CZ285116B6 - Imunogenní polypeptid - Google Patents

Abstract

Komplexní soli hematoporfyrinu a jeho derivátů obecného vzorce I, v němž R.sup.1 .n.a R.sup.2 .n.nezávisle na sobě znamenají-CH=CH.sub.2.n., -CH(OH)-CH.sub.3 .n.nebo CH(OR.sup.3.n.)-CH.sub.3.n., kde R.sup.3 .n.znamená skupinu sestávající z jedné až pěti jednotek odvozených od monomeru vzorce II, nebo znamenají stejnou skupinu (CH(R.sup.4.n.)-CH.sub.3.n., kde R.sup.4 .n.znamená karboxymethylaminovou, 1-karboxypentylaminovou, 1-karboxy-2-methylpropylaminovou, 1-karboxy-3-methyl-butylaminovou, 1-karboxy-2-methyl-butylaminovou, 1-karboxy-butylaminovou,1-karboxy-pentylaminovou, 1-karboxy-2-hydroxyethylaminovou, 1-karboxy-2-2-hydroxy-propylaminovou, 1-karboxy-2-merkapto-ethyl-aminovou, 1-karboxy-3-methylthio-propylaminovou, 1,2-dikarboxy-ethylaminovou, 1-karboxy-2-karbamoyl-ethylaminovou, 1,3-dikarboxy-propylaminovou, 1-karboxy-3-karbamoyl-propylamynovou, 1-karboxy-2-fenyl-ethylaminovou, 1-karboxy-2-(4-hydroxyfenyl)-ethylaminovou, 1-karboxy-2-indolyl-ethylaminovou, 2-ŕ

Description

Oblast techniky

Vynález se týká nového antigenu protozoových parazitů rodu Eimeria. Tento antigen se může používat k ochraně drůbeže proti kokcidióze, přičemž způsob podávání může být různý.

Dosavadní stav techniky

Kokcidióza je choroba drůbeže způsobená intracelulámími protozoovými parazity rodu Eimeria. Při intenzivním chovu drůbeže ve velkých drůbežámách je tato choroba endemická. Odhadovaná výše výdajů na potlačení této choroby pomocí chemoterapie přesahuje 100 milionů dolarů ročně jenom ve Spojených státech amerických. Vývoj odolnosti ke známým antikokcidioticky působícím lékům vyžaduje neustálé vyvíjení nových činidel v době, kdy vývoj léků je stále dražší a snižuje se přijatelnost reziduí z léků v masných zvířatech ze strany konzumentů.

Ochranná imunita k přirozené kokcidiózové infekci byla již dobře popsána. Ukázalo se, že řízené denní podávání malého množství živých oocyst po dobu několika týdnů způsobí kompletní imunitu k provokační infekci vyvolané normálně virulentní dávkou /Rose a další, Parasitology 73:25 (1976); Rose a další, Parasitology 88:199 (1984)/. Tato demonstrace získané odolnosti k infekci ukazuje možnost zkonstruování vakcíny pro indukci imunity u mladých kuřat, čímž by se obešla potřeba chemických kokcidiostatik. Prakticky bylo toto pojetí otestováno v přípravku Coccivac vyrobeném ve Sterwin Laboratories, Opelika, AL.

Murray a další, Evropská patentová přihláška číslo 167 443, s úmyslem vytvořit vakcínu proti kokcidióze, připravili extrakty ze sporozoí nebo sporulovaných oocyst druhu Eimeria tenella, které obsahovaly alespoň 15 polypeptidů, z nichž mnohé byly připojeny k povrchu sporozoií. Injekční aplikace těchto extraktů kuřatům redukovala cekální léze, způsobené orální inokulací pomocí virulentních sporulovaných oocyst druhu E. tenella.

Nedávno Schenkel a další, americký patent číslo 4 650 676, popsali produkci monoklonálních protilátek, proti merozoiím druhu E. tenella. Pomocí těchto protilátek Schenkel a další identifikovali řadu antigenů, proti nimž byly tyto protilátky zaměřeny. Preinkubací sporozoí E. tenella s těmito protilátkami a zavedením těchto preinkubovaných sporozoí do cék kuřat mohli Schenkel a další ukázat určitou redukci velikosti cekálních lézí ve srovnání s kontrolními zvířaty s nepreinkubovanými sporozoovými buňkami.

Pomocí rekombinantní DNA methodologie Newman a další (Evropská patentová přihláška číslo 164 176) klonovali gen ze sporozoového stadia, který kódoval antigen z Eimeria tenella o velikosti 25 000 daltonů. Séra z kuřat imunizovaných opakovanou imunizací usmrcenými sporozoovými buňkami E. tenella imunoprecipitují tento antigen z jodidovaných sporocyst a sporozoových membránových přípravků. Dále Jenkins /Nucleic Acids Res. 16:9863 (1988)/ popsal cDNA, kódující část merozoového povrchového proteinu o velikosti 250 000 daltonů z Eimeria acervulina. Exprimovaný produkt této cDNA byl rozpoznán antisérem proti tomuto organismu.

Pokroky v DNA rekombinantní technologii umožnily jiný přístup tj. podjednotkovou vakcínu. Příklady takových podjednotkových vakcín jsou popsány např. v Evropských patentových přihláškách č. 324 648, 337 589 a 344 808.

- 1 CZ 285116 B6

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu jsou imunogenní polypeptidy mající sekvenci aminokyselin (1) (Sekv. id. č.:l)

M A

K

3

M L

S

G

I

V

F

A G

L V

A A

A A A

S S

A

N

S A

A

N

V

s

V

L E

S G

P A

V Q E

V P

A

R

T V

T

A

R

L

A

K P

L L

L L

S A L

A A

T

L

A A

A

F

L

V

L

Q c

F N

I I

S S N

N Q

Q

T

s v

R

R

L

A

A

G G

A C

G D

E E D

A D

E

G

T S

Q

Q

A

S

R

R R

R K

P D

T P A

A D

K

Y

D F

V

G

G

T

P

V S

V T

E P

N V D

E V

L

I

Q I

R

N

K

Q

I

F L

K N

P W

T G Q

E E

Q

V

L V

L

E

R

Q

S

E E

P I

L I

VAR

T R

Q

T

L E

G

Y

L

G

S

Q A

L A

Q D

G K T

A K

E

E

K V

E

G

G

K

T

H R

R Y

K V

K S S

D P

G

Y

G F

P

Y

T

T

V

L D

G V

P V

G T D

E D

G

Y

V V

E

V

L

M

K

T G

P H

G G

V D M

Μ T

S

T

A S

Q

G

K

F

c

G V

L M

D D

G K. G

N L

V

D

G Q

G

R

K

I

T

A V

I G

M L

T Q P

D T

E

F

R S

G

P

G

D

D

E D

D E

(sekv. id.č. 1)

přičemž tyto polypeptidy jsou schopné indukovat imunitní odpověď proti parazitům rodu Eimeria například u kuřat. Zde popsaný proteinový prekurzor antigenu z povrchu merozoí rodu Eimeria má sekvence, které odpovídající sekvenci (1) (Sekv. id. č.: 1).

Přednostním polypeptidem podle tohoto vynálezu je imunogenní polypeptid o sekvenci aminokyselin (1) (Sekv. id. č.: 1), který však postrádá sekvenci signálního peptidu na N-konci. Předmětem vynálezu je také funkčně ekvivalentní polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci, která se vytvoří z uvedené aminokyselinové sekvence pomocí delecí, inzercí nebo substitucí bez zásadní změny imunologických vlastností tohoto polypeptidu.

Předmětem vynálezu je dále DNA kódující celý proteinový prekurzor antigenu z povrchu merozoí rodu Eimeria nebo jeho část, jako je DNA mající nukleotidovou sekvenci (A) (Sekv. id. č.:2)

-2CZ 285116 B6

ATGGCTAAGTCTATGCTTTCTGGAATTGTTTTTGCTGGTCTTGTTGCTGCTGCAGCG gccagttcggccaacagcgccgccaacgtctccgttttggagagtgggcccgctgtg CAGGAAGTGCCAGCGCGCACGGTCACAGCTCGCCTGGCGAAGCCTTTGCTGCTTCTT TCTGCTCTTGCTGCGACTTTGGCAGCAGCTTTCCTCGTTTTGCAATGCTTCAACATC ATCTCCAGCAACAACCAGCAAACCAGCGTCAGGAGACTGGCCGCCGGAGGTGCATGC GGAGATGAGGAAGATGCAGATGAGGGAACTTCACAGCAGGCCAGCCGGAGGAGGAGA AAACCTGATACCCCTGCAGCAGATAAATACGATTTTGTTGGCGGAACTCCAGTTTCG GTCACTGAGCCGAATGTTGATGAAGTCCTTATCCAAATTAGAAATAAACAAATCTTT TTGAAGAACCCATGGACTGGACAAGAAGAACAAGTTCTAGTACTGGAACGACAAAGT GAAGAACCCATTCTGATTGTGGCGAGGACAAGACAAACACTTGAAGGATATC-TTGGT AGTCAAGCTCTTGCACAGGACGGAAAGACTGCTAAAGAAGAGAAAGTTGAAGGAGGC AAAACTCACAGAAGATATAAAGTCAAGAGCAGCGACCCAGGATATGGATTCCCATAC ACCACGGTGCTCGACGGGGTTCCTGTGGGAACAGACGAAGACGGATACGTCGTCGAA GTTCTTATGAAAACCGGACCCCATGGAGGAGTCGACATGATGACTAGCACAGCATCA CAAGGAAAATTCTGCGGAGTGCTTATGGATGACGGAAAAGGAAACCTAGTCGATGGA CAAGGGAGAAAAATTACCGCCGTTATCGGCATGCTAACTCAACCGGATACCGAGTTT AGAAGCGGACCAGGAGACGACGAGGACGACGAGTGA nebo její části, jako je nukleotidová sekvence (B), která odpovídá nukleotidové sekvenci (A) (Sekv. id. č.: 2), ale postrádá sekvenci nukleotidů, kódující sekvenci signálního peptidu. ATG 5 kodón se přednostně přidá na začátek DNA, obsahující částečnou sekvenci DNA s nukleotidovou sekvencí (A) (Sekv. id. č.: 2), pomocí způsobů dobře známých v tomto oboru. Předmětem vynálezu jsou dále rekombinantní vektory, které obsahují uvedenou DNA a jsou schopné řídit její expresi v kompatibilních hostitelských organismech, a mikroorganismy obsahující tyto vektory.

Předmětem vynálezu je dále způsob produkce shora uvedených polypeptidů, jehož podstata spočívá v tom, že se

a) kultivuje mikroorganismus, obsahující rekombinantní vektor s DNA o nukleotidové sekven- ci, kódující uvedený polypeptid, jako je DNA o nukleotidové sekvenci (A) (Sekv. id. č.: 2) nebo její fragment, jako je nukleotidová sekvence (B), za podmínek, při kteiých se DNA sekvence nebo její fragment exprimuje; a

b) izoluje se rekombinantní polypeptid z kultury.

Předmětem vynálezu jsou dále vakcíny na ochranu subjektů (např. lidí nebo zvířat) proti kokcidióze, které obsahují účinné množství jednoho nebo více polypeptidů podle tohoto vynálezu a fyziologicky vhodný nosič. Přednostním subjektem je drůbež (např. kuřata nebo krocani). Jinými subjekty mohou být domácí zvířata, jako jsou králíci nebo ovce.

Předmětem vynálezu jsou dále vakcíny na ochranu subjektů proti kokcidióze, obsahující rekombinantní virus s DNA sekvencí, která kóduje polypeptid podle tohoto vynálezu, kterýžto rekombinantní virus je schopen vyvolat expresi uvedené sekvence DNA, a fyziologicky vhodný nosič.

-3 CZ 285116 B6

Předmětem vynálezu je také způsob ochrany subjektů proti kokcidióze, který zahrnuje podávání účinného množství vakcíny podle tohoto vynálezu subjektu, jako je mladá drůbež, která je náchylná ke kokcidióze.

Polypeptidy rodu Eimeria podle tohoto vynálezu jsou důležitými vakcínovými antigeny, protože byly identifikovány použitím protilátek obsažených v sérech zvířat, která byla imunizována proti kokcidiózovým organismům a která si tak vytvořila proti nim imunitu. Proto je nejvýše pravděpodobné, že tyto polypeptidy hraj í významnou roli v ochraně drůbeže proti kokcidióze.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 ukazuje nukleotidovou sekvenci cDNA o velikosti molekuly 1,2 kb, která kóduje proteinový prekurzor rodu Eimeria rozpoznávaný antigen-selektivními králičími protilátkami nebo protilátkami ze séra imunních kuřat. Jak je z obr. 1 patrné, nukleotidová sekvence, kódující uvedený proteinový prekurzor, leží mezi ATG kodónem na nukleotidové pozici 68 a stop kodónem TAA na nukleotidové pozici 1013 (kóduje 315 aminokyselin). Obr. 1 také ukazuje sekvenci aminokyselin proteinového prekurzoru rodu Eimeria předpovězenou podle uvedené nukleotidové sekvence. Nukleotidy a aminokyseliny jsou vyjádřeny standardními jednopísmennými zkratkami. Význam těchto zkratek se dá zjistit ve standardních biochemických učebnicích, jako je například Lehninger, Principy biochemie, 1984, Worth Publishers, lne., New York, str. 96, 798.

Obr. 2 ukazuje výsledky analýzy SDS PAGE různých merozoových proteinů rodu Eimeria. Okénko A je imunoblot celkového množství merozoových proteinů s kontrolní próbou (a) nebo s próbou v podobě antigen-selektivních protilátek (b). Šipka v okénku A ukazuje umístění pásu, obsahujícího protein o molekulové hmotnosti asi 23 kilodaltonů. Okénko B je autoradiogram merozoových proteinů povrchově značených ¹²⁵I, které jsou imunoprecipitovány s kontrolní próbou (a) nebo s antigen-selektivními protilátkami (b). Okénko C ukazuje kompletní směs produktů získaných translací in vitro merozoové polyA mRNA (c) a translační produkty imunoprecipitované s protilátkami selektovanými s použitím lambda 5-7 klonu (b), protilátky selektované s použitím jiného fágového klonu, produkujícího proteiny reagující s antimerozoovým sérem (a) a kontrolní protilátky selektované z merozoového séra s použitím nerekombinantního fágu (d). Pásy byly vizualizovány fluorograficky. Umístění markérů molekulové hmotnosti, majících vyznačenou molekulovou hmotnost v kilodaltonech (kDa), jsou ukázána napravo od obrázku.

Obr. 3 ukazuje výsledky analýzy Southem Blot. Analýze byla podrobena genomová DNA ze sporulované oocysty druhu Eimeria tenella, která byla štěpena enzymy PvuII (pruh 1), HincII (pruh 2), Pstl (pruh 3), Sphl (pruh 4) nebo Sací (pruh 5) s použitím EcoRI inzertu obsahujícího 5-7 gen. Inzert je dále popsaný jako próba. Umístění standardních částí DNA o vyznačené velikosti v kb je ukázáno vpravo od obrázku.

Obr. 4 ukazuje schematickou kresbu plazmidů pDS56/RBSII (není nakreslena v měřítku). Na tomto diagramu a na obrázcích 6, 8 a 10 zkratky a symboly značí místa štěpení pro restrikční enzymy: B pro BamHI, E pro EcoRI, H pro HindlII, P pro Pstl, S pro Sáli, X pro Xhol a Xb pro Xbal. Značka I— vyjadřuje regulovatelný promotor/operátorový element

N250PSN250P29; značka vyjadřuje ribosomová vazná místa RBSII, RBSII (-1) a nebo RBSII (-2) podle vyznačení; značka —> označuje kódující oblasti pod kontrolou těchto ribosomových vazných míst; značka ΠΠίΠΙΙΙΠΠΙΙΙΙΙΙ vyjadřuje terminátory to nebo TI podle vyznačení; značka ---------označuje oblast nutnou pro replikaci DNA v E. coli (repl.);

-4CZ 285116 B6 značka označuje kódující oblasti pro chloramfenikolacetyltransferasu (cat) a pro beta-laktamasu (bia).

Obr. 5 udává kompletní nukleotidovou sekvenci plazmidu pDS56/RBSII. V této sekvenci jsou vyznačené rozpoznávací sekvence restrikčních enzymů popsané na obr. 4. Ukázaná aminokyselinová sekvence vyjadřuje otevřený čtecí rámec pod kontrolou ribosomového vazného místa RBSII.

Obr. 6 je schematická kresba plazmidu pDS56/RBSII (-1) (není nakreslena v měřítku).

Obr. 7 ukazuje kompletní nukleotidovou sekvenci plazmidu pDS56/RBSII (-1). V této sekvenci jsou vyznačené rozpoznávací sekvence restrikčních enzymů popsané na obr. 6. Ukázaná aminokyselinová sekvence vyjadřuje otevřený čtecí rámec pod kontrolou ribosomového vazného místa RBSII (-1).

Obr. 8 je schematická kresba plazmidu pDS56/RBSII (-2) (není nakreslena v měřítku).

Obr. 9 ukazuje kompletní nukleotidovou sekvenci plazmidu pDS56/RBSII (-2). V této sekvenci jsou vyznačené rozpoznávací sekvence restrikčních enzymů popsané na obr. 8. Ukázaná aminokyselinová sekvence vyjadřuje otevřený čtecí rámec pod kontrolou ribosomového vazného místa RBSII (-2).

Obr. 10 je schematická kresba plazmidu pDMI.l (není nakreslena v měřítku). Symboly a zkratky mají stejný význam jako je uvedeno v legendě k obr. 4, ale značka ^vyjadřuje kódující oblasti pro lac represor (lácí) a neomycinfosfotransferasu (neo).

Obr. 11, tj. obr. 11A, 11B a 11C, ukazuje kompletní nukleotidovou sekvenci plazmidu pDMI.l. V této sekvenci jsou vyznačené rozpoznávací sekvence restrikčních enzymů popsané na obr. 10. Ukázaná aminokyselinová sekvence zahrnuje otevřené čtecí rámce, kódující neomycinfosfotransferasu (od aminokyseliny Met k Phe) a lac represor (od aminokyseliny Met ke Glu; prosím všimněte si obrácené orientace tohoto genu).

Obr. 12 je schematická kresba plazmidu pUC8-TK-7,5K. V tomto diagramu a na obr. 13 a 15 zkratka TK. značí sekvenci genu thymidinkinasy zvakcinia viru, zkratka 7,5K znamená 7,5K promotor vakcinia viru, značka lac Z vyjadřuje regulátorové sekvence, kódující informaci pro část N-konce genu pro beta-galaktosidasu, zkratka ori vyjadřuje oblast nutnou pro replikaci DNA v E. coli a zkratka AmpR znamená kódující oblast genu pro beta-laktamasu.

Obr. 13 je schematická kresba rekombinantního plazmidu pR3.

Obr. 14 ukazuje kompletní nukleotidovou sekvenci rekombinantního plazmidu pR3. Ukázaná aminokyselinová sekvence vyjadřuje otevřený čtecí rámec pod kontrolou 7,5K vakciniového promotoru.

Obr. 15 je schematická kresba plazmidu pR4. Zkratka ML vyjadřuje malariovou vedoucí sekvenci.

Následuje podrobnější popis tohoto vynálezu.

Všechny uvedené citace nahrazují přenesení celého jejich obsahu do popisu tohoto vynálezu.

-5CZ 285116 B6

Následující termíny mají zde v textu tyto významy:

Povrchový antigen rodu Eimeria značí protein o zdánlivé molekulové hmotnosti okolo 23 kilodaltonů, zjištěné pomocí SDS PAGE, který je přítomen v merozoovém stadiu v buňkách Eimeria tenella. Tento protein se zřejmě tvoří při posttranslačních procesech, kterým podléhá in vivo expresní produkt kódovaný genem, jehož cDNA sekvence je ukázaná na obr. 1.

Proteinový prekurzor znamená protein o zdánlivé molekulové hmotnosti okolo 33 kilodaltonů, zjištěné pomocí SDS PAGE. Tento protein patrně vzniká in vivo proteolýzou z povrchového antigenu rodu Eimeria. Nukleotidová sekvence molekuly cDNA, kódující proteinový prekurzor, a podle ní předpovězená aminokyselinová sekvence jsou ukázány na obr. 1.

Termín imunogenní polypeptidy mající sekvenci aminokyselin (1), přičemž tyto polypeptidy jsou schopné indukovat imunitní odpověď proti parazitům rodu Eimeria znamená polypeptidy schopné vyvolat ochrannou imunitní odpověď, zprostředkovanou B-buňkami a/nebo T-buňkami, proti parazitům rodu Eimeria, obsahujícím uvedený merozoový povrchový antigen, který koresponduje se sekvencemi imunogenních polypeptidů. Uvedené imunogenní polypeptidy mohou být tvořeny zralým merozoovým povrchovým proteinovým antigenem rodu Eimeria přirozeně neobsahujícím jiné proteiny rodu Eimeria, nebo to mohou být fragmenty uvedeného povrchového proteinového antigenu rodu Eimeria, které jsou stále ještě schopné se specificky vázat na protilátky, přítomné v sérech zvířat infikovaných parazity rodu Eimeria. Tyto polypeptidy odpovídají epitopům T-buněk a B-buněk povrchového antigenu rodu Eimeria definovaného výše v textu. Polypeptidy podle tohoto vynálezu také mohou být funkčními ekvivalenty uvedeného merozoového povrchového proteinového antigenu rodu Eimeria, přičemž tyto polypeptidy mají aminokyselinovou sekvenci odvozenou od aminokyselinové sekvence na obr. 1 substitucemi aminokyselin. Tyto substituce však zásadně nemění imunologickou aktivitu (tj. zásadně neničí imunoreaktivní a/nebo antigenní determinanty).

Příkladem fragmentu je imunogenní polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci (1) (Sekv. id. č. 1), avšak postrádá v podstatě prvních 20 až asi 100 aminokyselinových zbytků, tvořících sekvenci signálního peptidu. Dalším příkladem je imunogenní polypeptid o molekulové hmotnosti 23 kilodaltonů, zjištěné pomocí analýzy na SDS-polyakrylamidovém gelu. Přednostní fragmenty jsou uvedeny dále:

SNNQQTSV (2) (Sekv. id. č. 3)

CGDEEDADEGTSQQASRRRRKPDTPAADK (3) (Sekv. id. č. 4) PNV (4) (Sekv. id. č. 5) RNK.QIF (5) (Sekv. id. č. 6) NPWTGQEE (6) (Sekv. id. č. 7) RQSEE (7) (Sekv. id. č. 8) TRQTLE (8) (Sekv. id. č. 9)

ODGKTAKEEKVEGGKTHRRYKVKSSDPGYG (9) (Sekv. id. č. 10) TDEDG(IO) (Sekv. id. č. 11) TGPHG (11) (Sekv. id. č. 12) ASQGK (12) (Sekv. id. č. 13)

DDGKGNLVDGQGRK (13) (Sekv. id. č. 14) a TQPDTEFRSGPGDDEDDE (14) (Sekv. id. č. 15).

Fragmenty podle tohoto vynálezu, jako např. imunogenní polypeptid o sekvenci (1) (Sekv. id. č. 1), jsou schopné vyvolat imunitní odpověď proti kokcidióze v subjektu. Přednostním subjektem je drůbež, např. kuřata.

Výskyt aminokyselinových substitucí v proteinech, které zásadně nemění biologické a imunologické aktivity, je známý a popsaný např. Neurath a další, The Proteins (Proteiny), Academie

-6CZ 285116 B6

Press, New York (1979), zejména na obr. 6 str. 14. Nejčastější pozorované aminokyselinové substituce jsou Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly a obráceně.

Kvůli degenerovanosti genetického kóduje zřejmé, že existuje mnoho možných nukleotidových sekvencí (funkčních ekvivalentů), které by mohly kódovat aminokyselinovou sekvenci (1) (Sekv. id. č. 1). Také by mělo být zřejmé, že nukleotidové sekvence DNA sekvencí a fragmentů podle vynálezu inzertované do vektorů mohou obsahovat nukleotidy, které nejsou částí vlastních strukturních genů, pokud rekombinantní vektory, obsahující takovou sekvenci nebo fragmenty, jsou schopné řídit produkci polypeptidu podle vynálezu ve vhodném hostitelském organismu.

Sekvence DNA, kódující polypeptidy, které jsou funkčními ekvivalenty uvedeného merozoového povrchového antigenu rodu Eimeria, se mohou vhodně připravit s použitím vhodných syntetických oligonukleotidů při primerem řízené místně-specifické mutagenezi například cDNA podle vynálezu (Sekv. id. č. 2). Tento typ mutageneze popsal Morinaga a další /Biotechnology 2:636 (1984)/.

