KR100244828B1 - 콕시디아증 백신 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 에이메리아 기생충에 대해 면역 반응을 유도할 수 있는. 하기 아미노산 서열을 갖는 면역원성 폴리펩타이드 및 그의 단편, 및 상기 폴리 펩타이드를 암호화하는 DNA, 뿐 아니라 상기 DNA 또는 그의 단편을 함유하는 형질전환된 미생물 및 상기 폴리펩타이드를 포함하는 콕시다아증 백신을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 폴리펩타이드 및 형질전환된 미생물을 제조 하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 폴리펩타이드를 사용하여 콕시다아증으로 부터 대상 개체를 보호하는 방법에 관한것이다. 본 발명의 폴리펩타이드는 정제된 폴리펩타이드로서 또는 백시니아 바이러스와 같은 적합한 바이러스 백터에서 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 형태를 상기 보호를 위해 투여할 수 있다.
Description
제 1 도는 토끼로 부터 얻은 항원-선택성 항체 및 닭의 면역 형청 의해 인식되는 에이메리아 전구체 단백질을 암호화하는 1.2 kb cDNA 분자의 뉴클레오티드 서열을나타낸다.
제 2 도는 다양한 에이메리아 메로조이트 단백질의 SDS PAGE 분석 결과를 나타낸다.
제 3 도는 프로브로서 하기에 기술하는 5-7 유전자 EorRI 삽입체를 사용하여 PvuII(레인 1), HincII(레인 2), PstI(레인 3), SphI(레인 4) 또는 SacI(레인 5)로 절단된 에이메리아테넬라의 포자형성된 낭포체 게놈성 DNA 외 서던 블롯(Southern Bolt) 분석 결과를 나타낸다.
제 4 도는 플라스미드 pDS56/RBSII(일정 비율로 축척한 것이 아님)의 개략적인 도면이다.
제 5 도는 플라스미드 pDS56/RBSII 외 완전한 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
제 6 도는 플라스미드 pDS56/RBSII(-1)(일정 비율로 축척한 것이 아님)의 개략적인 도면이다.
제 7 도는 플라스미드 pDS56/RBSII(-1)의 완전한 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
제 8 도는 플라스미드 pDS56/RBSII(-2)(일정 비율로 축척한 것이 아님)의 개략적인 도면이다.
제 9 도는 플라스미드 pDS56/RBSII(-2)의 완전한 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
제 10 도는 플라스미드 pDMI.1(일정 비율로 축척한 것이 아님)의 개략적인 도면이다.
제 11 도는 플라스미드 pDMI.1 의 완전한 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
제 12 도는 플라스미드 pUC8-TK-7.5K 의 개략적인 도면이다.
제 13 도는 제조합 플라스미드 pR3 의 개략적인 도면이다.
제 14 도는 재조합 플라스미드 pR3 의 완전한 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
제 15 도는 플라스미드 pR4 의 개략적인 도면이다.
본 출원은 에이메리아(Eimeria) 원생류 기생충의 신규한 항원에 관한 것이다. 상기 항원은 다양한 투여 경로를 동해 가금류를 콕시디아증으로 부터 보호하는데 사용할 수 있다.
콕시디아증은 에이메리아 속의 세포내 원생류 기생충에 의해 발병되는 가금류의 질병이다. 상기 질병은 크고 강한 가금류 사육 시설에서 발생하는 풍토병이다. 화학치료 요법으로 상기 질병을 억제하는데 책정된 비용은 미합중국에서만 매년 십억달러를 초과한다. 공지된 콕시디아증 치료 약물에 대한 내성이 증가되고, 동시에 약물의 개발에 점차적으로 많은 비용이 들게되며 식용 동물내에 약물 잔류물의 소비자 허용치가 감소되고 있음으로 인해, 신규한 약제의 지속적인 개발이 필요하다.
천연 콕시디아증 감염에 대한 보호 면역은 잘 입증되어있다. 수주동안 소수의 생존가능한 낭포체를 조절하여 매일 투여함으로써 통상적으로 유독한 용량의 항원투여 감염에 대해 완전한 면역이 달성되는 결과를 나타냈다[Rose et al., Parasitology 73 : 25(1976); Rose et al., Parasitology 88 : 199(1984)]. 감염에 대한 획득된 내성을 입증함으로써, 화학적 콕시디아치료제가 필요없이 어린 닭에 면역성을 유도하는 백신을 제작할 수 있는 가능성이 제시된다. 사실상, 상기 개념은 알라바마 오펠리카 소재의 스터원래버러토리즈(Sterwin Laboratories)의 콕시백(Coccivac)TM배합물에서 시험되었다.
콕시디아중 백신을 제조하기 위해, 머레이(Murray)등의 유럽 특허원 공보 제 167, 443 호에서는 15 개 이상을 폴리펩타이드(이들중 대부분은 스포로조이트의 표면에 결합되어 있다)를 함유하는 에이메리아 테넬라의 스포로조이트 또는 포자형성된 낭포체로 부터 추출물을 제조하였다. 이들 추출물을 닭에 주입함으로써 유독성의 이. 테델라 포자형성된 당포체로 경구 접종한 후에 맹장의 병변이 감소되었다.
보다 최근에, 셴켈(Schenkel)동의 미합중국 특허 제 4, 650, 676 호는 이. 테넬라 메로조이트에 대한 단클론성 항체의 제조를 개시하였다. 셴켈등은 이들 항체를 사용하여 항체가 지향하는 항원 다수를 동정하였다. 이 테델라 스포로조이트를 이들 항체와 함께 예비배양한 후 처리된 스포로조이트를 닭의 맹장내로 도입시킴으로써, 셴켈 등은 미처리 스포로조이트 대조용에 비해 맹장 병변 상태가 다소 감소됨을 볼 수 있었다.
재조합 DNA 방법을 사용하여, 뉴만(Newman)등(유럽특허원 제 164 176 호)은 에이메리아 테델라로 부터 25, 000달톤의 항원을 암호화하는 스포로조이트 단계에서 유전자를 클로닝하였다. 죽은 이. 테넬라 스포로조이트로 반복적으로 면역시킴으로써 면역된 닭에서 얻은 형청은 요오드화된 스포로시스트 및 스포로조이트 막 제제로 부터 상기 항원을 면역침전 시켰다. 보다 최근에 , 젤킨스(Jenkins)[Nucleic Acids Res. 16 : 9863(1988)]는 에이메리아 아세르블리 (Eimeria acervulina)로 부터 250, 000 달톤의 메로조이트 표면 단백질의 일부를 암호화하는 cDNA 릍 개시하였다. 상기 cDNA 의 발현 생성물은 유기체에 대한 항혈청정 의해 인식되었다.
제조합 DNA 기법의 진보로 인해 또다른 접근방법, 즉 서브유니트 백신이 유용하게 되었다. 상기 서브유니트 백신의 예는, 예를들면 유럽 특허원 공보 제 324 648, 337 589 및 344 808 호에 개시되어 있다.
본 발명은, 예를들면 닭에서 에이메리아 기생충에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는, 하기 아미노산 서열(1)(서열 식별 번호 : 1)을 갖는 면역원성 폴리펩타이드를 제공한다 :
본원에 개시된 에이메리아 메로조이트 표면 항원 전구체 단백질은서열(1)(서열식별번호 : 1)에 상응하는 서열을 갖는다.
바람직한 본 발명의 폴리펩타이드는 아미노산 서열(1)(서열 식별 번호 : 1)을 가지나 N-말단에 신호 펩타이드 서열이 없는 면역원성 폴리펩타이드이다. 본 발명은 또한 상기 폴리펩타이드의 면역성은 본질적으로 변화시키지 않으면서 결실, 삽입 또는 치환에 의해 상기 아미노산 서열에 관련되는 아미노산 서열을 갖는 그의 작용성 등가 폴리펩타이드에 관한 것이다.
본 발명은 또한 하기 뉴클레오티드 서열(A)(서열 식별번호 : 2), 또는 하기 뉴클레오티드 서열(A)(서열 식별 번호 : 2)에 상응하나 신호 펩타이드 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 결여된 뉴클레오티드 서열(B)와 같은 그의 일부를 갖는 DNA 와같은, 에이메리아 메로조이트 표면 항원 전구체 단백질의 전부또는 일부를 암호화하는 DNA 를 제공한다 :
ATG 코돈은 당해분야에 공지된 방법을 사용하여, 뉴클레오티드서열(A)(서열 식별 번호 : 2)를 갖는 DNA 의 부분 서열로 이루어진 DNA 의 개시접에 부가시키는 것이 바람직하다. 본 발명은 또한 상기 DNA 를 함유하고 화합성인 숙주 유기체에서 상기 DNA 의 발현을 유도할 수 있는 재조합 벡터 및 상기 벡터를 함유하는 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한 (a) DNA 서열 또는 단편이 발현되는 조건하에서, 뉴클레오티드 서열(A)(서열 식별 번호 : 2) 또는 그의 단편, 예를들어 뉴클레오티드 서열(B)를 갖는 DNA 와 같은, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 를포함하는 재조합 벡터물 함유하는 미성물을 배양하고, (b) 배양액으로부터 재조합 폴리폡타이드를 단리함을 포함하는, 상기 정의한 폴리팹타이드를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 효과량의 하나이상의 본 발명의 폴리펩타이드 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 콕시디아증으로부터 대상 개체(예를들면, 인간 또는 동물)을 보호하기 위한 백신을 제공한다. 바람직한 개체는 가금류(예를들면, 닭 또는 칠면조)이다. 다른 개체는 토끼 또는 양과 같은 가축 동물일 수도 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 함유하는, 상기 DNA 서열의 발현울 유발할 수 있는 제조합 바이러스 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 콕시디아증으로부터 대상 개체를 보호하기 위한 백신을 제공한다.
본 발명은 또한, 효과량의 본 발명의 백신을 콕시디아증에 걸리기 쉬운 어린 가금류와 같은 개체에게 투여함을 포함하는, 콕시디아증으로부터 대상 개체를 보호하는 방법을 제공한다.
본 발명의 에이메리아 폴리펩타이드는, 이들이 콕시디아증 유기체에 대해 면역되고 그에 대해 향상된 면역성을 갖는 동물의 혈청중의 항체를 사용하여 동정되었기 때문에 중요한 백신 항원이다. 이러한 이유로, 이들 폴리폡타이드는 콕시디아증으로부터 가금류를 보호하는데 중요한 억함을 하는 것 같다.
본 발명은 도면을 참고로 하여 보다 쉽게 알수 있다.
제 1 도는 토끼로 부터 얻은 항원-선택성 항체 및 닭의 면역 혈청에 의해 인식되는 에이메리아 전구체 탄백질을 암호화하는 1.2 kb cDNA 분자외 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
제 1 도로 부터 알 수 있듯이, 상기 전구체 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 68 번 뉴클레오티드의 ATG 와 1013 번 뉴클레오티드의 정지 코돈 TAA 사이에 함유되어 있다(315 개의 아미노산을 암호화한다). 제 1 도는 또한 제공된 뉴클레오티드 서열로부터 예상된 에이메리아 전구체 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다. 표준 단일자 약어를 사용하여 뉴클레오티드 및 아미노산을 표시한다. 이들 약어의 의미는 레닌저(Lehninger)의 문헌 [Principles of Biochemistry, 1984, Worth Publishers, Inc. , New York, pp. 96, 798]과 같은 표준 생화확 교제에서 찾아볼 수있다.
제 2 도는 다양한 에이메리아 메조이드 단백질의 SDSPACE 분석 결과를 나타낸다. 패널 A 는 대조용(a) 또는 항원-선택성 (b) 항체로 프로브검색된 충 메로조이트 단백질의 면역블릇이다. 패널 A 의 화실표는 약 23 kDa 의 분자량을 갖는 단백질을 함유하는 밴드의 위지를 나타낸다. 패널 B 는 대조용(a) 또는 항원-선택성(b) 항체로 면역침전된125I-표면-표지된 메로조이트 단백질의 오토라디오그램이다. 패널 C 는 메로조이트폴리A mRNA(c) 의 시험관내 번역에 의해 생성된 생성물과, 람다5-7 클론올 사용하여 선택된 항체(b), 항-메로조이트 혈청과 반응하는 단백질을 생성한 또다른 파아지 클론을 사용하여 선택된 항체(a) 및 비-제조합 파아지를 사용하여 메로조이트 혈정으로부터 선택된 대조용 항체(d)로 면역침전된 번역 생성물과의 완전 혼합물을 나타낸다. 밴드는 형광사진술로 가시화시켰다. 알려진 분자량(kDa)을 갖는 분자량 마커의 위지는 도면의 오른쪽에 나타낸다.
제 3 도는 프로브로서 하기에 기술하는 5-7 유전자 EcoRI 삽입체를 사용하여 PvuII(레인 1), HincII(레인 2), PstI(레인 3), SphI(레인 4) 또는 SacI(레인 5)로 절단된 에이메테넬라외 포자형성된 낭포체 게놈성 DNA 외의 서던 블롯(Southern Bolt) 분석결과를 나타낸다. 알려진 크기(kb)를 갖는 표준 DNA 의 위치는 도면의 오른쪽에 나타낸다.
제 4 도는 플라스미드 pDS56/RBSII(일정 비율로 축척한 것이 아님)의 개략적인 도면이다. 본 도면 및 제 6, 8 및 10 도 에서, 약어 및 기호 B, E, H, P, S, X 및 Xb 는 각각 제한 효소 BamHI, EcoRI, HindIII, PstI, SalI, XhoI 및 XbaI 에 대한 절단 부위를 나타낸다. 는 조절가능한 프로모터/작동인자요소 N250PSN250P29 를 나타내고,는 나타낸 바와 같이 라이보좀 결합 부위 RBSII, RBSII(-1) 또는 RBSII(-2)를 나타내며, →는이들 라이보좀 결합 부위의 조절하에 있는 암호화 영역을나타내고,는 나타낸 바와 같은 터미네이터 t0또는 T1을 나타내며,는 이. 콜라이(E. coli)(레플리콘)에서외 DNA복제에 필요한 영역을 나타내고,는 각각 클로람페니콜아세틸 트랜스퍼라제(cat) 및 베타-락타마제(bla)를 암호화하는 영역을 나타낸다.
제 5 도는 플라스미드 pDS56/RBSII 외 완전한 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 상기 서열에는, 제 4 도에 도시된 제한효소의 인식 서열이 나타나 있다. 나타낸 아미노산 서열은 라이보좀 결합부위 RBSII 의 조절하에 있는 개방된 판독 프레임을나타낸다.
제 6 도는 플라스미드 pDS56/RBSII(-1)(일정 비율로 축척한 것이 아님)의 개략적인 도면이다.
제 7 도는 플라스미드 pDS56/RBSII(-1)의 완전한 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 상기 서열에는, 제 6 도에 도시된 제한 효소의 인식 서열이 나타나 있다. 나타낸 아미노산 서열은 RBSII(-1) 의 조절하에 있는 개방된 판독 프레임을 나타낸다.
제 8 도는 플라스미드 pDS56/RBSII(-2)(일정 비율로 축척한 것이 아님)의 개략적인 도면이다.
제 9 도는 플라스미드 pDS56/RBSII(-2)외 완전한 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 상기 서열에는, 제 8 도에 도시된 제한효소의 인식 서열이 나타나 있다. 나타낸 아미노산 서열은 라이보좀 결합부위 RBSII(-2) 의 조절하에 있는 개방된 판독프레임을 나타낸다.
제 10 도는 플라스미드 pDMI.1(일정 비율로 축척한 것이 아님)의 개략적인 도면이다. 기호 및 약어는 제 4 도의 설명에 언급한 바와 동일한 외미를 가지나,는 각각 lac 억제제(lacI) 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(neo)를 암호화하는 영역을 나타낸다.
제 11 도, 즉 제 11A, 11B 및 11C 도는 플라스미드 pDMI.1 의 완전한 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 상기 서열에는제 10 도에 도시된 제한 효소의 인식서열이 나타나 있다. 나타낸 아미느산은 네오마이신 포스포트렌스퍼라제(Met 내지 Phe) 및 lac억제제(Met 내지 Cln : 상기 유전자의 역 배향을 주목할 것)를 암호화하는 개방된 판독 프레임을 포함한다.
제 12 도는 플라스미드 pUC8-TK-7.5K 의 개략적인 도면이다. 상기 도면 및 제 13 및 15 도에서, 약어 TK 는 백시니아 바이러스외 티미딘 키나제 유전자 서열을 나타내고, 7.5K 는 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터를 나타내며, lacZ 는 절 서열 및 베타-갈락토시다제 유전자의 N-말단의 일부에 대한 암호화 정보를 함유하고, ori 는 이. 콜라이에서의 DNA 복제에 필요한 영역을 나타내며, AmpR은 베타-락타마제 유전자의 암호화 영역을 나타낸다.
제 13 도는 재조합 플라스미드 pR3 외 개략적인 도면이다.
제 14 도는 제조합 플라스미드 pR3 의 완전한 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 나타낸 아미노산 서열은 7.5K 프로모터의 조절하에 있는 개방된 판독 프레임을 나타낸다.
제 15 도는 플라스미드 pR4의 개략적인 도면이다. ML 은 말라리아 리더(leader) 서열을 나다낸다.
본원에 인용된 모든 참조문헌은 본 발명에 그대로 참고로 인용된다.
본 원에 사용된 바와 같은 하기 용어들은 하기 의미를 갖는다.
