DE69432137T2

DE69432137T2 - Impfstoff gegen Geflügelkokzidose

Info

Publication number: DE69432137T2
Application number: DE69432137T
Authority: DE
Inventors: Janene Marilyn Bumstead; Paul Patrick James Dunn; Fiona Margaret Tomley; Arnoldus Nicolaas Vermeulen
Original assignee: Akzo Nobel NV
Current assignee: Akzo Nobel NV
Priority date: 1993-11-12
Filing date: 1994-11-09
Publication date: 2003-11-06
Anticipated expiration: 2014-11-10
Also published as: JPH07196690A; US5795741A; ES2192559T3; US5843722A; DE69432137D1; NZ264914A; AU684317B2; EP0653489A1; EP0653489B1; HUT69924A; ATE232903T1; HU217022B; AU7881194A; CA2135547A1; DK0653489T3; ZA948983B; US5614195A; PT653489E

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Protein, das von einer Eimeriaspezies stammt, insbesondere Eimeria maxima, die in der Lage ist, immunaktive Lymphozyten zu stimulieren. Sie bezieht sich auch auf eine Nukleinsäuresequenz, die alle oder einen antigenen Teil oder mehrere Teile dieses Proteins kodiert, einen rekombinanten Vektor, der solch eine Nukleinsäuresequenz umfasst, eine Wirtszelle oder einen Organismus, der durch solch einen rekombinanten Vektor transformiert wird, und auf einen Impfstoff zum Schutz des Geflügels vor Kokzidiose.
Die Kokzidiose ist eine Erkrankung, die durch eine Infektion mit einer oder mehreren der vielen Spezies der Kokzidia verursacht wird, welche intrazelluläre, protozoische Parasiten des Unterstamms Apicomplexa und dem Genus Eimeria sind. Geflügel ist hierin definiert als domestizierte Vögel, die als Quelle für Eier und Fleisch dienen und die kommerziell wichtigen Sorten beinhaltet wie Hühner, Puter, Enten, Gänse, Guineageflügel, Fasane, Tauben und Pfau.
Es ist bekannt, dass die Kokzidiose bei Hühnern durch einige unterschiedliche Spezies von Eimeria, namentlich Eimeria acervulina, E. maxima, E. tenella, E. necatrix, E. brunetti, E. mitis, E. praecox, E. mivati und E. hagani, verursacht wird. Einige bezweifeln allerdings die wahre Existenz der letzten beiden Spezies. Infektionen auf niedrigem Niveau mit einer dieser Eimeriaspezies bewirkt einen Immunschutz vor einer Reinfektion.
Die Spezies unterscheiden sich bei Hühnern in ihrer pathogenen Wirkung, wobei auch die Hühnerart eine Rolle spielt; daher wird ein Brathähnchen einen grossen Schaden durch einen Parasiten wie E. acervulina oder E. maxima erleiden, weil diese Parasiten grosse Teile des Dünndarms befallen, wo die Nahrungsverdauung eine wichtige Rolle spielt.
E. maxima ist von den oben genannten die am stärksten immunogen wirksame Spezies, die einen guten natürlichen Schutz nach der Infektion verursacht. Es gibt trotzdem Stammvarianten mit geringer oder keiner Kreuzimmunität zwischen den Stämmen.
Während des Lebenszyklus durchläuft der Eimeriaparasit eine Vielzahl von Stadien. Der Lebenszyklus beginnt, wenn das Huhn das infektiöse Stadium als sporulierende Oozyste bei der Bodenfütterung oder durch Inhalation von Staub aufnimmt. Im Fall von E. maxima ist die sporulierende Oozyste ungewöhnlich gross. Die Wand der sporulierenden Oozyste wird durch eine Kombination von mechanischen Verdauungsvorgängen und chemischen Vorgängen im Muskelmagen oder Darm zerstört, was zur Abgabe von 4 Sporozysten führt. Die Sporozysten erreichen das Duodenum, wo sie dem Gallensaft und den Verdauungsenzymen ausgesetzt werden, was zur Freigabe von durchschnittlich zehn Sporozoiten pro Sporozyste führt.
Die Sporozoiten sind beweglich und suchen nach geeigneten epithelialen Wirtszellen, um in sie einzudringen und sich in ihnen zu reproduzieren. Auf die Infektion einer Epithelzelle folgt das Eintreten des Parasiten in die Schizontenphase seines Lebenszyklus, wo er erst 8, dann 16 und dann > 200 Merzoiten pro Schizont produziert. Sobald sie von dem Schizonten abgegeben werden, können die Merozoiten weitere Epitelialzellen infizieren. Nach zwei bis fünf dieser ungeschlechtlichen Reproduktionszyklen wachsen die intrazellulären Merozoiten zu geschlechtlichen Formen an, bekannt als die weibliche Makrogametozyte und die männliche Mikrogametozyte. Nach der Befruchtung der Makrogametozyte durch die Mikrogameten, die von der Mikrogametozyte abgegeben werden, wird eine Zygote gebildet, die eine Zystenwand um sich aufbaut. Die neu gebildete Oozyste wird von dem infizierten Huhn mit den Ausscheidungen ausgeschieden.
Unter den richtigen Umgebungsbedingungen bezüglich Temperatur, Feuchtigkeit und genügendem Sauerstoffgehalt in der Luft wird die Oozyste in das infektiöse Stadium sporulieren, bereit einen neuen Wirt zu infizieren und dabei die Erkrankung zu verbreiten. Somit wird für den Transport des Parasiten von Vogel zu Vogel kein intermediärer Wirt benötigt.
Die Auswirkung der parasitären Eimeriainfektion des Verdauungstrakts eines Huhns können eine Verminderung der Gewichtszunahme, verschlechterte Futterverwertung, verminderte Eiproduktion und in vielen Fällen der Tod sein. Die Zunahme intensiver Huhnproduktion ist durch gravierende Verluste durch diesen Parasiten begleitet worden; tatsächlich ist die Kokzidiose zur ökonomisch wichtigsten, parasitären Erkrankung geworden. In den Niederlanden erleiden die Besitzer von Hühnerfarmen jedes Jahr Verluste von Millionen von Gulden; 1986 betrug der Verlust 13 Millionen Gulden. In dem gleichen Jahr wurde in den Vereinigten Staaten 300 Millionen Dollar Verluste gemacht.
In der Vergangenheit sind verschiedene Verfähren angewendet worden, um die Kokzidiose zu kontrollieren. Vor der Anwendung chemotherapeutischer Stoffe wurde als Hauptmassnahme eine verbesserte Reinigung durch Verwendung von Desinfektionsmitteln zusammen mit der mechanischen Entfernung des Schmutzes angewendet; allerdings verblieben genügend Oozysten, um die Erkrankung auszubreiten.
Die Einführung von kokzidiosestatischen Stoffen in der Nahrung oder im Trinkwasser in Verbindung mit einer guten Haltung bewirkten einen Fortschritt in der Kontrolle der Erkrankung. Es stellte sich heraus, dass solche Stoffe an einer Abnahme der Wirksamkeit über die Jahre litten, was teilweise auf die Entwicklung von resistenten Kokzidiosestämmen zurückzuführen ist. Zudem wurde festgestellt, dass einige Chemotherapeutika Spuren im Fleisch hinterliessen, was den Verzehr ungeeignet machte.
Es wurden auch Versuche unternommen, die Erkrankung auf immunologische Weise zu kontrollieren, indem eine Lebendvakzine, die Oozysten von allen 7 Eimeria-Spezies umfasst, verabreicht wurde, wobei die verabreichten Oozysten von präkokzidiären Linien stammten. Solche präkokzidiären Linien werden gewonnen, indem man Hühner mit einer Wildpopulation einer Eimeriaspezies impft und die allerersten Parasiten sammelt, die als Ergebnis der Infektion ausgeschieden werden. Die gesammelten Parasiten werden den Hühnern wieder zugeführt und der Zyklus wird einige Male durchlaufen. Tatsächlich wird eine präkokzidiäre Linie des Parasiten hergestellt, die weniger Zyklen der ungeschlechtlichen Reproduktion in den Gedärmen hat. Somit behalten solche Linien ihre Immunogenität, während sie weniger Parasiten in dem Darm produzieren und dadurch einen geringeren, nachfolgenden Schaden beim Wirt verursachen. Der Nachteil dieses Impfstofftyps ist, dass die Herstellung teuer ist, weil es notwendig ist, ihn in lebenden Hühnern mit geringem, reproduktivem Potential zu produzieren.
Das Aufkommen der Gentechnologie hat neue Verfahren zur Herstellung wirksamer Impfstoffe bereitgestellt. Bei Verwendung dieser Verfahren ist die DNA, die die antigenen Proteine einiger pathogener Mikroorganismen kodiert, in solchen Wirtsorganismen wie Escherichia coli geklont worden, mit dem Ergebnis, dass das Protein in genügend hohem Ausmass exprimiert wurde, damit es in einen Impfstoff integriert werden kann. Der Vorteil von so hergestellten Proteinen ist, dass sie nicht infektiös und relativ billig in der Herstellung sind. Auf diese Weise sind Impfstoffe gegen eine Reihe von Viren wie Hepatitis, Herpes simplex und die Maul- und Klauenseuche hergestellt worden.
Es wurden Versuche unternommen, um gentechnologisch einen Kokzidioseimpfstoff herzustellen. Die Europäische Patentanmeldung Nr. 337589 beschreibt die Isolierung eines Gruppe B-Proteins von Eimeria tenella und die Insertion in einen neuartigen Vektor, welcher wiederum verwendet wurde, um geeignete Wirte zu transformieren. Die Internationale Anmeldung (PCT) WO 92/04461 beschreibt die Konstruktion eines Mikroorganismus, der ein antigenes Protein herstellt, indem er entweder den mRNA-Weg oder den nukleären DNA-Weg verwendet. Auf diese Weise wurden bestimmte Antigene von E. tenella und E. maxima hergestellt und sequenziert. Für die Ausführung dieses Weges zur Herstellung von Antigenen für die Integrierung in Impfstoffe bedarf es nur der Auswahl von Antigenen, die Antikörper in einer heterologen Spezies induzieren könnten. Dieser Ansatz endet nicht unweigerlich in der Auswahl des Antigens mit der protektivsten Wirkung. Von H. S. Lillehoj (Vet. Immunol. Immunopath., 13, 312-330, 1986) kann entwickelt werden, dass bei Hühnern, die mit Kokzidia infiziert sind, eine schützende Immunität durch Auslösen einer speziesspezifischen T-Zellantwort erreicht werden kann.
Es ist nun nachgewiesen worden, dass durch Fraktionierung der Eimeriaparasiten und Selektion von Proteinen, die immunkompetente T-Lymphozyten stimulieren, sowie die darauffolgende Herstellung von Vektoren, die die Nukleinsäure beinhalten, die solche Proteine kodieren, und die anschliessende Herstellung eines Impfstoffes, der ein solches Protein beinhaltet, ein Kokzidioseimpfstoff mit einem wirksameren Schutz hergestellt werden kann.
Ein Gesichtspunkt der Erfindung bezieht sich auf T- Lymphozyten stimulierende Eimeriaproteine, die die Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID Nr. 2 dargestellt wird, oder wenigstens ein T-Lymphozyten stimulierenden Teil oder ein biologisch funktionales Äquivalent davon umfasst, wobei der genannte Teil oder das Äquivalent eine oder mehrere immunogene Determinanten auf dem Protein zurückbehält, welches die in SEQ ID Nr. 2 dargestellte Aminosäuresequenz umfasst, die fähig ist eine T- Lymphozyten-stimulierende Immunantwort beim Geflügel auszulösen.
Solch ein Protein ist im Wesentlichen frei von dem gesamten Parasiten oder anderen Proteinen, mit denen sie normalerweise verbunden sind.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf die Nukleinsäuresequenzen, die solche T-Lymphozyten stimulierende Eimeriaproteine kodieren.
Solch eine Nukleinsäuresequenz kann operativ an die Expressionskontrollsequenzen gebunden sein, wobei ein rekombinantes Nukleinsäuremoleküle entsteht, das, wenn es in einen geeigneten Vektor eingefügt wird, einen rekombinanten Vektor ergibt, der in der Lage ist, die Nukleinsäuresequenz zu exprimieren.
Der genannte, rekombinante Vektor oder eine Nukleinsäuresequenz, wie sie oben beschrieben wurde, kann für die Transformierung einer Wirtszelle oder eines Organismus verwendet werden. Solch eine transformierte Wirtszelle oder Organismus kann wiederum für die Herstellung des stimulierenden Proteins für die Inkorporation in einen Impfstoff zum Schutz des Geflügels vor Kokzidiose verwendet werden. Alternativ kann die transformierte Wirtszelle oder Organismus selber in den Impfstoff integriert werden.
Im Allgemeinen bezieht sich der Begriff "Protein" auf eine molekulare Kette von Aminosäuren mit einer biologischen Aktivität. Ein Protein hat keine spezifische Länge und kann, falls erwünscht, in vivo oder in vitro durch zum Beispiel Glykolysierung, Amidierung, Carboxylierung oder Phosphorylierung modifiziert werden; somit sind umgekehrt Peptide, Oligopeptide und Polypeptide auch in die Definition mit eingeschlossen.