Fragmenty nebo části merozoového povrchového proteinového antigenu z buněk rodu Eimeria nebo DNA, která je kóduje, se mohou vytvořit enzymovým štěpením větších molekul pomocí restrikčních endonukleas pro DNA a proteas pro proteiny. Fragmenty podle vynálezu se však neomezují na produkty jakékoliv formy enzymového štěpení, ale zahrnují subsekvence, jejichž konce neodpovídají žádným místům enzymového štěpení. Tyto fragmenty se mohou vyrobit např. chemickou syntézou s použitím sekvenčních údajů zde uvedených. Fragmenty DNA se také mohou vytvořit nekompletní syntézou komplementární DNA (cDNA) z izolované messenger RNA (mRNA). Proteinové fragmenty se také mohou utvořit expresí fragmentů DNA, kódujících proteinové fragmenty. Takové proteinové fragmenty mohou být užitečné v tomto vynálezu, jestliže obsahují dostatečný počet aminokyselinových zbytků, aby vytvořily imunoreaktivní a/nebo antigenní determinant. Obecně je zapotřebí alespoň asi 7 nebo 8 zbytků. Jak je vysvětleno dále v textu, může být nutné vázat takové fragmenty na imunogenní nosičovou molekulu, aby se staly imunoreaktivními.

Imunitní reaktivita může zahrnovat jak produkci protilátek B-buňkami (humorální imunita) tak aktivaci T-buněk (buněčná imunita). Polypeptidy podle tohoto vynálezu zahrnují antigenní determinanty nebo epitopy B-buněk a epitopy T-buněk. Humorální imunita se může demonstrovat indukcí produkce protilátek B-buňkami in vivo nebo in vitro. Buňkami zprostředkovaná imunita se může demonstrovat aktivací T-buněk například zvýšenou syntézou proteinu T-buněk nebo stimulací B-buněk aktivovanými T-buňkami. Stanovení obou typů imunity jsou v oboru dobře známá.

Polypeptidy podle vynálezu se mohou získat způsoby v oboru známými, jako je metodologie rekombinantní DNA, chemická syntéza nebo izolace přípravků z buněk rodu Eimeria. Polypeptid o sekvenci 1 (Sekv. id. č. 1) a jeho fragmenty, pokud se připraví v souladu s postupem podle tohoto vynálezu, jsou zásadně prosté jiných proteinů, které produkují parasiti rodu Eimeria.

DNA potřebná k tvorbě proteinů podle tohoto vynálezu se může chemicky syntetizovat s použitím poskytnutých informací o nukleotidové sekvenci (Sekv. id. č. 2) a na obrázcích. Taková chemická syntéza se může provádět s použitím jakéhokoliv známého způsobu, jako je např. způsob využívající fosforamiditový pevný nosič, který popsal Matteucci a další /J. Am. Chem. Soc. 103:3185 (1981)/.

Alternativně se může cDNA připravit pomocí mRNA z buněk rodu Eimeria. Messenger RNA se může izolovat z merozoí rodu Eimeria pomocí standardních způsobů. Tyto vzorky mRNA se mohou použít k vytvoření dvouvláknové cDNA, jak popsal Maniatis a další /Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Molekulární klonování: Laboratorní příručka), 1982, Cold Spring Harbor

-7CZ 285116 B6

Laboratory, Cold Spring Harbor, NY/. Tato cDNA se může vložit do vhodného klonujícího vektoru, který se může použít pro transformaci vhodného hostitelského organismu (např. E. coli), aby se vytvořila knihovna cDNA.

Knihovna cDNA se může testovat s použitím klonového genu podle tohoto vynálezu nebo jeho fragmentů jako prób. Pro užití jakožto prób se takový gen nebo fragmenty mohou označit např. nick-translací pomocí Pol I DNA polymerasy v přítomnosti čtyř deoxyribonukleotidů, z nichž jeden obsahuje 32P v poloze alfa (Maniatis a další, viz výše v textu, str. 109). Próby se také mohou připravit syntézou oligonukleotidů, která je založena na známé sekvenci cDNA povrchového antigenu buněk rodu Eimeria.

Ačkoliv v příkladech uvedených níže se jako zdroj mRNA používal druh Eimeria tenella, klonované geny z tohoto druhu se mohou použít jako próby pro izolaci genů z jiných druhů rodu Eimeria vzhledem k sekvenční homologii mezi různými druhy.

Již identifikované a izolované části DNA z buněk rodu Eimeria se vloží do vhodného expresního prostředku nebo vektoru, který obsahuje elementy nezbytné pro transkripci a translaci vložených genových sekvencí. Užitečné klonující prostředky se mohou skládat ze segmentů chromosomálních, nechromosomálních a syntetických DNA sekvencí, jako jsou různé známé bakteriální plazmidy, virová DNA, např. fágová DNA, kombinace plazmidů a virové nebo fágové DNA, jako jsou plazmidy modifikované tak, aby obsahovaly fágovou DNA nebo jiné sekvence kontrolující expresi, nebo kvasinkové plazmidy. Specifické klonující prostředky, které se mohou použít, obsahuje následující výčet, ale možnost použití se neomezuje jen na ně: pEV-vrf plazmidy /pEV-vrfl, -2 a-3, které popsal Crowl a další, Gene 38:31 (1985)/; SV40; adenovirus; kvasinkové vektory; lambda gt-WES-lambda B; Charon 4A a 28; lambda-gt-2; od M13 odvozené vektory, jako jsou pUC8, 9, 18 a 19, pBR313, 322 a 325; pAC105; pVA51; pACY177; pKH47; pACYC184; pUBHO; pMB9; coIEl; pSCIOl; pML21; RSF2124; pCRl nebo RP4; difterie drůbeže; vakcinia nebo člen herpes-virus rodiny.

Inzerce genů rodu Eimeria do klonujícího vektoru se snadno provede, když jak geny tak žádaný klonující prostředek se štěpí stejným restrikčním enzymem nebo enzymy, protože tím se vytvoří komplementární DNA konce. Jestliže se tato operace nemůže provést, může být nezbytné modifikovat vzniklé střižené konce (cut ends) zpětným štěpením jednovláknové DNA za vzniku tupých konců nebo pro dosažení stejného výsledku doplnit jednovláknové konce vhodnou DNA polymerasou. V tomto případě se může provést ligace natupo (blunt-end ligation) pomocí enzymu jako je T4 DNA ligasa. Alternativním způsobem je vytvoření jakéhokoliv žádaného místa na DNA koncích pomocí ligačních nukleotidových sekvencí (linkerů). Tyto linkery mohou obsahovat specifické oligonukleotidové sekvence, které kódují rozpoznávací sekvence restrikčního místa. Rozštěpený vektor a geny nebo fragmenty z buněk rodu Eimeria se mohou také modifikovat způsobem homopolymeric tailing, který popsal Morrow /Methods in Enzymology 68:3 (1979)/.

Mnoho klonujících prostředků, které se mohou použít v tomto vynálezu, obsahuje jednu nebo více markerových aktivit, které se mohou použít pro výběr žádaných transformantů, např. rezistenci k ampicilinu a tetracyklinu v pBR322, rezistenci k ampicilinu a β-galaktosidasovou aktivitu v pUC8 a rezistenci k ampicilinu v pEV-vrf plazmidech. Selekce hostitelských buněk, do nichž se tyto vektory vkládají, je značně usnadněna, když hostitelské buňky samy postrádají aktivity poskytnuté těmito vektory.

Je třeba si uvědomit, že nukleotidové sekvence genů buněk rodu Eimeria vložené na vybraném místě do klonujícího prostředku mohou obsahovat nukleotidy, které nejsou částí vlastních strukturních genů. Alternativně geny mohou obsahovat jenom část kompletního genu divokého typu. Je pouze potřeba, aby fragmenty genu po inzerci do klonujícího prostředku byly schopné

-8CZ 285116 B6 řídit ve vhodném hostitelském organismu produkci polypeptidu nebo proteinu, který obsahuje alespoň jeden imunoreaktivní a/nebo antigenní determinant povrchového antigenu buněk rodu Eimeria, takže rekombinantní vektory, obsahující DNA s nukleotidovou sekvencí, která kóduje protein podle tohoto vynálezu, se mohou připravit:

a) inzercí DNA s nukleotidovou sekvencí kódující uvedený protein do vektoru;

b) replikací tohoto vektoru v mikroorganismu; a

c) izolací rekombinantního vektoru z mikroorganismu.

Výběr vhodného hostitelského organismu je ovlivněn řadou faktorů, známých v oboru. Tyto faktory zahrnují například kompatibilitu s vybraným vektorem, toxicitu proteinů kódovaných hybridním plazmidem, snadnost získáni žádaného proteinu, expresní charakteristiky, biobezpečnost a náklady. Vyrovnanost těchto faktorů se musí uvážit a musí se vzít na vědomí, že ne všichni hostitelé budou stejně efektivní při expresi konkrétní rekombinantní molekuly DNA.

Skupina vhodných hostitelských mikroorganismů, které se mohou použít v tomto vynálezu, zahrnuje, ale neomezuje se na rostlinné, živočišné nebo kvasinkové buňky a bakterie jako např. Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus a Actinomyces. Může se použít Escherichia coli kmen MC 1061, který popsal Casadaban a další /J. Mol. Biol. 138:179 (1980)/, nebo jakýkoliv jiný kmen E. coli K-12 obsahující plazmid pRK248clts. Plazmid pRK248clts používaný v jiných E. coli K-12 kmenech popsal Bemhard a další /Meth. of Enzymol. 68:482 (1979)/ a je také dostupný v Americké sbírce typů kultur pod číslem ATCC 33766. E. coli kmen MC 1061 je komerčně dostupný např. od CLONTECH Laboratories, lne., Palo Alto, CA, USA a také v Americké sbírce typů kultur (Američan Type Culture Collection) pod číslem ATCC 53338. Plazmidy pDMI.l, pDS56/RBSII, -1 nebo -2 používané v E. coli kmenu M15 jsou popsány dále v textu.

Převod rekombinantního klonujícího vektoru do hostitelské buňky se může provést různými způsoby. V závislosti na konkrétním zvoleném systému vektor/hostitelská buňka se může tento převod provést transformací, transdukcí, transfekcí nebo elektroporací. Když se vytvoří taková modifikovaná hostitelská buňka, může se kultivovat a z kultury se může izolovat proteinový expresní produkt.

Transformované klony, produkující proteinový prekurzor povrchového antigenu buněk rodu Eimeria, se identifikují testováním pomocí séra zvířat imunizovaných proti sporozoovým nebo merozoovým buňkám E. tenella, které byly fixovány glutazaldehydem. V příkladech uvedených níže se pro testování a charakterizaci genového produktu použilo králičí anti-merozoové sérum. Výsledkem paralelního imunologického testování pomocí imunitního kuřecího séra byla nezávislá izolace cDNA, kódující merozoový povrchový antigenní prekurzor.

Specifičnost antisér užitých při imunologickém testování nebo imunoprecipitaci se může zvýšit použitím modifikovaného způsobu výběru protilátek viz Halí a další /Nátuře 311:379 (1984)/. Při tomto způsobu, který je podrobněji popsaný dále v textu, se protilátky specifické pro proteiny buněk rodu Eimeria, které vytvořily uvedené klony, adsorbují ze séra na filtry.

Detekce klonů produkujících antigen buněk rodu Eimeria se může provádět použitím dobře známých standardních stanovení včetně imunoprecipitace, enzymového imunostanovení (ELISA) a radioimunostanovení, která jsou popsána v literatuře /viz např. Kennet a další (editoři), Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A new Dimension in Biological Analyses (monoklonální protilátky a hybridomy: Nová dimenze v biologických analýzách), 1980, Plenům Press, New York, str. 376-384/.

-9CZ 285116 B6

Rekombinantní vektory obsahující DNA, která kóduje variantní polypeptid povrchového antigenu buněk rodu Eimeria podle tohoto vynálezu, se mohou připravit způsoby dobře známými v oboru např. místně specifickou mutagenezí.

Velká množství rekombinantních polypeptidů z buněk rodu Eimeria podle tohoto vynálezu se mohou připravit pěstováním transformovaných mikroorganismů, takto získaných, ve fermentačním médiu, které obsahuje nezbytné živiny, za podmínek vhodných pro expresi rekombinantní DNA. Při produkci v buňkách E. coli jsou rekombinantní polypeptidy buněk rodu Eimeria přítomné obyčejně v cytoplazmě nebo v inkluzích bakterií. Pro uvolnění proteinů je proto nutné rozbít vnější membránu bakterií. To se provádí sonikací nebo jinými prostředky mechanické dezintegrace, jako je např. použití Frenchovy tlakové cely nebo Gaulinova homogenizátoru /Charm a další, Meth. Enzymol. 22, 476-556 (1971)/.

Rozbití buněk se také může provádět chemicky nebo enzymaticky. Jelikož pro integritu buněčné membrány jsou často potřeba dvojvazné kationty, může být účinkem vhodných chelatačních činidel, jako je EDTA nebo EGTA, membrána dostatečně rozbita, takže usnadní uvolnění proteinů z buněk. Pro vyvolání stejného účinku se podobně mohou použít enzymy např. lysozym. Tento enzym hydrolyzuje peptidoglykanovou kostru buněčné stěny.

Také se může použít osmotický šok. Stručně řečeno osmotický šok se může provést umístěním buněk nejprve do hypertonického roztoku, který způsobí ztrátu vody a seschnutí buněk. Následné přemístění buněk do hypotonického šokového roztoku potom vede k rychlému přísunu vody do buněk s vylučováním žádaných proteinů.

Jakmile jsou proteiny buněk rodu Eimeria uvolněny z buněk, mohou se zkoncentrovat srážením solemi jako např. síranem sodným nebo amonným, ultrafiltrací nebo jinými způsoby dobře známými odborníkům v oboru. Další čištění se může provádět běžnými purifikačními postupy pro proteiny, které zahrnují, ale neomezují se na gelovou filtraci, intoměničovou chromatografii, preparativní elektroforézu na diskovitém gelu nebo záclonovou (curtain) elektroforézu, izoelektrickou fokuzaci, frakcionaci organickými rozpouštědly za nízké teploty nebo protiproudou distribuci. Purifíkace se také může provádět imunoafinitní chromatografii.

Specifické způsoby purifíkace proteinů z buněk rodu Eimeria z mikroorganismů jsou v oboru známé (viz např. Newman a další, Evropská patentová přihláška č. 164 176).

Proteiny podle tohoto vynálezu nebo jejich fragmenty se mohou chemicky syntetizovat vhodným způsobem, jako je syntéza výlučně v pevné fázi, způsoby využívající částečně pevnou fázi, kondenzace fragmentů nebo klasická syntéza v roztoku. Přednost se dává syntéze v pevné fázi, kterou popsal Merrifield /J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963)/.

Tato syntéza se provádí s aminokyselinami, které jsou na konci s α-aminoskupinou chráněny. Trifunkční aminokyseliny s nestabilními postranními řetězci se také chrání vhodnými skupinami, které zabraňují výskytu chemické reakce na tomto místě během tvorby peptidu. Skupina chránící konec s α-aminoskupinou se selektivně odstraní, aby se umožnila následná reakce, která se odehrává na aminoskupině. Podmínky pro odstranění skupiny chránící a-aminoskupinu nezpůsobí odstranění chránících skupin z postranního řetězce.

Skupinami chránícími α-aminoskupiny jsou známé skupiny užitečné v postupné syntéze peptidů. Mezi tyto skupiny náleží chránící skupiny acylového typu (např. formylskupina, trifluoracetylskupina, acetylskupina), chránící skupiny aromatického urethanového typu (např. benzyloxykarbonyl skupina (Cbz) a substituovaná benzyloxykarbonyl skupina), alifatické chránící skupiny urethanového typu (např. t-butyloxykarbonyl skupina (Boc), isopropyloxykarbonyl skupina, cyklohexyloxykarbonyl skupina) a chránící skupiny alkylového typu (např. benzyl skupina,

- 10CZ 285116 B6 trifenylmethyl skupina). Přednostní chránící skupinou je Boc. Chrániči skupiny postranního řetězce pro aminokyselinu Tyr jsou mimo jiné tetrahydropyranylskupina, terciální butylskupina, tritylskupina, benzylskupina, Cbz, 4-Br-Cbz a 2,6-dichlorbenzylskupina. Přednostní chránící skupinou postranního řetězce pro aminokyselinu Tyr je 2,6—dichlorbenzylskupina. Mezi chránící skupiny postranního řetězce pro aminokyselinu Asp patří benzylskupina, 2,6-dichlorbenzylskupina, methylskupina, ethylskupina a cyklohexylskupina. Přednostní chránící skupinou postranního řetězce pro aminokyselinu Asp je cyklohexylskupina. Mezi chránící skupiny postranního řetězce pro aminokyseliny Thr a Ser patří acetylskupina, benzoylskupina, tritylskupina, tetrahydropyranylskupina, benzylskupina, 2,6-dichlorbenzylskupina a Cbz. Přednostní chránící skupinou postranního řetězce pro aminokyseliny Thr a Ser je benzylskupina. Mezi chránící skupiny postranního řetězce pro aminokyselinu Arg patří nitroskupina, Tos, Cbz, adamantylkarbonylskupina nebo Boc. Přednostní chránící skupinou pro aminokyselinu Arg je Tos. Aminoskupina v postranním řetězci aminokyseliny Lys se může chránit Cbz, 2-ClCbz, Tos nebo Boc skupinou. Přednostní chránící skupinou pro aminokyselinu Lys je 2-Cl-Cbz skupina. Výběr chránící skupiny postranních řetězců se zakládá na následujících faktech: Chrániči skupiny postranních řetězců musí zůstat nedotčené během průběhu reakce a nesmí se odštěpovat během odstraňování skupiny chránící konec s aminoskupinou nebo za podmínek průběhu syntézy. Chrániči skupiny postranního řetězce musí být odstranitelné po dokončení syntézy finálního peptidů za reakčních podmínek neměnících cílový peptid.

Syntéza v pevné fázi se obvykle provádí od konce s karboxyskupinou navázáním aminokyseliny s chráněnou aminoskupinou (s chráněným postranním řetězcem) na vhodný pevný nosič. Když se taková aminokyselina zakotví na pryskyřici obsahující chlormethylskupiny a hydroxymethylskupiny, vytvoří se esterová vazba. Výsledný cílový protein bude mít volnou karboxylovou skupinu na C-konci. Alternativně se může použít pryskyřice obsahující benzylhydrylaminoskupiny a p-methylbenzhydrylaminoskupiny pro vytvoření amidové vazby a výsledný cílový peptid bude mít karboxamidovou skupinu na C-konci. Tyto pryskyřice jsou komerčně dostupné a jejich příprava je popsaná viz Stewart a další, Syntéza peptidů v pevné fázi (Solid Phase Peptide Synthesis) /2. vydání, Pierce Chemical Co., Rockford, IL, 1984/.

Aminokyselina Arg na C-konci, chráněná na postranním řetězci pomocí Tos a s a-aminoskupinou chráněnou pomocí Boc, se váže na pryskyřici s benzhydrylaminovými skupinami s použitím různých aktivačních činidel, mezi která patří dicyklohexylkarbodiimid (DCC), N,N'diisopropylkarbodiimid a karbonyldiimidazol. Po připojení k pryskyřičnému nosiči se odstraní skupina chránící α-aminoskupinu použitím trifluoroctové kyseliny (TFA) nebo HC1 v dioxanu při teplotě mezi 0 °C a 25 °C. Po zavedení methioninu (Met) se k roztoku TFA přidá dimethylsulfid, aby se zamezilo možné S-alkylaci. Po odstranění skupiny chránící α-aminoskupinu se postupně naváží zbylé chráněné aminokyseliny v požadovaném pořadí, aby se získala žádaná sekvence peptidů.

Pro spojovací reakce při syntéze peptidů se mohou použít různá aktivační činidla včetně DDC, Ν,Ν'-diisopropylkarbodiimidu, benzotriazol-l-yl-oxy-tris(dimethylamino)-fosfonium hexafluorfosfátu (BOP) a DCC-hydroxybenzotriazolu (HOBt). Každá chráněná aminokyselina se používá v přebytku (>2,5 ekvivalentního množství) a připojování se obvykle provádí v roztoku DMF, CH2CI2 nebo jejich směsi. Dokončení spojovací reakce se sleduje v každém stupni ninhydrinovou reakcí, kterou popsal Kaiser a další /Anal. Biochem. 34:595 (1970)/. V případě, že je zjištěno neúplné připojení, spojovací reakce se opakuje. Spojovací reakce se mohou provádět automaticky na syntetizátoru Vega 250, Applied Biosystems synthetizer nebo na jiném dostupném přístroji. Po skončení tvorby cílového peptidů se z komplexu peptid-pryskyřice odstraní chránící skupiny směsí TFA/dithioethan a potom se tento komplex štěpí činidlem, jako je kapalný HF při teplotě 0 °C po dobu 1 až 2 hodiny, přičemž se odštěpí peptid od pryskyřice a odstraní se všechny skupiny chránící postranní řetězce.

- 11 CZ 285116 B6

Cyklizace postranních řetězců s postranními řetězci na pevné podložce vyžaduje použití orthogonálního chránícího schématu, které umožňuje selektivní odštěpení skupin chránících postranní řetězce kyselých aminokyselin (např. Asp) a bázických aminokyselin (např. Lys). K tomuto účelu se může použít 9-fluorenylmethylová chránící skupina (OFm) pro postranní řetězec aminokyseliny Asp a 9-fluorenylmetoxykarbonylová chránící skupina (Fmoc) pro postranní řetězec aminokyseliny Lys. V těchto případech se chránící skupiny postranních řetězců komplexu peptid-pryskyřice chráněného Boc selektivně odstraní piperidinem v roztoku DMF. Cyklizace na pevné podložce se dosáhne použitím různých aktivačních činidel včetně DCC, DCC/HOBt nebo BOP. Odštěpení cyklizovaného peptidu od pryskyřice pomocí HF se provádí způsobem popsaným výše v textu.

Čištění a testování syntetických proteinů se může provádět způsoby popsanými výše v textu pro rekombinantními postupy vytvořené proteiny.

Proteiny rodu Eimeria se mohou také získat z organismů, z extraktů membránových proteinů. Těmito postupy se mohou připravit kompletní proteiny divokého typu. Monoklonální protilátky se pro tento účel mohou připravit způsobem, který popsal Kohler a Milstein /Nátuře 256:495 (1975)/ s použitím syntetických nebo přírodních proteinů rodu Eimeria jako antigenu. Tyto způsoby se mohou použít k čištění povrchového antigenu o velikosti 23 kd z buněk rodu Eimeria podle tohoto vynálezu.

Z jednoho nebo více polypeptidů podle tohoto vynálezu se mohou vytvořit vakcíny obsahující polypeptidy a fyziologicky vhodný nosič. Mezi vhodné nosiče patří např. fosfátový pufr o koncentraci 0,01 až 0,1 M o neutrálním pH nebo fyziologický roztok.

Zvýšení imunity proti kokcidióze se může docílit jedním ze dvou způsobů. Za prvé se k vakcíně může přidat adjuvant nebo imunopotenciátor. Za druhé se proteiny podle tohoto vynálezu mohou podávat subjektu, který má být imunizován, ve větší formě buď jako zesíťovaný komplex nebo konjugované s nosičovou molekulou.

Skupina vhodných adjuvantů pro podávání vakcín subjektům zahrnuje, ale neomezuje se na Adjuvant 65 (obsahující arašídový olej, monooleát mannidu a monostearát hlinitý); minerální gely, jako je hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý a oxid hlinitý; surfaktanty, jako je hexadecylamin, oktadecylamin, lysolecithin, dimethyldioktadecylamoniumbromid, N,N-dioktadecyl-N,N’-bis(2-hydroxymethyl)propandiamin, polyoly typu methoxyhexadecylglycerolu a pluronic; polyanionty, jako je pyran, síran dextranu, póly IC, polyakrylová kyselina a karbopol; peptidy, jako je muramyldipeptid, dimethylglycin a tuftsin; a olejové emulze. Proteiny by se také mohly podávat po inkorporaci do liposomů nebo jiných mikronosičů.

Inkorporace do liposomů nebo jiných mikronosičů poskytuje prostředek, kterým je možno prodloužit dobu uvolňování účinných látek z vakcín. Ke stejnému účelu se může použít čerpadel, jako je osmotické čerpadlo Alza.

Imunogenita polypeptidů podle vynálezu, zejména menších fragmentů, se může zvýšit zesíťováním nebo připojením k imunogenní nosičové molekule (tj. k makromolekule mající schopnost nezávisle vyvolat imunologickou odpověď v hostitelském zvířecím organismu). K této makromolekule se mohou proteiny a proteinové fragmenty podle vynálezu kovalentně vázat. Zesíťování nebo konjugace s nosičovou molekulou může být žádoucí, protože malé proteinové fragmenty se mohou někdy chovat jako hapteny (molekuly, které jsou schopné specificky se vázat na protilátku, ale neschopné vyvolat produkci protilátek, tj. nejsou imunogenní). Konjugace těchto fragmentů s imunogenní nosičovou molekulou činí fragmenty imunogenními, což je obecně známé jako nosičový efekt.

- 12CZ 285116 B6

Mezi vhodné nosičové molekuly patří např. proteiny a přírodní nebo syntetické polymemí sloučeniny, jako jsou polypeptidy, polysacharidy, lipopolysacharidy atd. Užitečným nosičem je glykosid nazvaný Quil A, který popsal Morein a další /Nátuře 308:457 (1984)/. Zejména přednostní jsou proteinové nosičové molekuly, které zahrnují, ale neomezují se na savčí sérum proteinů, jako je hemokyanin z organismů rodu Fissurellidae, lidský nebo hovězí gammaglobulin, lidský, hovězí nebo králičí sérový albumin nebo methylované nebo jiné deriváty těchto proteinů. Odborníci v oboru samozřejmě znají i jiné proteinové nosiče. Přednostně, ale nikoliv nezbytně, je proteinový nosič cizí pro zvířecího hostitele, u kterého se má vyvolat tvorba protilátek proti proteinům z buněk rodu Eimeria.