＆quot;에이메리아 표면 항원＆quot;이란 에이메리아 테넬라의 메로조이트 단계에 존재하는 SDS PACE 에서 약 23 kDa 의 겉보기 분자량을 갖는 단백질을 의미한다. 상기 단백질은 그외 cDNA 서열이 제 1 도에 나타나 있는 유전자의 생체내 발현 생성물의 번역후 처리에 의해 생성되는 것으로 보인다.
＆quot;전구체 단백질＆quot;은 SDS PACE 에서 약 33kDa 의 겉보기 분자량을 갖는 단백질을 의미한다. 상기 단백질은 생체내 단백 분해에 의해 처리되어 에이메아 표면 항원으로 되는것으로생각된다. 전구체 단백질을 암호화하는 cDNA 분자의 뉴클레오티드 서열 및 그로부터 예상된 아미노산 서열을 제 1 도에 나타내었다.
용어 ＆quot;아미노산 서열(1)을 갖는, 에이메리아 기생충에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 면역원성 폴리펩타이드＆quot;는 면역원성 폴리폡다이드의 서열에 상응하는 상기 메로조이트 표면항원을 포함하는 에이메리아 기생충에 대한 B-세포 및/또는 T-세포 매게 보호 면역 반응을 유도할 수 있는 풀리펩타이드를 의미한다. 상기 면역원성 풀리팩타이드는 다른 에이메리아 단백질이 없는 성숙한 에이메리아 메로조이트 표면 항원 단백질, 또는 에이메리아 기생충으로 감염된 동물의 혈청에 존재하는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는, 상기 에이메리아 표면 항원단백질의 단편일 수 있다. 이들 폴리펩타이드는 상기 정의한 에이메리아 표면 항원오의 T-세포 및 B-세포 에피토프에 상응한다.본 발명의 폴리펩타이드는 또한 상기 에이메리아 메로조이트 표면 항원 단백질의 작용성 등가물일 수 있으며, 면역 활성을 거의 변화시키지 않는(즉, 면역반응성 및/또는 항원성 결정인자를 거의 파괴하지 않는)아미노산 치환체에 의해 제 1 도의 아미노산 서열에 관련된 아미노산 서열을 갖는다.
단편의 예는 신호 펩타이드 서열을 구성하는 첫번째20 내지 약 100 개의 아미노산 잔기가 필수적으로 결여됨을 제외하고 아미노산 서열(1)(서열 식별 번호 : 1)을 갖는 면역원성 폴리펩타이드이다 . 또다른 예는 SDS-폴리아크릴아미드 겔상에서 23kDa 의 겉보기 분자량을 갖는 면역원성 폴리펩타이드이다.바람직한 단편은 다음과 같다;
서열(1)(서열 식별 번호 : 1)의 면역원성 폴리펩타이드와 같은 본 발명의 단편은 대상 개체에서 콕시디아증에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다. 바람직한 대상 개체는 닭과 같은 가금류이다.
단백질중에서 생물학적 및 면역학적 활성을 거의 변화시키지 않는 아미노산 치환체가 발생하는 것으로 알려져있으며 , 예를들면 뉴라쓰(Neurath)등의 문헌 [＆quot;The Proteins＆quot;, Acad는 mic Press, New York(1979)], 특히 14 페이지의 제 6 도에 개시된 바 있다. 가장 흔히 관찰되는 아미노산 치환체는 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 이며, 이들의 역도 가능하다.
유전 암호의 변성으로 인해, 아미노산 서열(1)(서열식별 번호 : 1)을 암호화할 수 있는 많은 가능한 뉴클레오티드 서열(작용성 등가물)이 있음을 알 것이다. 또한, 벡터내로 삽입된 본 발명의 DNA 서열의 뉴클레오티드 서열 및 단편이 상기 서열 또는 단편을 함유하는 제조합 벡터가 적절한 숙주 유기체중에서의 본 발명의 폴리펩다이드의 생산을 유도할 수 있는 한 실제 구조적 유전자의 일부가 아닌 뉴클레오티드를 포함할 수도 있음을 알아야 한다.
상기 에이메리아 메로조이트 표면 항원의 작용성 등가물인 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열은 모리나가(Morinaga)등의 문헌 [Biotechnology 2 : 636 (1984)]에 개시된 바와 같은, 본 발명의 예시적인 cDNA(서열 식별 번호 : 2)상에 프라이머-지향적 부위-특이적 돌연변이유발에 적절한 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 쉽게 제조할 수 있다.
에이메리아 메로조이트 표면 항원 탄백질 또는 그를 암호화하는 DNA 의 단면 또는 일부는, DNA 의 경우에는 제한 엔도뉴클레아제 및 단백질의 경우에는 프로테아제를 사용하여 보다 큰 분자를 효소에 의해 절단시킴으로써 생성시킬 수 있다. 그러나, 본 발명의 단편은 임의 형태의 효소에 의한 절단 생성물에 제한되지 않고, 말단이 임의의 효소에 의한 절단 지점에 상응하지 않는 서브서열을 포함한다. 상기 단편은, 예를들면 본원에 제공된 서열 테이타를 사용하여, 화학 합성에 의해 제조할 수 있다. DNA 단편은 또한 단리된 메신저 RNA(mRNA)로 부터 불완전 상보성 DNA(cDNA) 합성에 의해 제조할 수 있다. 단백질 단편은 또한 단백질 단편을 암호화하는 DNA 단편을 발현시킴으로서 제조할 수 있다. 상기 단백질 단편이 면·역반응성 및/또는 항원성 결정인자를 구성하기에 충분한 수의 아미노산 잔기를 함유하는 경우, 이들은 본 발명에 유용할 수 있다. 일반적으로, 적어도 약 7 또는 8 개의 잔기가 필요하다. 하기에 설명하는 바와 같이, 상기 단편을 면역 반응성으로 만들기 의해 이들을 면역원성 담체 분자에 커플링시키는 것이 필요할 수도 있다.
면역반응성은 B-세포에 의한 항체의 생성(체액성 면역) 및 T-세포의 활성화(세포성 면역) 둘다를 포함할 수 있다. 본 발명의 폴리타이드는 B-세포 항원성 결정인자 또는 에피토프 및 T-세포 에피토프를 포함한다. 체액성 면역은 생체내 또는 시험관내에서 B-세포에 의한 항체 생성의 유도에 의해 입증될 수 있다. 세포-매개 면역은 T-세포 활성화에 의해, 예를들면 증가된 T-세포 단백질 합성에 의해, 또는 활성화된 T-세포에 의한 B-세포의 자극에 의해 입증될 수 있다. 양쪽 타입의 면역에 대한 분석은 모두 당해분야에 공지되어 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 당해분야에 공지된 방법으로, 예를들면 재조합 DNA 방법, 화학적 합성에 의해, 또는 에이메리아 제제로 부터 단리함으로써 제조할 수 있다. 본 발명에 따라 제조하는 경우, 서열 1(서열 식별 번호 : 1)외 폴리펩타이드 및 그의 단편은 에이메리아 기생충에 의해 생성된 다른 단백질을 거의 함유하지 않는다.
본 발명의 단백질을 제조하는데 필요한 DNA 는 서열식별 번호 : 2 및 도면에 제공된 뉴클레오티드 서열 정보를 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 상기 화화적 합성은 매튜치(Matteucci) 등의 문헌[J. Am. Chem. Soc.103 : 3185(1981)]에 개시된 포스포르아미다이트 고체 지지 방법과 같은 임의의 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다.
또한, cDNA 는 에이메리아 mRNA 로 부터 제조할 수있다. 메신저 RNA 는 표준 기법을 사용하여 에이메리아 메로조이트로 부터 단리할 수 있다. 이들 mRNA 샘플을 사용하여 마니아티스(Maniatis)등의 문헌 [Molecular Clonin8 : A Laboratory Manual, 1982, Cold Sprin8 Harbor Laboratory, Cold Sprin8 Harbor, NY]에 개시된 바와 같이 이중-가닥 cDNA 를 제조할 수 있다. 그런후에, 상기 cDNA 를 적절한 클로닝 벡터내로 삽입 시키고 이 백터를 이용하여 적합한 숙주 유기체(예를들면, 이·콜라이)를 전환시켜 cDNA 라이브러리를 생성시킬 수 있다. 이어서, 상기 cDNA 라이브러리는 프로브로서 본발명의 클로닝된 유전자 또는 그의 단편을 사용하여 검색할 수 있다. 상기 유전자 또는 단편은, 예를들면 프로브로 사용하기 위한 4 개의 데옥시리보뉴클레오티드(이들중 하나는 α 위치에S2p 를 함유한다(마니아티스등의 상기 문헌109 페이지))의 존재하에서 Pol I DNA 폴리머라제를 사용하여 니크-번역(nick-translation)에 의해 표지화 할 수 있다. 상기 프로브는 또한 에이메리아 표면항원의 cDNA 의 공지된 서열을 기준으로하여 올리고뉴클레오티드합성에 의해 제조할 수 있다.
하기 실시예에서 에이메리아 테넬라를 mRNA·공급원으로 사용하였으나, 다양한 종 가운데 DNA 서열 상동성으로 인해, 상기 종으로 부터 클로닝된 유전자를 프로브로 사용하여 에이메리아의 다른 종으로 부터 유전자를 단리할 수 있다.
일단 동정되어 단리되면, 본 발명의 에이메리아 DNA 를 삽입된 유전자 서열의 전사 및 번역에 필수적인 요소를 함유하는 적절한 발현 비히클 또는 벡터내로 삽입시킨다. 유용한 클로닝 비히클은 염색체, 비염색체 및 합성 DNA 서열의 분절, 예를들면 다양한 공지된 세균 플라스미드, 바이러스 DNA(예를들면, 파아지DNA), 플라스미드와 바이러스 또는 파아지 DNA 와외 혼합물 (예를들면, 파아지 DNA 를 사용하기 위해 변형된 폴라스미드)또는 기타 발현 조절 서열 또는 호모 플라스미드로 이루어질 수도 있다. 사용할 수 있는 특정 클로닝 비히클로는 pEV-vrf 플라스미드(크라울(Crowl)동의 문헌 [Cene 38 : 31(1985)]에 개시된 pEV-vrfl, -2 및 -3), SV40, 아데노바이러스, 호모 벡터, 람다gt-WES-람다 B, 카톤(Charon) 4A 및 28, 람다-gt-2, M-13 유도된 벡터(예를들면, pUC8, 9, 18및 19, pBR313, 322및 325), pACl05, pVA51, pACY177, pKH47, pACYCl84, pUBll0, pMB9, colEl, pSC 101, pML21, RSF2124, pCR1 또는 RP4, 계두, 백시니아 또는 헤르페스바이러스 부류의 일원이 포함되나 이에 제한되는 것은아니다.
에이메리아 유전자를 클로닝 벡터내로 삽입시키는 것은 유전자 및 필요한 클로닝 비히클이 둘다 동일한 제한 효소 또는 효소들로 절단된 경우에 쉽게 수행되는데, 이것은 이로써 상보성 DNA 말단이 생성되기 매문이다. 이렇게 동일한 효소로 절단되지 못할 정우에는, 단일-가닥 DNA 를 반대방향으로 절탄시켜 끝이 무딘(blunt) 말단을 생성시킴으로써, 또는 단일-가닥 말단을 적절한 DNA 폴리머라제로 채워서 동일한 결과를 달성함으로써 절단 말단을 변형시키는 것이 필요할 수도 있다. 이리한 식으로 무딘 말단을 T4 DNA 리가제와 같은 효소로 연결시킬 수도 있다.그렇지 않으면, DNA 말단상으로 뉴클레오티드 서열(링커)을 연결시킴으로써 목적하는 임의의 부위를 생성시킬 수도 있다. 상기 링커는 제한 부위 인식 서열을 암호화하는 특정 올리고뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 절단된 벡터 및 에이메리아 유전자 또는단편은 또한 모로우(Morrow)의 문헌[Methods in Enzymology68 : 3(1979)]에 개시된 바와 같이, 단독중합체 후미부(tail)에 의해 변형될 수도 있다.
본 발명에 사용될 수도 있는 클로닝 비히클의 대부분은 목적하는 형질전환체를 선별하는테 이용할 수 있는 하나이상의 마커 활성, 예를들면 pBR 322 에서의 암피실린 및 테트라사이클린내성, pUC8에서의 암피실린 내성 및 베타-갈락토시다제 활성, 및 pEV-vrf 폴라스미드에서의 암피실린 내성을 함유한다. 상기 벡터가 삽입된 숙주 세포의 선택은 숙주 세포가 달리 벡터에 의한 활성을 갖지 않는 경우 대단히 간단해진다.
클로닝 비히클중의 선택된 부위에 삽입된 에이메리아 유전자의 뉴클레오티드 서열은 실제 구조적 유전자의 일부가 아닌 뉴클레오티드를 포함할 수도 있음을 알아야 한다. 그렇지않으면, 상기 유전자는 완전 야생타입 유전자의 단지 일부만을 함유할 수도 있다. 필요한 모든 것은 클로닝 비히클내로 삽입된후의 유전자 단편이 적절한 숙주 유기체중에서 에이메리아 표면 항원의 면역반응성 및/또는 항원성 결정인자 하나이상을 갖는 폴리펩타이드 또는 단백질의 생성을 유도할 수 있어야 한다는 것이다. 따라서, 본 발명의 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 를 포함하는 재조합 벡터는, (a) 상기 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는DNA 를 벡터내로 삽입시키고, (b) 상기 벡터를 미생물에서 복제시키고, (c) 재조합 벡터를 미생물로부터 단리함으로써 제조할 수 있다.
적절한 숙주 유기체 선택은 당해분야에 공지된 많은 요인에 의해 영향받는다. 이러한 요인으로는, 예를들면 선택된 벡터와의 화합성, 하이브리드 플라스미드에 의해 암호화된 단백질의 독성, 목적 단백질의 회수 용이성, 발현 특성, 생물 안정성 및 비용이 포함된다. 이들 요인들간의 균형이 고려되어야하며, 모든 숙주가 특정 재조합 DNA 분자의 발현에 동일하게 효과적인 것은 아님을 알아야 한다.
본 발명에 사용할 수 있는 적합한 숙주 미생물에는 식물, 포유동물 또는 효모 세포 및 세균, 예를들면 이쉐리키아콜라이 (Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus) 및 액티노마이세스(Actinomyces)가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 카사다반(Casadaban)등의 문헌[J. Mol. Biol. 138 : 179(1980)]에 개시된 이쉐리키아 콜라이균주 MCl061, 또는 플라스미드 pRK248clts 를 함유하는 이.콜라이 K-12 의 다른 균주를 사용할 수 있다. 다른 이. 콜라이 K-12 균주에 사용하기 위한 플라스미드 pRK248clts 는 버나드(Bernhard)등의 문헌 [Meth. of Enzymol. 68 : 482(1979)]에 개시되어 있으며, 또한 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)으로 부터 승인 번호 제 ATCC 33766 호로 입수할 수있다. 이. 콜라이 균주 MCl061 은, 예를들면 미합중국 캘리포니아 팔로 앨토 소재의 클론태크 레버러토리즈, 인코포레이티드(CLONTECH Laboratories, Inc.)로 부터 상업적으로 시판하며, 또한 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션으로 부터 승인번호 제 ATCC 53338 호로 입수할 수 있다. 이. 콜라이 균주 M15 에 사용하기 위한 플라스미드 pDMl.1, pDS56/RBSII, -1 또는 -2 는 하기에 기술한다.
재조합 클로닝 벡터를 숙주 세포내로 전달하는 것은 다양한 방법으로 수행할 수 있다. 선택된 특정 벡터/숙주 세포 시스템에 따라서, 상기 전달과정을 형질전한, 형질유도, 형질감염 또는 전기천공(electroporation)에 의해 수행할 수 있다. 일단 상기 변형된 숙주 세포가 생성되면, 세포를 배양할 수 있으며 배양액으로 부터 단백질 발현 생성물을 단리할 수 있다.
에이메리아 표면 항원의 전구체 단백질을 생성하는 형절전환체 클론은 이. 테넬라의 글루타르알데하이드-고정된 스포로조이트 또는 메로조이트에 대해 면역화된 동물로부터 취한 혈청으로 검색함으로써 동정한다. 하기 실시예에서, 토끼의 항-메로조이트 혈청을 유전자 생성물의 검색 및 특성화에 사용하였다. 면역 닭 혈청을 이용한 병렬 면역원성 검색 결과 메로조이트 표면 항원 전구체를 암호화하는 cDNA 가 독립적으로 단리되었다.
면역 검색 또는 면역침전에 사용된 항혈청의 특이성은 홀(Hall)등 [Nature 311 : 379(1984)]의 다양한 항체 선별 방법을 사용하여 증가될 수 있다. 하기에 보다 더 상세히 기술하는 상기 방법에서는, 클론에 의해 제조된 에이메리아 단백질에 특이적인 항제를 필터상에 흡착시킨다.
에이메리아 항원 생성 클론은, 문헌(예를들면, 케네트(Kennet) 등 (편집자)의 [Monoclonal Antibodies and Hybridomas : A New Dimension in Biological Analyses, 1980, Plenum Press, New York, pp. 376-384]에 개시된 면역침전, 효소-결합 면역분석(ELISA) 및 방사성 면역분석 기법을 포함한 공지된 표준 분석 방법을 사용하여 검출할 수 있다.
본 발명의 에이메리아 표면 항원의 다양한 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 를 포함하는 재조합 벡터는 당해분야에 공지된 방법, 예를들면 부위-특이적 돌연변이유발을 사용하여 제조할 수 있다.
