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Hintergrund der Erfindung
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1. Gebiet der Erfindung
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Diese
Erfindung betrifft das Gebiet der Vogelkokzidiose und bezieht sich
auf ein DNA-Molekül,
das ein antigenes Protein des Antigens 1 der apikalen Membran von
Eimeria codiert, und seine Verwendung.
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Kokzidiose
ist eine Darmstörung
von Geflügel
und verursacht eine Vielzahl von Problemen für den infizierten Wirt. Diese
Probleme reichen von schlechten Futterumwandlungsverhältnissen
bei leichten Infektionen bis zu akuten Todesfällen bei schwereren Infektionen.
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Kokzidiose
wird durch Protozoen verursacht, die zur Gattung Eimeria gehören. Die
Vertreter dieser Gattung im Geflügel
sind E. acervulina, E. tenella, E. maxima, E. necatrix, E. brunetti,
E. mitis und E. praecox. Einige Forscher stellen auch E. mivati
und E. hagani zu der Gattung. Alle diese Spezies haben ähnliche
Lebenszyklen, weisen aber eine unterschiedliche Gewebespezifität und Pathogenität auf. Ein
Masthähnchen wird
durch E. acervulina oder E. maxima erheblich geschädigt, da
sie in großen
Teilen des Dünndarms
parasitieren, wo die Nahrungsverdauung eine Hauptrolle spielt.
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Kokzidiose
kann durch die Verabreichung von Anti-Kokzidiose-Mitteln bekämpft werden.
Es treten jedoch häufig
wirkstoffresistente Stämme
auf, und die Kosten der Entwicklung von neuen Wirkstoffen sind ziemlich
hoch. Außerdem
hinterlassen mehrere dieser Erreger Rückstände im Fleisch, was zu Problemen
für den Verbraucher
führen
könnte.
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Es
wurde versucht, die Krankheit zu verhindern, indem man Hühner mit
lebenden abgeschwächten Stämmen von
Eimeria oder inaktivierten Parasiten impfte. Diese lebenden abgeschwächten Stämme, wie
frühreife
Linien, werden erhalten, indem man Hühner mit Oocysten einer wilden
Eimeria-Spezies impft und den allerersten Parasiten einsammelt,
der aufgrund der Infektion ausgeschieden wird (J. Parasitol. 1975,
61: 1083–1090).
Solche abgeschwächten
Lebendimpfstoffe produzieren jedoch weniger Parasiten und haben
bei geimpften Hühnern
einen merklichen Krankheitseffekt. Andererseits ist die Schutzwirkung
unter Verwendung des letzteren (inaktivierter Impfstoff) bei weitem
nicht vollständig.
Weiterhin ist ein Nachteil dieser Impfstoffe, dass sie nur kostspielig
herzustellen sind, da bei einer Produktion dieser Impfstoffe im
großen
Maßstab
viele lebende Hühner
benötigt
werden.
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Eine
alternative Lösung
bestünde
darin, die schützenden
Antigene von Eimeria-Parasiten
gentechnisch herzustellen. Einmal entwickelt, könnten diese Immunogene in einem
prokaryontischen oder eukaryontischen Kultursystem billig in unbegrenzter
Menge hergestellt und zum Impfen von Hühnern gegen Kokzidiose verwendet
werden.
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2. Stand der Technik
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Mehrere
schützende
Antigen-Gene von Eimeria wurden beschrieben. Zum Beispiel beschrieben
Jenkins et al. ein Screeningverfahren unter Verwendung eines Kaninchenserums
gegen die Membranfraktion von E. acervulina und einen Teil der cDNA,
die ein 250-kDa-Protein in der Parasitenoberfläche codiert (Exp. Parasitol.
1988; 66: 96–107,
US-Patent 5,122,471 ). Einige
Eimeria-Antigen-Gene
wurden einem Screening unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern gegen
Eimeria-Parasiten anstelle von Antiseren unterzogen (
US-Patente 5,028,694 ,
5,279,960 ,
5,814,320 ,
5,449,768 ). Diese Antigene konnten
Hühnern,
die mit einem rekombinanten Protein oder einem das Antigen exprimierenden
rekombinanten Virus immunisiert wurden, jedoch nur einen partiellen
Schutz vor einer Eimeria-Infektion verleihen (
US-Patente 5,387,414 ,
5,403,581 ,
5,602,033 ,
6,001,363 ).
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Infection
and Immunity, März
1991, Seite 983–989,
Vol. 59, Nr. 3, Y. D. Karkhanis et al., offenbart die Reinigung
und Charakterisierung eines schützenden
Antigens von Eimeria tenella. Extrakte wurden aus ultraschallbehandelten
sporulierten Oocysten oder aus ultraschallbehandelten Sporozoiten
hergestellt, und nach Gelfiltration und Reinigung wurde ein schützendes
Antigen mit einer Molmasse von 26 kDa identifiziert. Es wurde gezeigt,
dass der Extrakt zum partiellen Schutz von Hühnern vor durch E. tenella
induzierter Kokzidiose führt,
siehe Diskussion Seite 987–989.
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US-A-5,661,015 (Binger
et al.) offenbart DNA-Sequenzen, die für Eimeria-Oberflächenantigene codieren, rekombinante
Vektoren, die die DNA enthalten, transformierte Wirtszellen und
Verfahren zur Herstellung der Antigene unter Verwendung der transformierten
Mikroorganismen. Ebenfalls mit dabei sind Verfahren zum Schützen von
Geflügel
vor Kokzidiose unter Verwendung von Eimeria-Oberflächenantigenen,
die entweder als gereinigte Proteine oder in Form von DNA, die die
Proteine codiert, in einem viralen Vektor verabreicht werden.
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Plasmodium,
das Malaria beim Menschen verursacht, ist mit Eimeria nahe verwandt,
und beide Parasiten gehören
zum Stamm der Apicomplexa. Malaria ist eine der drei bedeutendsten
Infektionskrankheiten beim Menschen, und es gibt schätzungsweise
500 Millionen infizierte Menschen, wobei 1–2 Millionen jährlich sterben.
Daher konzentrieren sich viele Forschungsgruppen auf die Entwicklung
eines Malariaimpfstoffs, um die Infektion zu bekämpfen.
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Das
Antigen 1 der apikalen Membran von Plasmodium ist zur Zeit eines
der vielversprechendsten Antigene für einen Malariaimpfstoff (Molecular
Microbiology (2004) 52, 159–168,
The Journal of Immunology 172 (2004) 6167–6174, und Infect. Immun. 72
(2004) 4464–4470).
Das Gen des Antigens 1 der apikalen Membran von Eimeria (AMA-1)
wird im spezifischen Organ von Eimeria nur in kleiner Menge exprimiert.