Die biologisch funktionalen Äquivalente oder Varianten der Eimeriaproteine, die explizit hierin eingeschlossen sind, sind Proteine, die von den oben genannten Aminosäuresequenzen stammen, die zum Beispiel durch Deletionen, Insertionen und/oder Substitutionen einer oder mehrerer Aminosäuren entstanden sind, aber die eine oder mehrere, immunogene Determinanten des Eimeria-Antigens behalten, d. h. genannte Varianten eine oder mehrere Epitope besitzen, die in der Lage sind, eine Immunantwort in einem Wirtstier auszulösen.
Es wird vorausgesetzt, dass für die einzelnen Proteine, die hierin eingeschlossen sind, natürliche Varianten zwischen individuellen Eimeriaparasiten oder -stämmen existieren können. Diese Varianten können sich als Unterschied(e) in der Aminosäure innerhalb der Gesamtsequenz oder durch Deletionen, Substitutionen, Insertionen, Inversionen oder Additionen einer oder mehrerer Aminosäuren in der genannten Sequenz darstellen. Aminosäuresubstitutionen, die die biologischen und immunologischen Aktivitäten nicht im Wesentlichen verändern, sind von Neurath et al. in "The Proteins", Academic Press New York (1979) beschrieben worden. Austausch von Aminosäuren zwischen verwandten Aminosäuren oder Austauschvorgänge, die häufiger in der Evolution stattgefunden haben, sind unter anderem Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, Ile/Val (siehe Dayhoff, M. D., Atlas of Protein sequence and structure, Nat. Biomed. Res. Found, Washington D. C., 1978, Vol. 5, Suppl. 3). Andere Aminosäuresubstitutionen schliessen Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Leu/Ile, Leu/Val und Ala/Glu. Auf dieser Information basierend entwickelten Lipman und Pearson ein Verfahren für den schnellen und sensitiven Proteinvergleich (Science, 227, 1435-1441, 1985) sowie zur Bestimmung der funktionalen Ähnlichkeit zwischen homologen Proteinen. Solche Aminosäuresubstitutionen der exemplarischen Ausführungsformen dieser Erfindung liegen so lange im Bereich der Erfindung, wie die sich ergebender. Proteine ihre Immunreaktivität bewahren.
Die Erfindung stellt weiter isolierte und gereinigte Nukleinsäuresequenzen bereit, die die oben erwähnten Eimeriaproteine kodieren. Solche Nukleinsäuresequenzen sind in SEQ ID Nr. 1 dargestellt. Im Stand der Technik ist bekannt, dass die Degeneration des genetischen Codes Basensubstitutionen im Kodon erlaubt, die ein anderes Kodon ergeben, aber weiter dieselbe Aminosäure kodieren, z. B. das Kodon für die Aminosäure Glutaminsäure ist sowohl GAT als auch GAA. Daher ist es klar, dass für die Expression eines Proteins mit der Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID Nr. 2 dargestellt wird, die Nukleinsäuresequenz eine Kodonzusammensetzung haben kann, die sich von der Nukleinsäuresequenz, wie sie in SEQ ID Nr. 1 dargestellt wird, unterscheidet.
Eimeria maxima-Parasiten wurden durch Hühnerpassagen hergestellt, wie es von Long et al. (Folio Vet., Lat., 1976, 6, 201-207) beschrieben wurde. Oozysten wurden aus dem Kot der infizierten Hühner isoliert, sporuliert und dann durch Spülung in gesättigtem Natriumchlorid gereinigt. Die sporulierenden Oozysten wurden dann für die Infizierung von pathogenfreien, 4 Wochen alten Hühnchen verwendet. Eine weitere Dosis von sporulierenden Oozysten wurde den Vögeln zur Auffrischung ihrer Immunantwort verabreicht.
Eine Zubereitung aus sporulierenden Oozysten, die durch die oben beschriebene Spülung gereinigt wurden, wurde einer Vibration durch einen Desintegrator zugeführt, um die Sporozoiten freizusetzen. Die Sporozoiten wurden mit proteolytischen Enzymen behandelt, um die Sporozoiten freizusetzen, die dann gewaschen und durch Ionenaustauschchromatographie entsprechend dem Verfahren von Schmatz et al. (J. Protozool., 1984, 31, 181-183) gereinigt wurden. Die Sporozoiten wurden dann in Pufferlösung suspendiert, in einem Wasserbad gekocht und vor dem Beladen auf ein Polyacrylamidgel für die SDS-PAGE ("sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel elctrophoresis") kurz zentrifugiert. Molekularmassenmarker liess man auf demselben Gel mitlaufen, um die Molekularmasse der Eimeria-Antigene zu extrapolieren. Das Gel wurde auf Nitrozellulosepapier entsprechend dem Verfahren von Towbin und Gordon (J. Immunol. Methods, 1984, 72, 313-340) laufen gelassen. Das Nitrozellulosepapier wurde dann gewaschen und durch Aurodye-Färbung entsprechend den Anweisungen des Herstellers sichtbar dargestellt.
Proteinbanden wurden aus dem Nitrozellulosepapier herausgeschnitten, in kleine Stücke geschnitten und in Glasskolben gegeben. Die Nitrozellulosestücke wurden dann in Dimethylsulphoxid (DMSO) löslich gemacht und für eine vollständige Solubilisierung eine Zeitlang stehen gelassen, woraufhin die Nitrozelluloseteilchen durch tropfenweise Zugabe von Carbonat/Bicarbonatpuffer mit kräftigem Vortexen präzipitiert wurden. Die Proben wurden dann zentrifugiert, die Pellets der Nitrozelluloseteilchen wurden einige Male gewaschen, wonach sie wieder zurücksuspendiert wurden und in kleine Aliquote geteilt wurden.
Um zu bestimmen, ob eine der Proteinbanden von dem Elektrophoresegel die Lymphozyten von den infizierten Vögeln stimulierte, wurde den, wie oben beschrieben, infizierten Vögeln durch Venenpunktion Blut für ein Lymphozytenproliferations-Assay entnommen. Das Blut wurde mit 600 g zentrifugiert, nach 10 Minuten wurde die Zellsuspension oberhalb der sedimentierten Erythrozyten entnommen und für weitere 10 Minuten mit 400 g zentrifugiert. Die Zellen, die nach der zweiten Zentrifugation verblieben, wurden einige Male gewaschen und schliesslich zurücksuspendiert. Die resuspendierten Zellen wurden in Platten mit rundem Boden zusammen mit den verdünnten, resuspendierten Nitrozelluloseteilchen kultiviert. Kontrollwannen mit Nitrozelluloseteilchen, die frei von Protein sind, wurden angesetzt.
Die Lymphozytenkulturen wurden über 96 Stunden inkubiert, wobei während der letzten 16 Stunden die Kulturen mit 3H- Thymidin gepulst wurden, anschliessend wurden die Zellen auf Glasmikrofaserfiltern geerntet. Nach dem Trocknen wurden die Filter in Szintillationsgefässe getan, denen ein flüssiger Szintillationscocktail (Scintillator 299 [registrierter Handelsname] Packard, Caversham, U.K.) zugefügt wurde, und die Radioaktivität in einem Szintillationsspektrophotometer gemessen. Die Ergebnisse wurden als Stimulationsindex (SI) dargestellt, der durch folgende Formel bestimmt wurde:
SI = cpm1/cpm2
worin:
cpm1 = durchschnittliche Impulse pro Minute der Dreifach-Kulturen, die mit Protein-enthaltenden NC- Teilchen inkubiert wurden.
cpm2 = durchschnittliche Impulse pro Minute der Dreifach-Kulturen, die mit Proteinfreien NC- Teilchen inkubiert wurden.
Durch dieses Verfahren proliferierten die meisten T- Lymphozyten.
Die Ergebnisse zeigten, dass obwohl der Stimulationsindex bei verschiedenen Vögeln und verschiedenen Gels variierte, eine Proteinbande mit einer relativen Molekularmasse von ungefähr 70 000 D eine konstante Stimulation der Lymphozyten von immunisierten Vögeln bewirkte, aber nicht von den Kontrollvögeln.
Anschliessend an diese Entdeckung wurde eine frische Zubereitung von E. maxima-Sporozoiten durch SDS-PAGE getrennt und wie oben beschrieben auf Nitrozellulose übertragen. Eine Proteinbande mit einer Molekularmasse von 70 000 D (p70) wurde herausgeschnitten, wie beschrieben in Lösung gebracht, in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und dann wieder in PBS suspendiert. Mit dieser Suspension wurden Hasen subkutan geimpft, wobei die Injektionen alle 2 Wochen wiederholt wurden. Zwei Wochen nach jeder Injektion wurde den Hasen durch Punktion der linken Ohrvene Blut entnommen. Ein durch Western-Blot bestätigtes anti-p70-Hasenserum wurde nach 5 Auffrischimpfungen gewonnen.
Die gesamte Ribonukleinsäure (RNA) wurde durch Zentrifugation mit Hilfe eines Gradienten von Cäsiumtrifluoracetat von E. maxima-Sporozoiten extrahiert und gereinigt. Um die Messenger-RNA (mRNA) von der non-mRNA zu trennen, wurden Säulen mit oligo-dT-ZELLULOSE (poly[A]Quik, Stratagene) nach Vorschrift des Herstellers verwendet. Die poly(A) + RNA oder mRNA wurde dann über Nacht unter Verwendung von Natriumacetat in reinem Alkohol aus der Säule herausgelöst.
Die Copy-Desoxyribonukleinsäure (cDNA) wurde aus der mRNA mit einem ZAP-cDNA-(eingetragener Handelsname) Synthesekit (Stratagene) synthetisiert. Der erste Strang der cDNA wurde mit einer oligo-dT-Template (eine XhoI-Restriktionsstelle beinhaltend) und der Moloney-Mäuse-Leukämievirusreversetranskriptase synthetisiert. Die Cytosinreste im ersten Strang der cDNA wurden methyliert, um die cDNA vor der Verdauung durch Restriktionsenzyme zu schützen, die später im Klonierungsprotokoll verwendet werden. Der zweite Strang der cDNA wurde mit RNAse H und DNA-Polymerase I synthetisiert, gefolgt von einem Reparieren der Enden mit T4-DNA-Polymerase. EcoRI-Adapter wurde an der cDNA mit stumpfen Enden durch eine T4-DNA-Ligase legiert. Verdauung mit XhoI erzeugte eine cDNA mit einem XhoI kompatiblen 3'- Ende und einem EcoRI kompatiblen 5'-Ende.
Die cDNA wurde an einen durch EcoRI/XhoI verdauten und dephosphorylierten Uni-ZAPXR-Vektor unter Verwendung einer T4-DNA-Ligase ligiert. Die sich ergebenden, primären Bibliotheken (Emx8 und Emx9) wurden plattiert und auf E. coli SURE-Zellen amplifiziert. Es wurde nachgewiesen, dass die Emx8-Bibliothek 65% der Rekombinanten lieferte, während die Emx9-Bibliothek 55% der Rekombinanten lieferte.
Die beiden Bibliotheken, Emx8 und Emx9, wurden mit Hilfe von anti-p70-Hasenserum, das wie oben beschrieben hergestellt wurde, gescreent. Positive Plaques wurde herausgenommen und wiederholt gescreent, bis die Positiven reine Plaques waren.
Die cDNA der Klone in den zwei Bibliotheken, Emx8 und Emx9, wurde in pUC19-Plasmid subkloniert und durch Verdau mit Restriktionsendonukleasen analysiert. Alternativ wurden die cDNAs einer Plasmidgewinnung aus lambda-ZAP unter Anwendung einer in vivo Exzision unterzogen und anschliessend durch Restriktionsenzymverdau analysiert.
Auf diese Weise wurden einige, unterschiedliche Klone identifiziert. Ausgewählte Antiseren für zwei der Klone kreuzreagierten mit verschiedenen Flecken, die durch die anti-p70-Antiseren auf Blots von E. maxima-Sporozoiten erkannt wurden, die durch 2d-PAGE getrennt wurden, dann wurden diese Klone für die DNA-Sequenzanalyse ausgewählt. Dies wurde mittels Zufallssubklonierung und Sequenzierung unter Anwendung der M13/Didesoxynukleotid- Kettenbeendigungsmethode durchgeführt, die von Bankier et al. (Techniques in the Life Sciences (Biochemistry) 85: techniques in Nucleic Acids Biochemistry 1-34, 1983) beschrieben wurde.
Eine Nukleinsäuresequenz gemäss der vorliegenden Erfindung kann von einem Eimeria maxima-Stamm isoliert und durch rekombinante DNA-Techniken, einschliesslich der Polymerasekettenreaktions(PCR)-Technologie, vervielfacht worden sein oder sie kann chemisch in vitro durch im Stand der Technik bekannte Techniken synthetisiert worden sein.
Eine Nukleinsäuresequenz gemäss der Erfindung kann an verschiedenen DNA-Sequenzen, die die Replikation betreffen, ligiert werden, obwohl sie nicht mit ihnen natürlicherweise assoziiert oder verbunden sind, wobei ein so genannter rekombinanter Vektor entsteht, der für die Transformation eines geeigneten Wirts verwendet werden kann. Geeignete, rekombinante Vektoren stammen vorzugsweise von Plasmiden, Bakteriophagen, Cosmiden oder Viren.
Spezifische Vektoren oder Klonierungsvehikel, die dazu verwendet werden können, erfindungsgemässe Nukleinsäuresequenzen zu klonen, sind im Stand der Technik bekannt und beinhalten unter anderem Plasmidvektoren, wie pBR322, verschiedene pUC, pGEM und Bluescript-Plasmide, Bakteriophagen, z. B. lamdagt-Wes, Charon 28 und die von M13 stammenden Phagen, oder virale Vektoren, wie SV40, Adenovirus oder Polyomavirus (siehe auch: Rodriguez, R. L. und D. T. Denhardt, ed., Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Butterworths, 1988; Lenstra, J. A. et al., Arch. Virol., 110, 1-24, 1990). Die Verfahren, die für die Konstruktion eines erfindungsgemässen, rekombinanten Vektors zu verwenden sind, sind den im Stand der Technik Erfahrenen bekannt und sind unter anderem bei Maniatis. T. et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, second edition; Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) fortgeführt.