대량의 본 발명의 재조합 에이메리아 폴리펩타이드는 상기 방법으로 수득된 형질전한된 미생물을 재조합 DNA의 발현에 적합한 조건하에서 필요 영양분을 포함하는 발효 브로스중에서 증식시켜 생성시킬 수 있다. 이.콜라이에서 생성된 바와 같이, 재조합 에이메리아 폴리펩타이드는 통상적으로 세포질 또는 세균의 봉임체(inclusion body)에 존재한다. 따라서, 단백질을 유리시키기 위해, 세균의 외막을 파괴시킬 필요가 있다. 상기 공정은 초음파 처리에 의해, 또는 다른 기계적 파괴 수단에 의해, 예를들면 프렌치(French) 가압세포 또는 가울린(Gaulin) 균질기[Charm et al., Meth. Enzymol. 22, 476-556(1971)]를 사용하여 수행할 수 있다.
세포 파괴는 또한 화학적 또는 효소적 수단에 의해 수행할 수 있다. 흔히 2 가 양이온이 세포 막 보전에 필요하므로, EDTA 또는 EGTA 와 같은 적절한 킬레이트화제로 처리하면 세포로 부터 단백질의 누출을 촉진하기에 충분히 파괴적인것으로 입증된다. 유사하게, 라이소자임과 같은 효소를 사용하여 동일한 결과를 달성하였다. 상기 효소는 세포벽의 펩타이도글리칸 주쇄를 가수분해시킨다.
삼투압 쇼크도 또한 사용할 수 있다. 간략하게, 상기 공정은 먼저 세포를 이들로 부터 물을 손실시키고 수축을 유발하는 고장액에 넣음으로써 수행할 수 있다. 이어서, 저장성 ''쇼크＆quot; 용액에 연속하여 넣으면 목적하는 단백질의 유출과 함께 세포내로 물이 급속히 유입된다.
에이메리아 단백질은 또한 세포로부터 유리되면, 황산나트륨 또는 암모늄과 같은 염으로 침전시키거나, 한외여과시키거나 또는 당해 분야에 숙련된 자에게 공지된 다른 방법으로 농축시킬 수 있다. 겔 여과, 이온-교환 크로마토그래피, 예비 디스크-겔 또는 막 전기영동, 등전점 집속, 저온 유기 용대 분별, 또는 억류 분배(이에 제한되는 것은 아니다)를 포함하는 통상적인 단백질 정제기법으로 더 정제할 수 있다. 면역친화성 크로마토그래피에 의해 또한 정제할 수 있다.
유기체로 부터 에이메리아 단백질을 정제하기 위한 특정 방법은 당해분야에 공지되어 있다(예를들면, 뉴만등의 유럽 특허원 공보 제 164 176 호를 참조하시오).
본 발명의 단백질 또는 그외 단편은 또한 배제 고상합성, 부분 고상 합성, 단편 축합 또는 통상적인 액상 합성과 같은 적합한 방법에 의해 화학적으로 합성할 수 있다. 메리필드(Merrifield)의 [J. Am. Chem. Soc.85 : 2149(1963)]에 개시된 바와 같은 고상 합성이 바람직하다.
상기 합성은 알파-아미노-말단에서 보호된 아미노산을 이용하여 수행한다. 불안정한 측쇄를 갖는 삼작용성 아미노산은 또한 펩타이드가 구성되는 동안 화학 반응이 그 부위에서 일어나는 것을 방지할 적합한 그룹으로 보호된다. 알파-아미노 보호 그룹은 선택적으로 제거되어 후속 반응이 아미노-말단에서 일어나도록한다. 알파-아미노 보호 그룹을 제거하기 위한 조건은 측쇄보호 그룹의 탈보호를 유발하지 않는다.
알파-아미노 보호 그룹은 단계적인 펩타이드 합성분야에 유용한 것으로 알려진 것들이다. 아실 타입 보호 그룹(예를들면, 포르밀, 트리플루오로아세틸, 아세틸), 방향족 우레탄타입 보호 그룹(예를들면, 벤질옥시카보닐(Cbz) 및 치환된 벤질옥시카보닐), 지방족 우레탄 보호 그룹(예를들면, t-부틸옥시카보닐 (Boc), 이소프로필옥시카보닐, 사이클로헥실옥시카보닐 ) 및 알킬 타입 보호 그룹(예를들면, 벤질, 트리페닐메틸)이 포함된다.
바람직한 보호 그룹은 Boc 이다. Tyr 에 대한 측세 보호 그룹에는 테트라하이드로피라닐, 3급-부틸, 트리틸, 벤질 Cbz, 4-Br-Cbz 및 2, 6-디클로로벤질이 포함된다. Tyr 에 대한 바람직한 측쇄 보호 그룹은 2, 6-디클로로벤질이다. Asp 에 대한 측쇄 보호 그룹으로는 벤질, 2, 6-디클로로벤질, 메틸, 에틸 및 사이클로핵실이 포함된다. Asp 에 대한 바람직한 측쇄 보호 그룹은 사이클로핵실이다. Thr 및 Ser 에 대한 측쇄 보호 그룹에는 아세틸, 벤조일, 트리틸, 테트라하이드로피라닐, 벤질, 2, 6-디클로로벤질 및 Cbz 이 포함된다.
Thr 및 Ser 에 대한 바람직한 보호 그룹은 벤질이다. Arg 에 대한 측쇄 보호 그룹에는 니트로, Tos, Cbz, 아다만틸윽시카보닐 또는 Boc 가 포함된다. Arg 에 대한 바람직한 보호 그룹은 Tos 이다. Lys 의 측쇄 아미노 그룹은 Cbz, 2-ClCbz, Tos 또는 Boc 로 보호될 수도 있다. 2-Cl-Cbz 그룹이 Lys 에 대한 바람직한 보호 그룹이다.측쇄 보호 그룹의 선택은 다음조건을 기준으로 한다 : 측쇄 보호 그룹은 커플링시 손상되지 않고 유지되며, 아미노-말단 보호 그룹의 탈보호시 또는 커플링 조건하에서 분리되지 않는다. 측쇄 보호그룹은 표적 펩타이드를 변화시키지 않는 반응 조건을 사용하여 최종 펩타이드의 합성 완료시에 제거될 수 있어야 한다.
고상 합성은 동상적으로 알파-아미노 보호된(측새 보호된)아미노산을 적합한 고체 지지체에 커플링시켜 카복시-말단으로 부터 수행한다. 클로로메틸화 또는 하이드록시메틸 수지에 부착되면 에스테르 결합이 형성되고, 생성된 표적 펩타이드는 C-말단에 유리 카복실 그룹을 가질것이다. 그렇지않으면, 벤즈하이드릴아민 또는 p-메틸멘즈하이드릴아민 수지를 사용하는데, 이 경우 아미드 결합이 형성되며 생성된 표적 펩타이드는 C-말단에 카복스아미드 그룹을 가질 것이다. 이들 수지는 상업적으로 시판하며 그 제조방법은 스테워트(Stewart)등의 문헌[＆quot;Solid Phase Peptide Synthesis＆quot;(2nd Edition, Pierce Chemical Co. , Rockford, IL., 1984)]에 개시되어 있다.
측쇄에서 Tos 로 보호되고 알파-아미노 작용기에서 Boc 로 보호된 C-말단 아미노산 Arg는 디사이클로헥실카보디이미드(DCC), N, N'-디이소프로필카보디이미드 및 카보닐디이미다졸을 포함한 다양한 활성화제를 사용하여 벤즈하이드릴아민수지에 커플링시킨다. 수지 지지체에 부착된 후에, 0°내지 25℃의 온도에서 디옥산중의 트리플루오로아세트산(TFA) 또는 HCl 을 사용하여 알파-아미노 보호 그룹을 제거한다. 가능한 S-알킬화를 억제하기 위해 메티오닌(Met)을 도입한 후에 디메틸설파이드를 TFA 에 가한다. 알파-아미노 보호 그룹을 제거한 후에, 목적하는 펩타이드 서열을 수득하기 위해 필요한 대로 단계적으로 남은 보호된 아미노산을 커플링시킨다.
DDC, N, N' -디이소프로필카보디이미드, 벤조트리아졸-1-일-옥시 -트리스(디메틸아미노)-포스포늄 헥사풀루오로포스페이트(BOP) 및 DCC-하이드록시 벤조트리아졸(HOBt)을 포함한 다양한 활성화제를 커플링 반응에 사용할 수 있다. 각각의 보호된 아미노산은 과량(＆gt; 2.5 당량)으로 사용하며, 커플링은 통상적으로 DMF, CH2Cl2또는 그의 혼합물중에서 수행한다. 커플링 반응의 완료 정도는 카이저(Kaiser)등의 문헌[Anal. Biochem. 34 : 595(1970)]에 개시된 바와 같은 닌하이드린 반응에 의해 각 단계에서 조사한다. 불완전한 커플링이 측정되는 경우에는, 커플링 반응을 반복한다. 커플링 반응은 베가(Vega)250, 어플라이드 바이오시스템즈(Applide Biosystems) 합성기 또는 다른 상업적으로 시판하는 장치상에서 자동으로 수행할 수 있다. 표적 펩타이드 전체가 구성된 후에, 펩타이드-수지를 TFA/디티오에탄으로 탈보호시키고, 이어서 0℃ 에서 1 내지 2 시간동안 액상 HF 와 같은 시약으로 분리시키면 수지로부터 펩타이드가 분리되고 모든 측쇄 보호 그룹이 제거된다.
고체 지지체상에서 측쇄에서 측쇄로 환화시키는 공정에는 산성 아미노산(예를들면, Asp) 및 염기성 아미노산 (예를들면, Lys)의 측쇄 작용기를 선택적으로 분리시킬 수 있는 직각 보호 도식을 사용할 필요가 있다. Asp의 측쇄에 대한 9-플루오레닐메틸(OFm) 보호 그룹 및 Lys 의 측쇄에 대한 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 보호 그룹을 상기 목적으로 사용할 수 있다. 이 경우 Boc-보호된 펩타이드-수지의 측쇄보호 그룹은 DMF 중의 피페리딘으로 선택적으로 제거된다.
DCC, DCC/HOBt 또는 BOP 를 포함한 다양한 활성화제를 사용하여 고체 지지체상에서 결정화시킨다. HF 반응은 전술한 바와 같이 환화된 펩타이드-수지상에서 수행한다.
합성 단벡질의 정제 및 검색은 재조합기법으로 생성된 단백질에 대해 전술한 바와 같이 수행할 수 있다.
에이메리아 단벡질은 또한 유기체로 부터 막 단백질 추출물로 부터 회수할 수 있다. 상기 방법은 완전한 야생-타입 단백질을 생성시킬 수 있다. 상기 목적의 단클론성 항체는 합성 또는 천연 에이메리아 단백질을 항원으로 사용하여 쾰러(Kohler) 및 밀스타인(Milstein)의 문헌[Nature 256 : 495(1975)]에 개시된 바와 같이 생성시킬 수 있다. 상기 방법을 사용하여 본 발명의 23kd 에이메리아 표면 항원을 정제할 수 있다.
하나이상의 본 발명의 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 백신으로 제형화할 수 있다. 적합한 담체는, 예를들면 중성 pH 의 0.01 내지 0.lM 포스페이트 완충제 또는 생리 식염수 용액을 포함한다.
콕시디아증에 대한 면역성은 2 가지 방법중 하나에 의해 증대될 수 있다. 첫째로, 보조제 또는 면역강화제를 백신에 가할 수 있다. 둘째로는, 본 발명의 단백질을 면역될 대상 개체에게 보다 큰 형태로, 가교결합된 복합체로서 또는 담체 분자에 결합된 상태로 투여할 수 있다.
대상개체의 예방접종에 적합한 보조제로는 애쥬번트(Adjuvant) 65(호마유, 만니드 모노올리에이트 및 알루미늄모노스테아레이트 함유), 무기질 겔(예들들면, 수산화 알루미늄, 인산 알루미늄 및 알룸), 계면활성제(예를들면, 헥사대실아민, 옥타대실아민, 라이졸레시틴, 브롬화 디메틸디옥타데실암모늄, N, N-디 옥타데실-N' N' -비스(2-하이드록시메틸)프로판디아민, 메톡시헥사데실글리세롤 및 플루론산 폴리올, 다가음이온(예를들면, 피란, 덱스트란 설페이트, 폴리 IC, 폴리아크릴산 및 카보폴), 펩타이드(예를들면, 뮤라밀 디펩타이드, 디메틸글리신 및 터프트신) 및 오일 유화액이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질은 또한 리포좀 또는 기타 미제담체내로 삽입된 후에 투여할 수 있다.
리포좀 또는 기타 미세담체내로 삽입시킴으로써 백신방출이 연장된 기간동안 지속될 수 있게 하는 수단이 제공된다. 앨자(Alza) 삼투압 핌프와 같은 펌프를 상기 목적에 사용할 수 있다.
본 발명의 폴리폡타이드, 특히 보다 작은 단편의 면역원성은 공유 결합에 의해, 또는 면역원성 담체 분자(즉, 본 발명의 단백질 및 단백질 단편이 공유 결합될 수 있는, 숙주 동물에서 면역 반응을 독립적으로 유도하는 성질을 갖는 거대분자)에 커플링시킴으로써 증대될 수 있다. 때때로 소 단백질 단편은 합텐(항체에 특이적으로 결합할 수 있으나 항체 생성은 유도할 수 없는, 즉 면역원성이 아닌 분자)으로 작용하므로 담체분자에 가교결합시키거나 결합시키는것이 필요할 수도 있다.
면역원성 담체 분자에 대한 상기 단편의 결합은 단편을 면역원성이 되도록 하여 이에의해 보편적으로 ＆quot;담체 효과＆quot;로 알려져있다.
적합한 담체 분자로는, 예를들면 단백질 및 천연 또는 합성 중합체성 화합물, 예를들면 폴리펩타이드, 다당류, 리포다당류등이 포함된다. 유용한 담체는 모레인(Morein)등의 문헌[Nature 308 : 457(1984)]에 개시된 퀼(Quil) A 로 불리는 글리코사이드이다. 포유동물 혈청 단백질, 예를들면 키홀림펫 헤모시아닌, 인간 또는 소외 감마글로불린, 인간, 소 또는 토끼 혈청 알부민, 또는 상기 단백질의 메틸화 또는 기타 유도체(이에 제한되는 것은 아니다)를 포함한 단백질 담체 분가자 특히 바람직하다. 다른 단백질 담체는 당해분야에 숙련된 자에게 명벡할 것이다. 단백질 당체는 에이메리아 단백질에 대한 항체가 유도될 숙주 동물에 이중인 것이 바랍직하나, 반드시 그럴 필요는 없다.
담체 분자에 대한 공유 커플링은 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있으며, 그 정확한 선택은 사용된 담체 분자의 성질에 의해 결정될 것이다. 면역원성 담체 분자가 단백질인 경우, 본 발명의 단백질 또는 단편은, 예를들면 디사이클로헥실카보디이미드 또는 클루타르알데하이드와 같은 수용성 카보디이미드를 사용하여 커플링시킬 수 있다.
또한, 상기와 같은 커플링제를 사용하여, 별도의 담체분자를 사용하지 않고 단백질 및 단편을 그 자체에 가교결합시킬 수 있다. 단백질 또는 단백질 단편 응집체내로 상기와 같이 가교결합시키면 또한 면역원성이 증가될 수 있다.
효과량의 본 발명의 백신을 투여하여, 예를들면 이. 테넬라 감염 또는 기타 에이메리아 종에 의한 감염에 의해 유발된 바와 같은 콕시디아증을 예방할 수 있다. 이. 테넬라 항원에 대한 단클톤성 항체를 이. 아세르불리나 및 이. 멕시마(E. maxima)와 시험관내에서 교차 반응시킨다. 바람직한 대상 기체는 닭과 같은 가금류이나, 다른 개체도 본 발명의 범주에 속한다. 본 발명에 따라 임의의 효과량의 백신을 사용할 수도 있다. 효과량은 하기에 기술하는 방법을 사용하여 통상적인 실험에 의해 결정할 수 있다. 종두화된 대상 개체의 체중kg당 약 5 내지 약 50㎍/kg 범위인 효과량의 본 발명 풀리펩타이드 및 단편이 바람직하며, 약 25 내지 50㎍/kg 의 투여량이 특히 바람직하다. 초기 종두화에 이어 1 내지 수주후에 추가항원 자극제로 종두화 하는 것이 바람직하다. 다중 추가항원자극제를 투여할 수도 있다. 상기 추가항원자극제의 투여량은 일반적으로 약 5 내지 50㎍/kg, 바랍직하게는 약 20 내지 50㎍/kg 의 범위이다. 피하, 피내, 근육내, 경구, 항문 또는 난(ovo) 투여(배자내로 직접 주입)와 같은 표준 투여 경로를 사용할 수 있다. 단일 또는 다중 추가항원자극 종두화후에, 유도된 경미한 콕시디아증에 감염시킬 수도 있는데 이로써 예방이 강화될 수 있다.
대상 개체, 예를들면 가금류의 면역 시스템에 본 발명의 콕시디아증 항원을 투여하는 것은 또한 세균(예를들면, 이. 콜라이 또는 살모넬라) 또는 바이러스(예를들면, 폭스바이러스 또는 헤르페스바이러스)내로 항원을 암호화하는 유전자를 클로닝시키고, 생 벡터 시스템, 또는 경우에 따라 그의 불화성화 형태를 대상 개체에게 경구로, 주사에 의해 또는 보편적으로 사용되는 다른 경로에 의해 투여함으로써 또한 수행할 수 있다. 카빗(Carbit )등의 문헌 [Vaccines, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory, pp.68-71]에는 이. 콜라이의 사용이 개시되어 있고, 클레멘츠(Clements)등의 문헌[Pathol. Immunopathol. Res.6 : 137(1987)]에는 살모넬라의 사용이 개시되어 있다. 모스(Moss)등의 문헌[Ann. Rev. Immunnol. 5 : 305(1987)]은 재조합 폭스 바이러스를 사용하는 바이러스 벡터 시스템의 사용을 개관하고있다.
