HU211673A9 - Coccidiosis vaccines - Google Patents

Description

A találmány Eimeria protozoa paraziták új antigénjeire vonatkozik. Ez az antigén különböző adagolási módokon keresztül baromfi kokcidiózissal szemben történő megvédésére használható.

A kokcidiózis az Eimeria nemzetséghez tartozó intra- 5 celluláris protozoa paraziták által előidézett baromfibetegség. A kokcidiózis a nagy, intenzív baromfitenyésztő intézményekben járványos méretű megbetegedés és kemoterápiás szerekkel történő kezelése magában az Amerikai Egyesült Államokban évi több mint 100 millió dől- 10 lárt vesz igénybe, a kokcidiózis-ellenes gyógyszerekkel szembeni rezisztencia kialakulása újabb és újabb szerek kifejlesztését igényli. Ismeretes ugyanakkor, hogy új gyógyszerek kikísérletezése és bevezetése egyre költségesebb és egyre kevésbé engedélyeznek gyógyszerma- 15 radványokat az állati takarmányokban.

A természetes kokcidiózis fertőzéssel szembeni védő immunitás bőséges irodalommal rendelkezik. Kisszámú életképes oociszta több héten át naponta történő szabályozott beadása szokásos körülmények 20 között virulens dózisnak megfelelő fertőzéssel szemben teljes immunitást biztosít [Rose et al., Parasitology 73: 25 (1976): Rose et al., Parasitology 88: 199 (1984)]. A fertőzéssel szemben megszerzett rezisztencia alapján lehetőség nyílik fiatal csirkék számára im- 25 munitást biztosító és ezáltal a kémiai kokcidiosztatikumokat kiküszöbölő vakcina előállítására. A Sterwin Laboratories. Opelika, Alabama. (Amerikai Egyesült Államok) ezt az elvet alkalmazta Coccivac^R elnevezésű készítménye kifejlesztésénél. 30

Murray és tsai 167 443 sz. európai szabadalmi bejelentésükben kokcidiózis vakcina készítése céljából Eimeria tenella sporozoitáiból vagy sporulázott oocisztáiból legalább 15 polipeptidet tartalmazó extraktumokat állítottak elő. amelyek közül sok a sporozoita felü- 35 leiéhez kapcsolódott. Az ily módon nyert extraktumok csirkébe befecskendezve a virulens E. tenella sporulázott oociszta orális beadása után kialakult vakbélsérüléseket csökkentették.

Újabb irodalmi helyen (Schenkel és tsai; 4 650 676 40 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) E. tenella merozoiták elleni monoklonális anti-testek termelését írták le. A fenti anti-testek felhasználásával Schenkel és tsai számos olyan antigént azonosítottak, amelyek ellen az anti-testek irányultak. Az E tenella 45 sporozoitákat a fenti anti-testekkel elő-inkubálva, majd az ily módon kezelt sporozoitákat csirkék vakbelébe juttatva Schenkel és tsai azt találták, hogy a vakbél-sérülések a kezeletlen sporozoita kontrollal összehasonlítva bizonyos mértékben csökkentek. 50

Rekombináns DNS módszerek felhasználásával Newman és tsai (164 176 sz. közrebocsátott európai szabadalmi bejelentés) 25 000 dalion tömegű antigént kódoló gént klónoztak sporozoita stádiumban levő Eimeria tenellából. E. tenella sporozoitákkal végzett ismételt immunizálással immunizált csirke szérum jódozott sporocisztákból és sporozoita membrán készítményekből kicsapta ezt az antigént. Újabb közleményben Jenkins [Nucleic Acids Rés. 16 (1988)] olyan cDNS-t írt le, amely egy 250 000 dalton merozoita felületi fehérje egy részét kódolja Eimeria acervalinából. A fenti cDNS kifejezési termékét az organizmus elleni antiszérum felismerte.

A rekombináns DNS technológia terén végzett vizsgálatok újabb megközelítést tettek hozzáférhetővé, nevezetesen az alegység vakcinát. Ilyen alegység vakcinák pl. a 324 648, 337 589 és 344 808 sz. európai közrebocsátási iratokban kerültek ismertetésre.

A jelen találmány tárgya az (1) (SEQ ID NO: 1)

M

A

K

S

M

L

S

G

I

V

F

A

G

L

V

A

A

A

A

A

S

S

A

N

S

A

A

N

V

s

V

L

E

S

G

P

A

V

Q

E

V

P

A

R

T

V

T

A

R

L

A

K

P

L

L

L

L

S

A

L

A

A

T

L

A

A

A

F

L

V

L

Q

c

F

N

I

I

s

S

N

N

Q

<2

T

S

V

R

R

L

A

A

G

G

A

C

G

D

E

E

D

A

D

E

G

T

Ξ

Q

Q

A

S

R

R

R

R

K

P

D

T

P

A

A

D

K

Y

D

F

V

G

G

T

P

V

S

V

T

E

P

N

V

D

E

V

L

I

Q

I

R

N

K

Q

I

F

L

K

N

P

W

T

G

Q

E

E

Q

V

L

V

L

E

R

Q

s

E

E

P

I

L

I

V

A

R

T

R

Q

T

L

E

G

Y

L

G

s

Q

A

L

A

Q

D

G

K

T

A

K

E

E

K

V

E

G

G

K

T

H

R

R

Y

K

V

K

s

s

D

P

G

Y

G

F

P

Y

T

T

V

L

D

G

V

P

V

G

T

D

E

D

G

Y

V

V

E

V

L

M

K

T

G

P

H

G

G

V

D

M

M

T

S

T

A

S

Q

G

K

F

c

G

V

L

M

D

D

G

K

G

N

L

V

D

G

Q

G

R

K

I

T

A

V

I

G

M

L

T

Q

P

D

T

E

F

F

. £

; g ί

p i

G

D

D

E

D

D

E

(SEQ ID NO: 1) aminosav-szekvenciájú immunogén polipeptidek. amelyek pl. csirkében Eimeria paraziták elleni immunválasz kiváltására képesek. Az itt leírt Eimeria merozoita felületi antigén prekurzor szekvenciája az (1) (SEQ ID NO:1) szekvenciának felel meg.

A találmányunk szerinti előnyös polipeptid egy immunogén polipeptid. amely az (1) (SEQ ID NO: 1) képletű aminosav-szekvenciával rendelkezik, azonban a N-terminuson a szignál peptid szekvencia hiányzik. Ajelen találmány továbbá olyan funkcionális ekvivalens polipeptidekre is vonatkozik, amelyeknek az aminosav-szekvenciája a fenti polipeptidéhez képest törlések, beillesztések vagy helyettesítések révén a polipeptid immunológiai tulajdonságainak lényeges megváltoztatása nélkül módosítva lett.

Találmányunk tárgya továbbá az Eimeria merozoita felületi antigén prekurzor fehérjét egészben vagy annak egy részét kódoló DNS, pl. az (A) (SEQ ID NO:2) nukleotid szekvenciát

ATGGCTAAGTCTATGCTTTCTGGAATTGTTTTTGCTGGTCTTGTTGCTGCTGCAGCG

GCCAG'iTCGGCCAACAGCGCCGCCAACGTCTCCGTTTTGGAGAGTGGGCCCGCTGTG

CAGGAAGTGCCAGCGCGCACGGTCACAGCTCGCCTGGCGAAGCCTTTGCTGCTTCTT

TCTGCTCTTGCTGCGACTTTGGCAGCAGCTTTCCTCGTTTTGCAATGCTTCAACATC

ATCTCCAGCAACAACCAGCAAACCAGCGTCAGGAGACTGGCCGCCGGAGGTGCATGC

GGAGATGAGGAAGATGCAGATGAGGGAACTTCACAGCAGGCCAGCCGGAGGAGGAGA

AAACCTGATACCCCTGCAGCAGATAAATACGATTTTGTTGC-CGGAACTCCAGTTTCG

HU 211 673 A9

GTCACTGAGCCGAATGTTGATGAAGTCCTTATCCAAATTAGAAATAAACAAATCTTT

TTGAAGAACCCATGGACTGGACAAGAAGAACAAGTTCTAGTACTGGAACGACAAAGT

GAAGAACCCATTCTGATTGTGGCGAGGACAAGACAAACACTTGAAGGATATCTTGGT

AGTCAAGCTCTTGCACAGGACGGAAAGACTGCTAAAGAAGAGAAAGTTGAAGGAGGC

AAAACTCACAGAAGATATAAAGTCAAGAGCAGCGACCCAGGATATGGATTCCCATAC

ACCACGGTGCTCGACGGGGTTCCTGTGGGAACAGACGAAGACGGATACGTCGTCGAA

GTTCTTATGAAAACCGGACCCCATGGAGGAGTCGACATGATGACTAGCACAGCATCA

CAAGGAAAATTCTGCGGAGTGCTTATGGATGACGGAAAAGGAAACCTAGTCGATGGA

CAAGGGAGAAAAATTACCGCCGTTATCGGCATGCTAACTCAACCGGATACCGAGTTT

AGAAGCGGACCAGGAGACGACGAGGACGACGAGTGA vagy annak egy részéi tartalmazó DNS, pl. egy olyan DNS, amely az (A) (SEQ ID NO:2) szekvenciának megfelelő, azonban a szignál peptid szekvenciát kódoló nukleotid szekvenciát magában nem foglaló (B) nukleotid szekvenciát tartalmazza. Az (A) (SEQ ID NO:2) nukleotid szekvenciát tartalmazó DNS részleges szekvenciájából álló DNS elejére előnyösen egy ATG kodont adunk, az irodalomból jól ismert módszerek alkalmazásával. A találmány tárgya továbbá megfelelő gazdaszervezetben a fenit DNS kifejezésének irányítására képes rekombináns vektor, és a fenti vektorokat tartalmazó mikroorganizmusok.

A találmány tárgya továbbá eljárás a fenti polipeptidek előállítására oly módon, hogy (a) a fenti polipeptideket kódoló nukleotid szekvenciát tartalmazó DNS-t tartalmazó rekombináns vektort magában foglaló mikroorganiuzmust - pl. az (A) (SEQ ID NO:2) nukleotid szekvenciát vagy fragmensét, mint pl. a (B) nukleotid szekvenciát tartalmazó DNS-t tartalmazó rekombináns vektort magában foglaló mikroorganizmust - a DNS szekvencia vagy fragmense kifejezésére alkalmas körülmények között tenyésztünk; és (b) a rekombináns polipeptidet a tenyészetből izoláljuk.

A találmány tárgya továbbá egyedeknek (pl. emberek vagy állatok) kokcidiózissal szemben történő megvédésére szolgáló vakcina, amely hatkékony mennyiségben egy vagy több találmányunk szerinti polipeptidet és fiziológiailag alkalmas hordozóanyagot tartalmaz. Megvédendő egyednek előnyösen szárnyas vagy baromfi (pl. csirke vagy pulyka) alkalmazható. azonban háziállatok (pl. nyúl vagy birka) is felhasználhatók.

A találmány tárgya továbbá egyedeknek kokcidiózissal szemben történő megvédésére szolgáló vakcina, amely a találmányunk szerinti polipeptidet kódoló DNS-t tartalmazó, a fenti DNS kifejezésének előidézésére képes rekombináns vírust és fiziológiailag alkalmas hordozóanyagot tartalmaz.

A találmány tárgya továbbá eljárás egyedeknek kokcidiózissal szemben történő megvédésére oly módon, hogy a kokcidiózis veszélyének kitett egyednek (pl. fiatal szárnyasnak) hatékony mennyiségben találmányunk szerinti vakcinát adunk be.

A találmányunk szerinti Eimeria polipeptidek fontos vakcina antigének, mivel ezeket a polipeptideket a kokcidiózis szervezettel szemben korábban immunizált és immunitást kifejlesztett állatok szérumában levő antitestek azonosítják. Fentiek miatt a találmányunk sze15 rinti polipeptidek baromfi kokcidiózissal szemben történő megvédésében fontos szerepet játszanak.

AZ ÁBRÁK RÖVID ISMERTETÉSE

Az ábrák találmányunk jobb megértésére szolgálnak. Az ábrák magyarázata a következő;

Az 1. ábrán nyúl és csirke immun szérum antigén-kiválasztott antitestek álul felismert, az Eimeria prekurzor fehéijét kódoló 1,2 kb cDNS molekula nukleotid szekvenciáját tüntetjük fel. Az 1. ábrából látható, hogy a fenti prekurzor fehéijét kókoló nukleotid szekvencia a 68 nukleotidnál levő ATG és a 1013 nukleotidnál levő TAA stop kodon (315 aminosavat kódol) között helyezkedik el. Az 1. ábrán továbbá az Eimeria prekurzor fehéijének a nukleotid szekvencia alapján várható aminosav szekvenciáját tüntetjük fel. A nukleotidok és aminosavak jelölésére standard egybetűs rövidítéseket alkalmazunk. A fenti rövidítések jelentése sundard biokémiai kézikönyvekben Ulálható [lásd pl. Leihninger: Principles of Biochemistry, (1984), Worth Publisher, Inc., New York, 96, 798 oldal],

A 2. ábrán különböző Eimeria merozoiu fehérjék SDS-PAGE analízisének eredményeit tüntetjük fel. Az A-mezőn kontroll (a) vagy anti-testek álul kiválasztott (b) anti-testek álul megvizsgált teljes merozoiu fehérjék immunobiot elemzését mutatjuk be. Az A-mezőben levő nyíl a kb. 23 kilodalton molekulatömegű fehérjét tartalmazó sáv helyzetét jelzi. AB-mezőn kontroll (a) vagy anti-testek álul kiválasztott (b) antitestek álul immunológiai úton kicsapott ¹²⁵I-felületileg jelzett merozoiu fehérjék autoradiogramját mutatjuk be. A 0-mezőn merozoiu poly A mRNS-ek in vitro transzlációjával készített termékek (c), lambda 5-7 klónok felhasználásával szelekUlt anti-testekkel immunológiailag kicsapott transzlációs termékek (b), anti-merozoita szérummal szemben reakcióképes fehérjéket termelő más fág klón felhasználásával szelektált anti-testek (a) és merozoita szérumból nem rekombináns fággal szelektált kontroll anti-testek (d) teljes keverékét muUtjuk be. A sávokat fluorográfia segítségével tesszük láthatóvá. A meghatározott molekulatömegű [kilodaltonban (kDA)] markerek helyzetét az ábra jobb oldalán tüntetjük fel.

A 3. ábrán PvuII (1. sáv), HincII (2. sáv) PstI (3. sáv), Sphl (4. sáv) vagy SacI (5. sáv) által emésztett Eimeria tenella sporulázott oociszta genom DNS „Southern Biot” analízisét tüntetjük fel. Mintaként az alábbiakban leírt 5-7 gén EcoRI inzertet alkalmazzuk. A megjelölt nagyságú (kb-ben) standard DNS-ek helyzetét az ábra jobboldalán tüntetjük fel.

A 4. ábrán a pDS56/RBSlI plazmid vázlatos rajzát

HU 211 673 A9 mutatjuk be. ezen a rajzon, valamint a 6., 8. és 10. ábrán a Β, E, Η, P, S, X és Xb rövidítések és szimbólumok a BamHI, EcoRI, HindlII, PstI, Sáli, Xhol és Xbal restrikciós enzimek hasítási helyeit jelölik.

tor/operator elemet jelöli; | g * *| a RBSII, RBSII(-l) és RBSII(-2) riboszómás kötődési helyeket jelzi; -> a fenti riboszómás kötődési helyek ellenőrzése alatt levő kódoló tartományokat jelöli; || ||||]|] a t₀ és ti terminátorokat jelöli; í=^»a E. coliban történő DNS replikádéhoz (repl) szükséges tartományt jelöli; a kloramfenikol-acetil-transzferázt (cat) és beta-laktamázt (bla) jelöli.

Az 5. ábrán a pDS56/RBSII plazmid teljes nukleotid szekvenciáját tüntetjük fel. Ebben a szekvenciában a 4. ábrán bemutatott restrikciós enzim felismerő szekvenciáit tüntetjük fel. A bemutatott aminosav-szekvencia az RBSII riboszómás kötődési hely ellenőrzése alatt levő nyílt leolvasó keretet jelöli.

A 6. ábrán a pDS56/RBSII(-l) plazmidot vázlatosan mutatjuk be.

A 7. ábrán a pDS56/RBSH(-l) plazmid teljes nukleotid szekvenciáját tüntetjük fel. Ebben a szekvenciában a 6. ábrán feltüntetett restrikciós enzimek felismerési szekvenciáit tüntetjük fel. A bemutatott aminosavszekvencia az RBSII(-) riboszómás kötődési hely ellenőrzése alatt levő nyitott leolvasó keretet mutatja be.

A 8. ábrán a pDS56/RBSII(-2) plazmidot vázlatosan ábrázoljuk.

A 9. ábrán a pDS56/RBSII(-2) plazmid teljes nukleotid szekvenciáját tüntetjük fel. Ebben a szekvenciában a 8. ábrán feltüntetett restrikciós enzimek felismerési szekvenciáit jelöljük meg. A bemutatott aminosavszekvencia az RBSII(-2) riboszómás kötődési hely ellenőrzése alatt levő nyílt leolvasó keretet mutatja be.

A 10. ábrán a pDMI.l plazmidot vázlatosan ábrázoljuk. A szimbólumok és rövidítések jelentése a 4. ábránál megadott, azonban jelentése a lac represszort (lacl), illetve neomicin-foszfotranszferázt (neo) kódoló tartományok.

A 11. ábrán - azaz a 11A., 11B. és 1 IC. ábrán - a pDMI. 1 plazmid teljes nukleotid szekvenciáját mutatjuk be. Ebben a szekvenciában a 10. ábrán feltüntetett restrikciós enzimek felismerési szekvenciáit jelöljük. A bemutatott aminosavak a neomicin-foszfotranszferzái (Met-Phe) és a lac represszort (Met-Gln; a gén fordított orientációja figyelembe veendő) kódoló nyílt leolvasó kereteket foglalják magukban.

A 12. ábrán a pUC8-TK-7.5K plazmid sematikus rajzát mutatjuk be. Ebben a diagramban, valamint a 13. és 15. ábrán a TK rövidítés a tehénhimlő vírus timidin kináz gén szekvenciáját jelenti; 7,5K a tehénhimlő vírus 7.5K promotorját jelenti; lac Z a beta-galaktozidáz gén N-tcrminusa egy részének szabályozó szekvenciáját és kódoló információját tartalmazza; őri az E. coliban történő DNS replikációhoz szükséges tartományt jelenti; és AmpR jelentése a beta-laktamáz gén kódoló tartománya.

A 13. ábrán a pR3 rekombináns plazmid sematikus rajzát mutatjuk be.

A 14. ábrán a pR3 rekombináns plazmid teljes nukleotid szekvenciáját tüntetjük fel. A bemutatott aminosav szekvencia a tehénhimlő 7,5K promotor ellenőrzése alatt levő nyitott leolvasó keretet képvisel.

A 15. ábrán a pR4 plazmid sematikus rajzát tüntetjük fel. ML a malária leader szekvenciáját jelenti.