Zum Beispiel kann die Insertion einer erfindungsgemässen Nukleinsäuresequenz in einen Klonierungsvektor leicht erreicht werden, indem die Gene sowie das gewünschte Klonierungsvehikel mit demselben Restriktionsenzym oder -enzymen geschnitten werden, da hierdurch komplementäre DNA-Termini hergestellt werden.
Alternativ hierzu kann es notwendig sein, die Restriktionsstellen, die erstellt wurden, entweder durch Verdau der einsträngigen DNA oder durch Einfüllen der einsträngigen Termini mit einer geeigneten DNA-Polymerase in stumpfe Enden umzuwandeln. Anschliessend kann eine Ligation der stumpfen Enden mit einem Enzym, wie der T4 DNA-Ligase, durchgeführt werden.
Falls gewünscht kann jegliche Restriktionsstelle durch Ligation von Linkern auf die DNA-Termini hergestellt werden. Solche Linker können spezifische Oligonukleotidsequenzen, die Restriktionstellensequenzen kodieren, umfassen. Der durch ein Restriktionsenzym gespaltene Vektor und die Nukleinsäuresequenz können auch durch homopolymere Tailen verändert werden.
"Transformierung", wie es hierin verwendet wird, bezieht sich auf die Einführung einer heterologen Nukleinsäuresequenz in eine Wirtszelle, unabhängig von der verwendeten Methode, zum Beispiel durch "direct uptake" oder Transduktion. Die heterologe Nukleinsäuresequenz kann durch autonome Replikation erhalten werden oder kann alternativ in das Wirtsgenom integriert werden. Falls gewünscht werden die rekombinanten Vektoren mit geeigneten Kontrollsequenzen, die mit dem ausgewählten Wirt kompatibel sind, ausgerüstet. Diese Sequenzen können die Expression der eingefügten Nukleinsäuresequenz regulieren. Abgesehen von Mikroorganismen können auch Zellkulturen, die von mehrzelligen Organismen stammen, als Wirt verwendet werden.
Die rekombinanten, erfindungsgemässen Vektoren beinhalten vorzugsweise eine oder mehrere Markeraktivitäten, die für die Auswahl von gewünschten Transformanten verwendet werden können, wie die Ampicillin- und Tetrazyklinresistenz in pBR322, die Ampicillinresistenz und das _-Pepzid der β- Galaktosidase in pUC8.
Eine geeignete Wirtszelle ist ein Mikroorganismus oder eine Zelle, die durch eine Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid kodiert, oder durch einen rekombinanten Vektor, der eine Nukleinsäuresequenz umfasst, transformiert werden kann und die, falls gewünscht, für die Expression des genannten Polypeptids, das durch die genannte Nukleinsäuresequenz kodiert wird, verwendet werden kann. Die Wirtszelle kann von Prokaryoten stammen, z. B. Bakterien wie Escherichia coli, Bacillus subtilis und Pseudomonasspezies, oder von Eukaryoten stammen, wie Hefen, z. B. Saccharomyces cerevisiae oder höhere eukaryotische Zellen, wie Insekten-, Pflanzen- oder Säugetierzellen, einschliesslich HeLa-Zellen und chinesische Hamsterovarzellen (CHO). Insektenzellen beinhalten die Sf9- Zelllinie von Spodoptera frugiperda (Luckow et al., Biotechnology 6, 47-55, 1988). Informationen zum Klonen und zur Expression der Nukleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung in eukaryotischen Klonierungssystemen können bei Esser, K et al. (Plasmids of Eukaryotes, Springer-Verlag, 1986) nachgelesen werden.
Im Allgemeinen werden für die Konstruktion der rekombinanten Vektoren, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, Prokaryoten bevorzugt. Insbesondere sind E. coli-K12-Stämme geeignet, hier besonders DH5a oder MC1061- Stämme.
Für die Expression werden die Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung in einen Expressionsvektor eingeführt, d. h. dass die genannte Sequenzen operativ an die Expressionskontrollsequenzen gebunden werden. Solche Kontrollsequenzen können Promotoren, Verstärker, Operatoren, Induktoren, Ribosomenbindungsstellen usw. umfassen. Damit stellt die vorliegende Erfindung einen rekombinanten Vektor bereit, der eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die das oben identifizierte Eimeriaprotein kodiert, das operativ an Expressionskontrollsequenzen gebunden ist, die in der Lage sind, die darin enthaltenden DNA-Sequenzen in einer transformierten Wirtszelle oder in transformierten Wirtzellen zu exprimieren.
Selbstverständlich ist dies so zu verstehen, dass die Nukleotidsequenzen, die an einer ausgewählten Stelle des Klonierungsvektor eingefügt werden, Nukleotide beinhalten können, die nicht Teil des tatsächlichen, strukturellen Gens für das gewünschte Polypeptid sind, oder nur ein Fragment des vollständigen, strukturellen Gens für das gewünschte Protein beinhalten, so lange wie der transformierte Wirt ein Polypeptid herstellen wird, das wenigstens eine oder mehrere immunogene Determinanten eines Eimeriaproteinantigens besitzt.
Wenn die Wirtszellen Bakterien sind, beinhalten geeignete, zu verwendende Expressionskontrollsequenzen den Trp- Promotor und Operator (Goeddel et al., Nucl. Acids Res., 8, 4057, 1980); den lac-Promotor und Operator (Chang et al., Nature, 275, 615, 1978); den Aussenmembranprotein-Promotor (Nakamura, K. und Inouge, M., EMBO J., 1, 771-775, 1982); die Bakteriophagen-lambda-Promotoren und -Operatoren (Remaut, E. et al., Nucl. Acids Res., 11, 4677-4688, 1983); den _-Amylase (B. subtilis)-Promotor und -Operator, Terminierungssequenzen und andere Expressionsverstärker- und Kontrollsequenzen, die mit der ausgewählten Wirtszelle kompatibel sind. Wenn die Wirtszelle Hefe ist, beinhalten illustrative geeignete Kontrollsequenzen z. B. den _-mating Faktor. Bei Insektenzellen können die Polyhedrin- oder p10- Promotoren der Baculoviren verwendet werden (Smith, G. E. et al., Mol. Cell. Biol. 3, 2156-65, 1983). Wenn die Wirtszelle von Säugetieren stammt, können ausgesprochen geeignete Expressionskontrollsequenzen den SV-40-Promotor (Berman, P. W. et al., Science, 222, 524-527, 1983) oder den Metallthionin-Promotor (Brinster, R. L., Nature, 296, 39-42, 1982) oder einen heat shock-Promotor (Voellmy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4949-53, 1985) beinhalten. Alternativ können auch Expressionskontrollsequenzen, die in Eimeria vorhanden sind, angewendet werden. Für eine Maximierung der Genexpression siehe auch Roberts und Lauer (Methods in Enzymology, 68, 473, 1979).
Somit umfasst die Erfindung auch eine Wirtszelle oder Wirtszellen, die eine Nukleinsäuresequenz beinhaltet oder ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül oder einen rekombinanten Vektor, wie oben beschriebenen, der in der Lage ist, das Eimeriaprotein durch Expression der Nukleinsäuresequenz herzustellen.
Die Immunisierung des Geflügels gegen die Eimeria-Infektion kann durch Verabreichung eines erfindungsgemässen Protein im immunologischen Sinne als so genannter Untereinheitsimpfstoff an die Vögel erreicht werden. Der erfindungsgemässen Untereinheitsimpfstoff kann ein Protein in reiner Form, gegebenenfalls in Gegenwart von einem pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff umfassen. Das Protein kann gegebenenfalls an ein nicht verwandtes Protein kovalent gebunden sein, was bei der Reinigung des Fusionsprodukt von Vorteil sein kann. Beispiele hierfür können β-Galaktosidase, Protein A, Prochymosin, Blutgerinnungsfaktor Xa usw. sein.
In einigen Fällen kann die Fähigkeit eine schützende Immunität mit diesen Proteinen zu erreichen per se gering sein. Kleine Fragmente werden bevorzugt an Trägermoleküle konjugiert, um ihre Immunogenität zu steigern. Geeignete Trägerstoffe für diese Zwecke sind Makromoleküle wie natürliche Polymere (Proteine wie Napfschneckenhämocyanin, Albumin, Toxine), synthetische Polymere wie Polyaminosäure (Polylysin, Polyalanin) oder Micellen von amphiphilen Verbindungen wie Seifen. Alternativ können diese Fragmente als Polymere davon dienen, vorzugsweise lineare Polymere.
Falls benötigt können die erfindungsgemässen Proteine, die für den Impfstoff verwendet werden, in vitro oder in vivo modifiziert werden, zum Beispiel durch Glykolysierung, Amidierung, Carboxylierung oder Phosphorylierung.
Eine Alternative zu den Untereinheitsimpfstoffen sind die Lebendimpfstoffe. Eine erfindungsgemässe Nukleinsäuresequenz wird durch rekombinante DNA-Techniken in einen Mikroorganismus (z. B. ein Bakterium oder Virus) auf die Weise eingeführt, dass der rekombinante Mikroorganismus sich noch replizieren kann und damit ein Polypeptid exprimiert, das durch die eingeführte Nukleinsäuresequenz kodiert wird und eine Immunantwort in dem infizierten Wirtsvogel auslöst.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein rekombinanter Virusvektor, der eine oben beschriebene, heterologe Nukleinsäuresequenz umfasst, und fähig ist, die DNA-Sequenz in einer Wirtszelle oder in Wirtszellen oder in einem Wirtsvogel, der mit dem rekombinanten Virusvektor infiziert wurde, zu exprimieren. Der Ausdruck "heterolog" bezeichnet, dass die erfindungsgemässe Nukleinsäuresequenz normalerweise in dem Virusvektor natürlicherweise nicht vorkommt.
Im Weiteren umfasst die Erfindung auch eine Wirtszelle oder Wirtszellen oder eine Zellkultur, die mit dem rekombinanten Virusvektor infiziert ist oder sind, der fähig ist das Eimeria-Protein durch Exprimieren der Nukleinsäuresequenz herzustellen.
Zum Beispiel kann die gut bekannte Technik der homologen in vivo-Rekombination verwendet werden, um eine heterologe Nukleinsäuresequenz gemäss der Erfindung in das Genom des Virusvektors einzuführen.
Zuerst wird ein DNA-Fragment, das mit einer Insertionsregion des Vektorgenoms korrespondiert, d. h. einer Region, die für die Inkorporation einer heterologen Sequenz ohne Störung der essentiellen Funktionen des Vektors, wie jene, die notwendig für die Infektion und Replikation sind, in einen Klonierungsvektor gemäss den recDNA-Standardtechniken eingeführt. Insertionsregionen sind für eine grosse Anzahl von Mikroorganismen bekannt (z. B. EP 80806, EP110385, EP83286, EP314569, WO 8802022, WO 8807088, US 4769330 und US 4722848).
Zweitens, kann, falls gewünscht, eine Deletion in die Insertionsregion, die in dem im ersten Schritt gewonnenen, rekombinaten Vektormolekül vorhanden ist, eingeführt werden. Dies kann zum Beispiel mit Restriktionsenzymen durch entsprechenden Exonukleaseverdau oder Behandlung von dem rekombinanten Vektormoleküls vom ersten Schritt erreicht werden.
Drittens wird die heterologe Nukleinsäuresequenz in die Insertionsregion, die in dem rekombinanten Vektor des ersten Schritts vorhanden ist, oder Anstelle der DNA, die von dem genannten Vektor deletiert wurde, eingefügt. Die DNA-Sequenz der Insertionsregion sollte eine entsprechende hänge haben, um zu ermöglichen, dass eine homologe Rekombination mit dem Vektorgenom stattfindet. Danach können geeignete Zellen mit dem Wildtyp des Virusvektors oder dem Virus, der transformiert wurde mit genomischer Vektor-DNA in Anwesenheit des rekombinanten Vektors, der die Insertion beinhaltet, die durch die entsprechenden Vektor-DNA-Sequenzen flankiert wird, wobei die Rekombination zwischen den korrespondierenden Regionen in dem rekombinanten Vektor und dem Vektorgenom stattfindet, infiziert werden. Rekombinante Vektornachfahren können nun in Zellkulturen hergestellt werden und können genotypisch oder phänotypisch durch z. B. Hybridisierung, Nachweis von Enzymaktivitäten, die durch ein mit der homologen Nukleinsäuresequenz eingeführtes Gen kodiert werden, oder den Nachweis von antigenen, heterologen Polypeptiden, die durch den rekombinanten Vektor immunologisch exprimiert werden, selektioniert werden.
