DE68921923T2

DE68921923T2 - Rekombinante Coccidiosis-Vakzine.

Info

Publication number: DE68921923T2
Application number: DE68921923T
Authority: DE
Inventors: Werner Altenburger; Mary-Helen Binger; Richard Anthony Chizzonite; Richard Allen Kramer; Peter Thomas Lomedico; Stephen J Mcandrew
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: Alpharma Luxembourg SARL
Priority date: 1988-06-03
Filing date: 1989-06-02
Publication date: 1995-08-10
Anticipated expiration: 2009-06-03
Also published as: EP0344808A1; JP3051130B2; JPH037594A; IE891812L; AU3601689A; MC2039A1; FI892714A0; NO892251D0; KR910000183A; DE68921923D1; US20030175311A1; HU212505B; AU635704B2; FI892714A; FI101453B1; ES2070866T3; PT90727A; CN1187368A; ZA893740B; FI101453B

Description

Kokzidiose ist eine Geflügelkrankheit, die durch intrazelluläre protozoische Parasiten der Gattung Eimeria verursacht wird. Die Krankheit ist endemisch in grossen Geflügelintensivzuchtanstalten und die geschätzten Kosten der Kontrolle der Krankheit durch Chemotherapie überschreiten 100 Millionen Dollar jedes Jahr allein in den Vereinigten Staaten von Amerika. Die Entwicklung einer Resistenz gegen die bekannten Antikokzidiose-Arzneimittel erfordert es, die Entwicklung neuer Mittel fortzusetzen zu einer Zeit, wo die Arzneimittel-Entwicklung immer teurer wird und die Verbraucher-Akzeptanz von Arzneimittel-Rückständen bei Tieren, die als Nahrung dienen, abnimmt.
Eine schützende Iimnunität gegenüber natürlicher Kokzidiose- Infektion ist gut belegt. Es wurde gezeigt, dass eine kontrollierte tägliche Verabreichung einer geringen Anzahl lebensfähiger Oozysten mehrere Wochen lang zu einer vollständigen Immunität gegenüber einer Kontaktinfektion mit einer normalerweise virulenten Dosis führt [Rose et al., Parasitology 73:25 (1976); Rose et al., Parasitology 88:199 (1984)]. Die Demonstration der erworbenen Resistenz gegenüber der Infektion weist auf die Möglichkeit der Herstellung eines Impfstoffs hin, um bei jungen Hühnern eine Immunität zu induzieren, wodurch der Bedarf für chemische Kokzidiostatika umgangen wird. Tatsächlich wurde ein derartiger Plan getestet bei der Coccivac -Formulierung von Sterwin Laboratories, Opelika, AL, USA.
Im Hinblick auf eine Herstellung eines Kokzidiose-Impfstoffs stellten Murray et al., Europäische Patentanmeldung, Veröffentlichungs-Nr. 167,443, Extrakte aus Sporozoiten oder sporulierten Oozysten von Eimeria tenella her, die mindestens 15 Polypeptide enthielten, von denen viele mit der Oberfläche des Sporozoiten in Verbindung gebracht wurden. Die Injektion dieser Extrakte in Hühner verminderte zäkale Schädigung nach einer oralen Impfung mit virulenten sporolierten E. tenella Oozysten.
Kürzlich offenbarten Schenkel et al., US-Patent Nr. 4,650,676 die Herstellung monoklonaler Antikörper gegen E. tenella-Merozoiten. Unter Verwendung dieser Antikörper identifizierten Schenkel et al. eine Anzahl von Antigenen, gegen die die Antikörper gerichtet waren. Durch Vorinkubieren von E. tenella-Sporozoiten mit diesen Antikörpern und Einführen der behandelten Sporozoiten in die Zäka von Hühnchen, konnten Schenkel et al. eine gewisse Verminderung der zäkalen Schädigungsraten zeigen, verglichen mit unbehandelten Sporozoiten-Kontrollen.
Fortschritte in der rekombinanten DNS Technologie haben eine weitere Vorgehensweise verfügbar gemacht, nämlich Untereinheitenvakzine. In der Anwendung geläufiger rekombinanter DNS Verfahren werden spezifische DNS Sequenzen in ein geeignetes DNS Vehikel oder Vektor eingefügt, um ein rekombinantes DNS Molekül, das in einer Wirtszelle replizieren kann, zu bilden. Kreisfbrrnige doppelsträngige DNS Moleküle, genannt Plasmide, werden häufig als Vektoren verwendet und die Herstellung solcher rekombinanter DNS Formen hat die Verwendung von Restriktionsendonukleaseenzymen zur Folge, die die DNS an spezifischen Basensequenzstellen schneiden können. Wenn durch ein Restriktionsenzym in einem Plasmid und in dem Segment der Fremd-DNS, das einzufügen ist, einmal Schnitte gemacht worden sind, können die zwei DNS Moleküle kovalent durch ein Enzym, das als Ligase bekannt ist, verbunden werden. Allgemeine Methoden zur Herstellung von solchen rekombinanten DNS Molekülen sind von Cohen et al. [U.S. Patent Nr. 4,237,224], Collings et al. [U.S. Patent Nr. 4,304,863] und Maniatis et al. [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory] beschrieben worden. Da sie viel vom Stand der Technik veranschaulichen, wurden diese Referenzen hierin durch Bezugnahme aufgenommen.
Einmal hergestellt, können die rekombinanten DNS Moleküle zur Herstellung des Produktes, das durch die eingefügte Gensequenz spezifiziert ist, nur verwendet werden, wenn eine Anzahl von Bedingungen erfüllt ist. An erster Stelle ist die Bedingung zu nennen, dass das rekombinante Molekül kompatibel und somit fähig zur autonomen Replikation in der Wirtszelle ist. Ein Grossteil der letzten Arbeiten hat Escherichia coli als Wirtsorganismus verwendet, weil dieser kompatibel ist mit einer grossen Anzahl von rekombinanten Plasmiden. Abhangig von dem Vektor/Wirtszellsystem, das verwendet wird, wird das rekombinante DNS Molekül in den Wirt durch Transformation, Transduktion oder Transfektion eingeführt.
Der Nachweis der Anwesenheit des rekombinanten Plasmids in Wirtszellen kann bequemerweise durch die Verwendung von Plasmidmarkeraktivitäten, wie beispielsweise Antibiotikaresistenzen, erreicht werden. So kann ein Wirt, der ein Plasmid beinhaltet, das für die Herstellung eines Enzyms, das Ampicillin abbaut, kodiert, von nicht veränderten Zellen selektiert werden dadurch, dass der Wirt in einem Medium, enthaltend Ampicillin, wachsen gelassen wird. Einen weiteren Vorteil kann man sich von den Antibiotikaresistenzmarkern zu Nutze machen, wo ein Plasmid für eine zweite Antibiotika abbauende Aktivität, an einer Stelle, wo die selektiefte Restriktionsendonuklease schneidet und die Fremdgensequenz eingefägt ist, kodiert. Wirtszellen, die in richtiger Weise rekombinante Plasmide enthalten, werden dann durch die Resistenz zum ersten Antibiotikum aber Sensitivität zum zweiten charakterisiert.
Nur die Einfügung eines rekombinanten Plasmids in eine Wirtszelle und Isolierung des modifizierten Wirts wird nicht an sich alleine dafür sorgen, dass bedeutende Mengen des gewünschten Genprodukts hergestellt werden. Damit dies passiert, muss die Fremdgensequenz in einer geeigneten Beziehung zu einer Signalregion in dem Plasmid zur DNS Transkription, genannt Promoter, fusioniert werden. In alternativer Weise kann die Fremd-DNS ihren eigenen Promoter tragen und zwar solange, wie er durch den Wirt anerkannt wird. Unabhängig von seinem Ursprung ist der Promotor eine DNS Sequenz, die die Bindung der RNS Polymerase steuert und dadurch die Transkription der DNS zu Boten-RNS (mRNS) fördert.
Wenn starke Förderung vorliegt, die grosse Mengen von mRNS zur Verfügung stellen kann, wird die Herstellung des gewünschten Genprodukts von der Wirksamkeit der Translation von der mRNS zum Protein abhängen. Diese ist wiederum abhängig von der Wirksamkeit der ribosomalen Bindung an die mRNS. In E. coli beinhaltet die ribosomale Bindungsstelle auf der mRNS einen Initiationskodon (AUG) und eine stromaufwärts gelegene Shine-Dalgarno-Sequenz (SD). Diese Sequenz, die 3- 9 Nukleotide enthält und 3-11 Nukleotide vom AUG Kodon entfernt liegt, ist zum 3' Ende der E. coli 165 ribosomalen RNS (rRNS) komplementär [Shine und Dalgarno, Nature 254, 34 (1975)]. Ganz offensichtlich wird die ribosomale Bindung an die mRNS durch Basenpaarung zwischen der SD Sequenz in der mRNS und der Sequenz am 3' Ende der 165 rRNS erleichtert. Für einen Übersichtsartikel bezüglich der Maximierung der Genexpression, siehe Roberts und Lauer, Methods in Enzymology 68, 473 (1979).
Ein alternatives Expressionssystem ist auf der Grundlage des lacZ Operons in Verbindung mit Lambda Phagenvektoren entwickelt worden (Huynh et al., in DNA Cloning: Volumen I, D.M. Glover, Ed.). In diesem System sind das Strukturgen für β-Galactosidase zusammen mit dem induzierbaren Promotor, der seine Expression kontrolliert, in den Phagenvektor eingebaut worden. Eine einzige Klonierurigsstelle am 3' Ende des Gens für die β-Galactosidase hat eine Genfusion nach Einfügung einer cDNS Kopie einer mRNS oder eines genomischen DNS Fragments, enthaltend eine proteinkodierende Region, zur Folge.
Expression des β-Galactosidasegens hat die Herstellung eines Fusionsproteins enthaltend 114 kd der β-Galactosidase und am carboxyterminalen Ende das durch die cDNS Einfügung kodierte Polypeptid zur Folge unter der Voraussetzung, dass die Einfügung einen offenen Leserahmen in derselben Weise wie der Leserahmen der β-Galactosidase hat. Ein Phage, der ein Gen enthält, dessen Produkt durch ein monoklonales oder polyklonales Antiserium erkannt wird, kann so durch immunologisches Screening einer Bank identifiziert werden, nach Induktion der Expression des Fusionsproteins unter Verwendung von β-D- Thiogalactopyranosid (IPTG), um den lacZ-Repressor zu inaktivieren. Dieses Expressionssystem verbindet die Effizienz des Phagensystems in der Verpackung von DNS und Einführung in E. coli Zellen mit einer verstärkten Stabilität von Polypeptidfusionen mit β-Galactosidase.
Bei der Vakzinuntereinheitsvorgehensweise wird eine Untereinheit des gesamten infektiösen Organismus dem Wirtstier in einem immunologisch relevanten Zusammenhang übertragen. Die Untereinheit kann ein von dem Parasiten gereinigtes Protein, ein rekombinantes Protein oder ein in einem heterologen System exprimiertes Proteinfragment, ein synthetisches Peptid das eine einzige neutralisierende Determinante enthält, oder ein durch einen viralen Vektor, wie beispielsweise Vaccinia, eingeführtes Protein, sein. Das Wirtsimmunsystem erstellt eine spezifische Antwort auf die Untereinheit ohne jemals gegenüber dem gesamten Parasiten exponiert worden zu sein. Bei Herausforderung mit einer virulenten Dosis des infektiösen Organismus erstellt das Wirtsimmunsystem eine erfolgreiche Verteidigung, angeleitet nur durch die Vakzinuntereinheit, der gegenüber es vorher exponiert worden ist.
Evidenzen können in der Literatur gefunden werden, dass zirkulierende Antikörper, sekretorische IgA im Intestinalepithelium [Davis et al., Immunology 34, 879 (1978)] und das durch Zellen vermittelte Immunsystem [Giambroni et al., Poultry Science 59, 38 (1980)] in der erlangten Resistenz gegen Kokzidiose involviert sind. Als Übersichtsartikel siehe P.S. Davis in Avian Immunology, M.E. Rose, Ed., British Poultry Science, Ltd., Edenberg, 361-385 (1981). Das mögliche Beiteiligtsein von verschiedenen Teilen des Immunsystems bedeutet, dass ein vollständiger und andauernder Schutz die Fähigkeit benötigt, spezifische Aspekte des natürlichen Infektionsprozesses zu imitieren. Diese Aspekte beinhalten eine lokale Exposition an der Stelle, wo Schutz gewünscht wird, das Hervorrufen einer inflammatorischen Antwort um die Antigen prozessierenden Zellen aufzustellen, Präsentation des geeigneten Parasitenantigens und möglicherweise Assoziation mit MHC Determinanten in einer bestimmten Membrankonfiguration.