Kovalentní připojení k nosičové molekule se může provádět způsoby dobře známými v oboru, jejich přesná volba je určena povahou použité nosičové molekuly. Když je imunogenní nosičovou molekulou protein, mohou se proteiny nebo fragmenty proteinů podle vynálezu připojit např. s použitím karbodiimidů rozpustných ve vodě, jako je dicyklohexylkarbodiimid nebo glutaraldehyd.

Připojovací činidla tohoto typu se také mohou použít pro zesíťování samotných proteinů a proteinových fragmentů bez použití separátní nosičové molekuly. Toto zesíťování, kterým vzniknou agregáty proteinu nebo proteinových fragmentů, může také zvýšit imunogenitu.

Podávání účinného množství vakcín podle vynálezu může chránit proti kokcidióze např. způsobené infekcí druhem E. tenella nebo infekcí jinými druhy rodu Eimeria. Monoklonální protilátky proti antigenům zE. tenella křížově reagují in vitro s antigeny zE. acervulina a E. maxima. Přednostním subjektem je drůbež, např. kuřata, ale jiné subjekty také spadají do rozsahu tohoto vynálezu. V souladu s tímto vynálezem se může použít jakékoliv účinné množství vakcíny. Účinné množství se může určit rutinními experimenty pomocí metod, popsaných dále v textu. Účinné množství polypeptidů a jejich fragmentů podle vynálezu, které se pohybuje v rozmezí od asi 5 do asi 50 mikrogramů/kg tělesné hmotnosti subjektu, kterému se dává vakcína, je přednostní. Zvláště přednostní je dávka okolo 25 až 50 pg/kg. Přednostně po prvním podávání vakcíny následuje opakované podávání vakcíny, provedené o jeden nebo několik týdnů později. Vakcína se může podávat mnohokrát za sebou. Dávky při tomto opakovaném podávání se obvykle pohybují v rozmezí od asi 5 do 50 pg/kg, přednostně asi od 20 do 50 pg/kg. Mohou se použít standardní způsoby podávání, jako je podkožní, intradermální, intramuskulámí, orální, anální nebo in ovo podávání (přímá injekce do embryí). Jednoduché nebo mnohonásobně opakované podávání vakcín může být provázeno indukovanou nevýznamnou infekcí kokcidiózy, která může zvýšit ochranu.

Podávání kokcidiózových antigenů podle vynálezu do imunitních systémů subjektů, např. drůbeže, se může také provádět pomocí klonujících genů, kódujících antigeny v bakteriích (např. u E. coli nebo u rodu Salmonella) nebo ve virech (např. v poxvirech nebo herpesvirech) a podáváním živého vektorového systému nebo, je-li to vhodné, jako inaktivované formy subjektům orálně, injekčně nebo jiným obecně známým způsobem. Carbit a další /ve Vaccines (Vakcíny), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory, str. 68-71/ popsal užití buněk E. coli, zatímco Clements /Pathol. Immunopathol. Res. 6:137 (1987)/ popsal použití buněk rodu Salmonella. Moss a další /Ann. Rev. Immunol. 5:305 (1987)/ udělali přehled použití virových vektorových systémů, které využívají rekombinantního poxviru.

Jeden druh poxviru, vakcinia virus, se může použít k testování dodání kokcidiozových antigenů v buněčné kultuře a ve zvířatech. Virus diftérie drůbeže je další poxvirový nosič, který se může použít pro převedení tohoto vynálezu. Zjistilo se, že pro analytické studie je praktičtější použít vakcinia virus než virus drůbeží diftérie. To je způsobeno tím, že vakcinia virus se množí rychleji než ptačí virus a jeho hostiteli nemusí být pouze ptačí buňky. Do genomu vakcinia viru se mohou vložit velká množství heterologní DNA bez inhibičního účinku na zrání viru a jeho infekčnost

- 13CZ 285116 B6 /Smith a další, Gene 25:21 (1983)/. Zmnožené heterologní geny vložené do tohoto viru se exprimují v infikovaných zvířatech a vyvolají tvorbu protilátek /Perkus a další, Science 229:981 (1985)/.

Způsoby používané pro tvorbu rekombinantních vakcinia virů se mohou snadno přizpůsobit rutinním postupům pro systémy virů drůbeží diftérie a herpesvirů. Rekombinantní virus, obsahující DNA s nukleotidovou sekvencí kódující protein podle tohoto vynálezu, se může připravit:

a) vložením DNA s nukleotidovou sekvencí kódující uvedený protein do genomu viru bez inhibování zrání a infekčnosti viru;

b) amplifikací uvedeného rekombinantního viru v buněčné kultuře; a

c) vyčištěním rekombinantního viru z kultury.

Použití rekombinantních virů jako nosičů ve vakcínách proti kokcidióze je zvláště výhodné proto, že drůbež si vyvine imunitu jak proti kokeidlóžovému antigenu, tak proti virovému nosiči (tj. takové vakcíny jsou bivalentní). Užitečnost takových vakcín se může dále zvýšit vložením přídavných genů do nosičového viru. Například do viru drůbeží diftérie se může společně s genem pro kokcidiózový antigen vložit virový genom Newcastle nemoci. Tak se může jednoduchou vakcínou způsobit imunita k Newcastle nemoci, kokcidióze a drůbeží diftérii.

Podávání vakcín se živými vektory podle tohoto vynálezu se může provádět početnými způsoby, známými v oboru. Například se může použít bodací (stick) metoda obvykle užívaná pro podávání vakcín proti virům drůbeží diftérie. Tato metoda spočívá v bodnutí nebo napíchnutí kůže tkáně křídla ostrou jehlou namočenou ve vakcíně. Tato jehla má obvykle blízko špičky očko jako jehla šicího stroje, které nese kapku vakcíny. Alternativně se mohou živé vakcíny aplikovat injekčně podkožně nebo intradermálně do tkáně křídla nebo jakéhokoliv jiného místa.

Rekombinantní vakcíny s živým vektorem se také mohou přidávat do pitné vody nebo dokonce se mohou sprejově stříkat na subjekty, kterým se mají podávat vakcíny, jako jsou např. kuřata. Vakcíny se také mohou podávat v krmivu, přednostně po ochranném obalení /Balancou a další, Nátuře 322:373 (1986)/ nebo in ovo. Při in ovo podávání se virové vakcíny injekčně aplikují přímo do embryí, zejména kuřecích embryí /Sharma, Avian Dis. 25:1155 (1985)/.

Pokud není uvedeno jinak, procenta udávaná dále v textu pro tuhé látky v tuhých směsích jsou hmotnostní, pro kapaliny v kapalných směsích jsou objemová a údaje pro tuhé látky v kapalinách jsou uváděny v g/1. Dále, pokud není uvedeno jinak, použití konkrétních reagencií a přístrojů, které je dále v textu uvedeno, není zamýšleno jako povinné. Odborník si může vybrat podobné reagencie nebo přístroje od jiných dodavatelů.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Čištění merozoových buněk

Merozoové buňky E. tenella se získají zcéka 50 infikovaných kuřat (3 týdny starých Hubbard Cross; Avian Services, Frenchtown, NJ, USA) po 5 dnech od infikování dávkou 50 000 dříve sporulovaných oocyst na kuře. Mohou se použít podobná kuřata z jiných zdrojů. Céka se odstraní a promývají se fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátovým pufrem (PBS) po dobu 15 minut

- 14CZ 285116 B6 za míchání magnetickým míchadlem. Zbytky epithelu se odstraní odstředěním při pomalé rychlosti (50 x g) a surové merozoové buňky se získají odstředěním při 2000 g, po dobu 10 min, při teplotě 4 °C. Peleta se resuspenduje v lyzovacím pufru (o složení: 8,29 g/1 NH4CI, 0,372 g/1 Na₂EDTA, 1,0 g/1 KHCO3; o pH 7,6) a inkubuje se v ledové lázni 30 minut. Merozoové buňky se shromáždí odstředěním, jednou se promyjí PBS a nechají se projít kolonou, obsahující 1,0 g předených nylonových vláken (výrobce Scrub Nylon Fiber, Fenwall Laboratories, Deerfíeld, IL), v separační nálevce. Merozoové buňky se shromáždí odstředěním za stejných podmínek jako v předchozím případě a zmrazí se suchým ledem pro izolaci RNA nebo pro další čištění v diethylaminoethylcelulóze (DEAE, Whatman DE52, Whatman Bio Systems, lne., Clifton, NJ, USA) pro Western blot analýzu.

Pro čištění v DEAE celulóze se na kolonu s mrtvým objemem 10 ml nanese přibližně 1 x 10⁹ merozoových buněk v PBS roztoku a eluuje se roztokem PBS. Merozoové buňky se získají v prvních 100 ml eluátu, v zásadě zbavené červených krvinek a jiných buněčných zbytků.

Imunoprecipitace povrchových proteinů, značených ¹²⁵I

Povrchové proteiny vyčištěných merozoových buněk se označí ¹²’I metodou IODOGEN^(R) (Pierce Chemical Co.) nebo se použiji IODOBEADS^(R) (jodokuličky) (Pierce Chemical Co.). Při způsobu využívajícím IODOBEADS se 4 IODOBEADS třikrát promyjí roztokem fosforečnanu sodného o koncentraci 0,2 M a pH 7,5, přidá se ¹²⁵I-Na a směs se 5 minut inkubuje při teplotě místnosti. Do reakční ampule se přidají vyčištěné merozoové buňky (v množství 3 x 10⁸ buněk) ve 200 ml PBS o pH 7,0 a pokračuje se v inkubaci po dobu 15 minut. Na konci inkubace se přidá fenylmethansulfonylchlorid (PMSF) tak, aby jeho konečná koncentrace byla 5 mM.

Značené merozoové buňky se získají z inkubační směsi odstředěním při 12 000 g po dobu 30 s a solubilizací v 1 ml buď roztoku dodecylsulfátu sodného (SDS) o koncentraci 20 g/1 nebo v l%ním Tritonu X-100, v PBS o pH 7,0. Nerozpustný materiál se odstraní odstředěním při 12 000 g po dobu 3 minut. Solubilizované proteiny se dialyzují proti 3 1 PBS o pH 7,0 při teplotě 4 °C, s použitím membrány s dělicím rozhraním molekulové hmotnosti 3500, aby se odstranil všechen zbylý volný ¹²⁵I. Proteiny značené ^l25I (typicky je do proteinu inkorporováno množství asi 1,5 x 10⁸ cpm ^l25I) se skladují před použitím při teplotě 4 °C. TCA precipitovatelná radioaktivita je obvykle vyšší než 95 %, vztaženo na celkovou radioaktivitu.

Králičí antisérum proti merozoovým buňkám, fixovaným glutaraldehydem, se připraví následujícím postupem:

Přibližně 1 x 10⁹ vyčištěných merozoových buněk se suspenduje v roztoku glutaraldehydu v PBS o koncentraci 1 % a inkubuje se 5 min při teplotě místnosti. Fixované parazitické buňky se sklidí odstředěním při 2000 g, 5 min, třikrát se promyjí PBS a resuspendují v 1 ml PBS. Novozélandští bílí králíci dostanou několikanásobné intradermální injekce do kůže na zádech s celkovým množstvím 5,0 ml roztoku s fixovaným parazitickým proteinem, emulgovaného v 0,5 ml kompletního Freundova adjuvantu. Králíci dostanou dvě opakované injekce, obsahující stejný parazitický protein v nekompletním Freundově adjuvantu, v intervalu dvou týdnů. Krev se získá z ušní žíly dva týdny po poslední injekci a sérum obsahující protilátky se získá odstředěním koagulovaných krevních vzorků při 2500 g po dobu 15 minut.

Vzorky značených proteinů pro imunoprecipitaci (o objemu 5 ml, obsahující 5 x 10⁵ cpm ¹²⁵I) se zředí do 100 ml IP pufru (o složení: 0,25 % NP-40, 20 mM Tris-HCl o pH 7,5, 0,15 M NaCl), předčistí se inkubací v ledové lázni s 5 mg StapH-A proteinu (výrobce Pansorbin, Calbiochem Corp., San Diego, CA) po dobu 20 minut. Potom se vzorky inkubují několik hodin s 5 až 10 ml králičího anti-merozoového séra, při teplotě 4 °C. Komplexy protilátek se shromáždí druhou

- 15 CZ 285116 B6 inkubací s 5 mg StapH-A proteinu v ledové lázni, 20 min a odstředěním v Eppendorfově centrifugační zkumavce po dobu 15 s. Pelety se 4krát promyjí IP pufrem a značené proteiny imunoprecipitované protilátkami se eluují z komplexu zahříváním při 100 °C, po dobu 5 min, v SDS gelovém pufru se vzorkem (složení SDS gelového pufru: 65 mM Tris o pH 6,8, 0,5 % SDS, 5 % β-merkaptoethanolu, 10 % glycerolu, 0,1 % bromfenolové modři). SDS elektroforéza v polyakrylamidovém gelu (SDS PAGE) se provádí způsobem, který popsal Laemmli /Nátuře 227:680(1970)/.

Výsledky získané pomocí králičího antiséra se potvrdí použitím imunitního kuřecího séra, které se připraví následujícím způsobem:

Kuřata se imunizují opakovanou injekcí s živými sporulovanými oocystami E. tenella (množství 100 000 oocyst podané třikrát v intervalu dvou týdnů). Krev se sklidí srdeční punkcí a sérum obsahující protilátky se oddělí od koagulovaných buněčných zbytků následným odstředěním při 2500 g po dobu 5 minut.

Provedou se srovnávací studie, při nichž se jak anti-merozoové králičí sérum, tak imunitní kuřecí sérum použijí pro imunoprecipitaci povrchových merozoových proteinů rodu Eimeria značených ^12:>I a produktů in vitro translace poly(A)-obsahující merozoové RNA. Precipitované proteiny se podrobí analýze na SDS PAGE a vizualizují se fluorograficky s použitím standardních fluorografických postupů a reagencií.

Tyto studie ukazují, že mnoho proteinů z obou zdrojů se precipituje pomocí obou sér. Takže pro testování genetických rekombinantů, které se exprimují jako proteiny rodu Eimeria, se mohou použít obě séra. Králičí anti-merozoové sérum se pro testování, popsané dále v textu, použije dříve pro svou výhodnost. Avšak sérum imunních kuřat se použije při paralelním testování cDNA knihovny, popsané dále v textu. To je zásadní pro identifikaci proteinů, pravděpodobně důležitých v imunitní odpovědi na infekční organismus, protože jenom kuřecí sérum se získá jako odpověď na provokační infekci živými organismy. Pouze imunizovaná kuřata jsou prokazatelně odolná k takovým organismům.

Aby se zvýšila specifita králičího anti-merozoového séra pro proteiny z buněk rodu Eimeria, provede se v séru výběr protilátek podle obecného návodu, který popsal Halí a další /Nátuře 311:379 (1984)/. Stručně řečeno se protilátky specifické pro proteinový prekurzor exprimovaný rekombinantním fágovým klonem (viz dále v textu) čistí z králičího antimerozoového séra následujícím způsobem.

Pozitivní fág se hustě naočkuje na misku a pěstuje se 3,5 hodiny při teplotě 42 °C. Exprese fúzovaného proteinu se vyvolá převrstvením misky nitrocelulózovým filtračním materiálem nasyceným roztokem isopropylthiogalaktosidu (IPTG) o koncentraci 10 mM. V inkubaci se pokračuje dalších 6 až 8 hodin, při teplotě 37 °C. Filtrační materiál napuštěný antigenem se promyje v roztoku TBS (o složení: 20 mM Tris-HCl o pH 8,0, 150 mM NaCl) a inkubuje se po 8 až 10 hodin, při teplotě 4 °C s přebytkem antimerozoového séra, preadsorbovaným pomocí hostitelských bakterií E. coli. Filtrační materiál se třikrát promyje roztokem TBS, aby se odstranily nespecifické protilátky.

Protilátky, specificky navázané na fúzovaný protein na filtračním materiálu, se eluují 2,0 ml glycinu o koncentraci 0,1 M v roztoku NaCl o koncentraci 0,15 M o pH 2,6 (15 min, při teplotě 20 C). Eluované protilátky se ihned neutralizují stejným objemem roztoku Tris-HCl o koncentraci 0,1 M a pH 8,0. Vybrané protilátky (zde uváděné jako antigenem vybrané protilátky) se potom použijí při imunoprecipitaci povrchově značených merozoových buněk nebo in vitro translačních produktů nebo jako próby při Western blot analýza celého

- 16CZ 285116 B6 merozoového proteinu. Kontrolní séra se připraví s použitím rekombinantního fágu antigenselektivním postupem.

Výsledky Western blot a imunoprecipitačních analýz s použitím antigen-selektivních protilátek ukazuje obr. 2. Produkty imunoprecipitace značených proteinů se vizualizují fluorograficky způsobem, který popsal Bonner a další /Eur. J. Biochem. 46:83 (1974)/. Čísla vpravo od obrázku ukazují umístění markerových proteinů o molekulové hmotnosti, udané v kilodaltonech.

Okénko A na obr. 2 ukazuje imunoblot celkových merozoových proteinů testovaný próbou v podobě kontroly (a) nebo antigenem vybraných protilátek (b). Okénko B ukazuje povrchové merozoové proteiny značené ^12oI imunoprecipitované s kontrolou (a) nebo antigenem vybranými protilátkami (b).

Izolace a in vitro translace merozoové mRNA

Zmrazené merozoové pelety obsahující 1 x 109 až 1 x 10¹⁰ organismů se nechají roztát v 10 ml TEL/SDS pufru (o složení: 0,2 M Tris-HCl, 0,1 MLiCl, 25 mM EDTA, 10 g/1 dodecylsulfát sodný (SDS), pH 8,8), který obsahuje 1 mM dithiothreitolu (DTT) a 300 jednotek RNasin (Promega Biotec, Madison, WI) a homogenizují se 10 až 12 údery v tkáňovém homogenizátoru pokrytém teflonem. Nerozpustné buněčné zbytky se odstraní odstředěním za chladu, při 3000 g. Supematant se dvakrát extrahuje směsí fenol:chloroform:isoamylalkohol (24:24:1, objemové díly), uvedenou do rovnovážného stavu TEL pufrem.

Vodná fáze se štěpí 30 minut proteinasou Ko koncentraci lOOmg/ml při teplotě 37 °C a reextrahuje se stejným objemem směsi fenokchloroform (1:1). Nukleová kyselina se sráží 1 hodinu dvěma objemy ethanolu v suchém ledu nebo přes noc při teplotě -20 °C. Peleta, po odstředění 1 hodinu při 10 000 g, se resuspenduje v TE (o složení: 10 mM Tris-HCl o pH 7,5, 2 mM EDTA) a zvlákňuje se přes clonu z 4 ml chloridu česného (5,7 M CsCl, 0,1 M EDTA) při 150 000 g, 20 hodin, při teplotě 15 °C. Peleta RNA se znovu vysráží z roztoku octanu draselného, o koncentraci 0,2 M, 2,5 objemy ethanolu. Toto celkové množství RNA se nechá projít jednou přes oligo-dT celulózu, aby se zvýšil obsah poly(A)⁺ RNA, jak popsal Maniatis, viz výše v textu, str. 197. Obvyklý výtěžek 1,9 mg celkové RNA z 5 x 10⁹ merozoových buněk obsahuje přibližně 20 pg poly(A)⁺ RNA.

K naprogramování in vitro syntézy proteinu v lyzátu králičích retikulocytů ošetřených nukleasou (Amersham Corp., Arlington Heights, IL, USA nebo Promega Biotec) s přídavkem methioninu, značeného ³⁵S v množství 10-20 mCi na 20 ml reakční směsi, se použije množství mRNA pohybující se mezi 0,1 a 0,5 pg. In vitro translační produkty se analyzují imunoprecipitací a dále SDS PAGE a vizualizují se fluorograficky, jak je popsáno výše. Výsledky ukazuje obr. 2, okénko C.

Pruh C v okénku C ukazuje kompletní směs produktů, programovaných merozoovou poly(A)obsahující RNA. Pruhy b, a a d ukazují translační produkty imunoprecipitované protilátkami vybranými pomocí rekombinantního fágového klonu označeného lambda 5-7 (viz dále v textu; tento klon exprimuje gen, kódující proteinový prekurzor buněk rodu Eimeria o velikosti 33 kilodaltonů) (pruh b), pomocí dalšího fágového klonu reagujícího s antimerozoovým sérem (pruh a) a pomocí nerekombinantního lambda gtl 1 klonu (pruh d).

Je třeba poznamenat, že hlavní protein o molekulové hmotnosti okolo 33 kilodaltonů se může sledovat v pruzích a a b, obr. 2, okénko C. Tento protein není přítomen v pruhu obsahujícím celkové množství merozoových proteinů testovaných próbou v podobě antigenem vybraných protilátek (okénko A, pruh b), ale v tomto gelu (okénko A, pruh b, označeno šipkou) se může

- 17CZ 285116 B6 sledovat pás o hmotnosti 23 kilodaltonů. Protein o hmotnosti 23 kilodaltonů se také imunoprecipituje antigenově vybranými protilátkami z merozoových proteinů značených ¹²⁵I, jak je ukázáno na obr. 2, okénko B, pruh b. Z těchto pozorování dohromady vzniká předpoklad, že z prekurzorového proteinu o hmotnosti 33 kilodaltonů se proteolytickým štěpením ve zralých merozoových buňkách vytváří povrchový antigen o hmotnosti 23 kilodaltonů.

Příprava knihovny pro expresi merozoové cDNA

Dvouvláknová cDNA se syntetizuje z 6 pg merozoové poly(A)⁺ RNA, jak popsal Gubler a další, Gene 25:263 (1983), s použitím reversní transkriptasy (BRL, Gaithersburg, MD, USA) pro prodloužení z oligo(dT) primeru a RNasy H (BRL) a DNA polymerasy I z E. coli (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) pro syntézu komplementárního vlákna. Dvouvláknová cDNA se potom opatří tupými konci pomocí T4 DNA polymerasy (BRL). Po působení EcoRI methylasy (New England Biolabs) se přidají Eco RI linkery (složení GGAATTCC, výrobce Collaborative Research lne., Bedford, MA, USA) podle předpisu výrobce.

Po štěpení pomocí EcoRI se části cDNA frakcionují v přípravku Biogel A-50M, aby se odstranil přebytek linkerových molekul a části cDNA menší než přibližně 300 bp, jak popsal Huynh a další, viz dále v textu. cDNA se potom zkoncentruje vysrážením ethanolem.

Knihovna se připraví ve fágu gtl 1 (výrobce Stratagene Cloning Systems, San Diego, CA), jak popsal Huynh a další v D. Glover (ed.), DNA Cloning Vol. I: A Practical Approach (Klonování DNA, sv. I: Praktický přístup), 1985, IRL Press, Washington, D.C., USA, str. 49 až 78. EcoRI cDNA fragmenty se ligací spojí s defosforylovanými ramínky gtl 1, rozštěpenými pomocí EcoRI (Stratagene Cloning Systems). Výsledná DNA se zabalí do fágu pomocí Gigapack soupravy (Stratagene Cloning Systems) podle předpisu výrobce.

Výsledná knihovna se amplifikuje naočkováním na misku sY 1088 hostitelskými buňkami. Počet procent rekombinantů, odhadnutý z poměru modrých k bezbarvým plakům na miskách s X-gal médiem (Maniatis, viz výše v textu, str. 24) v přítomnosti isopropylthiogalaktosidu (IPTG, Sigma Chemicals Co.), je asi 90 %.

Imunologické testování cDNA knihovny

Knihovna pro expresi merozoové cDNA ve fágu gtl 1 se naočkuje na misky s buňkami Y 1090 s hustotou asi 10 000 plaků na misku o průměru 150 mm. Šest takových misek se inkubuje 3,5 hodiny při teplotě 42 °C, překryje se nitrocelulózovým filtračním materiálem předem máčeným v IPTG o koncentraci 10 mM, aby se indukovala exprese β-galaktosidasového fúzovaného proteinu. Misky se dále inkubují 4 až 5 hodin až přes noc, při teplotě 37 °C. Filtrační materiál se z misek odstraní a několikrát se vsádkově promyje roztokem TBS (o složení: 20 mM Tris HC1 o pH 8,0, 0,15 mMNaCI). Nespecifická vazná místa proteinu se zablokují inkubací v 20%ním fetálním telecím séru (FCS) v TBS po 1 hodinu, při teplotě místnosti.

Filtrační materiál se potom inkubuje 1 hodinu s buňkami Y 1090, na kterých je předem naadsorbované králičí anti-merozoové sérum, při zředění 1:100 v TBS, obsahujícím 20% telecího séra. Nespecifické protilátky se odstraní následným promýváním TBS, přičemž jeden promývací roztok TBS obsahuje 0,1 % NP-40. Filtrační materiál se inkubuje s kozím antikráličím peroxidasovým konjugátem (BioRad, Richmond, CA), při zředění 1:1000 v TBS s telecím sérem, 1 hodinu, při teplotě místnosti. Podle pokynů výrobce se vyvine barevná reakce s 4-chlor-l-naftolem (BioRad).