Weiter können diese rekombinanten Mikroorganismen an das Geflügel für eine Immunisierung verabreicht werden, woraufhin sie selber für einige Zeit erhalten bleiben oder sich sogar in dem Körper des geimpften Tieres replizieren und dabei in vivo ein Polypeptid exprimieren, das durch die eingefügte, erfindungsgemässe Nukleinsäuresequenz kodiert wird, was zu einer Stimulierung des Immunsystems des geimpften Tieres führt. Geeignete Vektoren für die Inkorporierung einer erfindungsgemässen Nukleinsäuresequenz können von Viren, wie den Pockenviren, z. B. dem Impfvirus (EP 110385, EP 83286, US 4769330 und US 4722848) oder Geflügelpocken-Virus (WO 8802022), den Herpesviren, wie dem HVT (WO 8807088) oder dem Virus der Marek-Erkrankung, dem Adenovirus oder dem Influenzavirus, oder Bakterien wie E. coli oder spezifischen Salmonellenspezies stammen. Mit rekombinanten Mikroorganismen diesen Typs kann das Polypeptid, das in dem Wirtstier synthetisiert wird, als Oberflächenantigen erscheinen. In diesem Zusammenhang ist die Fusion des Polypeptids mit OMP-Proteinen oder Pilusproteinen von zum Beispiel E. coli oder der synthetische Ersatz von Signal- oder Ankersequenzen, die durch den Organsimus erkannt werden, vorstellbar. Es ist auch möglich, dass das Eimeria-Polypeptid, falls gewünscht, als Teil eines grösseren Ganzen, in dem zu immunisierenden Tier frei wird. Bei allen diesen Fällen ist es möglich, dass ein oder mehrere immunogene Produkte exprimiert werden, dass sie einen Schutz gegen verschiedene Pathogene und/oder gegen verschiedene Antigene eines gegebenen Pathogens erzeugen.
Ein erfindungsgemässer Vektorimpfstoff kann durch Kultivieren eines rekombinanten Bakteriums oder durch eine Wirtszelle, die mit einem rekombinanten Vektor infiziert wurde, der eine erfindungsgemässe Nukleinsäuresequenz umfasst, hergestellt werden, wonach das rekombinante Bakterium oder die Vektor beinhaltenden Zellen und/oder die rekombinanten Virusvektoren, die in den Zellen gewachsen sind, gesammelt werden können, gegebenenfalls in reiner Form, und zu einem Impfstoff, gegebenenfalls in lyophilisierter Form, verabreicht werden kennen.
Wirtszellen, die mit einem rekombinanten, erfindungsgemässen Vektor transformiert werden, können auch unter Bedingungen kultiviert werden, die geeignet für die Expression des Polypeptids sind, das durch die genannte Nukleinsäuresequenz kodiert wird. Impfstoffe können mit Hilfe von Proben der Rohkultur, von Wirtszelllysaten oder Wirtszellextrakten hergestellt werden, obwohl in einer anderen Ausführungsform gereinigtere, erfindungsgemässe Polypeptide zu einem Impfstoff verarbeitet werden, abhängig von seiner beabsichtigten Verwendung. Um die hergestellten Polypeptide zu reinigen, werden die Wirtszellen, die mit einem erfindungsgemässen, rekombinanten Vektor transformiert wurden, in geeigneter Menge kultiviert und die hergestellten Polypeptide von solchen Zellen oder von dem Medium, wenn das Protein sezerniert wird, isoliert. Polypeptide, die in das Medium sezerniert werden, können durch Standardverfahren isoliert und gereinigt werden, z. B. durch Salzfraktionierung, Zentrifugieren, Ultrafiltration, Chromatographie, Gelfiltration oder Immunaffinitätschromatographie, wohingegen innerzelluläre Polypeptide zuerst durch Sammeln der genannten Zellen, Zerstörung der Zellen, zum Beispiel durch Ultraschallbehandlung oder durch andere, mechanisch zerstörende Massnahmen wie der französischen Presse, gefolgt von der Trennung der Polypeptide von anderen intrazellulären Inhaltstoffen, isoliert und zu einem Impfstoff verarbeitet werden können. Eine Zellzerstörung kann auch durch chemische (z. B. EDTA oder Detergentien wie Triton X114) oder enzymatische Massnahmen, wie die Lysozymverdauung, erreicht werden.
Antikörper oder das Antiserum, das gegen ein erfindungsgemässes Polypeptid gerichtet ist, haben einen potentiellen Nutzen bei der passiven Immuntherapie, bei diagnostischen Immuntests und bei der Erzeugung von antiidiopathischen Antikörpern.
Die Eimeria-Proteine, wie sie oben beschrieben wurden, können für die Herstellung von polyklonalen, monospezifischen sowie monoklonalen Antikörpern verwendet werden. Wenn polyklonale Antikörper erwünscht sind, sind die Techniken zur Herstellung und Verarbeitung von polyklonalen Seren im Stand der Technik bekannt (z. B. Mayer und Walter, eds., Immunochemical methods in Cell and Molekular Biology, Academic Press, London, 1987). Monospezifische Antikörper als Immunogen können von polyspezifischen Antiseren affinitätsgereinigt werden, indem die Verfahren von Hall et al. modifiziert werden (Nature, 311, 379-387, 1984). Der monospezifische Antikörper, wie er hierin verwendet wird, ist eine Einfach- Antikörperspezies oder eine Mehrfach-Antikörperspezies mit homogenen Bindungseigenschaften für das relevante Antigen. Eine homogene Bindung, wie sie hierin verwendet wird, bezieht sich auf die Fähigkeit des jeweiligen Antikörpers ein spezifisches Antigen oder Epitop zu binden.
Monoklonale Antikörper, die mit Eimeria-Proteinen gemäss der vorliegenden Erfindung reagieren, können durch Immunisierung von Inzucht-Mäusen durch im Stand der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden (Kohler und Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975). Hybridomzellen wurden durch Wachsen in Hypoxanthin, Thymidin und Aminopterin in entsprechenden Zellkulturmedien, wie dem "Dulbecco's modifizierten Eagle's Medium", selektioniert. Antikörper bildende Hybridome werden geklont, vorzugsweise unter Verwendung der Soft-Agar-Technik von MacPherson (Soft Agar Techniques, Tissue Culture Methods and Applications, Kruse und Paterson, eds., Academic Press, 276, 1973). Einzelne Kolonien werden in eigene Wannen auf Kulturplatten für die Kultivierung in einem entsprechenden Kulturmedium übertragen. Antikörper bildende Zellen werden durch Screenen mit dem entsprechenden Immunogen identifiziert. Immunogen-positive Hybridomzellen werden durch im Stand der Technik bekannte Verfahren am Leben gehalten. Spezifische, anti-monoklonale Antikörper werden durch in vivo- Kultivierung der Hybridome oder durch Herstellung von Ascitesflüssigkeit von Mäusen, gefolgt von der Hybridominjektion durch Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, hergestellt.
Anti-idiotypische Antikörper sind Immunglobuline, die ein "internal image" des Antigens des Pathogens tragen, gegen den der Schutz erwünscht wird, und als Immunogen in einem Impfstoff verwendet werden können (Dreesman et al., J. Infect. Disease, 151, 761, 1985). Verfahren zum Züchten von anti-idiotypischen Antikörpern sind im Stand der Technik bekannt (MacNamara et al., Science, 226, 1325, 1984).
Der erfindungsgemässe Impfstoff kann in einem konventionellen Immunisierungsschema angewendet werden: einzelne oder wiederholte Verabreichung in einer mit der Dosierungsformulierung kompatiblen Weise und in solch einer Menge, dass er prophylaktisch wirksam ist, d. h. die Menge des immunisierenden Antigens oder rekombinanten Mikroorganismus, der in der Lage ist, das genannte Antigen zu exprimieren, die eine Immunität in Geflügel gegen eine Infektion durch virulente Eimeriaparasiten erzeugen kann. Immunität wird als die Induktion eines signifikanten Schutzgrades in einer Population von Hühnern nach der Impfung im Vergleich mit einer ungeimpften Gruppe definiert.
Neben einer Zunahme an Schutz wird ein Impfstoff, der das erfindungsgemässe Polypeptid umfasst, auch die Anzahl der Oozysten reduzieren, die vom infizierten Tier ausgeschieden werden. Normalerweise werden die ausgeschiedenen Oozysten andere Tiere in der Schar infizieren. Eine Verminderung der Anzahl von ausgeschiedenen Oozysten wird eine verminderte Anzahl von anschliessend infizierten Tieren bewirken und ebenso wird eine Verminderung der Anzahl von Oozysten den infektiösen Load vermindern.
Weiter kann ein Impfstoff auch ohne Wirkung auf den Parasiten selbst die Erkrankungsinzidenz vermindern. Dies tritt insbesondere dann ein, wenn die Symptome der Erkrankung durch die Stoffe verursacht werden, die von dem Parasiten abgegeben werden. Impfstoffe, die gegen derartige Stoffe gerichtet sind, die Symptome lindern ohne den Parasiten anzugreifen.
Bei viralen, Vektorlebendimpfstoffen kann die Dosis pro Huhn von 105-108 pfu variieren. Ein typischer Untereinheitsimpfstoff gemäss der Erfindung umfasst 1 ug- 1 mg des erfindungsgemässen Proteins. Derartige Impfstoffe können intradermal, subkutan, intramuskulär, intraperitoneal, intravenös, oral oder intranasal verabreicht werden.
Zusätzlich kann der Impfstoff auch ein wässriges Medium oder eine Wasser enthaltende Suspension enthalten, die oft mit anderen Bestandteilen gemischt ist, um die Aktivität und/oder die Gebrauchsfähigkeitsdauer zu erhöhen. Solche Bestandteile können Salze, pH-Puffer, Stabilisatoren (wie Magermilch oder Kaseinhydrolysat), Emulgatoren, Adjuvantien zur Verbesserung der Immunantwort (z. B. Öle, Muramyldipeptid, Aluminiumhydroxid, Seifen, Polyanione und aliphatische Substanzen) und Konservierungsstoffe sein.
Ein Impfstoff, der das erfindungsgemässe Polypeptid umfasst, kann auch andere immunogene Proteine von E. maxima oder immunogene Proteine von anderen Eimeriaspezies umfassen. Solch ein Kombinationsimpfstoff wird den Parasitenload in einer Schar vermindern und wird den Grad des Schutzes gegenüber Kokzidiose erhöhen.
Es ist offensichtlich, dass ein erfindungsgemässer Impfstoff auch Immunogene beinhalten kann, die anderen Geflügelpathogenen zugehören, oder Nukleinsäuresequenzen beinhalten können, die diese Immunogene kodieren, wie Antigene des Virus der Marek-Erkrankung (MDV), der Virus der Newcastle Erkrankung (NDV), Virus der infektiösen Bronchitis (IBV), das Hühneranämievirus (CAA), der Reovirus, der aviäre Retrovirus, der Geflügeladenovirus, der Putenrhino-tracheitisvirus oder E. coli, um multivalente Impfstoffe herzustellen.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein "immunchemisches" Reagenz, wobei das Reagenz ein erfindungsgemässes Protein umfasst. Der Ausdruck "immunchemisches Reagenz" bezeichnet, dass das erfindungsgemässe Protein an eine geeignete Trägersubstanz gebunden ist oder mit einer markierenden Substanz ausgestattet ist.
Die Trägersubstanzen, die verwendet werden können, sind zum Beispiel die innere Wand einer Mikrotestwanne oder eine Kuvette, ein Röhrchen oder Kapillare, eine Membran, ein Filter, ein Teststreifen oder die Oberfläche eines Teilchens, wie zum Beispiel ein Latexteilchen, ein Erythrozyt, eine Farbsalz, eine Metallsalz oder eine Metallverbindung als Salzteilchen.
Markierende Substanzen, die verwendet werden können, sind unter anderem ein radioaktives Isotop, eine fluoreszierende Verbindung, ein Enzym, ein Farbsalz, ein Metallsalz oder eine metallische Verbindung als Salzteilchen.
Eine erfindungsgemässe Nukleinsäuresequenz kann auch für die Erstellung von spezifischen Proben für Hybridisierungsexperimente zum Nachweis von Eimeria betreffenden Nukleinsäuren in irgendwelchen Gewebearten verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein Testkit, das die genannte Nukleinsäuresequenz umfasst, das für die Diagnose von Eimeriainfektionen geeignet ist.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Testkit, das in einem Immungssay verwendet werden kann, wobei dieses Testkit wenigstens ein erfindungsgemässes, immunchemisches Reagenz beinhaltet. Die immunchemische Reaktion, die bei Verwendung dieses Testkits stattfindet, ist vorzugsweise eine Sandwichreaktion, eine Agglutinierungsreaktion, eine kompetitive Reaktion oder eine Hemmreaktion.
Für die Durchführung einer Sandwichreaktion kann das Testkit zum Beispiel aus einem erfindungsgemässen Polypeptid, das an eine feste Trägersubstanz gebunden ist, zum Beispiel an die innere Wand einer Mikrotestwanne, und entweder aus einem markierten, erfindungsgemässen Polypeptid oder einem markierten anti-Antikörper bestehen. Die Erfindung wird durch folgende Beispiele erläutert.