일종의 폭스바이러스인 백시니아 바이러스를 사용하여 세포 배양액 및 동물중에서 콕시디아증 항원의 전달을 시험할수 있다. 계두 바이러스는 본 발명의 수행에 사용할 수 있는 또다른 폭스바이러스 담체이다. 분석화적 연구에 있어, 백시니아바이러스는 계두 바이러스보다 더 실용적인 것으로 밝혀졌다.
이것은 백시니아 바이러스가 조류 바이러스보다 더 신속히 증식되며 조류 세포로 제한되지 않는 숙주 범위를 갖기 때문이다. 바이러스 성숙 및 감염력을 억제하지 않고 대량의 이종 DNA 를 백시니아 바이러스 게놈내로 삽입할 수 있다[Smith et al., Gene 25 : 21(1983)]. 바이러스내로 삽입된 다중 이종 유전자는 감염된 동물내에서 발현되며 항체 생성을 유도한다[Perkus et al., Science 229 : 981(1985 ) ] .
재조합 백시니아 바이러스를 제조하는데 사용된 기법은 통상적인 방법에 의해 계두 또는 헤르페스바이러스 시스템에 쉽게 적용될 수 있다. 본 발명의 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 를 포함하는 재조합 바이러스는, (a) 바이러스 성숙 및 감염력을 억제하지 않으면서, 상기 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 를 바이러스의 게놈에 삽입시키고, (b) 상기 재조합 바이러스를 세포 배양액중에서 증폭시킨 후, (c) 재조합 바이러스를 배양액으로 부터 정제함으로써 제조할 수 있다.
콕시디아증에 대한 백신에 당체로서 재조합 바이러스를 사용하면 종두화된 가금이 콕시디아증 항원 및 바이러스 담체, 둘다에 대해 변역성이 중대된다는 점에서 특히 유리하다(즉, 상기 백신은 이중으로 유용하다). 상기 백신의 유용성은 추가의 유전자를 담체 바이러스내로 삽입시킴으로세 더욱 증대될 수 있다.예를들면, 일부의 뉴캐슬(Newcastle) 질병 바이러스 게놈은 콕시디아증 항원 유전자와 함께 계두 바이러스내로 삽입될 수있으며, 이로써 뉴캐슬 질병, 콕시디아증 및 계두에 대한 면역성이 모두 단일 백신에 의해 제공된다.
본 발명의 생 벡터 백신의 투여는 당해분야에 공지된 많은 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를들면, 계두 바이러스에 대해 가금류를 종두화시키는데 통상적으로 사용되는 ＆quot;스틱(stick)＆quot; 방법을 사용할 수 있다. 상기 방법은 날개 깃의 가죽을 백신중에 침지시킨 날카로운 바늘로 찌름을 포함한다. 통상적으로 상기 바늘은 소량의 백신을 갖는 재봉기 바늘과 같이 팁 부근에 눈을 갖는다. 그렇지않으면, 생 백신을 피하로 또는 피내로 날게 깃 또는 임의의 기타 부위내로 주입할 수 있다.
재조합 생 벡터 백신은 또한 음료에 가하거나 또는 심지어 병아리와 같은 종두화될 대상 개체에 분무할 수 있다. 이들 백신은 또한 바람직하게는 보호성 캡슐화[Balancou et al., Nature 322 : 373(1986)] 후에 사료에 또는 난에 투여될 수 있다. 후자의 방법에서는 바이러스 백신을 직접 배자에, 특히 닭 배자에 주입 한다 [Sharma, Avian Dis. 25 : 1155(1985)].
달리 명시하지 않는한, 고체 혼합물중의 고체, 액체중의 액체, 액체중의 고체에 대해 나타낸 % 는 각각 중량/중량, 부피/부피 및 중량/부피 기준이다. 또한, 달리 명시하지 않는한, 하기에 언급하는 시약 및 장지의 공급자는 지정된 것으로 이해할 필요 없다. 숙련된 자라면 유사한 시약 또는 다른 공급자의 장치를 선택할 수 있을 것이다.
[실시예 1]
[메로조이트의 정제]
50, 000 개의 상기 포자형성된 낭포체/조류로 감염된 5 일 후에 50 마리의 감염된 닭(3 주된 휴바드 크로스(Hubbard Cross)종, 미합중국 뉴저지 프렌치타운 소재의 아비안 서비스(Avian Services))의 맹장으로 부터 이. 테넬라의 메로조이트를 수거하였다. 다른 공급원으로 부터 유사한 닭을 사용할 수도 있다. 맹장을 떼어내어 자기적 교반기상에서 15 분간 포스페이트 완충된 식염수(PBS)로 세척하였다. 상피성 조직편을 저속 원심분리(50xg)에 의해 부분적으로제거하고, 4℃ 에서 2, 000xg 에서 10 분간 원심분리하여 조 메로조이트를 회수하였다. 셀릿을 라이징(Lysing) 완충제(8.29g/ℓ NH4CL, 0.372g/ℓ Na2EDTA, 1.0g/ℓ KHCO3, pH 7.6)에 재현탁시키고, 30 분간 얼음상에서 배양하였다. 원심분리에 의해 메로조이트를 수거하여 PBS 중에서 1 회 세척하고, 분별 깔대기에서 1.0g 의방적 나일톤 섬유(스크럽 나일론 섬유, 일리노이즈 데어필드 소재의 휀월 레버러토리즈(Fenwall Laboratories)를 함유하는 컬럼상에 통과시켰다. 상기와 같이 원심분리에 의해 메로조이트를 수거하고, RNA 단리를 위해 드라이아이스상에서 냉동시키거나 또는 웨스턴 블롯 분석을 위해 디에틸아미노에틸셀룰로즈 (DEAE, 미합중국 뉴저지 클립톤 소재의 와트만 바이오 시스템즈 인코포레이티드(Whatman Bio Systems, Inc.)사의 와트만 DE52)중에서 더 정제하였다.
DEAE 셀룰로즈로 정제할때 PBS중 의 약 1×109메조이트를 10㎖베드 용적 컬럼에 걸고 PBS로 용출시켰다. 메로조이트를 필수적으로 적혈 세포 및 기타 세포 조직편이 없는 첫번째 100㎖의 흐름으로 히수 하였다.
[125I-표지된 표면 단백질의 면역침전]
정제된 메로조이트의 표면 단백질을 요오도겐( IODOCEN )TM방법(피어스 케미칼 캄파니(Pierce chemical Co. ))에 의해 또는 요오도비이드( IODOBEADS )TM(피어슨 케미칼 캄파니)를 사용하여125I로 표지화하였다. 요오드비이드를 사용하는 경우 4개의 요오도비이드TM를 0.2M 인산 나트륨(pH 7.5)으로, 3 회 세척하고, 1 내지 3mCi 의125I-Na 를 가한후 실온에서 5 분간 배양하였다. 200㎖ 의 PBS(pH 7.0)중의 정제된 메로조이트(3 x 108)틀 반응 바이알에 가하고, 15 분간 배양을 지속하였다. 배양말기에 , 페닐메탄설포닐 플루오라이드(PMSF)를 5mM 의 최종 농도가 되도록 가하였다.
표지된 메로조이트를 12, 000 x g 에서 30 초간 원심분리하여 배양 혼합물로 부터 회수하고, 1㎖ 의 2% 도에실황산나트륨(SDS) 또는 PBS(pH 7.0중의 1% 트리톤(Triton) X-100 에 용해시켰다. 12, 000 × g 에서 3 분간 원심분리시켜 불용성물질을 제거하였다. 가용화된 단백질을 3, 500 분자량의 차단막을 사용하여 4℃ 에서 3ℓ 의 PBS(pH 7.0로 투석시켜 임의의 잔류하는 유리125I 를 제거하였다.125I-표지된 단백질(전형적으로 약 1.5× 108cpm 이 단백질내로 삽입됨)은 사용할때까지 4℃ 에서 저장하였다. TCA 침전성 방사능은 전형적으로 총 방사능의 95% 를 초과하였다.
글루타르알테하이드-고정된 메로조이트에 대한 토끼 항혈청은 다음과 같이 제조하였다.
약 1 × 109의 정제된 메로조이트틀 PBS 중의 1% 클루타르알데하이드에 현탁시키고 실온에서 5 분간 항온처리하였다. 고정된 기생충을 2000 x g 에서 5 분간 원심분리시켜 수거하고, PBS 로 3 회 세척한 후, 1㎖ 의 PBS 에 재현탁시켰다. 뉴질랜드 화이트 토끼 등가죽에 0.5㎖의 완전 프러인드(Freund)보조제로 유화된 고정된 기생충 용액 총 0.5㎖ 를 중복 피내 주입하였다. 토끼는 2 주 간격으로 불완전 프러인드 보조제중의 동일한 기생충 단백질을 함유하는 2 개의 추가항원자극제 주입물을 투여받았다. 최종 추가항원자극 2 주후에 귀 정맥으로 부터 혈액을 모아서 2500 x g 에서 15 분간 응집된 혈액 샘플을 원심분리하여 항체를 함유하는 혈청을 수득하였다.
면역침전용의 표지된 단백질 샘플(5ml, 5 x 105cpm함유)을 100ml의 IP 완충제(0.25% NP-40, 20mM 트리스-HCl, pH 7.5, 0.15M NaCl)로 희석하고, 얼음상에서 5mg 의 스타프(Staph)-A 단백질(캘리포니아 샌디에고 소재의 칼바이오켐코포레 이 션(Calbiochem Corp.) 사의 판소르빈(Pansorbin)TM)과 함께 20 분간 배양함으로써 미리 께끗하게 하고, 4℃ 에서 5 내지 10㎖ 의 토기 항-메로조이트 혈청과 함께 수시간 동안 배양하였다. 얼음상에서 5㎎ 스타프-A 단벡질을 함께 20 분 2 차 배양하여 항체 복항체를 수거하고 에펜도르프(Eppendorf) 원심분리기에서 15 초간 원심분리하였다. 펠릿을 IP 완충제로 4 회 세척하고, 항체 시약에 의해 면역침전된 침전된 표지된 단벡절을 SDS 겔 샘플 완충제(65mM 트리스(pH 6.8), 0.5%SDS, 5% 베타-머캅토에탄올, 10% 글리세롤, 0.1% 브로모페놀 블루)중에서 5 분간 100℃ 로 가열하여 복합체로 부터 용출시겼다. SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS PACE)을 라엠리(Laennnli)의 문헌[Nature 227 : 680(1970)]에 개시된 바와같이 수행하였다.
토끼 항혈청을 사용하여 수득된 결과를 하기와 같이 제조한 면역 닭 혈청을 사용하여 확인하였다.
이. 테넬라의 생존가눙한 포자형성된 낭포체(100, 000낭포체, 2 주 간격으로 3 회 투여)를 반복 감염시켜 닭을 면역시켰다. 혈액을 심장 천자에 의해 모아서 2500 x g 에서 5 분간 원심분리한 후 응집된 조직편으로 부터 항체를 함유하는 혈청을 분리하였다.
항-메로조이트 토끼 혈청 및 면역 닭 혈청 둘 다를 사용하여125I-표면-표지된 에이메리아 메로조이트 단백질 및 폴리(A)-함유 메로조이트 RNA 의 시험관내 번역 생성물을 면역침전시키는 비교 연구를 수행하였다. 이어서, 침전된 단백질을 SDS PACE 시키고, 표준 형광사진 기법 몇 시약을 사용하여 형광사진으로 가시화시켰다.
상기 연구로부터 2가지 공급원 모두로 부터 많은 단백질이 두가지 혈청 모두에 의해 침전됨을 알수 있었다. 따라서, 어떤 혈청을 사용하여서도 에이메리아 단백질을 발현시키는 유전자 제조합체를 검색할 수있었다. 편리하도록, 하기에 기술하는 검색 방법에 토끼 항-메로조이트 혈청을 먼저 사용하였다. 그러나, 면역 닭혈청을 하기에 기술하는 바와 같이 cDNA 라이브러리의 병렬 검색에 사용하였다. 이것은 전염성 유기체에 대한 면역 반응에 중요할 듯한 단백질의 동정에 필수적인데, 왜냐하면 닭 혈청만이 생 유기체로 항원투여에 반응하여 생성되기 때문이다. 면역된 닭만이 상기 유기체에 입증할 수 있도록 내성이 있었다.
에이메리아 단백질에 대한 토끼 항-메로조이트 혈청의 특이성을 증가시키기 위해, 본절적으로 홀등의 문헌[Nature 311 : 379(1984)]에 개시된 바와 같이 혈청상에서 항체를 선택하였다. 간략하게, 재조합 파아지 클톤(하기 참조)에 의해 발현된 전구체 단백질에 특이적인 항체를 하기와 같이 토끼 항-메로조이트 혈청으로 부터 정제하였다.
양성 파아지를 고농도로 평판배양하고 42℃ 에서 3.5시간동안 배양시켰다. 플레이트에 10mM 이 소프로필티오갈락토사이드(IPTG)로 포화된 니트로실물로즈 필터를 덮어 융합 단백질의 발현을 유도하고 37℃ 에서 6 내지 8 시간동안 배양을 지속하였다. 항원-부하된 필터를 TBS(20mM 트리스-HCl, pH 8.0, 150mM NaCl)로 세척하고, 이. 콜라이 숙주 세균으로 미리 흡수시킨 과량의 항-메로조이트 혈청과 함께 4℃ 에서 8 내지 10 시간동안 배양하였다. 필터를 TBS 로 3 회 세척하여 비-특이적 항체를 제거하였다.
필터상에서 융합 단백질에 특이적으로 결합된 항체를 2.0㎖의 0.1M 글리신(pH 2.6), 0.15MNaCl 로 용출시켰다(20℃에서 15 분). 용출된 항체를 등부피의 0.1M 트리스-HCl(pH8.O)로 즉시 중화시켰다. 이어서, 선택된 항체(하기에서 ''항원-선택성 항체＆quot;로 지칭함)를 표면-표지화된 메로조이트 또는 시험관내 번역 생성물의 면역침전에 사용하거나 또는 전체 메로조이트 단백질의 웨스턴 블롯에 프로브로 사용하였다.대조용 혈청은 항원-선택 방법에 비-재조합 파아지를 사용하여 제조하였다.
항원-선택성 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 및 면역침전시킨 결과를 제 2 도에 나타내었다. 표지된 단백질의 면역침전 생성물을 보너 (Bonner)등의 문헌 [Eur. J. Biochem, 46 : 83(1974)]에 개시된 바와 같이 형광사진술로 가시화시켰다. 도면 오른쪽의 번호는 알려진 크기(kDa)를 갖는 분자량 마커 단백질의 위지를 나타낸다.
제 2 도의 패널 A 는 대조용(a) 또는 항원-선택성 항체(b) 로 프로브검색된 총 메로조이트 단백질의 면역블롯을 나타낸다. 페널 B 는 대조용(a) 또는 항원-선택성 (b) 항체로 면역침전된125I-표면-표지화된 메로조이트 단백질을 나타낸다.
[메로조이트 mRNA의 단리 및-시험관내 번역]
1 × 109내지 1× 101o유기체를 함유하는 냉동된 메로조이트 펠릿을 1mM 디티오트레이톨(DTT) 및 300 유니트의 RNasin(위스콘신 메디슨 소재외 프로메가 바이오텍(Promega Biotec))을 함유하는 10㎖의 TEL/SDS 완충제(0.2M 트리스-HCl, 0.1M LiCl, 25mM EDTA, 1%(w/v) 도데실 황산 나트륨(SDS), pH 8.8)에 해동시키고 테플론-코팅된 조직 균질기에서 10내지 12 스트로크로 균질화시켰다. 불용성 조직편을 3, 000 × 8에서 냉각하에 원심분리시켜 분리하였다. 상등액 유체를 TEL 완충제로 평형화시킨 페놀 : 클로로포름 : 이소아일 알콜 (24 : 24 : 1, v/v)로 2 회 추출시켰다.
수성상을 37℃ 에서 100㎎/㎖의 프로테이나제 K로 30 분간 절단시키고 동부피의 페놀 : 클로로포름(1 : 1)으로 재추출시킨 후, 헥산을 2 부피의 에탄올로 드라이아이스상에서 1 시간 동안 또는 -20℃ 에서 밤새 침전시켰다. 10, 000 x g에서 1 시간동안 원심분리한 후 펠릿을 TE(10mM 트리스-HCl, pH 7.5, 2mM EDTA)에 재현탁시키고, 15℃ 에서 150, 000 x g 에서 20 시간동안 4㎖ 의 CsCl 쿠션(5.7M CsCl, 0.1 M EDTA을 통해 방사시켰다. RNA 펠릿을 2.5 부피의 에탄올로 0.2M 아세트산 칼륨으로부터 재침전 시켰다. 총 RNA 를 올리고 -dT 셀룰로즈상으로 1 회 통과시켜 마니아티스의 상기 문헌 197 페이지에 개시된 바와같이 폴리(A)+RNA 를 농축시켰다. 5 x 109메로조이트로 부터 1.9mg의 총 RNA 의 전형적인 수율은 약 20㎍ 의 폴리(A)+RNA 를 함유하였다.