Daher war die Reinigung des Antigens schwierig, und die volle Aminosäuresequenz
war unbekannt. Da es kein gereinigtes AMA-1 gab, war es schwierig,
das AMA-1-Gen durch das allgemeine Screeningverfahren zu erhalten,
das heißt,
einen Antikörper
gegen das Antigen zu erhalten und eine cDNA-Bibliothek mit dem Antikörper zu
durchmustern.
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Wie
oben beschrieben ist, gibt es keinen befriedigenden Impfstoff gegen
Vogelkokzidiose. Außerdem wurde
noch kein DNA-Molekül,
das Eimeria-AMA-1-Protein codiert, kloniert und ist bezüglich seiner
Eignung als Impfstoffantigen bekannt.
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Kurzbeschreibung der Erfindung
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Dementsprechend
besteht ein Ziel der vorliegenden Erfindung darin, ein Mittel zum
Identifizieren und Klonieren von cDNA, die Eimeria-tenella-AMA-1
codiert, bereitzustellen. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung
besteht darin, ein DNA-Molekül,
das Eimeria-tenella-AMA-1 codiert, bereitzustellen und seine Verwendung
anzugeben. Noch weitere Ziele der vorliegenden Erfindung bestehen
darin, Verfahren und Impfstoffe bereitzustellen, die zum Schützen von
Hühnern
vor Vogelkokzidiose geeignet sind.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein DNA-Molekül bereit, das ein antigenes
Protein von Eimeria-AMA-1, insbesondere Eimeria-tenella-AMA-1, codiert.
Die DNA-Sequenz codiert das Eimeria-tenella-AMA-1-Protein, das aus
der in SEQ ID Nr. 2 gezeigten Aminosäuresequenz besteht.
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Außerdem stellt
die vorliegende Erfindung ein DNA-Molekül bereit, das ein antigenes
Protein von Eimeria-tenella-AMA-1 codiert, wobei das antigene Protein
eine Aminosäuresequenz
umfasst, die durch Insertion, Deletion und/oder Substitution von
einer oder mehreren Aminosäuren
in der in SEQ ID Nr. 2 gezeigten Sequenz modifiziert ist, oder wobei
das antigene Protein mehr als 90% Identität mit der in SEQ ID Nr. 2 gezeigten Aminosäuresequenz
aufweist.
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Außerdem stellt
die vorliegende Erfindung ein DNA-Molekül bereit, das ein antigenes
Protein von Eimeria-tenella-AMA-1 codiert, wobei das DNA-Molekül unter
hochstringenten Bedingungen mit dem Bereich des offenen Leserasters
in der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten DNA hybridisiert.
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Ein
DNA-Vektor, der das oben beschriebene DNA-Molekül enthält, ist hier ebenfalls offenbart
und kann als DNA-Impfstoff für
Vogelkokzidiose verwendet werden.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein antigenes Protein von Eimeria-tenella-AMA-1
und ein Verfahren zu seiner Herstellung bereit.
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Das
Protein eignet sich auch zum Schützen
von Hühnern
vor Vogelkokzidiose.
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Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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Antigenes Protein des Antigens 1 der apikalen
Membran von Eimeria
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Das
Antigen 1 der apikalen Membran (AMA-1) von Eimeria gemäß der vorliegenden
Erfindung ist von dem Vogelparasiten Eimeria abgeleitet und umfasst
insbesondere die Aminosäuresequenz
von SEQ ID Nr. 2.
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Das
antigene Protein von Eimeria-AMA-1 ist jedoch nicht nur auf AMA-1
beschränkt,
sondern umfasst auch das Protein, das die Aminosäuresequenz umfasst, die durch
Substitution, Deletion, Addition und/oder Insertion von einer oder
mehreren Aminosäuren
in SEQ ID Nr. 2 modifiziert ist, solange es bei Hühnern die
gleichen Antikörper
induzieren kann wie bei Hühnern,
die mit Eimeria-AMA-1 immunisiert sind. Ein Beispiel für das antigene
Protein ist eines mit demselben Epitop wie Eimeria-tenella-AMA-1,
das die in SEQ ID Nr. 2 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst, und ein
Beispiel ist das in Beispiel 3 beschriebene rekombinante Protein,
das die 57. bis 276. Aminosäure
von SEQ ID Nr. 2 enthält.
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Die
Zahl der obigen modifizierten Aminosäuren beträgt vorzugsweise weniger als
10%, besonders bevorzugt weniger als 5% der Gesamtheit von SEQ ID
Nr. 2 und am meisten bevorzugt weniger als 10 Aminosäuren.
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Das
antigene Protein von Eimeria-tenella-AMA-1 gemäß der vorliegenden Erfindung
ist auch in dem DNA-Molekül
codiert, das unter hochstringenten Bedingungen mit dem DNA-Molekül des offenen
Leserasters in SEQ ID Nr. 1 hybridisiert. In diesem Fall sind "hochstringente Bedingungen" äquivalent zu "0,2 × SSC und 68°C".
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Antigene
Proteine von Eimeria-tenella-AMA-1 gemäß der vorliegenden Erfindung
umfassen außerdem
das Protein, das eine Aminosäuresequenz
umfasst, die mehr als 90% Identität mit der in SEQ ID Nr. 2 gezeigten
Aminosäuresequenz
aufweist. Vorzugsweise beträgt
die Identität
wenigstens mehr als 95%.
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DNA-Molekül, das ein antigenes Protein
von Eimeria-AMA-1 codiert
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Das
DNA-Molekül
der vorliegenden Erfindung codiert ein antigenes Protein des oben
genannten AMA-1 des Vogelparasiten Eimeria tenella. Ein spezifisches
Beispiel für
eine DNA der vorliegenden Erfindung ist eine, die das Eimeria-tenella-AMA-1 codiert,
das die in SEQ ID Nr. 2 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst. Insbesondere
ist ein DNA-Molekül
der vorliegenden Erfindung eines, das die in SEQ ID Nr. 1 gezeigte
Nucleotidsequenz aufweist.
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Die
DNA der vorliegenden Erfindung ist jedoch nicht nur auf diejenige
mit der Sequenz von SEQ ID Nr. 1 beschränkt, sondern umfasst auch eine
DNA, die ein Protein codiert, das die Aminosäuresequenz umfasst, die durch
Substitution, Deletion, Addition und/oder Insertion von einer oder
mehreren Aminosäuren
in SEQ ID Nr. 2 modifiziert ist, solange das Protein bei Hühnern die
gleichen Antikörper
induzieren kann wie bei Hühnern,
die mit Eimeria-tenella-AMA-1 immunisiert sind.