A TALÁLMÁNY LEÍRÁSA

A leírásban idézett hivatkozások teljes kitanítása figyelembe veendő a jelen szabadalmi leírás értelmezésénél.

Az alábbiakban a jelen szabadalmi leírásban foglalt definíciókat értelmezzük;

Az „Eimería felületi antigén” kifejezésen SDS-PAGE meghatározás szerint kb. 23 kilodalton látszólagos molekulatömegű, Eimeria tenella merozoita stádiumában jelen levő fehérje értendő. Ezt a fehérjét valószínűleg az 1. ábrán feltüntetett nukleotid szekvenciával rendelkező gén in vivő kifejezési termékének poszttranszlációs feldolgozásával nyerjük.

A „prekurzor fehérje” kifejezés SDS-PAGE meghatározás szerint kb. 33 kilodalton látszólagos molekulatömegű fehérjét jelöl. Ezt a fehérjét feltételezésünk szerint az Eimeria felületi antigén in vivő proteolízisével nyerjük. A fenti fehérjét kódoló cDNS molekula nukleotid szekvenciáját és az annak alapján várható aminosav szekvenciát az 1. ábrán tüntetjük fel.

Az „(1) aminosav-szekvenciát tartalmazó, Eimeria parazitákkal szemben immunválasz kiváltására képes immunogén polipeptidek” kifejezésen az immunogén polipeptidek szekvenciáinak megfelelő merozoita felületi antigént tartalmazó Eimeira paraziták ellen B-sejt és/vagy T-sejt által közvetített védő immunválasz kiváltására képes polipeptidek értendők. A fenti immunogén polipeptidek más Eimeria fehérjéktől mentes érett Eimeria merozoita felületi antigén vagy annak olyan fragmense lehet, amely Eimeria parazitával fertőzött állatok szérumában jelen levő antitestekhez specifikusan kötődni képes. Ezek a polipeptidek a fent ismertetett Eimeria felületi antigén T-sejt és B-sejt epitopjainak felelnek meg A találmányunk szerinti polipeptidek továbbá a fenti Eimeria merozoita felületi antigén fehérje olyan funkcionális ekvivalensei is lehetnek, amely polipeptideknek az aminosav-szekvenciája az 1. ábra szerniti aminosav-szekvenciához viszonyítva aminosav-helyettesítések által módosítva van, azonban ezek a helyettesítések az immunológiai aktivitást lényegében nem változtatják meg (azaz az immunoreaktív és/vagy antigén determinánsokat lényegében nem teszik tönkre).

A fragmensek példájaként egy olyan immunogén polipeptidet említünk meg, amely az (1) (SEQ ID NO:1) aminosav-szekvenciát tartalmazza, azonban amelyből a szignál peptid szekvenciát képező első kb. 20-100 aminosavmaradék hiányzik. Az immunogén polipeptidek másik példája az SDS-poliakrilamid gélen 23 kilodalton látszólagos molekulatömegű polipeptid. Előnyösek az alábbi fragmensek:

HU 211 673 A9

SNNQQTSV (2)(SEQ ID N0:3)

CGDEEDADEGTSQQASRRRRKPDTPAADK (3)(SEQ ID N0:4) PNV (4)(SEQ ID NO:5)

RNKQIF (5)(SEQ ID N0:6)

NPWTGQEE (6)(SEQ ID N0:7)

RQSEE (7)(SEQ ID N0:8)

TRQTLE (8) (SEQ ID NO:9)

QDGKTAKEEKVEGGKTHRRYKVKSSDPGYG (9)(SEQ ID NO: 10) TDEDG (10)(SEQ ID NO: 11)

TGPHG (11 )(SEQ ID NO: 12)

ASQGK (12)(SEQ ID NO: 13)

DDGKGNLVDGQGRK (13)(SEQ ID NO:14) and TQPDTEFRSGPGDDEDDE (14)(SEQ ID NO: 15).

A találmányunk szerinti fragmensek - az (1) (SEQ 15 ID NO: 1) szekvenciájú immunogén polipeptidhez hasonlóan - az egyedekben kokcidiózis elleni immunválasz kiváltására képesek. Egyedként előnyösen szárnyasok (pl. csirke) alkalmazhatók.

Ismeretesek fehérjék olyan aminosav-szubsztitú- 20 ciói. amelyek a biológiai és immunológiai aktivitásokat számottevően nem befolyásolják. Ilyen aminosavszubsztitúciók pl. Neurath és tsai: „The Proteins”, kiadó: Academic Press. New York (1979) c. művében kerültek ismertetésre; különösen a 14. oldalon levő 6. 25 ábrára hivatkozunk. A leggyakrabban megfigyelhető amínosav-helyettesítések az alábbiak: Ala/Ser, Val/Ile. Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly. Ala/Thr. Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly. Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly és fordítva. 30

A genetikus kód degenerálódása miatt sok potenciális nukleotid szekvencia (funkcionális ekvivalensek) létezik, amelyek az (1) (SEQ ID NO:1) aminosav szekvencia kódolására képesek. Megemlítjük továbbá, hogy a DNS nukleotid szekvenciája és a vektorokba 35 beillesztett találmányunk szerinti fragmensek olyan nukleotidokat foglalhatnak magukban, amelyek a tényleges szerkezeti géneknek nem részei, mindaddig, amíg a rekombináns vektor megfelelő gazdaszervezetben a találmányunk szerinti polipeptid termelésének 40 irányítására képes szekvenciát vagy fragmenst tartalmaz.

A fenti Eimeria merozoita felületi antigén funkcionális ekvivalenseit képező polipeptideket kódoló DNSszekvenciák megfelelő szintetikus oligonukleotidok 45 felhasználásával primer-irányított hely-specifikus mutagenézissel, a találmányunk szerinti példálódzó jelleggel bemutatott cDNS-en állíthatók elő (SEQ ID NO:2), lásd Morigana és tsai [Biotechnology 2, 636 (1984)].

Az Eimeria merozoita felületi antigén fehérje frag- 50 menseit vagy részeit vagy az ezeket kódoló DNS-t nagyobb molekulák enzimes hasításával állíthatjuk elő,

DNS számára restrikciós endonukleázok, és fehérjék számára proteázok felhasználásával. A találmányunk szerinti fragmenseket azonban nem korlátozzuk az en- 55 zimes hasítási termékek összes formájára, hanem olyan alszekvenciák is ide tartoznak, amelyeknek a végcsoportjai egyetlen enzimes hasítási pontnak sem felelnek meg. Az ilyen fragmensek pl. kémiai szintézissel, az itt megadott szekvencia adatok felhasználásával állíthatók 60 elő. A DNS fragmensek továbbá izolált messenger RNS-ból (mRNS) nem teljes komplementer DNS (cDNS) szintézissel is elkészíthetők. A fehérje fragmensek továbbá a fehérje fragmenseket kódoló DNS kifejezésével is előállíthatók. Az ilyen fehérje fragmensek a jelen találmány szempontjából akkor hasznosak, ha egy ímmunoreaktív és/vagy antigén determináns kialakításához elegendő számú aminosav-maradékol tartalmaznak. Általában legalább kb. 7 vagy 8 aminosav-maradékra van szükség. Az alábbiakban ismertetésre kerülő módon az ilyen fragmensek egy immunogén hordozó molekulához történő kapcsolással tehetők immunoreaktívvá.

Az immunreaktivitás antitesteknek B-sejtek által történő termelését (humorális immunitás) és a T-sejtek aktiválását (celluláris immunitás) foglalja magában. A találmányunk szerinti polipeptidek B-sejt antigén determinánsokat, vagy epitopokat, és T-sejt epitopokat foglalnak magukban. A humorális immunitás a B-sejtek által indukált antitest-termeléssel in vivő vagy in vitro igazolható. A sejtek által közvetített immunitás T-sejt aktiválással (pl. fokozott T-sejt fehérje szintézissel) vagy a B-sejteknek aktivált T-sejtek által történő stimulálásával mutatható be. Az irodalomból az immunitás mindkét típusa jól ismert.

A találmányunk szerinti polipeptideket az irodalomból ismert módszerekkel állíthatjuk elő (rekombináns DNS metodika, kémiai szintézis vagy Eimeria készítményekből történő izolálás). A találmányunk szerint előállított 1 (SEQ ID NO:1) szekvenciájú polipeptid és fragmensei Eimeria paraziták által termelt más fehérjéktől lényegében mentesek.

A találmányunk szerinti fehérjék előállításához szükséges DNS a megadott nukleotid szekvencia információ (SEQ ID NO.2 és az ábrák) felhasználásával kémiailag szintetizálható. Az ilyen kémiai szintézis ismert módszerekkel [pl. foszforamidit szilárd hordozós módszer; lásd Matteucci et al: J. Am. Chem. Soc. 103, 3185 (1981)] végezhető el.

Alternatív módon a cDNS Eimeria mRNS-ből is előállítható. A messenger Eimeria merozoitákból szokásos standard módszerekkel izolálható. Ezek az mRNS minták felhasználhatók kettősszálú cDNS termelésére Maniatis és tsai: [Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N. J ] módszerével. Ez a

HU 211 673 A9 cDNS megfelelő klónozó vektorba beiktatható, amely felhasználható E. coli transzformálására cDNS könyvtár termelése céljából.

A cDNS könytár a találmány szerinti klónozott gének vagy fragmensek próbaként történő felhasználásával screenelhető. A fenti gének vagy fragmensek radioaktív jelzéssel láthatók el pl. „nick-translation” útján, Pol 1 DNS polimeráz felhasználásával, a négy deoxiribonukleotid jelenlétében, amelyek közül az egyik az alfa-helyzetben ³²P-t tartalmaz (Maniatis és tsai: fent idézett műve, 109. oldal). A minták továbbá Eimeria felületi antigén cDNS ismert szekvenciáján alapuló oligonukleotid szintézissel is előállíthatók.

Bár a példákban mRNS forrásként Eimeria tenella-t alkalmaztunk, e faj klónozott génjei felhasználhatók próbaként gének izolálására más Eimeria fajokból, tekintettel a különböző fajok DNS szekvenciáinak homológiájára.

A találmány szerinti Eimeria géneket azonosítás és izolálás után olyan megfelelő kifejezési hordozóba illesztjük be, amely a beillesztett génszekvenciók transzkripciójához és transzlációjához szükséges elemekkel rendelkezik. Az előnyösen felhasználható klónozó hordozóanyagok kromoszómás. nem-kromoszómás és szintetikus DNS szekvenciák szegmenseiből állhatnak. így pl. különböző ismert baktériumos plazmidok. vírus DNS, mint pl. fág DNS, plazmid és virális vagy fág DNS kombinációk (pl. fág DNS felhasználásával módosított plazmidok) vagy más kifejezési kontroll szekvenciák vagy élesztőplazmidok szegmenseiből. A felhasználható klónozó hordozók a szakember által jól ismertek és csupán példálódzó - tehát nemkorlátozó - jelleggel az alábbiakat soroljuk fel: pEVvrf plazmidok [peV-vrfl, -2 és -3 lásd: Crowl és tsai: Gene 38, 31 (1985)]; SV40; adenovírus; élesztő vektorok: lambda gt-WES-lambda B; Charon 4A és 28; lambda-gt-²-lambda B; M13-leszármaztatott vektorok pl. pUC8, 9, 18 és 19, pBR313, 322 és 325; pAC105; pVA51: pACY177; pKH47; pACYC184; pUBllO. pMB9; colEl; pSCIOl; pml21; RSF2124; pCRl vagy RP4; baromfihimlő; tehénhimlő; a herpesvírus család egy tagja.

Az Eimeria gének könnyen illeszthetők a klónozó vektorba abban az esetben, ha a géneket és kívánt klónozó hordozót egyazon restrikciós enzim vagy enzimek hasította, illetve hasították; ez esetben ugyanis kiegészítő DNS végcsoportok alakulnak ki. Abban az esetben, ha ez nem végezhető el, a kialakított hasítási végek módosítására lehet szükség, éspedig tompa végek képzése céljából egyszálú DNS-sé történő visszaalakítás vagy ugyanezzel az eredménnyel az egyszálú végcsoportokba megfelelő DNS polimeráz betöltése útján. A fenti módszer segítségével tompa végű ligálást megfelelő enzimmel (pl. T4 NDS ligázs) végezhetünk el. Alternatív módon bármely kívánt hely kialakítható nukleotid szekvenciáknak (linkerek) a DNS végcsoportokra való ligálása útján. A fenti linkerek restrikciós helyeket felismerő szekvenciákat kódoló specifikus oligonukleotid szekvenciákat tartalmazhatnak. A hasított vektor és az Eimeria gének továbbá homopolimer farokképzéssel is módosíthatók [lásd Morrow: Methods in Enzymology 6S:3 (1979)].

A jelen találmány értelmében felhasználható számos klónozó hordozó egy vagy több olyan marker aktivitást tartalmaz, amelyek a kívánt transzformáns kiválasztásához felhasználhatók, így pl. ampicillin és tetraciklin rezisztencia pBR322-ben, ampicillin rezisztencia és beta-galaktozidáz aktivitás pUC8-ban és ampicillin rezisztencia pEV-vrf plazmidokban. Azon gazdasejtek, amelyekbe ilyen vektorokat beillesztettek, lényegesen egyszerűbben választhatók ki abban az esetben, ha a gazdasejt a vektor által bevitt aktivitással egyébként nem rendelkezik.

Megjegyezzük, hogy a klónozó vektor kiválasztott helyén beillesztett Eimeria gének nukleoúd szekvenciái olyan nukleotidokat is tartalmazhatnak, amelyek a tényleges strukturális géneknek nem részei. Alternatív r,„.,jon a gén a teljes „vad-típusú” génnek csupán egy részét tartalmazhatja. A találmány szempontjából csupán arra van szükség, hogy a klónozó hordozóba beillesztett gén fragmensek képesek legyenek megfelelő gazdaszervezetben valamely Eimeria felületi antigén legalább egy immunoreaktív és/vagy antigén determinánsát tartalmazó polipeptid vagy fehérje termelésének irányítására.

Fentiek értelmében a találmány szerinti fehérjét kódoló nukleotid szekvenciát magában foglaló DNS-t tartalmazó rekombináns vektorok oly módon állíthatók elő, hogy

a) a fenti fehérjét kódoló nukleotid szekvenciát tartalmazó DNS-t valamely vektorba illesztünk be;

b) ezt a vektort valamely mikroorganizmusban replikájuk; és

c) a rekombináns vektort a mikroorganizmusból izoláljuk.

A megfelelő gazdaszervezet kiválasztását az irodalomból ismert számos tényező befolyásolja. Ezek közé tartoznak pl. az alábbiak: a kiválasztott vektorral való kompatibilitás, a hibrid plazmid által kódolt fehérjék toxicitása, a kívánt fehérje kinyerésének egyszerűsége, kifejezési jellemzők, biológiai biztonság és költségek. Az adott gazdaszervezel megválasztásánál az összes fenti tényezőt megfelelően súlyozva vesszük figyelembe. Megjegyezzük, hogy nem minden gazdaszervezet egyformán hatékony meghatározott rekombináns DNS molekula kifejezésére.

A találmány szempontjából előnyösen felhasználható gazdaszervezetek közül példálódzó - azaz nem korlátozó - jelleggel az alábbiakat soroluk fel. növényi, emlős vagy élesztősejtek és baktériumok, pl. Escherichia coli, Baccilus subtilis, Bacillus stearothermophilus és Actinomyces. Különösen előnyös a Casadaban és tsai által leírt [J. Mól. Bioi. 138 179 (1980)] Esherichia coli MC1061 törzs. Ez a törzs felhasználható vagy a pRK248cIts plazmidot tartalmazó bármely más E. coli K12 törzs alkalmazható. [Bemhard és tsai: Meth. of Enzymol. 68. 482 (1979).] A más E. coli KI 2 törzsekben felhasználható pRK248cIts plazmid az American Typc Culture Collection intézménytől szerezhető be, deponálási szám ATCC 33766. Az E. coli

HU 211 673 A9

MC1061 törzs is hozzáférhető, deponálási szám ATCC 53338, valamint kereskedelmi úton is beszerezhető (CLONTECH Laboratories Inc., Palo Alto CA). A pDM 1.1. pDS56/RBS!I, -1 vagy -2 plazmidok felhasználását E. coli Ml5 törzsben a fenti irodalmi helyeken írták le.

A rekombináns klónozó vektor többfajta módszerrel vihető be a gazdaszervezetbe. Az adott kiválasztott vektor/gazdasejt rendszertől függően az átvitel transzformáció, transzdukció vagy transzfekció útján végezhető el. Az ily módon módosított gazdasejt ezután tenyészthető és a fehérje kifejezési termék a tenyészetből izolálható.

Az Eimeria felületi antigén prekurzor fehérjéjét termelő transzformáns kiónokat glutáraldehidhez rögzített E. tenella sporozoitákkal vagy merozoitákkal szemben immunizált állatok szérumával történő screeneléssel azonosítjuk. Az alábbi példákban a géntermék screeneléséhez és jellemzéséhez nyúl anti-merozoita szérumot alkalmazunk. Immun csirke szérummal végzett párhuzamos immunológiai screenelés a merozoita felületi antigént kódoló cDNS független izolálását eredményezte,

Az immunológiai screeneléshez vagy immunológiai kicsapáshoz felhasznált anti-szérum specifikussága Hall és tsai anti-test kiválasztási módszereinek [Natúré 313, 379 (1984)] változtatásával növelhető. A továbbiakban részletesen ismertetésre kerülő fent említett módszer során a kiónok által termelt, Eimeria fehérjékkel szemben specifikus anti-testeket szűrőkön adszorbeáltatunk.

Az Eimeria antigéneket termelő kiónok kimutatását jól ismert standard meghatározási módszerekkel végezhetjük el, pl. immunológiai kicsapás, enzimhez kötött immunológiai meghatározás (ELISA) és radioimmunológiai meghatározások segítségével [lásd pl. Kennet és tsai (kiadók), Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, 1980., Plenum Press, New York. 376-384. oldal],

A találmány szerinti Eimeria felületi antigén polipeptid variánst kódoló DNS-t tartalmazó rekombináns vektorok az irodalomból ismert módszerekkel állíthatók elő (lásd pl. helyspecifikus mutagenézis).

Találmányunk szerinti rekombináns Eimeria polipeptidek nagy mennyiségben termelhetők oly módon, hogy a fentiek szerint kapott transzformált mikroorganizmusokat a szükséges tápanyagokat tartalmazó fermentációs közegben a rekombináns DNS kifejezésére alkalmas körülmények között tenyésztünk. A termelt rekombináns Eimeria polipeptidek az E. coliban általában a citoplazmában vagy a baktériumok zárványtesteiben vannak jelen. A fehérjék felszabadítása céljából a baktériumok külső membránjának szétroncsolására van szükség. Ezt ultrahangos besugárzás vagy más mechanikus roncsolásos módszer segítségével (pl. francia nyomáscella vagy Gaulin homogenizátor) hajtjuk végre [Charm és tsai: Meth. Enzymol. 22, 476-556 (1971 >].

