KR20180082594A - 돼지 써코바이러스 2형 캡시드 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물의 제조 방법 - Google Patents

돼지 써코바이러스 2형 캡시드 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 PCV2 캡시드 단백질의 제조 방법 및 상기 캡시드 단백질을 함유하는 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 방법은 신규한 아라비노스-유도 발현 벡터를 사용하여 상기 PCV2 캡시드 단백질의 합성 효율을 향상시킨다. 한편, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 캡시드 단백질과 다른 유리한 구성 요소를 적절한 비율로 조합하여 우수한 면역-유도 효과를 얻는다.

Description

돼지 써코바이러스 2형 캡시드 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물의 제조 방법
본 발명은 PCV2 캡시드 단백질의 제조 방법에 관한 것으로, 특히 원핵 세포 발현 시스템을 이용한 PCV2 캡시드 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
돼지 써코바이러스 2형(PCV2)은 전 세계적으로 돼지의 산업에 큰 영향을 미치는 바이러스성 병원균이다. PCV2는 증상이 발열, 림프절 종증, 체중 감소 또는 약화, 호흡 곤란, 설사, 신체 창백, 때로는 황달 등인 이유후전신성소모성증후군(PMWS)을 주로 유발한다. 또한 이는 돼지 피부염 및 신병증성 증후군(PDNS), 전염성 선천성 진전(ICT) 및 생식 장애를 유발할 수 있다. 또한 다른 바이러스성 또는 박테리아성 병원균과 조합하여 PCV2의 감염은 돼지 호흡기 질환 복합체(PRDC)를 유발한다. 돼지에서 PCV2의 감염으로 유발된 질병은 생존율 및 사료 전환율을 감소시켜 돼지 생산자에게 심각한 경제적 손실을 가져온다.
올-인/올-아웃(AIAO), 양호한 위생 관리, 심한 질병을 가진 돼지의 제거 또는 분리, 백신 접종과 같이 현장에서 PCV2 예방 및 제어를 위한 20가지 사료 공급 및 관리 방법이 제안된다. 이 중, 백신 접종은 PCV2 감염률을 효과적으로 감소시키고 생존율을 더욱 증가시킬 수 있다. 현재의 분야에서 PCV2 백신은 비활성화된 PCV2 백신, 비활성화된 바큘로바이러스 서브유닛 백신 및 비활성화된 PCV1-PCV2 키메라 바이러스 백신을 포함하는 3가지 카테고리로 분류된다(Beach and Meng, 2012; Chanhee, 2012).
비활성화된 PCV2 백신은 돼지 신장 세포주 PK-15를 PCV2로 감염시키고, 바이러스를 수확하고, 바이러스를 비활성화시키고, 바이러스를 항원보강제와 혼합함으로써 생산된다. 비활성화된 바큘로바이러스 서브유닛 백신의 경우, 곤충 세포는 PCV2 캡시드 단백질을 암호화하는 ORF2 유전자를 운반하는 바큘로바이러스로 형질감염되어 항원 ORF2를 발현시킨다. 항원이 세포에서 발현되는 경우, 백신은 세포를 함유하는 배양 배지를 초음파로 분쇄하고, 바이러스를 비활성화시키고, 바이러스를 항원보강제와 혼합함으로써 제조된다. 항원이 세포 외 환경으로 분비되면 백신은 세포 배양 상등액을 수집하고, 바이러스를 비활화시키고, 바이러스를 항원보강제와 혼합함으로써 제조된다. 비활성화된 PCV1-PCV2 키메라 바이러스 백신은 PCV1 ORF2를 PCV2 ORF2로 대체하고, 세포를 감염시키고, 바이러스를 수확하고, 바이러스를 비활성화시키고, 바이러스를 항원보강제와 혼합함으로써 제조된다.
현재의 PCV2 백신 생산 방법은 모두 바이러스를 배양하는 방법에 기반을 두고 있기 때문에, 이들 방법은 제조 시간이 길고 생산 비용이 높다는 단점이 있다. PCV2 백신의 비용을 줄이기 위해, 이 분야의 연구자들은 백신 항원 ORF2를 생산하기 위해 배양 비용이 더 낮은 재조합 대장균을 사용하려고 하였다. 그러나, 상기 방법은 ORF2의 생산이 낮고, 재조합 ORF2의 바이러스 유사 입자를 형성할 수 없고, 공정이 복잡하거나, 면역이 약한 문제점이 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 PCV2 백신의 생산 시간 및 비용을 줄이기 위한 PCV2 캡시드 단백질의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 PCV2 감염을 예방하기 위한 조성물을 제공하는 것이다. 상기 조성물은 PCV2 캡시드 단백질을 활성 성분으로 사용하고, 산업을 위해 PCV2 감염을 예방하는 도구를 제공하기에 적합한 항원보강제를 함유한다.
본 발명의 다른 목적은 돼지 인터페론의 생산 시간 및 비용을 줄이고 PCV2 감염 예방 조성물에 돼지 인터페론의 응용을 용이하게 하기 위한 돼지 인터페론의 제조 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음 단계를 포함하여, 단백질을 발현하는 방법을 제공한다: (a) 아라비노스-유도 발현 벡터를 얻는 단계, 여기서 아라비노스-유도 발현 벡터는 발현 요소 및 표적 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다; 여기서 발현 요소는 프로모터; SEQ ID NO: 01을 갖는 T7 파지 번역 증강 요소; SEQ ID NO: 02를 갖는 리보솜 결합 부위를 포함한다; (b) 아라비노스-유도 발현 벡터를 대장균 숙주로 형질 전환시키고 표적 단백질의 발현을 유도하는 단계; 여기서 표적 단백질은 PCV2 캡시드 단백질 또는 돼지 인터페론이다.
바람직하게는, 프로모터의 -16 부위는 SEQ ID NO: 03을 갖는다.
바람직하게는, 발현 요소는 SEQ ID NO: 04를 갖는다.
바람직하게는, 아라비노스-유도 발현 벡터는 융합 파트너를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및/또는 마커 분자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 융합 파트너는 대장균의 MsyB, 대장균의 YjgD, 람다 파지의 D 단백질, 베이커(Baker) 효모의 SUMO 단백질 또는 이들의 조합인 것이 바람직하다. 바람직하게는, 마커 분자는 His 태그, Strep II 태그, FLAG 태그 또는 이들의 조합이다.
바람직하게는, 표적 단백질은 SEQ ID NO: 09 또는 SEQ ID NO: 24로부터 암호화된 PCV2 캡시드 단백질이다. 바람직하게는, 아라비노스-유도 발현 벡터는 SEQ ID NO: 46을 갖는다.
바람직하게는, 돼지 인터페론은 돼지 인터페론-α 또는 돼지 인터페론-γ이다. 바람직하게는, 표적 단백질은 돼지 인터페론이고, 돼지 인터페론은 SEQ ID NO: 64 또는 SEQ ID NO: 76으로부터 암호화된다. 바람직하게는, 아라비노스-유도 발현 벡터는 SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 87 또는 SEQ ID NO: 95를 갖는다. 바람직하게는, 상기 방법은 돼지 인터페론을 다시 접는 단계를 포함하지 않는다.
바람직하게는, 상기 방법은 (b) 단계 후에 (c) 단계: 표적 단백질을 정화하는 단계를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 상기 방법은 (c) 단계 이후 (d) 단계: 표적 단백질을 SUMO 단백질 분해 효소로 처리하는 단계를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 단계 (d)에서, 표적 단백질 대 SUMO 단백질 분해 효소의 중량비는 4 내지 20이다.
본 발명은 2.5 내지 170㎍/mL의 PCV2 캡시드 단백질; 2.5 내지 25㎍/mL의 돼지 인터페론-α; 2.5 내지 25㎍/mL의 돼지 인터페론-γ; 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 PCV2 감염을 예방하기 위한 조성물을 추가로 제공한다.
바람직하게는, 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 항원보강제를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 약학적으로 허용 가능한 항원보강제는 MONTANIDETM ISA 536 VG 항원보강제, MONTANIDETM GEL 01 항원보강제, 프로인트 완전 또는 불완전 항원보강제, 알루미늄 겔, 계면활성제, 폴리음이온 폴리머, 펩타이드, 오일 에멀젼 또는 이들의 조합이다.
바람직하게는, 상기 조성물은 3.5 내지 250 ㎍/mL의 PCV2 캡시드 단백질; 5 내지 20 ㎍/mL의 돼지 인터페론-α; 5 내지 20㎍/mL의 돼지 인터페론-γ; 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.
요약하면, 본 발명은 주로 아라비노스-유도 발현 벡터를 사용하여 단백질을 발현시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 백신에서 항원보강제로서 사용되는 PCV2 캡시드 단백질 및 돼지 인터페론의 합성을 효율적으로 촉진시킨다. 한편, 본 발명의 약학적 조성물은 캡시드 단백질과 다른 유리한 구성 요소를 적절한 비율로 조합하여 우수한 면역원성 유도 효과를 얻는다. 따라서, 본 발명은 본 분야에서 PCV2의 예방 및 치료에 상당한 이점을 갖는다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
도 1은 실시예 1에서 제조된 PCV2 캡시드 단백질의 5개 발현 벡터의 개략도이다.
도 2는 단백질 전기 영동 및 웨스턴 블롯을 사용하여 형질 전환 후 대장균 숙주에서 실시예 1에서 제조된 5개 발현 벡터의 단백질 발현의 결과를 나타낸다. (A) 단백질 전기 영동 결과. (B) 웨스턴 블롯의 결과; 레인 1: BL21(DE3)/pET29a; 레인 2: BL21(DE3)/pET-SUMO-ORF2; 레인 3: BL21(DE3)/pET-OPTSUMO-ORF2; 레인 4: 로제타 2/pET-SUMO-ORF2; 레인 5: BL21(DE3)/pET-SUMO-OPTORF2; 레인 6: BL21(DE3)/pET-OPTSUMO-OPTORF2; 레인 7: BL21/pBA-OPTSUMO-OPTORF2.
도 3은 단백질 전기 영동을 사용하여 형질 전환 후 대장균 숙주에서 실시예 1에서 제조된 4개 발현 벡터에 의해 발현된 융합 단백질의 용해도를 나타낸다. T: 총 세포 용해물; S: 가용성 단백질 분획; IS : 불용성 단백질 분획. 화살표는 표적 단백질을 나타낸다.
도 4는 플라스미드 pBA-OPTSUMO-OPTORF2를 보유하는 대장균 BL21(DE3)에 의해 발현된 단백질의 전기 영동 사진 및 고정화된 금속 이온 친화성 크로마토 그래피에 의한 단백질 정제를 나타낸다. 레인 1: 대장균 BL21(pBA-OPTSUMO-OPTORF2)의 총 세포 용해물; 레인 2: 정제된 융합 단백질.
도 5는 전기 영동 및 웨스턴 블랏을 사용하여 실시예 2의 숙주 세포[대장균 BL21(DE3)]에서 재조합 SUMO 단백질 분해 효소(SUMOPH) 및 재조합 D-SUMO 단백질 분해 효소(DSUMOPH)의 단백질 발현의 결과를 나타낸다. (A) 단백질 전기 영동의 결과. (B) 웨스턴 블롯의 결과. T: 총 세포 용해물; S: 가용성 단백질 분획; IS: 불용성 단백질 분획. 화살표는 표적 단백질을 나타낸다.
도 6은 플라스미드 pET-SUMOPH 및 pET-D-SUMOPH를 보유하는 대장균 BL21(DE3)에 의해 발현된 단백질의 전기 영동 사진 및 고정화된 금속 이온 친화성 크로마토 그래피에 의한 단백질 정제를 나타낸다. 레인 1: 정제된 SUMO 단백질 분해 효소(SUMOPH); 레인 2: 정제된 D-SUMO 단백질 분해 효소(DSUMOPH).
도 7은 정제된 SUMO-ORF2, 분해된 SUMO-ORF2 및 정제된 ORF2의 전기 영동 사진을 나타낸다. 레인 1: 정제된 SUMO-ORF2 융합 단백질. 레인 2: SUMO-ORF2와 D-SUMO 단백질 분해 효소의 절단 혼합물. 레인 3: 정제된 ORF2(100kDa 분자량 차단 막으로 여과된 절단 혼합물).
도 8은 SUMO-ORF2 융합 단백질(A), 분해된 SUMO-ORF2(단백질 분해 효소에 의해 절단된 SUMO-ORF2 융합 단백질) (B), 정제된 ORF2(C)의 바이러스 유사 입자의 투과 전자 현미경 이미지를 나타낸다.
도 9는 실시예 3에서 재조합 돼지 인터페론의 단백질 발현의 전기 영동 사진을 나타낸다. T: 총 세포 용해물; S: 가용성 단백질 분획. (A) pET-OPTPIFNAH/대장균 셔플; (B) pBA-OPTPIFNAH/대장균 셔플; (C) pET-SUMO-OPTPIFNAH/대장균 셔플; (D) pET-OPTSUMO-OPTPIFNAH/대장균 셔플; (E) pBA-OPTSUMO-OPTPIFNAH/대장균 셔플; (F) pET-OPTPIFNRH/대장균 BL21(DE3); (G) pET-SUMO-OPTPIFNRH/대장균 BL21(DE3); (H) pET-OPTSUMO-OPTPIFNRH/대장균 BL21(DE3); (I) pBA-OPTSUMO-OPTPIFNRH/대장균 BL21(DE3). 화살표는 표적 단백질을 나타낸다.
도 10은 실시예 3에서 발현된 정제된 재조합 돼지 인터페론의 전기 영동 사진을 나타낸다. 레인 1: 대장균 셔플(pET-OPTPIFNAH)에 의해 발현된 정제된 융합 단백질; 레인 2: D-SUMO 단백질 분해 효소[pET-D-SUMOP/대장균 BL21(DE3) 세포 파괴]에 의해 절단되어 정제된 대장균 셔플(pBA-OPTSUMO-OPTPIFNAH)에 의해 발현된 융합 단백질; 레인 3: D-SUMO 단백질 분해 효소[pET-D-SUMOP/대장균 BL21(DE3) 세포 파괴]에 의해 절단되어 정제된 대장균 BL21(DE3)(pET-OPTSUMO-OPTPIFNRH)에 의해 발현된 융합 단백질.
도 11은 실시예 4의 실험 3의 샘플에 의해 유도된 돼지에서 항-PCV2 항체 역가의 ELISA 결과를 나타낸다.
도 12는 실시예 4의 실험 3의 샘플에 의해 돼지에서 감소된 바이러스 혈증의 수준을 나타낸다.
도 13은 실시예 4의 실험 4의 샘플에 의해 유도된 돼지에서 항-PCV2 항체 역가의 ELISA 결과를 나타낸다.
도 14는 실시예 4의 실험 4의 샘플에 의해 돼지에서 감소된 바이러스 혈증의 수준을 나타낸다.
도 15는 실시예 4의 실험 5의 샘플에 의해 유도된 돼지에서 항-PCV2 항체 역가의 ELISA 결과를 나타낸다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 시점에서와 같이 대장균 발현 시스템을 통해 PCV2 캡시드 단백질을 생산하려는 시도가 있어 왔지만, 아직 저 수율의 단점을 극복하지는 못했다. 따라서, PCV2의 전염병 예방의 진전에 장애가 있다.
본 발명의 방법은 PCV2 캡시드 단백질을 제조하기 위해 대만 특허 출원 제103146225호(출원일: 2014년 12월 30일)에 본 출원인이 개시한 아라비노스-유도 발현 요소를 사용한다. 대만 특허 출원 제103146225호의 전체 내용이 참조로서 본 발명에 포함된다.
본 발명에 사용된 "표적 단백질"은 원핵 발현 시스템에 의해 발현되도록 의도된 단백질을 의미한다. 본 발명에서, 상기 표적 단백질은 PCV2 캡시드 단백질, 돼지 인터페론-α 또는 돼지 인터페론-γ이다.
본 발명에 사용된 "표적 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열" 또는 다른 유사한 기술은 생체 내 또는 생체 외 전사/번역 메카니즘에 의해 상기 표적 단백질을 형성할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 따라서, 본 발명의 "PCV2 캡시드 단백질을 암호화하는 염기 서열" 또는 "돼지 인터페론을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열"은 상기와 같이 정의된다. 유사하게, 본 발명의 "융합 파트너를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열" 또는 "마커 분자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열"은 이전과 동일하게 정의된다.