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Die
Zahl der obigen modifizierten Aminosäuren beträgt vorzugsweise weniger als
10%, besonders bevorzugt weniger als 5% der Gesamtheit von SEQ ID
Nr. 2 und am meisten bevorzugt weniger als 10 Aminosäuren.
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Die
DNA-Moleküle
der vorliegenden Erfindung, die ein antigenes Protein von Eimeria-tenella-AMA-1 codieren,
umfassen auch ein DNA-Molekül,
das unter hochstringenten Bedingungen mit dem DNA-Molekül des offenen
Leserasters in SEQ ID Nr. 1 hybridisiert. In diesem Fall sind "hochstringente Bedingungen" äquivalent zu "0,2 × SSC und
68°C".
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Außerdem umfassen
die DNA-Moleküle
der vorliegenden Erfindung, die ein antigenes Protein von Eimeria-tenella-AMA-1
codieren, auch ein DNA-Molekül,
das ein Protein mit einer Aminosäuresequenz
codiert, die mehr als 90% (besonders bevorzugt mehr als 95%) Identität mit der
in SEQ ID Nr. 2 gezeigten Aminosäuresequenz
aufweist. In diesem Fall wird die Identität mit Hilfe des Basic Local
Alignment Search Tool (BLAST) berechnet.
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Eines
der Verfahren, um das obige DNA-Molekül zu erhalten, das unter hochstringenten
Bedingungen mit dem DNA-Molekül
des offenen Leserasters in SEQ ID Nr. 1 hybridisiert oder das ein
Protein mit einer Aminosäuresequenz
codiert, die mehr als 90% Identität mit der in SEQ ID Nr. 2 gezeigten
Aminosäuresequenz aufweist,
ist die Modifikation des DNA-Moleküls von SEQ ID Nr. 1. Um das
DNA-Molekül
zu modifizieren, sind in der Technik die ortsspezifische Mutation
mit Hilfe von Primern und/oder die statistische Mutation bekannt: siehe
z. B. Sambrook et al., Kapitel 13 von Molecular Cloning: A Laboratory
Manual. 3. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,
N. Y. 2001.
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Vektor und dessen Konstruktion
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Ein
DNA-Vektor der vorliegenden Erfindung ist der Vektor, der das oben
beschriebene DNA-Molekül enthält. Um einen
DNA-Vektor der vorliegenden Erfindung zu erhalten, kann eine DNA
mit einer künstlichen Nucleotidsequenz
mit dem DNA-Molekül
der vorliegenden Erfindung verbunden werden. Ein Beispiel für die DNA
für die
Verbindung ist ein Linker, der in der Gentechnik üblicherweise
verwendet wird. Bei dem Linker handelt es sich um wenigstens ein
oder zwei weitere Nucleotide, die nicht natürlicherweise mit dem DNA-Molekül der vorliegenden
Erfindung verbunden sind und in Abhängigkeit von der Stelle des
Vektors, in die die DNA eingefügt
werden soll, in geeigneter Weise gestaltet werden.
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Der
DNA-Vektor, in den das DNA-Molekül
der vorliegenden Erfindung integriert wird, kann ausgewählt werden
aus einem Plasmid, wie pBR322, pBR325, pUC7, pUC8, pUC18, pUC19,
pBluescript oder pGEM, einem Cosmid, wie pHC79, oder einem Phagen,
wie λ- oder
M13-Phage. Der Vektor wird mit einem oder mehreren geeigneten Restriktionsenzymen
verdaut, und das DNA-Molekül
der vorliegenden Erfindung oder eine andere notwendige DNA, wie
ein Linker, wird nach dem Standardverfahren darin eingefügt.
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Ein
DNA-Vektor zum Aufbau des Expressionsvektors für ein antigenes Protein von
Eimeria-tenella-AMA-1 unterliegt keiner Einschränkung und kann aus den oben
genannten Vektoren ausgewählt
werden. Ein DNA-Vektor, um das Zielprotein als Fusionsprotein mit
einem Tag zu exprimieren, mittels dessen das Zielprotein affinitätsgereinigt
werden könnte,
ist besonders gut geeignet. Als Beispiele für einen solchen Vektor sind
pGEX-Vektor (AMERSHAM BIOSCIENCES Corp.) oder pQE-Vektor (QIAGEN
Inc.) kommerziell erhältlich.
Ein Beispiel dafür
ist pGEX-6p-3, der in Beispiel 3 beschrieben ist.
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Der
Transcriptionsregulations-Bereich, wie ein Promotor oder Terminator,
muss notwendigerweise in den Expressionsvektor mit aufgenommen werden.
Der geeignete Promotor ist je nach Wirtszelle unterschiedlich. Zum
Beispiel wird ein lac-, tac- oder T5-Promotor als Promotor verwendet,
wenn E. coli die Wirtszelle ist. Im Falle von Hefe sind OAX1- oder
GAPDH-Promotor, im Falle einer Insektenzelle der Polyhedrin-Promotor oder
bei Säugerzellen
der cmv- oder β-Actin-Promotor geeignet.
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Wirtszelle
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Unter
Verwendung des resultierenden Expressionsvektors kann eine Vielzahl
von Wirtszellen in geeigneter Weise transformiert werden, um einen
Mikroorganismus oder Zellen zu erhalten, die ein antigenes Protein
von Eimeria-tenella-AMA-1
oder ein rekombinantes Protein, das einen Teil von SEQ ID Nr. 2
und eine Tag-Sequenz
umfasst, produzieren können.
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Die
hier verwendeten Wirtszellen können
anhand ihrer Verträglichkeit
mit dem Expressionsvektor, Eignung der Produkte usw. ausgewählt werden,
und es kann sich entweder um prokaryontische oder um eukaryontische
Zellen handeln. Spezifische Beispiele für die Wirtszellen sind Bakterien,
wie die Gattung Escherichia (z. B. E. coli) oder die Gattung Salmonella
(z. B. Salmonella typhimurium), und niedere eukaryontische Zellen, wie
Hefe (z. B. Saccharomyces cerevisiae) oder Pilze (z. B. Penicillium).
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Und
Beispiele für
die Wirtszellen bei höheren
eukaryontischen Zellen sind Insektenzellen, Eierstockzellen des
chinesischen Streifenhamsters (CHO), CEF-Zellen oder humane Zelllinien (z. B.
HeLa).
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Um
einige Wirtszellen mit dem obigen Expressionsvektor zu transduzieren,
können
je nach den Wirtszellen geeignete Verfahren verwendet werden, die
dem Fachmann wohlbekannt sind.