A sejtek továbbá kémiai vagy enzimatikus módszerekkel is feltörhetők. Minthogy a sejtmembrán integritásához gyakran kétértékű kationokra van szükség, megfelelő kelátképző szerekkel (pl. EDTA vagy EGTA) kellőképpen feltörjük a sejtet és ily módon megkönnyítők a fehérjéknek a sejtekből történő kiáramlását. Megfelelő enzimek (pl. lizozim) ugyanezt az eredményt biztosítják. A fent említett enzim ugyanis a sejtfal peptidoglikán vázát hidrolizálja.

A sejtek továbbá ozmotikus sokk alkalmazásával is feltörhetők. Ennek során a sejteket előbb hipertóniás oldatba helyezzük, ez vízvesztést és zsugorodást idéz elő. A sejteket ezután hipotóniás „sokkoló” oldatba helyezzük, ennek hatására a víz gyorsan a sejtekbe áramlik és a kívánt fehérjéket kiszorítja.

A sejtekből kiszabadított Eimeria fehérjék különböző sókkal (pl. nátrium- vagy ammónium-szulfát) történő lecsapással, ultraszűréssel vagy a szakember által ismert módszerekkel koncentrálhatok. A további úsztítást szokásos fehérjetisztítási módszerekkel végezhetjük el, amelyek közül példálódzó - nem korlátozó jelleggel az alábbiakat soroljuk fel: gélszűrés, ioncserélő kromatográfia, preparatív lemez-gél vagy függönyelektroforézis, izoelektromos fókuszálás, alacsony hőmérsékleten szerves oldószerrel végzett frakcionálás vagy ellenáramú megoszlás. A tisztítást immunaffinitásos kromatografálással is végrehajthatjuk.

Az Eimeria fehérjék a szervezetekből az irodalomból jól ismert specifikus módszerekkel tisztíthatók (lásd pl. Newman és tsai, 164 176 sz. európai közrebocsátási irat).

A találmány szerinti fehérjék vagy fragmenseik továbbá megfelelő módszerekkel (pl. kizárásos szilárdfázisú szintézis, részlegesen szilárdfázisú módszerek, fragmens kondenzáció vagy oldatban végzett klasszikus szintézisek) kémiailag is szintetizálhatók. A szilárdfázisú szintézisek előnyösen végezhetők el a Merrifteld által leírt módon [J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 (1963)].

A fenti szintézist alfa-amino-végcsoportján védett aminosavakkal hajtjuk végre. A labilis oldalláncot tartalmazó trifunkcionális aminosavak megfelelő csoportokkal védhetők, amelyek a pepúd kialakítása közben gátolják a kémiai reakciók lejátszódását a nem kívánt helyen. Az alfa-ami no-védőcsoport szelektív eltávolítása után a kívánt reakció az amino-végcsoporton utólag lejátszódik. Az alfa-ami no-védőcsoportot olyan körülmények között kell lehasítani, hogy az oldalláncon levő védőcsoportok a molekulában megmaradjanak.

A felhasználható alfa-amino-védőcsoportok a többlépcsős peptidszintézisek kémiájából jól ismertek. Ide tartoznak az aciltípusú védőcsoportok (pl. formil-, trifluor-acetil- vagy acetilcsoport), aromás uretántípusú védőcsoportok [pl. benzil-oxi-karbonil-csoport (Cbz) és helyettesített benzil-oxi-karbonil-csoportok], alifás uretán védőcsoportok [pl. tercier butoxikarbonil(Boc), izopropoxi-karbonil-, ciklohexil-oxi-karbonilcsoport] és alkil típusú védőcsoportok (pl. benzil- vagy trifenil-metil-csoport). Védőcsoportként előnyösen Boc alkalmazható. Tyr esetében oldallánc-védőcsoportként pl. tetrahidropiranil-, tercier-butil-, tritil-, benzil-, Cbz-, 4-bróm-Cbz- vagy 2.6-diklór-benzil-csoport

HU 211 673 A9 alkalmazható. A Tyr előnyös védőcsoportja a 2,6-diklór-benzil-csoport. Az Asp oldallánc védőcsoportja előnyösen benzil-, 2,6-diklór-benzil-, metil-, etil- vagy ciklo-hexilcsoport lehet. Az Asp előnyös oldallánc-védőcsoportja a ciklohexilcsoport. Thr és Ser esetében oldallánc-védőcsoportként előnyösen acetil-, benzoil-, tritil-, tetrahidro-piranil-, benzil-, 2,6-diklór-benzil és Cbz-csoport alkalmazható. Thr és Ser esetében védőcsoportként előnyösen benzilcsoport használható. Az Arg oldallánc-védőcsoportja nitro-, Tos-, Cbz-, adamantiloxi-karbonil- vagy Boc-csoport, előnyösen Toscsoport lehet. A Lys oldallánc aminocsoportja Cbz-, 2-klór-Cbz-, Tos- vagy Boc-csoporttal - előnyösen 2klór-Cbz-csoporttal - védhető meg. Az oldallánc-védőcsoport megválasztása az alábbi szempontok szerint történik: az oldallánc-védőcsoport a kapcsolás folyamán változatlan maradjon és az ami no-végcsoport védőcsoportjának lehasításánál vagy a kapcsolási körülmények között ne hasadjon le, ugyanakkor azonban az oldallánc-védőcsoport a kívánt peptid szintézisének befejezése után olyan körülmények között legyen lehasítható. amelyek a célpeptid szerkezetet nem változtatják meg.

A szilárd fázisú szintézist a karboxi-végcsoporton általában oly módon hajtjuk végre, hogy az alfa-aminocsoporton védett (védett oldalláncot tartalmazó) aminosavat megfelelő szilárd hordozóhoz kapcsoljuk. A kiindulási anyagot klór-metilezett vagy hidroxi-metil gyantához kapcsolva észterkötés alakul ki és a kapott célpeptid a C-végcsoporton szabad karboxilcsoportot tartalmaz. Alternatív módon járhatunk el oly módon, hogy benzhidril-amin vagy p-metil-benzhidril-amin gyantát alkalmazunk; ez esetben amidkötés alakul ki és a kapott célpeptid a C-végcsoporton karboxamid-csoportot tartalmaz. Ezek a gyanták kereskedelmi forgalomban beszerezhetők és előállításukat Stewart és tsai írták le „Solid Phase Peptide Synthesis (2. kiadás, Pierce Chemical Co.. Rockford, IL., 1984).

Az oldalláncban Tos-csoporttal és alfa-amino-csoportján Boc-csoporttal védett Arg C-terminális aminosaval különböző aktiválószerek [pl. diciklohexil-karbodiimid (DCC), Ν,Ν’-diizopropil-karbodiimid vagy karbonil-diimidazol] felhasználásával kapcsoljuk a benzhidril-amtn gyantához. A gyantahordozóhoz történő kapcsolódás után az alfa-amino-védőcsoportot trifluorecetsavval (TFA) vagy sósavval dioxánban 0 C és 25 ’C közötti hőmérsékleten eltávolítjuk. Metionin (Met) bevitele után a lehetséges S-alkilezés visszaszorítása céljából a TFA-hoz dimeiil-szulfidol adunk. Az alfaamino-védőcsoport eltávolítása után visszamaradó védett aminosavakat a kívánt peptidszekvencia kialakítása céljából lépésenként kapcsoljuk.

A kapcsoló reakcióknál különböző aktiválószereket alkalmazhatunk, pl. DDC-t, N.N’-diizopropil-karbodiimidet. benzotriazol-1 -il-oxi-trisz-(dimetil-amino)foszfónium-hexfluor-foszfátot (BCP) és DCC-hidroxibenzotriazolt (HOBt). Minden védett aminosavat fölöslegben alkalmazunk (>2.5 ekvivalens) és a kapcsolásokat dimetil-formamidban. metilén-kloridban vagy ezek elegyeiben hajtjuk végre. A kapcsolási reakció teljessé válását minden lépésben ninhidrin-reakcióval követjük nyomon [Kaiser és tsai: Anal. Biochem. 34, 595 (1970)]. Amennyiben a kapcsolás nem tökéletes, a kapcsolási reakciót megismételjük. A kapcsolási reakciókat automatikusan Vega 250, „Applied Biosystems” szintetizátoron vagy más kereskedelmi forgalomban levő berendezésen végezhetjük el. A célpeptid teljes felépítése után a peptid gyantáról a védőcsoportokat TFA/ditioetán rendszerrel eltávolítjuk, majd megfelelő reagenssel (pl. folyékony hidrogén-fluoriddal) 0 °C-on egy-két óra alatt a peptidet a gyantáról lehasítjuk és az összes oldallánc-védőcsoportot eltávolítjuk.

A szilárd hordozón lejátszatott „oldallánc az oldallánchoz” ciklizációk ortogonális védőrendszerek alkalmazását teszik szükségessé, amelyek a savas aminosavak (pl. Asp) és bázikus aminosavak (pl. Lys) oldalláncában levő funkciós csoportok szelektív lehasítását lehetővé teszik. E célból Asp oldallauca esetében 9-fluorenil-metil-csoport (OFm) és Lys oldallánca esetében 9-fluorenil-metoxikarbonil-csoport (Fmoc) alkalmazható védőcsoportként. A fenti esetekben a Boc-védett peptidgyanta oldallánc-védőcsoportjait piperidinnel dimetil-formamidban szelektíven távolítjuk el. Aciklizációt szilárd hordozón különböző aktiválószerek [pl. DCC, DCC/HOBt vagy BOP] alkalmazásával végezzük el. A HF-reakciót a fentiekben leírt módon ciklizált peptidgyantán hajtjuk végre.

A szintetikus fehérjéket a korábbiakban a rekombináns módon termelt fehérjékkel kapcsolatban leírt módon tisztíthatjuk.

Eimeria fehérjék a szervezetekből, illetve a memránfehérjék extraktumaiból is kinyerhetők. Ezek a módszerek teljes vad-típusú fehérjéket termelnek. Monoklonális anti testek e célra Köhler és Milstein által leírt módon [Natúré 2J6, 495 (1975)1, antigénként szintetikus vagy természetes Eimeria fehérjék felhasználásával termelhetők. Ezek a módszerek használhatók fel a találmányunk szerinti 23 kd Eimeria felületi antigén tisztítására.

Egy vagy több találmányunk szerinti Eimeria fehérjéből és fiziológiailag elfogadható hordozókból vakcinái készíthetünk Hordozóként pl. 0,01-0,1 M semleges értékű foszfát-pufferek vagy fiziológiás konyhasóodat alkalmazható.

Kokcidiózissal szembeni fokozott immunitás kétféleképpen alakítható ki. Az egyik módszer értelmében a vakcinához adjuvánsl vagy immunopotenciátort adunk. A másik módszer szerint a találmányunk szerinti fehérjét nagyobb készítmény formájában (pl. térhálósított komplexként vagy hordozómolekulához konjugálva) adjuk be az immunizálandó állatnak.

Az állatok beoltása során alkalmazható adjuvánsok példáiként nem korlátozó jelleggel az alábbi anyagokat soroljuk fel: Adjuváns 65 (ez mogyoróolajat, mannidmono-oleátot és alumínium-monosztearátot tartalmaz); ásványi gélek pl. alumínium-hidroxid, alumíniumfoszfát és alumínium-oxid: felületaktív anyagok, pl. hexadecil-amin. oktadecil-amin, lizolecitin, dimetil-dioktadecil-ammónium-bromid, N,N-dioktadecil-N’,N’bisz(2-hidroxi-metil)-propándiamin, metoxi-hexadecil1

HU 211 673 A9 glicerin és pluronikus poliolok; polianionok pl. pirán, dextrán-szulfát, poli IC, poliakrilsav és carbopol; peptidek, pl. muramil-dipeptid, dimetil-glicin és tuftsin, valamint olajemulziók. A fehérjék továbbá liposzómákba vagy más mikrohordozókba beépítve is adagolhatók.

A liposzómákba vagy más mikrohordozókba történő beépítéssel olyan készítményeket állítunk elő, amelyekből a fehérjék hosszabb idő alatt szabadulnak fel. E célra továbbá szivattyúk (pl. ozmotikus Alza szivattyú) is felhasználhatók.

A találmány szerinti fehérjék immunogenicitása különösen kisebb fragmensek esetében - térhálósítással vagy immunogén hordozó molekulához történő kapcsolással fokozható (utóbbiak olyan makromolekulák. amelyekhez a találmányunk szerinti fehérjék és fehérjefragmensek kovalens módon kapcsolhatók és a gazdaállatban önmaguk is képesek immunológiai reakció kiváltására). Térhálósításra vagy a hordozó molekulához történő konjugálásra azért lehet szükség. mert a kis fehérjefragmensek bizonyos esetekben hapténként viselkednek (ezek olyan molekulák, amelyek az anti-testhez specifikusan kötődni képesek, azonban anti-test termelésre képtelenek, azaz nem immunogének). Amennyiben az ilyen fragmenseket immunogén hordozómolekulához konjugáljuk, a fragmenseket az ún. „hordozóhatás” révén immunogénné tesszük.

Hordozómolekulákként pl. fehérjék és természetes vagy szintetikus polimer anyagok alkalmazhatók pl. polipeptidek. poliszaccharidok, lipopoliszaccharidok stb. Hordozóként előnyösen használható a „Quil A” nevű glikozid [lásd Morein és tsai: Natúré 308, 457 (1984)]. Különösen előnyösnek bizonyultak a fehérje hordozómolekulák, amelyek közül példálódzó - nem korlátozó - jelleggel az alábbiakat említjük meg: emlős szérumproteinek, pl. kulcslyukkagyló hemocianin, humán vagy szarvasmarha gammaglobulin, humán vagy szarvasmarha vagy nyúl szérumalbumin, vagy a fenti fehérjék metilezett vagy egyéb származékai. Egyéb fehérjehordozók kiválasztása a szakember kötelező tudásához tartozik. Előnyösen alkalmazhatók olyan fehérjehordozók, amelyek idegenek a gazdaállat számára, amelyben az Eimeria fehérjék ellen anti-testek termelését idézzük elő; ez azonban nem kötelező jellegű követelmény.

A hordozó molekulához történő kovalens kapcsolást az irodalomból jól ismert módszerekkel végezzük el: az adott módszer kiválasztása a hordozó molekula jellegétől függ. Amennyiben immunogén hordozómolekulaként valamely fehérjét alkalmazunk, a találmány szerinti fehérjék vagy fragmensek kapcsolását pl. vízoldható karbodiimidek (mint pl. diciklohexilkarbodiimid vagy glutáraldehid) felhasználásával végezhetjük el.

A fenti kapcsolószerek továbbá felhasználhatók a fehérjék és fragmensek egymással történő térhálósítására. külön hordozómolekula alkalmazása nélkül. A fehérjében vagy fehérjefragmens aggregátumba történő térhálósítás is fokozhatja az immunogenitást.

Megfelelő mennyiségű találmányunk szerinti vakcina beadásával baromfi E. tenella vagy más Eimeria faj által okozott fertőzéssel szemben megvédhető. Az E. tenella antigének elleni monoklonális anti-testek E. acervulinával és E. maximával in vitro keresztreakcióba lépnek. Előnyösen baromfi (pl. csirke) alkalmazható, azonban más állatfajok alkalmazása is a találmány oltalmi körébe tartozik. A találmány szerint bármely hatékony mennyiségű vakcina felhasználható. A hatékony mennyiség az alábbiakban ismertetésre kerülő módszerekkel, rutinjellegű kísérletek segítségével határozható meg. A találmány szerinti polipeptidek és fragmensek hatékony dózisa a vakcinával kezelt állat testtömegére vonatkoztatva kb. 5-50 gg/kg testtömeg; az előnyös dózis kb. 25-50 gg/kg testtömeg. Előnyösen járhatunk el oly módon, hogy az indító oltás után egy és néhány hét közötti időtartam alatt emlékeztető oltást alkalmazunk. Többszöri emlékeztető oltás adható be. Az emlékeztető oltás dózisa általában kb. 5-50 gg/kg, előnyösen kb. 20-50 gg/kg testtömeg. Az oltás standard módszerekkel adható be, pl. szubkutáns, intradermális, intramuszkuláris, orális, anális úton vagy a tojáson keresztül. Egyetlen vagy többszörös emlékeztető oltást előidézett enyhébb kokcidiózis fertőzés követhet, amely a védelmet erősíti.

A találmányunk szerinti kokcidiózis antigéneket oly módon juttathatjuk fiatal madarak immunrendszerébe, hogy az antigéneket kódoló géneket baktériumokba (pl. E. coli vagy Salmonella) vagy vírusokba (pl. himlővírus vagy herpesz vírus) klónozzuk és az élő vektor (vagy szükség esetén inaktivált formáját) rendszert orálisan, befecskendezéssel vagy más szokásos módon adjuk be a madaraknak. Carbit és tsai [Vaccines, (1987), Cold Spring Harbor Laboratory, 68-71. oldal] E. coli, míg Clements [Pathol. Rés. 6, 137 (1987)] Salmonella felhasználását írták le. Moss és tsai [Ann. Rév. Immunoi. 5, 305 (1987)] rekombináns himlővírusok felhasználásával vírusos vektor-rendszerek alkalmazását ismertették.

A himlővírus egyik fajtája (tehénhimlő vírus) segítségével kokcidiózis antigének bevitele sejttenyészetekbe és állatokba kipróbálható. A jelen találmány végrehajtásához himlővírus hordozóként továbbá baromfihimlő-vírus is felhasználható. Analitikai vizsgálatokhoz a tehénhimlő vírus alkalmasabb, mint a baromfihimlő-vírus. Ennek oka, hogy a tehénhimlő-vírus gyorsabban szaporodik a madárvírusnál és gazdaszervezetek tartománya nem korlátozódik csirkesejtekre. A tehénhimlő-vírus genomba nagymennyiségű heterológ DNS illeszthető be a vírus érettségének és ragályosságának gátlása nélkül [Smith és tsai, Gene 25, 21 (1983)]. A vírusba beillesztett többszörös heterológ géneket a fertőzött állatokban kifejezzük és ez anti-test termelést idéz elő [Perkus és tsai, Science 229, 981 (1985)].

Rekombináns tehénhimlő-vírusok termelésére szolgáló eljárások rutin módszerekkel adaptálhatók szárnyasvírus vagy herpeszvírus rendszerekre. A találmányunk szerinti fehérjét kódoló nukleotid szekvenciát tartalmazó DNS-t magában foglaló rekombináns vírust oly módon állíthatjuk elő, hogy

HU 211 673 A9

a) a fenti fehérjét kódoló nukleotid szekvenciát tartalmazó DNS-t a vírusos érettség és fertőzőképesség gátlása nélkül valamely vírus genomjába illesztünk be:

b) a kapott rekombináns vírust valamely sejttenyészetben amplifikáljuk; és

c) a rekombináns vírust a tenyészetközegből tisztítjuk. A rekombináns vírusok különösen előnyösen alkalmazhatók hordozóként kokcidiózis-ellenes vakcinákban, minthogy a beoltott baromfi a kokcidiális antigénnel és a vírusos hordozóval szemben egyaránt immunitást fejleszt ki (azaz a fenti vakcinák kettős értékűek).