본 발명에 사용된 "융합 파트너"는 상기 합성된 표적 단백질의 용해도를 증가시키는데 사용되는 분자를 의미한다. 상기 목적을 위해서, 융합 파트너를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 상기 표적 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 유전자 공학 방법에 의해 동일한 발현 벡터에서 제조되어, 상기 융합 파트너는 융합 단백질로서 상기 융합 파트너와 합성된다. 상기 융합 파트너는, 예를 들어, 대장균의 MsyB, 대장균의 YjgD, 람다 파지의 D 단백질, 베이커 효모의 SUMO 단백질 또는 이들의 조합이나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 사용된 "마커 분자"는 상기 표적 단백질의 합성 관찰을 용이하게하거나 상기 표적 단백질의 정제를 용이하게 하는 분자를 의미한다. 상기 목적을 위해, 마커 분자의 뉴클레오타이드 서열 및 상기 표적 단백질의 뉴클레오타이드 서열은 유전적으로 조작된 방법으로 동일한 발현 벡터 내에서 제조되어, 상기 표적 단백질은 융합 단백질로서 상기 마커 분자와 합성된다. 상기 마커 분자는, 예를 들어, His 태그, Strep II 태그, FLAG 태그, 또는 이들의 조합이나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 제 1 양태는 PCV2 캡시드 단백질, 돼지 인터페론-α 또는 돼지 인터페론-γ를 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (a) 아라비노스-유도 발현 벡터를 얻는 단계; 여기서 아라비노스-유도 발현 벡터는 발현 요소 및 표적 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다; 및 (b) 아라비노스-유도 발현 벡터를 대장균 숙주로 형질 전환시켜 표적 단백질의 발현을 유도하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 상기 표적 단백질은 PCV2 캡시드 단백질이다. 다른 실시태양에서, 상기 표적 단백질은 돼지 인터페론-α 또는 돼지 인터페론-γ이다.
한 바람직한 실시태양에서, 상기 발현 요소는 본 발명의 출원인에 의한 대만 특허 출원 제103146225호(출원일: 2014년 12월30일)에 기술된 바와 같다. 구체적으로, 상기 발현 요소는 프로모터; T7 파지 번역 증강 요소; 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 예를 들어, 상기 성능 요소는 대만 특허 출원 제103146225호에 기술된 araB-M11 발현 요소이다.
한 바람직한 실시태양에서, 상기 T7 파지 번역 증강 요소는 SEQ ID NO: 01을 갖는다. 한 바람직한 실시태양에서, 상기 리보좀 결합 부위는 SEQ ID NO: 02를 갖는다. 한 바람직한 실시태양에서, 상기 프로모터의 -16 부위는 SEQ ID NO: 03을 갖는다. 한 바람직한 실시태양에서, 상기 발현 요소는 SEQ ID NO: 04를 갖는다.
다른 실시태양에서, 상기 단계 (b)는 추가로 상기 표적 단백질을 정제하는 단계 (c)가 이어진다. 본 발명의 방법에서 His 태그가 마커 분자로서 사용되는 경우, 표적 단백질은 고정화된 금속 이온 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.
다른 실시태양에서, SUMO 단백질이 본 발명의 방법에서 상기 융합 파트너로 사용되는 경우, 상기 (c) 단계 후에 상기 (d) 단계가 추가로 포함된다: 표적 단백질은 SUMO 단백질 분해 효소로 처리된다. 상기 언급된 "처리된"은 SUMO 융합 파트너가 SUMO 단백질 분해 효소에 의해 절단되어 표적 단백질이 SUMO 단백질로부터 분리된다는 것을 의미한다.
다른 실시태양에서, SUMO 단백질 분해 효소는 T7 발현 벡터에 의해 생산된다. 한 바람직한 실시태양에서, 상기 처리에서, 표적 단백질 대 SUMO 단백질 분해 효소의 중량비는 4 내지 20이다.
한 바람직한 실시태양에서, 상기 방법은 돼지 인터페론의 재접힘 단계를 포함하지 않는다. 당업자는 원핵 세포 발현 시스템에서 "재접힘 단계"는 요소 또는 염산 구아니딘을 사용하여 봉입체를 용해시킨 다음 투석 및 다른 단계에 의해 얻어진 폴리펩타이드의 재접힘에 의해 폴리펩타이드의 3차 구조 또는 4차 구조를 형성하는 과정을 의미한다는 것을 이해할 수 있다. 따라서, 본 발명의 "돼지 인터페론의 재접힘 단계를 포함하지 않음"은 본 발명의 방법으로 제조된 폴리펩타이드가 요소 또는 염산 구아니딘 및 투석을 사용하지 않고 원하는 단백질로 스스로 접힐 수 있다는 것을 이해할 수 있다.
다른 실시태양에서, 숙주는 대장균이다. 바람직하게는, 대장균은 BL21, BL21(DE3), 로제타 2 또는 셔플이다.
본 발명의 제 2 양태는 PCV2 캡시드 단백질, 돼지 인터페론-α, 돼지 인터페론-γ 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 PCV2 감염을 예방하기 위한 조성물이다.
한 바람직한 실시태양에서, PCV2 감염을 예방하기 위한 조성물은 2.5 내지 250 ㎍/mL의 PCV2 캡시드 단백질; 2.5 내지 25 ㎍/mL의 돼지 인터페론-α; 2.5 내지 25 ㎍/mL의 돼지 인터페론-γ; 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 또 다른 바람직한 실시태양에서, PCV2 감염을 예방하기 위한 조성물은 3.5 내지 170 ㎍/mL의 PCV2 캡시드 단백질; 5 내지 20 ㎍/mL 돼지 인터페론-α; 5 내지 20 ㎍/mL의 돼지 인터페론-γ; 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.
한 바람직한 실시태양에서, PCV2 캡시드 단백질은 본 발명의 방법에 의해 생산된다. 바람직한 실시태양에서, 돼지 인터페론-α 및/또는 돼지 인터페론-γ는 본 발명의 방법에 의해 생성된 것이다.
본 발명의 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 의학/약학적 양태로부터 조성물에서 PCV2 캡시드 단백질, 돼지 인터페론-α 및/또는 돼지 인터페론-γ에 의한 PCV2 감염을 예방하는 목적에 부정적 영향을 주지 않는 물질을 의미한다. 다른 실시태양에서, 약학적으로 허용 가능한 담체는, 예를 들어, 물, 인산염 완충 식염수, 알코올, 글리세린, 키틴, 알긴산염, 콘드로이틴, 비타민 E, 미네랄 또는 이들의 조합이나 이에 제한되지 않는다.
한 바람직한 실시태양에서, 조성물은 약학적으로 허용 가능한 항원보강제를 추가로 포함한다. 본 발명의 "약학적으로 허용 가능한 항원보강제"는 조성물에서 PCV2 캡시드 단백질, 돼지 인터페론-α 및/또는 돼지 인터페론-γ에 의한 PCV2 감염의 예방 목적을 용이하게 하고 의학/약학적 양태로부터 면역원성을 증가시키는 는 물질을 의미한다. 또 다른 실시태양에서, 약학적으로 허용 가능한 항원보강제는, 예를 들어, MONTANIDETM ISA 536 VG 항원보강제, MONTANIDETM GEL 01 항원보강제, 프로인트 완전 또는 불완전 항원보강제, 알루미늄 겔, 계면활성제, 폴리음이온 폴리머, 펩타이드, 오일 에멀젼 또는 이들의 조합이다. 한 바람직한 실시태양에서, 약학적으로 허용 가능한 항원보강제는 MONTANIDETM ISA 536 VG 항원보강제, MONTANIDETM GEL 01 항원보강제 또는 이들의 조합이다.
본 발명의 연구 방법은 다음 실시예에서 보다 상세히 설명될 것이다. 그러나, 다음 내용은 더 나은 이해를 위해 본 발명의 특징만을 설명한다. 당업자는 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다음의 내용을 수정할 수 있으며, 당해 분야의 일반적인 지식에 기초하여 이들을 변형 할 수 있지만, 여전히 본 발명의 범위 내에 속한다.
실시예 1: PCV2 캡시드 단백질(PCV2 ORF2) 발현 벡터의 제조.
PCV2 바이러스의 분리 및 서열화
아픈 돼지의 비장 및 림프절과 같은 림프 기관은 PCV2 감염을 가진 돼지 농장에서 얻었다(Yunlin, Taiwan). 멸균 가위로 절단한 후, 림프 기관을 멸균 연삭 막자와 연삭 막대로 갈고, 적절한 양의 멸균 인산 완충액을 가하여 혼합하여 에멀젼을 제조하였다. 에멀젼을 원심 분리하여(6,000 xg, 20분) 상등액을 수집한 다음 상등액을 체로 걸러서 조직 파편을 제거하였다. DNA 추출은 DNA 정제 키트(DNeasy Blood & Tissue kit; Qiagen, USA)를 사용하여 수행하였다. 100μL의 에멀젼 상등액을 180μL의 ATL 완충액 및 20μL의 단백질 분해 효소 K(10mg/mL)에 첨가하고 56℃에서 2시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 200μL의 무수 알코올을 첨가하고 잘 혼합한다. 모든 용액을 수집 튜브에 놓인 스핀 컬럼으로 옮겨서 6,000 x g에서 1분 동안 원심 분리하였다. 스핀 컬럼을 새로운 수집 튜브에 놓고 500μL의 AW1 완충액을 튜브에 첨가하고 튜브를 6,000 x g에서 1분 동안 원심 분리하였다. 새로운 수집 튜브에 스핀 컬럼을 놓고, 스핀 컬럼에 500μL의 AW2 완충액을 첨가하고 스핀 컬럼을 20,630 x g에서 5분 동인 원심 분리하였다. 스핀 컬럼을 멸균 에펜도르프(eppendorf)에 놓고 적당한 양의 멸균 탈 이온수를 첨가하여 DNA를 용리시켰다.
PCVF(5'-ACCAGCGCACTTCGGCAGC-3', SEQ ID NO: 05) 및 PCVR(5'-AATACTTACAGCGCACTTCTTTCGTTTTC-3'; SEQ ID NO: 06)의 프라이머를 디자인하고, PCV2 게놈 DNA를 중합 효소 연쇄 반응(PCR)으로 증폭시켰다. PCR 반응 혼합물의 부피는 100μL이었고, 림프관 기관으로부터 추출한 10μL의 DNA, 10μL의 10 x Taq 완충액, 200μM의 dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP, 1μM의 증폭 프라이머, 2.5U의 DreamTaq DNA 중합 효소(Thermo, USA)를 포함한다. PCR 반응 조건은 94℃에서 5분(1 사이클); 94℃에서 30초, 59℃에서 30초, 72℃에서 1분 30초(35 사이클); 72℃에서 7분(1 사이클)이었다. DNA 전기 영동을 사용하여 예측된 크기의 DNA 단편의 존재를 확인하였다.
PCR 생산물을 PCR-MTM 클린 업(Clean Up) 키트(GMbiolab, Taiwan)로 회수하고 yT&A 클로닝 벡터 키트(Yeastern, Taiwan)를 사용하여 TA 클로닝하였다. 실험 절차는 yT&A 클로닝 벡터 키트에 대한 제조자의 매뉴얼을 기초로 수행되었다. 5μL의 회수 및 정제된 PCR 생산물을 2μL의 yT&A 벡터, 1μL의 결찰 완충액 A, 1μL의 결찰 완충액 B, 및 1μL의 T4 DNA 리가아제(2 unit/μL)와 잘 혼합하였다. 혼합물을 22℃에서 30분 동안 배양하였다. 1μL의 결찰 혼합물을 대장균 ECOS 9-5로 형질 전환시켰다(Yeastern, Taiwan). 형질 전환된 세포를 1 mL의 SOC 회수 배지에 첨가하고 37℃, 250rpm에서 60분 동안 진탕시켰다. 그 후, 적당한 양의 박테리아 용액을 암피실린(최종 농도 100㎍/mL)을 함유하는 고체 배지에 적용하고, 37℃에서 16시간 동안 배양하였다.
그 후, 형질 전환체를 콜로니 중합 효소 연쇄 반응으로 선택하였다. 콜로니 중합 효소 연쇄 반응의 과정은 다음과 같다. 먼저, 50μL의 2 x 선혼합 반응 버퍼(GMbiolab, Taiwan), 0.5μL의 100mM PCVF 프라이머, 0.5μL의 100mM PCVR 프라이머, 및 49μL의 살균수를 에펜도르프에 첨가하고 잘 섞는다. PCR 반응액을 PCR 튜브(10μL/튜브)에 분배하였다. PCR은 이쑤시개로 PCR 튜브에 콜로니를 넣은 후에 수행되었다. PCR 반응 조건은 95℃에서 5분(1 사이클); 95℃에서 30초, 59℃에서 30초, 72℃에서 1분30초 (25 사이클); 72℃에서 7분(1 사이클)이었다. DNA 전기 영동을 사용하여 예측된 크기의 DNA 단편의 존재를 확인하였다. 형질 전환체 내의 재조합 플라스미드가 삽입 DNA를 가지고 있음을 확인한 후, 형질 전환체 내의 플라스미드를 추출하고 DNA 서열 분석을 수행하였다(Tri-I Biotech, Inc.). PCV2 DNA를 함유하는 플라스미드를 pTA-PCV2로 명명하였다.
ORF2 유전자(즉, 캡시드 단백질을 암호화하는 유전자)의 증폭 및 코돈-최적화
(1) ORF2 유전자의 증폭:
pTA-PCV2를 주형으로 사용하고 ORF2F/ORF2R 프라이머 세트(ORF2F; 5'-CAATATGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGCGTTTC-3'; SEQ ID NO: 07 및 ORF2R; 5'-GATATAGTCGACTTAGGGTTTAAGTGGGGGGTCTTTAAGATTAA-3'; SEQ ID NO: 08)를 사용하여 ORF2 유전자의 증폭을 수행하였다. 50μL PCR 반응 혼합물은 1 x GDP-HiFi PCR 완충액 B, 200μM dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP, 1μM 증폭 프라이머, 100ng pTA-PCV2 및 1U GDP-HiFi DNA 중합 효소를 함유하였다. PCR 반응 조건은 96℃에서 2분(1 사이클); 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 68℃에서 30초(35 사이클); 68℃에서 5분(1 사이클)이었다. 아가로스 겔 전기 영동을 사용하여 PCR 생산물이 예측된 크기의 DNA 단편을 포함하는지를 확인하였다. 다음으로, PCR-MTM 클린업 키트를 사용하여 PCR 생산물을 회수하였다. 서열 분석 결과에 기초하여, ORF2 유전자의 서열은 SEQ ID NO: 09로 나타내어진다.
(2) 코돈-최적화 ORF2(OPTORF2)의 유전자 합성:
ORF2의 아미노산 서열은 대장균의 바람직한 코돈에 기초하여 뉴클레오타이드 서열을 역전시켰다. 프라이머를 상기 뉴클레오타이드 서열: OPTORF2-T2, OPTORF2-T4, OPTORF2-T5, OPTORF2-T6, OPTORF2-T7, OPTORF2-T8, OPTORF2-T9, OPTORF2-T10, OPTORF2-T11, OPTORF2-T12, OPTORF2F 및 OPTORF2R에 기초하여 디자인하였다. 프라이머의 서열을 표 1에 도시한다.
코돈-최적화 ORF2(OPTORF2) 유전자의 합성에 사용되는 프라이머
명칭 SEQ ID NO 서열 (5' to 3')
OPTORF2-T1 SEQ ID NO: 10 ATGACCTACCCGCGTCGTCGTTTCCGTCGTCGTCGTCACCGTCCGCGTTCTCACCTGGGTCAGATCCTGCGTC
OPTORF2-T2 SEQ ID NO: 11 AGACGGGTGTTGAAGATACCGTTTTTACGACGCCAACGGTAACGGTGACGCGGGTGAACCAGCCACGGACGACGACGCAGGATCTGACCCAGG
OPTORF2-T3 SEQ ID NO: 12 AACGGTATCTTCAACACCCGTCTGTCTCGTACCTTCGGTTACACCGTTAAAGCGTCTACCGTTCGTACCCCGTCTTG
OPTORF2-T4 SEQ ID NO: 13 ATTTTGTTGGTACCACCACCCGGCGGAACGAAGTCGTTGATGTTGAAACGCATCATGTCAACCGCCCAAGACGGGGTACGAACGG
OPTORF2-T5 SEQ ID NO: 14 CGGGTGGTGGTACCAACAAAATCTCTATCCCGTTCGAATACTACCGTATCCGTAAAGTTAAAGTTGAGTTTTGGCCGTGCTCTC
OPTORF2-T6 SEQ ID NO: 15 GTAACGAAGTTGTCGTCCAGGATAACCGCGGTAGAACCAACACCACGGTCACCCTGGGTGATCGGAGAGCACGGCCAAAACTCAAC
OPTORF2-T7 SEQ ID NO: 16 GTTATCCTGGACGACAACTTCGTTACCAAAGCGACCGCGCTGACCTACGACCCGTACGTTAACTACTCTTCTCGTCACACCATCCCGCAG
OPTORF2-T8 SEQ ID NO: 17 CGGCTGGAAGTAGTCGATGGTAGAGTCCAGAACCGGTTTCGGGGTGAAGTAACGAGAGTGGTAAGAGAACGGCTGCGGGATGGTGTGACG
OPTORF2-T9 SEQ ID NO: 18 CTACCATCGACTACTTCCAGCCGAACTCTAAACGTAACCAGATCTGGCTGCGTCTGCAGACCTCTGCGAACGTTG
OPTORF2-T10 SEQ ID NO: 19 CTGGTCGTATTTAGAGTTTTCGAACGCGGTACCCAGACCAACGTGGTCAACGTTCGCAGAGGTCTGC
OPTORF2-T11 SEQ ID NO: 20 CGTTCGAAAACTCTAAATACGACCAGGACTACAACATCCGTGTTACCATGTACGTTCAGTTCCG
OPTORF2-T12 SEQ ID NO: 21 TTACGGTTTCAGCGGCGGGTCTTTCAGGTTAAACTCACGGAACTGAACGTACATGGTAAC
OPTORF2F SEQ ID NO: 22 GATATAGGATCCATGACCTACCCGCGTCGTCGTTTC
OPTORF2R SEQ ID NO: 23 CAATATGTCGACTTATTACGGTTTCAGCGGCGGGTC
OPTORF2-T1 내지 OPTORF2-T12를 주형 프라이머로 사용하고, OPTORF2 및 OPTORF2R을 증폭 프라이머로 사용하였다. 오버랩-확장 중합 효소 연쇄 반응 (OEPCR)을 사용하여 코돈-최적화 ORF2 유전자를 대량 증폭시켰다. 50μL PCR 반응 혼합물은 1 x GDP-HiFi PCR 완충액 B, 200μM dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP, 1μM의 각 프라이머, 및 1U GDP-HiFi DNA 중합 효소를 함유하였다. PCR 반응 조건은 96℃에서 2분(1 사이클); 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 68℃에서 30초(35 사이클); 68℃에서 5분(1 사이클)이었다. 반응 후에, 아가로스 겔 전기 영동을 사용하여 PCR 생산물이 예측된 크기의 DNA 단편을 포함하는지를 확인하였다. 다음으로, PCR-MTM 클린업 키트를 사용하여 PCR 생산물을 회수하였다. 서열 분석 결과에 기초하여, 코돈-최적화 ORF2 유전자의 서열은 SEQ ID NO: 24로 나타내어진다.