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Expression eines antigenen Proteins von
Eimeria-AMA-1
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Die
mit einem geeigneten Expressionsvektor transformierten Wirtszellen
können
unter Inkubationsbedingungen, die dem Fachmann wohlbekannt sind,
kultiviert und vermehrt werden.
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Zum
Beispiel kann transformierte E. coli gut unter aeroben Bedingungen
in LB-Medium bei
37°C kultiviert
werden. Bei der Herstellung eines antigenen Proteins von Eimeria-tenella-AMA-1
können
die Bedingungen für
die Induktion des Proteins gemäß dem verwendeten
Promotor ausgewählt
werden. Im Falle des E.-coli-Lactose-Promotor-
und -Operator-Systems als spezielles Beispiel wird dies erreicht,
indem man eine geeignete Menge Isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranosid (IPTG) zu
einem Kulturmedium gibt.
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Das
Verfahren zum Reinigen des antigenen Proteins von Eimeria-AMA-1
unterliegt keiner besonderen Einschränkung, sondern es kann jedes
bekannte Verfahren in Kombination mit Techniken, die auf diesem
Gebiet wohlbekannt sind, auf die Reinigung angewendet werden. Wenn
das antigene Protein von Eimeria-tenella-AMA-1 als Fusionsprotein,
das ein Tag enthält,
welches bei der Reinigung durch eine Affinitätssäule verwendet werden kann,
exprimiert wird, ist die Affinitätssäule ein
sehr zweckmäßiges Werkzeug.
Zum Beispiel könnte
das antigene Protein von Eimeria-tenellla-AMA-1, das als Fusion
mit Glutathion-S-Transferase
(GST) unter Verwendung von pGEX-Vektor exprimiert wird, leicht durch
eine Glutathion-Sepharose-4B-Säule (AMERSHAM
BIOSCIENCES Corp.) gereinigt werden.
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Impfstoffe gegen Kokzidiose
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Zu
den Impfstoffen gegen Kokzidiose gemäß der vorliegenden Erfindung
gehören
DNA-Impfstoffe und Proteinimpfstoffe. Der DNA-Impfstoff der vorliegenden
Erfindung kann bei Hühnern,
die damit geimpft werden, die Immunität induzieren. Dagegen enthält Proteinimpfstoff
das antigene Protein von Eimeria-tenella-AMA-1 der vorliegenden Erfindung, das die
Immunität
bei Hühnern
induzieren kann.
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Der
DNA-Impfstoff der vorliegenden Erfindung enthält das DNA-Molekül der vorliegenden
Erfindung, und bei dem Hauptbestandteil kann es sich insbesondere
um einen rekombinanten DNA-Vektor, wie ein Plasmid, handeln, in
den das DNA-Molekül
der vorliegenden Erfindung eingefügt wird. Der rekombinante DNA-Vektor kann der obige
Expressionsvektor für
ein antigenes Protein von Eimeria-tenella-AMA-1 sein, ist aber nicht darauf
beschränkt,
solange der DNA-Impfstoff das Gen für das antigene Protein von
Eimeria-tenella-AMA-1 in dem immunisierten Huhn exprimieren kann.
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Der
DNA-Impfstoff kann neben dem DNA-Molekül, das das antigene Protein
von Eimeria-tenella-AMA-1 codiert, noch beliebige weitere Bestandteile
enthalten. Als anderer Bestandteil kann CpG-Oligonucleotid, das
von einem TLR (toll-like receptor) auf der Zelloberfläche erkannt
wird und zellvermittelte Immunität aktivieren
kann, oder Stabilisatoradditiv verwendet werden, nachdem es in phosphatgepufferter
Kochsalzlösung
(PBS) in Lösung
gebracht wurde.
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Das
Verabreichungsverfahren für
den DNA-Impfstoff der vorliegenden Erfindung unterliegt keiner besonderen
Einschränkung,
und ein allgemeines Verfahren zur intramuskulären, intravenösen oder
subkutanen Injektion ist aufgeführt.
Der DNA-Impfstoff wird in einer Menge von 50 μl einer Lösung von 0,1 bis 10 mg/ml, besonders
bevorzugt 0,5 bis 5 mg/ml, pro Vogel verabreicht.
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Der
Proteinimpfstoff der vorliegenden Erfindung besteht hauptsächlich aus
dem antigenen Protein von Eimeria-tenella-AMA-1 und kann beliebige
Bestandteile, wie Kochsalzlösung,
Adjuvans und/oder Konservierungsstoffe enthalten, solange Hühner sicher
mit dem DNA-Impfstoff immunisiert werden können.
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Das
Verabreichungsverfahren für
den Proteinimpfstoff der vorliegenden Erfindung unterliegt keiner
besonderen Einschränkung,
solange es bei dem Huhn, dem der Impfstoff verabreicht wurde, Immunantworten induzieren
kann. Vorzugsweise wird der Proteinimpfstoff mit Adjuvans injiziert,
da er dann bei dem Huhn, dem er injiziert wurde, starke Immunantworten
induzieren kann. Das Adjuvans kann aus zahlreichen Adjuvantien, die
in der Technik wohlbekannt sind, ausgewählt werden, zum Beispiel Öl-Adjuvans
oder Aluminiumhydroxid. Die Menge des injizierten Proteinimpfstoffs
unterliegt ebenfalls keiner Einschränkung. Zum Beispiel kann Protein,
das in PBS suspendiert ist, in einer Menge von mehr als 0,02 ml
bei einer Konzentration von mehr als 0,1 mg/ml injiziert werden,
und in diesem Fall ist eine Auffrischungsimmunisierung zu bevorzugen.
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Kurzbeschreibung der Zeichnungsfiguren
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1:
Ergebnisse einer tBLASTn-Recherche in der Eimeria-EST-Datenbank
unter Verwendung der N-terminalen Aminosäuresequenz von PfAMA-1.
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2:
Ergebnisse einer tBLASTn-Recherche in der Eimeria-tenella-Genomdatenbank
unter Verwendung der Aminosäuresequenz
von TgAMA-1.
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3: Abbildungen von mutmaßlichen
Exon/Intron-Bereichen von AMA-1 im Eimeria-tenella-Genom.
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4:
Ergebnisse einer Homologierecherche unter Verwendung der Aminosäuresequenz
von Eimeria-tenella-AMA-1.
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5:
Konstruktion des Plasmids pGEX-EtAMA.
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Liste der SEQ-ID-Sequenzen.
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- SEQ ID Nr. 1: cDNA-Sequenz des Eimeria-tenella-AMA-1-Gens.
- SEQ ID Nr. 2: Aminosäuresequenz
des Eimeria-tenella-AMA-1-Proteins.
- SEQ ID Nr. 3: PCR-Primer BG708-F.
- SEQ ID Nr. 4: PCR-Primer BG003-R.