Die Erfindung stellt gereinigte Proteine oder Fragment davon, die eine oder mehrere immunreative und/oder antigenische Determinanten von einem Eimeriaoberflächenantigen haben, zur Verfügung.
Etwas spezieller stellt die Erfindung Proteine, die eine oder mehrere immunreaktive und/oder antigenische Determinanten von einem Eimeriaoberflächenantigen haben, zur Verfügung, wobei das Oberflächenantigen ein anscheinendes Molekulargewicht von etwa 28, 37, 120 oder grösser als 200 Kilodaltons hat und spezifisch an einen oder mehrere monoklonale Antikörper, die bei der American Type Culture Collection (ATCC) hinterlegt wurden und denen die Zugangsnummern HB 9707 bis HB 9712 zugeordnet wurden. Beispiele für besagte Proteine sind Proteine, die die Aminosäuresequenzen haben, die in Fig. 15, 17, 19 und 21 gezeigt sind, und seine funktionellen Äquivalente davon. Besagte funktionelle Äquivalente sind Proteine, die Aminosäuresequenzen haben, die von den obengenannten Aminosäuresequenzen, durch Additionen, Deletionen, Insertionen und Aminosäuresubstitutionen erhalten, abgleitet wurden, unter der Voraussetzung, dass diese Proteine eine oder mehre immunreative und/oder antigenische Determinanten eines Eimeriaoberflächenantigens zurückbehalten haben. Die besagten Proteine können für die Immunisierung von Geflügel gegen Kokzidiose verwendet werden.
Diese Erfindung stellt weiterhin Antikörper zur Verfügung, die gegen die obengenannten Proteine gerichtet sind, speziell monoklonalen Antikörper wie die monoklonalen Antikörper mit den Zugangsnummern HB 9707, HB 9708, HB 9709, HB 9710, HB 9711 und HB 9712.
Diese Erfindung stellt weiterhin DNS Sequenzen zur Verfügung, die die obengenannten Proteine kodieren, rekombinante Vektoren, die solche DNS Sequenzen enthalten, speziell rekombinante Vektoren, die fähig sind, die Expression der besagten DNS Sequenzen in kompatiblen Wirtsorganismen leiten zu können und Wirtsorganismen, die mit solchen rekombinanten Vektoren transformiert wurden, speziell transformierte Wirtsorganismen, die fähig sind, die DNS Sequenzen zu exprimieren, die für ein obengenanntes Protein kodieren, enthalten und von dem besagten Vektor umfasst sind.
Diese Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins zur Verfügung, das eine oder mehrere immunoreaktive und/oder antigenische Detemerinanten eines Eimeria tenella Oberflächeantigens hat, wobei der Prozess umfasst:
(a) das Kultivieren eines Wirtsorganismus, der mit einem rekombinanten Vektor transformiert worden ist, der eine DNS Sequenz umfasst, die besagtes Protein unter Konditionen, in welchen die DNS Sequenz exprimiert wird, kodiert; und
(b) die Isolierung des Proteins oder Fragments aus der Kultur.
Diese Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Verfügung für die Herstellung eines obengenannten transformierten Wirtsorganismus, wobei das Verfahren die Transformation eines Wirtsorganismus mit einem rekombinanten Vektor umfasst, der eine DNS Sequenz umfasst, die für ein Protein der vorliegenden Erfindung kodiert und zwar mittels an sich bekannten Methoden.
Diese Erfindung stellt weiterhin Vakzine zum Schützen von Geflügel gegen Kokzidiose zur Verfügung, die eine oder mehrere von den Proteinen der Erfindung und einen physiologisch akzeptablen Träger umfassen.
Diese Erfindung stellt weiterhin Vakzine zum Schützen von Geflügel gegen Kokzidiose zur Verfügung, die einen viralen Vektor umfassen, der eine DNS Sequenz oder ein Fragment davon enthält, das für ein Protein der Erfindung kodiert, welcher viraler Vektor fähig ist, die DNS Sequenz oder Fragment zu exprimieren, und einen physiologisch akzeptablen Täger.
Diese Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zum Schützen von Geflügel gegen Kokzidiose zur Verfügung, welches Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Vakzins der Erfindung an junges Geflügel, das empfänglich ist für Kokzidiose, umfasst.
Die vorliegende Erfindung kann leichter durch Bezugnahme auf die folgende Beschreibung der Erfindung und die Beispiele in Verbindung mit den folgenden Figuren verstanden werden, in welchen:
Fig. 1 zeigt das Ergebnis von einem E. tenella Sporozoiten ELISA. Verdünnungen von Immunmausserum (MS 107-2;Δ) und Konfrollmausserum (X) wurden mit 4 x 10&sup4; lebenden, gereinigten Sporozoiten inkubiert. Spezifische Antikörper gebunden an die Sporozoiten wurden mit einem Peroxidase-gekoppelten anti Maus IgG Antikörper und dem Peroxidase-Substrat o-Phenylendiamin nachgewiesen. Die OD&sub4;&sub9;&sub2;nm wurde in einem Titertek Multiscan Plattenleser gelesen.
Fig. 2. zeigt die Ergebnisse von einem Westernblotassay, der mit solubilisierten Proteinen von E. tenella Sporozoiten durchgeführt worden ist. Solubilisierte Sporozoitenproteine wurden mittels reduzierender SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese in 12.5 % Gelen aufgetrennt, auf Nitrozellulosemembrane übertragen und mit jedem Antikörper reagieren gelassen. Die spezifischen Proteine, die durch jeden Antikörper erkannt wurden, wurden mit Peroxidase-gekoppelten anti Maus IgG Antikörper und dem Peroxidasesubstrat 4-Chlor-1-Naphthol sichtbar gemacht. Der Antikörper, der mit jedem Streifen reagierte, ist an der Spitze des Streifens angegeben.
Fig. 3. zeigt das Ergebnis von einem Westernblotassay, der mit solubilisierten Proteinen von Sporozoiten und Merozoiten von E. tenella und von Sporozoiten von E. acervulina durchgeführt wurde. Verschiedene monoklonale Antikörper und Seren wurden mit auf Nitrozellulose gebundenen Eimeria Proteinen inkubiert und wie in der Beschreibung von Fig. 2. sichtbar gemacht. Die verwendeten monoklonalen Antiköper beinhalteten 3A5 (1), 20C6 (2), 7D1 (3), 13A6 (4), 6A5 (5) und ein Kontrollantikörper, der mit den Eimeraproteinen nicht reagierte. Die verwendeten Seren beinhalteten das Maus Nr. 107-2 Immunserum (7) und ein Kontrollserum (8).
Fig. 4 zeigt in der linken Reihe die Ergebnisse von einem Immunpräzipitationsassay mit ¹²&sup5;I-markierten Oberflächenproteinen von E. tenella Sporozoiten. Sporozoitenoberflächenproteine wurde entweder mit der IODOGEN oder IODOBEADS Methode markiert, solubilisiert und sichtbar gemacht nach SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese in 12.5 % Gelen durch Autroradiographie. Die rechte Reihe zeigt die Ergebnisse von einer Immunprazipitation von ¹²&sup5;I-markierten Sporozoitenoberflächenproteinen durch Serum von Mäusen, die mit lebenden Sporozoiten immunisiert wurden. Immunmausseren (105-1, 105-2, 105-3, 107-1, 107-2 und 107-3) und Kontrollmausserum (Kontrolle) wurden mit ¹²&sup5;I-Sporozoitenoberflächenproteinen inkubiert und der Immunkomplex wurde durch einen an Agarose gekoppelten Antimausantikörper abgefangen. Die Immunkomplexe wurden mit Laemmli Probenpuffer solubilisiert, durch SDS-Gelelektrophorese in 12.5 % Gelen aufgetrennt und durch Autoradiographie sichtbar gemacht. M steht für das Molekulargewicht von Standardmarkerproteinen in Kilodalton.
Fig. 5 zeigt die Ergebnisse von Immunpräzipitation von ¹²&sup5;I- Sporozoitenoberflächenproteinen durch monklonale Antikörper. Das Verfahren zur Identifikation der ¹²&sup5;I-Proteine, die durch jeden Antikörper gebunden wurden, ist in der Beschreibung zu Fig. 4 erklärt. Die spezifischen Sporozoiten monoklonalen Antikörper, die verwendet wurden, und der Kontrollantikörper (Kontrolle) ist an dem oberen Ende jeder Gelbahn angegeben. Die Molekulargewichte von Standardmarkerproteinen sind in Kilodaltons angezeigt.
Fig. 6 zeigt Phasenkontrastmikrographen und Mikrographen von mittels Inimunfluoressenz markierter Muster mittels verschiedener monoklonaler Antikorper von luftgetrockneten E. tenella Sporozoitenobjekttragerpraparationen. Die linke Seite von Feld A, B, C und D sind Phasenkontrastmikrographen, die intakte verlängerte Sporozoiten zeigen, mit grossen postenoren refraktilen Körpern (PRB), einem kleinen antenoren refraktilen Körper (ARB) und dem apicalen Ende (A) gegenuber den posterioren refraktilen Körpern. Die rechte Seite der Felder A, B, C und D zeigt Objekttrager, die mit monoklonalen Antikorpern 14C3 (spezifisch für Oberflächenantigene), 6A5 (spezifisch für Oberflächenproteine und refraktile Körperproteine), 11D2 (spezifisch für Sporozoiten apicale Spitzen) und Kontrollantikörpern, respektive. Die an die Präparationen gebundenen Antikörper wurden mit rhodamin-konjugierten Antimausantikörpern lokalisiert und durch Epifluoressenz mittels eines Leitz Dialux 22 Mikroskops sichtbar gemacht. Alle Mikrographen sind 630X.
Fig. 7. zeigt mit Antikörper angefärbte intrazelluläre Sporozoiten und entwickelnde Parasiten in Hühnernierenzellen. Hühnernierenzellen wurden mit Sporozoiten infiziert und zu den angegebenen Zeiten nach Infektion wurden die Zellen für die Antikörperanfärbung weiterverarbeitet. Die Kulturen wurden vor der Fixierung gewaschen, um allfällige extrazelluläre Sporozoiten zu entfernen. Phasenkontrast und korrespondierende Immunofluoressenzmikrographen wurden mittels der Antiköper 7D4, 8A2, 7B2 und 15A3 wie angegeben gemacht. Die an das Präparat gebundenen Antikörper wurden mit Rhodamin-konjugierten Antimausantikörpern lokalisiert und durch Epifluoressenz sichtbar gemacht. Alle Mikrographen waren 630X.
Fig. 8 zeigt Antikörperanfärbung von intrazellulären Sporozoiten und die sich entwickelnden Parasiten in Hühnernierenzellen. Phasenkontrastmikrographen und entsprechende Immunfluoressenzmikrographen wurden mittels den monoklonalen Antikörpern 14B1 und 19D6, Immunhühnerseren und fluoreszierenden zweiten Antikörper zu den angegebenen Zeitpunkten gemacht.
Fig. 9 zeigt die Neutralisierung von intrazellulärer Sporozoitenentwicklung durch anti-sporozoiten Antikörper. Gereinigte E. tenella Sporozoiten wurden für einer Stunde bei 40ºC vorinkubiert mit entweder Kontrollantikörpern (X) oder anti-sporozoiten Antikörpern 7D4 ( ) 8A2 (O), 14B1 ( ) oder 6A5 ( ) und dann durften sie MDBK Zellkulturen infizieren. Die Sporozoiten wurden auch mit Medium (Δ) oder mit der antikokzidiosen Droge, Lasalozid(*) vorinkubiert.
Nach Infektion wurde die Entwicklung von intrazellulären Sporozoiten durch den Einbau von ³H-Uracil in die Zellkulturen gemessen. Da Lasalozid die intrazelluläre Entwicklung von Sporozoiten verhindert, zeigten Kulturen, die mit dieser Drogen vorbehandelt wurden, minimalen Einbau von ³H-Uracil.
Fig. 10 zeigt die Ergebnisse einer SDS-polyacrylamidgelelektrophoretischen/Westernblotanalyse von 65 Kd-β-Galactosidasefusionsproteinproben oder anderen, wie angegebenen, Proben. Die Westernblotanalyse wurde durchgeführt mittels Murinanti-β-Galactosidaseantikörper (Feld A) oder gepoolten monoklonalen Antiköpern 7D1, 7D4 und 20C6 (Feld B) in Verbindung mit Ziegen anti Maus HPOD Konjugaten. Die Linien in beiden Feldern repräsentierten (1) β-Galactosidase, (m) vormarkierte Molekulargewichtsmarker, deren Grösse links auf der Platte A in kd angegeben sind, (2) Gesamtzellniederschlagsprotein, (3) Protein freigesetzt vom Zellpellet durch Beschallen und (4) Protein solubilisiert durch Guanidin-HCl aus dem Pellet nach Beschallen.
