观察实施例一所制得的4个表达载体转化至大肠杆菌宿主后的融合蛋白可溶性表达情形。T：总细胞破碎物；S：可溶性蛋白质；IS：不可溶性蛋白质。箭头标示处为目标蛋白质。
图4为蛋白质电泳图，其显示利用固定化金属离子亲和层析法纯化pBA-OPTSUMO-OPTORF2于宿主细胞(E.coli BL21)表达的融合蛋白的结果。泳道1：E.coli BL21(pBA-OPTSUMO-OPTORF2)的总细胞破碎物；泳道2：经纯化的融合蛋白。
图5显示以蛋白质电泳及蛋白质印迹法观察实施例二中重组SUMO蛋白酶(SUMOPH)和重组D-SUMO蛋白酶(DSUMOPH)于宿主细胞【E.coli BL21(DE3)】中的表达情形。(A)蛋白质电泳结果。(B)蛋白质印迹法结果。T：总细胞破碎物；S：可溶性蛋白质；IS：不可溶性蛋白质。箭头标示处为目标蛋白质。
图6为蛋白质电泳图，其显示利用固定化金属离子亲和层析法纯化pET-SUMOPH及pET-D-SUMOPH于宿主细胞【E.coli BL21(DE3)】表达的重组蛋白酶的结果。泳道1：经纯化的SUMO蛋白酶(SUMOPH)；泳道2：经纯化的D-SUMO蛋白酶(DSUMOPH)。
图7为蛋白质电泳图，其显示重组SUMO-ORF2融合蛋白的纯化、剪切及过滤。泳道1：纯化的SUMO-ORF2融合蛋白。泳道2：经剪切的SUMO-ORF2融合蛋白。泳道3：经剪切及过滤(100kDa过滤膜)后取得的ORF2融合蛋白。
图8为穿透式电子显微镜影像，其显示SUMO-ORF2融合蛋白(A)、经蛋白酶剪切的重组SUMO-ORF2融合蛋白(B)、及经蛋白酶剪切再经过滤后所得的ORF2融合蛋白(C)形成类病毒颗粒的影像。
图9为蛋白质电泳图，其显示实施例三的重组猪干扰素的表达情形；T：总细胞破碎物；S：可溶性蛋白质。(A)pET-OPTPIFNAH/E.coli Shuffle；(B)pBA-OPTPIFNAH/E.coliShuffle；(C)pET-SUMO-OPTPIFNAH/E.coli Shuffle；(D)pET-OPTSUMO-OPTPIFNAH/E.coliShuffle；(E)pBA-OPTSUMO-OPTPIFNAH/E.coli Shuffle；(F)pET-OPTPIFNRH/E.coli BL21(DE3)；(G)pET-SUMO-OPTPIFNRH/E.coli BL21(DE3)；(H)pET-OPTSUMO-OPTPIFNRH/E.coliBL21(DE3)；(I)pBA-OPTSUMO-OPTPIFNRH/E.coli BL21(DE3)。箭头标示处为目标蛋白质。
图10为蛋白质电泳图，其显示实施例三的重组猪干扰素经表达后的纯化结果。泳道1：E.coli Shuffle(pET-OPTPIFNAH)表达所得的融合蛋白的纯化结果；泳道2：E.coliShuffle(pBA-OPTSUMO-OPTPIFNAH)表达所得的融合蛋白经D-SUMO蛋白酶【pET-D-SUMOP/E.coli BL21(DE3)细胞破碎物】剪切后再经纯化的结果；泳道3：E.coli BL21(DE3)(pET-OPTSUMO-OPTPIFNRH)表达所得的融合蛋白经D-SUMO蛋白酶【pET-D-SUMOP/E.coli BL21(DE3)细胞破碎物】剪切后再经纯化的结果。
图11为ELISA试验结果，其显示实施例四实验3中各样品于猪只中产生的抗PCV2抗体效价。
图12显示实施例四实验3中各样品降低猪只病毒血症的程度。
图13为ELISA试验结果，其显示实施例四实验4中各样品于猪只中产生的抗PCV2抗体效价。
图14显示实施例四实验4中各样品降低猪只病毒血症的程度。
图15为ELISA试验结果，其显示实施例四实验5中各样品于猪只中产生的抗PCV2抗体效价。
具体实施方式
如前所述，虽然领域中已尝试通过大肠杆菌表达系统生产猪圆环病毒2型的外鞘蛋白质，然而截至本发明申请时，仍未能克服产量过低的缺点，而阻碍猪圆环病毒2型防疫工作的精进。
本发明方法是采用本发明的申请人于中国台湾发明专利申请案第103146225号案(申请日：公元2014年12月30日)所揭露的阿拉伯糖诱导表达元件来制备猪圆环病毒2型的外鞘蛋白质。前述中国台湾专利第103146225号案的全部内容并入于本案中作为参考文献。
本文中所述“目标蛋白质”是指欲藉由原核细胞表达系统表达的蛋白质。于本发明中，前述目标蛋白质为猪圆环病毒2型的外鞘蛋白质、猪干扰素α、或猪干扰素γ。
本文中所述“目标蛋白质的核苷酸序列”或其他类似的叙述是指一核苷酸序列，其通过活体内或活体外的转录/转译机制后，可形成前述目标蛋白质。据此，本发明所述“猪圆环病毒2型的外鞘蛋白质的核苷酸序列”或“猪干扰素的核苷酸序列”亦定义如前。同理，本发明所述“融合伴侣的核苷酸序列”或“标记分子的核苷酸序列”亦定义如前。
本发明所述“融合伴侣”是指为利于提高合成的前述目标蛋白质的水溶性而使用的分子。为上述目的，将融合伴侣的核苷酸序列与前述目标蛋白质的核苷酸序列以遗传工程的方式构建于同一表达载体上，从而使前述目标蛋白质与前述融合伴侣合成为融合蛋白。前述融合伴侣例如但不限于：大肠杆菌MsyB、大肠杆菌YjgD、λ噬菌体D蛋白质、面包酵母菌SUMO蛋白质、或其组合。
本发明所述“标记分子”是指为利于观察前述目标蛋白质的合成或为利于纯化前述目标蛋白质所使用的分子。为上述目的，将标记分子的核苷酸序列与前述目标蛋白质的核苷酸序列以遗传工程的方式构建于同一表达载体上，从而使前述目标蛋白质与前述标记分子合成为融合蛋白。前述标记分子例如但不限于：His标签、Strep II标签、FLAG标签、或其组合。
本发明的第一个方面为一种制备猪圆环病毒2型的外鞘蛋白质、猪干扰素α、或猪干扰素γ的方法。前述方法包含(a)取得阿拉伯糖诱导表达载体；其中前述阿拉伯糖诱导表达载体包含表达元件及目标蛋白质的核苷酸序列；及(b)将前述阿拉伯糖诱导表达载体转化至大肠杆菌宿主中进行目标蛋白质的表达。
于一可行实施态样中，前述目标蛋白质为猪圆环病毒2型的外鞘蛋白质。于一可行实施态样中，前述目标蛋白质为猪干扰素α或猪干扰素γ。
于一较佳实施态样中，前述表达元件如本发明的申请人于中国台湾发明专利申请案第103146225号案(申请日：公元2014年12月30日)中所述者。具体而言，前述表达元件包含：启动子；T7噬菌体转译增强元件；及核糖体结合部位。举例来说，前述表达元件为中国台湾发明专利申请案第103146225号案中所述araB-M11表达元件。
在一较佳实施态样中，前述T7噬菌体转译增强元件具有SEQ ID NO：01所示序列。在一较佳实施态样中，前述核糖体结合部位具有SEQ ID NO：02所示序列。在一较佳实施态样中，前述启动子的-16部位具有SEQ ID NO：03所示序列。在一较佳实施态样中，前述表达元件具有SEQ ID NO：04所示序列。
于一可行实施态样中，其中前述步骤(b)之后进一步包含步骤(c)：纯化前述目标蛋白质。当于本发明方法中使用His标签作为前述标记分子时，可采用固定化金属离子亲和层析法(immobilized-metal ion affinity chromatography)纯化前述目标蛋白质。
于一可行实施态样中，当于本发明方法中使用SUMO蛋白质作为前述融合伴侣时，于前述步骤(c)之后进一步包含步骤(d)：以SUMO蛋白酶处理前述目标蛋白质。前述“处理”是指使前述SUMO蛋白酶剪切前述SUMO融合伴侣，以使前述目标蛋白质与前述SUMO蛋白质分离。
于一可行实施态样中，前述SUMO蛋白酶是通过T7表达载体而制得。于一较佳实施态样中，于前述处理中，前述目标蛋白质与前述SUMO蛋白酶的重量比值为4至20。
于一较佳实施态样中，前述方法不包含前述猪干扰素的折叠步骤。所属领域技术人员当可理解于原核细胞表达系统中的“折叠步骤”是指通过使用尿素或盐酸胍(guanidine hydrochloride)溶解包涵体，再经透析等步骤使所产出的肽折叠形成三级结构或四级结构的过程。从而所属领域技术人员当可理解本发明所述“不包含前述猪干扰素的折叠步骤”是指本发明方法中所制得的肽可自行折叠为所欲蛋白质，而无需前述使用尿素或盐酸胍、及透析等人为步骤。
于一可行实施态样中，前述宿主为大肠杆菌。较佳地，前述大肠杆菌为BL21、BL21(DE3)、Rosetta2、或Shuffle。
本发明的第二个方面为一种防治猪圆环病毒2型感染的组合物，其包含：猪圆环病毒2型的外鞘蛋白质、猪干扰素α、猪干扰素γ、及医药可接受的载剂。
于一较佳实施态样中，前述防治猪圆环病毒2型感染的组合物包含：2.5至250μg/mL的猪圆环病毒2型的外鞘蛋白质；2.5至25μg/mL的猪干扰素α；2.5至25μg/mL的猪干扰素γ；及医药可接受的载剂。又于另一更佳实施态样中，前述防治猪圆环病毒2型感染的组合物包含：3.5至170μg/mL的猪圆环病毒2型的外鞘蛋白质；5至20μg/mL的猪干扰素α；5至20μg/mL的猪干扰素γ；及医药可接受的载剂。
于一较佳实施态样中，前述猪圆环病毒2型的外鞘蛋白质是按照本发明方法所制得的。于一较佳实施态样中，前述猪干扰素α、及/或前述猪干扰素γ是按照本发明方法所制得的。
本发明所述“医药可接受的载剂”是指从医学/药学的观点而论，不对前述猪圆环病毒2型的外鞘蛋白质、前述猪干扰素α、及/或前述猪干扰素γ于前述组合物防治猪圆环病毒2型感染的目的上产生负面影响的物质。于一可行实施态样中，前述医药可接受的载剂例如，但不限于：水、磷酸缓冲食盐水、醇、甘油、甲壳素、海藻酸盐、软骨素、维生素E、矿物质、或其组合。
于一较佳实施态样中，前述组合物进一步包含医药可接受的佐剂。本发明所述“医药可接受的佐剂”是指从医学/药学的观点而论，有助于前述猪圆环病毒2型的外鞘蛋白质、前述猪干扰素α、及/或前述猪干扰素γ于前述组合物防治猪圆环病毒2型感染的目的上产生免疫增强效果的物质。于一可行实施态样中，前述医药可接受的载剂例如，但不限于：MONTANIDETM ISA 536VG佐剂、MONTANIDETM GEL01佐剂、弗氏完全或不完全佐剂、铝胶、表面活性剂、阴离子型聚合物、肽、油乳液、或其组合。于一较佳实施态样中，前述医药可接受的佐剂为MONTANIDETM ISA536VG佐剂、MONTANIDETM GEL 01佐剂、或其组合。
本发明的研究过程将进一步于下列实施例中详述。惟以下内容仅例示性的说明本发明的特征，以利理解。所属领域技术人员自可在不违背本发明精神的前题下参酌下列内容并基于领域中的通常知识加以变化，而仍属于本发明的权利范围。
实施例一：建构猪圆环病毒2型的外鞘蛋白质(PCV2 ORF2)表达载体。
PCV2病毒的分离与基因体定序
由感染PCV2的猪场(云林，中国台湾)取得病弱猪的脾脏与淋巴结等淋巴器官，以灭菌的剪刀剪碎后，再利用灭菌的研磨钵与研磨棒将淋巴器官磨碎，并加入适量的灭菌磷酸缓冲溶液混合均匀，制成乳剂。利用离心(6,000×g，20分钟)方式收取上清液，再经滤网过滤去除组织碎片。利用DNA纯化套组(DNeasy Blood&Tissue kit；Qiagen,USA)进行病毒DNA的抽取。取100μL的乳剂上清液，加入180μL的ATL Buffer与20μL的蛋白酶K(proteinaseK；10mg/mL)，于56℃下作用2小时。之后，加入200μL的绝对酒精并混合均匀。吸取所有溶液至离心分离小管(spin column)，并将离心分离小管放置于收集小管(collection tube)中，于6,000×g下离心1分钟。将离心分离小管放置于一新的收集小管中，再加入500μL的AW1 Buffer至分离小管中，于6,000×g下离心1分钟。将离心分离小管放置于一新的收集小管中，再加入500μL的AW2 Buffer至离心分离小管中，于20,630×g下离心5分钟。将离心分离小管放入一灭菌微量离心管中，加入适量无菌去离子水引流DNA。
设计引物PCVF(5’-ACCAGCGCACTTCGGCAGC-3’；SEQ ID NO：05)与PCVR(5’-AATACTTACAGCGCACTTCTTTCGT TTTC-3’；SEQ ID NO：06)，并利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增PCV2基因体DNA。PCR反应混合物的体积为100μL，其中包括10μL的前述由淋巴器官萃取的DNA，10μL 10XTaq buffer，200μM的dATP、dTTP、dGTP与dCTP，1μM扩增引物及2.5U DreamTaq DNA聚合酶(Thermo,USA)。PCR反应条件为94℃反应5分钟(1个步骤)；94℃反应30秒、59℃反应30秒、72℃反应1分钟30秒(35个循环)；72℃反应7分钟(1个步骤)。利用DNA电泳确认有无预估大小的DNA片段。
PCR产物经PCR-MTM Clean Up kit(GMbiolab,中国Taiwan)回收后，利用益生yT&A克隆载体试剂组(Yeastern,中国Taiwan)进行TA克隆。实验步骤参考厂商提供的yT&A克隆载体试剂组操作手册进行。取5μL回收纯化的PCR产物与2μLyT&A载体、1μL连接缓冲液A(ligation buffer A)、1μL连接缓冲液B和1μL T4DNA连接酶(2unit/μL)混合均匀后，于22℃下作用30分钟。取1μL连接混合物(ligation mixture)转化入大肠杆菌ECOS 9-5(Yeastern,中国Taiwan)。转化后的菌体加入1mL SOC再生培养液中，于37℃与250rpm的条件下震荡60分钟。之后，取适量菌液涂布于含氨苄西林(ampicillin)(最终浓度为100μg/mL)的固态培养基上，于37℃下培养16小时。
之后，以菌落聚合酶链式反应挑选转化株。菌落聚合酶链式反应实验步骤如下所述。首先，先准备微量离心管加入50μL的2倍Premix反应缓冲液(GMbiolab,中国Taiwan)、0.5μL的100mM PCVF引物、0.5μL的100mM PCVR引物及49μL的灭菌水，混合均匀后，再将PCR反应液分装于PCR小管(10μL/管)中。以牙签将菌落点至PCR小管后，即可进行PCR反应。PCR反应条件为95℃反应5分钟(1个步骤)；95℃反应30秒、59℃反应30秒、72℃，反应1分钟30秒(25个循环)；72℃反应7分钟(1个步骤)。利用DNA电泳确认有无预估大小的DNA片段。确认转化株中的重组质粒带有外插DNA(insert DNA)后，再抽取转化株中的质粒并进行DNA定序(源资国际生物科技股份有限公司)，将含有PCV2 DNA的质粒命名为pTA-PCV2。
ORF2基因(即外鞘蛋白质的基因)扩增与密码子最佳化
(1)ORF2基因的扩增：
以前述pTA-PCV2作为模板，利用ORF2F/ORF2R引物组合(ORF2F；5’-CAATATGGATCCATGA CGTATCCAAGGAGGCGT TTC-3’；SEQ ID NO：07与ORF2R；5’-GATATAGTCGACTTAGGGT TTAAGTGGGGGGTCTTTAAGATTAA-3’；SEQ ID NO：08)进行ORF2基因的扩增。在50μL PCR反应混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR缓冲液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP与dCTP，1μM扩增引物，100ng pTA-PCV2及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反应条件为96℃反应2分钟(1个步骤)；94℃反应30秒、60℃反应30秒、68℃反应30秒(35个循环)；68℃反应5分钟(1个步骤)。利用琼脂糖凝胶电泳确认PCR产物中是否含有预估大小的DNA片段。接着，利用PCR-MTM Clean Up kit进行PCR产物的回收。根据定序结果，前述ORF2基因的序列如SEQ IDNO：09所示。
(2)密码子最佳化ORF2(OPTORF2)基因的合成：
依据大肠杆菌的偏爱密码子(preferred codons)将ORF2的氨基酸序列反向推导为核苷酸序列。依据前述核苷酸序列设计引物：OPTORF2-T1、OPTORF2-T2、OPTORF2-T3、OPTORF2-T4、OPTORF2-T5、OPTORF2-T6、OPTORF2-T7、OPTORF2-T8、OPTORF2-T9、OPTORF2-T10、OPTORF2-T11、OPTORF2-T12、OPTORF2F及OPTORF2R，其序列如下表一所示。
表一：密码子最佳化ORF2(OPTORF2)基因合成所用引物。
Figure GDA0003098700790000101
Figure GDA0003098700790000111
以OPTORF2-T1～OPTORF2-T12作为模板引物，OPTORF2与OPTORF2R则作为扩增引物。利用重叠延伸聚合酶链式反应(overlapping-extension polymerase chainreaction,OEPCR)大量扩增密码子最佳化的ORF2基因。在50μL的PCR反应混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR缓冲液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP与dCTP，1μM的各引物及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反应条件为96℃反应2分钟(1个步骤)；94℃反应30秒、55℃反应30秒、68℃反应30秒(35个循环)；68℃反应5分钟(1个步骤)。PCR反应结束后，利用琼脂糖凝胶电泳确认有无预估大小的DNA片段。然后利用PCR-MTM Clean Up system kit进行PCR产物的回收。根据定序结果，前述密码子最佳化的ORF2基因的序列如SEQ ID NO：24所示。
SUMO基因的扩增与密码子最佳化
(1)SUMO基因的扩增：
将由日正食品DIY速发酵母所分离的面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)接种于YPD(20％peptone,10％yeast extract,20％glucose；pH 6.5)培养基中，于30℃与200rpm的条件下进行振荡培养16小时后，利用YeaStarTM Genomic DNA kit(ZymoResearch,USA)进行酵母菌基因体的抽取。取1.5mL隔夜培养的菌液至微量离心管中，离心(2,000×g，5分钟，室温)收集菌体部分，并加入120μL YD Digestion Buffer与5μL R-Zymolase充分混合后，于37℃下作用一小时。接着加入120μL YD Lysis Buffer，缓和混合数次后，再加入250μL氯仿并进行震荡1分钟。离心(10,000×g，2分钟，室温)收集上清液。将离心分离小管放置于收集小管上，并将上清液置入离心分离小管中，经离心(10,000×g，1分钟，室温)后，倒除滤液。加入300μL DNA清洗缓冲液至离心分离小管中，离心(10,000×g，1分钟，室温)后，倒除滤液，并重复此步骤一次。将离心分离小管放入一灭菌微量离心管中，加入适量的溶离溶液(elution solution)至离心分离小管中并离心(10,000×g，2分钟，室温)以引流基因体DNA。