BEISPIEL 1

Herstellung von Antigenen der E. maxima Sporozoiten

1.a.i Herstellung der Parasiten

Die Parasiten des Eimeria maxima Houghton-Stamm (E. maxima H) wurden in Light Sussex-Hühner, wie es bei Long et al. beschrieben wird, passagiert (Folio Vet. Lat., 1976, 6: 201-207). Die Oozysten wurden aus dem Faeces isoliert, bildeten Sporen in 2% Kaliumdichromat bei 29ºC für 72 Stunden, die Oberfläche wurde durch Waschen in 10% Natriumhypochlorit sterilisiert und durch Flotation in gesättigtem Natriumchlorid gereinigt. Die sporulierenden Oozysten wurden in phosphatgepufferter Saline (PBS) pH 7,6 suspendiert und durch Vibration gebrochen. Die Sporozysten wurden in PBS pH 7,6 mit 0,5% G/V Schweinegalle (Difco) und 0,25% G/V Trypsin (Difco 1 : 250) suspendiert und bei 41 ºC für 30 Minuten inkubiert. Die freigewordenen Sporozoiten wurden in PBS pH 8,0 gewaschen, auf DE-52-Säulen (Whatman), wie bei Schmatz et al. (J. Protozool., 1984, 31: 181-183) beschrieben, gereinigt und als Pellets in Eppendorf- Röhrchen bei -70ºC gelagert.

1.a.ii Herstellung der Antigene

Die Sporozoiten-Pellets (5 · 10&sup7;) wurden durch Kochen für 10 Minuten in 100 ml Probenpuffer (50 mM Tris-Cl pH 6,8, 2% SDS, 10% Glycerol, 100 mM DTT und 10 mg/ml Bromphenol- Blau) löslich gemacht, dann auf ein diskontinuierliches SDS-Polyacrylamidgel geladen. Die Gele wurden einer Elektrophorese unterzogen und die Polypeptide wurden auf Nitrozellulose(NC)-Papier mit Hilfe des Verfahrens von Towbin and Gordon (J. Immunol. Methods, 1984, 72: 313-340) übertragen. Nach dem Transfer wurde das NC-Papier in PBS pH 7,6 mit 0,3% Tween-20 gespült und die Polypeptide wurden dann durch Färben mit kolloidalem Gold (Aurodye, Cambio, England) gemäss Anleitung des Herstellers sichtbar gemacht.
Das NC-Papier wurde in Streifen geschnitten, jedes trug Eimeria-Polypeptide eines begrenzten Molekularmassen- Bereichs. Jeder Streifen wurde in kleine Teile geschnitten und die Stückchen in markierte Glasgefässe übertragen. Zu jedem Gefäss wurde 400 ml DMSO beigefügt und die Mischung für 60 Minuten stehen gelassen, um eine Solubilisierung und eine Sterilisation sicher zu stellen. Die NC-Teilchen wurden durch tropfenweise Zugabe von einem in gleichem Volumenverhältnis stehenden Carbonat/Bicarbonat-Puffer (50 mM, pH 9,6) und unter kräftigem Vortexen präzipitiert. Die Proben wurden in Mikrozentrifugierungsröhrchen von 1,5 ml übertragen und mit 10 000 g für 5 Minuten zentrifugiert. Die NC-Teilchen wurden dreimal in RPMI 1640-Medium (Gibco Biocult, Paisley, Scotland) gewaschen, dann endlich in 1 ml von diesem Medium suspendiert, in 200 ml-Aliquote geteilt und bei -70ºC eingefroren gelagert.

BEISPIEL 2

Identifizierung von lymphostimulierenden Antigenen

2.a. Methode

2.a.i. Immunisierung der Tiere

Für die Primärinfektion erhielten Gruppen von Reaseheath-C- Hühnern (4 Wochen alt, 10 Vögel pro Gruppe) oral eine Dosis von 4000 sporulierenden Oozysten von E. maxima H. Für die Zweitinfektionen erhielten dieselben Vögel oral eine Dosis von 50 000 sporulierenden Oozysten von E. maxima H. Für jedes Experiment wurde eine bezüglich des Alters gepaarte Kontrollgruppe von Reaseheath-Hühnern getrennt gehalten.

2.a.ii. Herstellung von peripheren Blutlymphozyten

Blutproben (5 ml) wurden von oberflächlichen Flügelvenen mit heparinisierten (10 Einheiten/ml) Plastikspritzen entnommen. Das Blut wurde in die Röhrchen gegeben (Falcon 2027, Becton-Dickinson) und mit 400 rpm für 15 Minuten in einer Sorvall RC3B-Zentrifuge zentrifugiert. Die Zellschicht oberhalb der sedimentierten Erythrozyten wurde vorsichtig mit einer Pipette entfernt und in frische Röhrchen (Falcon 2059, Becton-Dickinson) gegeben und mit 2000 rpm für 10 Minuten zentrifugiert. Die hinterlegten Zellen wurden dreimal in RPMI 1640, das 10% fötales Kälberserum (FCS, Virus und Mycoplasma kontrolliert, Gibco Biocult), 200 Einheiten/ml Penicillin und 200 mg/ml Streptomycin (G. R. Squibb & Sons, Moreton, England) enthält, gewaschen und in das gleiche Medium mit 4 · 10&sup6; Zellen/ml zurücksuspendiert. 100 ml Aliquote der Zellen (4 · 10&sup5;) wurden in rundbödigen Wannen von 96-Wannen-Platten (Nung-Gibco, Paisley, Scotland) pipettiert. Zu jeder Wanne wurde 100 ml einer vorbereiteten Probe zugegeben. Die Testproben bestanden aus der hergestellten NC- Teilchensuspension (siehe Beispiel 1.a.i.), die mit RPMI 1640-Medium, das 10% FCS, 200 Einheiten/ml Penicillin, 200 mg/ml Streptomycin enthält, verdünnt wurde. Um die Verdünnungen herzustellen, wurden die Suspensionen von -70 ºC aufgetaut, 10-fach mit Medium verdünnt und dann wurden Zweifachverdünnungsserien hergestellt. Kontrollproben beinhalteten NC-Partikelsuspensionen, die frei von Proteinen und auf gleiche Weise verdünnt waren. Eine zweite Serie von Kontrollproben beinhaltete ein Lysat aus ganzen Sporozoiten (0,5 mg/ml Protein), das durch Einfrieren- Auftauen und Ultraschallbehandlung der Sporozoiten hergestellt wurde. Jede Probe wurde in dreifacher Ausführung für jede Zellzubereitung hergestellt, wobei Replikate zufällig auf den Platten platziert wurden. Die Platten wurden für 96 Stunden bei 41ºC in 5% CO&sub2; inkubiert, für die letzten 16 Stunden mit lmCi 3H-Thymidin bei 48 Ci/mMol (Amersham, U.K.) gepulst und dann auf Filtern aus Glasmikrofasern (MA 781, Dynatron Laboratories Ltd.) geerntet (Dynatron Macromash Harvester, Dynatech Laboratories Ltd., Sussex, England). Nach dem Trocknen für 1 Stunde bei 50ºC wurden die Scheiben in Szintillationsgefässe getan, dann wurde 3,5 ml flüssiger Szintillationscocktail (Scintillator 299Tm Packard, Caversham, U.K.) und die radioaktiven Einschlüsse in einem Szintillations-Spektrophotometer (Beckman Instruments Inc. LS9000) gemessen.

2b. Ergebnisse

Ergebnisse werden als Stimulationsindex (SI) ausgedrückt, der für jede Probe mit Zellen von jedem Vogel wie folgt berechnet wird:
SI = cpm1/cpm2
Worin:
cpm1 = durchschnittliche Impulse pro Minute der Dreifachkulturen, die mit NC-Teilchen inkubiert wurden, die Proteine trugen.
Cpm2 = durchschnittliche Impulse pro Minute der Dreifachkulturen, die mit NC-Teilchen inkubiert wurden, die frei von Proteinen waren.
Es stellte sich heraus, dass die in Lösung gebrachten NC- Streifen, die Polypeptide mit einer relativen Molekularmasse von ungefähr 73 000/71 000/69 000 D (kollektiv als 70 000 D bezeichnet) enthielten, die Proliferation der Lymphozyten von den infizierten Vögeln stimulierten (siehe Tabelle 1). Die Lymphozyten der Kontrollvögel wurden nicht zur Proliferation angeregt. Die SI-Werte variierten zwischen 4 und 9 und Zeitverlaufsstudien zeigten, dass die Lymphozyten, die von Vögeln 4 Tage nach der Zweitinfektion hergestellt wurden, am stärksten proliferierten.

BEISPIEL 3

Züchten und Screenen von Antikörpern gegen lymphostimulierende Antigene

3.a. Methode

3.a.i. Immunisierung der Tiere

Pathogenfreie Hasen (Harlan-Olac, Bicester, England) wurden frei von Kokzidien gehalten. Polypeptide von E. maxima H- Sporozoitenpellets wurden in Lösung gebracht, durch SDS- Polyacrylamidgel-Elektrophorese getrennt und auf NC, wie in Beispiel 1 beschrieben, aufgetragen. Die NC-Streifen, die Polypeptide mit einer Molekularmasse von 70 000 D trugen, wurden herausgeschnitten, in DMSO wie in Beispiel 1 löslich gemacht, in PBS pH 7,0 gewaschen und schliesslich in 1 ml PBS pH 7,0 suspendiert. Die Suspensionen wurden subkutan an 4 Stellen injiziert (0,25 ml pro Stelle) und die Injektionen wurden alle zwei Wochen wiederholt, indem jedes Mal ein Streifen pro Hase verwendet wurde. Den Hasen wurde 2 Wochen nach jeder Injektion Blut abgenommen.