Fig. 11 ist eine schematische Darstellung von Plasmid pEV/2-4, ein 65 kd Proteinexpressionsplasmid enthaltend ein 1.7 kb EcoRI DNS Insert vom Phage λm2-4. Positionen von verschiedenen Restriktionsenzymstellen in der Einfügung sind relativ zu der EcoRI Stelle gezeigt, einschliesslich PstI (P, bei bp 53 und 776), KpnI (K, bei bp 202), BstNI (B, bei bp 584, 1303 und 1412) und Sau3A (S, bei bp 1017 und 1439).
Fig. 12 ist eine Karte von pEV3-SEQ, enthaltend einen Polylinker mit den angegebenen Stellen eingefügt zwischen der EcoRI und SalI Stelle von pEV-vrf3. Das synthetische Oligonukleotid CGGTCGACTCGAGCCA angegeben durch den gestrichelten Pfeil wurde als ein Primer für die Kettenbeendigung-DNS-Sequenzanalyse verwendet.
Fig. 13 ist eine Restriktionskarte von cDNS Klonen, die Proteine kodieren, die durch den monoklonalen Antikörper 6A5 erkannt werden. Restriktionsendonukleasestellen, die für die Maxam-Gilbert DNS- Sequenzanalyse der 1.1 kb cDNS verwendet werden, sind gezeigt. Die EcoRI Stelle in Klammern ist an dem Ende der 0.9 kb cDNS. Der Stab oberhalb der Karte zeigt den offenen Leseraum, der von der DNS Sequenz vorhergesagt wurde mit dem möglichen Signalpeptide ausgefüllt. Die Linien unter der Karte geben die exoIII Deletionen an, die zur Kettenbeendigunssequenzanalyse verwendet wurden.
Fig. 14 ist die Nukleotidsequenz des 1.1 kb cDNS Molekuls, die ftir das 20 kd Protein, das durch den monoklonalen Antikörper 6A5 erkannt wird, kodiert.
Fig. 15 ist die Aminosäuresequenz des Proteins der Fig. 14, vorhergesagt von der Nukleotidsequenz von dieser Figur.
Fig. 16 ist die Nukleotidsequenz des 1.7 kb cDNS Moleküls, die für das 65 kd Protein, das durch die monoklonalen Antikörper 7D1, 7D4 und 20C6 erkannt wird, kodiert.
Fig. 17 ist die Aminosäuresequenz des Proteins der Fig. 16, vorhergesagt von der Nukleotidsequenz von dieser Figur und bestätigt durch Sequenzanalyse von tryptischen Peptiden, die von dem exprimierten 65 kd Proteinen hergestellt wurden. Regionen in der gesamten Aminosäurensequenz, die einigen dieser Peptiden entsprechen, sind unterstrichen gezeigt. Die bestimmten Sequenzen von diesen Peptiden sind überstrichen.
Fig. 18 ist die Nukleotidsequenz des 1.1 kb cDNS Moleküls, die für das 28 kd Protein kodiert, das durch den monoklonalen Antikörper 8A2 erkannt wird.
Fig. 19 ist die Aminosäuresequenz des Proteins der Fig. 18, vorhergesagt von der Nukleotidsequenz von dieser Figur.
Fig. 20 ist die Nukleotidsequenz des 3.2 kb cDNS Moleküls, die fiir das Protein kodiert, das durch den monoklonalen Antikörper 7B2 erkannt wird.
Fig. 21 ist die Aminosäuresequenz des Proteins der Fig. 20, vorhergesagt von der Nukleotidsequenz von dieser Figur.
Fig. 22 ist eine SDS polyacrylamidgelelektrophetische Analyse von dem immunaffinitätsgereinigten 65 kd Protein. Das Gel wurde durch Anfärben mit Coomassieblau und durch Westernblotanalyse sichtbar gemacht. Linien 2 und 4 und 3 und 5 enthalten die gereinigten Proteinen von zwei Präparationen. Linien 1 und 6 enthalten eine Mischung von Molekulargewichtsmarkerproteinen, die die Molekulargewichte haben, die zur Linken und Rechten der Figur angegeben sind.
Fig. 23 ist ein HPLC Elutionsprofil von einem mit β-Mercaptoethanol reduzierten (Feld A) und nichtreduzierten (Feld B) tryptischen Verdau des 65 kd Proteins, das bei 215 um Absorbtion als eine Funktion der Säulenretentionszeit zeigt.
Fig. 24 zeigt eine Restriktionskarte von vier Elementen des grundlegenden Vektors, der zur Rekombination in den Vacciniavirus der Gene verwendet wurde, die für die Kokzidialantigene kodieren. Diese Elemente beinhalten das 7.5 K Promoterelement (a und b, links), den TK Locus (a und b, rechts), einen Teil des Plasmids pUC8 (c) und die Polyklonierungsstelle von M13tgl31 (d). Die Direktion der Transkription der viralen 7.5 K und TK Promotoren ist von links nach rechts (d.h. von der BglII zu der EcoRI Scbnittstelle in dem Polylinker).
Fig. 25 zeigt die Aminosäuresequenz des N-terminus des Eimeria Antigens, das durch den monoklonalen Antikörper 8A2 erkannt wird (A), und von einem Konstrukt, das den AUG Translationsstartkodon in dem Polylinkerelement des Vektors von Fig. 24 enthält, exprimiert wurde und (B) an das Malaria 190 kd Leitersegment (erste 34 Aminosäuren) und den Polylinker des Klonierungsvektors von Fig. 24 (nächsten 13 Aminosäuren) fusioniert ist. Während des Reifungsprozesses des Proteins können die ersten 19 Aminosäuren am N-Terminus an der durch ein Kolon angegebenen Position gespalten werden.
In den Figuren werden Standardeinzelbuchstabenabkürzungen verwendet, um Nukleotide zu repräsentieren und Standardein- oder dreibuchstabenabkürzungen, um Aminosäuren zu repräsentieren. Die Bedeutung von diesen Abkürzungen können in biochemischen Standardlehrbüchern wie beispielsweise Lehninger, Principles of Biochemistry, 1984, Worth Publishers, Inc., New York, S. 96,798 gefunden werden.
Wie hier verwendet, sollen die folgenden Bezeichnungen die folgenden Bedeutungen haben:
"20 kd Protein" bedeutet ein rekombinantes oder synthetisches Protein, das ein anscheinendes Molekulargewicht von etwa 20 Kilodaltons in der SDS Polyacrylamidgelelektropherese hat und das spezifisch den monoklonalen Antikörper 6A5 bindet. Dieser Antikörper reagiert auch spezifisch mit einem Eimeriaoberflächenantigen (von einem Gesamtextrakt von Eimeriaproteinen), das ein anscheinendes Molekulargewicht von etwa 28 Kilodaltons in SDS Gelen hat. Dieses Antigen ist im Sporozoitenentwicklungsstadium vorhanden. Die Nukleotidsequenz von einem cDNS Molekül, das dieses Protein kodiert, und die Aminosäuresequenz, die hiervon vorhergesagt wurde, sind in den Fig. 14 und 15, respektive gezeigt.
"65 kd Protein" bedeutet ein rekombinantes oder synthetisches Protein mit einem anscheinenden Molekulargewicht von etwa 65 Kilodaltons in der SDS Polyacrylamidgelelektrophese, das spezifisch die monoklonalen Antikörper 7D1, 7D4 und 20C6 bindet. Diese Antikörper reagieren auch spezifisch mit einem Oberflächenantigen von Eimeriaextrakten mit einem anscheinenden Molekulargewicht von etwa 120 Kilodaltons in SDS Gelen. Dieses Antigen ist in Sporozoiten-, Schizont- und Merozoitenentwicklungsstadien vorhanden. Die Nukleotidsequenz von einem cDNS Molekül, das dieses Protein kodiert und die Aminosäuresequenz, die hiervon vorhergesagt wurde, sind in den Figuren 16 und 17, respektive gezeigt.
"28 kd Protein" bedeutet ein rekombinantes oder synthetisches Protein mit einem anscheinenden Molekulargewicht von etwa 28 Kilodaltons in SDS Polyacrylamidgelelektrophorese, das spezifisch den monoklonalen Antikörper 8A2 bindet. Dieser Antikörper reagiert auch spezifisch mit einem Eimeriaoberflächenantigen mit einem anscheinenden Molekulargewicht von etwa 37 Kilodaltons in SDS Gelen. Dieses Antigen ist in den Sporozoiten-, Schizont- und Merozoitenentwicklungsstadien vorhanden. Die Nukleotidsequenz von einem cDNS Molekül, das dieses Protein kodiert, und die davon vorhergesagte Aminosäuresequenz sind in Fig. 18 und 19, respektive gezeigt.
"45 kd Protein" bedeutet ein rekombinantes oder synthetisches Protein mit einem anscheinenden Molekulargewicht von etwa 45 Kilodaltons in der SDS Polyacrylamidgelelektrophorese, das spezifisch den monoklonalen Antikörper 7B2 bindet. Dieser Antikörper reagiert auch spezifisch mit einem Eimeriaoberflächenantigen mit einem anscheinenden Molekulargewicht von grösser als 200 Kilodaltons in SDS Gelen. Dieses Antigen ist in dem Sporozoitenenentwicklungsstadium vorhanden. Die Nukleotidsequenz von einem cDNS Molekül, das dieses Protein kodiert, und die Aminosäuresequenz, die davon vorher gesagt wurde, sind in Fig. 20 und 21, respektive gezeigt.
Die Bezeichnung "Protein mit einer oder mehrerer immunreaktiven und/oder antigenischen Determinanten eines Eimeriaoberflächenantigens" bedeutet ein Protein mit einer oder mehreren Regionen oder Epitopen, die fähig sind, eine Immunantwort in einem immunologisch kompetenten Wirtsorganismus hervorzurufen und/oder spezifisch an einen komplementären Antikörper zu binden.
Aufgrund der Entartetheit des genetischen Codes, ist es verständlich, dass es viele potentielle Nukleotidsequenzen (funktionelle Äquivalente) gibt, die für die in Fig. 15, 17, 19 und 21 gezeigten Aminosäuresequenzen kodieren können. Es sollte auch verstanden werden, dass die Nukleotidsequenzen der DNS Sequenzen und Fragmente der Erfindung, die in die Vektoren eingefügt wurden, Nukleotide enthalten können, die nicht Teil des wirklichen Strukturgens sind und zwar, solange als die rekombinanten Vektoren, die solche Sequenzen und Fragmente enthalten, fähig sind, die Herstellung in einem geeigneten Wirtsorganismus von einem Protein oder einem Fragment mit einem oder mehreren immunreaktiven und/oder antigenischen Determinanten von einem Eimeriaoberflächenantigen zu dirigieren.
Überdies ist es bekannt, dass Aminosäuresubstitutionen in Proteinen, die nicht essentiell die biologischen und immunologischen Aktivitäten ändern, vorkommen und sind beispielsweise von Neurath et al., in "The Proteins", Academic Press, New York (1979), insbesondere in Fig. 6 auf Seite 14 beschrieben worden. Die am häufigsten beobachteten Aminosäuresubstitutionen sind Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly, und umgekehrt.
Solche funktionell äquivalente Nukleotidsequenzvariationen und Aminosäuresubstitutionen der exemplifizierten Verkörperung der Erfindung sind innerhalb des Umfangs der Erfindung, solange die resultierenden Proteine eine oder mehrere immunreaktive und/oder antigenische Determinanten von einem Eimeriaoberflächenantigen zurückbehalten.
Der Ausdruck "Fragment" bedeutet eine DNS Sequenz oder Protein, das eine Subsequenz von einer der cDNS oder Proteinen der Erfindung umfasst. Solche Fragmente können durch enzymatische Spaltung von grösseren Molekülen, mittels Restriktionsendonukleasen für die DNS und Proteasen für die Proteine, hergestellt werden. Die Fragmente der Erfindung sind jedoch nicht beschränkt auf Produkte von jeder Form von enzymatischer Spaltung sondern beinhalten Subsequenzen, deren Termini nicht enzymatischen Spaltungspunkten entsprechen. Solche Fragmente können hergestellt werden, beispielsweise durch chemische Synthese mittels der hierin zur Verfügung gestellten Sequenzdaten. DNS Fragmente können durch unvollständige komplementäre DNS (cDNS) Synthese von isolierter Boten RNS (mRNS) produziert werden. Proteinfragmente können auch durch Expression von DNS Fragmenten hergestellt werde, die für die Proteinfragmente kodieren. Solche Proteinfragmente können in dieser Erfindung nützlich sein, wenn sie eine genügende Anzahl von Aminosäureresten enthalten, um immunreaktive und/oder antigenische Determinanten darzustellen. Im allgemeinen werden etwa wenigstens 7 oder 8 Reste benötigt. Wie unten erklärt, kann es nötig sein, solche Fragmente an immunogene Trägermoleküle zu koppeln, um sie immunreaktiv zu machen.