以前面段落中获得的面包酵母基因体作为模板，利用SUMOF(5’-GATATAGGTACCATGTCGGACTCAGAAGTCAATCAAG-3’；SEQ ID NO：25)/SUMOR(5’-CAATATGGATCCACCACCAATCTGTTCTCTGTGAGC-3；SEQ ID NO：26)引物组合进行SUMO基因的扩增。在50μL PCR反应混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR缓冲液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP与dCTP，1μM扩增引物，200ng面包酵母基因体及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反应条件为96℃反应5分钟(1个步骤)；94℃反应30秒、55℃反应30秒、68℃反应30秒(35个循环)；68℃反应5分钟(1个步骤)。PCR反应结束后，利用琼脂糖凝胶电泳确认有无预估大小的DNA片段。然后利用PCR-MTM Clean Up systemkit进行PCR产物的回收。
(2)密码子最佳化SUMO(OPTSUMO)基因的合成：
依据大肠杆菌的偏爱密码子将SUMO的氨基酸序列反向推导为核苷酸序列。依据前述核苷酸序列设计引物：OPTSUMO-T1、OPTSUMO-T2、OPTSUMO-T3、OPTSUMO-T4、OPTSUMO-T5、OPTSUMO-T6、OPTSUMO-T7、OPTSUMO-T8、OPTSUMOF及OPTSUMOR，其序列如下表二所示。
表二：密码子最佳化SUMO(OPTSUMO)基因合成所用引物。
Figure GDA0003098700790000121
Figure GDA0003098700790000131
以OPTSUMO-T1～OPTSUMO-T8作为模板引物，OPTSUMOF与OPTSUMOR则作为扩增引物。利用重叠延伸聚合酶链式反应大量扩增密码子最佳化的SUMO基因。在50μL的PCR反应混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR缓冲液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP与dCTP，1μM的各引物及1UGDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反应条件为96℃反应2分钟(1个步骤)；94℃反应30秒、55℃反应30秒、68℃反应30秒(35个循环)；68℃反应5分钟(1个步骤)。PCR反应结束后，利用琼脂糖凝胶电泳确认有无预估大小的DNA片段。然后利用PCR-MTM Clean Up system kit进行PCR产物的回收。根据定序结果，前述密码子最佳化的SUMO基因的序列如SEQ ID NO：37所示。
ORF2融合蛋白表达载体的构建
(1)pET-DRAHIS的构建：
以pET29a作为模板，利用DRAF(5’-GATATACATATGAAAAAAAAATTCGTATCGCATCACCATCACCATCACAGCGGTGGTGGTACCCCAGATCTGGGTACCCTGG-3’；SEQ ID NO：38)/T7 terminator(GCTAGTTATTGCTCAGCGG；SEQ ID NO：39)引物组合进行PCR反应。在50μL PCR反应混合物中包含1倍Ex TaqTM缓冲液，200μM的dATP、dTTP、dGTP与dCTP，1μM扩增引物，100ng pET29a及1.25U TakaRa Ex TaqTM DNA聚合酶(Takara,Japan)。PCR的反应条件为94℃反应5分钟(1个步骤)；94℃反应30秒、55℃反应30秒、72℃反应50秒(35个循环)；72℃反应7分钟(1个步骤)。PCR反应结束后，利用琼脂糖凝胶电泳确认有无预估大小的DNA片段。然后利用PCR-MTMClean Up system kit进行PCR产物的回收。
PCR产物以NdeI与SalI剪切后，利用T4 DNA连接酶将DNA片段接入以相同限制酶剪切的pET29a中。将黏合产物转化入大肠杆菌XL1-blue(Protech,中国Taiwan)中。随机挑选转化株进行DNA定序确认。将DNA序列正确无误的质粒命名为pET-DRAHIS。此质粒的起始码后带有下游序列(downstream sequence,DS)AAAAAAAAATTCGTATCG(SEQ ID NO：40)与His标签的DNA序列CATCACCATCACCATCAC(SEQ ID NO：41)。
(2)pET-SUMO-ORF2表达载体的构建：
自面包酵母基因体扩增的SUMO基因以KpnI与BamHI剪切后，利用T4 DNA连接酶将DNA片段接入以相同限制酶剪切的pET-DRAHIS中。将黏合产物转化进入大肠杆菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶链式反应挑选转化株。利用DNA电泳确认转化株中的重组质粒带有外插DNA后，抽取转化株中的质粒并进行DNA定序。将DNA序列正确无误的质粒命名为pET-SUMO。
自PCV2云林病毒基因体扩增的ORF2基因以BamHI与SalI剪切后，利用T4DNA 连接酶将DNA片段接入以相同限制酶剪切的pET-SUMO中。将黏合产物转化进入大肠杆菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶链式反应挑选转化株。利用DNA电泳确认转化株中的重组质粒带有外插DNA后，抽取转化株中的质粒并进行DNA定序。将DNA序列正确无误的质粒命名为pET-SUMO-ORF2，其具有如SEQ ID NO：42所示序列。
(3)pET-OPTSUMO-ORF2表达载体的构建：
将合成的OPTSUMO基因以KpnI与BamHI剪切后，利用T4 DNA连接酶将DNA片段接入以相同限制酶剪切的pET-DRAHIS中。将黏合产物转化进入大肠杆菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶链式反应挑选转化株。利用DNA电泳确认转化株中的重组质粒带有外插DNA后，抽取转化株中的质粒并进行DNA定序。将DNA序列正确无误的质粒命名为pET-OPTSUMO。
自PCV2云林病毒基因体扩增的ORF2基因以BamHI与SalI剪切后，利用T4DNA连接酶将DNA片段接入以相同限制酶剪切的pET-OPTSUMO中。将黏合产物转化进入大肠杆菌ECOS9-5中。以菌落聚合酶链式反应挑选转化株。利用DNA电泳确认转化株中的重组质粒带有外插DNA后，抽取转化株中的质粒并进行DNA定序。将DNA序列正确无误的质粒命名为pET-OPTSUMO-ORF2，其具有如SEQ ID NO：43所示序列。
(4)pET-SUMO-OPTORF2表达载体的构建：
将合成的OPTORF2基因以BamHI与SalI剪切后，利用T4 DNA连接酶将DNA片段接入以相同限制酶剪切的pET-SUMO中。将黏合产物转化进入大肠杆菌ECOS9-5中。以菌落聚合酶链式反应挑选转化株。利用DNA电泳确认转化株中的重组质粒带有外插DNA后，抽取转化株中的质粒并进行DNA定序。将DNA序列正确无误的质粒命名为pET-SUMO-OPTORF2，其具有如SEQ ID NO：44所示序列。
(5)pET-OPTSUMO-OPTORF2表达载体的构建：
将合成的OPTORF2基因以BamHI与SalI剪切后，利用T4 DNA连接酶将DNA片段接入以相同限制酶剪切的pET-OPTSUMO中。将黏合产物转化进入大肠杆菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶链式反应挑选转化株。利用DNA电泳确认转化株中的重组质粒带有外插DNA后，抽取转化株中的质粒并进行DNA定序。将DNA序列正确无误的质粒命名为pET-OPTSUMO-OPTORF2，其具有如SEQ ID NO：45所示序列。
(6)pBA-OPTSUMO-OPTORF2表达载体的构建：
本实验中所构建的pBA-OPTSUMO-OPTORF2是将OPTSUMO-OPTORF2的DNA片段嵌入一新颖的阿拉伯糖诱导表达载体pBCM-araM11所得。pBCM-araM11是采用本发明的申请人于中国台湾发明专利申请案第103146225号案(申请日：公元2014年12月30日)所揭露的阿拉伯糖诱导表达元件及中国台湾发明专利申请案第103142753号案(申请日：公元2014年12月9日)所揭露的载体pBRCMMCS(SEQ ID NO:100)进行构建。有关表达载体的构建过程描述如下。
将pARABM11-GFPT以EcoRI与NdeI剪切后，利用Gel-MTM gel extraction systemkit(GMbiolab,中国Taiwan)回收含有araC与araB-M11表达元件的DNA片段。利用T4 DNA连接酶将araC与araB-M11表达元件接入以相同限制酶剪切的pBRCMMCS中。将黏合产物转化入大肠杆菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶链式反应挑选转化株并抽取质粒进行DNA定序确认。将序列正确无误的质粒命名为pBCM-araM11，其具有SEQ ID NO：98所示序列。
pET-OPTSUMO-OPTORF2以NdeI与SalI剪切后，利用Gel-MTM gel extractionsystem kit回收含有OPTSUMO-OPTORF2的DNA片段。利用T4 DNA连接酶将OPTSUMO-OPTORF2接入以相同限制酶剪切的pBCM-araM11中。将黏合产物转化入大肠杆菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶链式反应挑选转化株并抽取质粒进行DNA定序确认。将序列正确无误的质粒命名为pBA-OPTSUMO-OPTORF2，其具有如SEQ ID NO：46所示序列。
前述含有araB-M11表达元件的DNA片段即本发明的阿拉伯糖诱导表达元件，其包含启动子(其-16部位如SEQ ID NO：03所示)、T7噬菌体转译增强元件(SEQ ID NO：01)、及核糖体结合部位(SEQ ID NO：02)。前述阿拉伯糖诱导表达元件是按照中国台湾发明专利申请案第103146225号案(申请日：公元2014年12月30日)所示，其具有如SEQ ID NO：04所示序列。
小结
综上所述，本实施例共制得5个猪圆环病毒2型的外鞘蛋白质表达载体，分别为：pET-SUMO-ORF2(SEQ ID NO：42)、pET-OPTSUMO-ORF2(SEQ ID NO：43)、pET-SUMO-OPTORF2(SEQ ID NO：44)、pET-OPTSUMO-OPTORF2(SEQ ID NO：45)、及pBA-OPTSUMO-OPTORF2(SEQ IDNO：46)，并请参见图1所示。
实施例二：制备本发明的猪圆环病毒2型的外鞘蛋白质。
如前所述，实施例一所制得的各个载体(SEQ ID NO：42至46)含有外鞘蛋白质ORF2的DNA，可应用于外鞘蛋白质的生产。并且，为了纯化及水溶性表达的需要，该目标蛋白质是与SUMO蛋白质及His标签合成为融合蛋白，本文中将此融合蛋白称为SUMO-ORF2融合蛋白，并不再赘述该融合蛋白是带有His标签。本实施例将利用实施例一中所述的表达载体进行本发明SUMO-ORF2融合蛋白的制备。
大肠杆菌的转化与重组SUMO-ORF2融合蛋白的诱导表达
(1)实验步骤：
将pET-SUMO-ORF2、pET-OPTSUMO-ORF2、pET-SUMO-OPTORF2及pET-OPTSUMO-OPTORF2等表达载体分别转化入E.coli BL21(DE3)(Yeastern,中国Taiwan)中。将pET-SUMO-ORF2转化至E.coli Rosetta2(EMD Millipore,USA)中。将pBA-OPTSUMO-OPTORF2转化入E.coli BL21(New England Biolabs,USA)中。转化的方法参照厂商提供的操作步骤进行。
将E.coli BL21(DE3)转化株接种于含有康那霉素(kanamycin)(最终浓度为30μg/mL)的LB培养基中，于37℃与180rpm的条件下进行振荡培养。经隔夜培养后，菌液以1：100的比例接种至含有康那霉素(kanamycin)(最终浓度为30μg/mL)的LB培养基中。于37℃与180rpm的条件下进行振荡培养。将细菌培养至以分光光度计量测细胞浓度达OD600约0.4～0.6，加入0.1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)进行蛋白质的诱导表达。诱导4小时后，离心(8,000×g，30分钟，4℃)收集菌体部分并以蛋白质电泳与蛋白质印迹法观察SUMO-ORF2融合蛋白的表达情形。蛋白质印迹法中所使用的一级抗体与二级抗体分别为兔抗His标签多株抗体(rabbit anti-6×His polyclonalantibody；Protech,中国Taiwan)与碱性磷酸酶共轭山羊抗兔抗体【alkalinephosphatase-conjugated goat anti-rabbit IgG(H+L)】；所使用的呈色剂为NBT/BCIP(Thermo,USA)。另亦针对菌体进行可溶性蛋白质与不可溶性蛋白质的划分(即，可溶性与否)并以蛋白质电泳观察SUMO-ORF2融合蛋白的可溶性表达情形。
将E.coli Rosetta2转化株接种于含有氯霉素(chloramphenicol)(最终浓度为34μg/mL)与康那霉素(最终浓度为30μg/mL)的LB培养基中，于37℃与180rpm的条件下进行振荡培养。经隔夜培养后，菌液以1：100的比例接种至含有氯霉素(最终浓度为34μg/mL)与康那霉素(最终浓度为30μg/mL)的LB培养基中。于37℃与180rpm的条件下进行振荡培养。将细菌培养至以分光光度计量测细胞浓度达OD600约0.4～0.6，加入0.1mM IPTG进行蛋白质的诱导表达。诱导4小时后，离心(8,000×g，30分钟，4℃)收集菌体部分并以蛋白质电泳与蛋白质印迹法观察SUMO-ORF2融合蛋白的表达情形。另亦针对菌体进行可溶性蛋白质与不可溶性蛋白质的划分并以蛋白质电泳观察SUMO-ORF2融合蛋白的可溶性表达情形。
将E.coli BL21转化株接种于含氯霉素(25μg/mL)的LB培养基中，于37℃与180rpm的条件下进行振荡培养。经隔夜培养后，将菌液以1：100的比例接种至含有氯霉素(25μg/mL)的LB培养基中。于37℃与180rpm的条件下进行振荡培养。将细菌培养至以分光光度计量测细胞浓度达OD600约0.4～0.6，加入0.2％阿拉伯糖进行蛋白质诱导表达。诱导4小时后，离心(8,000×g，30分钟，4℃)收集菌体部分并以蛋白质电泳与蛋白质印迹法观察SUMO-ORF2融合蛋白的表达情形。另亦针对菌体进行可溶性蛋白质与不可溶性蛋白质的划分并以蛋白质电泳观察SUMO-ORF2融合蛋白的可溶性表达情形。
蛋白质电泳胶片经扫描后，使用Image Quant TL 7.0(GE Healthcare LifeSciences,USA)软件估算重组SUMO-ORF2融合蛋白的表达百分比，并进一步计算融合蛋白的产量。
(2)实验结果：
结果显示，将pET-SUMO-ORF2与pET-OPTSUMO-ORF2转化入E.coli BL21(DE3)中并进行诱导，重组SUMO-ORF2融合蛋白完全不表达(图2)。将pET-SUMO-ORF2转化入可产生对应罕见密码子tRNA的E.coli Rosetta2中并进行诱导。结果显示，重组SUMO-ORF2融合蛋白可表达(图2)，且主要为可溶性蛋白质(图3)；可溶性重组SUMO-ORF2融合蛋白的产量为46.81mg/L。上述ORF2基因无法于E.coli BL21(DE3)中表达的情形说明ORF2所带有的密码子严重影响SUMO-ORF2融合蛋白于大肠杆菌中的表达。
将带有密码子最佳化ORF2基因的pET-SUMO-OPTORF2转化入E.coli BL21(DE3)中并进行诱导。结果显示，重组SUMO-ORF2融合蛋白可顺利被表达(图2)，且主要为可溶性蛋白质(图3)；可溶性重组SUMO-ORF2融合蛋白的产量为54.62mg/L。此结果说明，ORF2密码子经最佳化后，可提升SUMO-ORF2融合蛋白于E.coli BL21(DE3)中的表达。
将带有密码子最佳化的ORF2全长基因与密码子最佳化SUMO基因的pET-OPTSUMO-OPTORF2表达载体转化入E.coli BL21(DE3)中并进行诱导。结果显示，重组SUMO-ORF2融合蛋白可顺利被表达(图2)，且主要为可溶性蛋白质(图3)；可溶性重组SUMO-ORF2融合蛋白的产量为81.66mg/L。此结果说明，融合伴侣基因的密码子经最佳化后，亦可进一步提升ORF2融合蛋白于大肠杆菌中的表达。过去的研究未有针对SUMO基因密码子进行最佳化以提升融合蛋白表达量的实例。本发明证实SUMO基因的密码子经最佳化后，可提升SUMO-ORF2融合蛋白的产量。
将带有下游序列-His标签DNA-密码子最佳化的SUMO基因-密码子最佳化ORF2基因的DNA片段嵌入阿拉伯糖诱导表达载体pBCM-araM11中并转化入E.coli BL21中进行重组SUMO-ORF2融合蛋白的生产。结果显示，利用阿拉伯糖诱导表达系统亦可生产重组SUMO-ORF2融合蛋白(图2)，且主要为可溶性蛋白质(图3)。利用此表达载体进行SUMO-ORF2融合蛋白的生产，可获得最高的产量(103.04mg/L)；与T7表达系统的最高产量(81.66mg/L)相较之下，产量约可提升1.27倍。本发明实施例一的各表达载体于此实验中表达可溶性SUMO-ORF2融合蛋白的产量统整于下表三。
表三：可溶性SUMO-ORF2融合蛋白的产量。
Figure GDA0003098700790000181
Figure GDA0003098700790000191
利用固定化金属离子亲和层析进行重组SUMO-ORF2融合蛋白的纯化
利用重组SUMO-ORF2融合蛋白的N端带有His标签能与镍或钴离子形成配位共价键的特性，采用固定化金属离子亲和层析法进行蛋白质纯化。纯化的方式是利用蛋白质液相层析系统
Figure GDA0003098700790000192
prime plus(GE Healthcare,Sweden)搭配5mL HiTrapTM Ni excel管柱(GEHealthcare,Sweden)进行。
将菌体悬浮于Lysis buffer(50mM Tris-HCl,500mM NaCl,pH 8.0)中，并利用超声波破碎仪将菌体破碎后，离心(8,000×g,15分钟)收集上清液部分。以25mL Lysisbuffer平衡管柱后，将破菌上清液注入HiTrapTM Ni excel管柱。待样品注入完成后，以100mL清洗缓冲液(50mM Tris-HCl,500mM NaCl,30mM imidazole,pH 8.0)洗除非特异性结合的蛋白质。最后以150mL Elution buffer(50mM Tris-HCl,500mM NaCl,250mMimidazole,pH 8.0)洗脱树脂上的重组蛋白质，其是藉助高浓度的imidazole与重组蛋白质竞争树脂结合部位，致使重组SUMO-ORF2融合蛋白自树脂上被洗脱下来。利用蛋白质电泳观察重组SUMO-ORF2融合蛋白的纯化情形。实验结果如图4中所示。
以SUMO蛋白酶剪切本发明的SUMO-ORF2融合蛋白
本实验利用SUMO蛋白酶剪切由大肠杆菌表达系统所制得的ORF2融合蛋白。经剪切后，将可获得带有His标签的SUMO融合伴侣片段与外鞘蛋白质片段。于本实验中将通过大肠杆菌表达系统生产SUMO蛋白酶并应用于前述用途。所属领域技术人员亦可采用其他方式取得的SUMO蛋白酶进行此步骤。