3.a.ii. Screening der Antiseren durch ein- oder zweidimensionales Blotting

Polypeptide von E. maxima H-Sporozoitenpellets wurden solubilisiert, durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophoresegetrennt und auf NC, wie in Beispiel 1 beschrieben, aufgetragen. Alternativ wurden Sporozoiten (7 · 10&sup7;) in 500 ml Lysispuffer (o,2% Nonidet-P40, 20 mM CHAPS, 9 M Urea, 0,2% Biolytes 3-10 (Biorad), 1 mM DTT) suspendiert und mit Ultraschall behandelt (drei 10-Sekunden Behandlungen mit 10 Microns, MSE Soniprep 50) und drei Zyklen Einfrieren- Auftauen ausgesetzt. Die Proben wurden mit 12 000 g in einer Mikrozentrifuge für 1 Minute zentrifugiert, dann wurden die Polypeptide durch zweidimensionale Gelelektrophorese, im Wesentlichen wie bei O'Farell (J. Biol. Chem., 1975, 250: 4007-4021) beschrieben, getrennt.
Die getrennten Polypeptide wurden auf NC-Papier übertragen, wie es in Beispiel 2 beschrieben wird. Das NC-Papier wurde in TTN-Puffer (10 mM Tris-HCl pH 7,4, 500 mM NaCl, 0,05% Tween-20), das 3% Rinderserumalbumin (BSA) enthielt, eingetaucht und bei Raumtemperatur unter sanftem Schütteln für 2 Stunden inkubiert. Das Papier wurde in Wasser gespült, in Streifen geschnitten und jeder Streifen für 3 Stunden in einer Probe von Hasenserum, das 1 : 250 mit TTN, das 1% BSA enthält, verdünnt ist, inkubiert. Die Streifen wurden dreimal mit TTN, das 0,5% Tween-20 enthält, gewaschen, dann für eine Stunde in anti-Hasen-IgG von Ziegen, das mit Alkalinphosphatase (Promega) konjugiert ist und in TTN 1 : 7500 verdünnt ist und 1% BSA enthält, inkubiert. Die Streifen wurden drei weitere Male in TTN, das 0,5% Tween-20 enthält, und einmal in AP-Puffer (100 mM Tris pH 9,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl&sub2;) gewaschen.
Die Bindung des Phosphatasekonjugats wurde nachgewiesen, indem die Streifen in AP-Puffer mit 50 mg/ml Nitroblau- Tetrazolium und 50 mg/ml Bromchlorindolylphophat inkubiert wurden.

3.b. Ergebnisse

Die Spezifizierungen der anti-p70-Hasenseren, die auf eindimensionalen Western Blots von Polypeptiden von E. maxima untersucht sind, werden in Abb. 1 dargestellt. Die Fleckenerkennung auf den zweidimensionalen Western Blots wird in Tabelle 2 zusammengefasst.

BEISPIEL 4

Konstruktion einer E. maxima-Sporozoiten-cDNA-Bibliothek

4.a. Methode

4.a.i. Isolation der mRNA

E. maxima-Sporozoiten (5 · 10&sup8;) wurden wie in Beispiel 1 beschrieben gereinigt. Die gesamte, zelluläre mRNA wurde mit Hilfe eines RNA-Extraktionskit (Pharmacia) gemäss den Anleitungen des Herstellers hergestellt. In Kürze: die Sporozoiten wurden durch Inkubation in gepufferten Guanidiniumthiocyanat, N-Laurylsarcosin und EDTA lysiert und die RNA wurde dann von den anderen, zellulären Bestandteilen durch Ultrazentrifugation durch gepuffertes Caesium-trifluoracetat getrennt. Das RNA-Pellet wurde vorsichtig in TE-Puffer (10 mM Tris-Hcl pH 7,5, 1 mM EDTA) löslich gemacht und bei -70ºC als ein Aethanolpräzipitat gelagert. Die Messenger-RNA wurde von dieser Gesamt-RNA- Zubereitung mit Hilfe von Oligo(dT)-Zellulose (poly(A) Quik, Stratagene) gemäss den Anleitungen des Herstellers getrennt.

4.a.ii. Synthese und Klonen der cDNA

Die cDNA wurde aus der mRNA synthetisiert, indem ein ZAP- cDNATM-Synthesekit gemäss den Anleitungen des Herstellers verwendet wurde. Die cDNA-Population lag im Bereich von weniger als 200 bp bis ungefähr 6 kbp, wie durch Agarosegelelektrophorese und Autoradiographie einer kleinen Portion der synthetisierten cDNA beurteilt wurde. Die Enden der verbleibende cDNA wurde mit T4-DNA-Polymerase in Anwesenheit von allen vier dNTPs bei 37ºC für 30 Minuten repariert. EcoRI-Adapter wurden auf die stumpfen Enden der cDNA mit Hilfe von T4-DNA-Ligase bei 8ºC für 24 Stunden ligiert. Der Verdau mit XhoI erzeugte cDNA mit XhoI- Restriktionsstellen an allen 3'-Enden und EcoRI Restriktionsstellen an allen 5'-Enden. Die Oligonukleotide (überschüssige Adaptoren und die mit Restriktionsenzymen verdauten Primer-Matrizen) wurden durch Zentrifugierung der Probe durch eine 1 ml Säule aus Sephacryl S-400 entfernt.
100 ng Portionen von cDNA wurden mit 1 mg Uni-ZAP XR-Vektor (Stratagene, verdaut mit EcoRI und Xho I und dephosphoryliert) über Nacht bei 12ºC mit T4-DNA-Ligase ligiert. Ligierte DNA wurde in Phagenköpfe gepackt, indem das "Gigapack II Gold packing extract" (Stratagene) gemäss dem Protokoll des Herstellers angewendet wurde. Die verbleibenden primären Bibliotheken wurden auf E. coli SURE-Zellen (Stratagene) plattiert und amplifiziert und die sich ergebenden, amplifizierten Bibliotheken (Emx8 und Emx9) wurden auf E. coli XL1-Blauzellen (Stratagene) titriert, alles gemäss den Anleitungen des Herstellers. Kurzgefasst: für alle Plattierungen liess man die Wirtszellen über Nacht geschüttelt bei 30ºC in L-Brühe, der 0,2% (G/V) Maltose und 10 mM MgSO&sub4; hinzugefügt waren, wachsen. Die Zellen wurden vor der Verwendung verdünnt zu OD600 = 0,5 mit 10 mM MgSO&sub4;. Die Anzahl der Rekombinanten in jeder Bibliothek wurde bestimmt, indem die Phage in Anwesenheit von 0,4% (G/V) 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D- galaktosid (Xgal) und 2,5 mM Isopropylthio-β-D-galktosid (IPTG)(Nothumbria Biologicals Ltd.) plattiert wurde.

4.b. Ergebnisse

Emx8 beinhaltet 3 · 108 pfu/ml (65% rekombinant) und Emx9 beinhaltet 6 · 108 pfu/ml (55% rekombinant).

BEISPIEL 5

Identifikation von cDNA-Klonen, die E. maxima-p70-Antigene kodieren

5.a. Methode

Immunscreening der cDUA-Bibliotheken wurde gemäss den standardisierten Anleitungen, die von Stratagene zur Verfügung gestellt werden, durchgeführt. Die Papiere wurden in anti-p70-Hasenserum, 1 : 100 in TTN mit 1% BSA verdünnt, eingetaucht. Alle weiteren Vorgänge waren identisch mit denen, die für die Entwicklung von Western Blots in Beispiel 3A beschrieben wurden. Positive Plaques wurden identifiziert und nach Lagerung über Nacht bei 4ºC, um die Bakteriophagenteilchen zu eluieren, wurden die Plaques wieder gescreent. Das nochmalige Screening wurde fortgesetzt bis alle Positiven aus reinen Populationen von Antikörper-reaktiven Plaques bestanden.

5.b. Ergebnisse

20 unabhängige Plaques (pEm70/1 bis pEm70/20), die mit dem anti-p70-Hasenserum reagierten, wurden isoliert und die Plaques von den Bibliotheken Emx8 und Emx9 gereinigt.

BEISPIEL 6

Analyse der cDNA-Klone, die E. maxima-p70-Antigene kodieren

6.a. Methode

6.a.i. Selektion klonspezifischer Antikörper

0,2 ml Aliquote der XL1-Blauzellen wurden mit 1-3 · 103 pfu von Plaque-gereinigten Phagenpopulationen infiziert. Diese wurden auf 90 mm-Geschirr plattiert und gemäss den Vorgängen behandelt, die in Beispiel 5.a. bis zur und einschliesslich der Inkubation der NC-Papiere in TTN mit 3 % BSA über Nacht beschrieben werden. Die Papiere wurden dann in TTN gespült, jedes in 5 ml anti-p70-Hasenserum, das 1 : 100 mit 1% BSA enthaltenden TTN verdünnt wurde, eingetaucht und unter sanftem Schütteln bei Raumtemperatur für 6 Stunden inkubiert. Die Papiere wurden dreimal in mit 3% BSA enthaltendem TTN gewaschen und dann wurde der gebundene Antikörper durch Eintauchen von jedem Papier in 5 ml 0,2 M Glyzin pH 2,8 und Schütteln für 10 Minuten herausgespult. Das Eluat, das klonspezifische Antikörper beinhaltete, wurde durch Zugabe von 0,3 N Tris, 10% (G/V) BSA, auf einen neutralen pH gebracht. Klonspezifische Antikörper wurden unverdünnt verwendet, um Western Blots von E. maxima-Sporozoitproteinen, die durch ein- und zweidimensionale Gelelektrophorese getrennt wurden, zu untersuchen. Alle Herstellungsverfahren und das Immunscreening der Western Blots sind identisch mit denen, die in Beispiel 3.a.ii. beschrieben werden.

6.a.ii. Analyse der cDNA-Insertionen

Die DNA wurde aus Ansätzen von rekombinanten Phagen mit dem Verfahren von Grossberger (Nucleic Acids Res., 1987, 15: 6737) hergestellt und die cDNA-Insertionen wurden durch den Verdau mit den Restriktionsenzymen Eco RI und Xho I freigesetzt. Jede cDNA wurde zu pUC19 (Pharmacia) ligiert, das mit den Restriktionsenzymen Eco RI und Sal I verdaut und mit intestinaler Kälberphosphatase dephosphoryliert worden war. Die ligierte DNA wurde in den E. coli-Stamm TG1 durch Transformation eingeführt. Die Plasmide wurden mit Hilfe des Verfahrens nach Choudhary (Nucleic Acids Res., 1991, 19: 2792) und durch Verdau mit Restriktionsendonukleasen analysiert.
Als eine Alternative zum Subklonieren in das Plasmid pUC19, wurden cDNA-Klone in das pBluescript-Plasmid durch in vivo- Excision von rekombinantem lambda-ZAPII gemäss den Anleitungen des Herstellers (Stratagene) gerettet. Die cDNA enthaltenden pBluescript-Plasmide wurden durch alkalische Lysis (Birnboim und Doly, 1979, Nucleic Acids Res., 7: 1513) isoliert und die cDNAs durch Verdau mit Restriktionsendonukleasen analysiert.

6.a.iii DUA-Sequenzbestimmung

pEm70/1 wurde durch Gleichgewichtszentrifugation in CsCl/Ethidiumbromidgradienten gereinigt und dann wurde die cDNA-Insertion durch zufälliges Subklonieren in der M13- Phage, wie es bei Bankier und Barrell (Techniques in the Life Sciences (Biochemistry) 85: Techniques in Nucleic Acids Biochemistry 1-34, 1983) beschrieben wird, sequenziert. Für andere Klone wurden die 5'- und 3'-Enden de cDNA-Insertionen direkt von der doppelsträngigen Plasmid-DNA sequenziert.

6.b. Ergebnisse

6.b.i. Reaktivität der klonspezifischen Antikörper

Zwanzig Plaque-gereinigte lambda-Populationen, die von den Bibliotheken Emx8 und Emx9 (siehe Beispiel 5) isoliert wurden, wurden für die Herstellung von klonspezifischen Antikörpern verwendet. Vierzehn dieser Antikörper kreuzreagierten spezifischerweise mit Polypeptiden von ungefähr 70 kDa auf eindimensionalen Blots von E. maxima- Sporozoitproteinen. Die Polypeptidflecken wurden durch willkürliche Nummerierung identifiziert und die fünf durch Klonierung selektionierte Antikörper reagierten mit Fleckenkonstellationen, die Untersets der Flecken waren, die durch intaktes anti-p70-Hasenserum erkannt wurden. Diese Information wird in Tabelle 2 zusammengefasst.

6.b.ii. Restriktionskartierung

Analytischer Restriktionsenzymverdau der vierzehn Klone, die die Antikörper gegen 70 kDa-Polypetide spezifisch selektionieren, zeigte, dass es sechs unterschiedlich grosse cDNA-Insertionen gab. Zwei von denen wurden pEm70/1 und pEm70/4 bezeichnet. Restriktionsenzymkarten von den zwei cDNA-Insertionen werden in Abb. 2 dargestellt.