Die Proteine dieser Erfindung können mittels in der Technik bekannter Methoden, wie beispielsweise rekombinante DNS Methode, chemische Synthese oder Isolierung aus Eimeriapräparationen hergestellt werden.
DNS, die benötigt wird, um die Proteine dieser Erfindung zu machen, können mittels der Nukleotidsequenzinformation, die in Fig. 14, 16, 18 und 20 zur Verfügung gestellt wird, chemisch synthetisiert werden. Solche chemische Synthese kann mittels jeder bekannten Methode, wobei die Phosphoramiditfestphasenmethode von Matteucci et al. [J. Am. Chem. Soc. 103, 3185 (1981)]bevorzugt wird, hergestellt werden.
In alternativer Weise kann cDNS von Eimeria mRNS gemacht werden. Boten RNS kann von Eimeria sporulierenden Oocyten oder Merozoiten mittels Standardtechniken isoliert werden. Diese mRNS Proben können dann verwendet werden, um doppelsträngige cDNS, wie bei Maniatis et al., s.o., beschrieben, zu produzieren. Diese cDNS kann dann in einen geeigneten Klonierungsvektor eingefügt werden, der dann zur Transformation von E. coli verwendet werden kann, um eine cDNS Bank zu herzustellen.
Die cDNS Bank kann dann mittels der klonierten Gene dieser Erfindung oder Fragmenten davon als Proben abgesucht werden. Solche Gene oder Fragmente können radioaktiv markiert werden, beispielsweise durch nick-translatierte Pol I DNS Polyrnerase in der Gegenwart von vier Deoxyribonukleotiden, wobei eines von diesen ³²P in der α Position enthält (Maniatis et al., s.o., S. 109), um sie als Proben zu verwenden.
Obwohl Eimeria tenella als mRNS Quelle in den folgenden Beispielen verwendet wurde, können die klonierten Gene von dieser Spezies als Proben verwendet werden, um Gene von anderen Spezien von Eimeria gemäss der DNS Sequenzhomologie zwischen den verschiedenen Spezien, zu isolieren.
Einmal identifiziert und isoliert, werden die Eimeriagene von dieser Erfindung in geeignete Expressionsvehikel eingefügt, die die Elemente enthalten, die zur Transkription und Translation der eingefügten Gensequenzen nötig sind. Nützliche Klonierungsvehikel können Segmente von chromosomalen, nichtchromosomalen und synthetischen DNS Sequenzen enthalten so wie verschiedene bekannte bakterielle Plasmide, Phagen DNS, Kombinationen von Plasmiden und Phagen DNS sowie Plasmide, die modifiziert wurden, um Phagen DNS zu verwenden oder andere Expressionskontrollsequenzen oder Hefeplasmide. Spezifische Klonierungsvehikel, die verwendet werden können und einem Fachmann bekannt sind, beinhalten ohne dadurch beschränkt zu sein, die pEV-vrf Plasmide (pEV-vrfl, -2 und -3); SV40; Adenovirus; Hefe; Lambda-gt-WES- Lambda B; Charon 4A und 28; Lambda-gt-11-Lambda B; M13-abgeleitete Vektoren, solche wie pUC8, 9, 18 und 19, pBR313, 322 und 325; pAC105; pVA51; pACY177; pKH47; pACYC184; pUB110; pMB9; co1E1; pSC101; pm121; RSF2124; pCR1 oder RP4.
Die Einfügung von Eimeriagenen in einen Klonierungsvektor kann in einfacher Weise dadurch erfolgen, wenn beide, die Gene und die gewünschten Klonierungsvehikel, mit denselben Restriktionsenzymen oder Enzymen geschnitten worden sind, da komplementäre DNS Enden dadurch produziert werden. Wenn dies nicht erreicht werden kann, mag es nötig sein, die geschnittenen Enden zu modifizieren die durch Rückverdauung einzelsträngiger DNS, um stumpfe Enden zu produzieren, hergestellt werden oder durch Erreichen desselben Resultats durch Auffüllen der einzelsträngigen Termini mit einer geeigneten DNS Polymerase. In dieser Weise kann stumpfendige Legierung mit einem Enzym wie beispielsweise T4 DNS Ligase durchgeführt werden. In alternativer Weise kann jede gewünschte Seite durch Legierung von Nukleotidsequenzen (Linkern) an die DNS-Termini hergestellt werden. Solche Linker können spezifische Oligonukleotidsequenzen, die Restriktionsseitenerkennungssequenzen kodieren, umfassen. Der gespaltene Vektor und die Eimenagene konnen auch durch homopolymensche Tailing, wie bei Morrow beschrieben, modifiziert werden [Methods in Enzymology 68, 3 (1979)].
Viele der Klonierungsvehikel, die in dieser Erfindung verwendet werden können, enthalten eine oder mehrere Markeraktivitäten, die verwendet werden können, um nach gewünschten Transformanten zu selektieren, wie beispielsweise Ampicillin- und Tetracyclinresistenz in pBR322, Ampicillinresistenz und β-Galactosidaseaktivität in pUC8 und Ampicillinresistenz in pEV-vrf2. Selektion der Wirtszellen, in die solche Vektoren eingefügt worden sind, wird dadurch sehr vereinfacht, wenn die Wirtszellen sonst die durch die Vektoren zugefügten Aktivitäten nicht enthalten.
Es sollte verstanden werden, dass die Nukleotidsequenzen, der an einer bestimmten Stelle in einem Klonierungsvehikel eingeführten Eimeriagene Nukleotide enthalten können, die nicht Teil der wirklichen Strukturgene sind. Alternativ können die Gene auch nur Teile des kompletten Wildtypgens enthalten. Alles, was benötigt wird, ist, dass die Genfragmente, die in den Klonierungsvehikel eingeführt worden sind, fähig sind, die Herstellung in einem geeigneten Wirtssystem von Polypeptiden oder Proteinen, die wenigstens eine immunreaktive und/oder antigenische Determinante von einer Eimeriaoberflächenantigen haben, zu leiten.
Die Selektion von einem geeigneten Wirtsorganismus wird durch eine Zahl von Faktoren, die in der Technik bekannt sind, bedingt. Diese Faktoren beinhalten zum Beispiel Kompatibilität mit dem ausgewählten Vektor, Toxizität von Proteinen, die durch das Hybridplasmid kodiert werden, die Einfachheit der Zurückgewinnung der gewünschten Proteine, Expressionscharakteristiken, Biosicherheit und Kosten. Eine Balance von diesen Faktoren muss gemacht werden, und es muss verstanden werden, dass nicht alle Wirte gleich effektiv zur Expression von einem bestimmten rekombinanten DNS Molekül sind.
Geeignete einzellige Wirtsorganismen, die in dieser Erfindung verwendet werden können, beinhalten, ohne dadurch begrenzt zu sein, Pflanzen, Säuger oder Hefezellen und Bakterien wie Eschericha coli, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus und Actinomyces. Besonders bevorzugt ist der Escherichia coli Stamm MC1061, der von Casadaban et al. [J. Mol. Biol. 138, 179 (1980)] beschrieben worden ist. Dieser Stamm oder jeder andere Stamm von E. coli K-12, der das Plasmid pRK248cIts enthält, kann verwendet werden. Das Plasmid pRK248cIts zur Verwendung in anderen E. coli K-12 Stämmen ist von der American Type Culture Collection verfügbar und hat die Bezugsnummer ATCC 33766. E. coli Stamm MC1061 wurde auch hinterlegt und hat die Bezugsnummer. ATCC 53338.
Die Übertragung des rekombinanten Klonierungsvektors in die Wirtszelle kann durch eine Vielfalt von Wegen durchgeführt werden. Abhängig von dem speziellen gewählten Vektor/Wirtszellsystem, kann solcher Transfer durch Transformation, Transduktion oder Transfektion erfolgen. Sobald eine modifizierte Wirtszelle produziert wurde, kann die Zelle kultiviert werden, und das Proteinexpressionsprodukt kann von der Kultur isoliert werden.
Klone, die die Eimeriaproteine der Erfindung produzieren können mittels geeigneter markierter Antikörper, die spezifisch für die Proteine sind, identifiziert werden. Monoklonale Antikörper, die bevorzugt sind, können mittels Standardmethoden wie folgt hergestellt werden.
Antigenische Proteine von Eimeria tenella werden zur Immunisierung von Tieren, wie Mäusen, Ratten, Pferden, Schafen, Schweinen, Hasen etc. verwendet, um antikörperproduzierende somatische Zellen für die Fusion mit Myelomazellen zu erhalten.
Somatische Zellen mit der Fähigkeit zur Produktion von Antikörpern, speziell B Zellen, sind für die Fusion mit einer Myelomazelline geeignet. Diese somatischen Zellen können von den Lymphknoten, Knochenmark und periphärem Blut von präparierten Tieren stammen. In der bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung werden Mausknochenmarkzellen verwendet, teilweise weil diese Zellen einen relativ hohen Prozentsatz stabiler Fusion mit Mausmyelomazellinien produzieren. Es wäre jedoch möglich, Ratten, Hasen, Frösche oder andere Zellen an deren Stelle zu verwenden.
Spezialisierte Myelomazellinien wurden von lymphozytischen Tumoren für die Verwendung in dem hybridomaproduzierenden Fusionsverfahren entwickelt [Köhler und Milstein, Eur. J. Immunol. 6, 511 (1976); Shulman et al., Nature 276, 269 (1978); Volk et al., J. Virol. 42, 220 (1982)]. Diese Zellinien wurden aus wenigstens drei Gründen entwickelt. Der erste ist, um die Selektion von fusionierten Hybridomas unter nichtfusionierten und ähnlich undefiniert selbstpropagierenden Myelomazellen zu vereinfachen. Gewöhnlich wird dies mittels Myelomas mit Enzymmangeln erreicht, die dazu führen, dass sie in bestimmten Selektivmedien, die das Wachstum von Hybridomas unterstützen, nicht wachsen. Der zweite Grund resultiert von der inherenten Fähigkeit von lymphozytischen Tumorzellen, ihre eigenen Antikörper zu produzieren. Der Zweck von der Verwendung monoklonaler Techniken ist, fusionierte Hybridzellinien mit unbegrenzten Lebensdauern zu erhalten, die die gewünschten einzelnen Antikörper unter der genetischen Kontrolle von der somatischen Zellkomponente des Hybridoms produzieren. Um die Herstellung von Tumorzellantikörpern durch die Hybridomas zu eleminieren, werden Myelomazellinien verwendet, die nicht fähig sind, leichte oder schwere Immunoglobulinketten zu produzieren oder einen mangelhaften Antikörpersekretionsmechanismus haben. Ein dritter Grund zur Selektion von diesen Zellinien ist ihre Geeignetheit und Effizienz zur Fusion.
Viele Myelomazellinien können für die Herstellung von fusionierten Zellhybriden verwendet werden, enthaltend beispielsweise P3/X63-Ag 8, P3/NSI/1-Ag 4-1, SP2/0-Ag-14 und S194/5.XXO.BU.1. Die P3/X63-Ag 8 und P3/NSI/I-Ag 4-1 Zellinien wurden von Köhler und Milstein [Eur. J. Immunol. 6, 511, (1976)] beschrieben. Shulman et al. [Nature 276, 269 (1978)] entwickelten die Sp2/0-Ag14 Myelomalinie. Die S194/5.XXO.BU.1 Linie wurde von Trowbridge berichtet [J. Exp. Med. 148, 313 (1979)]. Im Beispiel der vorliegenden Erfindung wurde die PAI-O Mauszellinie (ein nicht-Ig- produzierender Subklon von P3/X63-Ag 8) verwendet.
Methoden zur Herstellung von Hybriden von antikörperproduzierendem Knochenmark oder Lymphknotenzellen und Myelomazellen beinhalten normalerweise das Mischen somatischer Zelllen mit Myelomazellinien in einem 10:1 Verhältnis (obwohl das Verhältnis von 20:1 bis etwa 1:1 varieren kann), respektive in der Gegenwart von einem Agens oder Agenzien (chemisch, viral oder elektrisch), die die Fusion der Zellmembrane begünstigen. Es ist bevorzugt, dass dieselben Spezien von Tieren als Quelle für die somatischen und Myelomazellen, die in der Fusion verwendet werden, dienen. Fusionsmethoden wurden von Köhler und Milstein beschrieben [Nature 256, 495 (1975) und Eur. J. Immunol. 6, 511 (1976)] von Gefter et al. [Somatic Cell Genet. 3, 231 (1977)], und von Volk et al. (J. Virol. 42, 220 (1982)]. Die fusionsbegünstigenden Agenzien, die von diesen Erfindern verwendet wurden, waren Sendaivirus und Polyethylenglykol (PEG). Die Fusionsverfahren fur das Beispiel der vorliegenden Erfindung verwenden PEG.