(1)重组SUMO蛋白酶表达载体pET-SUMOPH的构建：
以面包酵母基因体作为模板，利用SUMOPF(5’-CAATATGGATCCCTTGTTCCTGAATTAAATGAAAAAGACG-3’；SEQ ID NO：47)/SUMOPENZHISR(5’-GATATACTCGAGTTAGTGATGGTGATGGTGATGACCACTGCCGCTACCTTTTAAAGCGTCGGTTAAA ATCAAATG-3；SEQ ID NO：48)引物组合进行SUMO蛋白酶基因的扩增。在50μL PCR反应混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR缓冲液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP与dCTP，1μM扩增引物，200ng面包酵母基因体及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反应条件为96℃反应5分钟(1个步骤)；94℃反应30秒、55℃反应30秒、68℃反应30秒(35个循环)；68℃反应5分钟(1个步骤)。PCR反应结束后，利用琼脂糖凝胶电泳确认有无预估大小的DNA片段。然后利用PCR-MTM Clean Up system kit进行PCR产物的回收。
自酵母菌基因体扩增的SUMO蛋白酶基因以BamHI与XhoI剪切后，利用T4DNA 连接酶将DNA片段接入以BamHI与SalI剪切的pET29a中。将黏合产物转化进入大肠杆菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶链式反应挑选转化株。利用DNA电泳确认转化株中的重组质粒带有外插DNA后，抽取转化株中的质粒并进行DNA定序。将DNA序列正确无误的质粒命名为pET-SUMOPH，其具有SEQ ID NO：49所示序列。
(2)重组D-SUMO蛋白酶表达载体pET-D-SUMOPH的构建：
以λ噬菌体DNA(Promega,USA)作为模板，利用DF(5’-GATATAGGTACCATGACGAGCAAAGAAACCTTTACC-3’；SEQ ID NO：50)与DR(5’-CAATATGGATCCAACGATGCTGATTGCCGTTC-3’；SEQ ID NO：51)引物组合进行D蛋白质基因的扩增。在50μL PCR反应混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR缓冲液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP与dCTP，1μM扩增引物，100ngλ噬菌体DNA及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反应条件为96℃反应5分钟(1个步骤)；94℃反应30秒、55℃反应30秒、68℃反应30秒(35个循环)；68℃反应5分钟(1个步骤)。PCR反应结束后，利用琼脂糖凝胶电泳确认有无预估大小的DNA片段。然后利用PCR-MTM Clean Upsystem kit进行PCR产物的回收。
自λ噬菌体DNA扩增的D蛋白质基因以KpnI与BamHI剪切后，利用T4 DNA连接酶将DNA片段接入以相同限制酶剪切的pET29a中。将黏合产物转化进入大肠杆菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶链式反应挑选转化株。利用DNA电泳确认转化株中的重组质粒带有外插DNA后，抽取转化株中的质粒并进行DNA定序。将DNA序列正确无误的质粒命名为pET-D，其具有SEQID NO：99所示序列。
自酵母菌基因体扩增的SUMO蛋白酶基因以BamHI与XhoI剪切后，利用T4DNA连接酶将DNA片段接入以BamHI与SalI剪切的pET-D中。将黏合产物转化进入大肠杆菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶链式反应挑选转化株。利用DNA电泳确认转化株中的重组质粒带有外插DNA后，抽取转化株中的质粒并进行DNA定序。将DNA序列正确无误的质粒命名为pET-D-SUMOPH，其具有SEQ ID NO：52所示序列。
(3)重组蛋白酶的诱导表达与纯化：
将pET-SUMOPH与pET-D-SUMOPH等表达载体分别转化入E.coli BL21(DE3)中。将E.coli BL21(DE3)转化株接种于含有康那霉素(kanamycin)(最终浓度为30μg/mL)的LB培养基中，于37℃与180rpm的条件下进行振荡培养。经隔夜培养后，菌液以1：100的比例接种至含有康那霉素(最终浓度为30μg/mL)的LB培养基中。于37℃与180rpm的条件下进行振荡培养。将细菌培养至以分光光度计量测细胞浓度达OD600约0.4～0.6，加入0.1mM IPTG进行蛋白质的诱导表达。诱导4小时后，离心(8,000×g，30分钟，4℃)收集菌体部分进行可溶性蛋白质与不可溶性蛋白质的划分并以蛋白质电泳与蛋白质印迹法观察重组蛋白酶的可溶性表达情形。蛋白质印迹法中所使用的一级抗体与二级抗体分别为兔抗His标签多株抗体与碱性磷酸酶共轭山羊抗兔抗体；所使用的呈色剂为NBT/BCIP。重组蛋白酶的纯化方法同重组ORF2融合蛋白的纯化方法。
结果显示，SUMO蛋白酶与D-SUMO蛋白酶皆可于E.coli BL21(DE3)中表达(图5)，产量分别为20.55mg/L与46.94mg/L；其中D-SUMO蛋白酶的产量较高，其莫耳数约为SUMO蛋白酶的2.2倍。此结果说明，利用融合表达的策略可增进SUMO蛋白酶于大肠杆菌中的表达量。
接着利用重组蛋白酶的C端带有His标签的特性，采用固定化金属离子亲和层析法进行蛋白质纯化。结果显示，利用固定化金属离子亲和管柱可进行胞内可溶性重组SUMO蛋白酶与D-SUMO蛋白酶的纯化(图6)；其中D-SUMO蛋白酶的纯化产量较高，由1L培养液中可纯化21.50mg的蛋白质，约为SUMO蛋白酶纯化产量(15.33mg)的1.4倍。
(4)剪切重组SUMO-ORF2融合蛋白，并观察类病毒颗粒的形成：
将纯化的重组SUMO-ORF2融合蛋白与重组蛋白酶(SUMO蛋白酶或D-SUMO蛋白酶)以重量比为1：0.05的比例混合(例如1mg重组ORF2融合蛋白与0.05mg重组蛋白酶)，并使混合物于4℃下作用16小时。将剪切后的蛋白质溶液放入Amicon ultra-15ultracel-100K离心管(Merck Millipore,USA)中，在4℃以2,600×g离心至适当体积。之后利用100kDa的再生纤维素(regeberated cellulose)过滤膜进行剪切蛋白质的过滤。结果显示，利用100kDa的过滤膜可有效去除融合伴侣，毋需利用管柱层析方法进行ORF2与融合伴侣的分离，可有效节省抗原生产成本(图7)。
接着，分别将SUMO-ORF2融合蛋白、经蛋白酶剪切的SUMO-ORF2融合蛋白、及经蛋白酶剪切再经过滤后所得的ORF2融合蛋白置于铜网(copper grid)上，于室温下放置三分钟。然后以滤纸(filter paper)将多余水分吸干后，加入醋酸铀酰(uranyl acetate)染剂进行负染色(negative stain)，染色时间约为40秒至1分钟。之后利用滤纸将多余染剂吸干，以场发射穿透式电子显微镜JEM-2100F(JEOL,Japan)进行类病毒颗粒的观察。
结果显示，SUMO-ORF2融合蛋白无法形成类病毒颗粒，但经蛋白酶剪切的重组SUMO-ORF2融合蛋白、及经蛋白酶剪切再经过滤后所得的ORF2融合蛋白皆可形成类病毒颗粒(图8)。由穿透式电子显微镜图形计算类病毒颗粒的平均粒径约为19nm。
实施例三：制备猪干扰素。
本发明揭露的猪干扰素为特别合适作为猪圆环病毒2型的亚单位疫苗的佐剂。是故本实施例中以大肠杆菌宿主细胞生产本发明的亚单位疫苗所需的猪干扰素α及猪干扰素γ。
重组猪干扰素α(IFN-α)与γ(IFN-γ)基因的合成
(1)IFN-α基因的合成：
依据大肠杆菌的偏爱密码子将成熟猪干扰素α-6的氨基酸序列反向推导为核苷酸序列。依据前述核苷酸序列设计引物：OPTIFNA-T1、OPTIFNA-T2、OPTIFNA-T3、OPTIFNA-T4、OPTIFNA-T5、OPTIFNA-T6、OPTIFNA-T7、OPTIFNA-T8、OPTIFNAF及OPTIFNAR，其序列如下表四所示。
表四：密码子最佳化猪干扰素α-6基因合成所用引物。
Figure GDA0003098700790000221
Figure GDA0003098700790000231
以OPTIFNA-T1～OPTIFNA-T8作为模板引物，OPTIFNAF与OPTIFNAR则作为扩增引物。利用重叠延伸聚合酶链式反应大量扩增密码子最佳化的IFN-α基因。在50μL的PCR反应混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR缓冲液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP与dCTP，1μM的各引物及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反应条件为96℃反应2分钟(1个步骤)；94℃反应30秒、58℃反应30秒、68℃反应30秒(35个循环)；68℃反应5分钟(1个步骤)。PCR反应结束后，利用琼脂糖凝胶电泳确认有无预估大小的DNA片段。然后利用PCR-MTM Clean Up system kit进行PCR产物的回收。
利用CloneJET PCR Cloning Kit(Thermo,USA)进行基因克隆，并将黏合混合物(ligation mixture)转化入大肠杆菌ECOS 9-5。以菌落聚合酶链式反应挑选转化株。利用DNA电泳确认转化株中的重组质粒带有外插DNA后，抽取转化株中的质粒并进行DNA定序。将DNA序列正确无误的质粒命名为pJET-IFNA-6，其具有如SEQ ID NO：63所示序列。经定序验证，密码子最佳化的IFN-α基因具有SEQ ID NO：64所示序列。
(2)IFN-γ的合成：
依据大肠杆菌的偏爱密码子将成熟猪干扰素γ的氨基酸序列反向推导为核苷酸序列。依据前述核苷酸序列设计引物：OPTIFNR-T1、OPTIFNR-T2、OPTIFNR-T3、OPTIFNR-T4、OPTIFNR-T5、OPTIFNR-T6、OPTIFNR-T7、OPTIFNR-T8、OPTIFNRF及OPTIFNRR，其序列如下表五所示。
表五：密码子最佳化猪干扰素γ基因的合成所用引物。
Figure GDA0003098700790000241
以OPTIFNR-T1～OPTIFNR-T8作为模板引物，OPTIFNRF与OPTIFNRR则作为扩增引物。利用重叠延伸聚合酶链式反应大量扩增密码子最佳化的IFN-γ基因。在50μL的PCR反应混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR缓冲液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP与dCTP，1μM的各引物及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反应条件为96℃反应2分钟(1个步骤)；94℃反应30秒、57℃反应30秒、68℃反应30秒(35个循环)；68℃反应5分钟(1个步骤)。PCR反应结束后，利用琼脂糖凝胶电泳确认有无预估大小的DNA片段。然后利用PCR-MTM Clean Up system kit进行PCR产物的回收。
利用CloneJET PCR Cloning Kit进行基因克隆，并将黏合混合物转化入大肠杆菌ECOS 9-5。以菌落聚合酶链式反应挑选转化株。利用DNA电泳确认转化株中的重组质粒带有外插DNA后，抽取转化株中的质粒并进行DNA定序。将DNA序列正确无误的质粒命名为pJET-IFNR，其具有如SEQ ID NO：75所示序列。经定序验证，密码子最佳化的IFN-γ基因具有SEQID NO：76所示序列。
猪干扰素α与γ表达载体的构建
(1)pET-OPTPIFNAH表达载体的构建：
以pJET-IFNA-6质粒作为模板，利用PIFNANDEIF(5’-CAATATCATATGTGCGATCTGCCGCAAACC-3’；SEQ ID NO：77)/PIFNAHISSALIR(5’-GATATAGTCGACTTATTAGTGATGGTGATGGTGATGTTCCTTTTTACGCAGGCGGTC-3’；SEQ ID NO：78)引物组合进行IFN-α基因的扩增。在50μL PCR反应混合物中包含1倍GDP-HiFiPCR缓冲液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP与dCTP，1μM扩增引物，100ngpJET-IFNA-6及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反应条件为96℃反应2分钟(1个步骤)；94℃反应30秒、55℃反应30秒、68℃反应30秒(35个循环)；68℃反应5分钟(1个步骤)。PCR反应结束后，利用琼脂糖凝胶电泳确认有无预估大小的DNA片段。然后利用PCR-MTMClean Up system kit进行PCR产物的回收。
PCR产物以NdeI与SalI剪切后，利用T4 DNA连接酶将DNA片段接入以相同限制酶剪切的pET29a中。将黏合产物转化进入大肠杆菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶链式反应挑选转化株。利用DNA电泳确认转化株中的重组质粒带有外插DNA后，抽取转化株中的质粒并进行DNA定序。将DNA序列正确无误的质粒命名为pET-OPTPIFNAH，其具有SEQ ID NO：79所示序列。
(2)pBA-OPTPIFNAH表达载体的构建：
利用上述PCR扩增的IFN-α基因以NdeI与SalI剪切后，利用T4 DNA 连接酶将DNA片段分别接入以相同限制酶剪切的pBCM-araM11中。将黏合产物转化进入大肠杆菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶链式反应挑选转化株。利用DNA电泳确认转化株中的重组质粒带有外插DNA后，抽取转化株中的质粒并进行DNA定序。将DNA序列正确无误的质粒分别命名为pBA-OPTPIFNAH，其具有SEQ ID NO：80所示序列。
(3)pET-SUMO-OPTPIFNAH表达载体的构建：
以面包酵母基因体作为模板，利用SUMOF(SEQ ID NO：25)/SUMOR2(5’-ACCACCAATCTGTTCTCTGTGAGC-3’；SEQ ID NO：81)引物组合进行SUMO基因的扩增。在50μLPCR反应混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR缓冲液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP与dCTP，1μM扩增引物，200ng面包酵母基因体及1UGDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反应条件为96℃反应5分钟(1个步骤)；94℃反应30秒、55℃反应30秒、68℃反应30秒(35个循环)；68℃反应5分钟(1个步骤)。PCR反应结束后，利用琼脂糖凝胶电泳确认有无预估大小的DNA片段。然后利用Gel-MTMgel extraction system kit进行PCR产物的回收。
以pJET-IFNA-6质粒作为模板，利用SUMOIFNAF(5’-GCTCACAGAGAACAGATTGGTGGTTGCGATCTGCCGCAAACC-3’；SEQ ID NO：82)/PIFNAHISSALIR(SEQ ID NO 78)引物组合进行IFN-α基因的扩增。在50μLPCR反应混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR缓冲液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP与dCTP，1μM扩增引物，100ng pJET-IFNA-6及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反应条件为96℃反应5分钟(1个步骤)；94℃反应30秒、55℃反应30秒、68℃反应30秒(35个循环)；68℃反应5分钟(1个步骤)。PCR反应结束后，利用琼脂糖凝胶电泳确认有无预估大小的DNA片段。然后利用Gel-MTM gel extraction system kit进行PCR产物的回收。
以上述的两个PCR产物作为模板，利用SUMOF(SEQ ID NO：25)/PIFNAHISSALIR(SEQID NO：78)引物组合进行聚合酶链式反应即可获得SUMO-IFN-α融合基因。在50μL PCR反应混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR缓冲液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP与dCTP，1μM扩增引物，100ng SUMO PCR产物，100ng IFN-αPCR产物及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反应条件为96℃反应2分钟(1个步骤)；94℃反应30秒、55℃反应30秒、68℃反应1分钟(35个循环)；68℃反应5分钟(1个步骤)。PCR反应结束后，利用琼脂糖凝胶电泳确认有无预估大小的DNA片段。然后利用PCR-MTM Clean Up system kit进行PCR产物的回收。
PCR产物以KpnI与SalI剪切后，利用T4 DNA 连接酶将DNA片段接入以相同限制酶剪切的pET29a中。将黏合产物转化进入大肠杆菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶链式反应挑选转化株。利用DNA电泳确认转化株中的重组质粒带有外插DNA后，抽取转化株中的质粒并进行DNA定序。将DNA序列正确无误的质粒命名为pET-SUMO-OPTPIFNAH，其具有SEQ ID NO：83所示序列。
(4)pET-OPTSUMO-OPTPIFNAH表达载体的构建：
以pET-OPTSUMO-ORF2(SEQ ID NO：43)作为模板，利用OPTSUMOF(SEQ ID NO：35)/OPTSUMOR2(5’-GCCGCC GATTTGTTCACGG-3’；SEQ ID NO：84)引物组合进行OPTSUMO基因的扩增。
在50μL PCR反应混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR缓冲液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP与dCTP，1μM扩增引物，100ng pET-OPTSUMO-ORF2及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反应条件为96℃反应2分钟(1个步骤)；94℃反应30秒、55℃反应30秒、68℃反应30秒(35个循环)；68℃反应5分钟(1个步骤)。PCR反应结束后，利用琼脂糖凝胶电泳确认有无预估大小的DNA片段。然后利用Gel-MTM gel extraction system kit进行PCR产物的回收。