- SEQ ID Nr. 5: PCR-Primer BG003-F.
- SEQ ID Nr. 6: PCR-Primer c545-1F.
- SEQ ID Nr. 7: PCR-Primer c545-2R.
- SEQ ID Nr. 8: PCR-Primer c755-4F.
- SEQ ID Nr. 9: PCR-Primer c755-4R.
- SEQ ID Nr. 10: PCR-Primer für
die ortsspezifische Mutagenese EcoAMA1.
- SEQ ID Nr. 11: PCR-Primer für
die ortsspezifische Mutagenese AMA1Sal.
- SEQ ID Nr. 12: PCR-Primer für
die ortsspezifische Mutagenese XbaAMA1.
- SEQ ID Nr. 13: PCR-Primer für
die ortsspezifische Mutagenese AMA1endSal.
- SEQ ID Nr. 14: Oligonucleotid für Adjuvans CpG.
- SEQ ID Nr. 15: Oligonucleotid für Adjuvans CpG-30.
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Beschreibung der bevorzugten
Ausführungsformen
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Der
Aufbau der Plasmide wurde im Wesentlichen nach den Standardtechniken
der Molekularbiologie durchgeführt
(Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3. Auflage, Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. 2001). DNA-Restriktionsfragmente
wurden einer Elektrophorese auf Agarose-Gelen unterzogen und mit
einem QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Kat. -Nr. 28704) gereinigt.
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Eine
Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde, wenn nichts anderes erwähnt ist,
unter Verwendung von ExTaq-Polymerase (Produkt-Nr.: RR001A, TaKaRa
Bio, Shiga, Japan) unter den Bedingungen von 30 Temperaturzyklen,
die aus 1 Minute Denaturierung bei 94°C, 2 Minuten Assoziation bei
55°C und
3 Minuten Verlängerung
bei 72°C
bestanden, durchgeführt.
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Beispiel 1
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Klonierung von cDNA, die Eimeria-AMA-1
codiert
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1.1 Herstellung einer Eimeria-tenella-cDNA-Bibliothek
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Sporozoiten
wurden aus 1 × 108 Oocysten eines im Japanischen Feld isolierten
Stammes von Eimeria tenella (Spende vom Research Institute for Animal
Science, Kanagawa, Japan) nach dem auf diesem Gebiet üblichen
Verfahren präpariert,
mit PBS gewaschen und mit 0,5 ml Lysepuffer (4M Guanidinthiocyanat,
25 mM Natriumcitrat, 0,5% Natriumlaurylsarcosinat und 0,1 M β-Mercaptoethanol)
lysiert. Messenger-RNA wurde an einer Oligo(dT)-Säule (FastTrack
2.0 mRNA Isolation Kit, Invitrogen Carlsbad, Kalifornien) gereinigt
und als Matrize für
die cDNA-Synthese (cDNA Synthesis Kit, Produkt-Nr.: 6120, Takara
Bio, Shiga, Japan) verwendet. Nach der Synthese von doppelsträngiger cDNA
wurde eine cDNA-Bibliothek unter Verwendung eines cDNA Library Kit
(Produkt-Nr.: 6119, TaKara Bio, Shiga, Japan) und des Cassette-Adapters
im Kit hergestellt.
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1.2 Recherche in der Eimeria-EST-Datenbank
und Klonierung des 5'-Endes
des Eimeria-AMA-1-Gens
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Das
Gen für
AMA-1 des Malariaparasiten Plasmodium falciparum (PfAMA-1) und die
entsprechenden Proteinsequenzen wurden bereits veröffentlicht.
Es wurde in der Eimeria-EST-Datenbank mit dem Translating-BLAST-Tool
(tBLASTn) (http://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/blast/submitblast/e_tenella/omni)
recherchiert, wobei die N-terminale 392-Aminosäuren-Sequenz von PfAMA-1 (Proteindatenbank-Zugriffs-Nr.:
AAA29475) verwendet wurde, und die Ergebnisse sind in 1 gezeigt.
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EST-Sequenzen
mit hoher Punktzahl, die in 1A gezeigt
sind, wurden aneinander ausgerichtet. Die Ergebnisse zeigten an,
dass ein Teil (394 bp) von BG725003 mit dem von BG724708 identisch
ist, wie in 1B gezeigt ist. Zwei PCR-Primer
(BG708-F und BG003-R) wurden anhand des Teils vor und hinter dem identischen
Bereich gestaltet (unterstrichene Sequenz in 1B).
Sequenzen dieser PCR-Primer sind in SEQ ID Nr. 3 bzw. 4 gezeigt.
Unter Verwendung dieser PCR-Primer (BG708-F und BG003-R) und der
oben beschriebenen cDNA-Bibliothek als Matrize wurde eine PCR durchgeführt.
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Bei
der PCR wurde ein DNA-Fragment von etwa 0,6 kbp amplifiziert, das
in den Plasmidvektor des PCR Script Amp Cloning Kit (STRATAGENE,
Produkt-Nr.: 211188) ligiert wurde. Die resultierenden Transformanten
wurden kultiviert, und jedes Plasmid wurde gereinigt. Der Insert
jedes Plasmids wurde sequenziert, und es wurde ein Plasmid mit einem
DNA-Fragment gefunden, das den 5'-untranslatierten
Bereich von 181 bp und den N-terminalen Bereich (151 Aminosäuren) des
offenen Leserasters (ORF), der zu PfAMA-1 homolog ist, codiert.
Das Plasmid wurde pPCR-EtAMA1-N genannt.
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1.3 Klonierung des mittleren und des 3'-Ende-Bereichs von
Eimeria-AMA-1 unbekannter Sequenz
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Eine
schnelle 3'-Amplifikation
des cDNA-Endes (3' RACE)
wurde durchgeführt,
wobei man einen neuen Primer (BG003-F; SEQ ID Nr. 5), der im 3'-Ende des Inserts
von pPCR-EtAMA1-N existierte, und den Oligo(dT)-Primer, der im oben
beschriebenen cDNA Synthesis Kit vorhanden ist (Takara Bio, Produkt-Nr.:
6120), verwendete, aber leider wurde keine DNA amplifiziert. Daher
wurde als nächster
Versuch mit dem Translating-BLAST-Tool (tBLASTn) (http://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/blast/submitblast/e_tenella/omni)
unter Verwendung der Aminosäuresequenz
von der 150. bis zur 240. Aminosäure
von Toxoplasmagondii-AMA-1 (TgAMA-1) (Proteindatenbank-Zugriffs-Nr.:
AAB65410) in der Eimeria-EST-Datenbank recherchiert, und infolgedessen wurde
herausgefunden, dass die Aminosäuresequenz,
die sich von der Sequenz des 753. bis 989.