Da die Fusionsverfahren lebensfähige Hybride mit einer sehr niederen Frequenz produzieren (beispielsweise, wenn Knochenmark als Quelle für somatische Zellen verwendet wird, wird nur ein Hybrid auf etwa 1 x 10&sup5; Knochenmarkzellen erhalten), ist es wichtig, ein Mittel zu haben, um die fusionierten Zellhybriden von den zurückbleibenden nichtfusionierten Zellen speziell der nichtfüsionierten Myelomazellen, zu selektieren. Ein Mittel, um die gewünschten antikörperproduzierenden Hybridomas unter anderen entstehenden fusionierten Zellhybriden nachzuweisen, ist auch nötig.
Im allgemeinen wird die Selektion von fusionierten Zellhybriden durch Kultivierung der Zellen in Medien erreicht, die das Wachstum von Hybridomas unterstützen aber das Wachstum von Myelomazellen verhindern, die normalerweise sich weiterhin unbegrenzt teilen wurden. (Die somatischen Zellen, die in der Fusion verwendet werden, erhalten keine langandauerende Lebensfähigkeit in in vitro Kulturen aufrecht und stellen somit kein Problem dar). Im Beispiel der vorliegenden Erfindung wurden Myelomazellen, die einen Mangel an Hypoxanthinphosphoribosyltransferase (HPRT-negativ) haben, verwendet. Selektion gegen diese Zellen wird mittels Hypoxanthin/Aminopterin/Thymidin (HAT) Medium, ein Medium, in dem die fusionierten Zellhybride überleben und zwar dank des HPRT-positiven Genotyps der Knochenmarkzellen, verwendet. Die Verwendung von Myelomazellen mit unterschiedlichen genetischen Mängeln (Drogensensitivitäten, etc.), die in Medien selektiert werden können, die das Wachstum von genotypisch kompetenten Hybriden unterstützen, ist auch möglich.
Mehrere Wochen werden benötigt, um selektiv die fusionierten Zellhybriden zu kultivieren. Am Anfang dieser Zeitperiode ist es nötig, solche Hybride zu identifizieren, die die gewünschten Antikörper produzieren, so dass sie im folgenden kloniert und propagiert werden können. Im allgemeinen produzieren etwa 10 % der erhaltenen Hybride den gewünschten Antikörper, obwohl ein Bereich von 1 bis 30 % nicht unüblich ist. Der Nachweis von antikörperproduzierenden Hybriden kann durch jeden von mehreren Standardassaymethoden erreicht werden, einschliesslich enzymgebundener Immunassay und Radioimmunassaytechniken, die in der Literatur beschrieben worden sind [siehe beispielsweise Kennet et al. (editiors), Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, S. 376-384, Plenum Press, New York (1980)]. Verschiedene Nachweismethoden wurden in den Beispielen der vorliegenden Erfindung verwendet.
Wenn einmal die gewünschten fusionierten Zellhybride selektiert worden sind und in individuelle antikörperproduzierende Zellinien kloniert wurden, kann jede Zellinie nach einem von zwei Standardwegen propagiert werden. Eine Suspension von den Hyridomazellen kann in ein histokompatibles Tier injiziert werden. Das injiezierte Tier wird dann Tumoren entwickeln, die den spezifischen monoklonalen Antikörper sekretieren, der von dem fusionierten Zellhybrid produziert wird. Die Körperflüssigkeiten des Tiers, wie Serum oder Ascitesflüssigkeit, können abgezapft werden, um monoklonale Antikörper in hohen Konzentrationen zur Verfügung zu stellen. Alternativ können die individuellen Zellinien in vitro in Laborkulturkesseln propagiert werden. Das Kulturmedium, das hohe Konzentrationen von einem einzelnen spezifischen monoklonalen Antikörper enthält, kann durch Dekantierung, Filtrierung und Zentrifugation geerntet werden.
Die in E. coli hergestellten Eimeriaproteine verbleiben im Zytoplasma oder in Einschlusskörpern. Um die Proteine freizusetzen, ist es somit nötig, die äussere Membrane zu zerreissen. Dies wird bevorzugt durch Beschallung oder durch andere mechanische Zerreissmittel, wie beispielsweise eine Frenchpresszelle oder Gaulinhomgenisator, erreicht.
Zellzerreissen kann auch durch chemische oder enzymatische Mittel erreicht werden. Da divalente Kationen oft für die Zellmembranintegrität benötigt werden, kann die Behandlung mit geeigneten Chelatierungsreagenzien, wie beispielsweise EDTA oder EGTA nachweisbar ausreichend zum Zerrupfen sein, um das Auslaufen der Proteine von den Zellen zu erleichtern. In ähnlicher Weise wurden Enzyme, wie Lysozym verwendet, um dasselbe Ergebnis zu erreichen. Dieses Enzym hydrolysiert das Peptidoglycangrundgerüst von der Zellwand.
Die Anwendung von osmotischem Schock kann auch verwendet werden. Kurz gesagt, das kann dadurch erreicht werden, dass die Zellen in eine hypertonische Lösung plaziert werden, die sie dazu bringt, Wasser zu verlieren und zu schrumpfen. Anschliessend führt Plazierung in eine hypotonische Schocklösung zu schnellem Hereinfliessen von Wasser in die Zellen und Ausstoss der gewünschten Proteine.
Wenn einmal die Eimeriaproteine von den Zellen befreit sind, können sie durch Fällen mit Salzen, wie beispielsweise Natrium oder Ammoniumsulfat, Ultrafiltration oder anderen Methoden, die dem Fachmann wohl bekannt sind, ankonzentriert werden. Weitere Reinigung kann durch übliche Proteinreinigungstechniken erreicht werden, einschliesslich, ohne darauf beschränkt zu sein, Gelfiltration, Ion- Austauscherchromatographie, präperative Scheibengel- oder Plattenelektrophese, isoelektrische Fokusierung, Auftrennung mit organischen Lösungsmitteln bei niederen Temperaturen oder Gegenstromverteilung. Die Reinigung wird jedoch bevorzugt durch Immunaffinitätschromatographie, wie unten beschrieben, duchgeführt.
Die Proteine dieser Erfindung oder Fragmente davon können auch chemisch durch geeignete Methoden synthetisiert werden, wie beispielsweise durch auschliessliche Festphasensynthese, teilweise Festphasenmethoden, Fragmentkondensierung oder klassische Lösungssynthese. Festphasensynthese, wie durch Merrifield beschrieben [J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 (19063)], ist bevorzugt.
Solche Synthese wird mit Aminosäuren, die am Alpha-Amino-Ende geschützt sind, durchgeführt. Dreifunktionelle Aminosäuren mit labilen Seitenketten werden auch mit geeigneten Gruppen geschützt, die das Auftreten einer chemischen Reaktion an dieser Seite während des Auflbaus des Peptids verhindern. Die Alpha-Amino-Schutzgruppe wird selektiv entfernt, um eine folgende Reaktion am Amino-Ende zu erlauben. Die Bedingungen für das Entfernen der Alpha-Amino-Schutzgruppe führen nicht zu einem Entfernen der Schutzgruppen der Seitenketten.
Die Alpha-Amino-Schutzgruppen sind solche, die sich in der Technik der stufenweisen Synthese von Peptiden als nützlich erwiesen haben. Beinhaltet sind Acyltypschutzgruppen (beispielsweise Formyl, Trifluoracetyl, Acetyl), aromatische Urethantypschutzgruppen (beispielsweise Benzyloxycarbonyl (Cbz) und substituierte Benzyloxycarbonyl), aliphatische Urethanschutzgruppen (beispielsweise t- Butyloxycarbonyl (Boc), Isopropyloxycarbonyl, Cyclohexyloxycarbonyl) und Alkyltypenschutzgruppen (beispielsweise Benzyl, Triphenylmethyl). Die bevorzugte Schutzgruppe ist Boc. Die Seitenkettenschutzgruppen für Tyr beinhalten Tetrahydropyranyl, Tert.-Butyl, Triyl, Benzyl, Cbz, 4-Br-Cbz und 2,6 Dichlorbenzyl. Die bevorzugte Seitenkettenschutzgruppe für Tyr ist 2,6- Dichlorbenzyl. Die Seitenkettenschutzgruppen fur Asp beinhalten Benzyl, 2,6-Dichlorbenzyl, Methyl, Ethyl und Cyclohexyl. Die bevorzugte Seitenkettenschutzgruppe für Asp ist Cyklohexyl. Die Seitenkettenschutzgruppen für Thr und Ser beinhalten Acetyl, Benzoyl, Trityl, Tetrahydropyranyl, Benzyl, 2,6-Dichlorbenzyl und Cbz. Die bevorzugte Schutzgruppe für Thr und Ser ist Benzyl. Die Seitenkettenschutzgruppen für Arg beinhalten Nitro, Tos, Cbz, Adamantyloxycarbonyl oder Boc. Die bevorzugte Schutzgruppe für Arg ist Tos. Die Seitenkette von Lys kann mit Cbz, 2-ClCbz, Tos oder Boc geschütz werden. Die 2-Cl-Cbz Gruppe ist die bevorzugte Schutzgruppe für Lys. Die Auswahl der Seitenkettenschutzgruppe basiert auf dem Folgenden: Die Seitenkettenschutzgruppe bleibt während der Kopplung intakt und wird nicht während des Entschützens des Aminoterminus oder während der Kupplungskondition abgespalten. Die Seitenketteschutzgruppe muss nach Beendigung der Synthese des endgültigen Peptids mittels Reaktionsbedingung, die das Zielpeptid nicht verändern, entfernbar sein.
Festphasensynthese wird gewöhnlicherweise ausgehend vom Carboxy- Ende durch Koppeln der alpha-Amino geschützten (Seitenketten geschützten) Aminosäure an einen geeigneten festen Träger durchgeführt. Eine Esterbindung wird gebildet, wenn die Bindung an ein chlormethyliertes oder hydroxymethyliertes Harz gemacht wird und das resultierende Zielpeptid eine freie Carboxylgruppe am C-Terminus hat. Alternativ wird ein Benzhydrylamin oder p-Methylbenzhydrylaniin Harz verwendet, in welchem Fall eine Amidbildung gebildet wird und das resultierende Zielpeptid eine Carboxamidgruppe am C-Terminus haben wird. Diese Harze sind kommerziell erhältlich und ihre Herstellung ist von Stewart et al. "Solid Phase Peptide Synthesis" (2nd Edition, Pierce Chemical Co. Rockford, IL., 1984) beschrieben worden.
Die C-terminale Aminosäure Arg, geschützt an der Seitenkette mit Tos und an der Alpha-Aminofunktion mit Boc, wird an das Benzhydrylaminharz mittels verschiedener Aktivierungsagenzien gekoppelt, einschliesslich das Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), N,N'Diisopropylcarbodiimid und Carbonyldiimidazol. Nach der Bindung an das Trägerharz wird die Alpha-Amino-Schutzgruppe mittels Triflluoressigsäure (TFA) oder HCl in Dioxan bei einer Temperatur zwischen 0º und 25º entfernt. Dimethylsulfid wird zum TFA zugegeben nach der Einführung von Methionin (Met), um mögliche S-Alkylierung zu unterdrucken. Nach Entfernung der Alpha-Amino-Schutzgruppe, werden die verbleibenden geschützten Aminosäuren schrittweise in der geforderten Reihenfolge gekoppelt, um die gewünschte Peptidsequenz zu erhalten.
Verschiedene Aktivierungsagenzien können für die Kopplungsreaktionen verwendet werden, einschliesslich DDC, N,N'- Diisopropylcarbodiimid, Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)- Phosphoniumhexafluorophosphat (BOP) und DCC-Hydroxybenzotriazol (HOBt). Jede geschützte Aminosäure wird im Überschuss verwendet (> 2.5 Äquivalente), und die Kopplungen werden gewöhnlich in DMF, CH&sub2;Cl&sub2; oder Mischungen davon durchgeführt. Das Ausmass der Umsetzung der Kopplungsreaktion wird bei jedem Schritt durch Ninhydrinreaktion, wie von Kaiser et al. Anal. Biochem. 34, 595 (1970) beschrieben, verfolgt. In Fällen, wo unvollständige Kopplung bestimmt wird, wird die Kopplungsreaktion wiederholt. Die Kopplungsreaktionen können automatisch mit einem Vega 250, Applied Biosystemsynthesegerät oder anderen kommerziell erhältlichen Instrumenten durchgeführt werden. Nach dem vollständigen Aufbau des Zielpeptids, wird das Peptidharz mit TFA/Dithioethan entschützt und dann mit einem Reagenz, wie flussigem HF, in 1-2 Stunden bei 0º gespalten, das das Peptid vom Harz und allen Seitenkettenschutzgruppen entfernt.