以pJET-IFNA-6质粒(SEQ ID NO：63)作为模板，利用OPTSUMOIFNAF(CCGTGAACAAATCGGCGGCTGCGATCTGCCGCAAACC；SEQ ID NO：85)/PIFNAHISSALIR(SEQ ID NO：78)引物组合进行IFN-α基因的扩增。在50μL PCR反应混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR缓冲液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP与dCTP，1μM扩增引物，100ng pJET-IFNA-6及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反应条件为96℃反应2分钟(1个步骤)；94℃反应30秒、55℃反应30秒、68℃反应30秒(35个循环)；68℃反应5分钟(1个步骤)。PCR反应结束后，利用琼脂糖凝胶电泳确认有无预估大小的DNA片段。然后利用Gel-MTM gel extraction system kit进行PCR产物的回收。
以上述的两个PCR产物作为模板，利用OPTSUMOF(SEQ ID NO：35)/PIFNAHISSALIR(SEQ ID NO：78)引物组合进行聚合酶链式反应即可获得OPTSUMO-IFN-α融合基因。在50μLPCR反应混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR缓冲液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP与dCTP，1μM扩增引物，100ng OPTSUMO PCR产物，100ng IFN-αPCR产物及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反应条件为96℃反应2分钟(1个步骤)；94℃反应30秒、55℃反应30秒、68℃反应1分钟(35个循环)；68℃反应5分钟(1个步骤)。PCR反应结束后，利用琼脂糖凝胶电泳确认有无预估大小的DNA片段。然后利用PCR-MTM Clean Up system kit进行PCR产物的回收。
PCR产物以KpnI与SalI剪切后，利用T4 DNA 连接酶将DNA片段接入以相同限制酶剪切的pET29a中。将黏合产物转化进入大肠杆菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶链式反应挑选转化株。利用DNA电泳确认转化株中的重组质粒带有外插DNA后，抽取转化株中的质粒并进行DNA定序。将DNA序列正确无误的质粒命名为pET-OPTSUMO-OPTPIFNAH，其具有SEQ ID NO：86所示序列。
(5)pBA-OPTSUMO-OPTPIFNAH表达载体的构建：
pET-OPTSUMO-OPTPIFNAH以NdeI与SalI剪切后，利用Gel-MTM gel extractionsystem kit回收含有OPTSUMO-IFN-α融合基因的DNA片段。利用T4 DNA 连接酶将DNA片段接入以相同限制酶剪切的pBCM-araM11中。将黏合产物转化进入大肠杆菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶链式反应挑选转化株。利用DNA电泳确认转化株中的重组质粒带有外插DNA后，抽取转化株中的质粒并进行DNA定序。将DNA序列正确无误的质粒命名为pBA-OPTSUMO-OPTPIFNAH，其具有SEQ ID NO：87所示序列。
(6)pET-OPTPIFNRH表达载体的构建：
以pJET-IFNR质粒作为模板，利用PIFNRNDEIF(5’-CAATATCATATGCAAGCCCCGTTTTTCAAAGAA-3’；SEQ ID NO：88)/PIFNRHISSALIR(5’-GATATAGTCGACTTATT AGTGATGGTGATGGTGATGTTTGCTGGCACGCTGACC-3’；SEQ ID NO：89)引物组合进行IFN-γ基因的扩增。在50μL PCR反应混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR缓冲液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP与dCTP，1μM扩增引物，100ng pJET-IFNR及1UGDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反应条件为96℃反应2分钟(1个步骤)；94℃反应30秒、55℃反应30秒、68℃反应30秒(35个循环)；68℃反应5分钟(1个步骤)。PCR反应结束后，利用琼脂糖凝胶电泳确认有无预估大小的DNA片段。然后利用PCR-MTM Clean Up system kit进行PCR产物的回收。
PCR产物以NdeI与SalI剪切后，利用T4 DNA 连接酶将DNA片段接入以相同限制酶剪切的pET29a中。将黏合产物转化进入大肠杆菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶链式反应挑选转化株。利用DNA电泳确认转化株中的重组质粒带有外插DNA后，抽取转化株中的质粒并进行DNA定序。将DNA序列正确无误的质粒命名为pET-OPTPIFNRH，其具有SEQ ID NO：90所示序列。
(7)pET-SUMO-OPTPIFNRH表达载体的构建：
以面包酵母基因体作为模板，利用SUMOF(SEQ ID NO：25)/SUMOR2(SEQ ID NO：81)引物组合进行SUMO基因的扩增。扩增条件与PCR回收方式如前所述。
以pJET-IFNR质粒(SEQ ID NO：75)作为模板，利用SUMOIFNRF(5’-GCTCACAG AGAACAGATTGGTGGTCAAGCCCCGTTTTTCAAAGAA-3’；SEQ ID NO：91)/PIFNRHISSALIR(SEQ ID NO：89)引物组合进行IFN-γ基因的扩增。在50μL PCR反应混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR缓冲液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP与dCTP，1μM扩增引物，100ng pJET-IFNR及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反应条件为96℃反应2分钟(1个步骤)；94℃反应30秒、55℃反应30秒、68℃反应30秒(35个循环)；68℃反应5分钟(1个步骤)。PCR反应结束后，利用琼脂糖凝胶电泳确认有无预估大小的DNA片段。然后利用Gel-MTM gel extraction system kit进行PCR产物的回收。
以上述的两个PCR产物作为模板，利用SUMOF(SEQ ID NO：25)/PIFNRHISSALIR(SEQID NO：89)引物组合进行聚合酶链式反应即可获得SUMO-IFN-γ融合基因。在50μL PCR反应混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR缓冲液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP与dCTP，1μM扩增引物，100ng SUMO PCR产物，100ng IFN-γPCR产物及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反应条件为96℃反应2分钟(1个步骤)；94℃反应30秒、55℃反应30秒、68℃反应1分钟(35个循环)；68℃反应5分钟(1个步骤)。PCR反应结束后，利用琼脂糖凝胶电泳确认有无预估大小的DNA片段。然后利用PCR-MTM Clean Up system kit进行PCR产物的回收。
PCR产物以KpnI与SalI剪切后，利用T4 DNA连接酶将DNA片段接入以相同限制酶剪切的pET29a中。将黏合产物转化进入大肠杆菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶链式反应挑选转化株。利用DNA电泳确认转化株中的重组质粒带有外插DNA后，抽取转化株中的质粒并进行DNA定序。将DNA序列正确无误的质粒命名为pET-SUMO-OPTPIFNRH，其具有SEQ ID NO：92所示序列。
(8)pET-OPTSUMO-OPTPIFNRH表达载体的构建：
以pET-OPTSUMO-ORF2(SEQ ID NO：43)作为模板，利用OPTSUMOF(SEQ ID NO：35)/OPTSUMOR2(SEQ ID NO：84)引物组合进行OPTSUMO基因的扩增。扩增条件与PCR回收方式如前所述。
以pJET-IFNR质粒(SEQ ID NO：75)作为模板，利用OPTSUMOIFNRF(5’-CCGT GAACAAATCGGCGGCCAAGCCCCGTTTTTCAAAGAAATC-3’；SEQ ID NO：93)/PIFNRHISSALIR(SEQ ID NO：89)引物组合进行猪干扰素γ基因的扩增。在50μLPCR反应混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR缓冲液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP与dCTP，1μM扩增引物，100ng pJET-IFNR及1U GDP-HiFiDNA聚合酶。PCR反应条件为96℃反应2分钟(1个步骤)；94℃反应30秒、55℃反应30秒、68℃反应30秒(35个循环)；68℃反应5分钟(1个步骤)。PCR反应结束后，利用琼脂糖凝胶电泳确认有无预估大小的DNA片段。然后利用Gel-MTM gel extraction system kit进行PCR产物的回收。
以上述的两个PCR产物作为模板，利用OPTSUMOF(SEQ ID NO：35)/PIFNRHISSALIR(SEQ ID NO：89)引物组合进行聚合酶链式反应即可获得OPTSUMO-IFN-γ融合基因。在50μLPCR反应混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR缓冲液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP与dCTP，1μM扩增引物，100ng OPTSUMO PCR产物，100ng猪干扰素γPCR产物及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反应条件为96℃反应2分钟(1个步骤)；94℃反应30秒、55℃反应30秒、68℃反应1分钟(35个循环)；68℃反应5分钟(1个步骤)。PCR反应结束后，利用琼脂糖凝胶电泳确认有无预估大小的DNA片段。然后利用PCR-MTM Clean Up system kit进行PCR产物的回收。
PCR产物以KpnI与SalI剪切后，利用T4 DNA连接酶将DNA片段接入以相同限制酶剪切的pET29a中。将黏合产物转化进入大肠杆菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶链式反应挑选转化株。利用DNA电泳确认转化株中的重组质粒带有外插DNA后，抽取转化株中的质粒并进行DNA定序。将DNA序列正确无误的质粒命名为pET-OPTSUMO-OPTPIFNRH，其具有SEQ ID NO：94所示序列。
(9)pBA-OPTSUMO-OPTPIFNRH表达载体的构建：
pET-OPTSUMO-OPTPIFNRH以NdeI与SalI剪切后，利用Gel-MTM gel extractionsystem kit回收含有OPTSUMO-IFR-γ融合基因的DNA片段。利用T4 DNA连接酶将DNA片段接入以相同限制酶剪切的pBCM-araM11中。将黏合产物转化进入大肠杆菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶链式反应挑选转化株。利用DNA电泳确认转化株中的重组质粒带有外插DNA后，抽取转化株中的质粒并进行DNA定序。将DNA序列正确无误的质粒命名为pBA-OPTSUMO-OPTPIFNRH，其具有SEQ ID NO：95所示序列。
重组猪干扰素的表达及纯化
(1)重组猪干扰素的表达：
将pET-OPTPIFNAH(SEQ ID NO：79)、pBA-OPTPIFNAH(SEQ ID NO：80)、pET-SUMO-OPTPIFNAH(SEQ ID NO：83)、pET-OPTSUMO-OPTPIFNAH(SEQ ID NO：86)及pBA-OPTSUMO-OPTPIFNAH(SEQ ID NO：87)分别转化至E.coli Shuffle(NEB,USA)中；将pET-OPTPIFNRH(SEQ ID NO：90)、pET-SUMO-OPTPIFNHR(SEQ ID NO：92)、pET-OPTSUMO-OPTPIFNRH(SEQ IDNO：94)及pBA-OPTSUMO-OPTPIFNRH(SEQ ID NO：95)分别转化入E.coli BL21(DE3)中。将转化株接种于含有康那霉素(最终浓度为30μg/mL)的LB培养基中，于37℃与180rpm的条件下进行振荡培养。经隔夜培养后，菌液以1：100的比例接种至含有康那霉素(最终浓度为30μg/mL)的LB培养基中。于37℃与180rpm的条件下进行振荡培养。将细菌培养至以分光光度计量测细胞浓度达OD600约0.4～0.6，加入0.1mM IPTG于25℃与180rpm的条件下进行蛋白质的诱导表达。诱导4小时后，离心(8,000×g，30分钟，4℃)收集菌体部分并以蛋白质电泳观察重组猪干扰素的表达情形。另亦针对菌体进行可溶性蛋白质与不可溶性蛋白质的划分并以蛋白质电泳观察重组猪干扰素的可溶性表达情形。
请参见图9中(A)至(E)的实验结果。结果显示本发明藉由E.coli Shuffle宿主成功生产可溶性重组猪IFN-α与SUMO-IFN-α融合蛋白，可免除折叠步骤，以避免折叠效率不佳影响生物活性的问题。在SUMO-IFN-α融合蛋白表达部分，将SUMO基因的密码子经最佳化后，可提升SUMO-IFN-α融合蛋白的产量。不同表达系统对SUMO-IFN-α融合蛋白表达的影响结果显示，利用突变型阿拉伯糖诱导表达系统生产SUMO-IFN-α的产量较高(155.07mg/L；图9中(E))。又请参见图9中(F)至(I)的实验结果。结果显示利用SUMO融合的策略可增进重组猪IFN-γ的可溶性。SUMO基因的密码子经最佳化后，可提升SUMO-IFN-γ融合蛋白的产量。不同表达系统对SUMO-IFN-γ融合蛋白表达的影响结果显示，利用T7诱导表达系统及突变型阿拉伯糖诱导表达系统生产SUMO-IFN-γ的产量皆相当理想。
(2)重组SUMO蛋白酶表达载体pET-D-SUMOP的构建与表达：
为了剪切前述段落中所述于大肠杆菌表达系统中表达的猪干扰素，以取得不带有SUMO蛋白质片段的猪干扰素，本实验中将通过大肠杆菌表达系统生产SUMO蛋白酶。所属领域技术人员亦可采用其他方式取得的SUMO蛋白酶进行此步骤。
以面包酵母基因体作为模板，利用SUMOPF(SEQ ID NO：47)/SUMOPENZR(5’-GATATACTCGAGTTATTTTAAAGCGTCGGT TAAAATCAAATG-3；SEQ ID NO：96)引物组合进行SUMO蛋白酶基因的扩增。在50μL PCR反应混合物中包含1倍GDP-HiFi PCR缓冲液B，200μM的dATP、dTTP、dGTP与dCTP，1μM扩增引物，200ng面包酵母基因体及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。PCR反应条件为96℃反应5分钟(1个步骤)；94℃反应30秒、55℃反应30秒、68℃反应30秒(35个循环)；68℃反应5分钟(1个步骤)。PCR反应结束后，利用琼脂糖凝胶电泳确认有无预估大小的DNA片段。然后利用PCR-MTM Clean Up system kit进行PCR产物的回收。
自酵母菌基因体扩增的SUMO蛋白酶基因以BamHI与XhoI剪切后，利用T4DNA连接酶将DNA片段接入以BamHI与SalI剪切的pET-D中。将黏合产物转化进入大肠杆菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶链式反应挑选转化株。利用DNA电泳确认转化株中的重组质粒带有外插DNA后，抽取转化株中的质粒并进行DNA定序。将DNA序列正确无误的质粒命名为pET-D-SUMOP，其具有SEQ ID NO：97所示序列。
将pET-D-SUMOP(SEQ ID NO 97)转化入E.coli BL21(DE3)中。将E.coli BL21(DE3)转化株接种于含有康那霉素(最终浓度为30μg/mL)的LB培养基中，于37℃与180rpm的条件下进行振荡培养。经隔夜培养后，菌液以1：100的比例接种至含有康那霉素(最终浓度为30μg/mL)的LB培养基中。于37℃与180rpm的条件下进行振荡培养。将细菌培养至以分光光度计量测细胞浓度达OD600约0.4～0.6，加入0.1mM IPTG于28℃与180rpm的条件下进行蛋白质的诱导表达。诱导4小时后，离心(8,000×g，30分钟，4℃)收集菌体部分。
(3)重组猪干扰素的剪切与纯化：
将分别带有SUMO-猪干扰素融合蛋白表达载体与SUMO蛋白酶表达载体的转化株经诱导表达后，离心(8,000×g，30分钟，4℃)收集菌体部分。将收集的菌体悬浮于适量的Lysis buffer(20mM sodium phosphate,500mM NaCl,pH 7.4)中，使其于600nm下的吸光值达50。利用超声波破碎仪将菌体破碎后，离心(8,000×g，15分钟，4℃)收集上清液部分。将纯化的重组SUMO-猪干扰素融合蛋白与重组蛋白酶(SUMO蛋白酶)以重量比值为4的比例混合，于4℃静置16小时；此阶段中，SUMO-猪干扰素融合蛋白会被SUMO蛋白酶剪切成SUMO蛋白质与C端带有His标签的猪干扰素。
接着采用固定化金属离子亲和层析法进行蛋白质纯化。纯化的方式是利用蛋白质液相层析系统
Figure GDA0003098700790000332
prime plus搭配5mL HiTrapTM Ni excel管柱进行。以25mL Lysisbuffer平衡管柱后，将融合蛋白剪切溶液注入HiTrapTM Ni excel管柱。待样品注入完成后，以100mL清洗缓冲液(20mM sodium phosphate,500mM NaCl,30mM imidazole,pH 7.4)洗除非特异性结合的蛋白质。最后以150mL Elution buffer(20mM sodium phosphate,500mMNaCl,250mM imidazole,pH 7.4)洗脱树脂上的重组猪干扰素并利用蛋白质电泳观察纯化情形(如图10中所示)。
实施例四：本发明的防治猪圆环病毒2型感染的组合物的制备及应用。