0.1 내지 0.5㎍ 의 mRNA 를 사용하여 반응 혼합물 20㎖ 당 10 내지 20 mCi 의 35s-메티오닌으로 보충된 뉴클레아제-처리된 래비트 망상적혈구 용해물(미합중국 일리노이즈 앨링톤 하이츠 소재의 아머샴 코포레이션(Amersham Corp.) 또는 프로메가바이오텍)중에서 시험관내 단백질 합성을 계획하였다. 시험관내 면역 생성물을 면역 침전시킨 후 SDS PAGE 에 의해 분석하고 전술한 바와같이 형광 사진술로 가시화시켜 결과를 제 2 도 패널C 에 나타내었다.
패널 C 의 c 레인은 폴리(A)-함유 메로조이트 RNA 에 의해 프로그램된 생성물외 완전 혼합물을 나타낸다. b, a 및 d 레인은 각각 람다 5 내지 7(하기 참조 : 상기 클론은 33 kd 의 에이메리아 전구체 단백질을 암호화하는 유전자를 발현시킨다)로 불리는 재조합 파아지 클론, 항-메로조이트 혈청과 반응하는 또다른 파아지 클론 및 비-재조합 람다 8t11 클론에 의해 선택된 항체로 면역침전된 면역 생성물을 나타낸다.
약 33 kDa 외 겉보기 분자량을 갖는 주요 단백질을 제 2 도 패널 C 의 a 및 b 레인에서 볼 수 있음을 주목해야 한다. 상기 단백질은 항원-선택성 항체(패널 A, b레인)로 프로브검색된 총 메로조이트 단백질을 함유하는 레인에는 존재하지 않으나, 23 kDa 의 밴드를 이 겔에서 찾아볼 수 있다(패널 A, b레인, 화살표). 23 kDa 의 단백질은 또한 제 2 도 패널 B, b레인에 나타낸 바와같은125I-표지된 메로조이트 단백질로부터 항원-선택성 항체에 의해 면역침전되었다. 이러한 관찰로 부터 33 kDa 전구체 단백질이 성숙한 메로조이트의 단백분해적 절단에 의해 23 kDa 의 표면 항원으로 처리될 수 있음을 알 수 있다.
[메조로이트 cDNA 발현 라이브러리의 제작]
올리고(dT) 프라이머로부터 연장시키기 위한 역전사효소(BRL, 미합중국 메릴랜드 게이터스버그 소재) 및 상보성 가닥을 합성하기 위한 RNase H (BRL) 및 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I (미합중국 메사추제츠 비버리 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs))를 사용하여 거블러(Gubler) 등의 문헌[Gene 25 : 263(1983)]에 개시된 바와같이 6㎍ 의 메로조이트 폴리(A)+RNA 로 부터 2중 가닥 cDNA를 합성하였다. 이어서, 이중-가닥 cDNA를 T4 DNA 폴리머라제(BRL)로 무딘 말단을 형성시키고, EcoRI 링커(CGAATTCC, 미합중국 메사추세츠 배드포드 소재의 콜라보레이티브 리서치 인코포레이티드(Collaborative Research Inc.))를 제조업자의 프로토콜에 따라, EcoRI 메틸라제(뉴 잉글랜드 바이어오랩스)로 처리한 후에 가하였다.
EcoRI 로 절단한 후에, cDNA 를 바이오겔(Biogel) A-50M에서 분별시켜 휴인(Huynh)등의 하기 문헌에 기술된 바와같이 과량의 링커 분자 및 약 300bp 보다 작은 cDNA 를 제거하였다. 이어서, 에탄올로부터 침전시켜 cDNA를 농축시켰다.
휴인 등의 문헌 [D. Glover(ed.), DNA Cloning Vol. I : A Practical Approach, 1985, IRL Press, Washington, D.C., USA, pp. 49-78]에 기술된 바와같이, 라이브러리를 λgt11(미합중국 캘리포니아 샌 디에고 소재의 스트라타진 클로닝 시스템즈(Stratagene Cloning Systems))중에서 제작하였다. EcoRI cDNA 단편을 절단된 EcoRI 에 연결시키고, λgt11 아암(스트라타진 클로닝 시스템즈)을 탈인산화시킨 후, 생성된 DNA 를 제조업자의 프로토콜에 따라, 기가팩(Gigapack)TM키트를 사용하여 파아지내로 팩키지시켰다.
수득된 라이브러리를 Y1088 숙주 세포상에 평판배양하여 증폭시켰다. 제조합체의 % 는 이소프로필 티오갈락토사이드(IPTG, 시그마 케미칼 캄파니)의 존재하에서 X-gal 플레이트상의 청색 플라크 대 무색 플라크의 비로부터 평가하여 약 90% 로 나타났다.
[cDNA 라이브러의 면역 검색]
λgt11 메로조이트 cDNA 반현 라이브러리를 150mm 플레이트당 약 10, 000 플라크의 밀도로 Y1090 세포상에 평판배양 하였다. 6개의 상기 플레이트를 42℃ 에서 3.5 시간동안 배양하고, 10 mM IPTG 에 미리 침지시킨 니트로셀룰로즈 필터를 덮어 배타-갈락토시다제 융합 단백질의 발현을 유도한 후, 37℃에서 4 내지 5 시간 내지 밤새 더 배양하였다. 필터를 플레이트로부터 꺼내어 TBS(20 mM 트리스 HCl, pH 8.0, 0.15 M NaCl)로 수회 회분식으로 세척하였다. 실온에서 TBS 중의 20% 송아지 태 혈청 (FCS)중에서 1 시간동안 배양시켜 비특이적 단백질 결합 부위를 차단시켰다.
이어서, 필터를 20% 송아지 혈청을 함유하는 TBS 중에서 1 : 100 희석율로, Y1090 세포로 미리흡작시킨 토끼 항-메로조이트 혈청과 함께 1 시간동안 배양하였다. 하나가 0.1% NP-40을 함유한 TBS 로 연속적으로 세척하여 비특이적 항체를 제거하였다. 필터를 송아지 혈청을 함유한 TBS 중에서 1 : 1000 희석율로 양의 항-토끼 퍼옥시다제 결합물(캘리포니아 리치몬드 소재의 바이오래드)과 함께 실온에서 1시간동안 배양하였다. 제조업자의 지시에 따라 4-클로로-1-나프톨(바이오래드)로 색 반응을 발색시켰다.
면역 병아리로부터 취한 혈청을 또한 검색에 사용하였다. 상기 혈청은 Y1090 세포로 미리흡착시키고 토끼 혈청과 동일한 희석율로 사용하였다. 토끼의 항-닭 항체를 2차 항체로 사용하고, 양의 항-토끼 양고추냉이 퍼옥시다제 결합물을 검출 항체로 사용하였다. 동일한 시약을 사용하여 2차 검색에서 단일 플라크를 단리하였다.
람다 5 내지 7 로 불리는 하나외 클론은 래비트 혈청으로부터 얻은 항체와 강하게 반응하는 단백질을 생성하였다. 면역 병아리 혈청으로 검색하여 2차 단리물, 1-5를 동정하고, 5-7 클론과 동일한 크기의 cDNA 삽입체를 함유함을 입증하였다. DNA 서열분석으로부터 상기 파아지 클론이 동일한 메로조이트 항원을 암호화함을 알 수 있었다.
[이. 콜라이에서의 람다 5-7 cDNA의 발현]
EcoRI 절단 및 아가로즈 겔 전기영등에 의해 람다 5-7 로 부터 1.2kb 삽입체를 단리하였다(미니아티스 등의 상기 문헌 157 내지 170 페이지). dATP 및 dTTP 의 존재하에서, 클레나우(Klenow) 폴리머라제로 EcoRI 말단을 복원시키고, BamHI 링커(GGGATCCC)로 양쪽 말단을 연결시켰다. 변형된 단편을 BamHI 부위에서 3개의 발현 벡터 pDS56/RBSII, pDS56/RBSII, -1 및 pDS56/RBSII, -2 의 각각에 삽입시켰다. 이들 3개의 벡터는 하기에 기술한다. 양쪽의 가능한 배향으로 삽입체를 함유하는 플라스미드를 만델(Mandel)등의 문헌 [J. Mol. Biol, 53 : 159(1970)]에 개시된 바와같이 양립가능한 플라스미드 pDMI.1 을 갖는 이. 콜라이 균주 M15 내로 형질전환시켰다. 플라스미드 pDS56/RBSII 및 pDMI.1 을 갖는 이. 콜라이 균주 M15 는 유럽 특허원 공보 제 316 695 호에 개시되어 있다.
[플라스미드 제작]
일반적으로, 플라스미드 pDS56/RBSII, -1 및 -2 는 조절 가능한 프로모터/작동인자 요소 N250PSN250P29 및 각각 라이보좀 결합 부위 RBSII, RBSII(-1) 및 RBSII(-2)를 함유한다. 이들 라이보좀 결합 부위는 이. 콜라이 파아지 T5(유럽 특허원 공보 제 207 459 호)의 프로모터 PG25 의 라이보좀 결합 부위로부터 유도하였으며 DNA 합성에 의해 수득하였다.
높은 발현 효율로 인해, 전술한 플라스미드는 프로모터/작동인자 요소가 작동인자에 대한 lac 억제제의 결합에 의해 억제되는 경우 이. 콜라이 세포에서만 유지될 수 있다. lac 억제제는 lacI 유전자에서 암호화된다. N250PSN250P29 는 충분한 수의 억제제 분자가 세포에 존재할 경우에만 효과적으로 억제될 수 있다. 그러므로, 억제제 유전자의 발현을 증가시키는 프로모터 돌연변이체를 함유하는 laCIq대립유전자를 사용하였다. 상기 lacIq대립유전자는 하기에 기술하는 바와같이 플라스미드 pDMI.1 상에 존재한다.
pDMI.1 플라스미드는 lacI 유전자 이외에, 세균에 카나마이신 내성을 부여하고 선택 마커로 사용되는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 갖는다. pDMI.1 은 pDS56/RBSII, -1 및 -2 플라스미드와 양립가능하다. 발현 벡터 pDS56/RBSII, -1 및 -2 로 형질전환된 이. 콜라이 세포는 발현 벡터가 세포내에서 안정하게 유지되도록 하기 위해 pDMI.1 을 함유해야 한다.
[플라스미드 pDS56/RBSII]
XbaI 와 XhoI 에 대한 제한 절단 부위사이에 위치하고 복제 영역 및 베타-락타마제(세포에 암피실린 내성을 부여함)에 대한 유전자를 함유하는 pDS56/RBSII의 일부(제 4도 및 제 5도)는 원래 플라스미드 pBR322 로부터 유도하였다[Bolivar et al., Gene 2 : 95-113(1977); Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol, 43 : 77-90(1979)]. 그러나, 베타-락타마제에 대한 유전자는 제한 효소 HincII 및 PstI에 대한 절단 부위를 제거하여 변형 시킨다. 상기 DNA 서열의 변화는 베타-락타마제의 아미노산 서열에 어떤 영향도 미치지 않는다. 플라스미드의 나머지 부분은 조절가능한 프로모터/작동인자 요소 N250PS0P29를 가지며, 그 뒤로 EcoRI/BamHI 단편의 일부인 라이보좀 결합 부위 RBSII, 제한 효소 SalI, PstI 및 HindIII에 대한 절단부위, 이. 콜라이 파아지 람다[Schwarz et al., Nature 272 : 410-414(1978)]의 터미네이터, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제의 프로모터-비함유 유전자 [Marcoli et al, FEBS Letters, 110 : 11-14(1980)] 및 이. 콜라이 rrnB 오페론의 터미네이터 T1[Brosius et al., J. Mol. Biol 148 : 107-127(1981)]을 갖는다.
[플라스미드 pDS56/RBSII(-1)]
플라스미드 pDS56/RBSII(-1)(제 6 도 및 제 7 도)는 라이보좀 결합 부위 RBSII(-1)를 함유함을 제외하고 플라스미드 pDS56/RBSII 에 유사하다.
[플라스미드 pDS56/RBSII(-2)
플라스미드 pDS56/RBSII(-2)(제 8 도 및 제 9 도)는 라이보좀 결합부위 RBSII(-2)를 함유함을 제외하고 플라스미드 pDS56/RBSII 와 유사하다.
이들 3개 플라스미드간의 차이는 모든 3개의 가능한 판독 프레임으로부터 단백질 발현을 유발하는 ATG 출발 코돈을 따라 1개의 뉴클레오티드만큼 다른 것이다.
[플라스미드 pDMI.1]
플라스미드 pDMI.1 (제 10 도 및 제 11 도)는 이. 콜라이 세포에 카나마이신 내성을 부여하는, 트랜스포손 Tn5[Beck et a1., Gene 19 : 327-336(1982)]으로부터의 네오마이신 포스포트랜스퍼라제에 대한 유전자, 및 lac 억제제를 암호화하는, 프로모터 돌연 변이 Iq[Calos, Nature 274 : 762-765(1978)]를 갖는 lacI 유전자 [Farabough, Nature 274 : 765-769(1978)]를 갖는다. 또한, 플라스미드 pDMI.1 은 복제 및 딸 세포로의 안정한 전달에 필요한 모든 정보를 함유하는 플라스미드 pACYCl84[Chang and Cohen, J. Bacteriol. 134 : 1141-1156(1978)]의 영역을 함유한다.
전술한 플라스미드 이외에, 임의의 이. 콜라이 발현 시스템도 본 실험에 유용한 것으로 고려함을 알아야 한다.
세균 형질전환체를 37℃ 에서 LB 배지(마니아티스 등의 상기 문헌 68 페이지)에서 배양하고 배지에 1mM IPTG 를 가하여 단백질 발현을 유도하였다. 1시간동안 배양한 후에, 1㎖의 샘플을 취하여 원심분리에 의해 샘플중의 세포를 수거하였다.
세포 펠릿을 크라움등의 상기 문헌에 기술된 바와같이 처리하고, 용해물을 SDS PAGE 시켰다. 전기영동시킨 후에, 겔중의 단백질을 코마씨(Coomassie) 브릴리언트 블루로 염색하거나 또는 전술한 바와같이 토끼 항-메로조이트 혈청을 사용하여 웨스턴 블롯 분석[Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 76 : 4350(1979); Burnetti, Anal. Biochem. 112 : 195 (1981)]을 위해 니트로셀룰로즈 막으로 이동시켰다.
상기 분석으로부터 1.2kb cDNA 분자가 SDS-PAGE 로 측정할 때 약 33 kDa 의 겉보기 분자량에 따라 이동하는 단백질을 모든 3개의 판독 프레임에서 하나의 배향으로 암호화하고 토끼 항-메로조이트 혈청으로부터 취한 항체와 반응함을 알 수 있다.
[DNA 서열 분석]
일반적으로, 밤새 배양한 포화된 배양액 1㎖ 로 부터 플라스미드 DNA 를 소규모로 번보임(Birnboim)등의 문헌[Nucleic Acids Research 7 : 1513(1979)]의 방법을 사용하여 단리하였다. 상기 방법에 의해 분석용의 세균 콜로니로부터 소량의 DNA 가 단리된다. 염화 세슘 구배 원심분리(마니아티스 등의 상기 문헌 93 페이지)와 함께 표준 프로토콜에 따라 1ℓ 배양액을 사용하여 보다 대량의 플라스미드 DNA 를 제조하였다.
람다 5-7 로부터 1.2 kb EcoRI cDNA 삽입체의 DNA 서열을 다음과 같이 측정하였다. 삽입체를 EcoRI 로 절단하고, 겔 전기영동으로 정제한 후, 크라울등외 문헌 [Gene 38 : 31(1985)]에 개시된 EcoRI 절단된 pEV-vrf 플라스미드에 연결시켰다. 상기 플라스미드는 pEV/5-7 로 칭하며, 하이브리드형성 분석(하기에 기술함)을 위해 1.2 kb cDNA 삽입체를 증시시키는데 및 자거스키(Zagursky)등의 문헌 [Gene Anal. Tech. 2 : 89(1983)]의 방법에 의한 예비 DNA 서열 분석에 사용하였다.
완전 DNA 서열을 결정하기 위해, pEV/5-7 로부터의 1.2 kb cDNA 삽입체를 바이오-래드(BIO-RAD)TMM13 클로닝 키트 및 시쿼나제(SEQUENASE)TM서열화 키트를 이용하여 M13 mp19 단일가닥 파아지 벡터로 더 서브클로닝하였다. 시쿼나제 TM 키트(미합중국 오하이오 클리브랜드 소재의 유나이티트 스테이츠 바이오 케미칼 코포레이션(United States Biochemical Corp.))로 권장된 프로토콜에 따라 세인저(Sanger) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 : 5463(1977)]의 디데옥시 쇄 종결 방법에 의해 서열을 결정하였다.
5' 및 3' 비번역 영역을 포함하는 pEV/5-7 로부터 1.2 kb cDNA 의 완전 뉴클레오티드 서열을 제 1 도에 나타내었다.
cDNA 서열로부터 제 1 도에 나타낸 바와같은 315 개의 아미노산 잔기를 암호화하는 68 번 위치의 ATG 로부터 1013 번 위지의 TGA 정지 코돈까지 결쳐있는 개방된 판독 프레임을 예상할 수 있다.