- 18CZ 285116 B6

Pro testování se také použije sérum z imunních kuřat. Toto sérum se nejprve adsorbuje na buňky Y 1090 a použije se ve stejném zředění jako králičí sérum. Králičí anti-kuřecí protilátka se použije jako sekundární protilátka a kozí antikráličí křen-peroxidasový konjugát se použije jako detekční protilátka. Jednotlivé plaky se izolují při sekundárním testování s použitím stejných reagencií.

Jeden klon, označený lambda 5-7, produkuje protein silně reaktivní s protilátkami z králičího séra. Druhý izolát 1-5 se identifikuje testováním s imunitním kuřecím sérem a dokáže se, že obsahuje cDNA inzert stejné velikosti jako 5-7 klon. DNA sekvenční analýza ukazuje, že tyto fágové klony kódují stejný merozoový protein.

Exprese cDNA z fágu lambda 5-7 v E. coli

Inzert z fágu lambda 5-7 o velikosti 1,2 kb se izoluje štěpením pomocí EcoRI a elektroforézou vagarosovém gelu (Maniatis a další, viz výše v textu, str. 157-170). Konce, vzniklé štěpením pomocí EcoRI se opraví účinkem Klenowovy polymerasy v přítomnosti dATP a dTTP. Na oba konce se ligací připojí BamHI linkery (GGGATCCC). Do každého ze tří expresních vektorů pDS56/RBSII, pDS56/RBSII,-l a pDS56/RBSII,-2 se na BamHI místě vloží tento modifikovaný fragment. Plazmidy, obsahující inzerty v obou možných orientacích, se transformují, jak popsal Mandel a další /J. Mol. Biol. 53:159 (1970)/ do buněk E. coli kmen Ml5, které nesou kompatibilní plazmid pDMI.l. E. coli kmen Ml5, nesoucí plazmidy pDS56/ RBSII a pDMI.l, je popsaný v Evropské patentové přihlášce č. 316 695.

Konstrukce plazmidu

Obecně plazmidy pDS56/RBSII,-l a -2 obsahují regulovatelný promotor/operátorový element N25OPSN25OP29 a po řadě ribosomová vazná místa RBSII, RBSII(-l) a RBSII(-2). Tato ribosomová vazná místa se odvozují od ribosomových vazných míst promotoru P_G25 fágu T5 buněk E. coli (Evropská patentová přihláška č. 207 459) a získají se syntézou DNA.

Vzhledem ke své vysoké účinnosti se výše uvedené plazmidy mohou uchovávat v buňkách E. coli jenom v případě, že promotor/operátorový element se reprimuje navázáním lac represoru na operátor. Lac represor je kódován láci genem. Element N25OPSN25OP29 může být účinně reprimován jenom, když je v buňkách přítomen dostatečný počet represorových molekul. Proto se použije lacl^q alela, která obsahuje mutant promotoru, odpovědný za zvýšenou expresi represorového genu. Tato lacl^q alela je přítomná na plazmidu pDMI.l, jak je popsáno dále v textu.

Plazmid pDMI.l nese, kromě láci genu, gen pro neomycinfosfotransferasu, který bakteriím poskytuje rezistenci ke kanamycinu a který se používá jako selekční markér. Plazmid pDMI.l je kompatibilní s pDS56/RBSII,-l a -2 plazmidy. E coli buňky, které jsou transformovány expresními vektory pDS56/RBSII,-l a -2 musí obsahovat pDMI.l plazmid, aby se zaručilo, že expresní vektor zůstane v buňkách stabilní. Indukce tohoto systému se docílí přídavkem IPTG do média.

Plazmid pDS56/RBSII

Část plazmidu pDS56/RBSII, která leží mezi restrikčními místy pro enzymy Xbal a Xhol a která obsahuje replikační oblast a gen pro β-laktamasu (který buňkám udílí rezistenci k ampicilinu) (obr. 4 a 5), se odvozuje původně od plazmidu pBR322 /Bolivar a další, Gene 2:95-113 (1977);

- 19CZ 285116 B6

Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 43:77-90 (1979)/. Avšak gen pro β-laktamasu je modifikovaný eliminací míst pro štěpení pomocí restrikčních enzymů HincII a Pstl. Tyto změny v sekvenci DNA nemají žádný vliv na aminokyselinovou sekvenci β-laktamasy. Zbývající část plazmidu nese regulovatelný promotor/operátorový element N25OPSOP29, dále následuje ribosomové vazné místo RBSII, které je částí EcoRI/BamHI fragmentu, místa štěpení pro restrikční enzymy Sall, Pstl a HindlII, terminátor fágu lambda buněk E. coli /Schwarz a další, Nátuře 272:410-414 (1978)/, gen bez promotoru pro chloramfenikolacetyltransferasu /Marcoli a další, FEBS Letters, 110:11-14 (1980)/ a terminátor TI rmB operonu E. coli /Brosius a další, J. Mol. Biol. 148:107-127 (1981)/.

Plazmid pDS56/BRSII(-l)

Plazmid pDS56/RBSII(-l) (obr. 6 a 7) je podobný plazmidu pDS56/RBSII, ale obsahuje ribosomové vazné místo RBSII(-1).

Plazmid pDS56/RBSII(-2)

Plazmid pDS56/RBSII(-2) (obr. 8 a 9) je podobný plazmidu pDS56/RBSII, ale obsahuje ribosomové vazné místo RBSII(-2).

Rozdíl mezi těmito třemi plazmidy spočívá v tom, že se liší jedním nukleotidem, který následuje za ATG startovacím kodónem, jenž začíná expresi proteinu podle všech tří možných čtecích rámců.

Plazmid pDMI.l

Plazmid pDMI.l (obr. 10 a 11) nese gen pro neomycinfosfotransferasu z transpozónu Tn5 /Beck a další, Gene 19:327-336 (1982)/, který dodává kanamycinovou rezistenci buňkám E. coli a láci gen /Farabough, Nátuře 274:765-769 (1978)/ s mutovaným promotorem I^q /Calos, Nátuře 274:762-765 (1978)/, který kóduje lac represor. Kromě toho plazmid pDMI.l obsahuje oblast plazmidu pACYC184 /Chang a Cohen, J. Bacteriol. 134:1141-1156 (1978)/, která obsahuje celou informaci požadovanou pro replikaci a stabilní transmisi dceřinných buněk.

Mělo by být zřejmé, že kromě výše uvedeného plazmidu se pravděpodobně v tomto pokusu může použít jakýkoliv expresní systém buněk E. coli.

Bakteriální transformanty se pěstují při teplotě 37 °C v LB médiu (viz Maniatis a další, výše v textu, str. 68) a exprese proteinu se indukuje přídavkem lmM IPTG do média. Po hodinové inkubaci se odeberou vzorky o objemu 1 ml a buňky ve vzorcích se shromáždí odstředěním. Na buněčné pelety se působí tak, jak popsal Crowl a další, viz výše v textu, a lyzáty se analyzují pomocí SDS PAGE. Po elektroforéze se proteiny v gelu buď obarví modří Coomassie brilliant blue nebo se převedou na nitrocelulózové membrány pro Western blot analýzu /Towbin a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 76:4350 (1979); Bumetti, Anal. Biochem. 112:195 (1981)/, která se provádí s použitím králičího antimerozoového séra, popsaného výše.

Uvedená analýza ukazuje, že molekula cDNA, o velikosti 1,2 kb, kóduje v jedné své orientaci ve všech třech čtecích rámcích protein, který migruje při analýze SDS PAGE jako protein o molekulové hmotnosti asi 33 kilodaltonů a že tento protein reaguje s protilátkami z králičího anti-merozoového séra.

-20CZ 285116 B6

Analýza sekvence DNA

Obecně se izolace plazmidové DNA v malém měřítku z 1 ml kultur saturovaných přes noc provádí podle postupu, který popsal Bimboim a další /Nucleic Acids Research 7:1513 (1979)/. Tento postup umožňuje izolaci malého množství DNA z bakteriální kolonie pro analytické účely. Větší množství plazmidové DNA se připraví s použitím kultur o objemu 1 1 podle standardního postupu odstředěním a za působení gradientu chloridu česného (Maniatis a další, viz výše, str. 93).

DNA sekvence EcoRI cDNA inzertu o velikosti 1,2 kb zplazmidu lambda 5-7 se stanoví následujícím postupem. Inzert se štěpí pomocí EcoRI, čistí se gelovou elektroforézou a ligací se spojí spEV-vrf plazmidem, který byl štěpen EcoRI, jak popsal Crowl a další /Gene 38:31 (1985)/. Tento plazmid se pojmenuje pEV/5-7 a použije se k propagaci inzertu cDNA o velikosti 1,2 kb pro hybridizační analýzu (jak je popsáno dále) a pro předběžnou analýzu sekvence DNA způsobem, který popsal Zagursky a další /Gene Anal. Těch. 2:89 (1983)/.

Pro určení kompletní sekvence DNA se cDNA inzert o velikosti 1,2 kb z pEV/5-7 dále klonuje do jednovláknového fágového vektoru M13 mpl9 pomocí M13 klonovací soupravy firmy BIORAD a sekvenovací soupravy SEQUENASE. Sekvence se určí dideoxy řetězovou metodou podle Sangera a dalších /Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74:5463 (1977)/ způsobem, který se doporučuje v soupravě SEQUENASE (United States Biochemical Corp., Cleveland OH, USA).

Kompletní nukleotidovou sekvenci cDNA o velikosti 1,2 kb z pEV/5-7 včetně 5' a 3' nepřeložených oblastí ukazuje obr. 1.

Tato cDNA sekvence předurčuje otevřený čtecí rámec začínající od ATG kodónu na místě 68 až k TGA stop kodónu na místě 1013 a kóduje 315 aminokyselinových zbytků, jak ukazuje obr. 1.

Teoretická velikost pro tento protein, 33 375 daltonů, odpovídá imunoprecipitačnímu produktu z in vitro translace merozoové mRNA (viz obr. 2, okénko C, pruh a), získanému imunoprecipitací antigen-selektivního reagentu a proteinu exprimovanému z cDNA v expresních vektorech buněk E. coli, popsaných výše v textu.

Analýza odvozené sekvence aminokyselin proteinu, který je kódován lambda 5-7 cDNA inzertem, ukazuje, že v závislosti na algoritmu použitém pro předurčení sekvence má prvních 20 nebo 75 až 95 aminokyselinových zbytků na N-konci celkově hydrofobní charakter, což ukazuje na možnou funkci signálního peptidu. Sekvence signálního peptidu se tedy může skládat až z asi prvních sto aminokyselinových zbytků na N-konci. Toto se zřetelem na skutečnost, že se zjistilo, že polypeptid získaný po in vitro translaci merozoové mRNA čištěný imunoprecipitací má molekulovou hmotnost okolo 35 kDa ve své prekurzorové formě a že ve zralé podobě má tento polypeptid molekulovou hmotnost okolo 23 kDa. Jak je uvedeno výše, velikost prekurzorové formy jev dobrém souhlasu s teoretickou velikostí proteinu. Avšak zralá podoba proteinu může také obsahovat vnitřní nebo N-koncový fragment prekurzorové molekuly. Přesný N-konec se může určit známými způsoby.

Pro řadu oblastí tohoto polypeptidu s uvedenou aminokyselinovou sekvencí se mohou označit epitopy založené na kombinaci hydrofilních kritérií podle J. P. Hoppa a K. R. Woodse /Proč. Nati. Acad. Sci. USA 78:3824-3828 (1981)/ a kritérií sekundární struktury podle P. Y. Choua a G. D. Fasmana /Advances in Enzymology 47:45-148 (1987)/.

Následující oblasti obsahují pravděpodobné epitopy pro protilátky:

S79 - V₈₆ (Sekv. id. č. 3) C95 - K123 (Sekv. id. č. 4)

-21 CZ 285116 B6

Pj37- V_I39 (Sekv. id. č. 5) R147 - F]52 (Sekv. id. č. 6) N155- E₁₆₂ (Sekv. id. č. 7) R169 - E]₇₃ (Sekv. id. č. 8) T_18l - E₁₈₆ (Sekv. id. č. 9) Q196 - θ225 (Sekv. id. č. 10) T₂₃₉ - G₂₄₃ (Sekv. id. č. 11) T₂₅₂ - G₂56 (Sekv. id. č. 12) A₂65 - K-269 (Sekv. id. č. 13) D₂76 - K-289 (Sekv. id. č. 14) T₂₉₈ - E₃₁₅ (Sekv. id. č. 15)

Dále, epitopy T-buněk se mohou teoreticky odvodit podle Berzofského amfifilního kritéria /Good a další, Science 235, 1059-1062 (1987)/. Epitopy T-buněk se odvozují od antigenů ZH. M. Grey a R. Chestnut, Immunol. Today 6:101—106 (1985)/, transportují intracelulámě /Schwartz A. L., Ann. Rev. Immun. 8:195-229 (1990)/ a rozpoznávají se receptorovým komplexem T-buněk. Ačkoliv některé algoritmy se vytvářejí primárně k identifikaci antigenových míst třídy II, kvůli podobnostem s peptidovými interakcemi třídy I, se také zdají být užitečné pro identifikaci cílových míst peptidů pro cytotoxické T-lymfocyty /Feller a de la Cruz, Nátuře 349:720-721 (1991)/.

Dále, možné glykosylační místo je umístěno na aminokyselině asparaginu na místě 20 (D₂o). Cukerné skupiny jsou známé tím, že mají důležité fyzikální vlastnosti, jako je konformační stabilita, odolnost k proteasam, náboj a kapacita pro vázání vody. Avšak D₂₀ je částí vedoucí sekvence a nemusí proto být přítomná ve zralém proteinu. Přehled důležitých rolí cukerných skupin v biologickém rozpoznávání uvádí J. C. Paulson, TIBS 14:272-276 (1989).

Hybridizační analýza

DNA se izoluje z rozbitých sporulovaných oocystových buněk pro působení trypsinu a žluči a promytí roztokem PBS následujícím způsobem.

Parazitický materiál (přibližně 1 x 10⁹ oocystových buněk) se suspenduje ve 20 ml roztoku obsahujícího 0,5 M EDTA o pH 8,0 a 0,5 % sarkosylu (Sigma, St. Louis, MO, USA) a štěpí se proteinasou K (Boehringer-Mannheim, FRG) o koncentraci 0,1 mg/ml, 2 hodiny, při teplotě 50 °C. Protein se odstraní dvěma extrakcemi fenolem nasyceným 20 mM Tris HC1 o pH 7,5 a 1 mM EDTA (TE) a jednou extrakcí směsí fenol/chloroform (1:1). Vodná fáze se dialyzuje proti TE a zkoncentruje se ethanolovým srážením. Získá se typický výtěžek 0,4 mg DNA z 1 x 10⁶ oocystových buněk.

Parazitická DNA se štěpí různými restrikčními endonukleasami podle pokynů výrobce a výsledné DNA fragmenty se rozliší elektroforézou při 40 V, 2,5 hodiny v agarose o koncentraci 0,8 % v Loeningově pufru (složení: 4,7 g NaH₂PO₄, 4,36 g Tris báze, 0,372 g Na₂EDTA na litr, pH 7,6). Na gel se 30 min působí roztokem HCI o koncentraci 0,25 M a DNA se převádí přes noc na Zeta Probe (BIO-RAD) membránu v roztoku o koncentraci NaOH 0,4 M. Filtrační materiál se neutralizuje ve dvou lázních SSC (pH 6,8) a 1 hodinu se při teplotě 80 °C zapéká za vakua.

Filtr se 3 hodiny prehybridizuje při teplotě 65 °C v roztoku, obsahujícím 7 % SDS, 1 % BSA (Boehringer, frakce V) v pufru o koncentraci 0,5 M NaHPO₄ o pH 7,2. Po vyštěpení z pEV/5-7 plazmidu způsobem, popsaným výše v textu, pomocí enzymu EcoRl se 5-7 genový EcoRl inzert izoluje na gelu a označí se metodou random-priming pomocí Klenowova fragmentu v přítomnosti deoxynukleotidů značených ³² _P. Označený inzert se oddělí od neinkorporovaných nukleotidů v koloně Spin-Columns (firma BIO-RAD), denaturuje se a přidá se do hybridizačního

-22 CZ 285116 B6 roztoku. Po inkubaci po dobu 12 hodin při teplotě 65 °C se filtry třikrát promyjí roztokem o složení 2 X SSC/0,1 % SDS a dvakrát roztokem o složení 0,1 X SSC/0,1 % SDS při teplotě 65 °C. Fragmenty genomové DNA, které se hybridizují s uvedenou próbou, se detegují autoradiograficky. Ačkoliv se zde používá pEV/5-7 plazmid, je zřejmé, že se může vhodně použít jakýkoliv ekvivalentní vektor, obsahující cDNA inzert, o velikosti 1,2 kb, merozoového 5-7 genu.

Výsledky této analýzy ukazuje obr. 3, na němž jsou také vidět výsledky štěpení pomocí enzymů PvuII (1), HincII (2), Pstl (3), Sphl (4) nebo Sací (5).

Fragment genomové DNA o velikosti 6,5 kb po vyštěpení enzymem PvuII je detegován v pruhu 1 a fragment o velikosti 3,6 kb po vyštěpení enzymem Sací v pruhu 5. Protože v cDNA klonu nejsou žádná restrikční místa pro tyto enzymy, můžeme maximální velikost Eimeria genu odhadnout na asi 3,6 kb.

Po vyštěpení enzymem Pstl lze detegovat tři fragmenty (pruh 3). Dvě restrikční místa pro Pstl enzym se dají předpovědět ze sekvence cDNA. Přítomnost těchto dvou míst způsobí vznik vnitřního fragmentu o velikosti 306 bp (příliš malého, aby se dal detegovat při této analýze Southem blot) a dvou připojených fragmentů. Výskyt třetího velkého Pstl fragmentu se nejlépe vysvětlí přítomností intronu umístěného mezi vnitřními Pstl místy.

Charakter fragmentů, vzniklých štěpením enzymem Sphl (pruh 4), který se také štěpí cDNA na dvou místech, neposkytuje žádné určité informace. Malý vnitřní Sphl fragment o velikosti 604 bp, zjistitelný ze sekvence cDNA, se v tomto gelu nemůže detegovat.

Štěpením genomové DNA enzymem EcoRI vznikne genomový fragment o velikosti 1,2 kb, jehož velikost odpovídá cDNA fragmentu. Dvojitým štěpením enzymy HincII a EcoRI vznikne fragment o velikosti 0,9 kb (není ukázán na obrázcích).

Při analýze Northem blot /Alwine a další, Proč. Nati. Acad. Sci USA 74:5350 (1977)/ poly(A)-obsahujicí mRNA, izolované zmerozoových buněk, se cDNA fragment lambda 5-7 genu o velikosti 1,2 kb hybridizuje s jednovláknovými druhy mRNA přibližně o délce 1,3 kb. Z korelace velikosti je zřejmé, že 5-7 klon dohromady s prodloužením na 5' konci, určeném z 1-5 izolátu uvedeného výše v textu, představuje sekvenci cDNA v celé délce s možnou výjimkou nukleotidů na 5' konci.

Příklad 2

Pro vytvoření efektivnějšího způsobu imunizace kuřat merozoovým antigenem 5-7 z buněk E. tenella se cDNA o velikosti 1,2 kb, popsaná výše, klonuje do viru vakcinia. Rekombinantní vakcinia virus, získaný tímto způsobem, se použije jako podjednotka vakcíny proti kokcidióze pro vakcinaci kuřat.

Konstrukce vektoru

Všechny vytvořené formy rekombinantního vakcinia viru (rVV) se zakládají na homologní rekombinaci do lokusu virové thymidinkinasy (TK), jak popsal Macket a další /Proč. Nati. Acad. Sci. USA 79:7415 (1982)/. TK lokus byl zmapován ve vakcinia viru (VV) pomocí HindlII J fragmentu /Hrubý a další, J. Virol. 43:403 (1982)/ a část tohoto fragmentu byla sekvenována /Weir a další, J. Virol. 46:530 (1983)/.

-23 CZ 285116 B6

Konstrukce vektoru pro rekombinaci pUC8-TK-7,5K je v zásadě popsaná v Evropské patentové přihlášce č. 344 808. Stručně řečeno, vektor se skládá z kostry tvořené pUC8 plazmidem, která nese TK gen vakcinia viru přerušený VV 7,5K promotorem /Venkatesan a další, Cell 25:805 (1981)/. Dále od promotoru ve směru transkripce bylo vytvořeno mnohonásobné klonovací místo, které umožňuje zavedení genu, který se má exprimovat. Obr. 12 ukazuje schematický nákres pUC8-TK-7,5K plazmidu.

Pro vytvoření našeho konstruktu se EcoRI fragment, kódující merozoový 5-7 gen, klonuje na EcoRi místo polylinkeru, který je součástí základního vektoru, ukázaného na obr. 12. Konstrukty, obsahující fragment ve správné orientaci, se namnoží a modifikují způsobem, dále popsaným v textu, aby se vypustil v čtecím rámci obsažený start kodón, umístěný 97 nukleotidů proti směru transkripce od přirozeného start kodónu merozoového 5-7 genu. Za tímto účelem se plazmid štěpí restrikčními enzymy Smál a BglII. Po upravení tupého konce (blunt) BglII místa pomocí Klenowova fragmentu v přítomnosti čtyř deoxyribonukleotidů se plazmid znovu spojí ligací. Konstrukt pR3 (obr. 13), s očekávanou delecí, se namnoží a použije se pro rekombinaci do vakcinia viru. Obr. 14 ukazuje kompletní sekvenci tohoto rekombinovaného plazmidu.

Kromě toho se merozoový 5-7 gen zavádí také do vektoru pro rekombinaci, který obsahuje vedoucí sekvenci Dral-HindlII malariového antigenu. Tento vektor, popsaný v Evropské patentové přihlášce č. 344 808, je v zásadě vektorem pUC8-TK-7,5K, ale obsahuje kromě toho ve směru transkripce od 7,5K promotoru vedoucí sekvenci malariového antigenu o velikosti 190 kDa. Vedle této vedoucí sekvence bylo zkonstruováno mnohonásobné klonovací místo, které umožňuje zavedení genu, který se má exprimovat. Výsledný transkript, jehož vznik je řízený VV 7,5K promotorem, se přeloží jako protein, obsahující na N-konci vedoucí sekvenci malariového antigenu o velikosti 190 kDa. Změny v možném místě štěpení této vedoucí sekvence vedou in vivo ke zralému proteinu. Obr. 15 ukazuje schematický nákres konstruktu pR4, obsahujícího merozoový 5-7 gen.

Konstrukce rekombinantního vakcinia viru

Buňky CV1, naočkované na kultivační misku s povrchem 8 cm², se adaptují na teplotu 33 °C a pěstují se až k 80 až 90% konfluenci. Potom se infikují vakcinia virem v množství 0,1 plak tvořících jednotek (pfu) na buňku. Použije se teplotně senzitivní mutant viru ts N7 /Drillien, R. a Spehner, D. Virology 131:385.393 (1983)/. Po dvou hodinách při dobře snášené teplotě 33 °C v CO₂ inkubátoru /Kieny a další, Nátuře 312:163 (1984)/ se buňky transferují 0,25 ml roztoku, který obsahuje precipitát DNA s fosforečnanem vápenatým, jak popsal Weir a další /Proč. Nati. Acad. Sci. USA 79:1210-1214 (1982)/. Směs precipitátu DNA s fosforečnanem vápenatým obsahuje roztok o složení: 0,8% NaCl, 0,038% KC1, 0,0134 M Na₂HPO₄ . 2H₂O, 0,1 % glukózy, o pH 7,0 a 125 mM CaCl₂, 200 ng DNA divokého typu viru vakcinia (WR kmen) a 100 ng vhodného rekombinantního plazmidu pR3 nebo pR4. Po jedné hodině inkubace při teplotě místnosti se přidá další médium na misku; následuje dvouhodinová inkubace při teplotě 39,5 °C v inkubátoru při obsahu CO₂ 5 %. Při této teplotě se ts N7 vir nemůže replikovat a tím se provádí selekce virů, které jsou rekombinovány alespoň v ts 7 lokusu.

Po dvou dnech inkubace při teplotě 39,5 °C se buňky sklidí seškrábáním. Buňky v suspenzi se dále rozbijí sonikací. Tento homogenát se potom použije pro získání TK negativního (TK') viru titrací na lidské TK^- 143 buňky v přítomnosti bromdeoxyuridinu (BUdR) o koncentraci 30 pg/ml. Plaky se seberou a virus se dále plakově čistí ještě dvakrát v lidských TK' 143 buňkách v přítomnosti 30 pg/ml BUdR. Zásobní kultura viru se vytvoří vCVl buňkách za nepřítomnosti BUdR. Rekombinantní vakcinia viry R3,2 a R4,l se jednotlivě testují na přítomnost cDNA merozoového genu o velikosti 1,2 kb, vloženého do TK genu. Testování se provádí štěpením virové DNA enzymem HindlII a srovnáním rVV DNA matrice s matricí DNA

-24CZ 285116 B6 divokého typu (WR) vakcinia viru, přičemž tato DNA byla štěpena stejným restrikčním enzymem. Při výskytu rekombinace se po elektroforéze v 1 % agarosovém gelu objeví posun v HindlII J DNA fragmentu. Toto skutečně bylo pozorováno. Posun odpovídá vypočteným hodnotám, odvozeným z velikosti inzertu.