本实施例是使用前述实施例二及实施例三所制得的ORF2、SUMO-ORF2融合蛋白、及猪干扰素制备防治猪圆环病毒2型感染的组合物。在许多样品中，该组合物进一步包含MONTANIDETM ISA 563VG佐剂(SEPPIC,France)及/或MONTANIDETM GEL 01佐剂(SEPPIC,France)。将各项成分依下列各实验设计混合，再接种于仔猪，以观察诱发的免疫反应或是否产生不良反应(如，呕吐、发抖、精神抑郁、呼吸急促及施打部位肿胀情形；若出现3种以上的前述症状且症状出现的比例高于50％，则判定该组合物的安全性较低)。
(1)实验1：猪干扰素含量对本发明组合物的安全性的影响：
选择3周龄田间仔猪14头，以随机方式进行分组，共分为A～G七组，每组猪只数目为2头。各组进行1次肌肉注射免疫，免疫剂量为2mL。有关各疫苗成分如下表六。于施打疫苗当天与隔天进行观察并记录不良临床反应出现比例。
表六：实验1的实验设计。
Figure GDA0003098700790000331
Figure GDA0003098700790000341
实验结果显示(表七)，经接种V-001样品的猪只呈现精神抑郁的临床症状，但无其他不良反应。经接种V-002样品的猪只出现呕吐与发抖的症状。此外，V-003样品的安全性较具疑虑，而经接种V-004样品、V-005样品、或V-006样品的猪只的不良反应较为轻微。据此后续试验中猪干扰素的含量将维持于每剂量(2mL)为25μg。
表七：实验1的实验结果。
Figure GDA0003098700790000342
(2)实验2：佐剂含量对本发明组合物的安全性的影响：
选择3周龄田间仔猪73头，以随机方式进行分组，共分为A与B两组；A组猪只数目为38头，B组则为35头。各组进行1次肌肉注射免疫，免疫剂量为2mL。有关各疫苗成分如下表八。于施打疫苗当天与隔天进行观察并记录不良临床反应出现比例。
表八：实验2的实验设计。
Figure GDA0003098700790000343
实验结果显示(表九)，V-009样品的安全性较高，但V-008样品的安全性亦可接受。
表九：实验2的实验结果。
Figure GDA0003098700790000351
(3)实验3：不同佐剂对本发明组合物的免疫诱发效果的影响：
本实验于家畜卫生试验所动物用药品检定分所基因改造产品(geneticallymodified organisms,GMOs)动物舍中进行。选择4周龄无特定病原猪只11头，以随机方式进行分组，共分为A～E五组；A～D为实验组，每组猪只数目为2头，E组为对照组(Control)，猪只头数为3头。A～D组的猪只于4与6周龄各进行1次肌肉注射免疫，免疫剂量为2mL；E组不进行免疫处理。有关各疫苗成分如下表十。
表十：实验3的实验设计。
Figure GDA0003098700790000352
各组猪只于8周龄时，进行PCV2攻毒，并于攻毒后4周，全数进行剖检。于猪只免疫前(4周龄)、免疫后(6与8周龄)及攻毒后(9、10、11、12周龄)进行血清与血浆样品的收集。利用市售ELISA套组(BioCheck,Netherlands)测定血清中抗PCV2抗体的效价。利用即时定量聚合酶链式反应测定血浆中的病毒含量。
实验结果显示V-009、V-010、V-011、及V-012皆能诱发抗ORF2抗体产生(图11)，且能降低实验猪只的病毒血症(图12)。从实验结果亦可观察到每剂量(2mL)含有67μg ORF2的含量即可产生足够的免疫效果(V-011及V-012)。
(4)实验4：采用SUMO-ORF2融合蛋白或OFR2对本发明组合物的免疫诱发效果的影响：
本实验于家畜卫生试验所动物用药品检定分所基因改造产品动物舍中进行。选择4周龄无特定病原猪只16头，以随机方式进行分组，共分为A～E五组；A～D为实验组，每组猪只数目为3头，E组为对照组，猪只头数为4头。A～D组的猪只于4与6周龄各进行1次肌肉注射免疫，免疫剂量为2mL；E组不进行免疫处理。有关各疫苗成分如下表十一。
表十一：实验4的实验设计。
Figure GDA0003098700790000361
各组猪只于8周龄时，进行PCV2攻毒，并于攻毒后5周，全数进行剖检。在特定时间点下进行血清与血浆样品的收集。利用市售ELISA套组测定血清中抗PCV2抗体的效价。利用即时定量聚合酶链式反应测定血浆中的病毒含量。
实验结果显示各样品都能诱发猪只产生抗PCV2抗体，其中又以V-013样品(含27μg的ORF2融合蛋白)的效果最好(图13)。此外，所有样品都能降低猪只的病毒血症(图14)。
(5)实验5：猪干扰素α与猪干扰素γ对本发明组合物的免疫诱发效果的影响：
本实验于病原污染程度较低且无PCV2感染的牧场中进行。选用无感染PCV2的4周龄1代SPF猪只20头。以随机方式进行分组，共分为A～E五组，每组猪只数目为4头；A～D为实验组，E组为对照组。A～D组的猪只于4与7周龄各进行1次肌肉注射免疫，免疫剂量为2mL；E组不进行免疫处理。有关各疫苗成分如下表十二。在特定时间点下进行血清样品的收集。利用市售ELISA套组测定血清中抗PCV2抗体的效价。
表十二：实验5的实验设计。
Figure GDA0003098700790000362
实验结果显示，单独添加IFN-α(V-018)或IFN-γ(V-019)于本发明组合物中对于诱发免疫反应均有增强的效果；其中添加IFN-α的效果优于添加IFN-γ。另一方面，于本发明组合物中同时添加IFN-α与IFN-γ(V-020)可诱发更好的免疫反应，显示在本发明组合物中，IFN-α与IFN-γ对于增强免疫反应具有协同效果(图15)。
序列表
<110> 财团法人农业科技研究院
<120> 猪圆环病毒2型的外鞘蛋白质的制备方法及含该外鞘蛋白质的医药组合物
<130> WPI15TW0556-CN
<160> 100
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> DNA
<213> ENTEROBACTERIA PHAGE T7
<400> 1
tttaacttta 10
<210> 2
<211> 10
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 2
aggagg 06
<210> 3
<211> 10
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 3
tg 02
<210> 4
<211> 89
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EXPRESSION CASSETTE
<400> 4
ggatcctacc tgacgctttt tatcgcaact tgctactgtt tctccatacc cgtttttttg 60
tttaacttta agaaggagga atacatatg 89
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 5
accagcgcac ttcggcagc 19
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 6
aatacttaca gcgcacttct ttcgttttc 29
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 7
caatatggat ccatgacgta tccaaggagg cgtttc 36
<210> 8
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 8
gatatagtcg acttagggtt taagtggggg gtctttaaga ttaa 44
<210> 9
<211> 702
<212> DNA
<213> porcine circovirus
<400> 9
atgacgtatc caaggaggcg tttccgcaga cgaagacacc gcccccgcag ccatcttggc 60
cagatcctcc gccgccgccc ctggctcgtc cacccccgcc accgttaccg ctggagaagg 120
aaaaatggca tcttcaacac ccgcctctcc cgcaccttcg gatatactgt aaaggctagc 180
acagtcagaa cgccctcctg ggcggtggac atgatgagat ttaatattaa cgactttgtt 240
cccccgggag gggggaccaa caaaatctct ataccctttg aatactacag aataagaaag 300
gttaaggttg aattctggcc ctgctcccca atcacccagg gtgacagggg agtgggctcc 360
actgctgtta ttctagatga taactttgta actaaggcca cagccctaac ctatgacccc 420
tatgtaaact actcctcccg ccatacaatc ccccaaccct tctcctacca ctcccggtac 480
tttaccccca aacctgtcct tgattccact attgattact tccaaccaaa cagcaaaagg 540
aatcagattt ggctgaggct acaaacctcg gcaaatgtgg accacgtagg cctcggcact 600
gcgttcgaaa acagtaaata cgaccaggac tacaatatcc gtgtaactat gtatgtacaa 660
ttcagagaat ttaatcttaa agacccccca cttaaaccct aa 702
<210> 10
<211> 73
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 10
atgacctacc cgcgtcgtcg tttccgtcgt cgtcgtcacc gtccgcgttc tcacctgggt 60
cagatcctgc gtc 73
<210> 11
<211> 93
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 11
agacgggtgt tgaagatacc gtttttacga cgccaacggt aacggtgacg cgggtgaacc 60
agccacggac gacgacgcag gatctgaccc agg 93
<210> 12
<211> 77
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 12
aacggtatct tcaacacccg tctgtctcgt accttcggtt acaccgttaa agcgtctacc 60
gttcgtaccc cgtcttg 77
<210> 13
<211> 85
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 13
attttgttgg taccaccacc cggcggaacg aagtcgttga tgttgaaacg catcatgtca 60
accgcccaag acggggtacg aacgg 85
<210> 14
<211> 84
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 14
cgggtggtgg taccaacaaa atctctatcc cgttcgaata ctaccgtatc cgtaaagtta 60
aagttgagtt ttggccgtgc tctc 84
<210> 15
<211> 86
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 15
gtaacgaagt tgtcgtccag gataaccgcg gtagaaccaa caccacggtc accctgggtg 60
atcggagagc acggccaaaa ctcaac 86
<210> 16
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 16
gttatcctgg acgacaactt cgttaccaaa gcgaccgcgc tgacctacga cccgtacgtt 60
aactactctt ctcgtcacac catcccgcag 90
<210> 17
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 17
cggctggaag tagtcgatgg tagagtccag aaccggtttc ggggtgaagt aacgagagtg 60
gtaagagaac ggctgcggga tggtgtgacg 90
<210> 18
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 18
ctaccatcga ctacttccag ccgaactcta aacgtaacca gatctggctg cgtctgcaga 60
cctctgcgaa cgttg 75
<210> 19
<211> 67
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 19
ctggtcgtat ttagagtttt cgaacgcggt acccagacca acgtggtcaa cgttcgcaga 60
ggtctgc 67
<210> 20
<211> 64
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 20
cgttcgaaaa ctctaaatac gaccaggact acaacatccg tgttaccatg tacgttcagt 60
tccg 64
<210> 21
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 21
ttacggtttc agcggcgggt ctttcaggtt aaactcacgg aactgaacgt acatggtaac 60
<210> 22
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 22
gatataggat ccatgaccta cccgcgtcgt cgtttc 36
<210> 23
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 23
caatatgtcg acttattacg gtttcagcgg cgggtc 36
<210> 24
<211> 705
<212> DNA
<213> porcine circovirus
<400> 24
atgacctacc cgcgtcgtcg tttccgtcgt cgtcgtcacc gtccgcgttc tcacctgggt 60
cagatcctgc gtcgtcgtcc gtggctggtt cacccgcgtc accgttaccg ttggcgtcgt 120
aaaaacggta tcttcaacac ccgtctgtct cgtaccttcg gttacaccgt taaagcgtct 180
accgttcgta ccccgtcttg ggcggttgac atgatgcgtt tcaacatcaa cgacttcgtt 240
ccgccgggtg gtggtaccaa caaaatctct atcccgttcg aatactaccg tatccgtaaa 300
gttaaagttg agttttggcc gtgctctccg atcacccagg gtgaccgtgg tgttggttct 360
accgcggtta tcctggacga caacttcgtt accaaagcga ccgcgctgac ctacgacccg 420
tacgttaact actcttctcg tcacaccatc ccgcagccgt tctcttacca ctctcgttac 480
ttcaccccga aaccggttct ggactctacc atcgactact tccagccgaa ctctaaacgt 540
aaccagatct ggctgcgtct gcagacctct gcgaacgttg accacgttgg tctgggtacc 600
gcgttcgaaa actctaaata cgaccaggac tacaacatcc gtgttaccat gtacgttcag 660
ttccgtgagt ttaacctgaa agacccgccg ctgaaaccgt aataa 705
<210> 25
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 25
gatataggta ccatgtcgga ctcagaagtc aatcaag 37
<210> 26
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 26
caatatggat ccaccaccaa tctgttctct gtgagc 36
<210> 27
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 27
atgagcgata gcgaagtgaa ccaagaagcg aaaccggaag tgaaaccgga agtgaaac 58
<210> 28
<211> 61
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 28
gctgccgtca ctaactttca ggttgatgtg ggtttccggt ttcacttccg gtttcacttc 60
c 61
<210> 29
<211> 62
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 29
cctgaaagtt agtgacggca gctctgaaat tttctttaag atcaaaaaga ccacgccgct 60
gc 62
<210> 30
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 30
tgccctgacg tttggcaaac gcttccatca ggcgacgcag cggcgtggtc ttttt 55
<210> 31
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 31
tttgccaaac gtcagggcaa ggaaatggat agtctgcgtt tcctgtatga cgg 53
<210> 32
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 32
ttccggggtt tgatccgcct ggatgcgaat accgtcatac aggaaacgca gac 53
<210> 33
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 33
gcggatcaaa ccccggaaga cctggacatg gaagacaacg acattatcga agc 53