Seitenketten zu Seitenkettenzyklisierung an dem festen Träger benötigen die Verwendung von einem orthogonalen Schutzschema, das die selektive Spaltung von der Seitenkettenfunktion der sauren Aminosäuren (beispielsweise Asp) und der basischen Aminosäuren (beispielsweise Lys) ermöglicht. Die 9-Fluorenylmethyl (OFm) Schutzgruppe für die Seitenkette von Asp und die 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) Schutzgruppe für die Seitenkette von Lys können für diesen Zweck verwendet werden. In diesen Fällen werden die Seitenkettenschutzgruppen des Boc-geschützten Peptidharzes selektiv mit Piperidin in DMF entfernt. Die Zyklisierung am festen Träger wird mittels verschiedener Aktivierungsagenzien, einschliessend DCC, DCC/HOBt oder BOP, erreicht. Die HF Reaktion wird an dem zyklisierten Peptidharz, wie oben beschrieben, durchgeführt.
Reinigung der synthetischen Proteine kann, wie oben für die rekombinant produzierten Proteine beschrieben, durchgeführt werden.
Eimeria Proteine können auch aus Extrakten von Membranproteinen von E. tenella oder anderen Eimeriaspezies durch Immunpräzipitation oder Immunaffinitätschromatographie wiedergewonnen werden. Wie bereits bemerkt, können solche Methoden die vollständigen Wildtypproteine produzieren. In einigen Fällen sind diese Proteine grösser als die Proteine, die durch rekombinante DNS-Methodik produziert wurden. Monoklonale Antiköper für diesen Zweck können, wie oben beschrieben, mittels synthetischer oder natürlicher Eimeriaproteine als das Antigen hergestellt werden.
Andere nützliche Proteine, die die nötigen immunreaktiven und/oder antigenischen Determinanten haben, sind Antikörper oder Fragmente davon, die anti-idiotypisch gegen die aktive Determinante oder Determinanten auf den Proteinen der Erfindung sind. Solche anti- idiotypischen Antikörper können gegen andere Antikörper generiert werden, die spezifisch für die Determinanten auf den Proteinen der Erfindung sind (d.h. die anti-idiotypischen Antikörper sind anti-Antiköper). Bevorzugt werden monoklonale anit-idiotypische Antikörper verwendet. Solche Antikörper können als Vakzine in derselben Weise gegeben werden, in der die Eimeriaproteine selbst verwendet werden.
Eine oder mehrere der Eimeriaproteine und anti-idiotypische Antikörper dieser Erfindung können in Vakzine formuliert werden, die die Proteine und die physiologischen akzeptablen Träger umfassen. Geeignete Träger beinhalten beispielsweise 0.01 bis 0.1 M Phosphatpuffer von neutralem pH oder physiologische Kochsalzlösung.
Verstärkte Immunität gegen Kokzidiose kann auf eine oder zwei Weisen erzeugt werden. Als erstes kann ein Adjuvans oder Immunpotentiator zum Vakzin gegeben werden. Als zweites können die Proteine der Erfindung einem Tier, das in einem grösseren Ausmass immunisiert wird, entweder als quervernetzter Komplex oder an ein Trägermolekül konjugiert präsentiert werden.
Geeignete Adjuvanzien für das Impfen von Tieren beinhalten, ohne dadurch begrenzt zu sein, das Adjuvans 65 (enthaltend Erdnussöl, Mannidmonooleat und Aluminummonostearat); Mineralgele, wie Aluminumhydroxid, Aluminumphosphat und Alum; Surfactantien wie Hexadecylamin, Octadecylamin, Lysolecithin, Dimethyldioctadecylammoniumbromid, N,N-Dioctadecyl-N', N'- bis (2- hydroxymethyl)Propandiamin, Methoxyhexadecylglycerol und pluronische Polyole; Polyanione wie Pyran, Dextransulfat, Poly-IC, Polyakrylsäure und Carbopol; Peptide wie Muramyldipeptide, Dimethylglyzin und Tuftsin; und Ölemulsionen. Die Proteine können auch nach Einbau in Liposomen oder andere Mikroträger gegeben werden.
Einbau in Liposomen oder andere Mikroträger steilen Mittel zur Verfügung, mit denen die Freisetzung der Vakzine über eine verlängerte Zeitperioden aufrechterhalten werden kann. Eine Pumpe, wie beispielsweise eine Alzapumpe, kann für denselben Zweck verwendet werden.
Die Immunogenizität von den Proteinen der Erfindung, speziell der kürzeren Fragmente, kann durch Quervernetzung oder Koppeln an ein immunogenes Trägermolekül verstärkt werden (d.h. ein Makromolekül, das die Eigenschaft hat, unabhängig davon eine Immunantwort in einem Wirtstier zu erzeugen, an das die Proteine und Proteinfragmente der Erfindung kovalent gebunden werden können). Die Quervernetzung oder Konjugation an ein Trägermolekül kann benötigt werden, weil kleine Proteinfragmente manchmal als Haptene agieren (Moleküle, die fähig sind, spezifisch an einen Antikörper zu binden aber unfähig eine Antikörperproduktion zu provozieren, d.h. sie sind nicht immunogen). Bindung von solchen Fragmenten an immunogene Trägermoleküle macht die Fragmente immunogen durch das, was allgemein als "carrier"-Effekt bekannt ist.
Geeignete Trägermoleküle beinhalten beispielsweise Proteine und natürliche oder synthetische polymere Verbindungen, wie beispielsweise Polypeptide, Polysaccharide, Lipolysaccharide etc. Ein nützlicher Träger ist ein Glycosid, genannt Quil A, das von Morein et al., Nature 308, 457 (1984) beschrieben worden ist. Proteinträgermoleküle werden speziell bevorzugt, die in nicht einschränkender Weise Säugerserumproteine, wie beispielsweise das Napfschneckenschlüssellochhemocyanin, menschliches oder Rindergammaglobulin, menschliches oder Rinder- oder Hasenserumalbumin oder methylierte oder andere Derivate von solchen Proteinen beinhalten. Andere Proteinträger werden dem Fachmann bekannt sein. Bevorzugt, aber nicht notwendigerweise, kann der Proteinträger für das Wirtstier, in dem Antikörper gegen die Eimeriaproteine hervorgerufen werden, fremd sein.
Die kovalente Kopplung an das Trägermolekül kann mittels in der Technik bekannter Methoden durchgeführt werden, die genaue Auswahl wird von der Natur des verwendeten Trägermoleküls bestimmt. Wenn das immunogene Trägermolekül ein Protein ist, können Proteine oder Fragmente der Erfindung, beispielsweise mittels wasserlöslichen Carbodiimiden wie Dicyclohexylcarbodiimid oder Glutaraldehyd, gekoppelt werden.
Kopplungsagenzien wie diese können auch verwendet werden, um das Protein und Fragmente mit sich selbst quer zu vernetzen, ohne die Verwendung von einem separaten Trägermolekül. Solche Quervernetzung in Protein- oder Proteinfragmentaggregate kann auch die Immunogenizität verstärken.
Gabe einer wirksamen Menge der Vakzine dieser Erfindung kann Geflügel gegen Infektion durch E. tenella schützen. Monoklonale Antikörper gegen das E. tenella Antigen reagieren auch mit E. acervulina und E. maxima in vitro und zeigen dadurch an, dass auch Schutz für diese Spezies gewahrleistet werden kann. Eine effektive Dose von den Proteinen oder Porteinfragmenten bewegt sich im Bereich von etwa 10 bis etwa 50 Mikrogramm/kg Körpergewicht des geimpften Tiers. Eine Dose von etwa 25- 50 ug/kg ist bevorzugt. Initialvakzinierungen werden bevorzugt von Boostervakzinierungen, die eine bis mehrere Wochen später gegeben werden, gefolgt. Mehrere Boosters können gegeben werden. Die Dosierungen von solchen Boosters bewegen sich generell im Bereich von 5 bis 50 ug/kg, bevorzugt etwa 20-50 ug/kg. Standardweisen der Administration können verwendet werden, solche wie subcutan, intradermal, intramuskulär, oral, anal oder in ovo Administration.
Die Präsentation der Kokzidialantigene der Erfindung gegenüber dem Immunsystem von Geflügel kann durch die Klonierung von Genen, die für die Antigene kodieren, in Bakterien (beispielsweise E. coli oder Salmonella) oder in Viren (beispielsweise Poxviren oder Herpesviren), und oral Gabe des lebendigen Vektorsystems an die Vögel, durch Inijektion oder durch andere allgemein üblichen Weisen, erreicht werden. Carbit et al. [in: Vaccines, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 68-71] haben die Verwendung von E. coli beschrieben, während Clements [Pathol. Immunopathol. Res. 6, 137 (1987) die Verwendung von Salmonella beschrieben haben. Moss et al. [Ann. Rev. Immunol. 5, 305 (1987)] haben die Verwendung von viralen Vektorystemen, die rekombinante Poxviren benützen, zusammengefasst.
Eine Art von Poxviren, Vacciniavirus, kann verwendet werden, um die Gabe des Kokzidialantigens in Zellkulturen und in Tieren zu testen. Für analytische Studien wurde gefunden, dass Vacciniavirus effizienter ist als Fowlpoxvirus, ein anderer Poxvirusträger, der verwendet werden kann. Das beruht darauf, dass Vacciniavirus sich schneller teilt als der Avianvirus und ein breiteres Wirtsspektrum hat, das nicht auf Hühnerzellen beschränkt ist. Grosse Mengen von heterologer DNS kann in das Vacciniaviralgenom, ohne die virale Reifung und Infektivität zu inhibitieren, eingefügt werden [Smith et al., Gene 25, 21 (1983)]. Die Einfügung und Expression von multiplen heterologen Genen mittels des Virus ruft Antikörperherstellung gegen die exprimierten Antigene in infizierten Tieren hervor [Perkus et al., Science 229, 981 (1985)].
Die zur Herstellung rekombinanter Vacciniavirus verwendeten Techniken können leicht durch Routineverfahren auf Hühnerpocken- oder Herpesvirussysteme adaptiert werden. Die Verwendung von solchen rekombinanten Viren als Träger in Vakzinen gegen Kokzidiose ist speziell von Vorteil, dadurch, dass das vakzinierte Geflügel Immunität gegen beide, das Kokzidialantigen und den viralen Träger, entwickelt (d.h. solche Vakzine sind bivalent). Die Nützlichkeit solcher Vakzine kann weiterhin durch die Einfügung zusätzlicher Gene in den Trägervirus verstärkt werden. Beispielsweise Teile des Newcastlekrankheitsviralgenoms können zusammen mit einem Kokzidialantigen in ein Hühnerpockenvirus eingeführt werden und dadurch Immunität gegen Newcastlekrankheit, Kokzidiose und Hühnerpocken mit einem einzigen Vakzin verliehen werden.
Die Gabe des lebenden Vektorvakzins der Erfindung kann durch zahlreiche in der Technik bekannte Methoden durchgeführt werden. Beispielsweise kann die "Stech" Methode, die allgemein zum Impfen von Geflügel gegen das Hühnerpockenvirus verwendet wird, verwendet werden. Diese Methode beinhaltet das Stechen oder Durchstechen der Haut des Flügelgewebes mit einer scharfen Nadel, die in das Vakzin getaucht wurde. Die Nadel hat normalerweise ein Auge neben der Spitze wie eine Nähmaschinennadel, die einen Tropfen des Vakzins trägt. Alternativ können die lebenden Vakzine subcutan oder intradermal in das Flügelgewebe oder jede andere Seite injiziert werden.
Die rekombinanten lebenden Vektorvakzine können auch zum Trinkwasser zugegeben werden oder über die Hühner gesprüht werden, die zu impfen sind. Es kann auch im Futter, bevorzugt nach Schutzverkapsulierung [Balancou et al., Nature 22, 373 (1986)] oder in ovo gegeben werden. Bei der letzteren Methode werden die viralen Vakzine direkt in die Hühnerembryos injiziert [Sharma, Avian Dis. 25, 1155 (1985)].