6.b.iii. Analyse der DNA-Sequenzen

Die nachgewiesene Nukleotidsequenz ist von pEm70/1 und seine abgeleitete Aminosäuresequenz wird in SEQ ID Nr. 1 von der Nukleinsäure 126 an dargestellt. Die Sequenz, die in Klon pEm70/1 nachgewiesen wurde, ist eine 1294 bp cDNA, die einen 5'-EcoRI-Adapter und eine 3'-polyA-Sequenz gefolgt von einer XhoI-Stelle beinhaltet. Die cDNA erscheint "offen" vom ersten Nukleotidtriplet bis zu einem Ocker-Terminationcodon (TAA) bei 1258 bp, die der poly(a)- Sequenz vorangeht. Die abgeleitete Aminosäuresequenz kodiert ein Protein von 419 Aminosäuren oder ungefähr 46 Kilodaltons. Die cDNA hat interne EcoRI-Stellen bei 67 bp und 1000 bp und einzelne ScaI (699 bp), HindIII (736 bp), SspI (995 bp), HincII (1200 bp) und PstI (1251 bp)- Restriktionsstellen (die Distanz der Basenpaare, gemessen vom Start der Sequenz, die in Klon pEm70/1 gefunden wurde, d. h. Nukleinsäure 126 in SEQ ID Nr. 1). Die Analyse der ersten 125 Nukleotide der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz wird in Beispiel 9 besprochen.
Die 5' und 3' - Endsequenzen von pEm70/4 sind in SEQ ID Nr. 3 und 5 dargestellt.

BEISPIEL 7

Expression des rekombinanten Proteins, das von pEm70/1 kodiert wird

7.a. Methode

7.a.i. Konstruktion des Plasmids pRSETAEm70/1

1 ug von Plasmid pEM70/1 wurde mit 10 Einheiten von BamHI und 10 Einheiten von XhoI für 2 Stunden bei 37ºC verdaut und die cDNA-Insertion wurde in das mit BamHI-XhoI verdaute und entphosphorylierte Plasmid pRSETA von InVitrogen ligiert. Die ligierte DNA wurde in den E. coli-Stamm HMS174 transfiziert, Kolonien mit dem rekombinanten Plasmid pRSETAEm70/1 wurden herausgenommen und die Plasmid-DNA wurde durch alkalische Lysis isoliert (Birnboim und Doly, Nucl. Acid. Res., 7,1513, 1979).

7.a.ii. Expression des (His)6-Em70/1-Fusionsprotein vom Plasmid pRSETAEm70/1

Plasmid enthaltende Bakterien wurden über Nacht in L-Brühe mit 100 ug/ml Ampicillin wachsen gelassen. 10 ml der über Nacht stehen gelassenen Kultur wurden 1 : 100 mit vorgewärmter (37ºC) L-Brühe verdünnt und wuchsen unter Belüftung für 5 Stunden bei 37ºC. Proben wurden für die Western Blots entnommen.

7.a.iii. Reinigung des (His)6-Em70/1-Fusionsprotein durch Metallaffinitätschromatographie

Die 5-Stunden-Kultur des pRSETSEm70/1 wurde zentrifugiert und das bakterielle Pellet in 5 ml 6 M Guanidin-HCl, 20 mM Natriumphosphat pH 7,8 resuspendiert und 4 Mal dreissig Sekunden auf voller Stärke mit Ultraschall behandelt (MSE Soniprep). Das beschallte Produkt wurde mit 10 000 · g zentrifugiert, um das unlösliche Material zu entfernen, und die Überstände wurden dann mit 10 ml stationärem Nickelresin ("ProBondTM", InVitrogen) gemischt, das in 8 M Urea, 20 mM Natriumphosphat. pH 7,8 äquilibriert worden war. Die Resin-Lysat-Mischung wurde in eine Glassäule gegossen und das Resin konnte sich für 30 Minuten absetzen. Ein Hahn am Boden der Säule wurde geöffnet und das "Durchflussprodukt" wurde gesammelt, zum Resin reappliziert und wieder gesammelt. Das Resin wurde mit Äquilibrierungspuffer gewaschen, bis das Eluat eine Absorption von < 0,05 bei 280 nm (A280) hatte. Das Resin wurde mit Äquilibrierungspuffer bei einem pH von 6,0 gewaschen, um nichtspezifisch gebundene bakterielle Proteine zu entfernen und das rekombinante Protein wurde schliesslich mit Äquilibrierungspuffer bei pH 4,0 herausgelöst. Das rekombinante Protein wurde für 16 Stunden bei 4ºC gegen ein grosses Volumen PBS mit pH 7,6 dialysiert. Die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung von einem farbstoffbindenden Reagenz (Bio-Rad) abgeschätzt, der Ertrag betrug ungefähr 5 mg pro 1 Liter Kultur.

7.b. Ergebnisse

Rekombinantes pEm70/1 wurde als ein Fusionsprotein mit sechs Histidinresten am N-Terminus exprimiert. Das Fusionsprotein, das spezifisch mit Hasen-anti-p70- oder mit Hühner-anti-rekombinantem pEm70/1-Serum reagierte, war ein Dublett von 46-48 kDa Grösse (Fig. 3, Spur 1). Der Beitrag des Proteins zu dem Expressionsvektor waren sechs Histidinreste und die Enterokinase-Erkennungssequenz (Asp- Asp-Asp-Lys), die insgesamt 1 kDa betrug. Das in der 5- Stunden-Kultur hergestellte rekombinante Protein (Fig. 3, Spur 1) war nach der Ultraschallbehandlung in der löslichen Fraktion vorhanden (Fig. 3, Spur 2) und wurde mit Hilfe der Nickel-Affinitätssäule gereinigt (Fig. 3, Spuren 4 und 5). Fig. 4 zeigt das mit Coomassie-Blau gefärbte Polyacrylamidgel der Reinigung des von pRSETAEm/70/1 exprimierten Proteins.

Beispiel 8

Immunisierung von Hühnern mit dem rekombinanten Protein (His)6-Em70/1.

8.a. Verfahren

8.a.1 Immunisierung der Tiere.

Sechsunddreissig Helle Sussex Hühner wurde unter Kokzidien freien Bedingungen bis zu einem Alter von drei Wochen aufgezogen. Die Hühner wurden zufallsgemäss auf zwei Gruppen verteilt und einzeln in Einzelkäfigen untergebracht. Blutproben wurden entnommen und 18 Hühner wurden mittels subkutaner Injektion (0,1 ml) mit 25 ug Antigen (wie in Beispiel 7 beschrieben, hergestellt) und 100 ug Tensiden in PBS immunisiert. Die übrigen 18 Vögel wurden mit 25 ug bakteriellem Antigen (das nicht an das Nickelharz bindet) und 5 ug Tensiden in PBS immunisiert. Die Immunsierung wurde noch zweimal in zwei wöchentliche Intervallen wiederholt und nach jeder Immunisierung wurden Blutproben entnommen.

8.a.ii Challenge der Tiere

Zwei Wochen nach der letzten Immunisierung wurde allen Hühnern 100 sporulierte Oozysten von E. maxima mittels oraler Intubation verabreicht. Der Kot von jedem Vogel wurde täglich auf mit Papier ausgelegten Tabletts gesammelt und die Gesamtzahl der von jedem Huhn ausgeschiedenen Oozysten wurde von 5 bis 10 Tagen nach dem Challenge durch Zählen der gemischten und verdünnten Kotproben in Macmaster Zählkammern berechnet.

8.b. Ergebnisse

Tabelle 3 zeigt die individuelle Oozysten-Ausscheidung und das Gruppenmittel der Vögel, die entweder mit dem Antigen oder scheinimmunisert wurden. Diejenigen Vogel, die das Antigen erhalten hatten, zeigten Oozysten-Ausscheidungen, die niedriger als diejenigen der scheinimmunisierten Gruppe waren, was zeigt, dass das Antigen, wie in Beispiel 7 beschrieben, zum Schutz von Hühnern gegen Eimeria maxima- Infektionen verwendet werden kann.

Beispiel 9

Zusätzliche 5'-Nukleotidsequenz des Em70/1-Gens.

9.a. Verfahren

Die 5' RACE (rapid amplification of cDNA ends)-Technik (Frohmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85, 8998, 1988; Belyavsky et al., Nucl. Acids Res., 17, 2919, 1988, CLONTECH Laboratories) wurde angewendet, um mehr von der 5'DNA-Sequenz der cDNA zu erhalten, die Em70/1 codiert. Messenger-RNA wurde aus 200 · 10&sup6; E. maxima-Sporozoiten unter Verwendung eines Fasttrack-Sets (InVitrogen) isoliert. Die cDNA wurde aus 2 ug mRNA unter Verwendung von AMV Reverser Transkriptase gemäss Anleitung des Herstellers (CLONTECH Laboratories Inc.) synthetisiert, mit der Ausnahme, dass 1 ug der Zufallsprimer für das Primen der Synthese des ersten cDNA-Strangs anstelle eines Genspezifischen Primers verwendet wurde. Die RNA wurde mit NaOH hydrolysiert und ein Anker-Primer (SEQ ID NR. 6) wurde an das 5'-Ende der cDNA unter Verwendung von RNA-Ligase ligiert. Die ligierte cDNA wurde mit Wasser 1 : 10 verdünnt und dann mittels PCR (Polymerasekettenreaktion) unter Verwendung eines Anker-spezifischen Primers (SEQ ID Nr. 7) und einem genspezifischen Antisense-Primer (SEQ ID Nr. 8) analysiert. PCR ergab ein einzelnes Produkt von 800 Bp, wie durch Agarosegelelektrophorese bestimmt wurde. Dieses Fragment wurde aus dem Agarose-Gel unter Verwendung eines Gene-Clean-Sets (Stratatech Scientific) ausgeschnitten, mit 10 Einheiten EcoRI verdaut und mit EcoRI-verdautem und entphosphoryliertem M13mp18 ligiert, nach der Transfektion in den E. coli-Stamm isoliert und die Nukleotidsequenz der Insertionen unter Verwendung des PRISMTM DyeDeoxyTM Terminator Cycle Sequencing-Set (Applied Biosystems) bestimmt.

9.b. Ergebnisse

Unter Anwendung von 5'RACE, gefolgt von einer EcoRI- Subklo-nierung, wurden zusätzliche 125 Nukleotide stromaufwärts Em70/1 bestimmt, die mit der zuvor bestimmten (Beispiel 6) Sequenz verbunden wurden.

Beispiel 10

Expression des E.maxima Em70/1-Antigens in Insektenzellen unter Verwendung von Baculoviren als Vektor.

10.a. Konstruktion von pAcEM

Die XhoI-Schnittstelle von pEm70/1 wurde in BglII mittels eines synthetischen Linkers wie von Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Kapitel 8) beschrieben, umgewandelt. Das 1,3 kB Insertionsfragment von pEm70/1, das das Antigen 70/1 codierte, wurde anschliessend als BamHI-BglII-Fragment isoliert und in die BamHI- Schnittstelle des Baculovirustransfervektors pAcLaZ + MCS ligiert, der von Dr. Bishop, Institut für Virologie, Oxford, GB erhalten wurde.
Der korrekte Einbau relativ zu dem Polyhedrin-Promoter wurde durch Restriktionsenzymverdau überprüft.
Von vorhergehenden Sequenzanalysen war bekannt, dass die kodierende Region der Insertion von pEm70/1 am N-Terminus unvollständig war und der ATG-Initiator fehlte.
Um die Expression zu ermöglichen, wurde ein 42 Bp grosses synthetisches DNA-Fragment, das sich aus den komplementären Oligos L1 (SEQ ID NR. 9) und L2 (SEQ ID NR. 10) mit vorstehenden BamHI-kompatiblen Enden zusammensetzt, in die einzige BamHi-Schnittstelle ligiert, die nach der Insertion des 1,3 kB grossen Fragments von pEm70/10 in pAcLacZ + MCS wieder hergestellt wurde. Dies resultierte in dem Plasmid pAcEM. Der in pAcEM korrekt inserierte 42 Bp grosse Linker lieferte einen Leserahmen der ersten 11 Aminosäuren des Polyhedrinproteins, das mit dem E. maxima-Gen, das einen Hauptteil des Antigens 70/1 codierte, fusioniert war. Die endgültige Struktur stromabwärts des Polyhedrin-Promoters im Plasmid pAcEM wurde durch Sequenzieren der Nukleotide überprüft.