A fentiekben tárgyalt vakcinák felhasználhatósága tovább fokozható oly módon, hogy a hordozóvírusba további géneket illesztünk be. így pl. baromfihimlő vírusba a kokcidiális antigén génjével együtt a Newcastle betegség vírusos genomja illeszthető be és ily módon egyetlen vakcina segítségével a Newcastle-betegség, kokcidiózis és baromfihimlő ellen egyaránt immunitás biztosítható.

A találmány szerinti élő vektor vakcinák beadását számos önmagukban ismert módszerekkel végezhetjük el. így pl. baromfi madárhimlő vírussal szembeni beoltására ismert „szúrásos” módszert alkalmazhatjuk. Ennek lényege, hogy a szárnyszövetet a vakcinába mártott éles tűvel megszűrjük. A tű csúcsa közelében rendszerint nyílás helyezkedik el - hasonlóan a varrógéptűhöz - és ez hordozza a vakcinacseppet. Alternatív módon azélő vakcinákat szubkután vagy intradermális úton a számyszövetbe vagy más helyre fecskendezhetjük.

A rekombináns élő vektor vakcinákat továbbá az ivóvízhez adhatjuk vagy a beoltandó csirkékre permetezhetjük. A rekombináns élő vektor vakcinák továbbá a takarmánnyal, előnyösen védőkapszulába zárva [Balancou és tsai: Natúré 322. (1986)] adagolható vagy a tojásba juttatható. Utóbbi módszer esetében a vírusos vakcinákat közvetlenül a csirkeembrióba fecskendezzük [Sharma: Avian Dis. 25. 1155 (1985)].

A szilárd keverékekben a szilárd anyagokra, a folyadék-elegyekben a folyadékokra és a folyadékokban a szilárd anyagokra megadott százalékos értékek tömeg/tömeg, lérfogat/térfogat, illetve tömeg/térfogat %bán értendők, feltéve, hogy mást nem közlünk. A reagensek és műszerek szállítóit nem kötelező jelleggel említettük meg, feltéve, hogy mást nem közöltünk. A szakember más szállítóktól származó hasonló reagensek. illetve műszerek kiválasztására minden további nélkül képes.

I. példa

E. tenella merozoitákat 50 fertőzött csirke (3 hetes szárnyasok. Hubbard Cross; Avian Services Frenchtown NJ) vakbeléből madaranként 50 000 oocisztával elvégzett fenőzés után 5 nappal összegyűjtünk. Más forrásból származó hasonló csirkéket is felhasználhatunk. A vakbelet eltávolítjuk és mágneses keverőn foszfáttal pufferolt konyhasó-odattal (PBS) 15 percen át mossuk. Az epiteliális maradványokat alacsony fordulatszámú centrifugálással (50xg) eltávolítjuk és a nyers merozoitákat 2000 g mellett 4 C-on 10 percen át végzett centrifugálással elválasztjuk. A pelletet lizálópufferben [8,29 g/1 NH₄CI, 0,372 g/1 Na₂EDTA, 1,0 g/1 KHC0₃, pH 7,6] újraszuszpendáljuk és jégen 30 percen át inkubáljuk. A merozoitákat centrifugálással összegyűjtjük, PBS-el egyszer mossuk és választótölcsérben elhelyezett 1,0 g fonott nejlonszálat (Scrub Nylon Fiber, Fenwall Laboratories, Deerfield IL) tartalmazó oszlopon átvezetjük. A merozoitákat a fentiekben leírt centrifugálással összegyűjtjük és RNS izolálás céljából szárazjégen fagyasztjuk vagy Western biot analízishez dietil-amino-etil-cellzulózon továbbítjuk (DEAE, Whatman DE52, Whatman Biosystems, Inc. Clifton NJ.).

A DEAE cellulózban történő tisztításhoz mintegy lxlO⁹ merozoitát PBS-ben 10 ml-es oszloptérfogatra viszünk fel és PBS-el eluáljuk. A merozoitákat az első 100 ml-es áthaladó folyadékból nyerjük ki; az ilyen módon nyert merozoiták vörösvérsejtektől és más sejtmaradványoktól lényegében mentesek.

ⁿ⁵l-jelzett felületi fehérjék immunológiai kicsapása

A tisztított merozoiták felületi fehérjéit a JODOGÉN módszer (Pierce Chemical Co.) segítségével ¹²⁵Iel vagy IODOBEAD (Pierce Chemical Co.) felhasználásával jelezzük, Az utóbbi eljárás során 4 JODOBEAD-et 0.2 M nátrium-foszfáttal (pH 7,5) háromszor mosunk, 1-3 mCi ¹²⁵I-Na-t adunk hozzá és szobahőmérsékleten 5 percen át inkubáljuk. A reakcióampullához tisztított merozoitákat (3x10⁸) adunk 200 μΐ PBSben (pH 7,0) és az inkubálást 15 percen át folytatjuk. Az inkubálás végén fenil-metánszulfonil-fluoridot (PMSF) adunk hozzá, 5 mM végső koncentrációban.

A jelzett merozoitákat az inkubációs elegyből 12 OOOxg mellett 30 másodpercen át végzett centrifugálással kinyerjük és 1 ml 2%-os nátrium-dodecil-szulfát-oldatban (SDS) vagy 1 ml 1%-os PNS-el képzett Triton x-100 oldatában (pH 7,0) szolubilizáljuk. Az oldhatatlan anyagot 12 OOOxg mellett 3 percen át végzett centrifugálással eltávolítjuk. A szolubilizált fehérjéket 3 liter PBS-el szemben (pH 7,0) 4 °C-on dializáljuk, a maradék szabad ^l25I eltávolításához 3500 molekulatömegű membrán felhasználásával. A ^l25J-jelzett fehérjéket (a fehérjébe általában 1,5x10⁸ cpm épül be) felhasználásáig 4 °C-on tároljuk. A TCA által lecsapható radioaktivitás általában a teljes radioaktivitás 95%-a feletti érték.

Gultáraldehidhez kötött merozoiták elleni nyúl anti-szérumot a következőképpen készítünk:

Kb. lxlO⁹ tisztított merozoitát 1%-os, PBS-ben készült glutaraldehid-oldatban szuszpendálunk és szobahőmérsékleten 5 percen át inkubálunk. A rögzített parazitákat 2000 g mellett 5 percen át végzett centrifugálással összegyűjtjük, PBS-el háromszor mossuk és 1 ml PBS-ben újraszuszpendáljuk. Uj-zélandi fehér nyulak hátán levő bőrbe összesen 0.5 ml kötött parazita oldatot fecskendezünk, többszörös intradermális injekció formájában; a parazita oldatot 0.5 ml teljes Freund-féle adjuvánssal emulgeáljuk. A nyulak kéthetes időközökben nem teljes Freund-féle adjuvánsban ugyanezt a parazita fehérjét tartalmazó két emlékeztető injekciót kapják. A fülvénából az utolsó emlékeztető injekció

HU 211 673 A9 után 2 héttel vért gyűjtünk és az anti-testeket tartalmazó szérumot a koagulált vérmintákból 15 percen át 2500xg mellett végzett centrífugálással nyerjük.

A jelzett fehérjék mintáit az immunológiai kicsapáshoz (5 ml, 5X10⁵ cpm-t tartalmaz) 100 ml IP pufferrel hígítjuk (0,25% NP-40, 20 mM trisz-Hl, pH 7,5, 0,15 M NaCl), jégen 5 mg Staph-Aferhéijével (Pansorbin^R, Calbiochem Corp. San Diego CA) 20 percen át végzett inkubálással előderítjük és 4’C-on 5-10 ml nyúl anti-merozoita szérummal néhány órán át inkubáljuk. Az anti-test komplexeket 5 mg Staph-fehéijével jégen 20 percen át végzett második inkubálással összegyűjtjük és Eppendorf cenrifugában 15 mp-en át centrifugáljuk. A pelletet IP pufferrel négyszer mossuk és az anti-test reagenssel az immunológiailag kicsapott jelzett fehérjéket a komplexből SDS gélben minta pufferben (65 mM trisz, pH 6,8, 0,5% SDS, 5% β-merkapto-etanol, 10% glicerin, 0,1% brómfenolkék) 100 C-on 5 percen át végzett melegítéssel eluáljuk. Az SDS PAGE meghatározást Laemmli által leírt módszerrel [Natúré 227, 680 (1970)] végezzük el.

A nyúl anti-szérummal kapott eredményeket az alábbi módon előállított immun csirke szérum alkalmazásával igazoljuk.

Csirkéket E. tenella életképes sporulázott oocisztákkal (100 000 oociszta, hetenként háromszor kéthetes időközökben bedagolva) megfertőzünk. A vért kardiális punktúrával gyűjtjük össze és az anti-testeket tartalmazó szérumot a koagulált maradványokból 2500xg mellett 5 percen át végzett centrifugálás után választjuk el.

Az elvégzett összehasonlító vizsgálatok során antimerozoita nyúlszérumot és immun csirke szérumot alkalmazunk ^I25l felületileg jelzett Eimeria merozoita fehérjék és poli(A)-tartalmú merozoita RNS transzlációja in vitro termékei immunológiai kicsapásához. A lecsapott fehérjéket SDS-PAGE meghatározásnak vetjük alá és standard fluorográfiai módszerek és reagensek felhasználásával tesszük láthatóvá.

A fenti vizsgálatok azt mutatják, hogy mindkét szérum lecsap mindkét forrásból származó fehérjét. így mindkét szérum felhasználható az Eimeria fehérjéket kifejező genetikai rekombinánsok screenelésére. Az alábbiakban ismertetésre kerülő screenelési eljárásoknál célszerűségi okokból előbb nyúl anti-merozoita szérumot alkalmazunk. Azonban - ugyancsak az alábbiakban ismertetésre kerüld módon - a cDNS könyvtár párhuzamos screenelésére immun csirke szérumot alkalmazunk. Ez a fertőző szervezetekkel szembeni immun-válasz szempontjából feltehetően fontos fehérjék azonosítása tekintetében jelentős, minthogy az élő szervezetekkel szemben adott immun-válasz csak csirke szérumot termel. Az ilyen szervezetekkel szemben csak az immunizált csirkék bizonyultak rezisztensnek.

A nyúl anti-merozoita szérum Eimeria fehérjékre való specifikusságának növelése céljából az anti-test szelekciót a szérumon lényegében Hall és tsai módszerével végezzük el [Natúré 311, 379 (1984)]. Ennek lényege röviden, hogy a rekombináns fág klón (lásd az alábbiakban) által kifejezett prekurzor fehétjére specifikus anti-testeket nyúl anti-merozoita szérumból tisztítunk az alábbi módon:

A pozitív fágot magas sűrűségre szélesztjük és 42 'C-on 3,5 órán át tenyésztjük. A fúziós fehéije kifejezését oly módon indukáljuk, hogy a lemez fölé 10 mM izopropil-tio-galaktoziddal (IPTG) telített nitrocellulózt rétegezünk és az inkubálást 37 “C-on 6-8 órán át folytatjuk. Az antigénnel töltött szűrőket TBS-el (20 mM trisz HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl) mossuk és E. coli gazdabaktériumokkal előzetesen abszorbeáltatott fölös mennyiségű anti-merozoita szérummal 8-10 órán át 4 ’C-on inkubáljuk. A szűrőket a nem specifikus anti-testek eltávolítása céljából TBS-el háromszor mossuk. A szűrőn levő fúziós fehérjéhez specifikusan kötődött anti-testeket 2,0 ml 0,1 M glicinnel (pH 2,6, 0,15 M NaCl) 15 percen át 20 ‘C-on eluáljuk. Azeluált anti-testeket azonos térfogatú 0,1 M trisz HCl-el (pH 8,0) azonnal semlegesítjük. A szelektált anti-testeket (a továbbiakban: „anti-testek által szelektált anti-testek”) használjuk fel a felületileg jelzett merozoiták vagy az in vitro transzlációs termékek immunológiai lecsapásához vagy a teljes merozoita fehéije Western biot analízisénél mintaként. A kontroll szérumokat nem rekombináns fág felhasználásával antigének segítségével elvégzett szelektálást eljárással készítjük el.

A Western biot és anti-testek által szelektált antitestek felhasználásával végrehajtott immunológiai lecsapás analízis eredményeit a 2. ábrán tüntetjük fel. A jelzett fehérjék immunológiai lecsapásának termékeit Bonner és tsai módszerével [Eur. J. Biochem. 46, 83 (1974)] florográfiával tesszük láthatóvá. Az ábra jobb oldalán levő számok a megjelölt nagyságú (kilodaltonban) molekulatömeg markerek helyzetét jelzik.

A 2. ábra „A” mezőjén kontroll (a) vagy antigének által szelektált anti-testek (b) által megvizsgált teljes merozoita fehérjék immun blotját tüntetjük fel. A „B” mezőn kontroll (a) vagy antigén által szelektált (b) anti-testekkel immunológiailag lecsapott ¹²⁵I-felületileg jelzett merozoita fehétjéket mutatunk be.

Merozoita mRNS izolálása és in vitro transzlációja lxlO⁹-lxlO¹⁰ szervezetet tartalmazó fagyasztott merozoita pelletet, I mM ditiotreitet (DTT) és 300 egység RNasint (Promega Biotec. Medison WI) tartalmazó 10 ml TEL/SDS pufferben [0,2 M trisz HCl, 0,1 M LiCl, 25 mM EDTA, 1 tömeg/térfogat% nátrium-dodecil-szulfát (SDS), pH 8,8] feleresztünk és teflonbélésű szövethomogenizátorban 10-12 menetben homogenizálunk. Az oldhatatlan maradékot hidegen 3000 g mellett végzett centrífugálással elválasztjuk. A felülúszó folyadékot fenil, kloroform és izoamil-alkohol 24:24:1 térfogat/térfogat arányú, TEL pufferrel előzetesen egyensúlyba hozott elegyével kétszer extraháljuk.

A vizes fázist 100 mg/ml proteináz K segítségével 37 C-on 30 percen át emésztjük és azonos térfogatú, 1:1 arányú fenol-kloroform eleggyel újraextraháljuk. A nukleinsavat 2 térfogat etanollal szárazjégen 1 órán át vagy egy éjjelen keresztül -20 ’C-on végzett kezeléssel kicsapjuk. A pelletet egy órán át 10 OOOxg mellett centrifugáljuk, majd TE-ben (10 mM trisz, pH 7,5, 2 mM EDTA) újraszuszpendáljuk és 4 ml CsCl párnán

HU 211 673 A9 (5,7 mM CsCl, 0,1 M EDTA) 150 000 g mellett 15 ’Con 20 órán át végzett centrifugálással elválasztjuk. Az RNS pelletet 0,2 M kálium-acetátból 2,5 térfogat etanollal újra lecsapjuk. Az összes RNS-t a poli(A)⁺RNS feldúsítása céljából oligo-dT cellulózon egyszer átvezetjük (lásd Maniatis fent idézett közleménye, 197. oldal). Az 5xl0⁹ merozoitából általában nyert 1,9 mg össz RNS kb. 20 gg poli(A)⁺RNS-t tartalmaz.

Nukleázzal kezelt nyúl retikulocita lizátum (Amersham Corp., Arlington Heights, IL vagy Progema Biotect.) in vitro fehérjeszintézisének programozásához 0,1-0,5 pg mRNS-t alkalmazunk; a lizátumot előzetesen a reakcióelegy 20 μΐ-ére vonatkoztatva 10-20 pCi ^3sS-metioninnal egészítettük ki. Az in vitro transzlációs termékeket immunológiai lecsapással. majd SDS-PAGE meghatározással analizáljuk és a fentiekben ismerteteti fluorográfiai módszerrel vizualizáljuk. Az eredményeket a 2. ábra „C” mezején tüntetjük fel.

A ,,C” mező „c” pályáján a poli(A)-tartalmú merozoita RNS által programozott termékek teljes keverékét mutatjuk be. A ,,b, „a” és „d” pályán egy lambda 5-7 jelzésű rekombináns fág klón (lásd az alábbiakban; ez a klón fejezi ki a 33 Eimeria prekurzor fehérjét kódoló gént), egy anti-merozoita szérummal reagáló másik fág klón. illetve egy nem rekombináns lambda gtl klón által szelektált anii-testekkel lecsapott transzlációs termékeket tüntetünk fel.

Megjegyezzük, hogy a 2. ábra „c” mezején levő „a” és „b pályán kb. 33 kilodalton látszólagos molekulatömegű fő-fehérje látható. Ez a fehérje az anti-test által szelektált anti-tesiekkel vizsgált teljes merozoita fehérjéket tartalmazó pályán nincs jelen (.,A” mező, „b” pálya), azonban a 23 kilodalton sáv látható ebben a gélben („A mező, „b” pálya, nyíl). Egy 23 kilodalton fehérjét a ^l25I-jelzett merozoita fehérjékből nyert antigén által szelektált anti-testekkel is lecsapatunk (lásd 2. ábra „B mező. ,.b pálya). Ezek a megfigyelések arra utalnak, hogy a 33 kilodalton prekurzor fehérje érett merozoitákban proteolitikus hasítással alakítható a 23 kilodalton felületi antigénné.

Merozoira cDNS kifejezési könyvtár készítése pg merozoita poli(A)⁺RNS-ből Gubler és tsai módszerével [Gene 25, 263 (1983)] kettősszálú cDNS-t szintetizálunk; egy oligo(dT) primer meghosszabbításához fordított transzkriptázt (BRL, Gaithersburg, MD) és a kiegészítő szál szintetizálásához RNase H-t (BRL) és E. coli DNS polimerázt l-t (New Engladn Biolabs, Beverly MA) alkalmazunk. A kettőssszámú cDNS-n T4 DNS polimeráz (BRL) segítségével tompa végeket alakítunk ki és EcoRI metilázzal (New England Biolabs) végzett kezelés után EcoRI linkereket (GGAATTCC, Collaborative Research Inc. Bedford MA) adunk hozzá.

EcoRI segítségével végzett emésztés után a cDNSeket Biogel Α-50-M-ben frakcionáljuk a fölös menynyiségű linker molekulák és a kb. 300 bp-nél kisebb cDNS-ek eltávolítása céljából; ezt az eljárást Huynh és tsai fentiekben idézett közleményében leírt módon végezzük el. A cDNS-t etanolból történő kicsapással koncentráljuk.

A könyvtárat Xgtll-ben (Stratagene Cloning Systems, San Diego, CA) készítjük el, Huynh és tsai által leírt módon [D. Glover (kiadó) DNA Cloning I. kötet: A Practical Approach, (1985), 1RL Press, Washington D.C. 49-78. oldal]. Az EcoRI cDNS fragmensekel EcoRI által emésztett, defoszforizett Xgtll karokra ligáljuk (Stratagene Cloning Systems) és a kapott DNS-t a gyártó cég előírásának megfelelően Gigapack^R kit felhasználásával (Stratagene Cloning Systems) fágokba csomagoljuk.