SUMO 유전자의 증폭 및 코돈-최적화
(1) SUMO 유전자의 증폭:
선 라이트 푸드사(Sun Right Food Co.)의 DIY 인스턴트 효모로부터 분리된 빵 효모(Saccharomyces cerevisiae)를 YPD(20% 펩톤, 10% 효모 추출물, 20% 글루코오스; pH 6.5) 배지에 접종하고 30℃, 200rpm, 16시간 동안 진탕 배양 하였다. 배양 후, YeaStarTM 게놈 DNA 키트(Zymo Research, USA)를 사용하여 효모 게놈을 추출하였다. 1.5mL의 밤새 배양 브로쓰를 에펜도르프에 첨가하고, 원심 분리(2,000 x g, 5분, 실온)에 의해 박테리아 분획을 모으고 120μL의 YD 분해 완충액 및 5μL의 R-지몰라제를 완전히 혼합하고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 그런 다음 120μL의 YD 세포 용해 버퍼를 혼합물에 첨가하고 부드럽게 여러 번 혼합하였다. 250μL의 클로로포름을 혼합물에 첨가하고 1분 동안 진탕한다. 상등액을 원심 분리(10,000 x g, 2분, 실온)에 의해 수집하였다. 스핀 컬럼을 수집 튜브에 놓고 상등액을 스핀 컬럼에 첨가하였다. 원심 분리(10,000 x g, 1분, 실온) 후, 여과액을 버렸다. 300μL의 DNA 세척 완충액을 스핀 컬럼에 첨가하고 스핀 컬럼을 원심 분리 (10,000 x g, 1분, 실온)하고 여과액을 버리고 이 과정을 한 번 반복 하였다. 스핀 컬럼을 멸균된 에펜도르프에 놓고 스핀 컬럼에 적절한 양의 용출액을 첨가하고 스핀 컬럼과 에펜도르프를 원심 분리(10,000 x g, 2분, 실온)하여 게놈 DNA를 용리시켰다.
상기 단락에서 얻은 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)의 게놈 DNA를 주형으로 사용하고 SUMOF(5'-GATATAGGTACCATGTCGGACTCAGAAGTCAATCAAG-3', SEQ ID NO: 25)/SUMOR(5'-CAATATGGATCCACCACCAATCTGTTCTCTGTGAGC- 3'; SEQ ID NO: 26)를 프라이머 세트로 사용하여 SUMO 유전자를 증폭하였다. 50μL PCR 반응 혼합물은 1 x GDP-HiFi PCR 완충액 B, 200μM의 dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP, 1μM의 증폭 프라이머, 200ng의 사카로마이세스 세레비시애의 게놈 DNA 및 1U GDP-HiFi DNA 중합 효소를 함유하였다. PCR 반응 조건은 96℃에서 5분(1 사이클); 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 68℃에서 30초(35 사이클); 68℃에서 5분(1 사이클)이었다. 반응 후, 아가로스 겔 전기 영동을 사용하여 PCR 생산물이 예측된 크기의 DNA 단편을 포함하는지를 확인하였다. 다음으로, PCR-MTM 클린 업 시스템 키트를 사용하여 PCR 생산물을 회수하였다.
(2) 코돈-최적화 SUMO(OPTSUMO) 유전자의 유전자 합성:
SUMO의 아미노산 서열은 대장균의 바람직한 코돈에 기초하여 뉴클레오타이드 서열을 역전시켰다. 프라이머를 OPTSUMO-T1, OPTSUMO-T2, OPTSUMO-T3, OPTSUMO-T4, OPTSUMO-T5, OPTSUMO-T6, OPTSUMO-T7, OPTSUMO-T8, OPTSUMOF 및 OPTSUMOR와 같은 염기 서열에 기초하여 프라이머를 디자인하였다. 서열을 표 2에 도시한다.
코돈-최적화 SUMO(OPTSUMO) 유전자의 합성에 사용되는 프라이머
명칭 SEQ ID NO 서열 (5' to 3')
OPTSUMO-T1 SEQ ID NO: 27 ATGAGCGATAGCGAAGTGAACCAAGAAGCGAAACCGGAAGTGAAACCGGAAGTGAAAC
OPTSUMO-T2 SEQ ID NO: 28 GCTGCCGTCACTAACTTTCAGGTTGATGTGGGTTTCCGGTTTCACTTCCGGTTTCACTTCC
OPTSUMO-T3 SEQ ID NO: 29 CCTGAAAGTTAGTGACGGCAGCTCTGAAATTTTCTTTAAGATCAAAAAGACCACGCCGCTGC
OPTSUMO-T4 SEQ ID NO: 30 TGCCCTGACGTTTGGCAAACGCTTCCATCAGGCGACGCAGCGGCGTGGTCTTTTT
OPTSUMO-T5 SEQ ID NO: 31 TTTGCCAAACGTCAGGGCAAGGAAATGGATAGTCTGCGTTTCCTGTATGACGG
OPTSUMO-T6 SEQ ID NO: 32 TTCCGGGGTTTGATCCGCCTGGATGCGAATACCGTCATACAGGAAACGCAGAC
OPTSUMO-T7 SEQ ID NO: 33 GCGGATCAAACCCCGGAAGACCTGGACATGGAAGACAACGACATTATCGAAGC
OPTSUMO-T8 SEQ ID NO: 34 GCCGCCGATTTGTTCACGGTGTGCTTCGATAATGTCGTTGTCTTCC
OPTSUMOF SEQ ID NO: 35 CAATATGGTACCATGAGCGATAGCGAAGTGAACCAAG
OPTSUMOR SEQ ID NO: 36 GATATAGGATCCGCCGCCGATTTGTTCACGG
OPTSUMO-T1 내지 OPTSUMO-T8을 주형 프라이머로 사용하고, OPTSUMOF 및 OPTSUMOR을 증폭 프라이머로 사용하였다. 오버랩-확장 중합 효소 연쇄 반응을 사용하여 코돈-최적화 SUMO 유전자를 대량 증폭시켰다. 50μL PCR 반응 혼합물은 1 x GDP-HiFi PCR 완충액 B, 200μM dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP, 1μM의 각 프라이머, 및 1U GDP-HiFi DNA 중합 효소를 함유하였다. PCR 반응 조건은 96℃에서 2분(1 사이클); 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 68℃에서 30초(35 사이클); 68℃에서 5분(1 사이클)이었다. 반응 후에, 아가로스 겔 전기 영동을 사용하여 PCR 생산물이 예측된 크기의 DNA 단편을 포함하는지를 확인하였다. 다음으로, PCR-MTM 클린업 키트를 사용하여 PCR 생산물을 회수하였다. 서열 분석 결과에 기초하여, 코돈-최적화 SUMO 유전자의 서열은 SEQ ID NO: 37로 나타내어진다.
ORF2 융합 단백질의 발현 벡터 제조
(1) pET-DRAHIS의 제조:
pET29a를 주형으로 하고, 프라이머 세트로서 DRAF (5'-GATATACATATAAAAAAAAATTCGTATCGCATCACCATCACCATCACAGCGGTGGTGGTACCCCAGATCTGGGTACCCTGG-3'; SEQ ID NO: 38)/T7 터미네이터(GCTAGTTATTGCTCAGCGG; SEQ ID NO: 39)를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 50μL PCR 반응 혼합물은 1 x Ex TaqTM 완충액, 200μM dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP, 1μM 증폭 프라이머, 100ng pET29a 및 1.25U TakaRa Ex TaqTM DNA 중합 효소(Takara, Japan)를 함유하였다. PCR 반응 조건은 94℃에서 5분(1 사이클); 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 50초(35 사이클); 72℃에서 7분(1 사이클)이었다. 반응 후, 아가로스 겔 전기 영동을 사용하여 PCR 생산물이 예측된 크기의 DNA 단편을 포함하는지를 확인하였다. 다음으로, PCR-MTM 클린업 시스템 키트를 사용하여 PCR 산물을 회수하였다.
PCR 생산물을 NdeI 및 SalI로 절단한 후, DNA 단편을 T4 DNA 리가아제를 사용하여 동일한 제한 효소로 절단한 pET29a에 연결하였다. 결찰된 생산물을 대장균 XL1-blue(Protech, Taiwan)로 형질전환시켰다. DNA 서열의 확인을 위해 형질 전환체를 무작위로 선택하였다. 정확한 DNA 서열을 갖는 플라스미드를 pET-DRAHIS로 명명하였다. 이 플라스미드는 시작 코돈을 가지며 하류 서열(DS) AAAAAAAAATTCGTATCG(SEQ ID NO: 40) 및 His 태그 DNA 서열 CATCACCATCACCATCAC(SEQ ID NO: 41)이 이어진다.
(2) pET-SUMO-ORF2 발현 벡터의 제조:
사카로마이세스 세레비시애 게놈으로부터 SUMO 유전자를 증폭하고 KpnI 및 BamHI로 절단한 후, DNA 단편을 T4 DNA 리가아제를 사용하여 동일한 제한 효소로 절단한 pET-DRAHIS에 결찰시켰다. 결찰된 생산물을 대장균 ECOS 9-5로 형질전환시켰다. 형질 전환체는 콜로니 중합 효소 연쇄 반응에 의해 선택되었다. DNA 전기 영동에 의해 형질 전환체 내의 재조합 플라스미드가 삽입된 DNA를 운반한 것을 확인한 후, 형질 전환체 내의 플라스미드를 추출하고 DNA 서열을 결정하였다. 정확한 DNA 서열을 갖는 플라스미드는 pET-SUMO로 명명하였다.
PCV2 윤린(Yunlin) 바이러스 게놈으로부터 증폭된 ORF2 유전자를 BamHI 및 SalI로 절단한 후, DNA 단편을 T4 DNA 리가아제를 사용하여 동일한 제한 효소로 절단한 pET-SUMO에 삽입하였다. 결찰된 생산물을 대장균 ECOS 9-5로 형질 전환시켰다. 형질 전환체는 콜로니 중합 효소 연쇄 반응에 의해 선택되었다. DNA 전기 영동에 의해 형질 전환체 내의 재조합 플라스미드가 삽입된 DNA를 운반한 것을 확인한 후, 형질 전환체 내의 플라스미드를 추출하고 DNA 서열을 결정하였다. 정확한 DNA 서열을 갖는 플라스미드는 SEQ ID NO: 42의 서열을 갖는 pET-SUMO-ORF2로 명명된다.
(3) pET-OPTSUMO-ORF2 발현 벡터의 제조:
합성 OPTSUMO 유전자를 KpnI 및 BamHI로 절단한 후, DNA 단편을 T4 DNA 리가아제를 사용하여 동일한 제한 효소로 절단한 pET-DRAHIS에 연결하였다. 결찰된 생산물을 대장균 ECOS 9-5로 형질 전환시켰다. 형질 전환체는 콜로니 중합 효소 연쇄 반응에 의해 선택되었다. DNA 전기 영동에 의해 형질 전환체 내의 재조합 플라스미드가 삽입된 DNA를 운반한 것을 확인한 후, 형질 전환체 내의 플라스미드를 추출하고 DNA 서열을 결정하였다. 정확한 DNA 서열을 갖는 플라스미드를 pET-OPTSUMO로 명명하였다.
PCV2 윤린(Yunlin) 바이러스 게놈으로부터 증폭된 ORF2 유전자를 BamHI 및 SalI로 절단한 후, DNA 단편을 T4 DNA 리가아제를 사용하여 동일한 제한 효소로 절단한 pET-OPTSUMO에 삽입하였다. 결찰된 생산물을 대장균 ECOS 9-5로 형질 전환시켰다. 형질 전환체는 콜로니 중합 효소 연쇄 반응에 의해 선택되었다. DNA 전기 영동에 의해 형질 전환체 내의 재조합 플라스미드가 삽입된 DNA를 운반한 것을 확인한 후, 형질 전환체 내의 플라스미드를 추출하고 DNA 서열을 결정하였다. 정확한 DNA 서열을 갖는 플라스미드는 SEQ ID NO: 43의 서열을 갖는 pET-OPTSUMO-ORF2로 명명된다.
(4) pET-SUMO-OPTORF2 발현 벡터의 제조:
합성 OPTORF2 유전자를 BamHI 및 SalI로 절단한 후, DNA 단편을 T4 DNA 리가아제를 사용하여 동일한 제한 효소로 절단한 pET-SUMO에 연결하였다. 결찰된 생산물을 대장균 ECOS 9-5로 형질 전환시켰다. 형질 전환체는 콜로니 중합 효소 연쇄 반응에 의해 선택되었다. DNA 전기 영동에 의해 형질 전환체 내의 재조합 플라스미드가 삽입된 DNA를 운반한 것을 확인한 후, 형질 전환체 내의 플라스미드를 추출하고 DNA 서열을 결정하였다. 정확한 DNA 서열을 갖는 플라스미드는 SEQ ID NO: 44의 서열을 갖는 pET-SUMO-OPTORF2로 명명된다.
(5) pET-OPTSUMO-OPTORF2 발현 벡터의 제조:
합성 OPTORF2 유전자를 BamHI 및 SalI로 절단한 후, DNA 단편을 T4 DNA 리가아제를 사용하여 동일한 제한 효소로 절단한 pET-OPTSUMO에 삽입하였다. 결찰된 생산물을 대장균 ECOS 9-5로 형질 전환시켰다. 형질 전환체는 콜로니 중합 효소 연쇄 반응에 의해 선택되었다. DNA 전기 영동에 의해 형질 전환체 내의 재조합 플라스미드가 삽입된 DNA를 운반한 것을 확인한 후, 형질 전환체 내의 플라스미드를 추출하고 DNA 서열을 결정하였다. 정확한 DNA 서열을 갖는 플라스미드는 SEQ ID NO: 45의 서열을 갖는 pET-OPTSUMO-OPTORF2로 명명된다.
(6) pBA-OPTSUMO-OPTORF2 발현 벡터의 제조:
본 실험에서 제조된 pBA-OPTSUMO-OPTORF2는 OPTSUMO-OPTORF2의 DNA 단편을 새로운 아라비노스-유도 발현 벡터 pBCM-araM11에 삽입하여 얻었다. pBCM-araM11을 본 발명의 출원인에 의해 대만 특허 출원 제103146225호(출원일: 2014년 12월 30일) 및 제103142753호(출원일: 2014년 12월 9일)에 개시된 아라비노스-유도 발현 요소 및 pBRCMMCS(SEQ ID NO: 100)로 제조되었다. 발현 벡터의 제조 과정은 다음과 같이 기술된다.
pARABM11-GFPT를 EcoRI 및 NdeI로 절단한 후, Gel-MTM 겔 추출 시스템 키트 (GMbiolab, Taiwan)를 사용하여 araC 및 araB-M11 발현 요소를 포함하는 DNA 단편을 회수하였다. araC 및 araB-M11 발현 요소를 T4 DNA 리가아제를 사용하여 동일한 제한 효소로 절단한 pBRCMMCS에 결찰시켰다. 결찰된 생산물을 대장균 ECOS 9-5로 형질 전환시켰다. 형질 전환체를 콜로니 중합 효소 연쇄 반응에 의해 선택하고 플라스미드를 DNA 서열의 확인을 위해 추출하였다. 정확한 서열을 갖는 플라스미드는 SEQ ID NO: 98을 갖는 pBCM-araM11으로 명명된다.
pET-OPTSUMO-OPTORF2를 NdeI 및 SalI로 절단한 후, OPTUMO-OPTORF2를 포함하는 DNA 단편을 Gel-MTM 겔 추출 시스템 키트를 사용하여 회수하였다. OPTSUMO-OPTORF2를 T4 DNA 리가아제를 사용하여 동일한 제한 효소로 절단한 pBCM-araM11에 결찰하였다. 결찰된 생산물을 대장균 ECOS 9-5로 형질 전환시켰다. 형질 전환체를 콜로니 중합 효소 연쇄 반응에 의해 선택하고 플라스미드를 DNA 서열의 확인을 위해 추출하였다. 정확한 서열을 갖는 플라스미드는 SEQ ID NO: 46을 갖는 pBA-OPTSUMO-OPTORF2로 명명된다.
araB-M11 발현 인자를 포함하는 DNA 단편은 본 발명의 프로모터(-16 부분은 SEQ ID NO: 03로 나타내어진다) 및 T7 파지 번역 증강 요소(SEQ ID NO: 01) 및 리보솜 결합 부위(SEQ ID NO: 02)를 포함한다. 아라비노스-유도 발현 요소는 SEQ ID NO: 04을 갖는 대만 특허 출원 제103146225호(출원일: 2014년 12월 30일)에 도시된 바와 같다.