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Nucleotids
von c001002545.Contig1 ableitet, mit der von TgAMA-1 homolog ist,
wie in 2A gezeigt ist.
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Weiterhin
wurde in der Eimeria-EST-Datenbank auch mit dem Translating-BLAST-Tool (tBLASTn) (http://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/blast/submitblast/e_tenella/omni)
unter Verwendung der Aminosäuresequenz von
der 240. bis 420. Aminosäure
von TgAMA-1 recherchiert, und infolgedessen wurde herausgefunden,
dass die Aminosäuresequenz,
die sich von der Sequenz des 990. bis 1046. Nucleotids von c001002545.Contig1
ableitet, mit der des 260. bis 276. Nucleotids von TgAMA-1 homolog
ist, wie in 2B gezeigt ist. Die Aminosäuresequenz
von der 260. bis 276. Aminosäure
von TgAMA-1 erwies sich als homolog zu derjenigen, die vom 1255.
bis 1305. Nucleotid von c001002545.Contig1 abgeleitet ist, wie in 2C gezeigt ist. Außerdem war die Aminosäuresequenz
von der 336. bis 395. Aminosäure
von TgAMA-1 zu derjenigen homolog, die von der Sequenz vom 711.
bis 878. Nucleotid von c008400755.Contig1 abgeleitet ist, wie in 2D gezeigt ist.
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Wegen
der Annahme der Existenz eines Introns anhand der obigen Ergebnisse
und der Regel des Spleißsignals
wurde eine Exon-Intron-Struktur des Eimeria-AMA-1-Gens angenommen, wie in 3 gezeigt ist. Aufgrund dieser Annahme
wurden vier Primer (c545-1F, c545-2R, c755-4F, c755-4R: die Sequenzen
sind jeweils SEQ ID Nr. 6 bis 9) gestaltet.
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Eine
PCR wurde durchgeführt,
wobei die in Beispiel 1.1 beschriebene cDNA-Bibliothek als Matrize und der PCR-Primersatz
c545-1F und c545-12R verwendet wurden. Das DNA-Fragment von etwa
450 bp wurde amplifiziert. Im Falle des PCR-Primersatzes c545-1F
und c755-4R wurde das DNA-Fragment von etwa 850 bp amplifiziert,
in den pBluescript-SK(+)-Plasmidvektor (STRATAGENE, Produkt-Nr.:
212205) eingefügt
und sequenziert. Da die eingefügte
DNA anscheinend einen zentralen Bereich von Eimeria-AMA-1 codiert,
wurde das Plasmid als pBS-EtAMA1-M bezeichnet.
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Dann
wurde ein 3'-RACE
durchgeführt,
wobei die in Beispiel 1.1 beschriebene cDNA-Bibliothek als Matrize,
der Primersatz c755-4F und der OligodT-Primer in dem oben beschriebenen
cDNA Synthesis Kit (Takara Bio, Produkt-Nr.: 6120) verwendet wurde,
und in der Folge wurde ein DNA-Fragment von etwa 630 bp amplifiziert.
Das DNA-Fragment wurde auch in pBluescript SK(+) eingefügt und sequenziert.
Die Sequenzdaten zeigten an, dass es sich bei dem Insert um die
DNA handelte, die den C-terminalen Bereich von Eimeria-AMA-1 und
einen 3'-untranslatierten
Bereich enthält.
Das eingefügte
Plasmid wurde als pBS-EtAMA1-C
bezeichnet.
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Bei
den Inserts von drei Plasmiden, pPCR-EtAMA1-N, pBS-EtAMA1-M und
pBS-EtAMA1-C, handelte es
sich aufgrund ihrer Sequenzdaten um den 5'-Terminus, das Zentrum bzw. den 3'-Terminus von cDNA,
die Eimeria-tenella-AMA-1 codiert. Da die drei Inserts überlappende
Enden hatten, wo es Restriktionsenzym-Schnittstellen gab, wurden sie unter
Verwendung dieser Stellen zu einer einzigen kontinuierlichen cDNA verbunden
(deren Sequenz in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist). Das Plasmid, das die
kontinuierliche cDNA enthielt, wurde als pBS-EtAMA1 bezeichnet.
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Beispiel 2
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Nucleotid/Aminosäuresequenz-Analyse von Eimeria-AMA-1
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Das
DNA-Molekül
von SEQ ID Nr. 1 hat insgesamt 2002 Nucleotide, die einen 5'-untranslatierten Bereich von 126 bp,
ein offenes Leseraster von 536 Aminosäuren und einen 3'-untranslatierten
Bereich einschließlich
eines PolyA-Signals enthalten. Die Aminosäuresequenz ist in SEQ ID Nr.
2 gezeigt.
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Eine
Protein-Protein-BLAST(BLASTp)-Recherche (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)
wurde durchgeführt,
wobei man die in SEQ ID Nr. 2 gezeigte Aminosäuresequenz verwendete. In der
Proteindatenbank wurde kein identisches Protein gefunden, und das ähnlichste
Protein war TgAMA-1 (E-Wert von 9e-92 und 52% Homologie). Die BLASTp-Recherche-Ergebnisse
sind in 4 gezeigt. Außerhalb
von TgAMA-1 war die Homologie zwar kleiner als 50%, doch wurde mit mehreren
AMA-1 von Plasmodium-Spezies Treffer erzielt als Proteine mit einer
Aminosäuresequenzhomologie
zu SEQ ID Nr. 2, was auch stark die Annahme stützt, dass es sich bei dem Protein
von SEQ ID Nr. 2 um Eimeria-AMA-1 handelt. Bisher wurde die Nucleotid-
oder Aminosäuresequenz
von Eimeria-AMA-1
noch nicht veröffentlicht,
und die Sequenz dieser Erfindung ist der erste Bericht über volle
Sequenzdaten von Eimeria-AMA-1.
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Aufgrund
des Aminosäuresequenzprofils
von SEQ ID Nr. 2 enthält
Eimeria-AMA-1 ein Signalpeptid am N-Terminus (4. bis 25.) und eine
Transmembrandomäne
am C-Terminus (445. bis 467.). Daher wird vermutet, dass dieses
Protein auf der Oberfläche
des Eimeria-Parasiten existiert und sein C-Terminus (vom 468. bis
zum Ende) die cytoplasmatische Domäne ist.