A kapott könyvtárat Y1O88 gazdasejteken történő szélesítéssel amplifikáljuk. A rekombinánsok százalékát izopropil-tio-galaktozid (IPTG; Sigma Chemical Cp.) jelenlétében X-gal lemezeken (lásd Maniatis, fent idézett közleménye 24. oldal) a kék és színtelen plakkok arányából határozzuk meg; a kapott érték kb. 90%.

cDNS könyvtár immunológiai screenelése

A kgtll merozoita kifejezési könyvtárat Y1090 sejteken 150 mm lemezre vonatkoztatva kb. 10 000 plakk sűrűség mellett szélesítjük. Hat ily módon kapott lemezt 42 ’C-on 3.5 órán át inkubálunk, majd a β-galaktozidáz fúziós fejélje kifejezésének indukálása céljából előzetesen 10 mM IPTG-be áztatott nitrocellzulóz szűrőket rétegezünk föléje. Ezután további 4-5 órán át 37 C-on inkubáljuk. A szűrőket a lemezekről eltávolítjuk és szakaszosan többször TBS-el mossuk (20 mM írisz HCl. pH 8.0. 0,15 M NaCl). A nem specifikus fehérje kötődési helyeket 20%-os magzati szérummal (FCSt TBS-ben szobahőmérsékleten egy órán át végzett inkubálással blokkoljuk.

A szűrőket nyúl anti-merozoita szérummal egy órán át inkubáljuk: ezt a szérumot előzetesen az Y1090 sejtekkel adszorbeáltattuk. 20% borjúszérumot tartalmazó TBS-ben, 1:100 hígítás mellett. A nem specifikus anti-testeket TBS-el végzett többszöri mosással eltávolítjuk; az egyik 0.1% ΝΡ-40-t tartalmaz. A szűrőket kecske anti-nyúl peroxidáz konjugátummal (BioRad, Richmond, CA) 1:100 hígítás mellett, borjúszérumot tartalmazó TBS-ben szobahőmérsékleten egy órán át inkubáljuk. A színreakciót 4-klór-1-naftollal (Bi-Rad) a gyártó cég előírásainak megfelelően fejlesztjük ki.

A screeneléshez immun csirkékből nyert szérumot is felhasználunk. Ezt a szérumot Y1090 sejtekkel előzetesen adszorbeáltatjuk és ugyanolyan hígításban használjuk fel mint a nyúlszérumot. Másodlagos antitestként kecske anti-nyúl tormaperoxidáz konjugátumot alkalmazunk. Egy másodlagos sereenelés során ugyanezen reagensek felhasználásával egyetlen plakkot izolálunk.

A lambda 5-7 jelzésű klón nyúlszérumból nyert anti-testekkel szemben erősen reakcióképes fehérjét termel. Egy második, immun csirke szérummal végzett screeneléssel azonosított 1-5 jelzésű izolátum ugyanolyan nagyságú cDNS inzertet tartalmaz, mint az 5-7 klón. A DNS szekvencia analízis igazolja, hogy ezek a fág kiónok ugyanazt a merozoita antigént kódolják.

HU 211 673 A9

Lambda 5-7 cDNS kifejezése E. coli-ban

EcoRI emésztés és agaróz gél elektroforézis (Maniatis és tsai fent idézett közleménye, 157-170. oldal) segítségével lambda 5-7-ből egy 1,2 kb inzertet izolálunk. Az EcoRI végződéseket dATPés d l lF jelenlétében Klenow polimerázzal alakítjuk ki és mindkét végződésre BamHI linkereket (GGGATCCC) ligálunk. Mindhárom expressziós vektorba [pDS56/RBSII, pDS56/H -1, és pDS56/RBSII,-2] a BamHI helyen a módosított fragmenst beillesztjük. Ezt a három vektort az alábbiakban írjuk le. Az inzerteket mindkét lehetséges orientációban tartalmazó plazmidokat Mandel és tsai [J. Mól. Bioi 53, 159 (1970)] által leírt módon transzformáljuk a kompatibilis pDMl.l. plazmidot hordozó E. coli Ml5 törzsbe. Az E. Coli M15 törzsben levő pDS56/RBSII és pDMl.l. plazmidok a 316 695 sz. európai közrebocsátási iratban kerültek ismertetésre.

Plazmid felépítés

A pDS56/RBSII.-l és -2 plazmidok általában a szabályozható N250PSN250P29 promotor/operálor elemet, illetve az RBSII, RBSII(-l) és RBSIK-2) riboszómás kötődési helyeket tartalmazzák. Ezek a riboszómás kötődési helyek az E. coli fág T5 (207 459 sz. európai közrebocsátási irat) P_G25 promotora riboszómás kötődési helyéből származtathatók le és DNS szintézissel alakíthatók ki.

A fent említett plazmidok magas fokú kifejezési hatékonyságuk következtében E. coli sejtekben csak abban az esetben tarthatók fenn, ha a promotor/operátor elemet egy lac represszornak az operátorhoz való kötődése represszálja. A lac represszor a lacl génbe van kódolva. Az N250PSN250P29 csak akkor represszálható hatékonyan, ha a sejtekben megfelelő számú represszor molekula van jelen. Ezért a represszor gén fokozott kifejezésért felelős promotor mutánst tartalmazó lacU alléit alkalmazunk. A lacU alléi a pDMl.l. plazmidban az alábbiakban leírtak szerint van jelen.

A pMDI.l. plazmid a lac I génen kívül a baktériumoknak kanamicin-rezisztenciát átadó és szelekciós markerként felhasznált neomicin foszfotranszferáz gént is tartalmaz. A pDMl.l. a pDS56/RBSII, -1 és -2 plazmiddal kompatibilis. A pDS56RBII, -1 és -2 expressziós vektorokkal transzformált E. coli sejteknek pDMl.l-t kell tartalmazni abból a célból, hogy garantálják az expressziós vektor stabil fenntartását a sejtekben. E rendszert oly módon indukáljuk, hogy a közeghez IPTG-t adunk.

pDS56/RBSÍI plazmid

A pDS56/RBSll plazmidnak az Xbal és Xhol restrikciós hasítási helyek között elhelyezkedő és a replikációs tartományt, valamint a β-laktamáz gént (ez adja át a sejteknek az amplicillin rezisztenciát) tartalmazó részét (4. és 5. ábra) eredetileg a pBR322 plazmidból származtatjuk le [Bolivár és tsai: Gene 2; 95-113 (1977): Sutcliffe. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Bioi. 43: 77-90 (1979)]. Azonban a β-laktamáz gén módosítva van az által, hogy a Hindi és PstI restrikciós enzimek hasítási helyei hiányoznak. A DNS szekvencia ezen változtatásai azonban a β-laktamáz aminosav-szekvenciájára nem hatnak. A plazmid maradék része hordozza az N250PSOP29 szabályozható promotor/operátor elemet, majd ezt követik az RBSII riboszómás kötődési hely - ez az EcoRI/BamHI fragmens része -, a SAH, PStI és HindlII restrikciós enzimek hasítási helyei, az E. coli fág lambda ζ, terminátora [Schwarz és tsai: Natúré, 272, 410-414 (1978)], a kloramfenikol acetil-transzferáz promotormentes génje [Marcoli és tsai: FEBS Letters 110, 11-14 (1980)] és az E. coli rrnB operon TI terminátora [Brosius és tsai: I. Mól. Bioi. 148, 107-127 (1981)].

pDS56/RBSII(-l) plazmid

A pDS56/RBSII(-l) plazmid (6. és 7. ábra) a pDS5óhlBSII plazmidhoz hasonló, azonban RBSII(-l) riboszómás kötődési helyet tartalmaz.

pDS56/RNSll(-2) plazmid

A pDS56/RBSII(-2) plazmid (8. és 9. ábra) a pDS56/RMSII plazmidhoz hasonló, azonban RBSII(-2) riboszómás kötődési helyet tartalmaz. A fenti három plazmid egymástól az ATG start kodont követő egy nukleotidban különbözik és ez mind a három potenciális leolvasó keret fehérje kifejezését eredményezi.

pDMl. I, plazmid

A pDMl.l. plazmid (10. és 11. ábra) az E. coli sejteknek kanamicin rezisztenciát átadó transzpozon Tn5 neomicin foszfotranszferáz gént [Beck és tsai: Gene 19, 327-336 (1982)] és promotor U mutációjú [Calos, Natúré 274, 762-765 (1978)], a lac represszort kódoló lacl gént [Farabough. Natúré 274, 765-769 (1978)] hordoz. Ezenkívül a pDMl.l. plazmid tartalmazza a pACYC184 plazmid tartományt [Chang és Cohen: J. Bacteriol 134, 1141-1156 (1978)], amely a kívánt replikációhoz és a leánysejtekhez történő stabil transzmisszióhoz szükséges összes információt tartalmazza.

Megjegyezzük, hogy a fent említett plazmidon kívül ennél a kísérletnél bármely E. coli kifejezési rendszer felhasználható.

A baktériumos transzformánsokat 37 'C-on LB táptalajon tenyésztjük (Maniatis fent említett közleménye, 68. oldal) és a fehérje kifejezését oly módon indukáljuk, hogy a közeghez 1 mM IPTG-t adunk. Egyórás inkubálás után 1 ml-es mintákat veszünk és a mintákban levő sejteket centrifugálással összegyűjtjük. A sejtpelleteket Crowl és tsai fent említett közleményében leírt módon kezeljük és a lizátumokat SDS-PAGE meghatározásnak vetjük alá. Elektroforézis után a gélben levő fehérjéket Coomassie brilliant kékkel megfestjük vagy Western biot analízishez nitrocellulóz membránokra visszük át [Towbin és tsai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350 (1979); Bumetti: Anal. Biochem. 112, 195 (1981)], a fentiekben leírtak szerint nyúl anti-merozoita szérumot alkalmazva.

Az analízis szerint az egyik orientációban mindhárom leolvasásba kódolt 1,2 kb cDNS egy fehérjét képez, amely SDS-PAGE szerint mérve kb. 33 kilodalton

HU 211 673 A9 látszólagos molekulatömeggel vándorol, és nyúl antimerozoita szérumból származó anti-testekkel reagál.

DNS-szekvencia analízis

Általánosan, a DNS plazmidnak 1 ml telített egyéjszakás tenyészetekből kis méretekben történő izolálását Bimbóim és tsai módszerével végezzük el [Nucleic Acids Research 7, 1513 (1979)]. Az eljárás lehetővé teszi kis mennyiségű DNS izolálását baktériumtelepekből analitikai célokra. Nagyobb mennyiségű DNS plazmidot 1 literes tenyészetekből cézium-kloridos centrifugálással standard jegyzőkönyv szerint állítunk elő (Maniatis fent idézett műve, 93. oldal).

A lambda 5-7-ből származó 1,2 kb EcoRI-cDNS szekvenciáját a követkőképpen határozzuk meg. Az inzertet EcoRI-vel emésztjük, gél izolálásának vetjük alá és az EcoRI által emésztett pEV-vrf plazmidhoz a ^rrowl és tsai által leírt módszerrel [Gene, 38, 31 (1985)] ligáljuk. Ezt a plazmidot pEV/5-7-nek jelöljük és ezt használjuk fel az 1,2 kb cDNS inzert szaporítására hidridizációs analízishez (lásd az alábbiakban) és előzetes DNS-szekvencia analízishez, Zagursky és tsai módszerével [Gene Anal. Tech, 2, 89 (1983)].

A teljes DNS szekvencia meghatározása céljából a pEV/5-7-ből származó 1,2 kb cDNS inzertet BIORAD® M13 klónozó kit és SEQUENASE® szekvenciáié kit felhasználásával M13 mpJ9 egyetlenszálú fág vektorba alklónozzuk. A szekvenciát Sanger és tsai dideoxi láncvégződéses módszerével határozzuk meg [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)]. a SEQUENASE® kitben levő használati utasításnak megfelelően (United States Biochemical Corp., Cleveland OH, USA).

A pEV/5-7-ből származó, az 5’ és 3’ le nem fordított tartományokat magában foglaló 1,2 kb cDNS teljes nukleotid szekvenciáját az 1. ábrán tüntetjük fel.

A cDNS frekvencia a 68 helyzetben levő ATG-től az 1013 helyzetben levő TGA stop kodonig terjedő, 315 aminosavat kódoló nyitott leolvasó keretre utal, ahogyan azt az 1. ábrán feltüntettük.

A fenti fehérje 33,375 daltonos elméleti nagysága a merozoita mRNS-ből antigén-szelektáló reagens felhasználásával nyert (lásd 2. ábra, C mező, a pálya), immunológiailag lecsapott termékkel összhangban van, és a cDNS-ből a fentiekben leírt E. coli kifejező vektorokban kifejezett fehérjének is megfelel.

A lambda 5-7 cDNS inzert (1. ábra) által kódolt fehérje aminosav szekvenciájának analíziséből az a következtetés vonható le. hogy az amíno-terminálís aminosavmaradékok közül az első 20 vagy a 75-95 aminosavmaradék várhatóan teljesen hidrofób jellegű, és ez lehetséges szignál peptid funkcióra enged következtetni. Ezért a szignál peptid szekvencia kb. az első száz amino-terminális aminosavmaradékból állhat. Azt találtuk, hogy a merozoita mRNS in vitro transzlációja és immunokicsapással történő tisztítása után kapott polipeptid molekulatömege prekurzor formában kb. 35 kDa és érett formában kb. 23 kDa. Mint azt a korábbiakban már említettük, a prekurzor forma ezen nagysága a fehérje elméleti nagyságával jó egyezést mutat. Az érett forma azonban a prekurzor molekula belső vagy N-terminális fragmensét is képviselheti. A pontos amino-terminusokat ismert módszerekkel határozhatjuk meg.

A megadott aminosav-szekvenciájú polipeptid néhány tartományához epitopok rendelhetők, éspedig a hidrofilitási kritériumok [J. P. Hopp és K. R. Woods: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 3824-3828 (1981)] és a szekunder szerkezeti kritériumok [P. Y. Chou és G. D. Fasman: Advances in Enzymology, 47, 45-148 (1987)] kombinálásával.

Az alábbi tartományok tartalmazzák az antitestek valószínű epitopjait

S₇₉—(SEQ ID NO:3)

C₉₅-K,₂₃ (SEQ ID NO:4)

Pi₃₇-V₁₃₉(SEQID NO:5)

R₁₄7-F₁₅7 (SEQ ID NO:6)

N,₅₅-E₁₆₂ (SEQ ID NO:7)

R,₆₉-E_l7, (SEQ ID NO:8)

T₁₈,-E₁₈₆(SEQ IDN0:9)

Ql96^—θ225 (SEQ ID NO: 10)

T₂₃₉-G₂₄, (SEQ ID NO:11)

Ti₅₂-G₂₅₆ (SEQ ID NO:12)

A₂₅,-K₂₆₉ (SEQ ID NO: 13)

D₂₇₆-K,₈₉ (SEQ ID NO: 14)

T_29g-E_3I5(SEQIDNO:15)

T-sejt epitopok továbbá elméleti alapon Berzofsky amfilitás kritéruma szerint is ieszármaztathatók [Good et al.: Science 235, 1059-1062 (1987)]. AT-sejt epitopok kinyerése antigénekből történik [Η. M. Grey és R. Chestnut: Immunoi. Today 6, 101-106. (1985)], ezeket intracellulárisan szállítják [Schwartz A. L: Ann. Rév. Immun. 5, 195-229 (1990)] és a T-sejt receptor komplex ismeri fel, Bár néhány algorimust elsősorban a II. osztályba tartozó antigén helyek azonosítására terveztek. ezek az algoritmusok az I. osztályú peptid kölcsönhatásokkal mutatott hasonlóságok miatt a citotoxikus T limfociták peptid targetjeinek azonosítására is alkalmasak lehetnek [Feller és de la Cruz: Natúré 349, 720721 (1991)].

Ezenkívül az aszparagin aminosavnál a 20. helyzetben (D₂₀) is potenciális glikozálási hely található. Ismeretes, hogy a szénhidrátcsoportok fontos fizikai tulajdonságokat kölcsönöznek (pl. konformációs stabilitás. proteáz rezisztencia és vízmegkötő kapacitás). Megjegyezzük azonban, hogy a D₂₀ a vezető szekvencia része, és ezért az érett fehérjékben nem lehet jelen. A szénhidrátcsoportoknak a biológiai felismerésben játszott fontos szerepével kapcsolatban az alábbi irodalmi helyre hivatkozunk [J. C. Paulson: TIBS 14, 272-276(1989)].

Hibridizációs analízis

Excisztált és sporulázott oocisztákból DNS-t izolálunk tripszinnel és epével történő kezelés és PBS-el végzett mosás után, a következőképpen:

A parazita anyagot (kb. lxlO⁹ oociszta) 20 ml 0,5 M EDTA-ban (pH 8,0. 0,5% szarkozil, Sigma St. Louis MO) szuszpendáljuk és proteináz K-al (Boehringer Mannheim, Németország) 0,1 pg/ml koncentráció mel14

HU 211 673 A9 lett 2 órán át 50 °C-on, RNase-val (10 pg/ml) egy órán át 37 'C-on, majd ismét proteináz K-al egy órán át 50 ’C-on emésztjük. A fehérjét 20 mM trisz HCl-el telített fenollal [pH 7,5, 1 mM EDTA (TE)] végzett kétszeri extrakcióval és 1:1 arányú fenol-kloroform eleggyel végrehajtott egyszeri extrakcióval eltávolítjuk. A vizes fázist TE-el szemben extenzíven dializáljuk és etanolos kicsapással betöményítjük. A kitermelés lxlO⁶ oocisztára általában vonatkoztatva 0,4 mg DNS.

A parazita NDS-t a gyártó cég előírásainak megfelelően különböző restrikciós endonukleázokkal emésztjük és a kapott DNS fragmenseket 40 V mellett 2,5 órán át 0,8%-os, Loening pufferben (4,7 g NaH₂PO₄, 4,36 g trisz-bázis, 0,372 g Na₂EDTA literenként, pH 7,6) képezett agarózban végzett elektroforézissel rezolváljuk. A gélt 0,25 M HCl-el 30 percen át kezeljük, majd 0,4 N nátrium-hidroxid-oldatban egy éjszakára Zeta-Probe membránra (Bio-Rad) visszük át. A szűrőt 2xSSC-ben (pH 6,8) semlegesítjük és egy órán át 80 ’C-on vákuumban melegítjük.

A szűrőt 3 órán át 65 ’C-on 7% SDS, 1% BSA (Boehnnger, V frakció), 0,5 M NaHPO₄ puffer (pH 7,2) oldatban előhibridizáljuk. Az 5-7 gén EcoRI inzertet a pEV/5-7 plazmid fentiekben leírt módon EcoRl-val elvégzett emésztése után gél-izolálásnak vetjük alá és -^,:!P-jelzett deoxinukleotidok jelenlétében Klenow-fragmenssel végrehajtott véletlenszerű primálással jelezzük. A jelzett inzertet a be nem épült nukleotidektől spin-oszlopokban (Bio-Rad) elválasztjuk, denaturáljuk és a hidrolizációs oldathoz adjuk. Ezután 65 °C-on 12 órán át inkubáljuk. a szűrőket háromszor 2xSSC/0,1% SDS-el és kétszer 0,lxSSC/0,l% SDS-el 65 C-on mossuk. A mintához hibridizáló genom DNSfragmenseket autoradiográfiával mutatjuk ki. Bár a fentiek során a pEV/5-7 plazmidot alkalmazzuk megjegyezzük, hogy a merozoita 5-7 gén 1,2 kb cDNS inzertjét tartalmazó bármely ekvivalens vektor is megfelelő eredménnyel alkalmazható.