요약
요약하면, 5개의 PCV2 캡시드 단백질 발현 벡터를 이 실시예에서 제조하였다, 즉: pET-SUMO-ORF2(SEQ ID NO: 42) 및 pET-OPTSUMO-ORF2(SEQ ID NO: 43), pET-SUMO(SEQ ID NO: 44), pET-OPTSUMO-OPTORF2(SEQ ID NO: 45) 및 pBA-OPTSUMO-OPTORF2(SEQ ID NO: 46)를 포함한다. 도 1을 참조하기 바란다.
실시예 2 본 발명의 PCV2 캡시드 단백질의 제조.
상기한 바와 같이, 실시예 1에서 얻어진 벡터(SEQ ID NOs: 42 내지 46)는 캡시드 단백질 ORF2의 DNA를 함유하며 캡시드 단백질의 생산에 적용될 수 있다. 또한, 정제 및 용해도 성능을 위해, 표적 단백질을 SUMO 단백질 및 His 태그와 융합시켰다. 이 융합 단백질은 본 발명에서 SUMO-ORF2 융합 단백질로 지칭되며, 융합 단백질이 His 태그를 함유한다는 사실은 다시 언급되지 않을 것이다. 본 실시예는 실시예 1에 기술된 발현 벡터를 사용하여 본 발명의 SUMO-ORF2 융합 단백질을 제조할 것이다.
대장균의 형질 전환 및 재조합 SUMO-ORF2 융합 단백질의 유도 발현
(1) 실험 절차:
pET-SUMO-ORF2, pET-OPTSUMO-ORF2, pET-SUMO-OPTORF2 및 pET-OPTSUMO-OPTORF2와 같은 발현 벡터를 대장균 BL21(DE3)(Yeastern, Taiwan)으로 형질 전환시켰다. pET-SUMO-ORF2를 대장균 로제타 2(EMD Millipore, USA)로 형질 전환시켰다. pBA-OPTSUMO-OPTORF2를 대장균 BL21(New England Biolabs, USA)으로 형질 전환시켰다. 형질 전환 방법은 제조업체가 제공한 작업 절차를 따랐다.
대장균 BL21(DE3) 형질 전환체를 카나마이신(최종 농도 30㎍/mL)을 포함하는 LB 배지에 접종하고, 37℃, 180rpm으로 진탕 배양하였다. 하룻밤 배양 후, 카나마이신(최종 농도 30㎍/mL)을 함유하는 LB 배지에 박테리아 용액을 1:100의 비율로 접종하였다. 진탕 배양을 37℃ 및 180rpm에서 수행하였다. 박테리아를 분광 광도계로 측정한 약 0.4 내지 0.6 OD600의 농도로 배양하고 단백질 발현 유도를 위해 0.1 mM 아이소프로필-β-D-티오갈락토시드(IPTG)를 첨가하였다. 4시간의 유도 후, 박테리아 분획을 원심 분리(8,000 x g, 30분, 4℃)에 의해 수집하고 SUMO-ORF2 융합 단백질의 발현을 단백질 전기 영동 및 웨스턴 블롯으로 관찰하였다. 웨스턴 블롯 방법에 사용된 1차 및 2차 항체는 각각 토끼-항 6 x His 다클론 항체(Protech, Taiwan) 및 알칼라인 포스파타제-결합 염소 항-토끼 IgG(H + L)이었다. 사용된 착색제는 NBT/BCIP(Thermo, USA)이었다. 박테리아의 가용성 및 불용성 단백질도 분화되었고, SUMO-ORF2 융합 단백질의 용해도는 단백질 전기 영동에 의해 관찰되었다.
대장균 로제타 2 형질 전환체를 클로람페니콜(최종 농도 34㎍/mL) 및 카나마이신(최종 농도 30㎍/mL)을 함유하는 LB 배지에 접종하였다. 진탕 배양은 37℃ 및 180rpm에서 수행하였다. 하룻밤 배양한 후, 세균 용액을 클로람페니콜(최종 농도 34㎍/mL) 및 카나마이신(최종 농도 30㎍/mL)을 함유하는 LB 배지에 1:100의 비율로 접종하였다. 37℃ 및 180rpm에서 진탕 배양을 수행하였다. 박테리아를 분광 광도계로 측정한 약 0.4 내지 0.6 OD600의 농도로 배양하고 단백질 발현 유도를 위해 0.1 mM IPTG를 첨가하였다. 4시간의 유도 후, 균체 분획을 원심 분리(8,000 x g, 30분, 4℃)에 의해 수집하고 SUMO-ORF2 융합 단백질의 발현을 단백질 전기 영동 및 웨스턴 블롯으로 관찰하였다. 박테리아의 가용성 및 불용성 단백질도 분화되었고, SUMO-ORF2 융합 단백질의 용해도는 단백질 전기 영동에 의해 관찰되었다.
대장균 BL21 형질 전환체를 클로람페니콜(25㎍/mL)이 함유 된 LB 배지에 접종하였다. 진탕 배양은 37℃ 및 180rpm에서 수행하였다. 하룻밤 배양한 후, 박테리아 용액을 1:100의 비율로 클로람페니콜(25㎍/mL)을 함유하는 LB 배지에 접종하였다. 37℃ 및 180rpm에서 진탕 배양을 수행하였다. 박테리아를 분광 광도계로 측정 한 약 0.4 내지 0.6 OD600의 농도로 배양하고, 단백질 발현 유도를 위해 0.2% 아라비노스를 첨가하였다. 4시간의 유도 후, 균체 분획을 원심 분리(8,000 x g, 30분, 4℃)에 의해 수집하고 SUMO-ORF2 융합 단백질의 발현을 단백질 전기 영동 및 웨스턴 블롯으로 관찰하였다. 박테리아의 가용성 및 불용성 단백질도 분화되었고, SUMO-ORF2 융합 단백질의 용해도는 단백질 전기 영동에 의해 관찰되었다.
단백질 전기 영동 필름을 스캔한 후, Image Quant TL 7.0(GE Healthcare Life Sciences, USA) 소프트웨어를 사용하여 재조합 SUMO-ORF2 융합 단백질의 발현율을 평가하였고, 융합 단백질의 수율을 추가로 계산하였다.
(2) 실험 결과:
결과는, 대장균 BL21(DE3)에서 형질 전환되고 유도된 pET-SUMO-ORF2 및 pET-OPTSUMO-ORF2 그룹에서, 재조합 SUMO-ORF2 융합 단백질은 완전히 없었다는 것을 나타내었다(도 2). pET-SUMO-ORF2가 상응하는 희귀 코돈 tRNA를 생산할 수 있는 대장균 로제타 2에서 형질 전환되고 유도된 그룹에서, 재조합 SUMO-ORF2 융합 단백질이 발현될 수 있으며(도 2) 결과에 따르면 이들의 대부분이 가용성이었다(도 3). 가용성 재조합 SUMO-ORF2 융합 단백질의 수율은 46.81mg/L이다. 상기 ORF2 유전자가 대장균 BL21(DE3)에서 발현될 수 없다는 사실은 ORF2에 의해 운반된 코돈이 대장균에서 SUMO-ORF2 융합 단백질의 성능에 심각한 영향을 미친다는 것을 나타낸다.
코돈-최적화 ORF2 유전자를 갖는 pET-SUMO-OPTORF2를 대장균 BL21(DE3)으로 형질 전환하여 유도하였다. 결과는 재조합 SUMO-ORF2 융합 단백질이 성공적으로 발현되었으며(도 2) 주로 가용성 단백질이었다(도 3); 가용성 재조합 SUMO-ORF2 융합 단백질의 수율은 54.62mg/L이었다. 이 결과는 ORF2 코돈을 최적화한 후 대장균 BL21(DE3)에서 SUMO-ORF2 융합 단백질의 성능이 향상될 수 있음을 보여준다.
코돈-최적화 ORF2 전장 유전자 및 코돈-최적화 SUMO 유전자를 갖는 pET-OPTSUMO-OPTORF2 발현 벡터를 대장균 BL21(DE3)으로 형질 전환하여 유도하였다. 결과는 재조합 SUMO-ORF2 융합 단백질은 성공적으로 발현될 수 있었고(도 2), 주로 가용성 단백질이고(도 3); 가용성 재조합 SUMO-ORF2 융합 단백질의 수율은 81.66mg/L이다. 이 결과는 융합 파트너 유전자의 코돈 사용이 최적화된 후에, 대장균에서의 ORF2 융합 단백질의 성능이 더욱 향상될 수 있음을 보여준다. 이전의 연구는 SUMO 유전자 코돈의 최적화가 융합 단백질 발현을 증가시킬 수 있다는 것을 결코 보여주지 못했다. 본 발명자들은 SUMO 유전자 코돈의 최적화가 SUMO-ORF2 융합 단백질의 생산을 증가시킬 수 있다는 것을 확인하였다.
하류 서열-His 태그 DNA-코돈-최적화 SUMO 유전자-코돈-최적화 ORF2 유전자를 갖는 DNA 단편을 아라비노스-유도 발현 벡터 pBCM-araM11에 삽입하고 재조합 SUMO-ORF2 융합 단백질 생산을 위해 대장균 BL21로 형질 전환시켰다. 결과는 재조합 SUMO-ORF2 융합 단백질(도 2)은 아라비노스-유도 발현 시스템을 사용하여 생산될 수 있으며 주로 가용성 단백질이다(도 3). 이 발현 벡터를 SUMO-ORF2 융합 단백질 생산에 사용함으로써, 최고 수율(103.04mg/L)을 얻을 수 있었다. T7 발현 시스템의 최고 수율(81.66mg/L)과 비교하면, 수율은 약 1.27배 증가될 수 있다. 본 발명의 실시예 1의 각 발현 벡터는 아래 표 3에 요약된 바와 같이 이 실험에서 가용성 SUMO-ORF2 융합 단백질의 수율을 나타낸다.
가용성 SUMO-ORF2 융합 단백질의 수율
발현 벡터 숙주 - 대장균 가용성 SUMO-ORF2 융합 단백질의 수율(mg/L)
pET-SUMO-ORF2 BL21 (DE3) 0
pET-OPTSUMO-ORF2 BL21 (DE3) 0
pET-SUMO-ORF2 Rosetta2 46.81
pET-SUMO-OPTORF2 BL21 (DE3) 54.62
pET-OPTSUMO-OPTORF2 BL21 (DE3) 81.66
pBA-OPTSUMO-OPTORF2 BL21 103.04
고정화된 금속 이온 친화성 크로마토그래피를 사용하는 재조합 SUMO-ORF2 융합 단백질의 정제
단백질은 니켈 또는 코발트 이온과 공유 결합을 형성할 수 있는 이의 N 말단에 His 태그를 갖는 재조합 SUMO-ORF2 융합 단백질의 특징을 이용하여 고정화된 금속 이온 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 정제는 5 mL HiTrapTM Ni 엑셀 컬럼(GE Healthcare, Sweden)이 있는 단백질 액체 크로마토그래피 시스템 AKTA 프라임 플러스(prime plus)(GE Healthcare, Sweden)를 사용하여 수행하였다.
펠렛을 용해 완충액(50mM Tris-HCl, 500mM NaCl, pH 8.0)에 현탁시키고 초음파 파쇄기로 파쇄시켰다. 상등액을 원심 분리(8,000 x g, 15분)로 수집하였다. 컬럼을 25mL 용리 완충액으로 평형시킨 후, 파괴된 상등액을 HiTrapTM Ni 엑셀 컬럼에 주입하였다. 샘플 주입이 완료된 후, 비특이적으로 결합된 단백질을 100mL 세척 완충액(50mM Tris-HCl, 500mM NaCl, 30mM 이미다졸, pH 8.0)로 세척하였다. 마지막으로, 수지 상의 재조합 단백질은 고농도의 이미다졸의 도움으로 수지 결합 부위와 결합하기 위해 재조합 단백질과 경쟁하는 150mL 용리 완충액(50mM Tris-HCl, 500mM NaCl, 250mM 이미다졸, pH 8.0)으로 용출시켰고, 수지로부터 재조합 SUMO-ORF2 융합 단백질의 용출을 가져온다. 단백질 전기 영동을 사용하여 재조합 SUMO-ORF2 융합 단백질의 정제를 관찰하는데 사용하였다. 실험 결과는 도 4에 나타내어진다.
본 발명의 SUMO-ORF2 융합 단백질은 SUMO 단백질 분해 효소로 절단된다
이 실험은 대장균 발현 시스템으로부터 제조된 ORF2 융합 단백질을 절단하기 위해 SUMO 단백질 분해 효소를 사용하였다. 절단 후, His 태그 및 캡시드 단백질 단편을 가진 SUMO 융합 파트너 단편을 얻었다. 이 실험에서, SUMO 단백질 분해 효소는 대장균 발현 시스템을 통해 생산되었고 상기 응용분야에 적용되었다. 당업자는 다른 방식으로 얻은 SUMO 단백질 분해 효소를 사용하여 이 단계를 수행할 수 있다.
(1) 재조합 SUMO 단백질 분해 효소 발현 벡터 pET-SUMOPH의 제조:
사카로마이세스 세레비시애 게놈을 주형으로 사용하고 SUMOPF(5'-CAATATGGATCCCTTGTTCCTGAATTAAATGAAAAAGACG-3'/SEQ ID NO: 47)/SUMOPENZHISR(5'-GATATACTCGAGTTAGTGATGGTGATGGTGATGACCACTGCCGCTACCTTTTAAAGCGTCGGTTAAAATCAAATG-3; SEQ ID NO: 48)를 프라이머 세트로서 사용하여 SUMO 단백질 분해 효소를 증폭하였다. 50μL PCR 반응 혼합물은 1 x GDP-HiFi PCR 완충액 B, 200μM dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP, 1μM의 증폭 프라이머, 200ng의 사카로마이세스 세레비시애의 게놈 DNA 및 1U GDP-HiFi DNA 중합 효소를 함유하였다. PCR 반응 조건은 96℃에서 5분(1 사이클); 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 68℃에서 30초(35 사이클); 68℃에서 5분(1 사이클)이었다. 반응 후, 아가로스 겔 전기 영동을 사용하여 PCR 생산물이 예측된 크기의 DNA 단편을 포함하는지를 확인하였다. 다음으로, PCR-MTM 클린업 시스템 키트를 사용하여 PCR 생산물을 회수하였다.
효모 게놈으로부터 증폭된 SUMO 단백질 분해 효소 유전자를 BamHI 및 XhoI로 절단한 후, T4 DNA 리가아제를 사용하여 DNA 단편을 BamHI 및 SalI로 절단한 pET29a에 결찰하였다. 결찰된 생산물을 대장균 ECOS 9-5로 형질 전환시켰다. 형질 전환체는 콜로니 중합 효소 연쇄 반응에 의해 선택되었다. 형질 전환체 내의 재조합 플라스미드가 DNA 전기 영동에 의해 삽입된 DNA를 운반하는 것을 확인한 후, 형질 전환체 내의 플라스미드를 추출하고 DNA 서열을 결정하였다. 정확한 DNA 서열을 갖는 플라스미드는 SEQ ID NO: 49를 갖는 pET-SUMOPH로 명명된다.
(2) 재조합 D-SUMO 단백질 분해 효소 발현 벡터 pET-D-SUMOPH의 제조:
람다 파아지 DNA(Promega, USA)를 주형으로 사용하고 DF (5'-GATATAGGTACCATGACGAGCAAAGAAACCTTTACC-3'; SEQ ID NO: 50) 및 DR(5'-CAATATGGATCCAACGATGCTGATTGCCGTTC-3'; SEQ ID NO: 51)를 프라이머 세트로 사용하여 D 단백질 유전자를 증폭하였다. 50μL PCR 반응 혼합물은 1 x GDP-HiFi PCR 완충액 B, 200μM dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP, 1μM의 증폭 프라이머, 100ng의 람다 파지 DNA 및 1 U GDP-HiFi DNA 중합 효소를 함유하였다. PCR 반응 조건은 96℃에서 5분(1 사이클); 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 68℃에서 30초(35 사이클); 68℃에서 5분(1 사이클)이었다. 반응 후, 아가로스 겔 전기 영동을 사용하여 PCR 생산물이 예측된 크기의 DNA 단편을 포함하는지를 확인하였다. 다음으로, PCR-MTM 클린업 시스템 키트를 사용하여 PCR 생산물을 회수하였다.