상기 단백질에 대한 33, 375 달톤의 이론상 크기는 항원-선택성 시약을 사용하여 메로조이트 mRNA(제 2 도, 패널 C, a 레인)의 시험관내 번역으로부터 수득된 면역침전된 생성물 및 전술한 이. 콜라이 발현 벡터중의 cDNA 로부터 발현된 단백질과 상호관계가 있다.
람다 5-7 cDNA 삽입체(제 1 도)에 의해 암호화된 단백질이 추정 아미노산 서열을 분석하면, 서열 예상에 사용된 연산에 따라 첫번째 20 또는 75 내지 95 개 아미노-말단 아미노산 잔기가 신호 펩타이드 작용의 가능성을 암시하는 전체적인 소수성 특성을 가짐을 알 수 있다. 그러므로, 신호 펩타이드 서열은 약 첫번째 100 개까지의 아미노-말단 아미노산 잔기로 이루어질 수 있다. 사실상, 메로조이트 mRNA 의 시험관내 번역후에 수득되고 면역첨전에 의해 정제된 폴리펩타이드가 그의 전구체 형태로는 약 35 kDa 및 그의 성숙한 형태로는 약 23 kDa 의 분자량을 나타냄이 밝혀졌다. 전술했듯이, 전구체 형태의 크기는 단백질의 이론상의 크기와 잘 일치한다. 그러나, 성숙한 형태는 또한 전구체 분자의 내부 또는 N-말단 단편을 나타낼 수도 있다. 정확한 아미노 말단은 공지된 방법으로 결정할 수 있다.
언급한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩다이드의 많은 영역에 대해, 제이. 피. 호프(J.P.Hopp) 및 케이. 알. 우즈(K. R. Woods)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 : 3824-3828(1981)]에 따른 친수성 기준과 피. 와이. 쵸우(P.Y. Chou) 및 지. 디. 페스만(G. D. Fasman) [Advances in Enzymology 47 : 45-148(1987)]에 따른 2차 구조 기준의 조합을 기준으로 에피토프를 지칭할 수 있다.
하기 영역들은 항체들에 대해 예상되는 에피토프를 함유하다 :
또한, T-세포 에피토프는 베르조프스키 (Berzofsky)의 양친매성 기준 [Good et al. Science 235, 1059-1062 (1987)]에 따른 이론적 근거로부터 유도될 수 있다. T-세포 에피토프는 항원으로부터 처리되어 [H. M. Grey and R. Chestnut, Immunol. Today 6 : 101-106(1985)], 세포내로 전달되고 [schwartz A. L., Ann. Rev. Immun. 8 : 195-229(1990)], T-세포 수용체 복합체에 의해 인식된다. 일부의 연산은 주로 부류 II 의 항원성 부위를 동정하기 위해 고안되었지만, 부류 I 의 펩타이드 상호작용과의 유사성으로 인해 이들 연산은 또한 세포독성 T 림프구에 대한 표적 펩타이드의 동정에도 유용한 것으로 보인다[Feller and de la Cruz, Nature 349 : 720-721(1991)].
또한, 가능한 글리코실화 부위는 20 번 위치(D20)의 아미노산 아스파라긴에 위치한다. 탄수화물 그룹은 구조적 안정성, 프로테아제에 대한 내성, 충전 및 수결합 용량과 같은 중요한 물리적 성질을 부여하는 것으로 알려져 있다. 그러나, D20은 리더 서열의 일부이므로 성숙한 단백질에는 존재하지 않을 수도 있음을 알아야 한다. 생물학적 견지에서 탄수화물 그룹의 중요한 역할에 대한 개관은 제이. 씨. 폴슨(J. C. Paulson)의 문헌 [TIBS 14 : 272-276(1989)]을 참조하시오.
[하이브리드형성 분석]
다음과 같이 트립신 및 담즙으로 처리하고 PBS 로 세척한 후에 탈낭되고 포자형성된 낭포체로부터 DNA 를 단리 하였다.
기생충 물질(약 1 x 109낭포체)을 20㎖의 0.5M EDTA(pH 8.0), 0.5% 사르코실(미합중국 미저리 세인트 루이스 소재의 시그마(sigma)에 현탁시키고, 50℃ 에서 0.1㎎/㎖ 로 프로테이나제 K(독일연방공화국, 보에링거-만하임(Boehringer-Mannheim))로 2 시간동안, 및 37℃ 에서 RNase(10㎎/㎖)로 1 시간, 및 다시 50℃ 에서 프로테이나제 K 로 1 시간동안 절단시켰다. 20mM 트리스 HCl(pH 7.5), 1mM EDTA(TE)로 포화된 페놀로 2 회 추출시키고 페놀/클로로포름(1 : 1)으로 1 회 추출시켜 단백질을 제거하였다. 수성상을 TE 로 강하게 투석시키고 에탄올 침전에 의해 농축시켰다. 1 x 106낭포체 당 0.4㎎ DNA 의 전형적인 수율이 수득되었다.
기생충 DNA 를 제조업자의 프로토콜에 따라 다양한 제한 엔도뉴클레아제로 절단하고, 생성된 DNA 단편을 로에닝(Loening) 완충제(ℓ 당 4.7g NaH2PO4, 4.36g트리스 염기, 0.372g Na2EDTA, pH 7.6)중의 0.8% 아가로즈에서 40V 로 2.5 시간 동안 전기영동시켜 분석하였다. 겔을 0.25M HCl 로 30 분간 처리하고, 0.4M NaOH 중에서 밤새 제타-프로브(Zeta-Probe) 막(바이오-래드TH)으로 이동시켰다. 필터를 2 x SSC(pH 6.8)로 중화시키고 80℃ 에서 진공하에 1 시간동안 베이킹하였다.
필터를 65℃ 에서, 7% SDS, 1% BSA(보에링거, 분획물 V), 0.5M NaHPO4완충제(pH 7.2)중에서 3시간동안 예비하이브리드 형성시켰다. 전술한 바와같이, pEV/5-7 플라스미드를 EcoRI 로 절단한 후, 5-7 유전자 EcoRI 삽입체를 겔 단리하고, 32P-표지화된 데옥시뉴클레오티드의 존재하에서 클레나우 단편으로 임의-초기 항원자극시켜 표지화하였다. 표지화된 삽입체를 스핀-컬럼(Spin-Columns)(바이오-래드TH)에서 비삽입 뉴클레오티드로 부터 분리하고, 변성시킨 후 하이브리드 형성 용액에 가하였다. 65℃ 에서 12 시간동안 배양한 후, 필터를 2 x SSC/0.1% SDS 로 3회 및 65℃ 에서 0.1 x SSC/0.1% SDS 로 2 회 세척하였다. 프로브에 하이브리드형성하는 게놈성 DNA 단편을 자동 방사선 사진술로 검출하였다. 본 발명에서는 pEV/5-7 플라스미드를 사용하였으나, 메로조이트 5-7 유전자의 1.2 kb cDNA 삽입체를 함유하는 임의의 등가 벡터도 또한 허용된 방식으로 수행됨을 알 것이다.
상기 분석 결과는 제 3 도에 나타내었으며, 여기서 PvuII(1), HincII(2), PstI(3), SphI(4) 또는 SacI(5) 로 절단된 결과를 볼 수 있다.
PvuII 및 SacI 로 절단한 후 6.5 및 3.6 kb 의 게놈 DNA 단편이 각각 1 레인 및 5 레인에서 검출되었다. cDNA 클론중에 이들 효소에 대한 부위가 존재하지 않으므로, 에이메리아 유전자의 최대 크기는 3.6 kb 인 것으로 평가될 수 있다.
PstI(3 레인)으로 절단한 후 3개의 단편을 검출하였다. 2개의 PstI 부위가 cDNA 서열로부터 예상되며, 상기 서열은 306 bp 의 내부 단편(상기 서던 블롯에서 검출하기에는 너무 작다) 및 2개의 연결 단편을 생성한다. 제 3 의 거대한 PstI 단편의 출현은 내부 PstI 부위사이에 위치한 인트론의 존재에 의해 가장 잘 설명된다.
cDNA 에서 또한 2회 절단하는 SphI(4 레인)에 의해 생성된 단편의 패턴은 어떠한 뚜렷한 정보도 제공하지 않는다. cDNA 서열로부터 예상된 604 bp 의 내부 SphI 소 단편은 상기 겔에서 검출할 수 없었다.
게놈 DNA 를 EcoRI 로 절단시켜 크기에 있어 cDNA 단편에 상응하는 1.2 kb 게놈 단편을 생성시켰다. HincII 및 EcoRI 으로 2중 절단하여 0.9kb 단편이 생성되었다(도시하지 않음).
메로조이트로부터 단리된 폴리(A)-함유 mRNA 외 노던(Northern) 블롯 분석[Alwine et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA 74 : 5350(1977)]에서, 람다 5-7 유전자의 1.2 kb cDNA 단편을 약 1.3 kb 길이의 단일 mRNA 중에 하이브리드형성시켰다. 크기 관계로부터, 전술한 1-5 단리물로부터 측정된 5' 확장과 함께 5-7 클론이 제일 끝의 5' 뉴클레오티드는 제외하고 cDNA 의 전-길이 서열을 나타냄이 명백하다.
[실시예 2]
이. 테넬라 메로조이트 항원 5-7 로 병아리를 면역 시키는 보다 효과적인 방법을 제공하기 위해, 전술한 1.2 kb cDNA 를 백시니아 바이러스내로 클로닝시켰다. 상기 방법으로 수득된 재조합 백시니아 바이러스를 병아리를 종두화시키기 위한 서브유니트 콕시다아증 백신에 사용하였다.
[벡터 제작]
제조된 재조합 백시니아 바이러스(rVV)의 모든 형태는 맥킷트(Macket)등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 : 7415(1982)]에 기술된 바와같이 바이러스 티미딘 키나제(TK) 유전자 좌내로의 상등성 재조합화를 기초로 하였다. TK 유전자좌는 백시니아 바이러스(VV) HindIII J 단편[Hruby et al., J. Virol.43 : 403(1982)]으로 유전자 지도를 작성하였으며, 상기 단편의 일부를 서염화하였다[Weir et al., J. Virol. 46 : 530(1983)].
재조합용 벡터 pUC8-TK-7.5K 의 제작은 기본적으로 유럽 특허원 공보 제 344 808 호에 개시되어 있다. 간략하게, 상기 벡터는 VV 7.5K 프로모터에 의해 파괴되는 백시니아 바이러스 TK 유전자를 갖는 pUC8 플라스미드 주쇄로 이루어진다[Venkatesan et al., Cell 25 : 805(1981)]. 전사 방향으로 프로모터 아레쪽으로, 다중 클로닝 부위를 제작하여 발현될 유전자를 도입시켰다. 제 12 도는 pUC8-TK-7.5K 플라스미드의 개략적인 도면이다.
본 발명의 제작물을 일반화시키기 위해 메로조이트 5-7 유전자를 암호화하는 EcoRI 단편을 제 12 도에 나타낸 기본 벡터에 함유된 폴리링커의 EcoRI 부위내로 클로닝시켰다. 정확한 배향으로 단편을 함유하는 제작물을 하기 기술하는 바와 같이 증식시키고 변형시켜 메로조이트 5-7 유전자의 천연 출발 코돈의 97개 뉴클레오티드 위쪽에 위치한 프레임내(in-frame)출발 코돈을 결실시켰다. 상기 목적으로, 플라스미드를 제한 효소 SmaI 및 BglII 로 절단하였다. BglII 부위를 4개의 데옥시리보뉴클레오티드의 존제하에 클레나우 효소로 말단을 무디게 한 후에, 플라스미드를 다시연결하고, 예상한 결실 부위를 갖는 제작물 pR3(제 13 도)를 배양하여 백시니아 바이러스내로 제조합하는테 사용하였다. 제 14 도는 상기 재조합 플라스미드의 완전 서열을 나타낸다.
더우기, 메로조이트 5-7 유전자를 또한 DraI-HindIII 말라리아 항원 리더를 함유하는 재조합용 벡터내로 도입시켰다. 상기 벡터는 유럽 특허원 공보 제 344 808 호에 개시되어 있으며, 벡터 pUC8-TK-7.5K 를 기본으로 하나, 또한 7.5K 프로모터의 아래쪽으로 190kDa 말라리아 항원 리더의 서열을 갖는다. 상기 리더 서열에 인접하여 다중 클로닝 부위를 제작하여 발현될 유전자를 도입시켰다. VV 7.5K 프로모터에 의해 유도된 생성된 전사체는 N-말단에 190kDa 말라리아 항원 리더를 갖는 단백질로 번역될 것이다. 가능한 절단 부위에서 리더 서열을 생체내 처리하면 성숙한 단백질이 야기된다. 제 15도는 메로조이트 5-7 유전자를 갖는 상기 제작물 pR4의 개략적인 도면이다.
[재조합 백시니아 바이러스 제작]
8㎠ 배양 플레이트상에 평판배양된 CV1 세포를 33℃ 로 적응시켜 80 내지 90% 밀도로 증식시킨 후 백시니아 바이러스 온도 민감성 돌연변이체 ts N7[Drillien, R. and Spehner, D. Virology 131 : 385-393(1983)] 세포당 0.1 플라크 형성 유니트(pfu)로 감염시켰다. C02배양기[Kieny et al., Nature 312 : 163(1984)]에서 33℃ 의 허용된 온도에서 2시간 후에, 웨이어(Weir) 등의 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 : 1210-1214(1982)]에 개시된 바와 같이 0.25㎖ 의 인산 칼슘 DNA 침전물로 세포를 형질감염 시켰다. 인산 칼슘-DNA 침전물 혼합물은 0.8% NaCl, 0.038% KCl, 0.0134M Na2HPO4·2H2O, 0.1% 글루코즈(pH 7.0) 및 125mM CaCl2, 200mg 의 백시니아 야생 타입 DNA(WR 균주) 및 100ng 의 적절한 재조합 플라스미드 pR3 또는 pR4 로 이루어진다. 실온에서 1시간 후에 추가의 배지를 플레이트에 가한 후 5% CO2배양기에서 39.5℃ 에서 2시간동안 배양하였다. 상기 온도에서, ts N7 바이러스는 복제될 수 없으며, 그 결과 ts N7 유전자좌에서 최소한으로 제조합된 바이러스를 선택할 수 있게된다.
39.5℃ 에서 배양한지 2일 후에, 스크레이핑하여 세포를 수거하고, 초음파 처리에 의해 현탁액을 더 파괴시켰다. 이어서, 상기 균질액을 사용하여 30㎍/㎖ 의 브로모데옥시우리딘(BUdR)의 존재하에서 인간 TK- 143 세포상에 적정시켜 TK 네가티브(TK-)바이러스를 수득하였다. 플라스크를 취하여 바이러스를 30㎍/㎖ 의 BUdR 의 존재하에서 인간 TK- 143 세포중에서 2회 더 추가로 플라크-정제하였다. 이어서, 바이러스 공급물을 BUdR 의 부재하에서 CV1 세포에 제조하였다. 재조합 백시니아 바이러스 R3.2 및 R4.1 각각을, 바이러스 DNA를 HindIII 로 절단하고 rVV DNA 패턴을 동일한 제한 효소로 절단한 야생 타입(WR) 백시니아 DNA 의 패턴과 비교하여, TK 유전자내로 삽입된 1.2kb cDNA 메로조이트 유전자의 존재에 대해 조사하였다. 재조합 공정이 일어난 경우, HindIII J DNA 단편에서의 이동은 1% 아가로즈 겔에서의 전기영동 후에 보여야 한다. 이것은 실제로 관찰된다. 상기 이동은 삽입체 크기로부터 추정된 계산치와 상호 관련된다.
[발현에 대한 시험]
재조합 바이러스에 의한 메로조이트 5-7 항원의 발현에 대해 시험하기 위해, CV1 세포를 rVV R3.2 또는 rVV R4.1 로 감염시키고 48시간 후에 수거하였다. 세포를 원심분리한 후에, 환원제로서 베타-머캅토에탄올의 존재하에 라엠리 샘플 완충제[Nature 227 : 680(1970)]에 펠릿을 용해시켰다. 5분간 비등시킨 후에, 샘플을 12.5% SDS-PAGE 석관 겔상에 부하시켰다. 전기 영동으로 분리한 후에, 4℃ 에서 트랜스블롯(Transblot) 전달 쎌(바이오래드 래버러토리즈)중에서 80V 의 일정 전압에서 블롯-완충제(25mM 트리스-HCl, 0.19M 글리신(pH 8.3) 및 20%(v/v)메탄올)중에서 니트로셀룰로즈 막(트랜스-블롯, 바이오래드)상으로 단백질을 2시간동안 블롯팅시켰다[Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 : 4350-4354(1979)].
면역-검출시, 니트로셀룰로즈를 TBS(20mM 트리스-HCl, 150mM NaCl, pH 8 로 조정)중의 5% 비지방 분유로 45분간 미리 처리하고, 실온에서 20%(v/v) 송아지 태 혈청을 함유하는 TBS 완충제중의 토끼의 항-이. 테넬라 메로조이트 혈청의 1 : 50 희석율하에 2시간동안 또는 밤새 배양하였다. 이어서, 니트로셀룰로즈를 0.1% NP40 을 함유하는 TBS 중에서 10분간 3회 세척한 후, TBS 및 5% 비지방 분유중에서 1 : 1000 의 희석율로 친화도-정제된 양의 항-토끼 IgG(H+L) 퍼옥시다제 결합제(바이오-래드)와 함께 실온에서 2시간동안 배양하였다(H+L 은 IgG 의 무거운 쇄와 가벼운 쇄를 나타낸다). 이어서, 블롯을 전술한 바와 같이 3회 세척하였다. 퍼옥시다제 결합체의 결합은 0.018% 4-클로로-1-나프톨중의 니트로셀룰로즈를 H2O 및 0.02%(v/v) H2O2중의 6% 메탄올과 반응시켜 검출하였다. 블롯을 H2O 중에서 철저히 세척하여 반웅을 중단시켰다.