Testování exprese

Pro testování exprese merozoového 5-7 antigenu rekombinantním virem se CV1 buňky infikují buď rVV R3,2 virem nebo rVV R4,l virem. Buňky se sklidí 48 hodin po infikování. Po odstředění buněk se pelety solubilizují v Laemmli sample pufru /Nátuře 227:680 (1979)/ v přítomnosti β-merkaptoethanolu jako redukčního činidla. Po 5 min varu se vzorky nanesou na 12,5 % SDS-PAGE gelovou destičku. Po elektroforetické separaci se proteiny přenesou technikou blotting na nitrocelulózové membrány (Trans-Blot, BIO RAD) v Blot-pufru o složení: 25 mM Tris-HCI, 0,19 M glycin; pH 8,3 a v přítomnosti 20% (obj.) methanolu, při konstantním napětí 80 V v Transblot transfer cele (BIO RAD Laboratories), doba převádění 2 hodiny při teplotě 4 °C /Towbin a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 76:4350-4354 (1979)/.

Pro potřeby imunodetekce se nitrocelulózové membrány předem inkubují 45 minut s 5 % netučného mléčného prášku v TBS pufru (složení: 20 mM Tris-HCI, 150 mM NaCl, upraveno na pH 0,8) a potom se inkubují 2 hodiny nebo přes noc při teplotě místnosti s králičím anti-E. tenella merozoovým sérem při zředění 1:50, v TBS pufru, obsahujícím 20 % (obj.) fetálního hovězího séra. Nitrocelulózové membrány se dále třikrát promyjí, vždy po dobu 10 min, v TBS pufru, obsahujícím 0,1 % NP40. Následuje dvouhodinová inkubace při teplotě místnosti s konjugátem kozího-anti-králičího IgG (H+L) s peroxidasou (BIO-RAD) (konjugát je čištěný afinitní chromatografii) při zředění 1:1000 v TBS pufru a v přítomnosti 5 % netučného mléčného prášku (zkratka H+L znamení těžké (H) a lehké (L) řetězce imunoglobulinu IgG). Bloty se dále třikrát promyjí, jak je popsáno výše v textu. Vazba peroxidasového konjugátu se deteguje reakcí nitrocelulózové membrány v roztoku, obsahujícím 0,018% 4-chlor-l-naftolu v 6%ním methanolu ve vodě, v přítomnosti 0,02 % (obj.) H₂O₂. Reakce se zastaví mohutným promytím blotu ve vodě.

Zjistilo se, že králičí anti-E. tenella merozoové sérum reaguje při analýze Western blot (Towbin a další, viz výše v textu) prováděné s CV1 buňkami, infikovanými rVV R3,2, jednotlivě s odlišnými proteinovými pásy o velikosti 33 kDa a o velikosti 23 kDa. Jako srovnávací vzorky se použijí standardy molekulové hmotnosti předem obarvené pro SDS-PAGE firmy BIO-RAD (standardy o malých molekulových hmotnostech (low range)). CV1 buňky infikované divokým typem WR vakcinia viru nereagují s králičím anti-E. tenella merozoovým sérem. Velikost proteinu 33 kDa odpovídá teoreticky očekávané hodnotě prekurzorového proteinu viz obr. 2, okénko C, pruh b. Menší protein o velikosti 23 kDa by mohl být upravená verze prekurzorového proteinu, jak je uvedeno výše, který je také zřetelný na povrchu merozoových buněk (viz obr. 2, okénko A a B, pruh b). Stejné výsledky se pozorují, když se CV1 buňky infikují virem rVV R4,l.

Kromě toho se může dále ukázat analýzou Western blot, že imunitní sérum z kuřat, infikovaných sporulovanými oocystami E. tenella, rozpoznává merozoové 5-7 proteiny (o velikostech 33 kDa a 23 kDa) exprimované vCVl buňkách, infikovaných jednotlivě rekombinantními vakcinia viry R3,2 a R4,l.

-25 CZ 285116 B6

Produkce viru

Virus kmene WR se může množit v téměř všech typech buněk /Drillien a další, J. Virology 28:843 (1978)/ a jeho pomnožení se může přímo pozorovat jako tvorba plaků. Ve většině případů používáme pro přípravu zásobních kultur viru buňky CV1.

Za účelem infikování se kultivační médium oddělí od 80 až 90% konfluentních CV1 buněk, pěstovaných v kultivačních buňkách o povrchu 175 cm² (např. Falcon 3028 buňky), a buňky se inkubují 1 hodinu při teplotě místnosti (20 °C) v PBS roztoku, obsahujícím virus (0,1 pfu/ml, 0,01 ml/cm²). Potom se přidá čerstvé kultivační médium (0,2 ml/cm²) a baňky se inkubují při teplotě 37 °C, 2 až 3 dny, dokud asi 80 % buněk nezlyzuje. Vzniklý zásobní roztok se skladuje přímo s buňkami a médiem v původních kultivačních baňkách při teplotě -30 °C, než se virus čistí.

Následující čisticí kroky se provádí, aby se získal virový přípravek bez specifických komponent hostitelských buněk. Infikované buněčné kultury, skladované při teplotě -30 °C, se rozmrazí a zbylé buňky se odstraní z povrchu baněk setřepáním nebo seškrabáním. Buňky a viry se odstředí z média (na centrifuze Sorvall s rotorem GSA, podmínky odstřeďování: 1 hodina, 5000 ot/min, teplota 10 °C). Peleta buněk s virovými částicemi se resuspenduje v PBS roztoku (množství PBS roztoku - 10 až 20násobný objem pelety) a odstřeďuje se za podmínek uvedených výše. Peleta se resuspenduje v lOnásobném objemu RSB pufru (o složení: 10 mM Tris-HCl o pH 8,0, 10 mM KC1, 1 mM MgCl₂).

Vytvořená suspenze se podrobí sonikaci (dvakrát za sebou, 10 s při výkonu 60 W, při teplotě místnosti, v sonifikátoru např. Labsonic 1510 s próbou o průměru 4 mm) a tím se dosáhne lyže intaktních buněk a uvolnění viru z buněčných membrán. Vzniklá směs se odstřeďuje 3 min, při 3000 ot/min, při teplotě 10 °C v odstředivce Sorvall s rotorem GSA. Tak se získá suspenze viru, zbavená buněčných jader a velkých buněčných zbytků. Supematant se opatrně odstraní a peleta se resuspenduje v RSB pufru, podrobí se sonikaci a odstředí se za stejných podmínek.

Druhý supematant se spojí s prvním, převrství se na 10 ml roztoku o koncentraci sacharózy 35 % (v 10 mM Tris-HCl pufru o pH 8,0) a 90 min se odstřeďuje při 14 000 ot/min v odstředivce Beckman s rotorem SW 27, při teplotě 10 °C. Supematant se dekantuje a peleta virových částic se resuspenduje v 10 ml 10 mM Tris-HCl o pH 8,0 a sonikuje se, aby se peleta homogenizovala (dvakrát po dobu 10 sekund, při teplotě místnosti, jak je popsáno výše) a nanese se do kyvet obsahujících roztoky, které tvoří krokový gradient, čímž se provádí další čištění.

Roztoky, tvořící krokový gradient, obsahují 5 ml alikvótního množství sacharózy v pufru o koncentraci 10 mM Tris-HCl a pH 8,0, při koncentracích sacharózy: 20, 25, 30, 35 a 40 procent. Kyvety s tímto gradientem se odstřeďují na odstředivce Beckman s rotorem SW 27, 35 minut při 14 000 ot/min, při teplotě 10 °C. V oblasti, kde je koncentrace sacharózy 30 až 40%, je viditelných několik pásů, které obsahují virové částice. Tyto oblasti gradientu se odstraní a zředí roztokem PBS. Virové částice se odstředí (odstředivka Beckman s rotorem SW 27, 90 minut, 14 000 ot/min, teplota 10 °C). Peleta, obsahující téměř výhradně virové částice, se resuspenduje v roztoku PBS tak, aby koncentrace viru byla v průměru 0,5 až 1 krát 10¹⁰ pfu/ml. Tento zásobní virus se používá buď přímo nebo zředěný roztokem PBS.

Pro stanovení koncentrace viru a čistoty zásobního viru se používají dva způsoby. Absolutní koncentrace virových částic se výhodně zjistí měřením optické denzity (OD) zásobního roztoku na spektrofotometru při vlnové délce 260 nm (OD/260 nm), přičemž 1 OD/260 odpovídá množství asi 1,2 xlO¹⁰ částic/ml /Joklik, Virology 18:9 (1962)/. Koncentrace viru se také zjišťuje titrací viru na buňky (plaková zkouška) za předpokladu, že pouze jedna z 60 virových částic může infikovat buňku.

-26CZ 285116 B6

Pro titraci virové koncentrace na kultivovaných buňkách se v kultivačním médiu pěstují fibroblasty z kuřecích embryí (CEF) na miskách s povrchem 8 cm² (Falcon 3001). Když buňky dosáhnou 80 až 90 % konfluence, médium se odstraní a nahradí se 0,2 ml zředěného virového roztoku v PBS a nechají se inkubovat hodinu při teplotě místnosti. Zásobní kultura viru se zředí 10 krát. Na každou misku se přidají 2 ml polotuhého kultivačního média, které obsahuje 1 % agarosy a misky se umístí na 16 až 24 hodin do CO₂ inkubátoru, při teplotě 37 °C. Potom se misky přelijí 2 ml polotuhého kultivačního média, které obsahuje 0,2 % neutrální červeně, aby se obarvily živé buňky a misky se dále inkubují 16 až 24 hodin. Bezbarvé plaky se potom spočítají pod mikroskopem.

Příklad 3

Imunizace kuřat

Následující vakcinace se provádí, aby se stanovilo, zda vektor rVV-R3,2 viru vakcinia, obsahující merozoový 5-7 gen, může chránit kuřata proti provokační infekci sporulovanými oocystami pathogenního kmene E. tenella.

Kohoutci WARREN, dodání z líhně E. Wuethrich v Belpu (Švýcarsko), se chovají v klecích s drátěným dnem a krmí běžným krmivém pro broilery, skládajícím se hlavně z kukuřice, pšenice a sojových bobů. Sedmnáctý den se kuřata očkují množstvím 3 x 10⁸ pfu rekombinantního viru vakcinia R3,2 ve 100 μΐ PBS, přičemž 50 μΐ tohoto roztoku se injekčně očkuje podkožně do praporu křídla a dalších 50 μΐ se aplikuje nitrosvalově do hrudi. S přestávkou vždy jeden týden se tento postup dvakrát opakuje, ale u jedné pokusné skupiny se poslední injekce viru nahradí orálním podáním 5000 sporulovaných oocyst virulentního kmene E. tenella (např. kmene T7-776/21), aby se simulovala přirozená expozice kuřat infekčním kokcidiím v polních podmínkách. Jeden týden po poslední imunizaci se všem kuřatům odebere krev pro analytické účely a další týden (45. den) se kuřata infikují provokačně 50 000 sporulovanými oocystami E. tenella (např. kmene T7-776/21). Vývojový cyklus parazitů trvá 7 dní a potom 52. den se kuřatům odebere krev, usmrtí se a pitvají. Infikovaná céka se odstraní, léze způsobené vývojem parazitů se spočítají a celá tkáň se homogenizuje, aby se určil obsah oocyst. Kromě toho se zaznamenává výstav kuřat (denní přírůstek hmotnosti a využití krmivá).

Ochranný pokus

Údaje v tabulce 1 ukazují jasně, že vakcinace rekombinantním virem vakcinia R3,2 má značný chránící účinek proti kruté kokcidiózové provokační infekci. Počty lézí se sníží o 18 % a obsah oocyst v céku o 35 % ve srovnání s infikovanou kontrolou. Výstav, což je ekonomicky nejdůležitější parametr, se zlepší o 62% v ukazateli denního přírůstku hmotnosti a o 56% ve využití krmivá. Když se však poslední injekce viru nahradí mírnou kokcidiózovou infekcí, ochrana kuřat proti kokcidióze je téměř dokonalá. Výstav těchto kuřat je ekvivalentní s neinfikovanou kontrolní skupinou a počet lézí stejně jako obsah oocyst v céku je nízký. Protože ještě nikdy nebylo ukázáno, že by samotná inokulace buňkami E. tenella způsobovala takový stupeň ochrany, soudí se, že vakcinace pomocí viru silně povzbudila imunitní systém kuřat tak, že následná mírná kokcidiózová infekce mohla vyvolat zesilovací efekt, jehož výsledkem je takto účinná imunitní ochrana proti kokcidióze.

-27CZ 285116 B6

Humorální stav kuřat

Humorální stav kuřat se analyzuje nepřímo metodou ELISA a analýzou Western blot podle následujícího postupu.

Tabulka 1

Výstav a parazitologické parametry kuřat, podrobených vakcinaci rekombinantním virem vakcinia rVV-R3,2, po provokační infekci 50 000 oocystami E. tenella

Druh	zásahu	Počet skupin kuřat	Střední tělesná hmotnost (g) 45. den	Střední tělesná hmotnost (g) 52. den	Denní přírůstek hmotnosti (g) 45. až 52. den	Střední využití krmivá 45. až 52. den	Počet cekálních lézí	Počet oocyst v céku (Mio/g céka)
1. imunizace ♦)	2. imunizace *)	3. imunizace *)	Provokační infekce
-	-	-	-	3/12	788,2	985,8	28,2	2,66	0	0
v	v	v	+	3/12	778,1	860,4	11.8	5,19	1,58	1,73
v	v	c	+	3/12	779,3	960,6	25,9	2,98	0,75	0,18
-	-	-	+	3/12	783,0	834,3	7,3	11,88	1,92	2,67

*) V = injekce s 3 x 10⁸ PFU rekombinantního viru ve 100 μΐ na kuře C = inokulace s 5000 E. tenella oocystami na kuře

Analýza Western blot se provede, jak je popsáno výše, kromě jednoho přídavného inkubačního kroku předtím, než se přidají vzorky kuřecích sér. Tento krok spočívá v inkubaci blotů nitrocelulózových membrán s hyperimunitním králičím anti-vakciniovým sérem (2 hodiny při teplotě místnosti, při zředění 1:50), aby se zachytily všechny vakcinia-specifícké proteiny.

Pro nepřímé stanovení ELISA se použije třetí generace merozoových buněk E. tenella, sklizená z in vitro pěstovaných primárních buněk kuřecích ledvin. Do jamek mikrotitračních ploten se naplní po 3000 merozoových buněk, rozpuštěných ve 100 ml pufru o složení uhličitan-hydrogenuhličitan sodný o pH 9,6 a inkubuje se přes noc při teplotě 4 °C. Plotny se třikrát promyjí deionizovanou vodou a znovu se naplní 200 ml blokovacího pufru (o složení: 0,1 M Na₂HPO₄, PH upraveno na 6,5 pomocí HC1, 1 % BSA, 0,5 g/1 ethylmerkuri-thiosalicylátu sodného). Blokování probíhá přes noc při teplotě 4 °C. Zjednoho zvířete se testují dva vzorky séra. První vzorek se odebere týden po poslední imunizaci a druhý těsně po usmrcení zvířete. Vzorky se zředí dvakrát PBS roztokem, obsahujícím 3 % mléčného prášku; počáteční zředění je 1 až 50 krát. Inkubace probíhá 4 hodiny při teplotě 37 °C (v objemu 100 ml). Plotna se promyje, jak je popsáno výše, a přidá se 100 ml konjugátu kozího anti-kuřecího (H+L) imunoglobulinu označeného peroxidasou na jamku (konjugát je zředěný 1:2000 v roztoku PBS, obsahujícím 3 % mléčného prášku). Inkubace při teplotě 37 °C trvá 2 hodiny. Komplexy antigen-protilátka se vizualizují přídavkem 100 ml TMB substrátu. TMB substrát se skládá z jedné části TMB (0,24 g tetramethylbenzidinu rozpuštěného v 5 ml acetonu a doplněného na 50 ml methanolem) a 20 částí substrátu (0,2 M kyselina citrónová, pH 4,0, 275 ml/1 30%ního H7O2).

Reakce se zastaví přídavkem 0,5 M H₂SO₄ před tím, než se plotny přečtou v ELISA čtecím zařízení (Titertek Multiskan MCC/340, Flow Laboratories) při 450 nm.

Po vakcinaci kuřat rekombinantními viry R3,2 a R4,l se pozoruje jenom slabá humorální protilátková odpověď na merozoové buňky kokcidiokoků (průměrný titr 1:100) ve srovnání s kontrolními živočichy (průměrný titr>l :1600), imunizovanými nízkými dávkami sporulovaných oocyst. Tento fakt naznačuje, že příčinou získání pozitivních údajů, vztahujících se

-28CZ 285116 B6 k ochraně kuřat, a údajů, týkajících se výstavu vakcinovaných kuřat (viz tabulka 1 a výsledky diskutované výše) může být efektorově pracující mechanismus zprostředkovaný buňkami.

Aby se potvrdila přítomnost specifických protilátek proti merozoovému 5-7 antigenu, testují se krevní vzorky s nejvyšším titrem protilátek, zjištěným pomocí ELISA stanovení, analýzou Western blot. Při této analýze se používají CV1 buňky infikované rVV-R3,2 jako zdroj antigenů. Všechna séra rozpoznala jednotlivě dva proteiny o velikosti 33 kDA a 23 kDa, což dokazuje, že provedená imunizace byla úspěšná.

V tomto vynálezu se může provést mnoho úprav a variací bez toho, že by se to dotklo jeho smyslu a rozsahu, jak je zřejmé odborníkovi v oboru. Zde popsané specifické postupy se míní jen jako příklad a vynález je omezen pouze rozsahem připojených patentových nároků.

SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE:

(i) PŘIHLAŠOVATEL:

(A) Název: F. HOFFMANN-LA ROCHE AG (B) Ulice: Grenzacherstrasse 124 (C) Město: Basilej (D) Okres: BS (E) Stát: Švýcarsko (F) Poštovní kód: CH-4002 (G) Telefon: 061 -688 24 03 (H) Telefax: 061 -688 13 95 (I) Telex: 962292/965542 hlrchh (ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Vakcíny proti kokcidióze (iii) POČET SEKVENCÍ: 15 (iv) POČÍTAČOVĚ ČITELNÁ PODOBA:

(A) Typ média: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patent In Release č. 1,0, verze č. 1,25 (EPO) (v) ÚDAJE O PŘEDLOŽENÉ PŘIHLÁŠCE:

Přihláška číslo:

(vi) ÚDAJE O PŘEDEŠLÉ PŘIHLÁŠCE:

(A) Číslo přihlášky: US 07/729 099 (B) Datum podání: 12. července 1991 (2) INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 1 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) Délka: 315 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: neznámá (ii) TYP MOLEKULY: protein

-29CZ 285116 B6 (iii) HYPOTETICKÁ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) Organismus: Eimeria tenella (D) Vývojové stadium: merozoové (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. id. č. 1:

Met Ala Lys Ser Met Leu Ser Gly Ile Val Phe Ala Gly Leu Val Ala 15 1015

Ala Ala Ala Ala Ser Ser Ala Asn Ser Ala Ala Asn Val Ser Val Leu

2530

Glu Ser Gly Pro Ala Val Gin Glu Val Pro Ala Arg Thr Val Thr Ala

4045

Arg Leu Ala Lys Pro Leu Leu Leu Leu Ser Ala Leu Ala Ala Thr Leu 50 5560

Ala Ala Ala Phe Leu Val Leu Gin Cys Phe Asn Ile Ile Ser Ser Asn

70 7580

Asn Gin Gin Thr Ser Val Arg Arg Leu Ala Ala Gly Gly Ala Cys Gly 85 9095

Asp Glu Glu Asp Ala Asp Glu Gly Thr Ser Gin Gin Ala Ser Arg Arg 100 105110

Arg Arg Lys Pro Asp Thr Pro Ala Ala Asp Lys Tyr Asp Phe Val Gly 115 120125

Gly Thr Pro Val Ser Val Thr Glu Pro Asn Val Asp Glu Val Leu Ile 130 135140

Gin Ile Arg Asn Lys Gin Ile Phe Leu Lys Asn Pro Trp Thr Gly Gin 145 150 155160

Glu Glu Gin Val Leu Val Leu Glu Arg Gin Ser Glu Glu Pro Ile Leu 165 170175

Ile Val Ala Arg Thr Arg Gin Thr Leu Glu Gly Tyr Leu Gly Ser Gin 180 185190

Ala Leu Ala Gin Asp Gly Lys Thr Ala Lys Glu Glu Lys Val Glu Gly 195 200205

Gly Lys Thr His Arg Arg Tyr Lys Val Lys Ser Ser Asp Pro Gly Tyr 210 215220

Gly Phe Pro Tyr Thr Thr Val Leu Asp Gly Val Pro Val Gly Thr Asp

225 230 235240

Glu Asp Gly Tyr Val Val Glu Val Leu Met Lys Thr Gly Pro His Gly

245 250255

Gly Val Asp Met Met Thr Ser Thr Ala Ser Gin Gly Lys Phe Cys Gly 260 265270

Val Leu Met Asp Asp Gly Lys Gly Asn Leu Val Asp Gly Gin Gly Arg

275 280285

Lys Ile Thr Ala Val Ile Gly Met Leu Thr Gin Pro Asp Thr Glu Phe

290 295300

Arg Ser Gly Pro Gly Asp Asp Glu Asp Asp Glu

305 310315 (2) INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) Délka: 948 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina

-30CZ 285116 B6 (C) Počet vláken: jedno (D) Topologie: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) ΑΝΤΙ-SMYSL: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) Organismus: Eimeria tenella (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. id. č. 2:

ATGGCTAAGT CTATGCTTTC TGGAATTGTT AGTTCGGCCA ACAGCGCCGC CAACGTCTCC GTGCCAGCGC GCACGGTCAC AGCTCGCCTG GCTGCGACTT TGGCAGCAGC TTTCCTCGTT AACCAGCAAA CCAGCGTCAG GAGACTGGCC GCAGATGAGG GAACTTCACA GCAGGCCAGC GCAGATAAAT ACGATTTTGT TGGCGGAACT GAAGTCCTTA TCCAAATTAG AAATAAACAA GAAGAACAAG TTCTAGTACT GGAACGACAA ACAAGACAAA CACTTGAAGG ATATCTTGGT GCTAAAGAAG AGAAAGTTGA AGGAGGCAAA GACCCAGGAT ATGGATTCCC ATACACCACG GAAGACGGAT ACGTCGTCGA AGTTCTTATG ATGACTAGCA CAGCATCACA AGGAAAATTC AACCTAGTCG ATGGACAAGG GAGAAAAATT GATACCGAGT TTAGAAGCGG ACCAGGAGAC

TTTGCTGGTC TTGTTGCTGC TGCAGCGGCC GTTTTGGAGA gtgggcccgc tgtgcaggaa GCGAAGCCTT TGCTGCTTCT TTCTGCTCTT TTGCAATGCT TCAACATCAT CTCCAGCAAC GCCGGAGGTG CATGCGGAGA TGAGGAAGAT CGGAGGAGGA gaaaacctga tacccctgca CCAGITTCGG TCACTGAGCC GAATGTTGAT ATCTTTTTGA AGAACCCATG GACTGGACAA AGTGAAGAAC CCATTCTGAT TGTGGCGAGG AGTCAAGCTC TTGCACAGGA CGGAAAGACT ACTCACAGAA GATATAAAGT CAAGAGCAGC GTGCTCGACG GGGTTCCTGT GGGAACAGAC AAAACCGGAC CCCATGGAGG AGTCGACATG TGCGGAGTGC TTATGGATGA CGGAAAAGGA ACCGCCGTTA TCGGCATGCT AACTCAACCG GACGAGGACG ACGAGTGA (2) INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) Délka: 8 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ano (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní

-31 CZ 285116 B6 (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) Organismus: Eimeria tenella (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. id. č. 3:

Ser Asn Asn Gin Gin Thr Ser Val

5 (2) INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) Délka: 29 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ano (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) Organismus: Eimeria tenella (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. id. č. 4:

Cys Gly Asp Glu Glu Asp Ala Asp Glu Gly Thr Ser Gin Gin 1 5 10

Ala Ser Arg Arg Arg Arg Lys Pro Asp Thr Pro Ala

20 25

Ala Asp Lys (2) INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) Délka: 3 aminokyseliny (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ano (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) Organismus: Eimeria tenella (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. id. č. 5:

Pro Asn Val

-32CZ 285116 B6 (2) INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) Délka: 6 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ano (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) Organismus: Eimeria tenella (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. id. č. 6

Arg Asn Lys Gin Ile Phe

5 (2) INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) Délka: 8 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ano (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) Organismus: Eimeria tenella (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. id č. 7:

Asn Pro Trp Thr Gly Gin Glu Glu

5 (2) INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) Délka: 5 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ano (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní

-33CZ 285116 B6 (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) Organismus: Eimeria tenella (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. id. č. 8:

Arg Gin Ser Glu Glu

5 (2) INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) Délka: 6 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ano (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) Organismus: Eimeria tenella (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. id. č. 9:

Thr Arg Gin Thr Leu Glu

5 (2) INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) Délka: 30 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ano (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) Organismus: Eimeria Tenella (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. id. č. 10:

Gin Asp Gly Lys Thr Ala Lys Glu Glu Lys Val Glu Gly 1 5 10

Gly Lys Thr His Arg Arg Tyr Lys Val Lys Ser Ser Asp

20 25

-34CZ 285116 B6

Pro Gly Tyr Gly (2) INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) Délka: 5 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ano (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) Organismus: Eimeria tenella (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. id. č. 11:

Thr Asp Glu Asp Gly

5 (2) INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) Délka: 5 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ano (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) Organismus: Eimeria tenella (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. id. č. 12:

Thr Gly Pro His Gly

5 (2) INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) Délka: 5 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid

-35CZ 285116 B6 (iii) HYPOTETICKÁ: ano (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) Organismus: Eimeria tenella (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. id. č. 13:

Ala Ser Gin Gly Lys

5 (2) INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) Délka: 14 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ano (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) Organismus: Eimeria tenella (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. id. č. 14:

Asp Asp Gly Lys Gly Asn Leu Val Asp Gly Gin Gly Arg Lys 1 5 10 (2) INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) Délka: 18 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ano (v) TYP FRAGMENTU: C-terminální (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) Organismus: Eimeria tenella (xi) POPIS SEKVENCE: sekv. id. č. 15:

-36CZ 285116 B6

Thr Gin Pro Asp Thr Glu Phe Arg Ser Gly Pro Gly Asp 1 5 10

Asp Glu Asp Asp Glu

Claims (16)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Imunogenní polypeptid o sekvenci aminokyselin

   M A K S M L s G I V F A G L V A A A A A S S A N S A A N V S V L E S G P A V Q E V P A R T V T A R L A K P L L L L S A L A A T L A A A F L V L Q c F N I I S S N N Q Q T S V R R L A A G G A C G D E E D A D E G T S Q Q A S R R R R K P D T P A A D K Y D F v G G T P V S V T E P N V D E V L I Q I R N K Q I F L K N P w T G Q E E Q V L V L E R Q s E E P I L I V A R T R Q T L E G Y L G s Q A L A Q D G K T A K E E K V E G G K T H R R Y K V K S S D P G Y G F P Y T T v L D G V P v G Ί D E D G Y V V E V L M K T G P H G G V D M M T S T A S Q G K F c G V L M D D G K. G N L V D G Q G R K I T A V I G M L T Q P D T E F R s G P G D D E D D E (sekv id.č. 1)

   nebo jeho fragmenty, které jsou schopné vyvolat imunitní odpověď proti parazitům rodu Eimeria, přičemž uvedený polypeptid a jeho fragmenty neobsahují jiné proteiny produkované parazity rodu Eimeria.
2. 2. Imunogenní polypeptid, kteiý je fragmentem imunogenního polypeptidů podle nároku 1, který postrádá prvních dvacet aminokyselin uvedeného polypeptidů.
3. 3. Imunogenní polypeptid, který je fragmentem imunogenního polypeptidů podle nároku 1 a má zdánlivou molekulovou hmotnost, změřenou metodou SDS-PAGE, 23 kilodaltonů.
4. 4. Imunogenní polypeptid podle nároku 1, který je schopný vyvolat imunitní odpověď zprostředkovanou T-buňkami.
5. 5. Imunogenní polypeptid podle nároku 1, který je peptidem, vybraným ze skupiny peptidů, obsahujících sekvenci aminokyselin:

   -37 CZ 285116 B6

   SNNQQTSV (2) (sekv. id. č. 3), CGDEEDADEGTSQQASRRRRKPDTPAADK (3) (sekv. id. č. 4). PNV (4) (sekv. id. č. 5),

   RNK.QIF (5) (sekv. id. č. 6),

   NPWTGQEE (6) (sekv. id. č. 7),

   RQSEE (7) (sekv. id. č. 8),

   TRQTLE (8) (sekv. id. č. 9),

   QDGKTAKEEKVEGGKTHRRYKVKSSDPGYG (9) (sekv. id. č. 10),

   TDEDG (10) (sekv. id. č. 11),

   TGPHG (11) (sekv. id. č. 12),

   ASQGK (12) (sekv. id. č. 13),

   DDGKGNLVDGQGRK (13) (sekv. id. č. 14), nebo TQPDTEFRSGPGDDEDDE (14) (sekv. id. č. 15).
6. 6. Izolovaná molekula DNA, kódující imunogenní polypeptid se sekvencí (sekv. id. č. 1) nebo její částí podle nároku 1, přičemž takový polypeptid je schopen vyvolat imunitní odpověď proti parazitům rodu Eimeria.
7. 7. Izolovaná molekula DNA, mající celou nukleotidovou sekvenci nebo část této sekvence ATGGCTAAGTCTATGCTTTCTGGAATTGTTTTTGCTGGTCTTGTTGCTGCTGCAGCG GCCAGTTCGGCCAACAGCGCCGCCAACGTCTCCGTTTTGGAGAGTGGGCCCGCTGTG CAGGAAGTGCCAGCGCGCACGGTCACAGCTCGCCTGGCGAAGCCTTTGCTGCTTCTT TCTGCTCTTGCTGCGACTTTGGCAGCAGCTTTCCTCGTTTTGCAATGCTTCAACATC ATCTCCAGCAACAACCAGCAAACCAGCGTCAGGAGACTGGCCGCCGGALGTGCATGC ggagatgaggaagatgcagatgagggaacttcacagcaggccagccggaggaggaga aaacctgatacccctgcagcagataaatacgattttgttggcggaactccagtttcg gtcactgagccgaatgttgatgaagtccttatccaaattagaaataaacaaatcttt ttgaagaacccatggactggacaagaagaacaagttctagtactggaacgacaaagt gaac-aacccattctgattgtggcgaggacaagacaaacacttgaaggatatcttlgt agtcaagctcttgcacaggacggaaagactgctaaagaagagaaagttgaaggaggc aaaactcacagaagatataaagtcaagagcagcgacccaggatatggattcccatac accaclgtgctcgacgglgttcctgtgggaacagacgaagacggatacgtcgtcgaa GTTCTTATGAAAACCGGACCCCATGGAGGAGTCGACATGATGACTA.GCACAGCATCA CAAGGAAAATTCTGCGGAGTGCTTATGGATGACGGAAAAGGAAACCTAGTCGATGGA CAAGGGAGAAAAATTACCGCCGTTATCGGCATGCTAACTCAACCGGATACCGAGTTT AGAAGCGGACCAGGAGACGACGAGGACGACGAGTGA (A) (sekv. id.č. 2) nebo její funkční ekvivalent, kódující imunogenní polypeptid podle nároku 1, schopný vyvolat imunitní odpověď proti parazitům rodu Eimeria.
8. 8. Rekombinantní vektor, obsahující DNA molekulu podle nároku 6, přičemž tento rekombinantní vektor je schopný řízení exprese uvedené DNA v kompatibilním hostitelském organismu.
9. 9. Imunogenní polypeptid podle jakéhokoliv z nároků 1 až 3 pro imunizaci subjektu proti kokcidióze.

   -38CZ 285116 B6
10. 10. Způsob přípravy polypeptidů podle jakéhokoliv z nároků laž3, vyznačující se tím, že zahrnuje:

    a) kultivaci transformovaného mikroorganismu, obsahujícího rekombinantní vektor, zahrnující DNA s nukleotidovou sekvencí, která kóduje uvedený polypeptid za podmínek, při nichž se DNA exprimuje; a

    b) izolaci peptidu nebo jeho fragmentu z kultury.
11. 11. Způsob přípravy rekombinantního vektoru, který obsahuje DNA s nukleotidovou sekvencí kódující polypeptid podle kteréhokoliv z nároků laž3, vyznačující se tím, že zahrnuje:

    a) inzerci DNA s nukleotidovou sekvencí, kódující uvedený polypeptid do vektoru;

    b) replikaci uvedeného vektoru v mikroorganismu; a

    c) izolaci rekombinantního vektoru z mikroorganismu.
12. 12. Způsob přípravy rekombinantního viru, který obsahuje DNA s nukleotidovou sekvencí, kódující polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že zahrnuje:

    a) inzerci DNA s nukleotidovou sekvencí, kódující uvedený polypeptid do genomu viru bez inhibice virového zrání a infektivity;

    b) amplifikaci uvedeného rekombinantního viru v buněčné kultuře; a

    c) purifikaci rekombinantního viru z kultivačního média.
13. 13. Způsob přípravy transformovaného mikroorganismu, který je schopen produkovat polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že zahrnuje:

    a) transformaci mikroorganismu rekombinantním vektorem, který obsahuje DNA s nukleotidovou sekvencí, kódující uvedený polypeptid; a

    b) pěstování transformovaného mikroorganismu ve fermentačním médiu.
14. 14. Vakcina na ochranu subjektu proti kokcidióze, vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 a fyziologicky vhodný nosič nebo adjuvant.
15. 15. Vakcina na ochranu subjektu proti kokcidióze, vyznačující se tím, že obsahuje rekombinantní virus, zahrnující DNA s nukleotidovou sekvencí, která kóduje polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, přičemž rekombinantní virus je schopný řídit expresi DNA v kompatibilním hostitelském organismu, a fyziologicky vhodný nosič nebo adjuvant.
16. 16. Použití polypeptidů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 pro přípravu vakcíny schopné chránit subjekt proti kokcidióze.

    33 výkresů

    -39CZ 285116 B6

    F1G 1 a

    GCTTTTGCGTCGGAGATAGTCGTTGTGTGTTTGCGCGATCACCCGCGAACTTCTCTACCA

    1---------1-----------1----------H-----------1-----------1-----------1- 60

    CGAAAACGCAGCCTCTATCAGCAACACACAAACGCGCTAGTGGGCGCTTGAAGAGATGGT

    ACTGAAAATGGCTAAGTCTATGCTTTCTGGAATTGTTTTTGCTGGTCTTGTTGCTGCTGC ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120 TGACTTTTACCGATTCAGATACGAAAGACCTTAACAAAAACGACCAGAACAACGACGACG

    MA KSMLSGIVFAGLVAAA

    AGCGGCCAGTTCGGCCAACAGCGCCGCCAACGTCTCCGTTTTGGAGAGTGGGCCCGCTGT ---------₊---------₊---------₊---------+--------—+---------+ ιθο

    TCGCCGGTCAAGCCGGTTGTCGCGGCGGTTGCAGAGGCAAAACCTCTCACCCGGGCGACA

    AASSANSAANVSVLESGPAV

    GCAGGAAGTGCCAGCGCGCACGGTCACAGCTCGCCTGGCGAAGCCTTTGCTGCTTCTTTC ----------1--------4· ______ ___4-____------μ——————— +——_——— p 24 0 CGTCCTTCACGGTCGCGCGTGCCAGTGTCGAGCGGACCGCTTCGGAAACGACGAAGAAAG

    QEVPARTVTARLAKPLLLLS

    TGCTCTTGCTGCGACTTTGGCAGCAGCTTTCCTCGTTTTGCAATGCTTCAACATCATCTC ---------₊---------₊---------₊---------+---------₊---------₊ 3QQ ACGAGAACGACGCTGAAACCGTCGTCGAAAGGAGCAAAACGTTACGAAGTTGTAGTAGAG

    ALAATLAAAFLVLQCFNI IS

    CAGCAACAACCAGCAAACCAGCGTCAGGAGACTGGCCGCCGGAGGTGCATGCGGAGATGA

    ---------₊---------+---------₄----------₊---------₊---------₊ 350

    GTCGTTGTTGGTCGTTTGGTCGCAGTCCTCTGACCGGCGGCCTCCACGTACGCCTCTACT

    SNNQQTSVRRLAAGGACGDE

    GGAAGATGCAGATGAGGGAACTTCACAGCAGGCCAGCCGGAGGAGGAGAAAACCTGATAC ---------₊---------₊---------+---------₊---------₊---------₊ 420 CCTTCTACGTCTACTCCCTTGAAGTGTCGTCCGGTCGGCCTCCTCCTCTTTTGGACTATG

    EDADEGTSQQASRRRRKPDT

    CCCTGCAGCAGATAAATACGATTTTGTTGGCGGAACTCCAGTTTCGGTCACTGAGCCGAA ----------μ---------4----------+---------+---------+---------+ 430 GGGACGTCGTCTATTTATGCTAAAACAACCGCCTTGAGGTCAAAGCCAGTGACTCGGCTT

    PAADKYDFVGGTPVSVTEPN

    TGTTGATGAAGTCCTTATCCAAATTAGAAATAAACAAATCTTTTTGAAGAACCCATGGAC ---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ 540

    ACAACTACTTCAGGAATAGGTTTAATCTTTATTTGTTTAGAAAAACTTCTTGGGTACCTG

    VDEVL IQIRNKQIFLKNPWT

    -40CZ 285116 B6

    F1G 1 b

    TGGACAAGAAGAACAAGTTCTAGTACTGGAACGACAAAGTGAAGAACCCATTCTGATTGT ---------₊---------₊---------+---------+---------₊---------+ 600

    ACCTGTTCTTCTTGTTCAAGATCATGACCTTGCTGTTTCACTTCTTGGGTAAGACTAACA

    GQEEQVLVLERQSEEP I L I V

    GGCGAGGACAAGACAAACACTTGAAGGATATCTTGGTAGTCAAGCTCTTGCACAGGACGG ----------p ------F——— ————-p——————————660

    CCGCTCCTGTTCTGTTTGTGAACTTCCTATAGAACCATCAGTTCGAGAACGTGTCCTGCC

    ARTRQTLEGYLGSQALAQDG

    AAAGACTGCTAAAGAAGAGAAAGTTGAAGGAGGCAAAACTCACAGAAGATATAAAGTCAA ---------+---------+----------p---------+---------:_+---------+ 720

    TTTCTGACGATTTCTTCTCTTTCAACTTCCTCCGTTTTGAGTGTCTTCTATATTTCAGTT

    KTAKEEKVEGGKTHRRYKVK

    GAGCAGCGACCCAGGATATGGATTCCCATACACCACGGTGCTCGACGGGGTTCCTGTGGG -----------+---------+-- —— 1-----------i----------+ 780

    CTCGTCGCTGGGTCCTATACCTAAGGGTATGTGGTGCCACGAGCTGCCCCAAGGACACCC

    SSDPGYGFPYTTVLDGVPVG

    AACAGACGAAGACGGATACGTCGTCGAAGTTCTTATGAAAACCGGACCCCATGGAGGAGT

    ---------+---------+---------₊----------i-----------p

    TTGTCTGCTTCTGCCTATGCAGCAGCTTCAAGAATACTTTTGGCCTGGGGTACCTCCTCA

    TDEDGYVVEVLMKTGPHGGV

    CGACATGATGACTAGCACAGCATCACAAGGAAAATTCTGCGGAGTGCTTATGGATGACGG ---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊

    GCTGTACTACTGATCGTGTCGTAGTGTTCCTTTTAAGACGCCTCACGAATACCTACTGCC

    DMMTSTASQGKFCGVLMDDG

    AAAAGGAAACCTAGTCGATGGACAAGGGAGAAAAATTACCGCCGTTATCGGCATGCTAAC ---------₊---------+---------₊---------₊---------++ 96Q

    TTTTCCTTTGGATCAGCTACCTGTTCCCTCTTTTTAATGGCGGCAATAGCCGTACGATTG

    KGNLVDGQGRKI TAVIGMLT tcaaccggataccgagtttagaagcggaccaggagacgacgaggacgacgagigagtgag

    ---------₊---------+---------+---------+---------₊---------+ 1020

    AGTTGGCCTATGGCTCAAATCTTCGCCTGGTCCTCTGCTGCTCCTGCTGCTCACTCACTC

    QPDTEFRSGPGDDEDDECGGAGTTGGCTTTTGTCCCTGTTGATGCCGTTGCCCACTTTCGCAGCTTGCTTGTTTCCT ----------ρ—_—— —-p——--------1-----------p—------ ---p 1080

    GCCTCAACCGAAAACAGGGACAACTACGGCAACGGGTGAAAGCGTCGAACGAACAAAGGA

    -41 CZ 285116 B6

    FIG 1 c

    GGGCTTGCCTGTGCCGCGACATGCGCTTGGCGTTCCGCCTGAGTTCTTTCGGACTGTTTT

    ----------1-----------1-----------1-----------1---------—+—---------1140

    CCCGAACGGACACGGCGCTGTACGCGAACCGCAAGGCGGACTCAAGAAAGCCTGACAAAA

    AACTTTTAATTCATTTTCTACTGCGGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA ---------+----------₊---------+---------₊---------₊-------1197 TTGAAAATTAAGTAAAAGATGACGCCGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT

    -42CZ 285116 B6

    -43CZ 285116 B6

    FIG 3

    6.5

    3.6

    1.8

    44CZ 285116 B6

    FIG 4

    N250PSN250P29

    T1

    -45CZ 285116 B6

    FIG 5 a

    Xhol

    CTCGAGAAAT CATAAAAAAT ITMTTGCTT TGTGAGCGGA TAACAATTAT

    ECORI

    AATAGATTCA AITGTGAGCG GATAACAAIT TCACACAGAA TTCATIAAAG BariHT Sáli Pstl Hindi II

    AGGAGAAATT AACIATGAGA GGATCCGTCG ACCTGCAGCC AAGCTIAATT MetArg GlySerValA spLeuGlnPr oSerLeulle

    AGCTGAGCTT GGACTCCTCT TGATAGATCC AGTAATGACC TCAGAACTCC Ser

    ATCTGGATTT GITCAGAACG CTCGGTTGCC GCCGGGCGTT TTTTATTGGT GAGAATCCAA GCTAGCTTGG CGAGMTTTC AGGftGCTAAG GAAGCTAAAA TGGAGftAAAA AATCACTGGA TATACCACCG TTGATATATC CCAATGGCAT CCTAAAGAAC ATTTTGftGGC ATTTCAGTCA GITGCTCAňT GTACCTATAA CCAGACCGTT CAGCTGGATA TEACGGCCTT ITIAAAGACC CTAAAGAAAA AHAAGCACAA G'1T1’1!ATCCG GCCTITMTC ACATECTTGC CCGCCTGATG AATGcrcarc OGGftMrrcG tatggcamg aaagacggtg agctggtgat ATGGGAIAGT GTTCACCCIT GTEftCACCCT ITTCCAIGAG CAAACTGAAA CCTTTTCATC GCTCTGGftGT GÁMBCCACG ACGATTTCCG GCAGTTTCTA. CACATATATT CGCAňGATGT GGCGTGTTAC GGTGAAAACC TGGCCTATIT CCCEAAGGG TTTAITSftGA ΑϋΆΙΰΊΤΓΓΧ’ CGTCTCAGCC AATCCCTGGG IGňGmCAC CftGTriTGAT TEAAACGIGG CCAATATGGA CAACTTCTTC GCCCCCGTIT TCACCftlGGG CAAATATIAT ACGCAAGGCG ACAAGGTCCT GATGCCGCTG GCGATTCAGG TTCATCATGC CGTCTGTGAT GGCTTCCATG TCGGCAGAAT GCTIAftTGftA TTACAACAGT ACTGCGATGA GTGGCAGGGC GGGGCGTAAT TTITTTAAGG CAGTDVTTGG TGCCCTTAAA CGCCTGGGGT AATGACTCTC TAGCITGAGG CATCAAATAA AACGAAAGGC TCAGTCGAAA GACTGGGCCT ΙΊΌ3ΠΠΑΤ CTGTIGTTTG TCGGTGAACG CTCTCCTGAG

    Xbal

    TAGGACAAAT CCGCCGCTCT AGAGCTGCCT CGCGCGTTTC GGTGATGACG

    -46CZ 285116 B6

    FIG 5 b

    CTGACACATG CCGGGAGCAG CGGGGCGCAG CTTAACTAIG GTGTGftAATA CTTCCGCTTC CGAGCGGTAT AGGGGAIAAC GGAACCGIAA CCTGACGAGC GACAGGACTA GCTCTCCTGT CCTTCGGGftA TTCGGTCTAG TTCAGCCCGA CCGGTAAGAC TAGCAGAGCG CTAACTAQGG AAGCCAGTTA AACCACCGCT GCAGAAAAAA GftCGCTCAGT ATCAAAAAGG AATCAATCTA TTAATCAOTG AGCTGCCTGA CATCTGGCCC

    GTGAAAACCT TAAGCGGATG TGGCGGGTGT TGTAIftCTGG ACCATATGCG ATCAGGCGCT TCGGCIGCGG CCACAGAATC CAAAAGGCCA GCTCCGCCCC GGCGAAACCC TCCCTCGTGC cgcctitctc GCTATCTCAG GAACCCCCCG TGfiGTCCAAC GTAACAGGAT AAGTGGTGGC

    CCGGCftAACA CftGftTTACGC TACGGGGTCT TCATCAGMT TGAAGTOTTA TiaCCAATGC CTTCATCCAr GAGGGCHAC

    AGACGGTCAC CAGGGCGCGT GTCACGTAGC GCAGATTGTA GCGTAAGGAG GACTCGCTGC AAAGGCGGTA ACAIGTCAGC TTCCTGGCGT TCGACGCTCA AGGCGTTTCC CCGCTIACCG TTCTCAAIGC CCAAGCTGGG TZATCCGGTA GCCACTGGCA GCGGTGCIAC AGGACAGTAT AAGAGTIGGT σπτΓτπϋτ GAAGATCCTT CTCACGTTAA AGATCCTTTT GAGTAAACTT CTCAGCGATC TGTAGATAAC ATGATACCGC

    CftGCTCCCGG ACAAGCCCGT CCATCACCCA CGGCATCAGA CCGCACAGAT CTCGCTCACT CAGCTCACTC GCftGGftAftGA AAAGGCCGCG ATCACAAAAA TAAAGKEACC TCCGACCCTG GCGTGGOGCT GTCGTTCGCT COGCTGCGCC ACGACTTATC AGGTATGZAG CEACACTAGA CCTTCGGAAA GGTftGCGGTG AGGAICTCftA GGftACGRAAA ATCTTCACCT AAGZAZATAT AGGCACCTAT CTCCCCGTCG CAGTCCTGCA

    AGCTTGTCTG CAGCGGGTCT GATAGCGGAG CTGftGAGTGC AAAATACCGC GCTCGGTCTG AIACGGTEAT AAAAGGCCAG TITTCCMAG AGTCAGAGGT CCCTCGAAGC GAIACCTGTC TCACGCTCTA CTCTGTCCAC ACZATCGTCT GCAGCCACTG AGAGITCTTG TTGGTATCTG AGCTCTTGAT TTGCAAGCAG TGATCTTTTC GGGMTTIGG AAATTAAAAA GGTCTGACftG TGTCTATTTC TACGATACGG GAGACCCACG

    -47CZ 285116 B6

    FIG 5 c

    CAGCAATAAA ACITTATCCG AAGTAGTTCG GCMCGTGGT TCCCAACGAT GGTI3GCICC TCTIMCACr CCATCCGUA CTCftGAM»G GGGATAAIAC AAACGTTCTT CAGTTCGMG CTTTCACCAG AAAAAGGGAA ITTTCAAIAT AcammGA TTTCCCCGAA ATTAACCTAT

    CTCACCGGCT

    AGCGCAGAAG TGTTGCCGGG CGTTGTTGCC TGGCrrCATT CCCATGTTGT CAGAftGTAftG AIAA3TCTCT GAGTACTCAA CTCTTGCCCG

    TAAAAGTGCT

    ATCTTACOSC CTCATCTTCA CftGGAAGGCA IGAAIACTCA TIAITGTCTC AAM3M3GGGT GAAACCMTA GCCCTITO3T

    CCAGATTTAT TGGTCCTGCA AAGCTAGftGT AUTCCTACAG CAGCTCCGGT GCAAAAAAGC TIGGCCGCAG TACIGTCATG CCAftGTCATT GCGTCAATAC CMCATTGGA TGITCAGftTC GCATCTITTA AAATGCCGCA TACTCTTCCT ATGAGCGGAT TCCGCGCACA TEATCATGAC CTICAC

    GGAAGGGCCG GTCTKTTftAT GTTTGCGCAA TCGTTTGGTA TACKTGATCC CGATCGTTGT GCAGCACTGC TGTGACTGGT GACCGAGTIG AGCAGAACTT ACTCTCAAGG GTGCACCCAA TGAGCAAAAA ACGGAAATCT TTTATCAGGG AAAAAIAAAC TCACGTCTAA GWXACGAG

    CCAGCCAGCC CCTCCATČCA CCAGTIAATA GTCACGCTCG CAňGGCGRGT TTCGGICCTC aaGGTTMG GAracrmc TGTATGCGGC CGOGOCaCRT CGGGGCGAAA TAACCQCTC CGTTTCTGGG TAftGGGCGAC TMT3AAGCA AIGTMTIAG AAGIGCCACC AAAAAIAGGC