람다 파아지 DNA로부터 증폭된 D 단백질 유전자를 KpnI 및 BamHI로 절단한 후, T4 DNA 리가아제를 사용하여 동일한 제한 효소로 절단한 pET29a에 DNA 단편을 결찰하였다. 결찰된 생산물을 대장균 ECOS 9-5로 형질 전환시켰다. 형질 전환체는 콜로니 중합 효소 연쇄 반응에 의해 선택되었다. 형질 전환체 내의 재조합 플라스미드가 DNA 전기 영동에 의해 삽입된 DNA를 운반하는 것을 확인한 후, 형질 전환체 내의 플라스미드를 추출하고 DNA 서열을 결정하였다. 정확한 DNA 서열을 갖는 플라스미드는 SEQ ID NO: 99를 갖는 pET-D로 명명된다.
효모 게놈으로부터 증폭된 SUMO 단백질 분해 효소 유전자를 BamHI 및 XhoI로 절단한 후, T4 DNA 리가아제를 사용하여 DNA 단편을 BamHI 및 SalI로 절단한 pET-D에 결찰시켰다. 결찰된 생산물을 대장균 ECOS 9-5로 형질 전환시켰다. 형질 전환 체는 콜로니 중합 효소 연쇄 반응에 의해 선택되었다. 형질 전환체 내의 재조합 플라스미드가 DNA 전기 영동에 의해 삽입된 DNA를 운반하는 것을 확인한 후, 형질 전환체 내의 플라스미드를 추출하고 DNA 서열을 결정하였다. 정확한 DNA 서열을 갖는 플라스미드는 SEQ ID NO: 52를 갖는 pET-D로 명명된다.
(3) 재조합 단백질 분해 효소의 유도된 발현 및 정제:
pET-SUMOPH와 pET-D-SUMOPH의 발현 벡터를 각각 대장균 BL21 (DE3)으로 형질 전환시켰다. 대장균 BL21(DE3) 형질 전환체를 카나마이신(최종 농도: 30㎍/mL)을 포함하는 LB 배지에 접종하고, 37℃ 및 180rpm에서 진탕 배양하였다. 하룻밤 배양 후, 박테리아 용액을 카나마이신(최종 농도 30㎍/mL)을 함유하는 LB 배지에 1:100 비율로 접종하였다. 37℃ 및 180rpm에서 진탕 배양을 수행하였다. 박테리아를 분광 광도계로 측정한 약 0.4 내지 0.6 OD600의 농도로 배양하고 단백질 발현 유도를 위해 0.1mM IPTG를 첨가하였다. 4시간의 유도 후, 가용성 및 불용성 단백질의 분화를 위해 원심 분리(8,000 x g, 30분, 4℃)에 의해 박테리아 분획을 수집하였다. 재조합 단백질 분해 효소의 용해도는 단백질 전기 영동 및 웨스턴 블롯에 의해 관찰되었다. 웨스턴 블럿 방법에 사용된 1차 및 2차 항체는 각각 토끼 항-His 태그 다클론 항체 및 알칼리포스파타아제 결합된 염소 항-토끼 항체이다. 사용된 착색제는 NBT/BCIP이었다. 재조합 단백질 분해 효소의 정제 방법은 재조합 ORF2 융합 단백질의 정제 방법과 동일하다.
결과는 SUMO 단백질 분해 효소 및 D-SUMO 단백질 분해 효소 모두가 대장균 BL21(DE3)에서 발 될 수 있음을 보여 주었고(도 5), 수율은 각각 20.55mg/L 및 46.94mg/L이고, D-SUMO 단백질 분해 효소의 수율이 더 높았다. 몰 수는 SUMO 단백질 분해 효소의 몰 수의 약 2.2배이었다. 이 결과는 융합 발현의 전략이 대장균에서 SUMO 단백질 분해 효소의 발현 수준을 증가시킬 수 있음을 보여준다.
단백질은 C-말단에 His-태그를 갖는 재조합 단백질 분해 효소의 특징을 이용하여 고정화된 금속 이온 친화성 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 결과는 가용성 재조합 SUMO 단백질 분해 효소와 D-SUMO 단백질 분해 효소는 고정화된 금속 이온 친화성 칼럼(도 6)을 사용하여 정제될 수 있었고, D-SUMO 단백질 분해 효소의 정제된 수율이 더 높았다. 21.50mg의 단백질은 1L 배지로부터 정제될 수 있는데, 이는 SUMO 단백질 분해 효소의 정제된 수율(15.33mg)의 약 1.4배 이다.
(4) 재조합 SUMO-ORF2 융합 단백질 절단 및 바이러스 유사 입자의 형성 관찰:
정제된 재조합 SUMO-ORF2 융합 단백질을 1:0.05의 중량비(예를 들어, 1mg의 재조합 ORF2 융합 단백질 및 0.05mg의 재조합 단백질 분해 효소)로 재조합 단백질 분해 효소(SUMO 단백질 분해 효소 또는 D-SUMO 단백질 분해 효소)와 혼합하였고 혼합물을 4℃에서 16시간 동안 배양하였다. 절단된 단백질 용액을 아미콘 울트라-15 울르타셀-100K 스핀 컬럼(Merck Millipore, USA)에 넣고 4℃에서 2,600 x g로 적당한 부피로 원심 분리하였다. 그 후, 절단된 단백질을 100kDa의 재생 셀룰로스 필터를 사용하여 여과하였다. 결과는 100kDa 멤브레인을 사용하면 융합 파트너를 효과적으로 제거할 수 있어, ORF2를 이의 융합 파트너로부터 분리하기 위해 컬럼 크로마토그래피를 사용할 필요가 없어 항원 생산 비용을 효과적으로 낮출 수 있다(도 7).
다음으로, 단백질 분해 효소 절단 및 여과에 의해 얻어진 SUMO-ORF2 융합 단백질, 단백질 분해 효소 절단 SUMO-ORF2 융합 단백질 및 ORF2 융합 단백질을 각각 구리 그리드 상에 놓고 실온에서 3분 동안 방치하였다. 그런 후에 과량의 물을 여과지로 제거한 후 우란일 아세테이트 염료를 첨가하여 음성 염색을 하였다. 염색 시간은 약 40초 내지 1분이었다. 그런 후에 과량의 염료를 여과지로 제거하고, 바이러스-유사 입자를 전계 방출 투과 전자 현미경 JEM-2100F(JEOL, Japan)로 관찰 하였다. 결과는 SUMO-ORF2 융합 단백질은 바이러스-유사 입자를 형성할 수 없었지만, 단백질 분해 효소에 의해 절단된 재조합 SUMO-ORF2 융합 단백질 및 단백질 분해 효소로 절단되어 여과된 ORF2 융합 단백질은 모두 바이러스-유사 입자를 형성 할 수 있었다는 것을 나타내었다(도 8). 투과 전자 현미경 사진에 의해 계산된 바이러스-유사 입자의 평균 입자 크기는 약 19nm이었다.
실시예 3 : 돼지 인터페론의 제조.
본 발명은 돼지 인터페론이 PCV2의 서브 유닛 백신에 특히 적합한 항원보강제로서 사용될 수 있음을 개시한다. 따라서, 본 발명의 서브 유닛 백신에 필요한 돼지 인터페론-α 및 돼지 인터페론-γ는 이 실시예의 대장균 숙주 세포에서 생산된다.
재조합 돼지의 인터페론-α(IFN-α)와 γ(IFN-γ) 유전자의 합성
(1) IFN-α 유전자의 합성:
성숙한 돼지 인터페론-α-6의 아미노산 서열은 대장균의 바람직한 코돈에 기초한 뉴클레오타이드 서열로서 역으로 유래되었다. 프라이머는 뉴클레오타이드 서열: OPTIFNA-T1, OPTIFNA-T2, OPTIFNA-T3, OPTIFNA-T4, OPTIFNA-T5, OPTIFNA-T6, OPTIFNA-T7, OPTIFNA-T8, OPTIFNAF 및 OPTIFNAR에 기초하여 디자인되었다. 서열을 표 4에 도시한다.
코돈-최적화 돼지 인터페론-α-6 유전자의 합성을 위한 프라이머.
명칭 SEQ ID NO 서열 (5' to 3')
OPTIFNA-T1 SEQ ID NO: 53 TGCGATCTGCCGCAAACCCACAGTCTGGCTCACACCCGTGCCCTGCGTCTGCTGGCCCAAATGC
OPTIFNA-T2 SEQ ID NO: 54 CTTCGTGCGGAGAGCCAAAGTCGCGACGATGATCCAGACAACTGAACGGGGAGATACGACGCATTTGGGCCAGCAGACG
OPTIFNA-T3 SEQ ID NO: 55 ACTTTGGCTCTCCGCACGAAGCATTCGGCGGTAACCAGGTGCAAAAAGCTCAGGCGATGGCCCTGGT
OPTIFNA-T4 SEQ ID NO: 56 GCAGTGATTCATCCCATGCGGCCGCGGAGCCTTCCGTACTGAACAGTTGAAAGGTTTGCTGCAGCATTTCATGAACCAGGGCCATCGCCTGAG
OPTIFNA-T5 SEQ ID NO: 57 CCGCATGGGATGAATCACTGCTGCACCAGTTTTGCACCGGTCTGGATCAGCAACTGCGTGACCTGGAAGCATGTGTCATGC
OPTIFNA-T6 SEQ ID NO: 58 TACGCACCGCCAGAATCGAATCTTCTTCCAGCAGCGGGGTGCCTTCCAGGCCAGCTTCCTGCATGACACATGCTTCCAGGTCA
OPTIFNA-T7 SEQ ID NO: 59 ATTCGATTCTGGCGGTGCGTAAATATTTCCATCGCCTGACGCTGTATCTGCAGGAAAAGAGCTACTCTCCGTGCGCGTGGGAAATCGTTC
OPTIFNA-T8 SEQ ID NO: 60 TTCCTTTTTACGCAGGCGGTCTTGCAGATTACGGCTTGACGAGAACGAACGCATCACTTCGGCGCGAACGATTTCCCACGCGCAC
OPTIFNAF SEQ ID NO: 61 TGCGATCTGCCGCAAACC
OPTIFNAR SEQ ID NO: 62 TTCCTTTTTACGCAGGCGGTC
OPTIFNA-T1 내지 OPTIFNA-T8을 주형 프라이머로 사용하였고 OPTIFNAF 및 OPTIFNAR를 증폭 프라이머로 사용하였다. 중첩-확장 중합 효소 연쇄 반응을 사용하여 코돈-최적화 IFN-α 유전자를 대량으로 증폭시켰다. 50μL PCR 반응 혼합물은 1X GDP-HiFi PCR 완충액 B, 200μM dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP, 1μM의 각 프라이머 및 1U GDP-HiFi DNA 중합 효소를 함유하였다. PCR 반응 조건은 96℃에서 2분(1 사이클); 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 68℃에서 30초(35 사이클); 68℃에서 5분(1 사이클)이었다. 반응 후, 아가로스 겔 전기 영동을 사용하여 PCR 생산물이 예측된 크기의 DNA 단편을 포함하는지를 확인하였다. 다음으로, PCR-MTM 클린업 시스템 키트를 사용하여 PCR 생산물을 회수하였다.
유전자의 클로닝은 CloneJET PCR 클로닝 키트(Thermo, USA)를 사용하여 수행하였고, 결찰 혼합물은 대장균 ECOS 9-5로 형질 전환시켰다. 형질 전환체는 콜로니 중합 효소 연쇄 반응에 의해 선택되었다. 형질 전환체 내의 재조합 플라스미드가 DNA 전기 영동에 의해 삽입된 DNA를 운반하는 것을 확인한 후, 형질 전환체 내의 플라스미드를 추출하고 DNA 서열을 결정하였다. 정확한 DNA 서열을 갖는 플라스미드는 SEQ ID NO: 63을 갖는 pJET-IFNA-6으로 명명된다. 서열 검증 후, 코돈-최적화 IFN-α 유전자는 SEQ ID NO: 64를 갖는다.
(2) IFN-γ의 합성:
성숙한 돼지 인터페론-γ의 아미노산 서열을 대장균의 바람직한 코돈에 기초한 뉴클레오타이드 서열로 역전시켰다. 프라이머를 상기 뉴클레오타이드 서열: OPTIFNR-T1, OPTIFNR-T2, OPTIFNR-T3, OPTIFNR-T4, OPTIFNR-T5, OPTIFNR-T6, OPTIFNR-T7, OPTIFNR-T8, OPTIFNRF 및 OPTIFNRR에 기초하여 디자인하였다. 서열을 표 5에 도시한다.
코돈-최적화 돼지 인터페론-γ 유전자의 합성을 위한 프라이머.
명칭 SEQ ID NO 서열 (5' to 3')
OPTIFNR-T1 SEQ ID NO: 65 CAAGCCCCGTTTTTCAAAGAAATCACGATCCTGAAAGACTACTTCAATGCGTCAACCTCCGATGTC
OPTIFNR-T2 SEQ ID NO: 66 TCGCTTTCTTCTTTCCAGTTTTTCAGGATTTCCAGGAACAGCGGACCACCATTCGGGACATCGGAGGTTGACGCATTG
OPTIFNR-T3 SEQ ID NO: 67 CTGAAAAACTGGAAAGAAGAAAGCGATAAGAAAATTATCCAGAGTCAAATCGTCTCCTTCTACTTCAAATTTTTCG
OPTIFNR-T4 SEQ ID NO: 68 CATGTCCTGTTTAATAACATCCATACTACGTTGGATCGCCTGATTGTCTTTGAAGATTTCGAAAAATTTGAAGTAGAAGGAGACGA
OPTIFNR-T5 SEQ ID NO: 69 ACGTAGTATGGATGTTATTAAACAGGACATGTTTCAGCGCTTCCTGAACGGCAGCTCTGGTAAACTGAACGATTTCGAAAAACTGATCAAAATC
OPTIFNR-T6 SEQ ID NO: 70 CAGTTCTGAGATGGCTTTACGTTGGATCTGCAGGTTGTCCACCGGGATTTTGATCAGTTTTTCGAAATCGTTC
OPTIFNR-T7 SEQ ID NO: 71 CCAACGTAAAGCCATCTCAGAACTGATCAAAGTTATGAACGATCTGTCGCCGCGCTCCAATCTGCGTAAACG
OPTIFNR-T8 SEQ ID NO: 72 TTTGCTGGCACGCTGACCCTGGAACATCGTTTGACTACGTTTACGTTTACGCAGATTGGAGCGC
OPTIFNRF SEQ ID NO: 73 CAAGCCCCGTTTTTCAAAGAA
OPTIFNRR SEQ ID NO: 74 TTTGCTGGCACGCTGACC
OPTIFNR-T1 내지 OPTIFNR-T8을 주형 프라이머로 사용하였고 OPTIFNRF 및 OPTIFNRR을 증폭 프라이머로 사용하였다. 중첩-확장 중합 효소 연쇄 반응을 사용하여 코돈-최적화 IFN-γ 유전자를 대량으로 증폭시켰다. 50μL PCR 반응 혼합물은 1X GDP-HiFi PCR 완충액 B, 200μM dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP, 1μM의 각 프라이머 및 1U GDP-HiFi DNA 중합 효소를 함유하였다. PCR 반응 조건은 96℃에서 2분(1 사이클); 94℃에서 30초, 57℃에서 30초, 68℃에서 30초(35 사이클); 68℃에서 5분(1 사이클)이었다. 반응 후, 아가로스 겔 전기 영동을 사용하여 PCR 생산물이 예측된 크기의 DNA 단편을 포함하는지를 확인하였다. 다음으로, PCR-MTM 클린업 시스템 키트를 사용하여 PCR 생산물을 회수하였다.
유전자의 클로닝은 CloneJET PCR 클로닝 키트를 사용하여 수행하였고, 결찰 혼합물은 대장균 ECOS 9-5로 형질 전환시켰다. 형질 전환체는 콜로니 중합 효소 연쇄 반응에 의해 선택되었다. 형질 전환체 내의 재조합 플라스미드가 DNA 전기 영동에 의해 삽입된 DNA를 운반하는 것을 확인한 후, 형질 전환체 내의 플라스미드를 추출하고 DNA 서열을 결정하였다. 정확한 DNA 서열을 갖는 플라스미드는 SEQ ID NO: 75를 갖는 pJET-IFNR로 명명된다. 서열 검증 후, 코돈-최적화 IFN-γ 유전자는 SEQ ID NO: 76을 갖는다.