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Beispiel 3
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Produktion von antigenem Protein von Eimeria-AMA-1
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3.1 Konstruktion eines E.-coli-Exressionsvektors
für Eimeria-AMA-1
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Um
ein antigenes Protein von Eimeria-AMA-1 als GST-Fusionsprotein zu
exprimieren, wurde ein E.-coli-Expressionsvektor pGEX-EtAMA wie
folgt konstruiert (5). Um eine DNA, die Eimeria-AMA-1
codiert, in einen pGEX-6p-3-Vektor (Amersham Nr. 27-4599-01), der
ein GST-Gen enthält,
zu ligieren, wurde ein DNA-Fragment von etwa 1,1 kbp durch PCR amplifiziert,
wobei pBS-EtAMA1 als Matrize sowie EcoAMA1 (SEQ ID Nr. 10) und AMA1Sal
(SEQ ID No. 11) als Primersatz verwendet wurden.
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Das
amplifizierte DNA-Fragment wurde mit EcoRI und SalI geschnitten,
durch eine Agarose-Gel-Elektrophorese fraktioniert und mit einem
QIAquick Gel Extraction Kit gereinigt. Das Plasmid pGEX-6p-3 wurde ebenfalls
mit EcoRI und SalI geschnitten, durch eine Agarose-Gel-Elektrophorese
fraktioniert und mit einem QIAquick Gel Extraction Kit gereinigt.
Diese gewonnenen DNA-Fragmente wurden miteinander ligiert, wobei pGEX-EtAMA
entstand, und in kompetente E.- coli-Zellen
von JM109 (TaKaRa Bio Inc., Japan) übertragen. Die resultierenden
ampicillinresistenten Transformanten wurden zufällig herausgesucht und mit
jeweils 2 ml LB-Brühe,
die Ampicillin enthielt (LB+amp), kultiviert. Jedes Plasmid wurde
nach den Standardverfahren (alkalische Lyse) präpariert und durch Schneiden
mit Restriktionsenzym analysiert. Ein Zielplasmid, das durch Restriktionsenzymanalyse
ausgewählt
wurde, wurde mit zwei Sequenzprimern von Amersham, Nr. 27-1410-01
und 27-1411-01, sequenziert, um zu bestätigen, dass das Eimeria-AMA-1-Gen
rastergleich in den pGEX-Vektor eingefügt wurde.
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3.2 Expression eines antigenen Proteins
von Eimeria AMA-1
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E.-coli-BL21-Zellen
(Amersham Nr. 27-1542-01) wurden mit pGEX-EtAMA transformiert. Die
resultierenden Transformanten wurden 16 Stunden lang mit LB+amp-Brühe kultiviert,
in 100 frische Volumina von LB+amp-Brühe eingeimpft und zwei Stunden
lang weiterkultiviert. Sie wurden nach der Zugabe von IPTG bis zu
einer Endkonzentration von 1 mM mehr als drei Stunden lang kultiviert,
durch Zentrifugation geerntet und mit Laemmli-Probenpuffer (60 mM
Tris-Cl (pH 6,8), 25% Glycerin, 2% SDS, 5% 2-Mercaptoethanol, 0,01% Bromphenolblau)
durch Kochen bei 100°C
lysiert. Das Lysat wurde zur Elektrophorese (PAGE) auf 12,5%iges SDS-Polyacrylamid-Gel
aufgetragen, und das Gel wurde mit 0,05%iger Coomassie-Brilliant-Blau(CBB)-Lösung angefärbt. Das
erwartete Protein von etwa 53 kDa wurde sehr gut als GST-Fusionsprotein
induziert.
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3.3 Reinigung eines antigenen Proteins
von Eimeria AMA-1
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BL21-Zellen,
die mit pGEX-GAPDH transformiert wurden, wurden 16 Stunden lang
in einer 2-ml-LB+amp-Brühe
kultiviert und in frische 100-mlLB+amp-Brühe eingeimpft und zwei Stunden
lang weiterkultiviert. Sie wurden nach der Zugabe von IPTG bis zu
einer Endkonzentration von 1 mM mehr als drei Stunden lang kultiviert,
geerntet und zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)
gewaschen. Das Zellsediment wurde in Lysepuffer (50 mM Tris-Cl (pH
8,0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,2 mM 4-(2-Aminoethyl)benzolsulfonylfluorid-Hydrochlorid (Merck
Ltd., Japan; Produktname: Pefabloc SC), 1,5 mg/ml Lysozym) suspendiert
und eine Stunde und 20 Minuten lang langsam geschüttelt, und
danach wurde Triton X-100 bis zu einer Endkonzentration von 0,3%
hinzugefügt.
Die Suspension wurde in ein Röhrchen übergeführt und
30 Minuten lang mit 12 000 × g
zentrifugiert. Das Sediment und der Überstand wurden getrennt und
auf 12,5% SDS-PAGE aufgetragen. Die meisten Fusionsproteine fanden
sich in der Sedimentfraktion.
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Das
Sediment wurde mit Laemmli-Probenpuffer suspendiert, gekocht und
auf 8% SDS-PAGE aufgetragen. Das Zielfusionsprotein von 53 kDa wurde
aus dem Gelbereich, in dem das Protein vorlag, eluiert und fraktioniert,
wobei man einen Mini Whole Gel Eluter (Bio-Rad) mit dem Elutionspuffer
(60 mM Tris-Cl (pH 8,7), 25 mM Borsäure) verwendete. Die gewonnenen
Proteine in den Fraktionen wurden durch 12,5%-SDS-PAGE und CBB-Färbung überprüft, und
die Fraktion, in der das Zielprotein vorlag und nicht mit anderen
Proteinen kontaminiert war, wurde ausgewählt. Das antigene Protein von
Eimeria-AMA-1 von etwa 1 mg wurde aus BL21-Transformanten gereinigt,
die mit 100 ml LB+amp-Brühe
kultiviert wurden, wie es hier beschrieben ist.
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Beispiel 4
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Immunantwort von Hühnern, die mit antigenem Protein
von Eimeria-AMA-1 geimpft wurden
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Das
antigene Protein von Eimeria-AMA-1 (0,3 mg/ml), das so gereinigt
wurde, wie es im obigen Beispiel 3 beschrieben ist, wurde mit dem
gleichen Volumen Freunds vollständigem
Adjuvans (FCA; Sigma) gemischt, wobei 2-ml-Micellen entstanden.
Zehn Hühner,
die 4 Wochen alt waren, wurden subkutan (sc) mit jeweils 0,2-ml-Micellen
immunisiert und zweimal in Abständen
von einer Woche einer sc-Auffrischungsimpfung mit derselben Menge
an AMA-1-Protein und Freunds unvollständigem Adjuvans (IFA; Sigma)
unterzogen.
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Zehn
Tage nach der letzten Immunisierung wurde den immunisierten Hühnern jeweils
etwa 2 ml Blut entnommen, und die Lymphocyten des peripheren Bluts und
Seren wurden durch Standardtechniken präpariert. Aus fünf nichtimmunisierten
Hühnern
wurden ebenfalls die Lymphocyten des peripheren Bluts und Seren als
negative Kontrollproben präpariert.