    -48CZ 285116 B6

    FIG 6

    N250PSN250P29

    T1

    -49CZ 285116 B6

    FIG 7 a

    Xhol

    CTCGAGAAAT CATAAAAAAT ΊΤΑΤΠΌΟΓΓ TGTGAGCGGA TAACAATIAT ECORI

    AAIAGMTCA ATTGIGAGCG GATAACAATT TCACACftGAA TTCATIAAAG

    BamHl Sáli Pstl HindlII

    AGGAGAAATT AACTATGAGG GATCCGTCGA CCTGCAGCCA AGCTTAATEA MetArg AspProSerT hrCysSerGl nAla

    GCTGAGCTIG GACTCCTGIT GATftGATCCA GTAATGACCT CAGAACTCCA TCTGGMTTG TTCAGAACGC TCGGTTGCCG CCGGGCGTTT TTTATTGGTG AGAATCCftAG CTAGCTTGGC GAGATTITCA GGAGCTAAGG AAGCIAAAAT GGAGRAAAAA ATCACTGGAT AIACCACCGT TCAEATATCC CAAIGGCATC GTAPAGAACA TTTTGAGGCA TTTCAGTCAG TTGCTCAATG TACCIMAAC CAGACCGTTC AGCTGGAHAIT TACGGCCTTT TTAAAGACCG TAAAGAAAAA TAAGCACAAG TTTTATCCGG CCITIATTCA CATTCTTCCC CGCCIGATGA ATOCTCATCC GGAATTICGT ATGGCftATGA AAGACGGTGA GCTCGTGAIA TGGGATAGTG TTCACCCTTG TTACACCGIT TTCCATGftGC AAACTGAAAC GTITTCATCG CTCTGGAGTG AATACCACGA CGATTTCCGG CAGTTTCTAC ACATATATTC GCAAGATGTG GCGIGTIACG GTGAAAACCT GGCCTATTTC CCTAAAGGGT TTAITGAGAA TATGTTTTTC GTCTCAGCCA ATCCCTGGGT GftGTTTCACC AGTTTTGATT TftAAOGTGGC CAAIAIGGAC AACITCITCG CCCCCGím CACCAZGGGC ΑΑΑΤΑΊΊΑΤΑ CGCftAGGCGA CAAGGTGCTG ATGCCGCTGG CGATTCAGGT TCATCATCCC GTCTCTGATG GCTTCCATGT CGGCAGAATG CTTAAIGftAT IACAACAGTA CTGCGATGAG TGGCAGGGCG GGGCGTAATT TITTIAAGGC AGTTATTGGT GCCCTTAAAC GCCTGGGGTA ATGACTCTCT AGCTTGAGGC ATCAAATAAA ACGAAAGGCT CftGTCGAAAG ACTGGGCCTT TCGTHTATC TGTTGTTTGT CGGTGAACGC TCTCCTGAGT Xbal

    AGGACAAATC CGCCGCTCTA GftGCTGCCTC GCGCGTTTCG GTGATGACGG

    -50CZ 285116 B6

    TGACACATGC CGGGAGCAGA GGGGCGCAGC TTftACTATGC TGIGAAAIAC TICCGCTTCC GAGCGGTATC GGGGATAACG GAACCGTAAA CTGACGAGCA ACAGGACIAT CTCTCCTGIT CTTCGGGftAG TCGGTGTAGG TCAGCCCGAC CGGTAAGftCA AGCAGAGCGA TAACTACGGC AGCCAOTEAC ACCACCGCTG CAGAAAAAAA ACGCTCAGTG TCAAAAAGGA ATCAATCTAA TAATCAGTGA GCTGCCTGAC ATCTGGCCCC

    TGAAAACCTC AAGCGGATGC GGCGGGTGTC GTATACTGGC CCAIATGCGG TCAGGCGCTC CGGCTGCGGC CACAGAATCA AAAAGGCCAG CTCCGCCCCC GCGAAACCCG CCCTCGTGCG GCCTTTCTCC GTATCTCAGT AACCCCCCGT GAGTCCAACC TAACAGGATT AGTGGTGGCC GCTCTGCTGA CGGCAAACAA AGAITACGCG ACGGGGTCTG GATCAGATTA GftAGTTTTAA TACCAATGCT TTCATCCAEA AGGGCHACC b

    GACGGTCACA AGGGCGCGTC TCACGTAGCG CAGATTGTAC CGTAAGGftGA ACTCGCTGCG AAGGCGGTAA CATGTGAGCA TGCTCGCGTT CGACGCTCAA GGCGTTTCCC CGCTTACCGG TCTCAATGCT CAAGCTGGGC TATCCGGTAA CCACTGGCAG CGGTGCTACA GGACAGTATT AGAGITGGIA TTTTTTTGIT AAGMCCITT TCňCGTISAG GATCCTTTTA AGTAAACTTG TCAGCGATCT GTAGATAACT TGATACCGCG

    FIG 7

    AGCTCCCGGA CAAGCCCGTC CAPGACCCAG GGCATCAGAG CGCACAGATG TCGCTCACT3 AGCTCACTCA CAGGAAftGAA AAGGCCGCGT TCACAAAAAT AAAGAIACCA CCGACCCTGC CGTGGCGCTT TCGTTCGCTC CGCTGCGCCT CGACTTATCG GGTATGTAGG TACACTAGAA CTTCGGAAAA GTAGCGGTGG GGATCTCAAG GAACGAAAAC TCTTCACCTA AGTATATATG GGCACCTATC TCCCCGTCGT ACT3CTGCAA

    GCTTGTCTGT AGCGGGTGTT ATAGCGGAGT TGAGAGTGCA AAATACCGCA CTCGGTCTGT TACGGTIATC AAAGGCCAGC ITTCCAIAGG GTCAGAGGTG CCTGGMGCT ATACCTGTCC CACGCTCTAG TGTGTGCACG CTATCGTCTT CAGCCACTGG GAGTTCITCA TGGTATCTGC GCTCTTGATC TGCAAGCftGC GATCTTTTCT GGATTTTGGT AATTAAAAAT GTCTGACAGT GTCTMTTCG ACGA3ACGGG AGACCCACGC

    -51 CZ 285116 B6

    TCACCGGCTC GCGCAGAAGT GTIGCCGGGA GITCTIGCCA GGCTTCATTC CCATGTTGTG AGAAGIAAGT TAATTCTCTT AGIACTCAAC TCTTGCCCGG AAAAGTGCTC TCTTACCGCT TGATCITCAG AGGAAGGCAA GAATACTCAT lATTGTCTCA AATftGGGGTT AAACCATTAI CCCTTTCGTC

    CAGATTTATC GGTCCTGCAA AGCTAGAGTA TTGCTACAGG AGCTCCGGTT CAAAAAAGCG TGGCCGCAGT ACTGTCATGC CAAGTCATTC CGTCAATACG ATCMTGGAA GITGAGATCC CATCTITrAC AATGCCGCAA ACTCTTCCTT TGňGCGGAEA CCGCGCACAT TATCATGACA TTCAC

    FIG 7

    AGCAAKAAC CTmTCCGC AGIAGTTCGC CATCGTGGTG CCCAACGATC ghagctcct GTIATCACTC CATCCGTftftG TGAGAMAGT GGATAATACC AACGTTCTTC AGTTCGATGT TTTCACCAGC AAAAGGGAAT TTTCAATATT CAIMTTGAA TTCCCCGAAA TlftACCTMCA

    C

    CAGCCAGCCG CTCCATCCAG CAGITAMAG TCACGCTCGT AAGGCGAGTT TCGGTCCTCC AIGGTTATGG AIGCTTITCT GTATGCGGCG GCGCCACATA GGGGCGAAAA AACCCACTCG GnTCTGGGT AAGGGCGACA ATTGAAGCAT TGTAITEAGA AGTGCCACCT AAAATAGGCG

    GAAGGGCCGA TCTATTAATT TTTGCGCftAC CCTTTGGTAT ACATGAICCC GATCGTTGTC CAGCACTGCA GTGACTGGTG ACCGAGTTGC GCAGAACTIT CTCTCAftGGA TGCACCCAAC GAGCAAAAAC CGGAAATGTT ITATCAGGGT AAAAIAAACA GACGTCTAAG TATCACGftGG

    -52CZ 285116 B6

    FIG 8

    N250PSN250P29

    -53CZ 285116 B6

    FIG 9 a

    Xhol

    CTCGAGAAAT CAIAAAAAAT ΊΊΑΤΠΟΟΓΤ TGTGAGCGGA TAACAAITAT ECORI

    AATAGATTCA ATTGTGAGCG GAIAACAATT TCACACAGAA ITCATTAAAG BamHI Sáli Pstl HindlII

    AGGASAAATT AACTATGAGG ATCCGTCGAC CTGCAGCCAA GCITAATTAG MetArg HeArgArgP rcAlaAlaLy sLeuAsn

    CXGAGCTTGG ACTCCTGTTG ATAGATCCAG TAATGACCTC AGAACTCCAT CTGGATTIGT TCAGAACGCT CGGTTGCCGC CGGGCGTITT TTATTGGTGA GAATCCAftGC TAGCTIGGCG AQOTTTCAG GAGCIAAGGA AGCTAAAATG GAGAAAAAAA TCACTGGATA TACCACCGTT GAIATATCCC AATCGCATCG TAAAGAACAT TTIGAGGCAT TTCAGTCAGT TGCTCftATOT ACCTKEAACC AGACCGTTCA GCTGGATAIT ACGGCCTTTT TAAAGACCGT AAAGAAAAAT AAGCACAAGT TTTATCCGGC CTTIATTCAC AITCTTGCCC GCCTGATCAA TGCTCATCCG GAATITCGTA TGGCAATGAA AGACGGTGAG CTGGTGATAT GGGATAGTGT TCACCCTTGT TACACCGTTT TCCATGAGCA AACTGAAACG TTTTCATCGC TCTGGAGTGA ATACCACGAC GAUTCCGGC AGZTXCBACA CMMKTTCG CAAGATGTGG CGTGTTACGG TGMAACCTO GCCTATTTCC CTftAAGGGIT TAITGAGAAT ATGITTITCG TCTCAGCCAA TCCCTGGGTG AGTTTCACCA GTTTTGAITT AAACGTGGCC AAZATGGACA ACTTCTTCGC CCCCGTTTTC ACCAIGGGCA AATMTMAC GCAAGGCGAC AAGGTGCTGA TGCCGCTGGC GATTCAGGTT CATCATCCCG TCTCTGATGG CTTCCATGTC GGCAGAATGC TIAATGAATT ACAACAGZkC TGCGATGAGT GGCAGGGCGG GGCGTAATTT TTTTAAGGCA GTTATTGGTG CCCTAAACG CCTGGGGTAA TGÁCTCTCTA GCITGAGGCA TCAAAUAAA CGAAAGGCTC AGTCGAAAGA CTGGGCCTTT CGTTTTATCT GTTGTTTGTC GGTGAACGCT CTCCTGAGTA Xbal

    GGACAAATCC GCCGCTCZAG AGCTGCCTCG CGCGTTTCGG TGATGACGGT

    -54CZ 285116 B6

    GAAAACCTCT AGCGGATGCC GCGGGTGTCG TAEACTGGCT CATATGCGGT CAGGCGCTCT GGCTGCGGCG ACAGAATCAG AAAGGCCAGG TCCGCCCCCC CGAftACCCGA CCTCGTGCGC CCTTTCTCCC TATCTCAGTT ACCCCCCGTT AGTCCAACCC AACAGGATTA GTGGTGGCCT CTCTGCTCAA GGCAAACAAA GATTACGCGC CGGGGTCTGA ATGAGAHAT AAGTTTTAAA ACCAATGCIT TCATCCATAG GGGCTIACCA

    GACACATGCA GGGAGCAGAC GGGCGCAGCC TAACTATGCG GTGAAATACC TCCGCTTCCT AGCGGTATCA GGGATAACGC AACCGTAAAA TGACGAGCAT CAGGÁCTATA TCTCCTGTTC TTCGGGAAGC CGGIGTAGGT CAGCCCGACC GGTAAGACAC GCAGAGCGAG AACTACGGCT GCCAGTTACC CCACCGCTGG AGftAAAAAAG CGCTCAGTGG CAAAAAGGAT TCAATCTAAA AATCAGTGAG CIGCCTGACT TCTGGCCCCA b

    ACGGTCACAG GGGCGCGTCA CACGTftGCGA AGATTOTACT GIAAGGAGAA ctcgctgcgc AGGCGGTAAT ATGTGAGCftA GCTGGCGTTT GACGCTCAAG GCGTTTCCCC GCTTACCGGA CTCAATGCTC AAGCTGGGCT ATCCGGIřAC CACTGGCAGC GGTGCTACAG GACftGTATTT GftGTTGGTftG 'ΓΓΙΤΙΊΰΤΙΤ AGATCCTTTG CACGTTAAGG ATCCTTTTAA GTAAACTTGG CAGCGATCTG TAGATPACTA GATACCGCGA

    FIG 9

    GCTCCCGGAG AAGCCCGTCA ATGACCCAGT GCATCAGAGC GCACAGATGC CGCTCACTGA GCTCACTCAA AGGřAAGAAC AGGCCGCGTT CACAAAAATC AAGftlACCAG CGACCCTGCC GTGGCGCTTT CGTTCGCTCC GCTGCGCCTT GACnATCGC GTMGTOJSGC ACAC1AGAAG TTCGGAAAAA TAGCGGTGGT GATCTCAAGA AACGAAAACT CITCACCTAG GTATATATGA GCACCTATCT CCCCGTCGTG GTGCTGCAAT

    CTTGTCTGTA GCGGGTGTTG TAGCGGAGTG GAGAGTGCAC AAEACCGCAT TCGGTCTGTC ACGGTTATCC AAGGCCAGCA TTCCATAGGC TCAGAGGTGG CTGGAAGCTC TACCTGTCCG ACGCTGTAGG GTGTGCACGA ZATCGTCTTG AGCCACTGGT AGTTCTTGAA GGTATCTGCG CTCITGATCC GCAAGCAGCA ATCTTTTCTA GATTTTGGTC ATTAAAAATG TCTGACAGTT TCTATTTCGT CGATACGGGA GACCCACGCT

    -55CZ 285116 B6

    CACCGGCTCC CGCAGAAGTG TTGCCGGGAA TTGTTGCCAT GCTTCATTCA CATCTTGTGC GAAGTAAGTT AAITCTCTTA GTACTCAACC CTTGCCCGGC AAAGTGCTCA CTEACCGCTG GATCTTCAGC GGftAGGCAAA AATACTCATA AITOTCTCAT ATAGGGGTTC AACCATEATT cctttcgtct

    AGMTIATCA GTCCTGCAAC GCTAGAGTAA TGCTACAGGC GCTCCGGTTC AAAAAAGCGG GGCCGCAGTG CTGTCATGCC AAGTCATTCT GTCAATACGG TCATTGGAAA TTCAGATCCA ATCTTHACT ATCCCGCAAA CTCiTccnT GAGCGGATAC CGCGCACATT ATCATCACAT TCAC c

    AGCCAGCCGG TCCATCCAGT AGTIAATAGT CACGCTCGTC AGGCGAGTTA CGGTCCTCCG TGGTIATGGC TGdTTTCTG TATGCGGCGA CGCCACATAG GGGCGAAAAC ACCCACTCGT TTTCTGGGTG AGGGCGACAC TTGAAGCAIT GTATITAGAA GTGCCACCTG AAATAGGCGT

    FIG 9

    C-CAATAAACC TTTATCCGCC GTAGTTCGCC ATCGTGGTGT CCAACGATCA TTAGCTCCTT TZATCACTCA ATCCGTAAGA GAGftAlftGTG GMAATACCG ACGITCTTCG GTTCGATGTA TTCACCAGCG AAAGGGAATA TTCAATAITA ΑΊΑΙΤΓΟΑΑΓ TCCCCGAAAA TAACCTATAA

    AAGGGCCGAG CTMTAATTG TTGCGCAACG GITTGGTATG CATGATCCCC ATCGTTGTCA AGCACTGCAT TGACTGGTGA CCGftGTTGCT CAGAACTTTA TCTCAAGGAT GCACCCAACT AGCAAAAACA GGAAATGTTG TATCAGGGTT AAAIAAACAA ACGTCTAAGA ATCACGftGGC

    -56CZ 285116 B6

    FIG 10 neo láci

    -57CZ 285116 B6

    FIG 11 a

    HindiII

    AAGCTTCACG CTGCCGCAAG CACTCAGGGC GCAAGGGCTG CTAAA3GAAG CGGAAÚACGT AGAAAGCCAG TCCGCAGAAA CGGTGCTGAC CCCGGATGAA TGTCAGCTAC TGGGCH&TCT GGACAAGGGA AAACGCAAGC GCAAAGAGAA AGCAGGTAGC TIGCAGT3GG CTTACATGGC GATAGCTASA CTGGGCGGTT TTATGGACAG CAAGCGAACC GGAATTGCCA. GCTGGGGCGC CCTCTGGTAA GGTTGGGAAG CCCTGCAAAG TAAACTGGAT GGCTTTCTTG CCGCCAftGGA TCTGATGGCG CAGGGGATCA AGATCIGATC AAGA3ACA3G ATGAGGATCG TTTCGCATGA TTGAACAAGA TGGATTGCAC GCAGGTTCTC CGGCCGCTTG

    Met

    GGTGGAGAGG CTATTCGGCT ATGACTGGGC ACAACAGACA ATCGGCTGCT CTGATGCCGC CGTGTTCCGG CIGTCftGCGC AGGGGCGCCC GCTTCTTTTT GTCAAGACCG ACCTGTCCGG TGCCCTGřAT GAACTGCAGG ACGA3GCAGC GCGGCTATCG TGGCTGGCCA CGACGGGCGT TCCTTGCGCA GCTGTCCTCG ACGTTGTCAC TGAAGCGGGA A33GACTGGC TCCTAITGGG CGAAGTGCCG GGGCAGGATC TCCTGTCATC TCACCITGCT CCTGCCGAGA AAGTATCCAT CATGGCTGAT GCAAIGCGGC GGCTGCMAC GdTGATCCG GCTACCTGCC CATTCGACCA CCAAGCGAAA CATCGCATCG AGCGftGCACG TACTCGGATG GAAGCOGGTC TTGTCGATCA GGMGATCTG GACGftAGAGC ATCAGGGGCT CGCGCCAGCC GAACTGTTCG CCAGGCICAA GGCGCGCATG CCCGACGGCG AGGATCTCGT CGTGACCCAT GGCGATGCCT GCTTGCCGAA TATCATGGTG GAAAATCGCC GCTTTTCTCG ATTCATCGAC TGTGGCCGGC TGGGTGTGGC GGACCGCTAT CAGGACATAG CGTTGGCTAC CCGTGATATT GCTGAAGftGC TTGGCGGCGA ATOGGCTGAC CGCTTCCTCG TGCITEACGG TATCGCCGCT CCCGATTCGC AGCGCATCGC CTTCTATCGC CTTCTTGACG AGITCTTCTG

    Phe AGCGGGACTC TGGGGTTCGA AATGftCCGAC CAAGCGACGC CCAACCTGCC

    -58CZ 285116 B6

    FIG 11 b

    ATCACGAGAT TTCGATTCCA CCGCCGCCIT CTATGAAAGG TTGGGCTTCG GAATCGTTTT CCGGGACGCC GGC1GGATGA TCCTCCAGCG CGGGGATCTC ATGCTGGAGT TCTTCGCCCA CCCCGGGCTC GATCCCCTCG CGAGTIGGTT CAGCTGCTGC CTGAGGCTGG ACGACCTCGC GGAGTTCTAC CGGCAGTGCA AATCCGTCGG CATCCAGGAA ACCAGCAGCG GCTATCCGCG CATCCATGCC Sáli

    CCCGAACTGC AGGAGTGGGG AGGCACGATG GCCGdTTGG TCGACAATTC GCGCTAACIT ACATIAATIG CGTTOCGCTC ACTGCCCGCI TTCCAGTCGG (Gin)

    GAAACCTGTC GTGCCAGCTG CATTAAIGAA TCGGCCAACG CGCGGGGAGA GGCGGITIGC GTATTGGGCG CCAGGGTGGT ΤΊΤΤϋΤΤΤΤΟ ACCAGTCAGA CGGGCAACAG CTGATTGCCC TTCACCGCCT GGCCCTGAGA GAGTTGCAGC AAGCGGTCCA CGCTGGTITG CCCCAGCAGG CGAAAATCCT GTTTGATGGT GGTTAACGGC GGGATATAAC AIGftGCTGTC ITCGGTATCG TCGTATCCCA CTACCGAGAT ATCCGCACCA ACGCGCAGCC CGGACTCGGT AAIGGCGCGC ATTGCGCCCA GCGCCATCTC ATCGTTGGCA ACCAGCATCG CAGTGGGAAC GATGCCCTCA TTCAGCAITT GCAIGGTTTG TTGAAAACCG GACATGGCAC TCCAGTCGCC TTCCCGTTCC GCTATCGGCT GAATTTGATT GCGftGTGftGA TATTTATGCC AGCCAGCCAG ACGCAGACGC GCCGAGACAG AACTIAATGG GCCCGCTAAC AGCGCGAITT GCTGGTGACC CAATGCGACC AGATGCTCCA CGCCCAGTCG CGTACCGTCT TCATGGGAGA AAATAATACT GITGATGGCT GTCTGGTCftG AGACATCAAG AANBACGCC GGAACMTAG TGCAGGCAGC TTCCACAGCA ATCGCftTCCT GGTCATCCAG CGGATAGTIA ATGATCAGCC CACTGACGCG TTGCGCGAGA AGATTGTGCA CCGCCGCTTT ACAGGCTTCG ACGCCGCTTC GITCTACCAT CGACACCACC ACGCTGGCAC CCAGTTGATC GGCGCGAGAT TlftATCGCCG CGACAATTTG CGACGGCGCG TCCAGGGCCA GACTCGAGGT GGCAACGCCA ATCAGCAACG ACTGTITCCC CGCCAGTTGT

    -59CZ 285116 B6

    FIG 11 c

    TGTGCCACGC GGTTGGGAAT GTAATTCAGC TCCGCCATCG CCGCTTCCAC TmTCCCGC GITITCGCAG AAACGTGGCT GGCCPOGITC ACCACGCGGG AAACGGTCTG ATAAGAGACA CCGGCATACT CTGCGACATC GTATAACGTT ACTGGTTTCA CATTCACCAC CCTGAAITGA CTCTCTTCCG GGCGCTATCA (Me t)

    IGCCATACCG CGAAAGGTTT TGCACCATTC GATGGTGTCA ACGTAAATGC Sáli

    ATGCCGCITC GCCITCGCGC GCGAATIGTC GACCCTGTCC CTCCTGTTCA GCTACTCACG GGGTGGTGCG TAACGGCAAA AGCACCGCCG GACATCAGCG CTAGCGGAGT GTATACTGGC TTACTATGTT GGCACTGATG AGGGTGTCAG TGAAGTGCTT CATGTGGCAG GAGAAAAAAG GCTGCACCGG TGCGTCAGCA GAATATGTGA TACAGGATAT ATTCCGCTTC CTCGCTCACT GACTCGCTAC GCTCGGTCGT TCGACTGCGG CGAGCGGAAA TGGCTIACGA ACGGGGCGGA GATITCCTGG AAGATGCCAG GAAGATACTT AACftGGGAAG TGAGftGGGCC GCGGCAAAGC CGTTTTTCCA TAGGCTCOGC CCCCCTGACA AGCATCACGA AATCTGACGC TCAAATCAGT GGTGGCGftAA CCCGACAGGA CTAIAAAGM ACCAGGCGTT TCCCCTGGCG GCTCCCTCGT GCGCTCTCCT GITCCTGCCT TTCGGTITAC CGGTGTCA1T CCGCTGTTAT GGCCGCGTTT GTCTCATTCC ACGCCTGACA CTCAGTTCCG GGTAGGCAGT TCGCTCCAAG CTGGACTGIA TGCACGAACC CCCCGTTCAG TCCGACCGCT GCGCCTLATC CGGTAACTAT CGTCTTGAGT CCAACCCGGA AAGACATGCA AAAGCACCAC TGGCAGCAGC CACTGGTAAT TGATTTAGftG GAGTZAGTCT TGAAGTCATG CGCCGGITAA GGCTAAACTG AAAGGACAAG THTGGTGAC TGCGCTCCTC CAAGCCAGTT ACCTCGGTTC AAAGAGTTGG TAGCTCAGAG AACCTTCGAA AAACCGCCCT GCAAGGCGGT TTTTTCGTIT TCAGAGCAAG AGATTACGCG CAGACCAAAA CGATCTCAAG AAGATCATCT TATTAATCAG ATAAAAIATT TCTAGAITTC AGTGCAATTT ATCTCTTCAA ATGTAGCACC TGAAGTCAGC CCCATACGAT ATAAGTTGTT AATTCTCATG TTTGACAGCT TATCATCGAT