돼지 인터페론-α 및 γ 발현 벡터의 제조
(1) pET-OPTPIFNAH 발현 벡터의 제조:
pJET-IFNA-6 플라스미드를 주형으로 사용하고 PIFNANDEIF(5'-CAATATCATATGTGCGATCTGCCGCAAACC-3'; SEQ ID NO: 77)/PIFNAHISSALIR(5'-GATATAGTCGACTTATTAGTGATGGTGATGGTGATGTTCCTTTTTACGCAGGCGGTC-3'; SEQ ID NO: 78)를 프라이머 세트로 사용하여 IFN-α 유전자를 증폭하였다. 50μL PCR 반응 혼합물은 1 x GDP-HiFi PCR 완충액 B, 200μM dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP, 1μM의 증폭 프라이머, 100ng의 pJET-IFNA-6 및 1U GDP-HiFi DNA 중합 효소를 함유하였다. PCR 반응 조건은 96℃에서 2분(1 사이클); 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 68℃에서 30 초(35 사이클); 68℃에서 5분(1 사이클)이었다. 반응 후, 아가로스 겔 전기 영동을 사용하여 PCR 생산물이 예측된 크기의 DNA 단편을 포함하는지를 확인하였다. 다음으로, PCR-MTM 클린업 시스템 키트를 사용하여 PCR 생산물을 회수하였다.
PCR 생산물을 NdeI 및 SalI로 절단한 후, T4 DNA 리가아제를 사용하여 동일한 제한 효소로 절단한 pET29a에 DNA 단편을 결찰하였다. 결찰된 생산물을 대장균 ECOS 9-5로 형질 전환시켰다. 형질 전환체는 콜로니 중합 효소 연쇄 반응에 의해 선택되었다. 형질 전환체 내의 재조합 플라스미드가 DNA 전기 영동에 의해 삽입된 DNA를 운반하는 것을 확인한 후, 형질 전환체 내의 플라스미드를 추출하고 DNA 서열을 결정하였다. 정확한 DNA 서열을 갖는 플라스미드는 SEQ ID NO: 79를 갖는 pET-OPTPIFNAH로 명명된다.
(2) pBA-OPTPIFNAH 발현 벡터의 제조:
PCR 증폭된 IFN-α 유전자를 NdeI 및 SalI로 절단한 후, T4 DNA 리가아제를 사용하여 동일한 제한 효소로 절단한 pBCM-araM11에 각각 결찰시켰다. 결찰된 생산물을 대장균 ECOS 9-5로 형질 전환시켰다. 형질 전환체는 콜로니 중합 효소 연쇄 반응에 의해 선택되었다. 형질 전환체 내의 재조합 플라스미드가 DNA 전기 영동에 의해 삽입된 DNA를 운반하는 것을 확인한 후, 형질 전환체 내의 플라스미드를 추출하고 DNA 서열을 결정하였다. 정확한 DNA 서열을 갖는 플라스미드는 SEQ ID NO: 80을 갖는 pBA-OPTPIFNAH로 명명된다.
(3) pET-SUMO-OPTPIFNAH 발현 벡터의 제조:
사카로마이세스 세레비시애 게놈을 주형으로 사용하고 SUMOF(SEQ ID NO: 25)/SUMOR2(5'-ACCACCAATCTGTTCTCTGTGAGC-3'; SEQ ID NO: 81)를 프라이머 세트로 사용하여 SUMO 유전자를 증폭시켰다. 50μL PCR 반응 혼합물은 1 x GDP-HiFi PCR 완충액 B, 200μM dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP, 1μM의 증폭 프라이머, 200ng의 사카로마이세스 세레비시애의 게놈 DNA 및 1U GDP-HiFi DNA 중합 효소를 함유하였다. PCR 반응 조건은 96℃에서 5분(1 사이클); 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 68℃에서 30초(35 사이클); 68℃에서 5분(1 사이클)이었다. 반응 후, 아가로스 겔 전기 영동을 사용하여 PCR 생산물이 예측된 크기의 DNA 단편을 포함하는지를 확인하였다. 다음으로, Gel-MTM 겔 추출 시스템 키트를 사용하여 PCR 생산물을 회수하였다.
pJET-IFNA-6 플라스미드를 주형으로 사용하고 SUMOIFNAF(5'-GCTCACAGAGAACAGATTGGTGGTTGCGATCTGCCGCAAACC-3'; SEQ ID NO: 82)/PIFNAHISSALIR(SEQ ID NO: 78)을 프라이머 세트로 사용하여 IFN-α 유전자를 증폭하였다. 50μL PCR 반응 혼합물은 1 x GDP-HiFi PCR 완충액 B, 200μM dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP, 1μM의 증폭 프라이머, 100ng의 pJET-IFNA-6 플라스미드 및 1U GDP-HiFi DNA 중합 효소를 함유하였다. PCR 반응 조건은 96℃에서 5분(1 사이클); 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 68℃에서 30초(35 사이클); 68℃에서 5분(1 사이클)이었다. 반응 후, 아가로스 겔 전기 영동을 사용하여 PCR 생산물이 예측된 크기의 DNA 단편을 포함하는지를 확인하였다. 다음으로, Gel-MTM 겔 추출 시스템 키트를 사용하여 PCR 생산물을 회수하였다.
상기에서 얻은 두 PCR 생산물을 주형으로 사용하고 SUMOF(SEQ ID NO: 25)/PIFNAHISSALIR(SEQ ID NO: 78)을 프라이머 세트로 사용하여 중합 효소 연쇄 반응을 통해 SUMO-IFN-α 융합 유전자를 얻었다. 50μL PCR 반응 혼합물은 1 x GDP-HiFi PCR 완충액 B, 200μM dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP, 1μM의 증폭 프라이머, 100ng의 SUMO PCR 생산물, 100ng의 IFN-α PCR 생산물 및 1U GDP-HiFi DNA 중합 효소를 함유하였다. PCR 반응 조건은 96℃에서 2분(1 사이클); 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 68℃에서 1분(35 사이클); 68℃에서 5분(1 사이클)이었다. 반응 후, 아가로스 겔 전기 영동을 사용하여 PCR 생산물이 예측된 크기의 DNA 단편을 포함하는지를 확인하였다. 다음으로, PCR-MTM 클린업 시스템 키트를 사용하여 PCR 생산물을 회수하였다.
PCR 생산물을 KpnI 및 SalI로 절단한 후, T4 DNA 리가아제를 사용하여 동일한 제한 효소로 절단한 pET29a에 DNA 단편을 결찰하였다. 결찰된 생산물을 대장균 ECOS 9-5로 형질 전환시켰다. 형질 전환체는 콜로니 중합 효소 연쇄 반응에 의해 선택되었다. 형질 전환체 내의 재조합 플라스미드가 DNA 전기 영동에 의해 삽입된 DNA를 운반하는 것을 확인한 후, 형질 전환체 내의 플라스미드를 추출하고 DNA 서열을 결정하였다. 정확한 DNA 서열을 갖는 플라스미드는 SEQ ID NO: 83을 갖는 pET-SUMO-OPTPIFNAH로 명명된다.
(4) pET-OPTSUMO-OPTPIFNAH 발현 벡터의 제조:
pET-OPTSUMO-ORF2(SEQ ID NO: 43)를 주형으로 사용하고 OPTSUMOF(SEQ ID NO: 35)/OPTSUMOR2(5'-GCCGCCGATTTGTTCACGG-3', SEQ ID NO: 84)를 프라이머 세트로 사용하여 OPTSUMO 유전자를 증폭하였다.
50μL PCR 반응 혼합물은 1 x GDP-HiFi PCR 완충액 B, 200μM dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP, 1μM의 증폭 프라이머, 100ng의 pET-OPTSUMO-ORF2 및 1U GDP-HiFi DNA 중합 효소를 함유하였다. PCR 반응 조건은 96℃에서 2분(1 사이클); 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 68℃에서 30초(35 사이클); 68℃에서 5분(1 사이클)이었다. 반응 후, 아가로스 겔 전기 영동을 사용하여 PCR 생산물이 예측된 크기의 DNA 단편을 포함하는지를 확인하였다. 다음으로, Gel-MTM 겔 추출 시스템 키트를 사용하여 PCR 생산물을 회수하였다.
pJET-IFNA-6 플라스미드(SEQ ID NO: 63)를 주형으로 사용하고, OPTSUMOIFNAF(CCGTGAACAAATCGGCGGCTGCGATCTGCCGCAAACC; SEQ ID NO: 85)/PIFNAHISSALIR(SEQ ID NO: 78)을 프라이머 세트로 사용하여 IFN-α 유전자를 증폭하였다. 50μL PCR 반응 혼합물은 1 x GDP-HiFi PCR 완충액 B, 200μM dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP, 1μM의 증폭 프라이머, 100ng의 pJET-IFNA-6 및 1U GDP-HiFi DNA 중합 효소를 함유하였다. PCR 반응 조건은 96℃에서 2분(1 사이클); 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 68℃에서 30초(35 사이클); 68℃에서 5분(1 사이클)이었다. 반응 후, 아가로스 겔 전기 영동을 사용하여 PCR 생산물이 예측된 크기의 DNA 단편을 포함하는지를 확인하였다. 다음으로, Gel-MTM 겔 추출 시스템 키트를 사용하여 PCR 생산물을 회수하였다.
상기 두 PCR 생산물을 주형으로 사용하고 OPTSUMOF(SEQ ID NO: 35)/PIFNAHISSALIR(SEQ ID NO: 78)을 프라이머 세트로 사용하는 중합 효소 연쇄 반응에 의해 OPTSUMO-IFN-α 융합 유전자를 얻었다. 50μL PCR 반응 혼합물은 1 x GDP-HiFi PCR 완충액 B, 200μM dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP, 1μM의 증폭 프라이머, 100ng의 OPTSUMO PCR 생산물, 100ng의 IFN-α PCR 생산물 및 1U GDP-HiFi DNA 중합 효소를 함유하였다. PCR 반응 조건은 96℃에서 2분(1 사이클); 94℃에서 30 초, 55℃에서 30초, 68℃에서 1분(35 사이클); 68℃에서 5분(1 사이클)이었다. 반응 후, 아가로스 겔 전기 영동을 사용하여 PCR 생산물이 예측된 크기의 DNA 단편을 포함하는지를 확인하였다. 다음으로, PCR-MTM 클린업 시스템 키트를 사용하여 PCR 생산물을 회수하였다.
PCR 생산물을 KpnI 및 SalI로 절단한 후, T4 DNA 리가아제를 사용하여 동일한 제한 효소로 절단한 pET29a에 DNA 단편을 결찰하였다. 결찰된 생산물을 대장균 ECOS 9-5로 형질 전환시켰다. 형질 전환체는 콜로니 중합 효소 연쇄 반응에 의해 선택되었다. 형질 전환체 내의 재조합 플라스미드가 DNA 전기 영동에 의해 삽입된 DNA를 운반하는 것을 확인한 후, 형질 전환체 내의 플라스미드를 추출하고 DNA 서열을 결정하였다. 정확한 DNA 서열을 갖는 플라스미드는 SEQ ID NO: 86을 갖는 pET-OPTSUMO-OPTPIFNAH로 명명된다.
(5) pBA-OPTSUMO-OPTPIFNAH 발현 벡터의 제조:
pET-OPTSUMO-OPTPIFNAH를 NdeI 및 SalI로 절단한 후, OPTUMO-IFN-α 융합 유전자를 포함하는 DNA 단편을 Gel-MTM 겔 추출 시스템 키트를 사용하여 회수하였다. DNA 단편을 T4 DNA 리가아제를 사용하여 동일한 제한 효소로 절단한 pBCM-araM11에 결찰시켰다. 결찰된 생산물을 대장균 ECOS 9-5로 형질 전환시켰다. 형질 전환체는 콜로니 중합 효소 연쇄 반응에 의해 선택되었다. 형질 전환체 내의 재조합 플라스미드가 DNA 전기 영동에 의해 삽입된 DNA를 운반하는 것을 확인한 후, 형질 전환체 내의 플라스미드를 추출하고 DNA 서열을 결정하였다. 정확한 DNA 서열을 갖는 플라스미드는 SEQ ID NO: 87을 갖는 pBA-OPTSUMO-OPTPIFNAH로 명명된다.
(6) pET-OPTPIFNRH 발현 벡터의 제조:
pJET-IFNR 플라스미드를 주형으로 사용하고 PIFNRNDEIF(5'-CAATATCATATGCAAGCCCCGTTTTTCAAAGAA-3'; SEQ ID NO: 88)/PIFNRHISSALIR(5'-GATATAGTCGACTTATTAGTGATG GTGATGGTGATGTTGGTGGCACGCTGACC-3'; SEQ IN NO: 89)를 프라이머 세트로 사용하여 IFN-γ 유전자를 증폭하였다. 50μL PCR 반응 혼합물은 1 x GDP-HiFi PCR 완충액 B, 200μM dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP, 1μM의 증폭 프라이머, 100ng의 pJET-IFNR 플라스미드 및 1U GDP-HiFi DNA 중합 효소를 함유하였다. PCR 반응 조건은 96℃에서 2분(1 사이클); 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 68℃에서 30초(35 사이클); 68℃에서 5분(1 사이클)이었다. 반응 후, 아가로스 겔 전기 영동을 사용하여 PCR 생산물이 예측된 크기의 DNA 단편을 포함하는지를 확인하였다. 다음으로, PCR-MTM 클린업 시스템 키트를 사용하여 PCR 생산물을 회수하였다.
PCR 생산물을 NdeI 및 SalI로 절단한 후, T4 DNA 리가아제를 사용하여 동일한 제한 효소로 절단한 pET29a에 DNA 단편을 결찰하였다. 결찰된 생산물을 대장균 ECOS 9-5로 형질 전환시켰다. 형질 전환체는 콜로니 중합 효소 연쇄 반응에 의해 선택되었다. 형질 전환체 내의 재조합 플라스미드가 DNA 전기 영동에 의해 삽입된 DNA를 운반하는 것을 확인한 후, 형질 전환체 내의 플라스미드를 추출하고 DNA 서열을 결정하였다. 정확한 DNA 서열을 갖는 플라스미드는 SEQ ID NO: 90을 갖는 pET-OPTPIFNRH로 명명된다.
(7) pET-SUMO-OPTPIFNRH 발현 벡터의 제조:
사카로마이세스 세레비시애 게놈을 주형으로 사용하고 SUMOF(SEQ ID NO: 25) /SUMOR2(SEQ ID NO: 81)를 프라이머 세트로 사용하여 SUMO 유전자를 증폭시켰다. 증폭 조건 및 PCR 생산물 회수 방법은 앞서 기술한 바와 같다.
pJET-IFNR 플라스미드(SEQ ID NO: 75)를 주형으로 사용하고 SUMOIFNRF(5'-GCTCACAGAGAACAGATTGGTGGTCAAGCCCCGTTTTTCAAAGAA-3'; SEQ ID NO: 91)/PIFNRHISSALIR(SEQ ID NO: 89)를 프라이머 세트로 사용하여 IFN-γ 유전자를 증폭시켰다. 50μL PCR 반응 혼합물은 1 x GDP-HiFi PCR 완충액 B, 200μM dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP, 1μM의 증폭 프라이머, 100ng의 pJET-IFNR 플라스미드 및 1U GDP-HiFi DNA 중합 효소를 함유하였다. PCR 반응 조건은 96℃에서 2분(1 사이클); 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 68℃에서 30초(35 사이클); 68℃에서 5분(1 사이클)이었다. 반응 후, 아가로스 겔 전기 영동을 사용하여 PCR 생산물이 예측된 크기의 DNA 단편을 포함하는지를 확인하였다. 다음으로, Gel-MTM 겔 추출 시스템 키트를 사용하여 PCR 생산물을 회수하였다.
두 PCR 산물을 주형으로 사용하고 SUMOF(SEQ ID NO: 25)/PIFNRHISSALIR(SEQ ID NO: 89)을 프라이머 세트로 사용하는 중합 효소 연쇄 반응에 의해 SUMO-IFN-γ 융합 유전자를 얻었다. 50μL PCR 반응 혼합물은 1 x GDP-HiFi PCR 완충액 B, 200μM dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP, 1μM의 증폭 프라이머, 100ng의 SUMO PCR 생산물, 100ng의 IFN-γ PCR 생산물, 및 1U GDP-HiFi DNA 중합 효소를 함유하였다. PCR 반응 조건은 96℃에서 2분(1 사이클); 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 68℃에서 1분(35 사이클); 68℃에서 5분(1 사이클)이었다. 반응 후, 아가로스 겔 전기 영동을 사용하여 PCR 생산물이 예측된 크기의 DNA 단편을 포함하는지를 확인하였다. 다음으로, PCR-MTM 클린업 시스템 키트를 사용하여 PCR 생산물을 회수하였다.
PCR 생산물을 KpnI 및 SalI로 절단한 후, T4 DNA 리가아제를 사용하여 동일한 제한 효소로 절단한 pET29a에 DNA 단편을 결찰하였다. 결찰된 생산물을 대장균 ECOS 9-5로 형질 전환시켰다. 형질 전환체는 콜로니 중합 효소 연쇄 반응에 의해 선택되었다. 형질 전환체 내의 재조합 플라스미드가 DNA 전기 영동에 의해 삽입된 DNA를 운반하는 것을 확인한 후, 형질 전환체 내의 플라스미드를 추출하고 DNA 서열을 결정하였다. 정확한 DNA 서열을 갖는 플라스미드는 SEQ ID NO: 92를 갖는 pET-SUMO-OPTPIFNRH로 명명된다.