A fenti analízis eredményeit a 3. ábrán ismertetjük, aholis a PvuII (1), HincII (2), PstI (3), Sphl (4) és SacI (5) által végrehajtott emésztés eredményeit tüntetjük fel.

PvuII és SacI segítségével végzett emésztés után az 1., illetve 5. pályán a 6.5. illetve 3,6 kb genom DNS fragmenseket mutatjuk ki. Minthogy a cDNS kiónban ezeknek az enzimeknek nincs helyük, az Eimeria gén becsült maximális nagysága 3,6 kb.

PstI felhasználásával végzett emésztés után három fragmenst mutatunk ki (3. pálya). A cDNS szekvencia alapján két PstI hely várható, amelyek feltehetően egy 306 kb belső fragmenst (Southern biot kimutatáshoz túl kicsi) és két csatlakozó fragmenst termelnek. A harmadik nagy PstI fragmens megjelenése legjobban a belső PstI helyek között elhelyezkedő intronnal magyarázható.

Az Sphl állal termelt fragmensek sémája (4. pálya) - amely szintén kétszer vág a cDNS-ben - nem ad hatorozott információt. A cDNS szekvencia alapján várható 604 bp kis belső Sphl fragmens ebben a gélben nem mutatható ki.

A genom DNS-nek EcoRI által történő emésztése

1,2 kb genom fragmenst eredményez, amely a cDNS fragmens nagyságának felel meg. HincII és EcoRI által végzett kettős emésztés egy 0,9 kb fragmenst termel (nem ábrázoljuk).

A merozoitákból izolált poli(A)-tartalmú mRNS Northern biot analízise [Alwine és tsai: Proc. Natl. Acad. Sci, USA 74, 5350 (1977)] szerint a lambda 5-7 gén 1,2 kb cDNS fragmense egy kb. 1,3 kb hosszúságú egyetlen mRNS specieshez hibridizálódik. A nagyság összefüggésekből nyilvánvaló, hogy az 5-7 klón, a fent említett 1-5 izolátumból meghatározott 5’ kiterjesztéssel együtt a cDNS teljes hosszúságú szekvenciáját képviseli, az extrém 5’-nukleotidek lehetségek kivételével.

2. példa

Csirkének E tenella merozoita 5-7 antigénnel történő hatékonyabb immunizálása céljából a fent ismertetett 1,2 kb cDNS-t tehénhimlő-vírusba klónozzuk. Az ily módon kapott rekombináns tehénhimlő-vírust csirkék beoltására kokcidiózis vakcina alegységként használjuk.

A vektor felépítése

A rekombináns tehénhimlő-vírus (rVV) összes formája virális timidin kináz (TK) locusba történő homológ rekombináción alapul [Macket és tsai: Proc. Natl. Acad. Sci; USA 79, 7415 (1982)]. A TK loxust a tehénhimlő-vírus (VV) HindHI J fragmensbe másoljuk [Hruby és tsai: J. Virol. 43, 403 (1982)], és e fragmens egy részét szekvenciáljuk [Weir és tsai: J. Virol. 46, 530(1983)].

A rekombináláshoz a pUC8-TK-7,5K vektor szerkezetét lényegében a 344 808 sz. európai közrebocsátási iratban ismertették. Ennek lényege, hogy a vektor a VV 7,5K promotor [Venkatesan és tsai: Cell 25, 805 (1981)] által megbontott tehénhimlő-vírus TK gént hordozó pUC8 plazmid alapvázból áll. A promotorban a transzkripció irányában lefelé haladó áramban egy többszörös klónozó helyet alakítunk ki, amelynek a segítségével a kifejező gén beilleszthető. A 12. ábrán a pUC8-TK-7,5K plazmid sematikus rajzát mutatjuk be.

A szerkezet kialakítása céljából a merozoita 5-7 gént kódoló EcoRI fragmenst az alapvektorban levő polilinker EcoRI helyébe klónozzuk (lásd 12. ábra). A fragmenst a helyes orientációban tartalmazó szerkezetet az alábbiakban ismertetésre kerülő módon propagáljuk, és módosítjuk, a merozoita 5-7 gén természetes start kodontól 97 nukleotiddal felfelé irányuló áramban elhelyezkedő start kodon törlése céljából. E célból a plazmidot a Smal és BglII restrikciós enzimekkel emésztjük. A BglII helyet négy deoxiribonukleozid jelenlétében Klenow enzimmel tompává alakítjuk, majd a plazmidot újraligáljuk, a várt törlést hordozó pR3 szerkezetet (13. ábra) propagáljuk, és a tehénhimlő-vírusba történő rekombináláshoz használjuk. A 14. ábrán a rekombinált plazmid teljes szekvenciáját tüntetjük fel.

A merozoita 5-7 gént továbbá rekombinálás céljából a Dral-HindlII malária antigén leadert tartalmazó vektorba is beillesztjük. Ez a vektor, amely a 344 808 sz. európai közrebocsátási iratban került ismertetésre, a

HU 211 673 A9 pUC8-TK-7,5K vektoron alapul, azonban a 7,5K promotortől lefelé irányuló áramban a 190 kDa malária antigén leader szekvenciáját is tartalmazza. A kifejeződő gén beillesztésének biztosítása céljából e leader szekvenciával szomszédosán egy többszörös klónozó helyet alakítunk ki. A keletkező, a VV 7,5K promotor által hajtott transzkriptot a N-terminuson a 190 kDa malária antigén leadert hordozó fehérjébe fordítjuk le. A leader szekvencia potenciális hasító helyén történő in vivő átalakítás az érett fehérjéhez vezet. A 15. ábrán a merozoita 5-7 gént hordozó pR4 szerkezet sematikus rajzát mutatjuk be.

Rekombináns tehénhimlő-vírus felépítése

CV1 sejteket 8 cm²-es tenyészetlemezen szélesztiink. 33 °C-on adaptálunk, 80-90%-os összefüggő tenyészet kialakulásáig tenyésztjük, majd 0,1 plakk-képző egységgel (pfu) megfertőzzük, 1 egység tehénhimlő-vírus hőmérsékletre érzékeny ts N7 mutánsra vonatkoztatva [Drillien, R. és Spehner, D.: Virology 131, 385-393 (1983)]. A sejteket két óra múlva 33 ’C hőmérsékleten széndioxid inkubátorban [Kieny és tsai: Natúré 312, 163 (1984)] 0.25 ml kalcium-foszfát DNS csapadékkal transzfektáljuk [Weir és tsai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 1210-1214 (1982)]. A kalciumfoszfát DNS csapadék keverék az alábbi komponensekből áll: 0.8% NaCl. 0,038% KC1, 0,0134 M Na₂HPO₄-2H₂O, 0,1% glükóz; pH 7,0 és 125 mM CaCl₂. 200 ng vadtípusú DNS (WR törzs) és 100 ng megfelelő pR3 vagy pR4 rekombináns plazmid. Szobahőmérsékleten egy órán ál állni hagyjuk, majd további táptalajt adunk hozzá, és utána két órán át 39,5 C-on 5% széndioxid inkubátorban inkubáljuk. A ts N7 vírus ezen a hőmérsékleten nem képes replikálódni. és ennek eredményeként szelektálhatok azok a vírusok, amelyek legalább a ts 7 locusban rekombinálódtak.

A sejteket 2 napon át 39,5 ’C hőmérséklelen végzett inkubálás után lekaparással összegyűjtjük, és a szuszpenziót besugárzással tovább bontjuk. Az ily módon nyert homogenizátumot 30 pg/ml bróm-deoxiuridin (BUdR) jelenlétében, humán TK’ 143 sejteken végzett titrálással TK negatív (TK ) vírus előállítására használjuk fel A plakkokat összegyűjtjük, és a vírust 30 pg/ml BUdR jelenlétében további két plakktisztításnak vetjük alá humán TK’ 143 sejtekben. CV1-sejtekben, BUdR távollétében vírus készletet készítünk. Az R3.2, illetve R4.1 rekombináns tehénhimlő-vírust a TK génbe beillesztett 1.2 kb cDNS merozoita gén jelenlétére vizsgáljuk oly módon, hogy a virális DNS-t HindlII-al emésztjük, és a rW DNS-t az ugyanazon restrikciós enzimmel emésztett vadtípusú (WR) tehénhimlő DNS-el hasonlítjuk össze. Rekombináció lejátszódása esetén a HindllI J DNS fragmensben egy eltolódásnak kell látszódnia, 1% agaróz gélben történő elektroforézis után. Ezt ténylegesen megfigyeltük. Az eltolódás az inzert nagyságából következtetett számított értékekkel összhangban van.

Kifejezési teszt

A merozoita 5-7 antigénnek a rekombináns vírus által történő kifejezése céljából CV1 sejteket az rVV

R3.2 vagy rVV R4.1 által megfertőzzük, és 48 óra múlva összegyűjtjük. A sejtek centrifugálása után a pelleteket Laemmli minta-pufferben [Natúré 227, 680 (1970)] beta-merkapto-etanol redukálószer jelenlétében szolubilizáljuk. Ezután 5 percen át forraljuk, majd a mintákat 12,5%-os SDS-PAGE gélre visszük fel. Elektroforetikus elválasztás után a fehérjéket nitrocellulóz membránon [Trans-Blot, BIO RÁD; Blot-puffer: 25 mM tirs-HCl, 0,19 M glicin; pH 8,3 és 20% (v/v) metanol] 80 V állandó feszültség mellett Trasblot transzfer cellában (BIO RÁD Laboratories) 2 órán át 4 ’C-on kezeljük [Towbin és tsai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354 (1979)].

Immunodetektálás céljából a nitrocellulózt 5%-os nem zsíros tejporral TBS-ben (20 mM tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8) 45 percen át előkezeljük, és 2 órán keresztül vagy egy éjjelen át szobahőmérsékleten nyúl anti E. tenella merozoita szérum 20 térfogat/térfogat % magzati borjúszérumot tartalmazó, TBS-pufferrel készített 1:50 arányú hígításával inkubáljuk. A nitrocellulózt 0.1%? NP40-t tartalmazó TBS-el 10-10 percig háromszor mossuk, majd szobahőmérsékleten 2 órán át affinitás-tisztított kecske-anti-nyúl IgG (H+L) peroxidáz konjugátummal (BIO-RAD) TBS-ben készített 1:1000 hígításban és 5% nem zsíros tejporban inkubáljuk (H+L= az IgG nehéz és könnyű láncai). A blot-okat a fentiekben leírt módon háromszor mossuk. A peroxidáz konjugátum megkötését oly módon detektáljuk, hogy a nitrocellulózt 0,018% 4-klór-l-naftol 6% metanolt tartalmazó vizes oldatával és 0,02 térfogat/térfogat % hidrogén-peroxiddal reagáltatjuk. A reakciót a biot bőséges vizes mosásával állítjuk le.

Azl találtuk, hogy a nyúl anti E. tenella merozoita szérum Western blot-ban (Towbin és tsai: supra) rVV R3.2-vel fertőzött CVI sejtekkel reagál; 33 kDa, illetve 23 kDa értéknek megfelelő két különálló ferhérjesáv jelentkezik. Referenciának BIO-RAD előre színezett SDS-PAGE molekulatömeg standardokat (alacsony tartomány) alkalmaznk. Vadtípusú WR tehénhimlő-vírussal fertőzött CVI sejtek a nyúl anti E. tenella merozoita szérummal nem reagálnak. A 33 kDa ferhérje nagysága a prekurzor fehérje elméletileg várt értékével összhangban van (lásd 2. ábra, C mező, b pálya). A kisebb 23 kDa fehérje a fent említett prekurzor fehérje feldolgozott változata lehet, amely a merozoita felületén is látható (lásd 2. ábra, A és B mező, b pálya). Az rVV R4.1 által fertőzött CVI sejtekkel azonos eredményeket kapunk.

Western biot analízis továbbá azt mutatja, hogy sporulázott E tenella oocisták által fertőzött csirkékből nyert immunszérum a R3.2, illetve R4.1 tehénhimlővírus rekombinánsok által megfertőzött CVI sejtekben kifejezett merozoita 5-7 fehérjéket (33 kDa és 23 kDa) felismerte.

Vírus termelése

A WR törzs csaknem valamennyi sejttípusban képes multiplikálódni [Drillien és tsai: J. Virology 28, 843 (1978)] és a multiplikáció közvetlenül plakk-képződésen keresztül megfigyelhető. Nagy víruskészletek

HU 211 673 A9 készítéséhez a legtöbb esetben CV1 sejteket alkalmazunk.

A fertőzés céljából a sejttenyészet-táptalajt 175 cm²-es tenyészetüvegekben (pl. Falcon 3028) 80-90%os összefüggésig tenyésztett CV1 sejtekből eltávolítjuk, és a sejteket vírust tartalmazó PBS oldatban (0,1 pfu/ml, 0,01 ml/cm²) szobahőmérsékleten (20 ’C) másfél órán át tenyésztjük. Friss sejttenyészet táptalajt adunk hozzá (0,2 ml/cm²) és az üvegeket 37 ’C-on 2-3 napon át inkubáljuk, míg a sejtek kb. 80%-a lizálódott. A kapott törzsoldatot a vírus tisztítása előtt az eredeti tenyészetüvegekben -30 ’C-on a sejtekkel és táptalajjal együtt közvetlenül tároljuk.

A gazdasejt specifikus komponensektől mentes vírus készítmények előállításához az alábbi tisztítási lépéseket alkalmazzuk. A -30 C-on tárolt fertőzött sejttenyészeteket felengedjük és a maradék sejteket az üveg felületéről rázogatással és kaparással eltávolítjuk. A sejteket és a vírusokat a táptalajból centrifugálással izoláljuk (Sorvall centrifuga, GSA rotor, egy órán át percenkénti 5000 fordulat mellett, 10 °C). A sejtpelletet és a vírus-részecskéket PBS-ben újraszuszpendáljuk (a pellet térfogatának 10-20-szorosa) és a fentiek szerint centrifugáljuk. A pelletet 10-szeres térfogatú RBS-pufferben újraszuszpendáljuk (10 mM trisz-HCl, pH 8,0ra beállítva, 10 mM Kel, 1 mM MgClj).

A maradék intakt sejtek lizálása és a vírusnak a sejtmembránoktól történő megszabadítása céljából a fenti szuszpenziót besugárzásnak vetjük elá (kétszer. 10 mp. 60 watt. szobahőmérséklet, besugárzó berendezésben, pl. Labsonic 1510, 4 mm-es minta). Az elegyet Sorval GSA rotorban 3 percen át 10 ’C-on, percenkénti 3000 fordulat mellett centrifugáljuk. A kapott vírus szuszpenzió sejtmagoktól és nagy sejttörmeléktől mentes. A felülúszót óvatosan eltávolítjuk, és a pelletet RBS pufferben újraszuszpendáljuk, besugározzuk és centrifugáljuk, a fentiekben leírt módon.

A második felülúszót az elsővel egyesítjük, 10 ml 35%-os szacharóz-oldat (10 mM trisz-HCl-ben, pH 8,0) fölé rétegezzük és Beckman SW 27 rotorral 10 ‘C-on percenkénti 14 000 fordulat mellett centrifugáljuk. A felülúszót dekantáljuk. és a vírus-részecske pelletet 10 ml 10 mM tisz-HCl-ben (pH 8,0) újraszuszpendáljuk, besugárzással homogén keverékké alakítjuk (kétszer, szobahőmérsékleten, 10 mp-ig, a fentiekben leírt módon) és további lépcsőzetes gradiens tisztításnak vetjük alá.

A lépcsőzetes gradiens 10 mM trisz-HCl-ben (pH 8.0) készült 5 ml-es szacharóz-aliquot részekből áll, a koncentráció 20%, 25%, 30%, 35% és 40%. Ezt a gradienst Beckman SW27 rotorban 10 ’C-on percenkénti 14 000 fordulat mellett 35 percen át centrifugáljuk. A 30-40%-os szacharóz-tartományban számos, vírus-részecskéket tartalmazó sáv látható. Ezt a gradiens-tartományt eltávolítjuk. PBS-el hígítjuk és a vírus-részecskéket szedimentáljuk (Beckman SW27 rotor, 10 C-on, percenkénti 14 000 fordulat mellett, 90 percig). A csaknem kizárólag vírus-részecskéket tartalmazó pelletet PBS-ben újraszuszpendáljuk oly módon, hogy a víruskoncentráció átlagosan 0,5-1x10'° pfu/ml. Ezt a vírus törzsoldatot közvetlenül felhasználjuk vagy PBS-el hígítjuk.

A víruskoncentráciő és a vírus törzsoldat tisztaságának meghatározásához két módszert alkalmazunk. A vírus-részecskék abszolút koncentrációját oly módon határozzuk meg, hogy a törzsoldat optikai sűrűségét (OD) spektrofotométerben 260 nm hullámhosszon (OD/260 nm) mérjük, aholis 1 OD/260 kb.l,2xl0¹⁰ részecske/ml értéknek felel meg [Joklik: Virology 18, 9 (1962)]. A víruskoncentrációí a vírusnak sejteken történő titrálásával is meghatározhatjuk (plakk assay) abból kiindulva, hogy 60 vírus-részecskéből csak egy képes a sejt megfertőzésére.

A víruskoncentráciő tenyésztett sejteken történő titrálásához csirke embrió fibroblasztok (CEF) sejteket sejttenyészet-táptalajban 8 cm²-es tenyészetlemezeken tenyésztünk (Falcon 3001). Miután a sejtek a 80-90%os összefüggő állapotot elérték, a táptalajt eltávolítjuk, 0,2 ml hígított PBS-oldatra cseréljük le és szobahőmérsékleten egy órán át állni hagyjuk. A vírus törzsoldatot 10-szeres léptékkel hígítjuk. Minden lemezhez 1% agarózt tartalmazó félszilárd sejttenyészet táptalajt (2 ml) adunk, és a lemezeket 16-24 órára 37 ’C-on széndioxid inkubátorba helyezzük. Ezután az élő sejtek megfestése céljából 0,2% semleges vöröst tartalmazó félszilárd sejttenyészet-táptalajt (2 ml) rétegezünk föléje. és a lemezeket további 16-24 órán át inkubáljuk. A színtelen plakkokat mikroszkóp alatt megszámláljuk.