    -60CZ 285116 B6

    FIG 12

    -61 CZ 285116 B6

    FIG 13

    -62CZ 285116 B6

    FIG 14 a

    TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCA

    1--------4----------+----------1-----------1----------4----------4- gQ

    AGCGCGCAAAGCCACTACTGCCACTTTTGGAGACTGTGTACGTCGAGGGCCTCTGCCAGT

    CAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTG ---------₊---------₊---------+---------₊---------₊---------_{+ 12}0 GTCGAACAGACATTCGCCTACGGCCCTCGTCTGTTCGGGCAGTCCCGCGCAGTCGCCCAC

    TTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGC ---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---.------_{+ 180} AACCGCCCACAGCCCCGACCGAATTGATACGCCGTAGTCTCGTCTAACATGACTCTCACG

    ACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCC ----------1-----------1-----------1-----------1-----------1-----------_F 240 TGGTATACGCCACACTTTATGGCGTGTCTACGCATTCCTCTTTTATGGCGTAGTCCGCGG

    ATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTAT ----------1-----------[----------4-----------1-----------1-----------μ 300 TAAGCGGTAAGTCCGACGCGTTGACAACCCTTCCCGCTAGCCACGCCCGGAGAAGCGATA

    TACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGT ----------1-------— 1----------4—---------1-----------1· —---------μ 360 ATGCGGTCGACCGCTTTCCCCCTACACGACGTTCCGCTAATTCAACCCATTGCGGTCCCA

    TTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTAGCTTTTGCGATCAATA ---------4----------4----------4----------4----------4----------+ 420 AAAGGGTCAGTGCTGCAACATTTTGCTGCCGGTCACGGTTCGATCGAAAACGCTAGTTAT

    AACTGGATCACAACCAGTATCTCTTAACGATGTTCTTCGCAGATGATGATTCATTTTTTA ---------+---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. 4Q0

    TTGACCTAGTGTTGGTCATAGAGAATTGCTACAAGAAGCGTCTACTACTAAGTAAAAAAT

    AGTATTTGGCTAGTCAAGATGATGAATCTTCATTATCTGATATATTGCAAATCACTCAAT ---------₊---------.4.---------4.---------4.---------4.---------4. 54Q TCATAAACCGATCAGTTCTACTACTTAGAAGTAATAGACTATATAACGTTTAGTGAGTTA

    ATCTAGACTTTCTGTTATTATTATTGATCCAATCAAAAAATAAATTAGAAGCCGTGGGTC ---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. 500 TAGATCTGAAAGACAATAATAATAACTAGGTTAGTTTTTTATTTAATCTTCGGCACCCAG

    ATTGTTATGAATCTCTTTCAGAGGAATACAGACAATTGACAAAATTCACAGACTTTCAAG --------------1--------——4-—————-----h----————4—·————————4- 660 TAACAATACTTAGAGAAAGTCTCCTTATGTCTGTTAACTGTTTTAAGTGTCTGAAAGTTC

    -63 CZ 285116 B6

    FIG 14 b

    ATTTTAAAAAACTGTTTAACAAGGTCCCTATTGTTACAGATGGAAGGGTCAAACTTAATA ----------1----------4-----------1-----------1-----------1-----------1- 720 TAAAATTTTTTGACAAATŤGTTCCAGGGATAACAATGTCTACCTTCCCAGTTTGAATTAT

    AAGGATATTTCTTCGACTTTGTGATTAGTTTGATGCGATTCAAAAAAGAATCCTCTCTAG ---------₊---------₊---------+---------+---------+---------+ 7SQ TTCCTATAAAGAAGCTGAAACACTAATCAAACTACGCTAAGTTTTTTCTTAGGAGAGATC

    CTACCACCGCAATAGATCCTGTTAGATACATAGATCCTCGTCGCAATATCGCATTTTCTA ---------₊---------₊---------+---------₊---------₊---;------₊ 34Q

    GATGGTGGCGTTATCTAGGACAATCTATGTATCTAGGAGCAGCGTTATAGCGTAAAAGAT

    ACGTAGTGGATATATTAAAGTCGAATAAAGTGAACAATAATTAATTCTTTATTGTCATCA ---------4----------+---------+---------₊---------+----------+ 90Q TGCATCACCTATATAATTTCAGCTTATTTCACTTGTTATTAATTAAGAAATAACAGTAGT

    TGAACGGCGGACATATTCAGTTGATAATCGGCCCCATGTTTTCAGGTAAAAGTACAGAAT ---------₊---------₊---------₊---------+---------₊---------₊ ggQ ACTTGCCGCCTGTATAAGTCAACTATTAGCCGGGGTACAAAAGTCCATTTTCATGTCTTA

    TAATTAGACGAGTTAGACGTTATCAAATAGCTCAATATAAATGCGTGACTATAAAATATT ---------₊---------+---------+---------+---------+---------₊ 1020 ATTAATCTGCTCAATCTGCAATAGTTTATCGAGTTATATTTACGCACTGATATTTTATAA

    CTAACGATAATAGATACGGAAGGGGACTATGGACGCATGATAAGAATAATTTTGAAGCAT ---------4----------+---------₊---------₊---------₊---------₊ 1080 GATTGCTATTATCTATGCCTTCCCCTGATACCTGCGTACTATTCTTATTAAAACTTCGTA

    TGGAAGCAACTAAACTATGTGATGTCTTGGAATCAATTACAGATTTCTCCGTGATAGGTA ----------j-----------1-----------1-----------1---------——μ----------μ H40 ACCTTCGTTGATTTGATACACTACAGAACCTTAGTTAATGTCTAAAGAGGCACTATCCAT

    TCGACATCTATATACTATATAGTAATACCAATACTCAAGACTACGAAACTGATACAATCT ---------₊---------₊---------₊---------4----------₊— -------₊ 1200 AGCTGTAGATATATGATATATCATTATGGTTATGAGTTCTGATGCTTTGACTATGTTAGA

    CTTATCATGTGGGTAATGTTCTCGATGTCGAATAGCCATATGCCGGTAGTTCGCATATAC ---------₊---------₊---------₊---------₊---------+---------₊ 1260

    GAATAGTACACCCATTACAAGAGCTACAGCTTATCGGTATACGGCCATCAAGCGTATATG

    ATAAACTGATCACTAATTCCAAACCCACCCGCTTTTTATAGTAAGTTTTTCACCGATAAA ----------1-----------μ-------—— +———-------1----------4-----------1320

    TATTTGACTAGTGATTAAGGTTTGGGTGGGCGAAAAATATCATTCAAAAAGTGGCTATTT

    -64CZ 285116 B6

    FIG 14 c

    TAATAAATACAATAATTAATTTCTCGTAAAAGTAGAAAATATATTCTAATTTATTGCACG ---------₊---------+---------₊---------₊---------₊---------_{+ 1380} ATTATTTATGTTATTAATTAAAGAGCATTTTCATCTTTTATATAAGATTAAATAACGTGC

    GTAAGGAAGTAGAATCATAAAGAACAGTCAGATCGGGAATTCGGCTTTTGCGTCGGAGAT

    ---------₊---------+---------+---------+---------₊---------_{+ 144}Q

    CATTCCTTCATCTTAGTATTTCTTGTCAGTCTAGCCCTTAAGCCGAAAACGCAGCCTCTA

    AGTCGTTGTGTGTTTGCGCGATCACCCGCGAACTTCTCTACCAACTGAAAATGGCTAAGT ---------₊---------+---------+---------+---------₊---;------_{+ 15}QQ

    TCAGCAACACACAAACGCGCTAGTGGGCGCTTGAAGAGATGGTTGACTTTTACCGATTCA

    M A K S

    CTATGCTTTCTGGAATTGTTTTTGCTGGTCTTGTTGCTGCTGCAGCGGCCAGTTCGGCCA

    ---------+---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ 1560

    GATACGAAAGACCTTAACAAAAACGACCAGAACAACGACGACGTCGCCGGTCAAGCCGGT

    MLSGIVFAGLVAAAAASSAN

    ACAGCGCCGCCAACGTCTCCGTTTTGGAGAGTGGGCCCGCTGTGCAGGAAGTGCCAGCGC ---------₊---------+---------+---------+---------₊---------_{+ 1620}

    TGTCGCGGCGGTTGCAGAGGCAAAACCTCTCACCCGGGCGACACGTCCTTCACGGTCGCG

    SAANVSVLESGPAVQEVPAR

    GCACGGTCACAGCTCGCCTGGCGAAGCCTTTGCTGCTTCTTTCTGCTCTTGCTGCGACTT

    ---------+----------μ----------1-----------i-----------1-----------1- 1680

    CGTGCCAGTGTCGAGCGGACCGCTTCGGAAACGACGAAGAAAGACGAGAACGACGCTGAA

    TVTARLAKPLLLLSALAATL

    TGGCAGCAGCTTTCCTCGTTTTGCAATGCTTCAACAGCATCTCCAGCAACAACCAGCAAA ----------p----—————h-----------1-----------1-----------1-----------1- 1740

    ACCGTCGTCGAAAGGAGCAAAACGTTACGAAGTTGTgGTAGAGGTCGTTGTTGGTCGTTT

    AAAFLVLQCFNTISSNNQQT

    CCAGCGTCAGGAGACTGGCCGCCGGAGGTGCATGCGGAGATGAGGAAGATGCAGATGAGG ---------₊---------₊---------+---------+---------₊---------+ 1800

    GGTCGCAGTCCTCTGACCGGCGGCCTCCACGTACGCCTCTACTCCTTCTACGTCTACTCC

    SVRRLAAGGACGDEEDADEG

    GAACTTCACAGCAGGCCAGCCGGAGGAGGAGAAAACCTGATACCCCTGCAGCAGATAAAT ---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ 1860

    CTTGAAGTGTCGTCCGGTCGGCCTCCTCCTCTTTTGGACTATGGGGACGTCGTCTATTTA

    TSQQASRRRRK PDTPAADKY

    -65CZ 285116 B6

    FIG 14 d

    ACGATTTTGTTGGCGGAACTCCAGTTTCGGTCACTGAGCCGAATGTTGATGAAGTCCTTA ---------₊---------₊---------₊---------+---------₊---------₊ 1920

    TGCTAAAACAACCGCCTTGAGGTCAAAGCCAGTGACTCGGCTTACAACTACTTCAGGAAT

    DFVGGTPVSVTEPNVDEVLI tccaaattagaaataaacaaatctttttgaagaacccatggactggacaagaagaacaag

    ---------₊---------+---------+---------+---------+---------+ 1980 aggtttaatctttatttgtttagaaaaacttcttgggtacctgacctgttcttcttgttc

    QIRNKQIFLKNPWTGQEEQV ttctagtactggaacgacaaagtgaagaacccattctgattgtggcgaggacaagacaaa

    ---------₊---------+---------+---------+--------—--------+ 2040 aagatcatgaccttgctgtttcacttcttgggtaagactaacaccgctcctgttctgttt

    LVLERQSEEPILIVARTRQT CACTTGAAGGATATCTTGGTAGTCAAGCTCTTGCACAGGACGGAAAGACTGCTAAAGAAG ---------₊---------+---------+---------+---------+---------+ 2100

    GTGAACTTCCTATAGAACCATCAGTTCGAGAACGTGTCCTGCCTTTCTGACGATTTCTTC

    LEGYLGSQALAQDGKTAKEE

    AGAAAGTTGAAGGAGGCAAAACTCACAGAAGATATAAAGTCAAGAGCAGCGACCCAGGAT ----------1-----------μ__—,-------1-----------μ-----2160

    TCTTTCAACTTCCTCCGTTTTGAGTGTCTTCTATATTTCAGTTCTCGTCGCTGGGTCCTA

    KVEGGK THRRYKVKSSDPGY

    ATGGATTCCCATACACCACGGTGCTCGACGGGGTTCCTGTGGGAACAGACGAAGACGGAT ---------₊---------₊-----·----+---------₊---------+---------₊ 2220

    TACCTAAGGGTATGTGGTGCCACGAGCTGCCCCAAGGACACCCTTGTCTGCTTCTGCCTA

    GFPYTTVLDGVPVGTDEDGY

    ACGTCGTCGAAGTTCTTATGAAAACCGGACCCCATGGAGGAGTCGACATGATGACTAGCA ---------₊---------₊---------+---------+---------3----------+ 2280

    TGCAGCAGCTTCAAGAATACTTTTGGCCTGGGGTACCTCCTCAGCTGTACTACTGATCGT

    VVEVLMKTGPHGGVDMMTST

    CAGCATCACAAGGAAAATTCTGCGGAGTGCTTATGGATGACGGAAAAGGAAACCTAGTCG ---------₊---------₊---------+---------₊---------₊---------₊ 2340

    GTCGTAGTGTTCCTTTTAAGACGCCTCACGAATACCTACTGCCTTITCCTTTGGATCAGC

    ASQGKFCGVLMDDGKGNLVD

    ATGGACAAGGGAGAAAAATTACCGCCGTTATCGGCATGCTAACTCAACCGGATACCGAGT ---------₊---------₊---------+---------+---------+---------+ 2400

    TACCTGTTCCCTCTTTTTAATGGCGGCAATAGCCGTACGATTGAGTTGGCCTATGGCTCA

    GQGRKITAVIGMLTQPDTEF

    -66CZ 285116 B6

    FIG 14 e

    TTAGAAGCGGACCAGGAGACGACGAGGACGACGAGTGAGTGAGCGGAGTTGGCTTTTGTC

    --------—-i-------———+—————-----H----——————--------l·————------ř 2460

    AATCTTCGCCTGGTCCTCTGCTGCTCCTGCTGCTCACTCACTCGCCTCAACCGAAAACAG

    RSGPGDDEDDECCTGTTGATGCCGTTGCCCACTTTCGCAGCTTGCTTGTTTCCTGGGCTTGCCTGTGCCGC ---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ 2520

    GGACAACTACGGCAACGGGTGAAAGCGTCGAACGAACAAAGGACCCGAACGGACACGGCG

    GACATGCGCTTGGCGTTCCGCCTGAGTTCTTTCGGACTGTTTTAACTTTTAATTCATTTT ---------₊---------₊---------+---------+--------—------₊ 2580 CTGTACGCGAACCGCAAGGCGGACTCAAGAAAGCCTGACAAAATTGAAAATTAAGTAAAA

    CTACTGCGGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACCGAATTCTGTGAGCGTATG ---------+---------+---------+---------+---------₄----------+ 2640 GATGACGCCGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCTTAAGACACTCGCATAC

    GCAAACGAAGGAAAAATAGTTATAGTAGCCGCACTCGATGGGACATTTCAACGTAAACCG ---------+---------₊---------+---------₊---------₊---------₊ 2700 CGTTTGCTTCCTTTTTATCAATATCATCGGCGTGAGCTACCCTGTAAAGTTGCATTTGGC

    TTTAATAATATTTTGAATCTTATTCCATTATCTGAAATGGTGGTAAAACTAACTGCTGTG ---------₊---------4---------₊---------4.---------₊---------₊ 2760 AAATTATTATAAAACTTAGAATAAGGTAATAGACTTTACCACCATTTTGATTGACGACAC

    TGTATGAAATGCTTTAAGGAGGCTTCCTTTTCTAAACGATTGGGTGAGGAAACCGAGATA ---------₊---------₊---------+---------+---------₊---------4. 2820 ACATACTTTACGAAATTCCTCCGAAGGAAAAGATTTGCTAACCCACTCCTTTGGCTCTAT

    GAAATAATAGGAGGTAATGATATGTATCAATCGGTGTGTAGAAAGTGTTACATCGACTCA ---------₊---------₊---------₊---------+---------₊---------+ 2880 CTTTATTATCCTCCATTACTATACATAGTTAGCCACACATCTTTCACAATGTAGCTGAGT

    TAATATTATATTTTTTATCTAAAAAACTAAAAATAAACATTGATTAAATTTTAATATAAT ---------4----------₊---------+---------+---------₊---------₊ 2940 attataatataaaaaatagattttttgatttttatttgtaactaatttaaaattatatta acttaaaaatggatgttgtgtcgttagataaaccgtttatgtattttgaggaaattgata ---------₊---------+---------4----------4----------+---------+ 3000 tgaatttttacctacaacacagcaatctatttggcaaatacataaaactcctttaactat atgagttaaattacgaaccagaaagtgcaaatgaggccgcaaaaaaactgccgtatcaag ---------₊---------₊---------+---------+---------4----------4- 3050 tactcaatttaatgcttggtctttcacgtttactccggcgtttttttgacggcatagttc

    -67CZ 285116 B6

    FIG 14 f

    GACAGTTAAAACTATTACTAGGAGAATTATTTTTTCTTAGTAAGTTACAGCGACACGGTA

    ---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ 3120

    CTGTCAATTTTGATAATGATCCTCTTAATAAAAAAGAATCATTCAATGTCGCTGTGCCAT

    TATTAGATGGTGCCACCGTAGTGTATATAGGATCTGCTCCCCGTAATCATGGTCATAGCT ——--------1-------———————+—---------1-----------b------— l· 3180

    ATAATCTACCACGGTGGCATCACATATATCCTAGACGAGGGGCATTAGTACCAGTATCGA

    GTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCAT ---------₊---------+---------+---------₊-------—+_—------+ 3240 CAAAGGACACACTTTAACAATAGGCGAGTGTTAAGGTGTGTTGTATGČTCGGCCTTCGTA

    AAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTC ---------₊--------—₊---------₊---------₊---------₊---------+ 3300 TTTCACATTTCGGACCCCACGGATTACTCACTCGATTGAGTGTAATTAACGCAACGCGAG

    ACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACG ---------4----------+---------4----------4----------4----------4. 3360 TGACGGGCGAAAGGTCAGCCCTTTGGACAGCACGGTCGACGTAATTACTTAGCCGGTTGC

    CGCGGGGAGAGGCGGŤTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCT ---------4----------4----------+---------4----------4----------4- 3420

    GCGCCCCTCTCCGCCAAACGCATAACCCGCGAGAAGGCGAAGGAGCGAGTGACTGAGCGA

    GCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTT ---------4.---------4----------4----------4----------4.---------4. 3430 CGCGAGCCAGCAAGCCGACGCCGCTCGCCATAGTCGAGTGAGTTTCCGCCATTATGCCAA

    ATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGC -------—₊---------4.---------₊---------4.---------4.---------4. 354Q TAGGTGTCTTAGTCCCCTATTGCGTCCTTTCTTGTACACTCGTTTTCCGGTCGTTTTCCG

    CAGGAACCGTAAAAAGGČCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGA --------:_4----------4.---------4.---------4.---------4.---------4. 3600 GTCCTTGGCATTTTTCCGGCGCAACGACCGCAAAAAGGTATCCGAGGCGGGGGGACTGCT

    GCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATA ------ —b—————————4——————-----1-----------f------——f—————————4. 3660 CGTAGTGTTTTTAGCTGCGAGTTCAGTCTCCACCGCTTTGGGCTGTCCTGATATTTCTAT

    CCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTAC ---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. 3720 GGTCCGCAAAGGGGGACCTTCGAGGGAGCACGCGAGAGGACAAGGCTGGGACGGCGAATG

    -68CZ 285116 B6

    FIG 14 g

    CGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTG

    ----------1-----------)-----------1-----------1-----------1-----------1- 3780

    GCCTATGGACAGGCGGAAAGAGGGAAGCCCTTCGCACCGCGAAAGAGTTACGAGTGCGAC

    TAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCC —-------₊---------₊---------₊---------+-----,----+---------+ 3840

    ATCCATAGAGTCAAGCCACATCCAGCAAGCGAGGTTCGACCCGACACACGTGCTTGGGGG

    CGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAG ---------₊---------₊---------+---------₊---------₊—-------+ 3900

    GCAAGTCGGGCTGGCGACGCGGAATAGGCCATTGATAGCAGAACTCAGGTTGGGCCATTC

    ACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGT ----------i-----------1---------—+—————---—+————————f---——————+ 3960

    TGTGCTGAATAGCGGTGACCGTCGTCGGTGACCATTGTCCTAATCGTCTCGCTCCATACA

    AGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGT ----------1-----------]-----------1-----------1-----------1-----------J- 4020 TCCGCCACGATGTCTCAAGAACTTCACCACCGGATTGÁTGCCGATGTGATCTTCCTGTCA

    ATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTG ---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------4. 4080 TAAACCATAGACGCGAGACGACTTCGGTCAATGGAAGCCTTTTTCTCAACCATCGAGAAC

    ATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTAC ---------4----------4.---------4.---------₊---------4.---------4. 4140

    TAGGCCGTTTGTTTGGTGGCGACCATCGCCACCAAAAAAACAAACGTTCGTCGTCTAATG

    GCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCA ---------4.---------4----------4----------4----------4----------4- 4200

    CGCGTCTTTTTTTCCTAGAGTTCTTCTAGGAAACTAGAAAAGATGCCCCAGACTGCGAGT

    GTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCAC

    ----:-----4----------4----------4----------4----------4----------4- 4260

    CACCTTGCTTTTGAGTGCAAT.TCCCTAAAACCAGTACTCTAATAGTTTTTCCTAGAAGTG

    CTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAAC ----------_k----------1--------------1-----------1----------4- 4320

    GATCTAGGAAAATTTAATTTTTACTTCAAAATTTAGTTAGATTTCATATATACTCATTTG

    TTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATT ---------4.---------4.---------4.---------4.---------4.---------4- 4380

    AACCAGACTGTCAATGGTTACGAATTAGTCACTCCGTGGATAGAGTCGCTAGACAGATAA

    -69CZ 285116 B6

    FIG 14 h

    TCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTT ---------₊---------₊---------₊---------₊---------+---------+ 4440 AGCAAGTAGGTATCAACGGACTGAGGGGCAGCACATCTATTGATGCTATGCCCTCCCGAA

    ACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTT —————————4-------—— —d-----------h —-------1-----------h —— — — — — — — + 4500

    TGGTAGACCGGGGTCACGACGTTACTATGGCGCTCTGGGTGCGAGTGGCCGAGGTCTAAA

    ATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATC ----------1----------4.·.——------4. — —4----------4—————----1- 4560

    TAGTCGTTATTTGGTCGGTCGGCCTTCCCGGCTCGCGTCTTCACCAGGACGTTGAAATAG

    CGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAA ---------4-,---------4.---------4.---------4.---------4----------4. 4520

    GCGGAGGTAGGTCAGATAATTAACAACGGCCCTTCGATCTCATTCATCAAGCGGTCAATT

    TAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGG ----------_F—4.——*-----------_F---—----—4.— μ 4590 ATCAAACGCGTTGCAACAACGGTAACGATGTCCGTAGCACCACAGTGCGAGCAGCAAACC

    TATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTT ---------4----------4----------4----------4----------4----------4- 4740

    ATACCGAAGTAAGTCGAGGCCAAGGGTTGCTAGTTCCGCTCAATGTACTAGGGGGTACAA

    GTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGC ---------4----------4----------4.---------4----------4----------4- 4800

    CACGTTTTTTCGCCAATCGAGGAAGCCAGGAGGCTAGCAACAGTCTTCATTCAACCGGCG

    AGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGT ---------4----------4.---------4.---------₊---------4.---------4. 4860

    TCACAATAGTGAGTACCAATACCGTCGTGACGTATTAAGAGAATGACAGTACGGTAGGCA

    AAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCG ---------₊---------4.--------- +---------4.---------4.---------₊ 4920 TTCTACGAAAAGACACTGACCACTCATGAGTTGGTTCAGTAAGACTCTTATCACATACGC

    GCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAAC ---------4----------4----------4.---------4----------4----------4- 4980

    CGCTGGCTCAACGAGAACGGGCCGCAGTTATGCCCTATTATGGCGCGGTGTATCGTCTTG

    TTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACC ---------4----------4----------+---------4----------4----------4- 5040

    AAATTTTCACGAGTAGTAACCTTTTGCAAGAAGCCCCGCTTTTGAGAGTTCCTAGAATGG

    -70CZ 285116 B6

    FIG 14 i

    GCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTT

    ---------₊---------₊---------+---------+---------₊---------₊ 5100

    CGACAACTCTAGGTCAAGCTACATTGGGTGAGCACGTGGGTTGACTAGAAGTCGTAGAAA

    TACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGG --------—P———— — — — 4-----------1----------·—p————————-4— ---------p 5160 ATGAAAGTGGTCGCAAAGACCCACTCGTTTTTGTCCTTCCGTTTTACGGCGTTTTTTCCC

    AATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAG ---------₊---------₊---------₊---------₊---------+— ------₊ 5220 TTATTCCCGCTGTGCCTTTACAACTTATGAGTATGAGAAGGAAAAAGTTATAATAACTTC

    CATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAA ---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊---------₊ 5280 GTAAATAGTCCCAATAACAGAGTACTCGCCTATGTATAAACTTACATAAATCTTTTTATT

    ACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCAT ---------4----------₊---------4.----------p---------₊---------₊ 5340

    TGTTTATCCCCAAGGCGCGTGTAAAGGGGCTTTTCACGGTGGACTGCAGATTCTTTGGTA

    TATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTC ----------1-----------1-----------p---------4-----------p--- 5393 ATAATAGTACTGTAATTGGATATTTTTATCCGCATAGTGCTCCGGGAAAGCAG

    -71 CZ 285116 B6

    FIG 15

    Konec dokumentu