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Antikörper in
den Seren gegen E.-tenella-Sporozoiten wurden durch das Western-Blotting-Verfahren überprüft. 1 × 10 Sporozoiten
von E. tenella wurden mit Laemmli-Probenpuffer lysiert und 5 min
lang gekocht und auf 12,5%-SDS-PAGE aufgetragen. Nach dem PAGE wurden
die Proteine der Sporozoiten durch Blotting auf eine PVDF-Membran
(MILLIPORE; Produktname: Immobilon) aufgetragen. Nach dem Blotting
wurde die Membran getrocknet und in insgesamt 12 Stücke geschnitten.
Jedes Stück
wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur (RT) mit jedem Serum (1:500
Verdünnung)
inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit PBS wurde die Membran 1
Stunde lang bei RT mit Ziegen-Anti-Hühner-IgG (H+L), konjugiert
mit Alkalischer Phosphatase (Verdünnung 1:1000; Bethyl, Inc.
Katalog-Nr. A30-106AP) inkubiert, mehrmals mit PBS gewaschen und
mit der Substratlösung
von Bromchlorindolylphosphat/Nitroblautetrazolium (BCIP/NBT) entwickelt.
Alle 10 Seren, die aus immunisierten Hühnern präpariert wurden, reagierten
spezifisch auf etwa 60-kDa-Protein von Sporozoiten, während zwei
negative Kontrollseren nicht reagierten, obwohl es einige Proteine
gab, die unspezifisch reagierten. Diese Ergebnisse zeigten an, dass
das antigene Protein von Eimeria-AMA-1 bei Hühnern humorale Immunität induzieren
kann und das Eimeria-AMA-1 von etwa 60 kDa in den E.-tenella-Sporozoiten.
exprimiert wird.
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Beispiel 5
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Immunantworten von Hühnern, denen DNA-Impfstoff
injiziert wird, der Eimeria-AMA-1-Gen
enthält
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Das
Plasmid pNZ45/46BacpA, das in den Beispielen von
US-Patent 6,764,684 beschrieben ist,
wurde als Gerüstplasmidvektor
für DNA-Impfstoff
verwendet.
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Um
das DNA-Fragment zu erhalten, das Restriktionsenzym-Schnittstellen
vor und nach dem ORF von Eimeria-AMA-1 enthält, wurde eine PCR durchgeführt, wobei
pBS-EtAMA1 als Matrize und der Primersatz XbaAMA1 (SEQ ID Nr. 12)
und AMA1endSal (SEQ ID Nr. 13) verwendet wurde.
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Die
amplifizierte DNA von 1,6 kbp wurde mit XbaI und SalI geschnitten
und in XbaI/SalI-Stellen von pNZ45/46BacpA (7,4 kb) eingefügt. Das
resultierende Plasmid p45BacEtAMA1 (9 kbp) könnte als DNA-Impfstoff und/oder
homologer Vektor für
die Konstruktion von rekombinantem Herpesvirus des Truthahns verwendet
werden.
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Dann
wurde zur Bewertung des Plasmids für DNA-Impfstoff eine Konfrontation
von immunisierten Hühnern
mit Eimeria tenella durchgeführt.
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Befruchtete
SPF-Eier der Linie M wurden vom NIPPON INSTITUTE FOR BIOLOGICAL
SCIENCE, Japan, bezogen und ausgebrütet. Die geschlüpften Hühner wurden
in drei Gruppen eingeteilt. 1 mg des Plasmids p45BacEtAMA-1 und
jeweils 0,1 mg des Adjuvans CpG (SEQ ID Nr. 14) und CpG-30 (SEQ
ID Nr. 15) wurden mit 1 ml PBS verdünnt und zweimal im Alter von
2 und 9 Tagen durch in-vivo-Elektroporation (bei 50 V, 20 μs dreimal
und noch dreimal mit umgekehrter Polarität unter Verwendung von Model
ECM830; Gentronics Inc., San Diego, USA) subkutan in den Beinmuskel
von Hühnern
aus einer Gruppe eingeimpft. Die Hühner der anderen beiden Gruppen
wurden nicht geimpft.
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Vier
Wochen später
(im Alter von 37 Tagen) wurden die Körpergewichte von allen Hühnern gemessen. Die
Hühner
wurden außer
einem aus zwei nichtimmunisierten Gruppen oral (in den Schlund der
Hühner)
mit 1000 sporulierten Oocysten des E.-tenella-Stamms Rt7 (aus japanischem
Feld isoliert) konfrontiert. Nicht konfrontierte Hühner bildeten
die negative Kontrolle (nicht immunisiert und nicht konfrontiert).
Alle Hühner
wurden bis 8 Tage nach der Konfrontation beobachtet und zur Messung
des Körpergewichts
vorbereitet. Kot wurde 5 bis 8 Tage nach der Konfrontation gesammelt,
und Oocysten aus dem Kot wurden durch das Schwimmverfahren in gesättigter
Kochsalzlösung überprüft. Wenn
im Kot Oocysten nachgewiesen wurden, wurden die Oocysten des Kots
nach der Zentrifugation in Chromsulfatlösung mikroskopisch gezählt und
als Anzahl pro Gramm Kot berechnet. Die Ergebnisse der Gewichtszunahmen
und der Zahl der abgegebenen Oocysten im Kot für jede Gruppe sind in Tabelle
1 gezeigt.
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Tabelle
1 zeigt an, dass mit DNA-Impfstoff dieser Erfindung immunisierte
Hühner
sowohl in Bezug auf die Zahl der abgegebenen Oocysten im Kot als
auch in Bezug auf die Gewichtszunahme von der nichtimmunisierten
Konfrontationskontrolle statisch verschieden waren und dass DNA-Impfstoff
eine schützende
Immunität
gegenüber
Konfrontation durch Eimeria tenella induzieren könnte. Tabelle 1
Gruppe | Zahl der
Vögel | Bewertung |
abgegebene
Oocysten im Kot* | Gewichtszunahme (%) |
nicht
immunisierte, nicht konfrontierte Kontrolle | 12 | – | 35,2 ± 3,8 |
nicht
immunisierte Kontrolle | 10 | ++ | 17,9 ± 2,0 |
immunisiert
mit DNA-Impfstoff | 10 | + | 30,0 ± 3,0 |
- *: Zahl der Oocysten pro g
Kot 6 Tage nach der Konfrontation: (–) bedeutet "unter der Nachweisgrenze" (103), (+)
bedeutet weniger als 106, (++) bedeutet über 106.
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