<210> 34
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 34
gccgccgatt tgttcacggt gtgcttcgat aatgtcgttg tcttcc 46
<210> 35
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 35
caatatggta ccatgagcga tagcgaagtg aaccaag 37
<210> 36
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 36
gatataggat ccgccgccga tttgttcacg g 31
<210> 37
<211> 294
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 37
atgagcgata gcgaagtgaa ccaagaagcg aaaccggaag tgaaaccgga agtgaaaccg 60
gaaacccaca tcaacctgaa agttagtgac ggcagctctg aaattttctt taagatcaaa 120
aagaccacgc cgctgcgtcg cctgatggaa gcgtttgcca aacgtcaggg caaggaaatg 180
gatagtctgc gtttcctgta tgacggtatt cgcatccagg cggatcaaac cccggaagac 240
ctggacatgg aagacaacga cattattgaa gcacaccgtg aacaaatcgg cggc 294
<210> 38
<211> 82
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 38
gatatacata tgaaaaaaaa attcgtatcg catcaccatc accatcacag cggtggtggt 60
accccagatc tgggtaccct gg 82
<210> 39
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 39
gctagttatt gctcagcgg 19
<210> 40
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 40
aaaaaaaaat tcgtatcg 18
<210> 41
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 41
catcaccatc accatcac 18
<210> 42
<211> 6315
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PLASMID
<400> 42
atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60
ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120
tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagtgcggcc gcaagcttgt 180
cgacttaggg tttaagtggg gggtctttaa gattaaattc tctgaattgt acatacatag 240
ttacacggat attgtagtcc tggtcgtatt tactgttttc gaacgcagtg ccgaggccta 300
cgtggtccac atttgccgag gtttgtagcc tcagccaaat ctgattcctt ttgctgtttg 360
gttggaagta atcaatagtg gaatcaagga caggtttggg ggtaaagtac cgggagtggt 420
aggagaaggg ttgggggatt gtatggcggg aggagtagtt tacatagggg tcataggtta 480
gggctgtggc cttagttaca aagttatcat ctagaataac agcagtggag cccactcccc 540
tgtcaccctg ggtgattggg gagcagggcc agaattcaac cttaaccttt cttattctgt 600
agtattcaaa gggtatagag attttgttgg tcccccctcc cgggggaaca aagtcgttaa 660
tattaaatct catcatgtcc accgcccagg agggcgttct gactgtgcta gcctttacag 720
tatatccgaa ggtgcgggag aggcgggtgt tgaagatgcc atttttcctt ctccagcggt 780
aacggtggcg ggggtggacg agccaggggc ggcggcggag gatctggcca agatggctgc 840
gggggcggtg tcttcgtctg cggaaacgcc tccttggata cgtcatggat ccaccaccaa 900
tctgttctct gtgagcctca ataatatcgt tatcctccat gtccaaatct tcaggggtct 960
gatcagcttg aattctaata ccgtcgtaca agaatcttaa ggagtccatt tccttaccct 1020
gtcttttagc gaacgcttcc atcagccttc ttaaaggagt ggtctttttg atcttaaaga 1080
agatttctga agatccatcg gacaccttta aattgatgtg agtctcaggc ttgacttctg 1140
gcttgacctc tggcttagct tcttgattga cttctgagtc cgacatggta ccaccaccgc 1200
tgtgatggtg atggtgatgc gatacgaatt tttttttcat atgtatatct ccttcttaaa 1260
gttaaacaaa attatttcta gaggggaatt gttatccgct cacaattccc ctatagtgag 1320
tcgtattaat ttcgcgggat cgagatcgat ctcgatcctc tacgccggac gcatcgtggc 1380
cggcatcacc ggcgccacag gtgcggttgc tggcgcctat atcgccgaca tcaccgatgg 1440
ggaagatcgg gctcgccact tcgggctcat gagcgcttgt ttcggcgtgg gtatggtggc 1500
aggccccgtg gccgggggac tgttgggcgc catctccttg catgcaccat tccttgcggc 1560
ggcggtgctc aacggcctca acctactact gggctgcttc ctaatgcagg agtcgcataa 1620
gggagagcgt cgagatcccg gacaccatcg aatggcgcaa aacctttcgc ggtatggcat 1680
gatagcgccc ggaagagagt caattcaggg tggtgaatgt gaaaccagta acgttatacg 1740
atgtcgcaga gtatgccggt gtctcttatc agaccgtttc ccgcgtggtg aaccaggcca 1800
gccacgtttc tgcgaaaacg cgggaaaaag tggaagcggc gatggcggag ctgaattaca 1860
ttcccaaccg cgtggcacaa caactggcgg gcaaacagtc gttgctgatt ggcgttgcca 1920
cctccagtct ggccctgcac gcgccgtcgc aaattgtcgc ggcgattaaa tctcgcgccg 1980
atcaactggg tgccagcgtg gtggtgtcga tggtagaacg aagcggcgtc gaagcctgta 2040
aagcggcggt gcacaatctt ctcgcgcaac gcgtcagtgg gctgatcatt aactatccgc 2100
tggatgacca ggatgccatt gctgtggaag ctgcctgcac taatgttccg gcgttatttc 2160
ttgatgtctc tgaccagaca cccatcaaca gtattatttt ctcccatgaa gacggtacgc 2220
gactgggcgt ggagcatctg gtcgcattgg gtcaccagca aatcgcgctg ttagcgggcc 2280
cattaagttc tgtctcggcg cgtctgcgtc tggctggctg gcataaatat ctcactcgca 2340
atcaaattca gccgatagcg gaacgggaag gcgactggag tgccatgtcc ggttttcaac 2400
aaaccatgca aatgctgaat gagggcatcg ttcccactgc gatgctggtt gccaacgatc 2460
agatggcgct gggcgcaatg cgcgccatta ccgagtccgg gctgcgcgtt ggtgcggaca 2520
tctcggtagt gggatacgac gataccgaag acagctcatg ttatatcccg ccgttaacca 2580
ccatcaaaca ggattttcgc ctgctggggc aaaccagcgt ggaccgcttg ctgcaactct 2640
ctcagggcca ggcggtgaag ggcaatcagc tgttgcccgt ctcactggtg aaaagaaaaa 2700
ccaccctggc gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc 2760
agctggcacg acaggtttcc cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgta 2820
agttagctca ctcattaggc accgggatct cgaccgatgc ccttgagagc cttcaaccca 2880
gtcagctcct tccggtgggc gcggggcatg actatcgtcg ccgcacttat gactgtcttc 2940
tttatcatgc aactcgtagg acaggtgccg gcagcgctct gggtcatttt cggcgaggac 3000
cgctttcgct ggagcgcgac gatgatcggc ctgtcgcttg cggtattcgg aatcttgcac 3060
gccctcgctc aagccttcgt cactggtccc gccaccaaac gtttcggcga gaagcaggcc 3120
attatcgccg gcatggcggc cccacgggtg cgcatgatcg tgctcctgtc gttgaggacc 3180
cggctaggct ggcggggttg ccttactggt tagcagaatg aatcaccgat acgcgagcga 3240
acgtgaagcg actgctgctg caaaacgtct gcgacctgag caacaacatg aatggtcttc 3300
ggtttccgtg tttcgtaaag tctggaaacg cggaagtcag cgccctgcac cattatgttc 3360
cggatctgca tcgcaggatg ctgctggcta ccctgtggaa cacctacatc tgtattaacg 3420
aagcgctggc attgaccctg agtgattttt ctctggtccc gccgcatcca taccgccagt 3480
tgtttaccct cacaacgttc cagtaaccgg gcatgttcat catcagtaac ccgtatcgtg 3540
agcatcctct ctcgtttcat cggtatcatt acccccatga acagaaatcc cccttacacg 3600
gaggcatcag tgaccaaaca ggaaaaaacc gcccttaaca tggcccgctt tatcagaagc 3660
cagacattaa cgcttctgga gaaactcaac gagctggacg cggatgaaca ggcagacatc 3720
tgtgaatcgc ttcacgacca cgctgatgag ctttaccgca gctgcctcgc gcgtttcggt 3780
gatgacggtg aaaacctctg acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa 3840
gcggatgccg ggagcagaca agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg 3900
ggcgcagcca tgacccagtc acgtagcgat agcggagtgt atactggctt aactatgcgg 3960
catcagagca gattgtactg agagtgcacc atatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg 4020
cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg 4080
ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc 4140
cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag 4200
gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca 4260
tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca 4320
ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg 4380
atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag 4440
gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt 4500
tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca 4560
cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg 4620
cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt 4680
tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc 4740
cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg 4800
cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg 4860
gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgaacaat aaaactgtct gcttacataa 4920
acagtaatac aaggggtgtt atgagccata ttcaacggga aacgtcttgc tctaggccgc 4980
gattaaattc caacatggat gctgatttat atgggtataa atgggctcgc gataatgtcg 5040
ggcaatcagg tgcgacaatc tatcgattgt atgggaagcc cgatgcgcca gagttgtttc 5100
tgaaacatgg caaaggtagc gttgccaatg atgttacaga tgagatggtc agactaaact 5160
ggctgacgga atttatgcct cttccgacca tcaagcattt tatccgtact cctgatgatg 5220
catggttact caccactgcg atccccggga aaacagcatt ccaggtatta gaagaatatc 5280
ctgattcagg tgaaaatatt gttgatgcgc tggcagtgtt cctgcgccgg ttgcattcga 5340
ttcctgtttg taattgtcct tttaacagcg atcgcgtatt tcgtctcgct caggcgcaat 5400
cacgaatgaa taacggtttg gttgatgcga gtgattttga tgacgagcgt aatggctggc 5460
ctgttgaaca agtctggaaa gaaatgcata aacttttgcc attctcaccg gattcagtcg 5520
tcactcatgg tgatttctca cttgataacc ttatttttga cgaggggaaa ttaataggtt 5580
gtattgatgt tggacgagtc ggaatcgcag accgatacca ggatcttgcc atcctatgga 5640
actgcctcgg tgagttttct ccttcattac agaaacggct ttttcaaaaa tatggtattg 5700
ataatcctga tatgaataaa ttgcagtttc atttgatgct cgatgagttt ttctaagaat 5760
taattcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg 5820
cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgaa attgtaaacg ttaatatttt gttaaaattc 5880
gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt tttaaccaat aggccgaaat cggcaaaatc 5940
ccttataaat caaaagaata gaccgagata gggttgagtg ttgttccagt ttggaacaag 6000
agtccactat taaagaacgt ggactccaac gtcaaagggc gaaaaaccgt ctatcagggc 6060