토끼의 항 이. 테넬라 메로조이트 혈청은 웨스턴 블롯(토우빈 등의 상기 문헌)에서 각각 33kDa 및 23kDa 의 2개의 뚜렷한 단백질 밴드를 나타내면서 rVV R3.2 로 감염된 CV1 세포와 반응함이 밝혀졌다. 바이오-래드 예비염색된 SDS-PAGE 분자량 표준물(낮은 범위)을 기준으로 사용하였다. 야생 타입 WR 백시니아 바이러스로 감염된 CV1 세포는 토끼의 항 이. 테넬라 메로조이트 혈청과 반응하지 않았다. 33kDa 단백질의 크기는 제 2 도 패널 C, b 레인에 나타낸 바와 같은 전구체 단백질의 이론적으로 예상된 값과 상호 관계가 있다. 보다 작은 23kDa 단백질은 메로조이트의 표면에서 또한 볼 수 있는 전술한 전구체 단백질의 처리된 변형체일 수 있다(제 2 도 패널 A 및 B, b 레인 참조). rVV R4.1 로 감염된 CV1 세포의 경우에도 동일한 결과가 관찰되었다.
또한, 웨스턴 블롯 분석에 의해, 포자형성된 이. 테넬라 낭포체로 감염된 닭으로부터 얻어진 면역 혈청이 각각 백시니아 바이러스 재조합체 R3.2 및 R4.1 로 감염된 CV1 세포에서 발현된 메로조이트 5-7 단백질(33kDa 및 23kDa)을 인식함을 알 수 있다.
[바이러스 제조]
WR 균주 바이러스는 거의 모든 세포 타입에서 증식될 수 있으며[Drillien et al., J. Viroloy 28 : 843(1978)], 그의 증식은 플라크 형성을 통해 직접 관찰할 수 있다. 본 발명은 대부분의 경우에서 대량의 바이러스 공급물을 제조하는데 CV1 세포를 사용하였다.
감염시, 175㎠ 배양 플라스크(예를들면 , 팔콘(Falcon) 3028)에서 배양되는 80 내지 90% 밀도의 CV1 세포로부터 세포 배양 배지를 제거하고, 실온에서 바이러스(0.1pfu/㎖ 0.01㎖/㎠)를 함유하는 PBS 용액중에서 세포를 1시간동안 배양하였다. 이어서, 새로운 세포 배양 배지를 가하고(0.2㎖/㎠), 약 80% 의 세포가 용해될 때까지 2 내지 3일간 37℃ 에서 플라스크를 배양하였다. 생성된 공급 용액을 -30℃ 에서 원래의 배양 플라스크에서 세포 및 배지와 함께 직접 방치한 후 바이러스를 정제하였다.
하기 정제 단게를 사용하여 숙주 세포 특이적 성분이 없는 바이러스 제제를 수득하였다. -30℃ 에서 방치한 감염된 세포 배양액을 해동시키고, 남은 세포를 진탕 또는 스크레이핑에 의해 플라스크의 표면으로부터 제거하였다. 세포와 바이러스를 배지로부터 원심분리시켰다(소르발(Sorvall) 원심분리기 GSA 로터, 5000rpm 으로 1시간, 10℃). 바이러스 입자를 갖는 세포 펠릿을 PBS(펠릿 부피의 10 내지 20 배)에 재현탁시키고 상기와 같이 원심분리하였다. 이어서, 상기 펠릿을 10배 부피의 RSB 완충제(pH 8.0 으로 맞춘 10mM 트리스-HCl, 10mM KCl, 1mM MgCl2)에 재현탁시켰다.
남은 손상되지 않은 세포를 용해시키고 세포막으로부터 바이러스를 제거하기 위해, 상기 현탁액을 (실온에서 초음파발생 장치, 예를들면 4mm 프로브를 갖는 랩소닉(Labsonic) 1510 에서 60 와트로 10초간 2회) 초음파 처리하였다. 혼합물을 소르발 GSA 로터에서 3000rpm 으로 10℃ 에서 3분간 원심분리하였다. 이렇게 하여 세포 핵 및 대량의 세포 조직편이 제거된 바이러스 현탁액을 제조하였다. 상등액을 조심스립게 제거하고, 펠릿을 RSB 완충제에 재현탁시킨 후, 상기와 같이 초음파 처리하고 원심분리하였다.
2번째 상등액을 첫번째 상등액과 합하여 10㎖ 의 35% 슈크로즈 쿠선(10mM 트리스-HCl(pH 8.0)중의)상에 덮은 후 10℃, 벡크만(Beckman) SW27 로터에서 14000rpm 으로 90분간 원심분리시켰다. 상등액을 경사분리시키고 바이러스 입자의 펠릿을 10㎖ 의 10mM 트리스-HCl(pH 8.0)에 재현탁시킨 후, 초음파처리하여(전술한 바와 같이 실온에서 10초동안 2회) 혼합물을 균질화시키고, 더 정제하기 위해 단계 구배상으로 부하시켰다.
단계 구배는 20%, 25%, 30%, 35% 및 40% 농도의 10mM 트리스-HCl(pH 8.0)중의 5㎖ 분취량의 슈크로즈로 이루어졌다. 상기 구배를 10℃ 에서 14000rpm 으로 벡크만 SW27 로터에서 35분간 원심분리시켰다. 바이러스 입자를 함유하는 여러개의 밴드를 30% 내지 40% 슈크로즈 영역에서 육안으로 볼 수 있었다. 상기 영역의 구배를 제거하여 PBS 로 희석하고, 바이러스 입자를 침강시켰다(10℃ 에서 14000rpm 으로 벡크만 SW27 로터에서 90분간). 바이러스 입자를 거의 단독으로 함유하는 펠릿을 바이러스 농도가 평균 0.5 내지 1 x 1010pfu/㎖ 이 되도록 PBS 에 재현탁시켰다.
바이러스 농도 및 바이러스 공급물의 순도를 측정하기 위해, 2가지 방법을 사용하였다. 260nm의 파장에서 분광 광도계로 공급물 용액의 흡광도(OD/260nm)(여기서, 1OD/260 은 ㎖ 당 약 1.2 x 1010입자와 같다)를 측정하여 바이러스 입자의 절대 농도를 수득하는 것이 편리하다[Joklik, Virology 18 : 9(1962)]. 60개 바이러스 입자중 단지 1개만이 세포를 감염시킬 수 있다는 가정하에, 바이러스를 세포상에 적정하여(플라크 분석법) 바이러스 농도를 또한 수득하였다.
배양된 세포상에서 바이러스 농도를 적정하기 위해, 병아리 배자 섬유아세포(CEF) 세포를 8㎠ 배양 플레이트(팔콘 3001)상에서 세포 배양배지에서 중시시켰다. 세포가 80% 내지 90% 의 밀도에 이른 후에, 배지를 제거하고 PBS 중의 희석된 바이러스 용액 0.2㎖ 로 교체한 후 실온에서 1시간동안 방치하였다. 바이러스 공급물 용액을 10배 단계로 희석하였다.
1% 아가로즈를 포함하는 반-고형 세포 배양 배지 2㎖ 를 각 플레이트에 가하고, 이어서 플레이트를 37℃ 에서 CO2배양기중에 16내지 24시간동안 방지하였다. 연속하여, 0.2% 중성 레드를 함유하는 반-고형 세포 배양 배지 2㎖ 를 생 세포를 염색하기 위해 생 세포상에 덮고 플레이트를 16 내지 24시간 동안 더 배양하였다. 이어서, 현미경으로 무색 플라크를 계수하였다.
[실시예 3]
[병아리 면역화]
유전자 메로조이트 5-7 을 갖는 백시니아 바이러스 벡터 rVV-R3.2 가 이. 테넬라의 병원성 균주의 포자형성된 낭포체에 의한 감염으로부터 병아리를 보호할 수 있는지를 측정하기 위해, 하기의 종두화 과정을 수행하였다.
벨프(Belp, 스위스연방)의 부화장 이. 유에쓰리치(E. Wuethrich)에 의해 공급된, 알을 낳는 품종인 와렌(WARREN)의 수평아리를 철망 바닥의 우리에서 주로 옥수수, 및 대두로 이루어지는 시판하는 브로일러(broiler) 타입의 사육용 식이를 공급하여 유지시켰다. 17일째에, 병아리를 100㎕ PBS 중의 재조합 벡시니아 바이러스 R3.2, 3 x 108pfu 로 접종하는데, 이때 50㎕ 는 날개 깃에 피하 주입하고 또다른 50㎕ 는 가슴에 근육내 주입하였다. 각각 1주일 간격으로 상기 방법을 2회 반복하나, 한 처리 그룹에 대해서는 들판에서 전염성 콕시디아증에 병아리가 자연스럽게 노출되도록 자극하기 위해, 마지막 바이러스 주입 대신에 이. 테넬라의 유독성 균주(예를들면, 균주 T7-776/21)의 5000개 포자형성 낭포체로 경구 접종하였다. 마지막 면역화 1주일 후에, 분석 목적으로 모든 병아리를 출혈시키고 1주일이 더 지난후에(45일째에) 병아리를 이. 테넬라(예를들면, 균주 T7-776/21)의 50000개 포자형성된 낭포체로 감염시켰다. 기생충이 7일간의 그의 발생 주기를 마무리하도록 하고 52일째에 병아리를 출혈시켜 죽이고 해부하였다. 감염된 맹장을 떼어내어, 기생충에 의한 병변을 평가하고, 전체 조직을 균질화시켜 그의 낭포체 함량을 측정하였다. 병아리의 상태(매일의 체중 증가량 및 사료 전환율)를 기록하였다.
[예방 실험]
표 1 의 데이타로부터 재조합 백시니아 바이러스 R3.2 로 종두화시키면 수회 콕시디아증 감염에 대해 상당한 보호 효과를 가짐을 알 수 있다. 병변은 18% 만큼 감소하였으며 맹장중의 낭포체 함량은 감염된 대조용에 비해 35% 만큼 감소되었다. 경제적으로 가장 중요한 변수인 피검체의 상태에 있어서는 일일 체중 증가량은 62% 만큼 개선되고 사료 전환율은 56% 만큼 개선되었다. 그러나, 마지막 바이러스 주입 대신에 경미한 콕시디아증올 감염시킨 경우, 콕시디아증에 대한 병아리 예방 효과는 거의 완전하였다. 이들 병아리의 상태는 비-감염된 대조용과 같았으며, 병변 뿐 아니라 맹장의 낭포체 함량도 낮았다. 이. 테넬라로 단일 접종한 경우에는 상기 고도의 예방효과를 부여함이 입증되지 못하였으므로, 바이러스 기본 종두화는 병아리의 강하게 초기항원자극된 면역 시스템을 가져 잇따른 경미한 콕시디아증 감염이 추가항원자극제 효과를 나타내어, 콕시디아증에 대해 효과적인 면역 예방을 유도하는 것으로 결론지어졌다.
[닭의 체액 상태]
간접적인 ELISA 및 하기 방법을 사용하는 웨스턴 블롯으로 닭의 체액 상태를 분석하였다.
[표 1]
50, 000 개 이. 테넬라 낭포체로 감염후에 재조합 백시니아 바이러스 rVV-R3.2 로 종두화된 병아리의 상태 및 기생충학적 변수
*) V = 병아리당 100㎕중의 재조합 바이러스 3 x 108PFU를 주입
C = 병아리당 5000 개의 이. 테넬라 낭포체로 접종
닭 맹장 샘플에 앞서 추가로 1 회의 배양 단계를 수행함을 제외하고 웨스턴 블롯 분석을 전술한 바와 같이 행하였다. 상기 단계는 블롯팅된 니트로셀룰로즈를 과면역 토끼 항 백시니아 혈청과 함께 배양(실온에서 2 시간, 1 : 50 희석율)시켜 모든 백시니아 특이적 단백질을 커버함을 포함한다.
간접적 ELISA 에 있어, 시험관내 1 차 닭 신장 세포 배양액으로부터 얻은 이. 테넬라의 3 대 메로조이트를 사용하였다. 미세적정 풀레이트를 탄산-중탄산 나트륨 완충제(pH 9.6) 100㎖ 에 용해된 웰당 3000 메로조이트로 피복시키고 4℃ 에서 밤새 배양하였다. 플레이트를 탈이온수로 3 회 세척하고 200㎖ 의 차단 완충제(HCl 로 pH 6.5 로 조성한 0.1M Na2HPO41% BSA, 0.5g/ℓ 에틸머큐리티오살리실산 나트륨)를 재공급하였다. 4℃ 에서 밤새 차단시켰다. 동물당 2 개의 혈청 샘플을 시험하였다. 하나의 샘플을 마지막 면역화 1 주일 후에 취하고 동물당 죽이기 직전에 2번째 샘플을 취하였다. 샘플을 1 대 50 배 희석율로 출발하여 3% 분유를 함유하는 PBS 중에서 2 배 단계로 희석시켰다. 37℃ 에서 4 시간동안 배양하였다(100㎖). 플레이트를 전술한 바와 같이 세척한 후 표지화된 결합체 양의 항-닭(H+L)을 웰당 100㎖ 가하였다(3% 분유를 함유하는 PBS 로 1 : 2000 희석율). 37℃ 에서 2 시간동안 배양하였다. 항체-항원 복합체를 100㎖ 의 TMB-기질을 가하여 가시화시켰다. TMB-기질은 1 부의 TMB(0.24g 의 테트라메틸 벤지딘을 5㎖ 의 아세톤에 용해시키고 메탄올로 50㎖ 로 만듬) 및 20 부의 기질(0.2 M 시트르산(pB 4.0), 275㎖/ℓ 의 30% H2O2)로 이루어졌다.
반응을 0.5M H2SO4로 중단시킨 후 플레이트를 450nm 에서 ELISA 판독기(티터텍 멀티스캔(Titertek Multiskan) MCC/340, 플로우 래버러토리즈(Flow Laboratories))로 판독하였다.
닭은 재조합 바이러스 R3.2 및 R4.1 로 종두화한 후에, 저 용량의 포자형성된 낭포제로 면역화된 대조용 동물(평균 적정량＆gt;1 : 1600)에 비해 콕시디아증 메로조이트에 대한 단지 약한 체액성 항체 반응을 관찰하였다. 이로부터 종두화된 닭의 양성 예방 및 상태 데이타(표 1 및 전술한 결과 참조)가 세포 매개 작동물질 기작으로부터 야기될 수 있음을 알 수 있다.
메로조이트 5-7 항원에 대한 특이적 항체의 존재를 확인하기 위해, ELISA 에서 최고 항체 적정량을 갖는 혈액 샘플을, 항원 공급원으로서 rVV 3.2 로 감염된 CV 1 세포를 사용하여 웨스턴 블롯상에서 시험하였다. 모든 혈청은 각각 33kDa 및 23kDa 의 2 개 단백질을 인식하였으며 이로부터 면역화가 성공적으로 이루어졌음을 알 수 있다.
당해 분야에 숙면된 자에게 명백하듯이, 본 발명의 진의 및 범주를 벗어나지 않고 본 발명을 수정하고 변형할 수 있다. 본원에 개시된 특정 태양은 단지 예로서만 나타낸 것이며, 본 발명은 첨부된 특허청구범위에 의해서만 제한받을 것이다.
본 발명은 또한 다음의 것을 포함한다 :
·콕시다아증으로부터 대상 개체를 보호할 수 있는 백신을 제조하기 위한 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 용도.
·본 발명의 방법에 있어서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 단편의 효과적인 투여량이 종두화된 대상 개체의 체중 kg 당 약 5 내지 약 50㎍, 바람직하게는 25 내지 50㎍/㎏ 범위인 방법.
·본 발명의 방법에 있어서, 재조합 바이러스가 재조합 계두 바이러스와 같은 재조합 폭스 바이러스인 방법.
·본 발명의 방법에 있어서, 단일 또는 중복 추가항원 자극 종두를 투여하는 추가 단계를 포함하는 방법.
·본 발명에 따른 폴리펩타이드 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 백신 효과량을 난에 투여함을 포함하는, 콕시다아증으로부터 대상 개체를 보호하는 방법에 있어서, 대상개체에게 단일 또는 중복 추가항원 자극 종두를 투여하는 추가 단계를 포함하는 방법.
·상기 방법에 있어서, 대상 개체에 후속의 경미한 콕시다아증 감염을 유도하는 추가 단계를 포함하는 방법.
·상기 방법에 있어서, 대상 개체가 난의 상태인 방법.
·DNA의 발현을 유도할 수 있는, 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA를 포함하는 재조합 바이러스 및 생리학적으로 허용되는 담체를 함유하는 백신 효과량을 난에 투여함을 포함하는, 콕시다아증으로부터 대상 개체를 보호하는 방법에 있어서, 대상개체에게 단일 또는 중복 추가항원자극 종두를 투여하는 추가 단계를 포함하는 방법.
·상기 방법에 있어서, 대상 개체에 후속의 경미한 콕시다아증 감염을 유도하는 추가 단계를 포함하는 방법.
·상기 방법에 있어서, 대상 개체가 난의 상태인 방법.