10.b. Transfection von Insektenzellen und Isolierung von Baculovirus-Rekombinanten.

pAcEM-DNA wurde in SF9-Zellen mittels Standardtechniken (D. O'Reilly, K. Miller und V. Luckow: Baculovirus expression vectors, A Laboratory Manual, Oxford University Press, 1994) unter Verwendung von Lipofectin (Gibco/BRL) und Baculovirus-Wildtyp DNA transfiziert. Rekombinante Plaques wurden auf Gewebekulturplatten mit X-Gal (Gibco/BRL) in der Agarschicht identifiziert.
Blaue Plages wurden gestochen und dreimal erneut ausplattiert, bis kein Wildtypvirus mehr nachweisbar war. Die viralen Plaques wurden in T75- und T175-Flaschen und schliesslich in einer 100 ml Drehflasche mit SF9-Zellen vermehrt. Die Virustiter wurden mittels Immunfluoreszenz bestimmt: Mikrotiterplatten mit SF9-Zellen wurden mit einer Virusverdünnung infiziert. Nach 6 Tagen Inkubationszeit wurden die Platten mit Alkohol fixiert und mit einer 1 : 500- Verdünnung eines polyklonalen Hühnerantikörpers gefärbt, der gegen das Em70/1-Sporozoiten-Protein gerichtet war. Die nächste Inkubation wurde mit 1 : 600 verdünntem Ziege-anti- Huhn IgG(KPL) an FITC konjugiert durchgeführt. Der Titer der Vorratslösung des vAcEM-Virus betrug 7,2 Log10 TCID&sub5;&sub0;/ml.

10.c. Herstellung von E. maxima 70/1-Protein in Insektenzellen

Vier T175-Flaschen, die je 3 · 10&sup7; SF9-Zellen in exponentiellem Wachstum enthielten, wurden mit der vAcEM- Virusvorratslösung im Mittel mit 10 TCID&sub5;&sub0;/Zelle infiziert. Nach drei Tagen wurden die infizierten Zellen auf Eis geerntet. Die Zellen wurden zu 1 · 10&sup7; ml in PBS resuspendiert und Ultraschall behandelt. Die mit Ultraschall behandelten Zellen wurden mit 0,075% Formalin durch einwöchige Inkubation bei 4ºC inaktiviert. Das Formaldehyd wurde mit einer äquimolaren Menge Na&sub2;S&sub2;O&sub5; neutralisiert.

10.d. Analyse des in Baculo-Viren exprimierten Produkts unter Verwendung von SDS-PAGE und Western Blotting

Proben von resuspendierten, mit Ultraschall behandelten Zellen wurden 2 : 3 mit reduzierendem (R) oder nichtreduzierendem (NR) Probenpuffer (aus 188 mM Tris-HCl pH 6.8, 6% SDS ± 0,2 M β-Mercaptoethanol) gemischt, 10 Minuten bei 95ºC gekocht, 10 Minuten bei 13000 UpM zentrifugiert und auf SDS-Gele geladen. Nicht infizierte Zellen und SHAM-rekombinante infizierte Zellen ohne Insertion liefen als Kontrollen mit.
Die Proben wurden auf einem 12%-igen PAA-Gel (1,5 mm dick) analysiert. 80 ul Probe wurden in jede Spur geladen. Ein Teil des Gels wurde mit CBB (Coomassie Brilliant Blau R250) gefärbt und der Rest wurde auf Nitrozeilulose elektrogeblottet.
Der Blot wurde mit Hühnerserum inkubiert, das gegen E. max 70/1-Sporozoitenprotein gerichtet und 1 : 500 verdünnt war (oder mit negativem Hühnerserum als Kontrolle). Beide Blots wurden mit Phesphatase-markiertem Ziegen-anti-Huhn IgG und NBT/BCIP-Substrat gemäss Standardprotokollen entwickelt. Nur das EM70/1-enthaltende Virus exprimierte eine Bande, die von dem Hühnerserum erkannt wurde. Das ungefähre Molekulargewicht des exprimerten Produkts betrug 45 000; ein Abbauprodukt bei Mr 33 000 war ebenfalls sichtbar. Bezüglich Expression und Erkennung war nach dem Gellauf unter reduzierenden und nicht reduzierenden Bedingungen kein Unterschied erkennbar.

Beispiel 11

Immunisierung von Hühnern mit Salmonella gallinarum-EM70/1

11.a. Verfahren

2 ug gereinigtes pEm70/1-Plasmid wurden in die MCS (multiple Klonierungsstelle) des pMLB1113 (His)6-3-Vektor (siehe Fig. 5) nach Verdau mit EcoRI (20 Einheiten) kloniert. Die ligierte DNA wurde verwendet, um E. coli TG1 zu transformieren. Rekombinante Kolonien wurden auf L-Agar- Platten selektioniert, die 100 ug Ampicillin enthielten und die Plasmide wurden mittels alkalischer Lyse präpariert (Birnboim & Doly). Die Plasmide wurden durch Restriktionsenzymverdau und Gelelektrophorese analysiert und ein einzelnes Plasmid pMLB(His)6_3-EM70/1, das das 932 Bp grosse EcoRI-Fragment in der richtigen Orientierung enthielt, wurde ausgewählt.
Der Salmonella gallinarum 9R-Stamm (H. Williams Smith, J. Hygiene, 54, 419, 1956) wurde mit dem Plasmid pMLB1113(His)6_3-EM70/1 unter Verwendung des Höchste- Effizienz-Protokoll von Hanahan (J. Mol. Biol. 166, 557, 1983) transformiert. Eine plaquegereinigte rekombinante Kolonie wurde unter Belüftung in 50 ml L-Brühe + 50 ug Ampicillin bei 37ºC gezüchtet und bis zu einer Dichte von 108 Bakterien/ml wachsen gelassen.
Die Bakterien wurden konzentriert und durch 10-minütige Zentrifugation bei 4000 g und 4ºC gewaschen und mit L-Brühe bis zur immnunisierenden Konzentration von 10&sup9;/ml verdünnt.
Zwölf drei Wochen alte Weisse Leghorn-Hühner wurden mit 105 Salmonella 9R-EM70/1 in 0,1 ml L-Brühe intramuskulär geimpft. Diese Impfung wurde zweimal in zwei wöchentlichen Intervallen wiederholt. Der Salmonellen-Elternstamm wurde auf gleiche Weise behandelt und in der gleichen Dosis den Kontrollhühnern verabreicht. Alle Hühner wurde zwei Wochen nach der letzten Impfung infiziert. Infektion (Challenge) und Bestimmung des Schutzes wurden wie in Beispiel 8.a.ii beschrieben, durchgeführt.

11.b. Ergebnisse

Die Reduzierung der mittleren Oozysten-Ausscheidung beider Gruppen ist in Tabelle 4 dargestellt.
Hühner, die den Salmonellenvektorimpfstoff erhalten hatten, hatten durchschnittlich niedrigere Oozysten- Ausscheidungen im Vergleich zu ihren Kontrollen. Dies zeigt, dass dieser Vektorimpfstoff zur Reduzierung der Parasitenmenge der geimpften Tiere und dabei zur Reduzierung der pathogenen Wirkungen, die mit der Infektion einhergehen, verwendet werden kann. Tabelle 1 Stimulationsanzeichen von immunen und Kontrollhühnern, die von Nitrozellulose stammenden Antigenen von E.maxima- Sporozoiten ausgesetzt werden. Tabelle 2 2-D-Gel-Analyse von E.maxima H-Sporozoiten - Identifizierung der Flecken, die das lymphatische System stimulieren und die von Hasen-anti70kDa-Serum oder Klonspezifischen Antikörpern erkannt werden. Tabelle 3 In vivo-Schutz gegen eine Challenge-Infektion mit E.maxima: Oozysten-Ausscheidung von Vögeln, die mit dem Fusionsprotein pRSETAEm70/1 (Gruppe 1) geimpft wurden, im Vergleich zu scheinimmunisierten Hühnern (Gruppe 2).

Tabelle 4

Mittlere E.maxima-Oozysten-Ausscheidung von Hühnern, die mit S.gallinarum-Em70/1 geimpft wurden.

Behandlung Oozysten-Ausstoss [· 10&supmin;&sup6;]
S.gallinarum-Em70/1 34,0 ± 9
S. gallinarum 9R Kontrolle 41,3 ± 13

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: Akzo Nobel N. V.
(B) STRASSE: Velperweg 76
(C) ORT: NL-6824 BM Arnhem
(E) LAND: Niederlande
(F) POSTLEITZAHL (ZIP): NL-6824
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Kokzidiose-Geflügelimpfstoff
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 10
(iv) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Diskette
(B) COMPUTER: IBM-PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (EPO)
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1400 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA bis mRNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN
(v) ART DES FRAGMENTS: C-terminal
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Eimeria maxima
(B) STAMM: Houghton
(D) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Sporozoit
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK: Sporozoiten-cDNA, kloniert in Lambda ZAPII
(B) KLON: Em70-1
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1..1368 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 1:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 456 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 2.
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 242 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA bis mRNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN
(v) ART DES FRAGMENTS: C-terminal
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Eimeria maxima
(B) STAMM: Houghton
(D) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Sporozoit
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK: Sporozoiten-cDNA, kloniert in Lambda ZAPII
(B) KLON: Em70-4, 5'-Ende des Klons
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 3..242 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 3:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 4:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 80 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 4:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 5:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 250 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA bis mRNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iii) ANTISENSE: NEIN
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Eimeria maxima
(B) STAMM: Houghton
(D) ENTWICKLUNGSSTADIUM: Sporozoit
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK: Sporozoiten-cDNA, kloniert in Lambda ZAPII
(B) KLON: Em70-4, 3'-Ende des Klons (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 5:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 6:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 35 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 6:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 7:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 38 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 7:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 8:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 8:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 9:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 46 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 9:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 10:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 46 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 10:

Claims

1. T-Lymphozyten stimulierendes Eimeria-Protein, dadurch gekennzeichnet, dass es die in SEQ ID NO: 2 dargestellte Aminosäuresequenz oder mindestens einen T-Lymphozyten stimulierenden Teil oder ein biologisch funktionales Äquivalent davon umfasst, wobei der genannte Teil oder das Äquivalent eine oder mehrere immunogen wirksame Determinanten auf dem Protein zurückbehält, welches die in SEQ ID NO: 2 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst, die fähig ist eine T-Lymphozyten stimulierende Immunantwort in Geflügel auszulösen.

2. Nukleinsäuresequenz, die ein Protein nach Anspruch 1 codiert.

3. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenz mindestens einen Teil der in SEQ ID NO: 1 gezeigten DNA-Sequenz enthält.

4. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 2 oder 3 umfasst, die operativ an eine Expressionskontrollsequenz gebunden ist, die eine Expression der genannten Nukleinsäuresequenz ermöglicht.

5. Rekombinanter Vektor, der eine Nukleinsäure nach Anspruch 2 oder 3 umfasst.

6. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenz operativ an eine Expressionskontrollsequenz gebunden ist.

7. Wirtszelle, die mit einer Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 2 oder 3 oder mit einem rekombinanten Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 4 oder mit einem rekombinanten Vektormolekül nach Anspruch 5 oder 6 transformiert ist.

8. Verfahren zur Expression des Proteins nach Anspruch 1, wobei das genannte Verfahren das Züchten einer Wirtszelle nach Anspruch 7 umfasst.

9. Impfstoff zum Schutz von Geflügel gegen Kokzidiose, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Protein nach Anspruch 1, ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 4 oder ein rekombinantes Vektormolekül nach Anspruch 5 oder 6, oder eine Wirtszelle nach Anspruch 7 zusammen mit einem tiermedizinisch annehmbaren Trägerstoff umfasst.

10. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes gegen Kokzidiose, das die Schritte des Züchtens einer Wirtszelle nach Anspruch 7, Gewinnen des rekombinanten Vektors und Formulieren des genannten rekombinanten Vektors in ein tiermedizinisches Präparat mit immunisierender Aktivität umfasst.

11. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes gegen Kokzidiose, das das Formulieren eines Proteins nach Anspruch 1, oder eines gemäss Anspruch 8 hergestellten Proteins in ein veterinärmedizinisches Präparat mit immunisierender Aktivität umfasst.

12. Antikörper oder Antiserum, das mit einem Protein nach Anspruch 1 immunreagiert.

13. Immunochemisches Reagenz, das ein Protein nach Anspruch 1 umfasst, worin das genannte Reagenz an einen Träger gebunden oder mit einer markierenden Substanz ausgestattet ist.

14. Test-Set für die Diagnose einer Eimeria-Infektion, welches eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 2 oder 3 oder einen Antikörper oder Antiserum nach Anspruch 12 oder ein immunochemisches Reagenz nach Anspruch 13 umfasst.