gatggcccac tacgtgaacc atcaccctaa tcaagttttt tggggtcgag gtgccgtaaa 6120
gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc cgatttagag cttgacgggg aaagccggcg 6180
aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg aaaggagcgg gcgctagggc gctggcaagt 6240
gtagcggtca cgctgcgcgt aaccaccaca cccgccgcgc ttaatgcgcc gctacagggc 6300
gcgtcccatt cgcca 6315
<210> 43
<211> 6315
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PLASMID
<400> 43
atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60
ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120
tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagtgcggcc gcaagcttgt 180
cgacttaggg tttaagtggg gggtctttaa gattaaattc tctgaattgt acatacatag 240
ttacacggat attgtagtcc tggtcgtatt tactgttttc gaacgcagtg ccgaggccta 300
cgtggtccac atttgccgag gtttgtagcc tcagccaaat ctgattcctt ttgctgtttg 360
gttggaagta atcaatagtg gaatcaagga caggtttggg ggtaaagtac cgggagtggt 420
aggagaaggg ttgggggatt gtatggcggg aggagtagtt tacatagggg tcataggtta 480
gggctgtggc cttagttaca aagttatcat ctagaataac agcagtggag cccactcccc 540
tgtcaccctg ggtgattggg gagcagggcc agaattcaac cttaaccttt cttattctgt 600
agtattcaaa gggtatagag attttgttgg tcccccctcc cgggggaaca aagtcgttaa 660
tattaaatct catcatgtcc accgcccagg agggcgttct gactgtgcta gcctttacag 720
tatatccgaa ggtgcgggag aggcgggtgt tgaagatgcc atttttcctt ctccagcggt 780
aacggtggcg ggggtggacg agccaggggc ggcggcggag gatctggcca agatggctgc 840
gggggcggtg tcttcgtctg cggaaacgcc tccttggata cgtcatggat ccgccgccga 900
tttgttcacg gtgtgcttcg ataatgtcgt tgtcttccat gtccaggtct tccggggttt 960
gatccgcctg gatgcgaata ccgtcataca ggaaacgcag actatccatt tccttgccct 1020
gacgtttggc aaacgcttcc atcaggcgac gcagcggcgt ggtctttttg atcttaaaga 1080
aaatttcaga gctgccgtca ctaactttca ggttgatgtg ggtttccggt ttcacttccg 1140
gtttcacttc cggtttcgct tcttggttca cttcgctatc gctcatggta ccaccaccgc 1200
tgtgatggtg atggtgatgc gatacgaatt tttttttcat atgtatatct ccttcttaaa 1260
gttaaacaaa attatttcta gaggggaatt gttatccgct cacaattccc ctatagtgag 1320
tcgtattaat ttcgcgggat cgagatcgat ctcgatcctc tacgccggac gcatcgtggc 1380
cggcatcacc ggcgccacag gtgcggttgc tggcgcctat atcgccgaca tcaccgatgg 1440
ggaagatcgg gctcgccact tcgggctcat gagcgcttgt ttcggcgtgg gtatggtggc 1500
aggccccgtg gccgggggac tgttgggcgc catctccttg catgcaccat tccttgcggc 1560
ggcggtgctc aacggcctca acctactact gggctgcttc ctaatgcagg agtcgcataa 1620
gggagagcgt cgagatcccg gacaccatcg aatggcgcaa aacctttcgc ggtatggcat 1680
gatagcgccc ggaagagagt caattcaggg tggtgaatgt gaaaccagta acgttatacg 1740
atgtcgcaga gtatgccggt gtctcttatc agaccgtttc ccgcgtggtg aaccaggcca 1800
gccacgtttc tgcgaaaacg cgggaaaaag tggaagcggc gatggcggag ctgaattaca 1860
ttcccaaccg cgtggcacaa caactggcgg gcaaacagtc gttgctgatt ggcgttgcca 1920
cctccagtct ggccctgcac gcgccgtcgc aaattgtcgc ggcgattaaa tctcgcgccg 1980
atcaactggg tgccagcgtg gtggtgtcga tggtagaacg aagcggcgtc gaagcctgta 2040
aagcggcggt gcacaatctt ctcgcgcaac gcgtcagtgg gctgatcatt aactatccgc 2100
tggatgacca ggatgccatt gctgtggaag ctgcctgcac taatgttccg gcgttatttc 2160
ttgatgtctc tgaccagaca cccatcaaca gtattatttt ctcccatgaa gacggtacgc 2220
gactgggcgt ggagcatctg gtcgcattgg gtcaccagca aatcgcgctg ttagcgggcc 2280
cattaagttc tgtctcggcg cgtctgcgtc tggctggctg gcataaatat ctcactcgca 2340
atcaaattca gccgatagcg gaacgggaag gcgactggag tgccatgtcc ggttttcaac 2400
aaaccatgca aatgctgaat gagggcatcg ttcccactgc gatgctggtt gccaacgatc 2460
agatggcgct gggcgcaatg cgcgccatta ccgagtccgg gctgcgcgtt ggtgcggaca 2520
tctcggtagt gggatacgac gataccgaag acagctcatg ttatatcccg ccgttaacca 2580
ccatcaaaca ggattttcgc ctgctggggc aaaccagcgt ggaccgcttg ctgcaactct 2640
ctcagggcca ggcggtgaag ggcaatcagc tgttgcccgt ctcactggtg aaaagaaaaa 2700
ccaccctggc gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc 2760
agctggcacg acaggtttcc cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgta 2820
agttagctca ctcattaggc accgggatct cgaccgatgc ccttgagagc cttcaaccca 2880
gtcagctcct tccggtgggc gcggggcatg actatcgtcg ccgcacttat gactgtcttc 2940
tttatcatgc aactcgtagg acaggtgccg gcagcgctct gggtcatttt cggcgaggac 3000
cgctttcgct ggagcgcgac gatgatcggc ctgtcgcttg cggtattcgg aatcttgcac 3060
gccctcgctc aagccttcgt cactggtccc gccaccaaac gtttcggcga gaagcaggcc 3120
attatcgccg gcatggcggc cccacgggtg cgcatgatcg tgctcctgtc gttgaggacc 3180
cggctaggct ggcggggttg ccttactggt tagcagaatg aatcaccgat acgcgagcga 3240
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agtgggattg gttcaaattt attggtgtaa agattttatc aagtttatca atttgtgtct 600
tctttctctt catccacctc cggacgcctt gataacccct ttctgataaa ttggtataga 660
aaaacgaatt aaacgccact gtattagggg tagatttttc aatgtatttc ataaaaaact 720
caatgatagt gtcatttagc catcttcgtg gtgccaaggt cttaaaatca cgtactgtta 780
tctctatatt atctctattc attaactgag tattttctct agatgccaaa gctttttgta 840
cttggtcatc gtctttttca tttaattcag gaacaaggga tccaacgatg ctgattgccg 900
ttccggcaaa cgcggtccgt tttttcgtct cgtcgctggc agcctccggc cagagcacat 960
cctcataacg gaacgtgccg gacttgtaga acgtcagcgt ggtgctggtc tggtcagcag 1020
caaccgcaag aatgccaacg gcagcaccgt cggtggtgcc atcccacgca accagcttac 1080
ggctggaggt gtccagcatc agcggggtca ttgcaggcgc tttcgcactc aatccgccgg 1140
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ctttgctcgt catggtaccc agatctgggc tgtccatgtg ctggcgttcg aatttagcag 1260
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ggaattgtta tccgctcaca attcccctat agtgagtcgt attaatttcg cgggatcgag 1380
atcgatctcg atcctctacg ccggacgcat cgtggccggc atcaccggcg ccacaggtgc 1440
ggttgctggc gcctatatcg ccgacatcac cgatggggaa gatcgggctc gccacttcgg 1500
gctcatgagc gcttgtttcg gcgtgggtat ggtggcaggc cccgtggccg ggggactgtt 1560
gggcgccatc tccttgcatg caccattcct tgcggcggcg gtgctcaacg gcctcaacct 1620
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cttatcagac cgtttcccgc gtggtgaacc aggccagcca cgtttctgcg aaaacgcggg 1860
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tggcgggcaa acagtcgttg ctgattggcg ttgccacctc cagtctggcc ctgcacgcgc 1980
cgtcgcaaat tgtcgcggcg attaaatctc gcgccgatca actgggtgcc agcgtggtgg 2040
tgtcgatggt agaacgaagc ggcgtcgaag cctgtaaagc ggcggtgcac aatcttctcg 2100
cgcaacgcgt cagtgggctg atcattaact atccgctgga tgaccaggat gccattgctg 2160
tggaagctgc ctgcactaat gttccggcgt tatttcttga tgtctctgac cagacaccca 2220
tcaacagtat tattttctcc catgaagacg gtacgcgact gggcgtggag catctggtcg 2280
cattgggtca ccagcaaatc gcgctgttag cgggcccatt aagttctgtc tcggcgcgtc 2340
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gggaaggcga ctggagtgcc atgtccggtt ttcaacaaac catgcaaatg ctgaatgagg 2460
gcatcgttcc cactgcgatg ctggttgcca acgatcagat ggcgctgggc gcaatgcgcg 2520
ccattaccga gtccgggctg cgcgttggtg cggacatctc ggtagtggga tacgacgata 2580
ccgaagacag ctcatgttat atcccgccgt taaccaccat caaacaggat tttcgcctgc 2640
tggggcaaac cagcgtggac cgcttgctgc aactctctca gggccaggcg gtgaagggca 2700
atcagctgtt gcccgtctca ctggtgaaaa gaaaaaccac cctggcgccc aatacgcaaa 2760
ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac 2820
tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt aatgtaagtt agctcactca ttaggcaccg 2880
ggatctcgac cgatgccctt gagagccttc aacccagtca gctccttccg gtgggcgcgg 2940
ggcatgacta tcgtcgccgc acttatgact gtcttcttta tcatgcaact cgtaggacag 3000
gtgccggcag cgctctgggt cattttcggc gaggaccgct ttcgctggag cgcgacgatg 3060
atcggcctgt cgcttgcggt attcggaatc ttgcacgccc tcgctcaagc cttcgtcact 3120
ggtcccgcca ccaaacgttt cggcgagaag caggccatta tcgccggcat ggcggcccca 3180
cgggtgcgca tgatcgtgct cctgtcgttg aggacccggc taggctggcg gggttgcctt 3240
actggttagc agaatgaatc accgatacgc gagcgaacgt gaagcgactg ctgctgcaaa 3300
acgtctgcga cctgagcaac aacatgaatg gtcttcggtt tccgtgtttc gtaaagtctg 3360
gaaacgcgga agtcagcgcc ctgcaccatt atgttccgga tctgcatcgc aggatgctgc 3420
tggctaccct gtggaacacc tacatctgta ttaacgaagc gctggcattg accctgagtg 3480
atttttctct ggtcccgccg catccatacc gccagttgtt taccctcaca acgttccagt 3540
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atcattaccc ccatgaacag aaatccccct tacacggagg catcagtgac caaacaggaa 3660
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ctcaacgagc tggacgcgga tgaacaggca gacatctgtg aatcgcttca cgaccacgct 3780
gatgagcttt accgcagctg cctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac 3840
atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc 3900
cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggcg cagccatgac ccagtcacgt 3960
agcgatagcg gagtgtatac tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag 4020
tgcaccatat atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag 4080
gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc 4140
ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg 4200