(8) pET-OPTSUMO-OPTPIFNRH 발현 벡터의 제조:
pET-OPTSUMO-ORF2(SEQ ID NO: 43)를 주형으로 사용하고 OPTSUMOF(SEQ ID NO: 35)/OPTSUMOR2(SEQ ID NO: 84)를 프라이머 세트로 사용하여 OPTSUMO 유전자를 증폭시켰다. 증폭 조건 및 PCR 생산물 회수 방법은 앞서 기술한 바와 같다.
pJET-IFNR 플라스미드(SEQ ID NO: 75)를 주형으로 사용하고 OPTSUMOIFNRF (5'-CCGTGAACAAATCGGCGGCCAAGCCCCGTTTTTCAAAGAAATC-3'; SEQ ID NO: 93)/PIFNRHISSALIR(SEQ ID NO: 89)를 프라이머 세트로 사용하여 돼지 인터페론-γ 유전자를 증폭시켰다. 50μL PCR 반응 혼합물은 1 x GDP-HiFi PCR 완충액 B, 200μM dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP, 1μM의 증폭 프라이머, 100ng의 pJET-IFNR 플라스미드 및 1U GDP-HiFi DNA 중합 효소를 함유하였다. PCR 반응 조건은 96℃에서 2분(1 사이클); 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 68℃에서 30초(35 사이클); 68℃에서 5분(1 사이클)이었다. 반응 후, 아가로스 겔 전기 영동을 사용하여 PCR 생산물이 예측된 크기의 DNA 단편을 포함하는지를 확인하였다. 다음으로, Gel-MTM 겔 추출 시스템 키트를 사용하여 PCR 생산물을 회수하였다.
상기 두 PCR 산물을 주형으로 사용하고 OPTSUMOF(SEQ ID NO: 35)/PIFNRHISSALIR(SEQ ID NO: 89)을 프라이머 세트로 사용하는 중합 효소 연쇄 반응에 의해 OPTSUMO-IFN-γ 융합 유전자를 얻었다. 50μL PCR 반응 혼합물은 1 x GDP-HiFi PCR 완충액 B, 200μM dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP, 1μM의 증폭 프라이머, 100ng의 OPTSUMO PCR 생산물, 100ng의 돼지 IFN-γ PCR 생산물 및 1U GDP-HiFi DNA 중합 효소를 함유하였다. PCR 반응 조건은 96℃에서 2분(1 사이클); 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 68℃에서 1분(35 사이클); 68℃에서 5분(1 사이클)이었다. 반응 후, 아가로스 겔 전기 영동을 사용하여 PCR 생산물이 예측된 크기의 DNA 단편을 포함하는지를 확인하였다. 다음으로, PCR-MTM 클린업 시스템 키트를 사용하여 PCR 생산물을 회수하였다.
PCR 생산물을 KpnI 및 SalI로 절단한 후, T4 DNA 리가아제를 사용하여 동일한 제한 효소로 절단한 pET29a에 DNA 단편을 결찰하였다. 결찰된 생산물을 대장균 ECOS 9-5로 형질 전환시켰다. 형질 전환체는 콜로니 중합 효소 연쇄 반응에 의해 선택되었다. 형질 전환체 내의 재조합 플라스미드가 DNA 전기 영동에 의해 삽입된 DNA를 운반하는 것을 확인한 후, 형질 전환체 내의 플라스미드를 추출하고 DNA 서열을 결정하였다. 정확한 DNA 플라스미드를 갖는 플라스미드는 SEQ ID NO: 94를 갖는 pET-OPTSUMO-OPTPIFNRH로 명명된다.
(9) pBA-OPTSUMO-OPTPIFNRH 발현 벡터의 제조:
pET-OPTSUMO-OPTPIFNRH를 NdeI 및 SalI로 절단한 후, OPTUMO-IFR-γ 융합 유전자를 함유하는 DNA 단편을 Gel-MTM 겔 추출 시스템 키트를 사용하여 회수하였다. DNA 단편을 T4 DNA 리가아제를 사용하여 동일한 제한 효소로 절단한 pBCM-araM11에 삽입하였다. 결찰된 생산물을 대장균 ECOS 9-5로 형질 전환시켰다. 형질 전환체는 콜로니 중합 효소 연쇄 반응에 의해 선택되었다. 형질 전환체 내의 재조합 플라스미드가 DNA 전기 영동에 의해 삽입된 DNA를 운반하는 것을 확인한 후, 형질 전환체 내의 플라스미드를 추출하고 DNA 서열을 결정하였다. 정확한 DNA 서열을 갖는 SEQ ID NO: 95를 갖는 플라스미드는 pBA-OPTSUMO-OPTPIFNRH로 명명된다.
재조합 돼지 인터페론의 발현 및 정제
(1) 재조합 돼지 인터페론의 발현:
pET-OPTPIFNAH(SEQ ID NO: 79), pBA-OPTPIFNAH(SEQ ID NO: 80), pET-SUMO-OPTPIFNAH(SEQ ID NO: 83), pET-OPTSUMO-OPTPIFNAH(SEQ ID NO: 86), 및 pBA-OPTSUMO-OPTPIFNAH(SEQ ID NO: 87)를 각각 대장균 셔플(NEB, USA)로 형질 전환시켰다. pET-OPTPIFNRH (SEQ ID NO: 90), pET-SUMO-OPTPIFNHR (SEQ ID NO: 92), pET-OPTSUMO-OPTPIFNRH (SEQ ID NO: 94) and pBA-OPTSUMO-OPTPIFNRH (SEQ ID NO: 95)를 대장균 BL21(DE3)으로 각각 형질 전환시켰다. 형질 전환체를 카나마이신(최종 농도: 30㎍/mL)을 함유하는 LB 배지에 접종하고, 37℃ 및 180rpm에서 진탕 배양하였다. 밤새 배양 후, 박테리아 용액을 최종 농도 30㎍/mL의 코노마이신을 함유하는 LB 배지에 1:100의 비율로 접종하였다. 37℃ 및 180rpm에서 진탕 배양을 수행하였다. 박테리아를 분광 광도계로 측정한 약 0.4-0.6 OD600의 농도로 배양하고, 25℃ 및 180rpm에서 단백질 발현 유도를 위해 0.1 mM IPTG를 첨가하였다. 4시간의 유도 후, 원심 분리(8,000 x g, 30분, 4℃)에 의해 박테리아 분획을 수집하고 단백질 전기 영동에 의해 재조합 돼지 인터페론의 발현을 관찰하였다. 또한, 박테리아의 가용성 및 불용성 단백질도 분화되었고, 단백질 전기 영동에 의해 재조합 돼지 인터페론의 용해도를 관찰하였다.
도 9(A 내지 E)의 실험 결과를 참조하십시오. 결과는 본 발명이 대장균 셔플 숙주를 사용하여 가용성 재조합 돼지 IFN-α 및 SUMO-IFN-α 융합 단백질을 성공적으로 생산할 수 있으며, 재접힘 단계가 생략될 수 있어 생물학적 활성은 나쁜 재접힘 효율에 영향을 받을 수 있다. SUMO-IFN-α 융합 단백질의 발현을 위해, SUMO-IFN-α 융합 단백질의 생산은 SUMO 유전자 코돈을 최적화함으로써 증가될 수 있다. SUMO-IFN-α 융합 단백질의 발현에 대한 상이한 발현 시스템의 효과는 돌연변이 아라비노스-유도 발현 시스템(155.07 mg/L; 도 9(E))을 사용하여 SUMO-IFN-α의 생산이 더 높다는 것을 보여주었다. 도 9(F 내지 I)의 실험 결과를 참조하십시오. 결과는 SUMO 융합 단백질을 갖는 전략이 재조합 돼지 IFN-γ의 용해도를 증가시킬 수 있음을 보여준다. SUMO 유전자의 코돈을 최적화한 후에, SUMO-IFN-γ 융합 단백질의 생산을 증가시킬 수 있다. SUMO-IFN-γ 융합 단백질의 발현에 대한 상이한 발현 시스템의 효과는 T7-유도 발현 시스템 및 돌연변이 아라비노스-유도 발현 시스템을 사용하여 SUMO-IFN-γ의 생산이 상당히 만족스럽다는 것을 보여주었다.
(2) 재조합 SUMO 단백질 분해 효소 발현 벡터 pET-D-SUMOP의 제조 및 발현:
이전 단락에서 설명한 대장균 발현 시스템에서 발현된 돼지 인터페론을 절단하여 SUMO 단백질 단편이 없는 돼지 인터페론을 얻기 위해, 본 실험에서 대장균 발현 시스템을 통해 SUMO 단백질 분해 효소를 생산하였다. 당업자는 다른 방식으로 얻은 SUMO 단백질 분해 효소를 사용하여 이 단계를 수행할 수 있다.
사카로마이세스 세레비시애 게놈을 주형으로 사용하고, SUMPOF(SEQ ID NO: 47)/SUMOPENZR(5'-GATATACTCGAGTTATTTAAAGCGTCGGT TAAAATCAAATG-3; SEQ ID NO: 96)을 프라이머 세트로 사용하여 SUMO 단백질 분해 효소 유전자를 증폭시켰다. 50μL PCR 반응 혼합물은 1 x GDP-HiFi PCR 완충액 B, 200μM dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP, 1μM의 증폭 프라이머, 200ng의 사카로마이세스 세레비시애 게놈 및 1U GDP-HiFi DNA 중합 효소를 함유하였다. PCR 반응 조건은 96℃에서 5분(1 사이클); 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 68℃에서 30초(35 사이클); 68℃에서 5분(1 사이클)이었다. 반응 후, 아가로스 겔 전기 영동을 사용하여 PCR 생산물이 예측된 크기의 DNA 단편을 포함하는지를 확인하였다. 다음으로, PCR-MTM 클린업 시스템 키트를 사용하여 PCR 생산물을 회수하였다.
효모 게놈으로부터 증폭된 SUMO 단백질 분해 효소 유전자를 BamHI 및 XhoI로 절단한 후, T4 DNA 리가아제를 사용하여 DNA 단편을 BamHI 및 SalI로 절단한 pET-D에 삽입하였다. 결찰된 생성물을 대장균 ECOS 9-5로 형질 전환시켰다. 형질 전환체는 콜로니 중합 효소 연쇄 반응에 의해 선택되었다. 형질 전환체 내의 재조합 플라스미드가 DNA 전기 영동에 의해 삽입된 DNA를 운반하는 것을 확인한 후, 형질 전환체 내의 플라스미드를 추출하고 DNA 서열을 결정하였다. 정확한 DNA 서열을 갖는 플라스미드는 SEQ ID NO: 97을 갖는 pET-D-SUMOP으로 명명된다.
pET-D-SUMOP(SEQ ID NO: 97)을 대장균 BL21(DE3)으로 형질 전환시켰다. 대장균 BL21(DE3)을 카나마이신(최종 농도: 30㎍/mL)을 함유하는 LB 배지에 접종하고, 37℃ 및 180rpm에서 진탕 배양하였다. 하룻밤 배양 후, 박테리아 용액을 카나마이신(최종 농도 30㎍/mL)을 함유하는 LB 배지에 1 : 100 비율로 접종하였다. 37℃ 및 180rpm에서 진탕 배양을 수행하였다. 박테리아를 분광 광도계로 측정한 약 0.4-0.6 OD600의 농도로 배양하고, 28℃ 및 180rpm에서 단백질 발현 유도를 위해 0.1 mM IPTG를 첨가하였다. 4시간의 유도 후, 균체 분획을 원심 분리(8,000 x g, 30분, 4℃)로 수집하였다.
(3) 재조합 돼지 인터페론의 절단 및 정제:
SUMO-돼지 인터페론 융합 단백질 발현 벡터 및 SUMO 단백질 분해 효소 발현 벡터를 포함하는 형질 전환체를 유도 발현시킨 후, 원심 분리(8,000 x g, 30분, 4℃)에 의해 박테리아 분획을 수집하였다. 수집된 박테리아를 적절한 양의 용해 완충액(20mM 인산 나트륨, 500mM NaCl, pH 7.4)에 현탁시켜 600nm에서 50의 흡광도를 얻었다. 초음파 처리기를 사용하여 박테리아를 파괴한 후, 상등액을 원심 분리(8,000 x g, 15분, 4℃)로 수집하였다. 정제된 재조합 SUMO- 돼지 인터페론 융합 단백질과 재조합 단백질 분해 효소(SUMO 단백질 분해 효소)를 4의 중량비로 혼합하고 4℃에서 16시간 동안 배양하였다. 이 기간 동안, SUMO-돼지 인터페론 융합 단백질은 SUMO 단백질 분해 효소에 의해 C-말단에 His-태그를 갖는 SUMO 단백질 및 돼지 인터페론으로 절단되었다.
그런 후에, 고정화된 금속 이온 친화성 크로마토 그래피를 사용하여 단백질을 정제하였다. 정제는 5 mL HiTrapTM Ni 엑셀 컬럼을 사용하여 단백질 액체 크로마토 그래피 시스템 AKTA 프라임 플러스(prime plus)를 사용하여 수행하였다. 칼럼을 25 mL의 세포 용해 완충액으로 평형시킨 후, 융합 단백질 절단 용액을 HiTrapTM Ni 엑셀 컬럼에 주입하였다. 샘플 주입이 완료된 후, 비특이적으로 결합된 단백질을 100mL 세척 완충액(20mM 인산 나트륨, 500mM NaCl, 30mM 이미다졸, pH 7.4)으로 세척하였다. 마지막으로, 수지상의 재조합 돼지 인터페론은 150mL 용리 완충액(20mM 인산 나트륨, 500mM NaCl, 250mM 이미다졸, pH 7.4)으로 용출시키고 단백질 전기 영동에 의해 정제를 관찰하였다(도 10).
실시예 4: PCV2 감염을 예방하기 위한 본 조성물의 제조 및 응용분야.
본 실시예에서, 상기 실시예 2 및 실시예 3에서 제조한 ORF2 암호화 단백질, SUMO-ORF2 융합 단백질 및 돼지 인터페론을 사용하여 PCV2 감염 예방 및 치료용 조성물을 제조하였다. 본 발명에서 사용되는 다수의 샘플에서, 조성물은 MONTANIDETM ISA 563 VG 항원보강제(SEPPIC, France) 및/또는 MONTANIDETM GEL 01 항원보강제(SEPPIC, France)를 추가로 포함한다. 구성 요소를 다음 실험 디자인에 따라 혼합한 다음 유도된 면역 반응 또는 부작용(예를 들어, 구토, 떨림, 우울증, 호흡 곤란 및 부종과 같은 부작용이 있는지 여부; 적어도 3가지 부작용의 발생율이 50%보다 높으면 조성물의 안전성이 낮다.)을 관찰하기 위해 새끼 돼지에 접종하였다.
(1) 실험 1: 본 조성물의 안전성에 대한 돼지 인터페론의 함량의 효과:
14마리의 3주령 자돈을 선택하여 무작위로 분류하였다. 이들을 A 내지 G의 7개 그룹으로 나눴고 각 그룹에서 새끼 돼지 수는 2 마리였다. 각 그룹에서 1회의 근육 주사를 실행하였고, 면역 용량은 2mL이었다. 각 백신의 구성 요소를 하기 표 6에 나타내었다. 관찰을 예방 접종 당일 및 그 다음날에 하였고, 임상적 부작용의 비율을 기록하였다.
실험 1의 실험 디자인.
그룹 백신 구성 요소/투여량
ORF2(μg) IFN-α(μg) IFN-γ(μg) 항원보강제 (%, v/v)
A V-001 340 - - GEL 01 (20)
B V-002 - 50 50 GEL 01 (20)
C V-003 340 50 50 GEL 01 (20)
D V-004 340 25 25 GEL 01 (20)
E V-005 340 10 10 GEL 01 (20)
F V-006 340 5 5 GEL 01 (20)
G V-007 - - - GEL 01 (20)
실험 결과(표 7)는 V-001으로 백신 접종된 돼지는 우울증의 임상적 증상을 나타내지만 다른 부작용은 없음을 보여주었다. V-002로 예방 접종한 돼지는 구토와 떨림 증상을 나타냈다. 또한, V-003 샘플의 안전성은 더 회의적이었고 V-004, V-005 또는 V-006의 접종 돼지에 대한 악영향은 가벼웠다. 이러한 결과를 바탕으로, 돼지 인터페론 함량은 다음 실험에서 25μg/dose(2 mL)로 유지될 것이다.
실험 1의 실험 결과.
백신 임상 증상의 비율(%)
구토 떨림 우울 호흡 곤란 부종 사망률
V-001 0 0 100 0 0 0
V-002 50 50 0 0 0 0
V-003 100 0 50 50 0 50
V-004 0 0 50 0 0 0
V-005 100 0 50 0 0 0
V-006 50 50 0 0 0 0
V-007 0 0 0 0 0 0
(2) 실험 2: 본 조성물의 안전성에 대한 항원보강제의 함량의 영향:
73마리의 3주령 새끼 돼지를 선택하고 무작위로 A 그룹과 B 그룹으로 나누었다. A 그룹에서 새끼 돼지 수는 38마리 이었고 B 그룹에서 새끼 돼지 수는 35마리 이었다. 각각의 그룹에서 1회의 근육 주사를 실행하였고 면역 용량은 2mL이었다. 각 백신의 조성물을 하기 표 8에 나타내었다. 관찰을 예방 접종의 당일 및 다음 날에 하였고 임상적 부작용의 비율을 기록하였다. 실험 결과는 V-009 샘플의 안전성이 높지만 V-008 샘플의 안전성도 허용가능하다는 것을 보여준다(표 9).