[서열 목록]
(1) 일반정보 :
(i) 출원인 :
(A) 성명 : 에프. 호프만-라 롯슈 에이지
(B) 거리 : 그렌짜헤르스트라세 124
(C) 도시 : 바즐
(D) 주 : BS
(E) 국가 : 스위스연방
(F) 우편번호(ZIP) : CH-4002
(G) 전화 : 061-688 24 03
(H) 팩스 : 061-688 13 95
(I) 텔렉스 : 962292/965542 hlrchh
(ii) 발명의 명칭 : 콕시디아증 백신
(iii) 서열 수 : 15
(iv) 컴퓨터 판독가능 형태
(A) 매체 타임 : 플로피 디스크
(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환성
(C) 작동 시스템 : PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어 : Patent In release #1.0, 버전#1.25 (EPO )
(v) 현행 출원 데이타 :
출원번호 :
(vi) 선행 출원 데이타
(A) 출원번호 : US 07/729, 099
(B) 출원일 : 1991. 7. 12
(2) 서열 식별 번호 : 1 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 315개 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 위상학 : 알려지지 않음
(ii) 분자 타입 : 단백질
(iii) 가설 : 없음
(iv) 원래의 공급원 :
(A) 유기체 : 에이메리아 테넬라(Eimeria tenella)
(D) 발생 상태 : 메로조이트
(xi) 서열 개시 : 서열 식별 번호 : 1
(2) 서열 식별 번호 : 2 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 948개 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 위상학 : 선형
(ii) 분자 타입 : cDNA
(iii) 가설 : 없음
(iv) 안티-쎈스 : 없음
(vi) 원래의 공급원 :
(A) 유기체 : 에이메리아 테넬라
(xi) 서열 개시 : 서열 식별 번호 : 2
(2) 서열 식별 번호 : 3 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 8개 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 위상학 : 선형
(ii) 분자 타입 : 펩타이드
(iii) 가설 : 있음
(v) 단편 타입 : 내부 단면
(vi) 원래의 공급원 :
(A) 유기체 : 에이메리아 테넬라
(xi) 서열 개시 : 서열 식별 번호 : 3
(2) 서열 식별 번호 : 4 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 29개 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 위상학 : 선형
(ii) 분자 타입 : 펩타이드
(iii) 가설 : 있음
(v) 단편타입 : 내부 단편
(vi) 원래의 공급원 :
(A) 유기체 : 에이메리아 테넬라
(xi) 서열 개시 : 서열 식별 번호 : 4
(2) 서열 식별 번호 : 5 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 3개 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 위상학 : 선형
(ii) 분자 타입 : 펩타이드
(iii) 가설 : 있음
(v) 단편 타입 : 내부 단편
(vi) 원래외 공급원 :
(A) 유기체 : 에이메리아 테넬라
(xi) 서열 개시 : 서열 식별 번호 : 5
(2) 서열 식별 번호 : 6 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 6개 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 위상학 : 선형
(ii) 분자 타입 : 펩타이드
(iii) 가설 : 있음
(v) 단편 타입 : 내부 단편
(vi) 원래의 공급원 :
(A) 유기체 : 에이메리아 테넬라
(xi) 서열 개시 : 서열 식별 번호 : 6
(2) 서열 식별 번호 : 7 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 8개 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 위상학 : 선형
(ii) 분자 타입 : 펩타이드
(iii) 가설 : 있음
(v) 단편 타입 : 내부 단편
(vi) 원래의 공급원 :
(A) 유기체 : 에이메리아 테넬라
(xi) 서열 개시 : 서열 식별 번호 : 7
(2) 서열 식별 번호 : 8 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 5개 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 위상학 : 선형
(ii) 분자 타입 : 펩타이드
(iii) 가설 : 있음
(v) 단편 타입 : 내부 단편
(vi) 원래의 공급원 :
(A) 유기체 : 에이메리아 테넬라
(xi) 서열 개시 : 서열 식별 번호 : 8
(2) 서열 식별 번호 : 9 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 6개 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 위상학 : 선형
(ii) 분자 타입 : 펩타이드
(iii) 가설 : 있음
(v) 단편 타입 : 내부 단편
(vi) 원래의 공급원 :
(A) 유기체 : 에이메리아 테넬라
(xi) 서열 개시 : 서열 식별 번호 : 9
(2) 서열 식별 번호 : 10 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 30개 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 위상학 : 선형
(ii) 분자 타입 : 펩타이드
(iii) 가설 : 있음
(v) 단편 타입 : 내부 단편
(vi) 원래의 공급원 :
(A) 유기체 : 에이메리아 테넬라
(xi) 서열 개시 : 서열 식별 번호 : 10
(2) 서열 식별 번호 : 11 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 5개 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 위상학 : 선형
(ii) 분자 타입 : 펩타이드
(iii) 가설 : 있음
(v) 단편 타입 : 내부 단편
(vi) 원래의 공급원 :
(A) 유기체 : 에이메리아 테넬라
(xi) 서열 개시 : 서열 식별 번호 : 11
(2) 서열 식별 번호 : 12 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 5개 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 위상학 : 선형
(ii) 분자 타입 : 펩타이드
(iii) 가설 : 있음
(v) 단편 타입 : 내부 단편
(vi) 원래의 공급원 :
(A) 유기체 : 에이메리아 테넬라
(xi) 서열 개시 : 서열 식별 번호 : 12
(2) 서열 식별 번호 : 13 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 5개 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 위상학 : 선형
(ii) 분자 타입 : 펩타이드
(iii) 가설 : 있음
(v) 단편 타입 : 내부 단편
(vi) 원래의 공급원 :
(A) 유기체 : 에이메리아 테넬라
(xi) 서열 개시 : 서열 식별 번호 : 13
(2) 서열 식별 번호 : 14 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 14개 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 위상학 : 선형
(ii) 분자 타입 : 펩타이드
(iii) 가설 : 있음
(v) 단편 타입 : 내부 단편
(vi) 원래의 공급원 :
(A) 유기체 : 에이메리아 테넬라
(xi) 서열 개시 : 서열 식별 번호 : 14
(2) 서열 식별 번호 : 15 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 18개 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 위상학 : 선형
(ii) 분자 타입 : 펩타이드
(iii) 가설 : 있음
(v) 단편 타임 : C-말단
(vi) 원래의 공급원 :
(A) 유기체 : 에이메리아 테넬라
(xi) 서열 개시 : 서열 식별 번호 : 15
Claims (19)
- 에이메리아(Eimeria) 기생충에 의해 팽성된 다른 단백질을 거의 함유하지 않는, 하기 아미노산 서열을 갖는 면역원성 폴리펩타이드 또는 에이메리아 기생충에 대해 면역 반응을 유도할 수 있는 그의 단편.
- 에이메리아 기생충에 대해 면역 반응을 유도할 수 있는, 서열 식별 번호. 1 의 서열 또는 그의 부분 서열을 갖는 면역원성 폴리펩타이드틀 암호화하는 단리된 DNA 분자.
- 에이메리아 기생충에 대해 면역 반응을 유도할 수 있는 면역원성 폴리펩타이드를 암호화하는 하기 뉴클레오티드 서열 전부 또는 일부를 갖는 단리된 DNA 분자 또는 그의 작용성 등가물.
- 화합성의 숙주 유기체에 제 6항의 DNA 분자의 발현을 유도할 수 있는, 상기 DNA 분자를 포함하는 재조합 벡터.
- 콕시디아증으로부터 대상 개체를 면역시키기 위한 제 1항에 따른 면역원성 폴리펩타이드.
- (a) DNA 가 발현되는 조전하에서, 제 1항에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 형질전환된 미생물을 배양하고,(b) 배양액으로부터 폴리펩타이드 또는 단면을 단리함을 포함하는, 제 1항에 따른 폴리펩타이드를 제조하는 방법.
- 제 1항에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 를 백터내로 삽입시키고,(b) 상기 벡터를 미생물중에서 복제시킨 후,(c) 미생물로부터 재조합 벡터를 단리함을 포함하는, 제 1항에 따른 폴리펩타이드릍 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 튤 포함하는 재조합 벡터의 제조 방법.
- (a) 바이러스 성숙 및 감염력을 억제하지 않으면서 바이러스의 게놈내로 제 1항에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 를 삽입시키고,(b) 세포 배양액중에서 상기 재조합 벡터를 증폭시킨 후,(c) 배양 배지로부터 재조합 바이러스를 정제함을 포함하는, 제 1항에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 를 포함하는 재조합 바이러스의 제조 방법.
- (a)제 1항에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 를 포함하는 재조합 벡터로 미생물을 형질전환시키고,(b) 형질전환된 미생물을 발효 브로스중에서 증식시킴을 포함하는, 제 1항에 따른 폴리펩타이드를 생성할 수 있는 형질전환된 미생물의 제조방법.
- 제 1항에 따른 폴리펩타이드 및 생리학적으로 허용되는 담체 또는 보조제를 포함하는, 콕시디아증으로부터 대상 개체를 보호하기 위한 백신.
- 화합성의 숙주 유기체에서 DNA 의 발현을 유도할 수 있는 제 1항에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 를 포함하는 재조합 바이러스 및 생리학적으로 허용되는 담체 또는 보조제를 함유하는, 콕시디아증으로부터 대상 개체를 보호하기 위한 백신.
- 제 10 항에 따른 방법으로 제조된, 제 1항에 따른 폴리펩타이드.
- 제 11 항에 따른 방법으로 제조된, 제 1항에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 를 포함하는 재조합 벡터.
- 제 12 항에 따른 방법으로 제조된, 제 1항에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 를 포함하는 재조합 바이러스.
- 제 13 항에 따른 방법으로 제조된, 제 1항에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 형질전환된 미생물.
- 제 1항에 따른 폴리펩타이드 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 백신 효과량을 콕시디아증에 걸리기 쉬운 어린 개체에게 투여함을 포함하는, 콕시디아증으로부터 대상 개체를 보호하는 방법.
- (a)화합성의 숙주 유기체에서 DNA 의 발현을 유도할 수 있는, 제 1항에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 를 포함하는 재조합 바이러스, 및(b) 생리학적으로 허용되는 담체를 함유하는 백신 효과량을 콕시디아증에 걸리기 쉬운 어린 개체에게 투여함을 포함하는, 콕시디아증으로부터 대상 개체를 보호하는 방법.
- 제 1항에 따른 폴리펩타이드 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 백신 효과량을 난(ovo)에 투여함을 포함하는, 콕시디아중으로 부터 대상 개체를 보호하는 방법.
- DNA 의 발현을 유도할 수 있는, 제 1항에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 를 포함하는 재조합 바이러스 및 생리학적으로 허용되는 담체를 함유하는 백신 효과량을 난에 투여함을 포함하는, 콕시디아증으로부터 대상 개체를 보호하는 방법.
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| JP3129441B2 (ja) * | 1991-07-12 | 2001-01-29 | ファイザー・インコーポレイテッド | トリ・コクシジウムに対する継代細胞系およびワクチン |
| ES2192559T3 (es) * | 1993-11-12 | 2003-10-16 | Akzo Nobel Nv | Vacuna para la proteccion de aves de corral contra la coccidiosis. |
| US6495146B1 (en) | 1995-06-07 | 2002-12-17 | Pfizer Incorporated | In ovo vaccination against coccidiosis |
| WO1996040234A1 (en) | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Pfizer Inc. | In ovo vaccination against coccidiosis |
| US6627205B2 (en) | 1997-12-01 | 2003-09-30 | Pfizer Incorporated | Ovo vaccination against coccidiosis |
| CA2343934A1 (en) | 1998-09-25 | 2000-04-06 | The Children's Medical Center Corporation | Short peptides which selectively modulate the activity of protein kinases |
| US6984378B1 (en) | 1999-02-26 | 2006-01-10 | Pfizer, Inc. | Method for the purification, recovery, and sporulation of cysts and oocysts |
| ATE484573T1 (de) | 2001-08-30 | 2010-10-15 | Embrex Inc | Verbesserte verfahren zur herstellung von oozysten |
| US6924135B2 (en) * | 2003-08-29 | 2005-08-02 | Zeon Corporation | DNA encoding Eimeria glyceroaldehyde-3-phosphate dehydrogenase and uses thereof |
| DE602005003429T2 (de) * | 2004-12-01 | 2008-10-02 | Zeon Corp. | Kodierende DNS für ein Eimeria Apical Membran Antigen 1 und dessen Verwendungen |
| RU2561673C2 (ru) * | 2006-03-30 | 2015-08-27 | Эмбрекс, Инк. | Способы и композиции для вакцинации домашней птицы |
Family Cites Families (29)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1204057A (en) * | 1982-06-22 | 1986-05-06 | Eng-Hong Lee | Immunization against coccidiosis |
| EP0135712A3 (en) * | 1983-08-19 | 1987-05-27 | American Cyanamid Company | Antigens and monoclonal antibodies reactive against sporozoites of eimeria spp. |
| US4650676A (en) * | 1983-08-19 | 1987-03-17 | American Cyanamid Company | Antigens and monoclonal antibodies reactive against merozoites of Eimeria spp. |
| EP0135073A3 (en) * | 1983-08-19 | 1987-05-27 | American Cyanamid Company | Antigens and monoclonal antibodies reactive against merozites of eimeria spp. |
| US4710377A (en) * | 1983-08-19 | 1987-12-01 | American Cyanamid Company | Antigens and monoclonal antibodies reactive against sporozoites of Eimeria spp. |
| US4874705A (en) * | 1985-05-16 | 1989-10-17 | Solvay & Cie, S.A. | DNA encoding an antigenic protein derived from Eimeria tenella and vaccines for prevention of coccidiosis caused by Eimeria tenella |
| US5187080A (en) * | 1984-06-05 | 1993-02-16 | Solvay & Cie S.A. | DNA encoding an antigenic protein derived from Eimeria tenella and vaccines for prevention of coccidiosis caused by Eimeria tenella |
| CA1340520C (en) * | 1984-06-05 | 1999-05-04 | Karel Z. Newman Jr. | Antigenic proteins and vaccines containing them and protective antibodies directed to them for prevention of coccidiosis caused by eimeria tenella and eimeria necatrix |
| US4639372A (en) * | 1984-06-29 | 1987-01-27 | Merck & Co., Inc. | Coccidiosis vaccine |
| EP0190254A4 (en) * | 1984-07-05 | 1987-03-09 | Genex Corp | GENE CLONE AND PROCESS FOR THE PREPARATION AND USE THEREOF. |
| US4724145A (en) * | 1985-11-18 | 1988-02-09 | Merck & Co., Inc. | Eimeria acervulina immunogens |
| EP0231537B1 (en) * | 1985-12-03 | 1992-03-11 | Solvay | Antigenic proteins and vaccines containing them for prevention of coccidiosis |
| EP0241139A3 (en) * | 1986-03-13 | 1989-04-19 | Merck & Co. Inc. | Anti-idiotypic vaccine for coccidiosis |
| SU1396603A1 (ru) * | 1986-04-25 | 1990-05-07 | Inst Obshchej Genetiki Im N I | ЧЕТЦФєЛИБИгИБЭ ЬОБъФЛјИБЭ ј И Т Ч С Ефу јОЭ ГТЧЛИЛИїБ ФлгБїЕИЦВk ЛИјл»ЛЧлёэЛз в Ц в`ѕлИТ»ЛЛ В ТОЕгТБз ЕвГИЕЩЙГИЙБ ГЦУЙ |
| CA1340838C (en) * | 1986-08-14 | 1999-12-07 | Michael Wallach | Coccidiosis vacine |
| WO1988006629A1 (en) * | 1987-03-06 | 1988-09-07 | Synergen Incorporated | Polypeptides useful in diagnosis of coccidia infection and recombinant-dna methods for manufacturing same |
| IL85980A (en) * | 1987-04-16 | 1992-03-29 | Embrex Inc | Disease control in avian species by embryonal vaccination with a nonreplicating immunogen |
| US4808404A (en) * | 1988-01-11 | 1989-02-28 | A. H. Robins Company, Inc. | Live vaccine for coccidiosis utilizing coccidial sporozoites |
| NZ227595A (en) * | 1988-01-15 | 1991-11-26 | Merck & Co Inc | Recombinant production of eimeria tenella antigens and their use |
| US4973551A (en) * | 1988-01-15 | 1990-11-27 | Merck & Co., Inc. | Vector for the expression of fusion proteins and protein immunogens |
| NZ227597A (en) * | 1988-01-15 | 1991-11-26 | Merck & Co Inc | Eimeria tenella group b immunogens and their production |
| ZA889230B (en) * | 1988-02-12 | 1989-08-30 | Us Agriculture | Cloned genes coding for avian coccidiosis antigens which induce a cell-mediated immune response and method of producing the same |
| US5122471A (en) * | 1988-02-12 | 1992-06-16 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Cloned genes coding for avian coccidiosis antigens which induce a cell-mediated immune response |
| US5001230A (en) * | 1988-02-18 | 1991-03-19 | Schering Corporation | T cell activation markers |
| ZA893740B (en) * | 1988-06-03 | 1990-02-28 | Hoffmann La Roche | Recombinant coccidiosis vaccines |
| ZA894726B (en) * | 1988-06-27 | 1990-03-28 | Akzo Nv | Coccidiosis vaccine |
| ZA902147B (en) * | 1989-03-28 | 1990-12-28 | Akzo Nv | Coccidiosis vaccine |
| ZA9010461B (en) * | 1990-01-26 | 1991-10-30 | Hoffmann La Roche | Recombinant coccidiosis vaccines-5-7 eimeria surface antigen |
| ZA924203B (en) * | 1991-06-18 | 1993-03-31 | Akzo Nv | Coccidiosis poultry vaccine |
-
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