Beispiel

Falls nichts anders angegeben, stehen Prozentzahlen im folgenden für Festkörper in festen Mischungen, Flüssigkeiten in Flüssigkeiten und Festkörper in Flüssigkeiten in Gewicht/Gewicht, Volumen/Volumen und Gewicht/Volumen, respektive.

1. HERSTELLUNG VON MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN GEGEN EIMERIA ANTIGENE

1.1. PARASITENHERSTELLUNG

Sporozoiten von E. tenella, E. acervulina, E. brunetti und E. maxima wurden von sporulierenden Oozyten durch Standardverfahren isoliert. Kurz, sporulierende Oozyten wurden mit destiliertem Wasser gewaschen und mit 20 % Bleichmittel und dann mit destilliertem Wasser. Die Oozyten wurden in einem Gewebshomogenisierer auseinandergerissen, und nichtlösliches Material, einschliesslich Sporozoiten, wurden durch Zentrifugation wieder gewonnen.
Die freigesetzten Sporozoiten und anderes Material im Niederschlag wurden in 0.25 % Trypsin und Hühnergalle in Hanks-Salzlösung, pH 8 resuspendiert und für 2 Stunden bei 40ºC inkubiert. Die Lösung zum Herauslösen wurde durch 2 mal Waschen durch RPMI-1640 Medium, das 10 % fötales Rinderserum (FBS) enthält, entfernt, gefolgt von 2 mal Waschen mit PBS bei pH 7.4.
Die Sporozoiten wurden dann über einen Metrazimidgradienten [Wisher et al., Parasitiology 88, 515 (1984)] gereinigt. Kurz, die Sporozoiten wurden in 2 ml PBS, pH 7.0 resuspendiert, und 1 ml der Suspension wurde auf 15 ml Metrizamidgradienten gegeben. Der Gradient setzte sich aus 5 ml von jeweils 12 %, 18% und 24 % Metrazimid in PBS, pH 7.0 zusammen. Die Sporozoiten wurden durch Zentrifugation bei 900 x g 40 Minuten zentrifugiert. Gereinigte Sporozoiten wurden von der Zwischenfläche zwischen dem 18 % und 24 % Metrizamid durch Einführen einer 21 Gaugenadel durch die Seite von dem Röhrchen und Ansaugen der Sporozoiten in eine Spritze isoliert.
Die gereinigten Sporozoiten wurden 3 mal mit PBS, pH 7.0 gewaschen und sofort zur Immunisierung, Infektionsstudien, Oberflächenmarkierung mit ¹²&sup5;I, Immunfluoressenzassays oder SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese [Laemmli, Nature 227, 680 (1970)] und Westernblottingstudien verwendet.
Merozoiten von E. tenella wurden, wie in Sektion 6.2.3. beschrieben, isoliert. Die gereinigten Merozoiten wurden zur Immunisierung verwendet und mit Laemmliprobenpuffer für die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und Westernblottingstudien solubilisiert.