실험 2의 실험 디자인.
그룹 백신 구성 요소/투여량
ORF2 (μg) IFN-α(μg) IFN-γ(μg) 항원보강제(%)
A V-008 170 25 25 GEL 01 (20)
B V-009 170 25 25 GEL 01 (10)
실험 2의 실험 결과
백신 임상 증상의 비율(%)
구토 떨림 우울 호흡 곤란 부종 사망률
V-008 10.5 10.5 18.4 13.2 0 10.5
V-009 14.3 14.3 11.4 5.7 0 2.9
(3) 실험예 3: 본 조성물의 면역 유도에 대한 다른 항원보강제의 효과:
이 실험은 동물 건강 연구소(Animal Health Research Institute, AHRI)의 동물 의약품 검사 부서에서 유전자 변형 생물체(GMOs)의 축산에서 수행하였다. 특정 병원체에 감염되지 않은 11마리의 4주령 돼지를 무작위로 그룹화하여 A 내지 E 다섯 그룹으로 나누었다. A 내지 D 그룹은 실험군이었고, 각 그룹에서 새끼 돼지 수는 2마리 이었고, E 그룹은 3마리의 새끼 돼지를 갖는 대조군이었다. 그룹 A 내지 D에서 돼지는 4주 및 6주에 각각 근육 내 면역화되었고, 면역화 용량은 2mL 이었다. E 그룹은 면역화되지 않았다. 각 백신의 구성 요소를 하기 표 10에 나타내었다.
실험 3의 실험 디자인.
그룹 백신 구성 요소/투여량
ORF2 (μg) IFN-α(μg) IFN-γ(μg) 항원보강제(%)
A V-009 170 25 25 GEL 01 (10)
B V-010 170 25 25 ISA 563 (50)
C V-011 67 25 25 GEL 01 (10)
D V-012 67 25 25 ISA 563 (50)
E - - - - -
각 그룹의 새끼 돼지는 8주령에 PCV2로 면역성 검사하였고, 모두는 면역성 검사 4주 후에 부검을 받았다. 면역화 전(4주령), 면역화 후(6주령 및 8주령) 후 및 면역성 검사 후(9, 10, 11 및 12주령) 돼지로부터 혈청 및 혈장 샘플을 수집하였다. 혈청 중의 항-PCV2 항체의 역가를 시판되는 ELISA 키트(BioCheck, Netherlands)를 사용하여 측정하였다. 혈장 내 바이러스 양은 실시간 정량적 중합 효소 연쇄 반응을 사용하여 결정하였다.
실험 결과는 V-009, V-010, V-011 및 V-012는 모두 항-ORF2 항체를 유도하였고(도 11), 실험 돼지에서 바이러스 혈증을 감소시켰다(도 12)는 것을 나타내었다. 실험 결과를 바탕으로, 67㎍의 ORF2을 함유하는 각 용량(2mL)이 충분한 면역 반응(V-011 및 V-012)을 생성할 수 있다는 것을 보여준다.
(4) 실험예 4: 본 조성물의 면역 유도에 대한 SUMO-ORF2 융합 단백질 및 OFR2의 효과:
이 실험은 동물 건강 연구소(Animal Health Research Institute, AHRI)의 동물 의약품 검사 부서에서 유전자 변형 생물체 (GMOs)의 축산에서 수행하였다. 특정 병원체에 감염되지 않은 16마리의 4주령의 새끼 돼지를 무작위로 그룹화하여 A 내지 E 다섯 그룹으로 나누었다. A 내지 D 그룹은 실험군이었고, 각 그룹에서 새끼 돼지 수는 3마리 이었고, E 그룹은 4마리의 새끼 돼지를 갖는 대조군이었다. 그룹 A 내지 D에서 돼지는 4주 및 6주에 각각 근육 내 면역화되었고, 면역화 용량은 2mL 이었다. E 그룹은 면역화되지 않았다. 각 백신의 구성 요소를 하기 표 11에 나타내었다.
실험 4의 실험 디자인.
그룹 백신 구성 요소/투여량
ORF2(μg) SUMO-ORF2(μg) IFN-α(μg) IFN-γ(μg) 항원보강제(%)
A V-013 27 - 25 25 GEL 01 (10)
B V-014 13.5 - 25 25 GEL 01 (10)
C V-015 6.7 - 25 25 GEL 01 (10)
D V-016 - 100 25 25 GEL 01 (10)
E - - - - - -
각 그룹의 새끼 돼지는 8주령에 PCV2로 면역성 검사하였고, 모두는 면역성 검사 5주 후에 부검을 받았다. 특정 시점에 혈청 및 혈장 샘플을 수집하였다. 혈청 중의 항-PCV2 항체의 역가를 시판되는 ELISA 키트를 사용하여 측정하였다. 혈장 내 바이러스 양은 실시간 정량적 중합 효소 연쇄 반응을 사용하여 결정하였다.
결과는 각 시료가 돼지에게 항-PCV2 항체를 생산하도록 유도할 수 있었고 V-013 샘플(27μg의 ORF2 함유)을 사용하여 최상의 결과를 얻을 수 있음을 보여주었다(도 13). 또한, 모든 샘플은 돼지에서 바이러스 혈증을 감소시켰다(도 14).
(5) 실험 5: 본 조성물의 면역 유도에 대한 돼지 인터페론-α 및 돼지 인터페론-γ의 효과:
이 실험은 낮은 수준의 병원균 오염과 PCV2 감염이 없는 돼지 농장에서 수행하였다. PCV2 감염이 없는 20마리의 4주령 SPF SPF 새끼 돼지를 선택하고 무작위로 다섯 그룹 A 내지 E로 나누었고, 각 그룹은 4마리의 새끼 돼지를 가졌다. A 내지 D 그룹은 실험군이었고, E 군은 대조군이었다. 그룹 A 내지 D에서 돼지는 각각 4주 및 7주째에 근육 내 면역화되었고, 면역화 용량은 2mL 이었다. E 그룹은 면역화되지 않았다. 각 백신의 구성 요소를 하기 표 12에 나타내었다. 혈청 샘플은 특정 시점에서 수집하였다. 혈청 중의 항-PCV2 항체의 역가를 시판되는 ELISA 키트를 사용하여 결정하였다.
실험 5의 실험 디자인.
그룹 백신 구성 요소/투여량
ORF2(μg) IFN-α(μg) IFN-γ(μg) 항원보강제(%)
A V-017 13 - - GEL 01 (10)
B V-018 13 25 - GEL 01 (10)
C V-019 13 - 25 GEL 01 (10)
D V-020 13 25 25 GEL 01 (10)
E - - - - -
실험 결과는 본 발명의 조성물에 IFN-α(V-018) 또는 IFN-γ(V-019)만을 첨가하면 면역 반응의 유도에 대한 효과가 증진된다는 것을 나타낸다. IFN-α 첨가 효과는 IFN-γ 첨가 효과보다 낫다. 반면에, 본 발명의 조성물에서 IFN-α 및 IFN-γ(V-020)의 첨가는 보다 우수한 면역 반응을 유도하였다. 결과는 본 발명의 조성물에서 IFN-α 및 IFN-γ가 면역 유도에 상승적인 효과를 갖는다는 것을 나타낸다(도 15).
<110> Agricultural Technology Research Institute <120> A Method of Preparing Porcine Circovirus Type 2 Capsid Protein and Pharmaceutical Composition Comprising Same <160> 100 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> DNA <213> ENTEROBACTERIA PHAGE T7 <400> 1 tttaacttta 10 <210> 2 <211> 6 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 2 aggagg 6 <210> 3 <211> 2 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 3 tg 2 <210> 4 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EXPRESSION CASSETTE <400> 4 ggatcctacc tgacgctttt tatcgcaact tgctactgtt tctccatacc cgtttttttg 60 tttaacttta agaaggagga atacatatg 89 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 5 accagcgcac ttcggcagc 19 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 6 aatacttaca gcgcacttct ttcgttttc 29 <210> 7 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER <400> 7 caatatggat ccatgacgta tccaaggagg cgtttc 36 <210> 8 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc 3420 tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg 3480 cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag 3540 gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc 3600 gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag 3660 gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga 3720 ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc 3780 atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg 3840 tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt 3900 ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca 3960 gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca 4020 ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag 4080 ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca 4140 agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg 4200 ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg aacaataaaa 4260 ctgtctgctt acataaacag taatacaagg ggtgttatga gccatattca acgggaaacg 4320 tcttgctcta ggccgcgatt aaattccaac atggatgctg atttatatgg gtataaatgg 4380 gctcgcgata atgtcgggca atcaggtgcg acaatctatc gattgtatgg gaagcccgat 4440 gcgccagagt tgtttctgaa acatggcaaa ggtagcgttg ccaatgatgt tacagatgag 4500 atggtcagac taaactggct gacggaattt atgcctcttc cgaccatcaa gcattttatc 4560 cgtactcctg atgatgcatg gttactcacc actgcgatcc ccgggaaaac agcattccag 4620 gtattagaag aatatcctga ttcaggtgaa aatattgttg atgcgctggc agtgttcctg 4680 cgccggttgc attcgattcc tgtttgtaat tgtcctttta acagcgatcg cgtatttcgt 4740 ctcgctcagg cgcaatcacg aatgaataac ggtttggttg atgcgagtga ttttgatgac 4800 gagcgtaatg gctggcctgt tgaacaagtc tggaaagaaa tgcataaact tttgccattc 4860 tcaccggatt cagtcgtcac tcatggtgat ttctcacttg ataaccttat ttttgacgag 4920 gggaaattaa taggttgtat tgatgttgga cgagtcggaa tcgcagaccg ataccaggat 4980 cttgccatcc tatggaactg cctcggtgag ttttctcctt cattacagaa acggcttttt 5040 caaaaatatg gtattgataa tcctgatatg aataaattgc agtttcattt gatgctcgat 5100 gagtttttct aagaattaat tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa 5160 acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgaaattg taaacgttaa 5220 tattttgtta aaattcgcgt taaatttttg ttaaatcagc tcatttttta accaataggc 5280 cgaaatcggc aaaatccctt ataaatcaaa agaatagacc gagatagggt tgagtgttgt 5340 tccagtttgg aacaagagtc cactattaaa gaacgtggac tccaacgtca aagggcgaaa 5400 aaccgtctat cagggcgatg gcccactacg tgaaccatca ccctaatcaa gttttttggg 5460 gtcgaggtgc cgtaaagcac taaatcggaa ccctaaaggg agcccccgat ttagagcttg 5520 acggggaaag ccggcgaacg tggcgagaaa ggaagggaag aaagcgaaag gagcgggcgc 5580 tagggcgctg gcaagtgtag cggtcacgct gcgcgtaacc accacacccg ccgcgcttaa 5640 tgcgccgcta cagggcgcgt cccattcgcc a 5671 <210> 100 <211> 2340 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLASMID <400> 100 ggtaccaaag catgcaatga gctcagtaac ccgtatcgtg agcatcctct ctcgtttcat 60 cggtatcatt acccccatga acagaaatcc cccttacacg gaggcatcag tgaccaaaca 120 ggaaaaaacc gcccttaaca tggcccgctt tatcagaagc cagacattaa cgcttctgga 180 gaaactcaac gagctggacg cggatgaaca ggcagacatc tgtgaatcgc ttcacgacca 240 cgctgatgag ctttaccgca gctgcctcgc gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg 300 acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca 360 agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg ggcgcagcca tgacccagtc 420 acgtagcgat agcggagtgt atactggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg 480 agagtgcacc attgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa taccgcatca 540 ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag 600 cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag 660 gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc 720 tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc 780 agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc 840 tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt 900 cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg 960 ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat 1020 ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag 1080 ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt 1140 ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc 1200 cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta 1260 gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag 1320 atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga 1380 ttttggtcat gaacaataaa actgtctgct tacataaaca gtaatacaag gggtgttatg 1440 agccatatca acgggaaacg ctcgagtacg tatctagagc aaagcttatc gtcgacatgc 1500 atctgcagcc cgggggatcc tcgcgacata tgactagtga attcgctagc agatcttagt 1560 gacattagaa aaccgactgt aaaaagtaca gtcggcatta tctcatatta taaaagccag 1620 tcattaggcc tatctgacaa ttcctgaata gagttcataa acaatcctgc atgataacca 1680 tcacaaacag aatgatgtac ctgtaaagat agcggtaaat atattgaatt acctttatta 1740 atgaattttc ctgctgtaat aatgggtaga aggtaattac tattattatt gatatttaag 1800 ttaaacccag taaatgaagt ccatggaata atagaaagag aaaaagcatt ttcaggtata 1860 ggtgttttgg gaaacaattt ccccgaacca ttatatttct ctacatcaga aaggtataaa 1920 tcataaaact ctttgaagtc attctttaca ggagtccaaa taccagagaa tgttttagat 1980 acaccatcaa aaattgtata aagtggctct aacttatccc aataacctaa ctctccgtcg 2040 ctattgtaac cagttctaaa agctgtattt gagtttatca cccttgtcac taagaaaata 2100 aatgcagggt aaaatttata tccttcttgt tttatgtttc ggtataaaac actaatatca 2160 atttctgtgg ttatactaaa agtcgtttgt tggttcaaat aatgattaaa tatctctttt 2220 ctcttccaat tgtctaaatc aattttatta aagttcattt gatatgcctc ctaaattttt 2280 atctaaagtg aatttaggag gcttacttgt ctgctttctt cattagaatc aatccttttt 2340 2340

Claims (19)

  1. 다음 단계를 포함하여 단백질을 발현하는 방법:
    (a) 아라비노스-유도 발현 벡터를 얻는 단계, 여기서 아라비노스-유도 발현 벡터는 발현 요소 및 표적 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다;
    여기서 발현 요소는
    프로모터;
    SEQ ID NO: 01을 갖는 T7 파지 번역 증강 요소; 및
    SEQ ID NO: 02를 갖는 리보솜 결합 부위를 포함한다;
    (b) 아라비노스-유도 발현 벡터를 대장균 숙주로 형질 전환시키고 표적 단백질의 발현을 유도하는 단계;
    여기서 표적 단백질은 돼지 써코바이러스 PCV2 캡시드 단백질 또는 돼지 인터페론이다.
  2. 제 1 항에 있어서,
    프로모터의 -16 부위는 SEQ ID NO: 03을 갖는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    발현 요소는 SEQ ID NO: 04를 갖는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    아라비노스-유도 발현 벡터는 융합 파트너를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및/또는 마커 분자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    융합 파트너는 대장균의 MsyB, 대장균의 YjgD, 람다 파지의 D 단백질, 베이커(Baker) 효모의 SUMO 단백질 또는 이들의 조합인 방법.
  6. 제 4 항에 있어서,
    마커 분자는 His 태그, Strep II 태그, Flag 태그 또는 이들의 조합인 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    표적 단백질은 SEQ ID NO: 09 또는 SEQ ID NO: 24로부터 암호화된 PCV2 캡시드 단백질인 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    아라비노스-유도 발현 벡터는 SEQ ID NO: 46을 갖는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    돼지 인터페론은 돼지 인터페론-α 또는 돼지 인터페론-γ인 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    표적 단백질은 돼지 인터페론이고, 돼지 인터페론은 SEQ ID NO: 64 또는 SEQ ID NO: 76으로부터 암호화되는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    아라비노스-유도 발현 벡터는 SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 87 또는 SEQ ID NO: 95를 갖는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    방법은 돼지 인터페론을 다시 접는 단계를 포함하지 않는 방법.
  13. 제 8 항 또는 제 11 항에 있어서,
    (b) 단계 후에 (c) 단계: 표적 단백질을 정화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    (c) 단계 이후 (d) 단계: 표적 단백질을 SUMO 단백질 분해 효소로 처리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    단계 (d)에서, 표적 단백질 대 SUMO 단백질 분해 효소의 중량비는 4 내지 20인 방법.
  16. 2.5 내지 250㎍/mL의 PCV2 캡시드 단백질;
    2.5 내지 25㎍/mL의 돼지 인터페론-α;
    2.5 내지 25㎍/mL의 돼지 인터페론-γ; 및
    약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 돼지 써코바이러스 PCV2 감염을 예방하기 위한 조성물.
  17. 제 16 항에 있어서,
    약학적으로 허용 가능한 항원보강제를 추가로 포함하는 조성물.
  18. 제 17 항에 있어서,
    약학적으로 허용 가능한 항원보강제는 MONTANIDETM ISA 536 VG 항원보강제, MONTANIDETM GEL 01 항원보강제, 프로인트 완전 또는 불완전 항원보강제, 알루미늄 겔, 계면활성제, 폴리음이온 폴리머, 펩타이드, 오일 에멀젼 또는 이들의 조합인 조성물.
  19. 제 16 항에 있어서,
    3.5 내지 170㎍/mL의 PCV2 캡시드 단백질;
    5 내지 20㎍/mL의 돼지 인터페론-α;
    5 내지 20㎍/mL의 돼지 인터페론-γ; 및
    약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.
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