3. példa

Csirke immunizálás

Annak meghatározása céljából, hogy a merozoita 5-7 gént körülvevő rW-R3.2 tehénhimlő virális vektor megvédi-e a csibéket a patogén E. tenella törzs sporuláló oocisztáival szemben, az alábbi beoltásokat végezzük el:

Az E. Wuetrich (Belp, Svájc) keltető állomástól származó, Warren fajhoz tartozó fiatal kakasokat drótaljazattal ellátott ketrecekben túlnyomórészt kukoricából, búzából és szójababból álló kereskedelmi broiler lápon tartunk. A madarakat a 17. napon rekombináns tehénhimlő R3.2 vírussal beoltjuk (3xl0⁸ pfu, 100 μΐ RBS-ben) oly módon, hogy 50 μΙ-t szubkutáns a szárnyszövetbe és további 50 μΙ-t intramuszkulárisan a csibék mellébe fecskendezünk. Ezt a műveletet egyhetes időközökben kétszer megismételjük, azonban az egyik kezelt csoportnál az utolsó vírus injekciót E. tenella virulens törzs (pl. T7-776/21 törzs) 5000 sporulázó oocisztájának orális beadásával helyettesítjük; ennek célja, hogy a csibéket a szabadföldi körülmények szimulálásával tegyük ki a kokcidiózis fertőzésnek. Az utolsó immunizálás után egy héttel az összes csibét analitikai célból véreztetjük, majd további egy hét elteltével (a 45. napon) a madarakat E. tenella (pl. T7776/21 törzs) 50 000 sporuláló oocisztájával megfertőzzük. A paraziták 7 napos fejlődési ciklusának befejeződése után a csibéket az 52. napon véreztetjük, leöljük és felboncoljuk. A fertőzött vakbeleket eltávolítjuk, a parazita által okozott sérüléseket értékeljük és az oociszta-tartalom meghatározása céljából a teljes szövetet homogenizáljuk. Ezenkívül a csibék fejlődését feljegyezzük (napi tömeggyarapodás és takarmányátalakítás).

HU 211 673 A9

Megvédő teszt

Az 1. táblázat adatai világosan mutatják, hogy a rekombináns tehénhimlő-vírussal történő beoltás súlyos kokcidiózis fertőzéssel szemben jelentős védőhatást eredményezett. A fertőzött kontrolihoz viszonyítva a sé- 5 rülések száma 18%-kal és az ürülék oociszta-tartalma 35%-kal csökkent. A gazdaságilag legfontosabb paraméter - a csibék fejlődése - is javult, éspedig a napi tömeggyarapodás 62%-kal és a takarmány átalakítás 56%kal. Ha az utolsó vírus injekció befecskendezési enyhe 10 kokcidiózis fertőzéssel helyettesítjük, a csibék kokcidiózissal szembeni védelme közel teljes. Ezeknek a csibéknek a fejlődése a nem fertőzött kontrollal egyenértékű, és a sérülések száma, valamint a vakbél oociszta-tartalma alacsony. Minthogy egyetlen E. ten el la oltás még soha sem eredményezett ilyen nagyfokú védelmet, az a következtetés vonható le, hogy a vírusalapú oltás a csibék immunrendszerét olyan erősen működésbe hozta, hogy a későbbi enyhe kokcidiózis fertőzés emlékeztető hatást fejtett ki, és ez a kokcidiózissal szembeni ilyen erős immunvédelmet hozott létre.

Csirkék humorális állapota

A csirkék humorális állapotát közvetlen ELISA és Western biot segítségével az alábbi módszerrel analizáljuk.

1. táblázat

Rekombináns tehénhimlő rW-R3.2 vírussal, 50 000 E. tenella oocisztával történő fertőzés után beoltott csibék fejlődése és parazitológiai paraméterei

i Kezelés 1. ..............	Fertőzés	Csoporlszám csirkénként	Átlagos testtömeg (g) a 45. napon	Átlagos ^3ρ'tö testtömeg , , rapodás (g)az5Z (g)45η3ροη 52. nap	Átlagos takarmány átalakítás 4552.nap	Sérülés értékelés (csoportszám)	Ürülék oociszta- tartalma (Mio/g ürülék)
1. immunizálás*	2. immunizálás*	3. immunizálás
-	-	-	-	3/12	788,2	985,8 28,2	2,66	0	0
V	V	V	+	3/12	778,1	860,4 1 11,8	5,19	1,58	1,73
j V	V	c	+	3/12	779.3	960.6 1 25,9	2,98	0,75	0,18
-	-	-	+ 1	3/12	783.0	834.3 ' 7.3	11.88	1.92	2.67

’ V = 3xI0⁸ PFU rekombináns vírus befecskendezése (100 μΙ/csibe)

C = 5000 E. tenella oocisztával történő beoltás (csibénként )

A Western biot analízist a fentiekben leírtak szerint végezzük el. azzal a változtatással, hogy a csirke szérum minták készítése előtt további inkubálási lépést iktatunk be. E lépés során a nítrocellulóz blot-ot az összes tehénhimlő specifikus fehérje összegyűjtése céljából hiperimmun nyúl anti tehénhimlő szérummal inkubáljuk (2 óra, szobahőmérséklet, 1:50 hígítás).

A közvetett ELISA-hoz in vitro csirke vese sejttenyészetekből nyert harmadik generációs E. tenella merozoitákat alkalmazunk. A mikortiter lemezekei 100 ml nátrium-karbonát-hidrogénkarbonát pufferben (pH 9,6) oldott 3000 merozoitával (lemezenként) vonjuk be, és egy éjjelen át 4 °C-on inkubáljuk. A lemezeket ionmentesített vízzel háromszor mossuk, és 200 mi blokkoló pufferrel újra feltöltjük (0,1 M Na₂HPO₄, a pH-t sósavval 6,5 értékre állítjuk be. 1% BSA. 0,5 g/l nátrium-etil-merkuritioszalicilát). A blokkolási egy éjjelen ál 4 C-on végezzük. Állatonként 2 szémrumminlát tesztelünk. Az egyik mintát egy héttel az immunizálás után, és a másodikat közvetlenül az állatok leölése előtt vesszük le. A mintákat 3% teport tartalmazó PBS-el két lépésben hígítjuk; 1:50szeres hígítással indulunk. Az inkubálást 4 órán át 37 ’Con végezzük (100 ml). A lemezeket a fentiekben leírt módon mossuk, majd mélyedésenként 100 ml peroxidázzal (1:2000 hígítás, 3% tejport tartalmazó PBS-el) jelzett kecske anti-csirke konjugátomol (H+L) adunk hozzá. Az inkubálást 37%-on 2 órán át végezzük. Az antitest-antigén komplexet 100 ml TMB-szubsztrátum hozzáadásával tesszük láthatóvá. ATMB-szubsztrátum 1 részTMBből (0,24 g tetrametil-benzidin 5 ml acetonnal képezett és metanollal 50 ml-rc kiegészített oldata) és 20 rész szubsztrátumból (0.2 M citromsav, pH 4,0,275 ml/1 H₂O₂ 30%) áll.

A reakciót 0.5 M kénsavval leállítjuk, majd a lemezeket ELISA leolvasóban (Títertek Multiskan MCC/340, Flow Laboratories) 450 nm mellett leolvassuk.

A csirkék R3.2 és R4.1 rekombináns vírussal történő beoltása után a sporulázó oociszták alacsony dózisával immunizált kontroll állatokhoz (átlagos titer >1:1600) viszonyítva kokcidiózis merozoitákra csak gyenge humorális antitest válasz (átlagos titer = 1:100) figyelhető meg. Ez arra utal, hogy a beoltott csirkék pozitív reakciója és fejlődése sejtek által közvetített effektor mechanizmus eredménye lehet (lásd 1. táblázat és fentiekben tárgyalt eredmények).

Merozoita 5-7 antigének elleni specifikus antitestek jelenlétének igazolása céljából ELISA-ban legmagasabb antitest titert mutató vérmintákat Western bloton tesztelünk, antigénforrásként rVV 3.2 által fertőzött CV1 sejtek felhasználásával. Az összes szérum felismerte a 33 kDa, illetve 23 kDa fehérjét, és ez sikeres immunizálás lejátszódását jelzi.

A jelen találmánynak a szakember számára nyilvánvaló sok módosítása és variációja végezhető el anélkül, hogy a találmány szellemétől és lényegétől eltérnénk. Az itt leírt specifikus kiviteli alakok csupán példálódzó jellegűek, és találmányunkat kizárólag az igénypontok korlátozzák.

HU 211 673 A9

SZEKVENCIÁK FELSOROLÁSA		(D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Versi-
(1) ÁLTALÁNOS INFORMÁCIÓ		on#!^ (EPO)
(i) BEJELENTŐ		(v) JELEN BEJELENTŐ ADATAI:
(A) NÉV: F. HOFFMANN-LA ROCHE AG		BEJELENTÉS SZÁM:
(B) UTCA: Grenzacherstrasse 124	5	(vi) KORÁBBI BEJELENTÉS ADATAI
(C) VÁROS: Basel		(A) BEJELENTÉS SZÁMA: US 07/729,099
(D) ÁLLAM: BS		(B) BEJELENTÉS NAPJA: 1991.07. 12.
(E) ORSZÁG: Svájc		(2) SEQ ID NO: 1-RE VONATKOZÓ INFORMÁ-
(F) POSTAI KÓD (ZIP): CH-4002		CIÓK:
(G) TELEFON: 061-688 24 03	10	(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐ VONÁSAI:
(H) TELEFAX: 061-688 13 95		(A) HOSSZÚSÁG: 315 aminosav
(I) TELEX: 962292/965542 hlrchh		(B) TÍPUS: aminosav
(ii) TALÁLMÁNY CÍME: Kokcidiózis vakcinák		(D) TOPOLÓGIA: ismeretlen
(iii) SZEKVENCIÁK SZÁMA: 15		(ii) MOLEKULA TÍPUS: fehérje
(iv) KOMPUTER ÁLTAL OLVASHATÓ FORMA:	15	(iii) HIPOTETIKUS: NEM
(A) MÉDIA TÍPUSA: floppy disk		(vi) EREDETI FORRÁS:
(B) KOMPUTER: IBM PC kompatibilis		(A) SZERVEZET: Eimeria tenella
(C) OPERATÍV RENDSZER: PC-DOS/MS-		(B) KIFEJLŐDÉSI SZAKASZ: Merozoita

DOS (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO: 1 :

Met

Alá

Lys

Ser Met

Leu

Ser

Gly

Ile

Val

Phe Alá Gly Leu

Val

Alá

1

5

10

15

Alá

Alá

Alá

Alá

Ser

Ser

Alá

Asn

Ser

Alá

Alá

Asn

Val

Ser

Val

Leu

20

25

30

Glu

Ser

Gly

Pro

Alá

Val

Gin

Glu

Val

Pro

Alá

Arg

Thr

Val

Thr

Alá

35

40

45

Arg

Leu

Alá

Lys

Pro

Leu

Leu

Leu

Leu

Ser

Alá

Leu

Alá

Alá

Thr

Leu

5 0

55

60

Alá

Alá

Alá

Phe

Leu

Val

Leu

Gin

Cys

Phe

Asn

Ile

Ile

Ser

Ser

Asn

65

70

75

80

Asr.

Gin

Gin

Thr

Ser

Val

Arg

Arg

Leu

Alá

Alá

Gly

Gly

Alá

Cys

Gly

85

90

95

Asp

Glu

Glu

Asp

Alá

Asp

Glu

Gly

Thr

Ser

Gin

Gin

Alá

Ser

Arg

Arg

100

105

110

Arg

Arg

Lys

Pro

Asp

Thr

Pro

Alá

Alá

Asp

Lys

Tyr

Asp

Phe

Val

Gly

115

120

125

Gly

Thr

Pro

Val

Ser

Val

Thr

Glu

Pro

Asn

Val

Asp

Glu

Val

Leu

Ile

130

135

140

Gin

Ile

Arg

Asn

Lys

Gin

Ile

Phe

Leu

Lys

Asn

Pro

Trp

Thr

Gly

Gin

145

150

155

160

Glu

Glu

Gin

Val

Leu

Val

Leu

Glu

Arg

Gin

Ser

Glu

Glu

Pro

Ile

Leu

165

170

175

Ile

Val

Alá

Arg

Thr

Arg

Gin

Thr

Leu

Glu

Gly

Tyr

Leu

Gly

Ser

Gin

180

185

190

Alá

Leu

Alá

Gin

Asp

Gly

Lys

Thr

Alá

Lys

Glu

Glu

Lys

Val

Glu

Gly

195

200

205

Gly

Lys

Thr

His

Arg

Arg

Tyr

Lys

Val

Lys

Ser

Ser

Asp

Pro

Gly

Tyr

210

215

220

Gly

Phe

Pro

Tyr

Thr

Thr

Val

Leu

Asp

Gly

Val

Pro

Val

Gly

Thr

Asp

225

230

235

240

Glu

Asp

Gly

Tyr

Val

Val

Glu

Val

Leu

Met

Lys

Thr

Gly

Pro

His

Gly

245

250

255

Gly

Val

Asp

Met

Met

Thr

Ser

Thr

Alá

Ser

Gin

Gly

Lys

Phe

Cys

Gly

260

265

270

Val

Leu

Met

Asp

Asp

Gly

Lys

Gly

Asn

Leu

Val

Asp

Gly

Gin

Gly

Arg

275

280

285

Lys

Ile

Thr

Alá

Val

Ile

Gly

Met

Leu

Thr

Gin

Pro

Asp

Thr

Glu

Phe

290

295

300

Arg

Ser

Gly

Pro

Gly

Asp

Asp

Glu

Asp

Asp

Glu

305

310

315

HU 211 673 A9 (2) SEQ ID NO: 2-RE VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK: (ii) MOLEKULA TÍPUS: cDNA (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐ VONÁSAI: (iii) HIPOTETIKUS: NEM (A) HOSSZÚSÁG: 948 bázispár (iv) ΑΝΤΙ-ÉRZÉKELÉS: NEM (B) TÍPUS: nukleinsav (vi) EREDETI FORRÁS:

(C) SZÁLTÍPUS: egyetlen 5 (A) SZERVEZET: Eimeria tenella (D) TOPOLÓGIA: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO:2:

ATGGCTAAGT CTATGCTTTC TGGAATTGTT TTTGCTGGTC TTGTTGCTGC TGCAGCGGCC 60 AGTTCGGCCA ACAGCGCCGC CAACGTCTCC GTTTTGGAGA GTGGGCCCGC TGTGCAGGAA 120 GTGCCAGCGC GCACGGTCAC AGCTCGCCTG GCGAAGCCTT TGCTGCTTCT TTCTGCTCTT 180 GCTGCGACTT TGGCAGCAGC TTTCCTCGTT TTGCAATGCT TCAACATCAT CTCCAGCAAC 240 AACCAGCAAA CCAGCGTCAG GAGACTGGCC GCCGGAGGTG CATGCGGAGA TGAGGAAGAT 300 GCAGATGAGG GAACTTCACA GCAGGCCAGC CGGAGGAGGA GAAAACCTGA TACCCCTGCA 360 GCAGATAAAT ACGATTTTGT TGGCGGAACT CCAGTTTCGG TCACTGAGCC GAATGTTGAT 420 GAAGTCCTTA TCCAAATTAG AAATAAACAA ATCTTTTTGA AGAACCCATG GACTGGACAA 480 GAAGAACAAG TTCTAGTACT GGAACGACAA AGTGAAGAAC CCATTCTGAT TGTGGCGAGG 540 ACAAGACAAA CACTTGAAGG ATATCTTGGT AGTCAAGCTC TTGCACAGGA CGGAAAGACT 600 GCTAAAGAAG AGAAAGTTGA AGGAGGCAAA ACTCACAGAA GATATAAAGT CAAGAGCAGC 660 GACCCAGGAT ATGGATTCCC ATACACCACG GTGCTCGACG GGGTTCCTGT GGGAACAGAC 720 GAAGACGGAT ACGTTCGTCA AGTTCTTATG AAAACCGGAC CCCATGGAGG AGTCGACATG 780 ATGACTAGCA CAGCATCACA AGGAAAATTC TGCGGAGTGC TTATGGATGA CGGAAAAGGA 840 AACCTAGTCG ATGGACAAGG GAGAAAAATT ACCGCCGTTA TCGGCATGCT AACTCAACCG 900 GATACCGAGT TTAGAAGCGG ACCAGGAGAC GACGAGGACG ACGAGTGA 948 (2) SEQ ID NO:3-RA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK: 25 fi) SZEKVENCIA JELLEMZŐ VONÁSAI:

(A) HOSSZÚSÁG: 8 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUS: peptid 30 (iii) HIPOTETIKUS: IGEN (v) FRAGMENS TÍPUS: belső (vi) EREDETI FORRÁS:

(A) SZERVEZET: Eimeria tenella

(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁSA:	SEQ IDNO:3:	35
Ser	Asn	Asn	Gin	Gin	Thr	Ser	Val
i_				5
Cys	Gly	Asp	Glu	Glu	Asp	Alá	Asp	Glu	C-ly	Thr
1				5					10
Alá	Ser	Arg	Arg	Arg	Arg	Lys	Pro	Asp	Thr	Pro
15					20					25
Lys

(2) SEQ ID NO:4-RE VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐ VONÁSAI:

(A) HOSSZÚSÁG: 29 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUS: peptid (iii) HIPOTETIKUS: IGEN (v) FRAGMENS TÍPUS: belső (vi) EREDETI FORRÁS:

(A) SZERVEZET: Eimeria tenella (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO:4:

(2) SEQ ID NO:5-RE VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐ VONÁSAI:

(A) HOSSZÚSÁG: 3 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUS: peptid (iii) HIPOTETIKUS: IGEN (v) FRAGMENS TÍPUS: belső (vi) EREDETI FORRÁS:

(A) SZERVEZET: Eimeria tenella (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO:5:

Pro Asn Val (2) SEQ ID NO:6-RA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐ VONÁSAI:

(A) HOSSZÚSÁG: 6 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUS: peptid (iii) HIPOTETIKUS: IGEN (v) FRAGMENS TÍPUS: belső (vi) EREDETI FORRÁS:

(A) SZERVEZET: Eimeria tenella (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO.6. Arg Asn Lys Gin Ile Phe 1 5 (2) SEQ ID NO:7-RE VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐ VONÁSAI;

(A) HOSSZÚSÁG: 8 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris 60 (ii) MOLEKULA TÍPUS: peptid

HU 211 673 A9 (iii) HIPOTETIKUS: IGEN (v) FRAGMENS TÍPUS: belső (vi) EREDETI FORRÁS:

(A) SZERVEZET: Eimeria tenella (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO:7:

Asn Pro Trp Thr Gly Gin Glu Glu 1 5 (2) SEQ ID NO: 8-RA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐ VONÁSAI:

(A) HOSSZÚSÁG: 5 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUS: peptid (iii) HIPOTETIKUS: IGEN (v) FRAGMENS TÍPUS: belső (vi) EREDETI FORRÁS:

(A) SZERVEZET: Eimeria tenella (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO:8:

Arg Gin Ser Glu Glu

5 (2) SEQ ED NO: 9-RE VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐ VONÁSAI:

(A) HOSSZÚSÁG: 6 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUS: peptid 5 (iii) HIPOTETIKUS: IGEN (v) FRAGMENS TÍPUS: belső (vi) EREDETI FORRÁS:

(A) SZERVEZET: Eimeria tenella (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO:9:

Thr Arg Gin Thr Leu Glu

5 (2) SEQIDNO: 10-RE VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐ VONÁSAI:

(A) HOSSZÚSÁG: 30 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUS: peptid (iii) HIPOTETIKUS: IGEN (v) FRAGMENS TÍPUS: belső (vi) EREDETI FORRÁS:

(A) SZERVEZET: Eimeria tenella (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO: 10:

Gin	Asp	Gly	Lys	Thr
1				5
Lys	Thr	His	Arg	Arg
15

Alá Lys Glu Glu Lys 10

Tyr Lys Val Lys Ser 20

Val

Ser

Glu Gly Gly

Asp Pro Gly Tyr Gly 30 (2) SEQ ID NO: 11-RE VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐ VONÁSAI:

(A) HOSSZÚSÁG: 5 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUS: peptid (iii) HIPOTETIKUS: IGEN tv) FRAGMENS TÍPUS: belső (vi) EREDETI FORRÁS:

(A) SZERVEZET: Eimeria tenella (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO: 11:

Thr Asp Glu Asp Gly

5 (2) SEQIDNO1: 12-RE VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐ VONÁSAI:

(A) HOSSZÚSÁG: 5 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (DJ TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUS: peptid (iii) HIPOTETIKUS: IGEN (v) FRAGMENS TÍPUS: belső (vi) EREDETI FORRÁS:

(A) SZERVEZET: Eimeria tenella (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO: 12:

Thr Gly Pro His Gly

5 (2) SEQIDNO: 13-RA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐ VONÁSAI:

(A) HOSSZÚSÁG: 5 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUS: peptid (iii) HIPOTETIKUS: IGEN (v) FRAGMENS TÍPUS: belső (vi) EREDETI FORRÁS:

(A) SZERVEZET: Eimeria tenella (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO: 13:

Alá Ser Gin Gly Lys

5 (2) SEQIDNO: 14-RE VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐ VONÁSAI:

(A) HOSSZÚSÁG: 14 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUS: peptid (iii) HIPOTETIKUS: IGEN (v) FRAGMENS TÍPUS: belső (vi) EREDETI FORRÁS:

(A) SZERVEZET: Eimeria tenella (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO: 14:

Asp Asp Gly Lys Gly Asn Leu Val Asp Gly Gin Gly Arg Lys 15 10 (2) SEQIDNO: 15-RE VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK:

(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐ VONÁSAI: 60 (A) HOSSZÚSÁG: 18 aminosav (B) TÍPUS: aminosav

HU 211 673 A9 (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUS: peptid (in) HIPOTETIKUS: IGEN (v) FRAGMENS TÍPUS: C-terminális (vi) EREDETI FORRÁS:

(A) SZERVEZET: Eimeria tenella (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO:15:

Thr Gin Pro Asp Thr Glu Phe Arg Ser Gly Pro Gly Asp Asp Glu Asp Asp Glu

Claims (57)

15 10 15

SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1 . (1) (SEQ ID NO.l) M A KSMLSGIVFAGLVAAAAA S Ξ ANSAANVSVLESGPAVQE V P ARTVTARLAKPLLLLSAL A A TLAAAFLVLQCFNIISSN N Q QTSVRRLAAGGACGDEED A D EGTSQQASRRRRKPDTPA A D KYDFVGGTPVSVTEPNVD Ε V LIQIRNKQIFLKNPWTGQ Ε Ξ QVLVLERQSEEPILIVAR T R QTLEGYLGSQALAQDGKT A K EEKVEGGKTHRRYKVKSS D P GYGFPYTTVLDGVPVGTD E D GYVVEVLMKTGPHGGVDM Μ T STASQGKFCGVLMDDGKG N L VDGQGRKITAVIGMLTQP D T EFRSGPGDDEDDE (I)

(SEQ ID NO: 1) képletű aminosav-szekvenciát tartalmazó immunogén polipeptid vagy fragmensei. amely fragmensek Eimeira paraziták elleni immunválasz kiváltására képesek, mimellett a fenti polipeptid és fragmensei Eimeria paraziták által termelt más fehérjéktől lényegében mentesek.

2. Az 1. igénypont szerinti immunogén polipeptid, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti immunogén polipeptid fragmense, amelyből a fenti polipeplid szignál peptid szekvenciája hiányzik.

3. Az 1. igénypont szerinti immunogén polipeptid.

azzal jellemezve, hogy az immunogén polipeptidnek SDS-PAGE szerint mérve 23 kilodalton látszólagos molekulatömegű fragmense.

4. Az 1. igénypont szerinti immunogén polipeptid, azzal jellemezve, hogy T-sejt által közvetített immunválasz kiváltására képes.

5. Az 1. igénypont szerinti immunogén polipeptid, azzal jellemezve, hogy valamely alábbi aminosav-szekvenciájú peptid:

SNNQQTSV (2)(SEQ ID NO:3),

CGDEEDADEGTSQQASRRRRKPDTPAADK (3)(SEQ1DNO:4),

PNV (4)(SEQ ID NO:5),

RNKQIF (5)(SEQ ID NO:6),

NPWTGQEE (6)(SEQ ID NO:7),

RQSEE(7l(SEQ ID NO:8).

TRQTLE (8) (SEQ ID NO:9).

QDGKTAKEEKVEGGKTHRRYKVKSSDPGYG (9)(SEQ IDNO:10).

TDEDG (lO)tSEQ ID NO:11),

TGPHG (11)(SEQID NO: 12),

ASQGK (12)( SEQ ID NO: 13),

DDGKGNLVDGQGRK (13)(SEQ ID NO: 14), vagy

TQPDTEFRSGPGDDEDDE (14)(SEQ ID NO: 15).

6. (SEQ ID NO.l) szekvenciát vagy annak részle35 ges szekvenciáját tartalmazó immunogén polipeptidet kódoló izolált DNS molekula, mimellett a fenti polipeptid Eimeria paraziták elleni immunválasz kiváltására képes.

7. (A) (SEQ ID NO:2)

ATGGCTAAGTCTATGCTTTCTGGAATTGTTTTTGCTGGTCTTGTTGCTGCTGCAGCG GCCAGTTCGGCCAACAGCGCCGCCAACGTCTCCGTTTTGGAGAGTGGGCCCGCTGTG CAGGAAGTGCCAGCGCGCACGGTCACAGCTCGCCTGGCGAAGCCTTTGCTGCTTCTT TCTGCTCTTOCTGCGACTTTGGCAGCAGCTTTCCTCGTTTTGCAATGCTTCAACATC ATCTCCAGCAACAACCAGCAAACCAGCGTCAGGAGACTGGCCGCCGGAGGTGCATGC GGAGATGAGGAAGATGCAGATGAGGGAACTTCACAGCAGGCCAGCCGGAGGAGGAGA AAACCTGATACCCCTGCAGCAGATAAATACGATTTTGTTGGCGGAACTCCAGTTTCG GTCACTGAGCCGAATGTTGATGAAGTCCTTATCCAAATTAGAAATAAACAAATCTTT TTGAAGAACCCATGGACTGGACAAGAAGAACAAGTTCTAGTACTGGAACGACAAAGT GAAGAACCCATTCTGATTGTGGCGAGGACAAGACAAACACTTGAAGGATATCTTGGT AGTCAAGCTCTTGCACAGGACGGAAAGACTGCTAAAGAAGAGAAAGTTGAAGGAGGC AAAACTCACAGAAGATATAAAGTCAAGAGCAGCGACCCAGGATATGGATTCCCATAC ACCACGGTGCTCGACGGGGTTCCTGTGGGAACAGACGAAGACGGATACGTCGTCGAA GTTCTTATGAAAACCGGACCCCATGGAGGAGTCGACATGATGACTAGCACAGCATCA CAAGGAAAATTCTGCGGAGTGCTTATGGATGACGGAAAAGGAAACCTAGTCGATGGA CAAGGGAC-AAAAATTACCGCCGTTATCGGCATGCTAACTCAACCGGATACCGAGTTT AGAAGCGGACCAGGAGACGACGAGGACGACGAGTGA (A) (SEQ ID NO:2) képletű nukleotid szekvenciát vagy funkcionális ekviva- kula, amely Eimeria parazitákkal szemben immunválensét teljesen vagy részben tartalmazó izolált DNS mole- 60 lasz kiváltásra képes immunogén polipeptidet kódol.

HU 211 673 A9

8. A 6. igénypont szerinti DNS molekulát tartalmazó rekombináns vektor, amely a fenti DNS kompatibilid gazdaszervezetben történő kifejezésének irányítására képes.

9. Az 1-3. igénypontok szerinti immunogén polipeptid, egyedeknek kokcidiózissal szemben történő immunizálására.

10. Eljárás az 1-3. igénypontok szerinti immunogén polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) a fenti polipeptidet kódoló nukleotid szekvenciát tartalmazó DNS-t magában foglaló rekombináns vektort tartalmazó transzformált mikroorganizmust a DNS kifejezésére alkalmas körülmények között tenyésztünk; és

b) a polipeptidet vagy fragmensét a tenyészetből izoláljuk.

11. Eljárás az 1-3. igénypont bármelyike szerinti polipeptidet kódoló nukleotid szekvenciát tartalmazó DNS-t magában foglaló rekombináns vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) a fenti polipeptidet kódoló nukleotid szekvenciát tartalmaz DNS-t egy vektorba beillesztünk;

b) a fenti vektort egy mikroorganizmusban replikáljuk; és

c) a rekombináns vektort a mikroorganizmusból izoláljuk.

12. Eljárás az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti polipeptideket kódoló nukleotid szekvenciát tartalmazó DNS-t magában foglaló rekombináns vírus előállítására. azzal jellemezve, hogy

a) a fenti polipeptidet kódoló nukleotid szekvenciát tartalmazó DNS-t egy vírus genomjába a virális érettség és fertőzőképesség gátlása nélkül beillesztünk;

b) a fenti rekombináns vírust egy sejttenyészetben amplifikáljuk; és

c) a rekombináns vírust a sejttenyészetből tisztítjuk.

13. Eljárás az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid termelésére képes transzformált mikroorganizmus előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) valamely mikroorganizmust a fenti polipeptidet kódoló nukleotid szekvenciát tartalmazó DNS-t magában foglaló rekombináns vektorral transzformálunk; és

b) a transzformált mikroorganizmust fermentációs táptalajban tenyésztjük.

14. Vakcina, egyedeknek kokcidiózissal szemben történő megvédésére, azzal jellemezve, hogy valamely, az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet és fiziológiailag alkalmas hordozóanyagot vagy adjuvánst tartalmaz.

15. Vakcina, egyedeknek kokcidiózissal szemben történő megvédésére, azzal jellemezve, hogy az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet kódoló nukleotid szekvenciát tartalmazó DNS-t magában foglaló, megfelelő gazdaszervezetben a DNS kifejezésének irányítására képes rekombináns vírust és fiziológiailag alkalmas hordozóanyagot vagy adjuvánst tartalmaz.

16 Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidek felhasználása egyedeknek kokcidiózissal szemben történő megvédésére szolgáló vakcina előállítására.

17. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid, azzal jellemezve, hogy a 10. igénypont szerinti eljárással állítjuk elő.

18. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet kódoló nukleotid szekvenciát tartalmazó DNS-t magában foglaló rekombinás vektor, azzal jellemezve, hogy all. igénypont szerinti eljárással állítjuk elő.

19. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet kódoló nukleotid szekvenciát tartalmazó DNS-t magában foglaló rekombináns vírus, azzal jellemezve, hogy a 12. igénypont szerinti eljárással állítjuk elő.

20. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet kódoló nukleotid szekvenciát tartalmazó DNS-t magában foglaló rekombináns vektort tartalmazó transzformált mikroorganizmus, azzal jellemezve, hogy a 13. igénypont szerinti eljárással állítjuk elő.

21. Eljárás egyedeknek kokcidiózissal szemben történő megvédésére, azzal jellemezve, hogy kokcidiózis veszélyének kitett fiatal egyednek hatékony mennyiségben az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet és fiziológiailag alkalmas hordozóanyagot tartalmazó vakcinát adunk be.

22. Eljárás egyedeknek kokcidiózissal szemben történő megvédésére, azzal jellemezve, hogy a kokcidiózis veszélyének kitett egyednek

a) az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet kódoló nukleotid szekvenciát tartalmazó DNS-t magában foglaló, kompatibilis gazdaszervezetben a DNS kifejezésének irányítására képes rekombináns vírust; és

f) fiziológiailag alkalmas hordozóanyagot tartalmazó vakcinát adunk be.

23. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polipeptidet vagy polipeptid fragmenst a vakcinával kezelendő egyed 1 kg testtömegére vonatkoztatva kb. 5-50 gg, előnyösen 25-50 gg mennyiségben alkalmazzuk.

24. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rekombináns vírusként valamely rekombináns himlővírust, pl. rekombináns szárnyas vírust alkalmazunk.

25. A 21. vagy 22, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy további lépésként egy vagy több emlékeztető oltást adunk be.

26. Eljárás egyedeknek kokcidiózissal szemben történő megvédésére, azzal jellemezve, hogy hatékony mennyiségben az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet és gyógyászatilag alkalmas hordozóanyagot tartalmazó vakcinát a tojásba juttatunk.

27. Eljárás egyedeknek kokcidiózissal szemben történő megvédésére, azzal jellemezve, hogy az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet kódoló nukleotid szekvenciát tartalmazó DNS-t magában foglaló, a DNS kifejezésének irányítására képes rekombináns vírust és fiziológiailag alkalmas hordozóanyagot tartalmazó vakcinát hatékony mennyiségben a tojásba juttatunk.

28. A 26.igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez23

HU 211 673 A9 ve, hogy további lépésként az egyednek egy vagy több emlékeztető oltást adunk be.

29. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy további lépésként az egyednek egy vagy több emlékeztető oltást adunk be.

30. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy további lépésként az egyedben utólagos enyhe kokcidiózis fertőzést váltunk ki.

31. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy további lépésként az egyedben utólagos enyhe kokcidiózis fertőzést váltunk ki.

32. A 26.igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tojásban levő egyedel védünk meg.

33. A 27 igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tojásban levő egyedet védünk meg.

34. Anyag vagy kompozíció egyedeknek kokcidiózissal szemben történő megvédésében történő felhasználásra, azzal jellemezve, hogy a fenti anyag vagy kompozíció az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet és fiziológiailag alkalmas hordozóanyagot tartalmaz, és a megvédő eljárás során a fenti anyag vagy kompozíció hatékony mennyiségét a kokcidiózis veszélyének kitett fiatal egyednek beadjuk.

35. Anyag vagy kompozíció, egyedeknek kokcidiózissal szemben történő megvédésében történő felhasználásra. azzal jellemezve, hogy a fenti anyag vagy kompozíció olyan vakcinát tartalmaz, amely

a) az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet kódoló nukleotid szekvenciát tartalmazó DNS-t magában foglaló, kompatibilis gazdaszervezetben a DNS kifejezésének irányítására képes rekombináns vírust. és

b) fiziológiailag alkalmas hordozóanyagot tartalmaz; és a fenti megvédő eljárás során a kokcidiózis veszélyének kitett egyednek hatékony mennyiségben a fenti anyagot vagy kompozíciót adjuk be.

36. Anyag vagy kompozíció, a 35. igénypont szerinti kezelési eljárásban történő felhasználásra, azzal jellemezve, hogy a polipeptideket vagy polipeptid fragmenseket a vakcinával kezelendő egyed 1 kg testtömegére vonatkoztatva kb. 5-50 pg. előnyösen 25-50 pg dózisban alkalmazzuk.

37. Anyag vagy kompozíció, a 35. igénypont szerinti kezelési eljárásban történő felhasználásra, azzal jellemezve, hogy rekombináns vírusként valamely himlő vírust, előnyösen szárnyas vírust alkalmazunk.

38. Anyag vagy kompozíció, a 34. vagy 35. igénypont szerinti kezelési eljárásban történő felhasználásra, azzal jellemezve, hogy további lépésként egy vagy több emlékeztető oltást adunk be.

39. Anyag vagy kompozíció egyedeknek kokcidiózissal szemben történő megvédésére, azzal jellemezve, hogy az anyag vagy kompozíció az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet és fiziológiailag alkalmas hordozóanyagot tartalmazó vakcinát foglal magában. és a fenti módszer során a fenti anyag vagy kompozíció hatékony mennyiségét a tojásba juttatjuk.

40. Anyag vagy kompozíció egyedeknek kokcidiózissal szemben történő megvédésére, azzal jellemezve, hogy a fenti anyag vagy kompozíció az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet kódoló nukleotid szekvenciát tartalmazó DNS-t magában foglaló, a DNS kifejezésének irányítására képes rekombináns vektort és fiziológiailag alkalmas hordozóanyagot tartalmazó vakcinát foglal magában, és a fenti módszer során a fenti anyag vagy kompozíció hatékony mennyiségét a tojásba juttatjuk.

41. Anyag vagy készítmény, a 39. igénypont szerinti kezelési eljárásban történő felhasználásra, azzal jellemezve, hogy további lépésként az egyednek egy vagy több emlékeztető oltást adunk be.

42. Anyag vagy készítmény, a 40. igénypont szerinti kezelési eljárásban történő felhasználásra, azzal jellemezve, hogy további lépésként az egyednek egy vagy több emlékeztető oltást adunk be.

43. Anyag vagy készítmény, a 41. igénypont szerinti kezelési eljárásban történő felhasználásra, azzal jellemezve, hogy további lépésként az egyedben utólagos enyhe kokcidiális fertőzést idézünk elő.

44. Anyag vagy készítmény, a 42.igénypont szerinti kezelési eljárásban történő felhasználásra, azzal jellemezve, hogy további lépésként az egyedben utólagos enyhe kokcidiális fertőzési idézünk elő.

45. Anyag vagy készítmény, a 39. igénypont szerinti kezelési eljárásban történő felhasználásra, azzal jellemezve, hogy tojásban levő egyedet védünk meg.

46. Anyag vagy készítmény, a 40. igénypont szerinti kezelési eljárásban történő felhasználásra, azzal jellemezve. hogy tojásban levő egyedet védünk meg.

47. Új polipeptid. ahogyan lényegében a jelen szabadalmi leírásban ismertettük.

48. Új izolált DNS molekula, ahogyan lényegében a jelen szabadalmi leírásban ismertettük.

49. Új vektor, ahogyan lényegében a jelen szabadalmi leírásban ismertettük.

50. Új eljárás polipeptidek termelésére, ahogyan lényegében a jelen szabadalmi leírásban ismertettük.

51. Új eljárás rekombináns vektor előállítására, ahogyan lényegében a jelen szabadalmi leírásban ismertettük.

52. Új eljárás rekombináns vírus előállítására, ahogyan lényegében a jelen szabadalmi leírásban ismertettük.

53. Új eljárás transzformált mikroorganizmusok előállítására, ahogyan lényegében a jelen szabadalmi leírásban ismertettük.

54. Új vakcina, ahogyan lényegében a jelen szabadalmi leírásban ismertettük.

55. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidek új felhasználása, ahogyan lényegében a jelen szabadalmi leírásban ismertettük.

56. Új eljárás egyednek kokcidiózissal szemben történő megvédésére, ahogyan lényegében a jelen szabadalmi leírásban ismertettük.

57. Anyag vagy készítmény kezelési eljárásban történő új felhasználásra, ahogyan lényegében a jelen szabadalmi leírásban ismertettük.