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cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc 4440
gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt 4500
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cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc 4620
cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg 4680
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cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga 4860
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atgcgagtga ttttgatgac gagcgtaatg gctggcctgt tgaacaagtc tggaaagaaa 5520
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ataaccttat ttttgacgag gggaaattaa taggttgtat tgatgttgga cgagtcggaa 5640
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accacacccg ccgcgcttaa tgcgccgcta cagggcgcgt cccattcgcc a 6351
<210> 53
<211> 64
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
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tgcgatctgc cgcaaaccca cagtctggct cacacccgtg ccctgcgtct gctggcccaa 60
atgc 64
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 54
cttcgtgcgg agagccaaag tcgcgacgat gatccagaca actgaacggg gagatacgac 60
gcatttgggc cagcagacg 79
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
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actttggctc tccgcacgaa gcattcggcg gtaaccaggt gcaaaaagct caggcgatgg 60
ccctggt 67
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
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gcagtgattc atcccatgcg gccgcggagc cttccgtact gaacagttga aaggtttgct 60
gcagcatttc atgaaccagg gccatcgcct gag 93
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
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ccgcatggga tgaatcactg ctgcaccagt tttgcaccgg tctggatcag caactgcgtg 60
acctggaagc atgtgtcatg c 81
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
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tacgcaccgc cagaatcgaa tcttcttcca gcagcggggt gccttccagg ccagcttcct 60
gcatgacaca tgcttccagg tca 83
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
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attcgattct ggcggtgcgt aaatatttcc atcgcctgac gctgtatctg caggaaaaga 60
gctactctcc gtgcgcgtgg gaaatcgttc 90
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 60
ttccttttta cgcaggcggt cttgcagatt acggcttgac gagaacgaac gcatcacttc 60
ggcgcgaacg atttcccacg cgcac 85
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 61
tgcgatctgc cgcaaacc 18
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 62
ttccttttta cgcaggcggt c 21
<210> 63
<211> 3472
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PLASMID
<400> 63
gcccctgcag ccgaattata ttatttttgc caaataattt ttaacaaaag ctctgaagtc 60
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aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg cc 3472
<210> 64
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IFN-αGENE
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<210> 65
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
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caagccccgt ttttcaaaga aatcacgatc ctgaaagact acttcaatgc gtcaacctcc 60
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
<400> 66
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<210> 67
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRIMER
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<220>
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gagcgtaatg gctggcctgt tgaacaagtc tggaaagaaa tgcataaact tttgccattc 4860
tcaccggatt cagtcgtcac tcatggtgat ttctcacttg ataaccttat ttttgacgag 4920
gggaaattaa taggttgtat tgatgttgga cgagtcggaa tcgcagaccg ataccaggat 4980
cttgccatcc tatggaactg cctcggtgag ttttctcctt cattacagaa acggcttttt 5040
caaaaatatg gtattgataa tcctgatatg aataaattgc agtttcattt gatgctcgat 5100
gagtttttct aagaattaat tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa 5160
acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgaaattg taaacgttaa 5220
tattttgtta aaattcgcgt taaatttttg ttaaatcagc tcatttttta accaataggc 5280
cgaaatcggc aaaatccctt ataaatcaaa agaatagacc gagatagggt tgagtgttgt 5340
tccagtttgg aacaagagtc cactattaaa gaacgtggac tccaacgtca aagggcgaaa 5400
aaccgtctat cagggcgatg gcccactacg tgaaccatca ccctaatcaa gttttttggg 5460
gtcgaggtgc cgtaaagcac taaatcggaa ccctaaaggg agcccccgat ttagagcttg 5520
acggggaaag ccggcgaacg tggcgagaaa ggaagggaag aaagcgaaag gagcgggcgc 5580
tagggcgctg gcaagtgtag cggtcacgct gcgcgtaacc accacacccg ccgcgcttaa 5640
tgcgccgcta cagggcgcgt cccattcgcc a 5671
<210> 100
<211> 2340
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PLASMID
<400> 100
ggtaccaaag catgcaatga gctcagtaac ccgtatcgtg agcatcctct ctcgtttcat 60
cggtatcatt acccccatga acagaaatcc cccttacacg gaggcatcag tgaccaaaca 120
ggaaaaaacc gcccttaaca tggcccgctt tatcagaagc cagacattaa cgcttctgga 180
gaaactcaac gagctggacg cggatgaaca ggcagacatc tgtgaatcgc ttcacgacca 240
cgctgatgag ctttaccgca gctgcctcgc gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg 300
acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca 360
agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg ggcgcagcca tgacccagtc 420
acgtagcgat agcggagtgt atactggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg 480
agagtgcacc attgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa taccgcatca 540
ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag 600
cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag 660
gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc 720
tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc 780
agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc 840
tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt 900
cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg 960
ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat 1020
ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag 1080
ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt 1140
ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc 1200
cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta 1260
gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag 1320
atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga 1380
ttttggtcat gaacaataaa actgtctgct tacataaaca gtaatacaag gggtgttatg 1440
agccatatca acgggaaacg ctcgagtacg tatctagagc aaagcttatc gtcgacatgc 1500
atctgcagcc cgggggatcc tcgcgacata tgactagtga attcgctagc agatcttagt 1560
gacattagaa aaccgactgt aaaaagtaca gtcggcatta tctcatatta taaaagccag 1620
tcattaggcc tatctgacaa ttcctgaata gagttcataa acaatcctgc atgataacca 1680
tcacaaacag aatgatgtac ctgtaaagat agcggtaaat atattgaatt acctttatta 1740
atgaattttc ctgctgtaat aatgggtaga aggtaattac tattattatt gatatttaag 1800
ttaaacccag taaatgaagt ccatggaata atagaaagag aaaaagcatt ttcaggtata 1860
ggtgttttgg gaaacaattt ccccgaacca ttatatttct ctacatcaga aaggtataaa 1920
tcataaaact ctttgaagtc attctttaca ggagtccaaa taccagagaa tgttttagat 1980
acaccatcaa aaattgtata aagtggctct aacttatccc aataacctaa ctctccgtcg 2040
ctattgtaac cagttctaaa agctgtattt gagtttatca cccttgtcac taagaaaata 2100
aatgcagggt aaaatttata tccttcttgt tttatgtttc ggtataaaac actaatatca 2160
atttctgtgg ttatactaaa agtcgtttgt tggttcaaat aatgattaaa tatctctttt 2220
ctcttccaat tgtctaaatc aattttatta aagttcattt gatatgcctc ctaaattttt 2280
atctaaagtg aatttaggag gcttacttgt ctgctttctt cattagaatc aatccttttt 2340

Claims (13)

1.一种表达蛋白质的方法，其包含：
(a)取得阿拉伯糖诱导表达载体；其中前述阿拉伯糖诱导表达载体包含表达元件及目标蛋白质的核苷酸序列；
其中前述表达元件具有SEQ ID NO：04所示序列且包含：
启动子，其-16部位具有SEQ ID NO：03所示序列；
T7噬菌体转译增强元件，其具有SEQ ID NO：01所示序列；及
核糖体结合部位，其具有SEQ ID NO：02所示序列；
(b)将前述阿拉伯糖诱导表达载体转化至大肠杆菌宿主中，并进行目标蛋白质的诱导表达；
其中前述目标蛋白质为：猪圆环病毒2型的外鞘蛋白质或猪干扰素；
其中前述猪圆环病毒2型的外鞘蛋白质的核苷酸序列具有SEQ ID NO：09或SEQ ID NO：24所示序列；
其中前述猪干扰素为猪干扰素α或猪干扰素γ，且其核苷酸序列具有SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：76所示序列。
2.如权利要求1所述的方法，其中前述阿拉伯糖诱导表达载体进一步包含融合伴侣的核苷酸序列及/或标记分子的核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的方法，其中前述融合伴侣选自于由大肠杆菌MsyB、大肠杆菌YjgD基因、λ噬菌体D蛋白质和面包酵母菌SUMO蛋白质所组成的群组。
4.如权利要求3所述的方法，其中前述标记分子选自于由His标签、Strep II标签和Flag标签所组成的群组。
5.如权利要求1所述的方法，其中前述阿拉伯糖诱导表达载体具有SEQ ID NO：46所示序列。
6.如权利要求1所述的方法，其中前述阿拉伯糖诱导表达载体具有SEQ ID NO：80、SEQID NO：87或SEQ ID NO：95所示序列。
7.如权利要求6所述的方法，其不包含前述猪干扰素的折叠步骤。
8.如权利要求5或6所述的方法，其中前述步骤(b)之后进一步包含步骤(c)：纯化前述目标蛋白质。
9.如权利要求8所述的方法，其中前述步骤(c)之后进一步包含步骤(d)：以SUMO蛋白酶处理包含SUMO的目标蛋白质。
10.如权利要求9所述的方法，其中前述步骤(d)的处理中，前述目标蛋白质与前述SUMO蛋白酶的重量比值为4至20。
11.一种防治猪圆环病毒2型感染的组合物，其包含：
2.5至250μg/mL的猪圆环病毒2型的外鞘蛋白质；
2.5至25μg/mL的猪干扰素α；
2.5至25μg/mL的猪干扰素γ；及
医药可接受的载剂。
12.如权利要求11所述的组合物，其进一步包含医药可接受的佐剂。
13.如权利要求11所述的组合物，其包含：
3.5至170μg/mL的猪圆环病毒2型的外鞘蛋白质；
5至20μg/mL的猪干扰素α；
5至20μg/mL的猪干扰素γ；及
医药可接受的载剂。
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