1.2. IMMUNISIERUNGEN

Acht weibliche Balb/c Mäuse (Charles River, Wilmington, Mass.) wurden mit gereinigten lebenden Sporozoiten gemäss dem folgenden Schema immunisiert.
Tag 1 1 x 10&sup7; Sporozoiten intravenös (i.v)
Tag 7 6 x 10&sup6; Sporozoiten intraperitoneal (i.p.)
Tag 85 6 x 10&sup6; Sporozoiten i.p.
Tag 120 3 x 10&sup7; Sporozoiten i.p.
Tag 244 Prefusionsiummunisierungsboosters
Tag 1 5 x 10&sup6; Sporozoiten i.v., 5 x10&sup6; Sporozoiten i.p.
Tag 2 so wie Tag 1
Tag 5 Fusion von Hyperimmunsplenozyten und Myelomazellen
Das Serum von jeder Maus wurde auf Antisporozoitenantikörper durch ELISA mit gereinigten Sporozoitenproteinen durch Westernblottingassay mit solubilisierten Sporozoitenproteinen durch Immunpräzipitation von ¹²&sup5;I-markierten Sporozoitenoberflächenproteinen und durch Immunfluoressenzassays mit gereinigten Sporozoiten getestet. Die Maus mit der höchsten Sporozoitenantikörperreaktivität (Maus 107-2) wurde für die Prefusionsimmunisationsboosters verwendet (siehe Fig. 1 für ELISA Analyse von diesem Antiserum). Am fünften Tag wurde die Maus getötet und das Knochenmark für die Herstellung von Splenozyten entfernt.

1.3. ZELLKULTUR UND ZELLFUSION

Zwei Tage vor der Fusion wurden Splenozytenfütterzellen von normalen Mäusen im vollständigen Medium [Iscoves modifiziertes Dulbeccos Medium (IMDM, Gibco) mit 10 % FBS, Glutamin (2.0 mM), und 2- Merkaptoethanol (100 uM)] hergestellt plus HAT (100 uM Hypoxanthin, 0.4 uM Aminopterin und 16 uM Thymidin). Unter Verwendung einer Modifikation des Verfahrens von de St. Groth et al. [J. Immunol. Methods 35, 1 (1980)] wurden 10&sup8; Knochenmarkzellen mit 10&sup8; PAI-O Mausmyelomazellen füsioniert. Jede andere Myelomazelle, die geeignet ist für die Herstellung von Hybridomen, kann verwendet werden. Eine Anzahl von solchen Myelomazellen sind bekannt und für den Fachmann erhältlich.
Die Zellen wurden gemischt, durch Zentrifugation pellitiert und unter konstantem sanften Schütteln resuspendiert in 1.0 ml 35 % (Vol/Vol) Polyethylenglycol in IMDM bei 37ºC eine Minute lang. Nach 3 Minuten Inkubation bei 37ºC wurden die Zellen wieder pelletiert und sanft in 10 ml IMDM + HAT resuspendiert. Die Zellen wurden dann auf 1 x 10&sup6; Zellen/ml in vollständigem Medium + HAT verdünnt und auf 24- Löchermikrotiterplatten (1 ml/Loch) aufgeteilt, enthaltend 5 x 10&sup5; Splenozytenfütterzellen in 1 ml vollständigem Medium.
Hybridomaüberstände wurden auf Antisporozoitenantikörper durch ELISA mit gereinigten Sporozoiten, durch Westernblot mit Sporozoitenproteinen, durch Immunpräzipitation mit ¹²&sup5;I-markierten Sporozoitenoberflächenproteinen und durch Immunfluoressenz mit gereinigten Sporozoiten und mit Sporozoiten infizierten Zellen getestet. Die Hybridomas wurden durch begrenzte Verdünnung kloniert.

1.4. SPOROZOITEN ELISA

Gereinigte Sporozoiten (4 x 10&sup4;) wurden zu jedem Loch der 96-Loch U- bodenförmigen PVC Platte gegeben, die vorher mit 1 % BSA in PBS, pH 7.0, abgesättigt worden war. Die Sporozoiten wurden auf den Boden der Löcher durch Zentrifugation bei 1000 x g in 5 Minuten sedimentiert. Die Sporozoiten wurden in 100 ul verdünntem Antiserum oder Hybridomaüberständen resuspendiert und 2 Stunden bei Raumtemperatur unter konstantem Schütteln inkubiert. Die Sporozoiten wurden dann mit 1 % BSA in PBS, pH 7.0 gewaschen, um nichtgebundene Antikörper zu entfernen.
Um spezifisch den Antikorper, der an die Sporozoiten gebunden ist, nachzuweisen, wurden 100 ul Peroxidase-konjugiertes Ziegenantimaus-IgG zu den resuspendierten Sporozoiten zugegeben und die Suspension wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Sporozoiten wurden gewaschen und gebundener Antikoper wurde durch Zugabe von Substratlosung (o- Phenylendiamin, 0.4 mg/ml in 0.1 M Zitratpuffer, pH 4.5, 0.12 % Hydrogenperoxid) für 30 Minuten bei Raumtemperatur sichtbar gemacht. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 2.5 M H&sub2;SO&sub4;, die 50 mM Natriummetabisulfit enthielt, abgestoppt. Die Menge von gebundenem Antikörper wurde durch Lesen bei OD&sub4;&sub8;&sub8;, der Substratfärbung, bestimmt.
Von einer Gesamtmenge von auf 480 Löcher von der Zellfusion aufplatierten waren 432 positiv bezüglich Hybridomawachstum. Von diesen wurden 358 Hybridome als Positive für Antikörperherstellung in dem primären Sporozoiten-ELISA bestimmt. Während der Expansion und Passage von diesen Original-Elternhybridomazellen starben 104 oder beendeten die Antikörperproduktion und waren somit negativ in den folgenden Screenings mit dem Sporozoiten-ELISA und Westernblotassays. Der Sporozoiten-ELISA identifizierte 205 Hybridome, die 10 mal mehr als der Hindergrund Antikörper produzierten.

1.5. WESTERNBLOTTING VON SPOROZOITENPROTEINEN

Gereinigte Sporozoiten (etwa 5 x 10&sup7; Sporozoiten pro ml pro Gel) wurden in Laemmli Probenpuffer solubilisiert, durch SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese entweder in einem 12.5 % Gel oder 7.5 % bis 20 % Gradientengel (Laemmli, s.o.) aufgetrennt und elektrophoretisch auf Nitrozelluloseblätter übertragen. Die Blätter wurden in 3 % Gelatinpuffer (3 % Gelatin, Tris-HCl, pH 7.5, 0.15 M NaCl) abgesättigt und in Streifen geschnitten und die Streifen konnten mit verdünntem Antiserum oder Hybridomaüberstand 12 Stunden bei 4ºC in 1 % BSA Puffer (1 % BSA, 50 mM Natriumphosphat, pH 6.5, 0.5 M NaCl, 0.05 % Tween-20) reagieren. Die Streifen wurden in PBS, pH 7.4, 0.05 % Tween-20 gewaschen und der spezifisch gebundene Antikörper wurde mit einem Peroxidase-konjugierten Antimausantikörper nachgewiesen. Die gebundenen Antikörper wurden durch Zugabe von Substratlösung [4-Chlor-1-Naphthol (30 mg aufgelöst in 10 ml von eiskaltem Methanol und 50 ml von Tris-HCl, pH 7.5), 0.15 M NaCl, 0.015 % Endkonzentration H&sub2;O&sub2;] für 30 Minuten bei Raumtemperatur sichtbar gemacht. Die Reaktion wurde durch extensives Waschen mit destilliertem Wasser beendet.
Von den in dem Sporozoiten-ELISA positiven Antikörpern waren 160 auch positiv bei Westernblotanalyse unter Verwendung von solubilisierten Sporozoitenproteinen.
Westernblotanalyse (siehe Fig. 2) zeigte, dass die monoklonalen Antikörper in eine von drei Reaktivitätsmustern fielen: (a) solche, die einzelne Eimeriaproteine (beispielsweise 11A1 und 11D1) binden, (b) solche, die 2 oder 3 Proteine (beispielsweise 6A5 und 20C6) binden und (c) solche die mehrere Proteine (beispielsweise 11A5, 13A6 und 14B5) binden.
Die Antikörper wurden weiter charakterisiert durch Westernblotanalyse unter Verwendung von E. tenella Merozoiten und E. acervulina Sporozoitenproteinen (Fig. 3). Eine Anzahl von Antikörpern einschliesslich 3A5, 13A6, 7D1 und 20C6 erkannten Proteine, die von Sporozoiten von E. tenella und E. acervulina und von Merozoiten von E. tenella isoliert wurden. Von anderen Antikörpern, wie beispielsweise 6A5, konnte gezeigt werden, dass sie Spezies und Stadien spezifisch sind und nur Proteine von E. tenella Sporozoiten binden.
Eine Zusammenfassung der Ergebnisse, die mit einigen von den Antikörpern erhalten wurde, ist in Tabelle 1 gezeigt, in der die Spezifität der Antikörper gemäss dem Ursprung und der Grösse des (der) Proteins (Proteine) in den Gelen, an die die Antikörper binden (a), und (b) die Grösse von ¹²&sup5;I-markierten Eimeria tenella Proteinen, die durch die Antikörper gefällt werden (rechte Säule), gezeigt wird. Die Antikörper wurden weiter in der Tabelle durch den Isotypus charakterisiert. TABELLE 1 WESTERNBLOTANALYSE Eimeriaproteine (Gelgrösse in kd) Tenella Antikörper Isotypus Acervulina Maxima Grösse des Proteins Ppt. Spz und Mrz sind Abkürzungen für Sporozoit und Merozoit, respektive. G und M beziehen sich auf IgG und IgM, respektive. m zeigt an, dass die Antikörper mehrere Proteine in dem Bereich von 24 bis mehr als 2000 kd Grösse binden. Werte, die durch N.D. angegeben sind, wurden nicht bestimmt.

1.6. IMMUNFÄLLUNG VON ¹²&sup5;I-MARKIERTEN SPOROZOITEN- OBERFLÄCHENPROTEINEN

Die Oberflächenproteine von gereinigten Sporozoiten wurden mit ¹²&sup5;I durch die IODOGEN Methode (Pierce Chemical Co.) markiert oder durch Verwendung von IODOBEADS (Pierce Chemical Co.). Für das letztere Verfahren wurden 4 IODOBEADS 3 x mit 0.2 M Natriumphospbat, pH 7.5 gewaschen und 1-3 mCi von ¹²&sup5;I-Na wurden zugegeben und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Gereinigte Sporozoiten (3 x 10&sup8;) in 200 ul PBS, pH 7.0, wurden zu dem Reaktionsgefäss zugegeben und die Inkubation wurde für 15 Minuten verlängert. Am Ende der Inkubation wurde Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) zugegeben bis auf eine endgültige Konzentration von 0.5 mM.
Die Sporozoiten wurden von der Inkubationsmischung durch Zentrifugation durch 12'000 x g für 30 Sekunden wiedergewonnen und in 1 ml von entweder 2 % Natriumdodecysulfat (SDS) oder 1 % Triton X-100 in PBS, pH 7.0 solubilisiert. Nichtlösliches Material wurde durch Zentrifugation für 3 Minuten bei 12'000 x g entfernt. Die solubilisierten Sporozoitenproteine wurden gegen 3 Liter PBS, pH 7.0, bei 4ºC dialysiert unter Verwendung von 3'500 Molekulargewichtsausschlussmembranen, um zurückgebliebenes freies ¹²&sup5;-I zu entfernen. Die ¹²&sup5;I-markierten Sporozoitenproteine (typischerweise 1.5 x 10&sup8; cpm in das Protein eingebaut) wurden bei 4ºC bis zur Verwendung gelagert. Die mit TCA präzipitierbare Radioaktivität war typisch im Überschuss von 95 % von der Gesamtradioaktivität. SDS-Polyacrylamidgelelektrophoretische Analyse von den ¹²&sup5;I-markierten Sporozoitenproteinen ist in Fig. 4, linkes Panel, gezeigt.
Immunfällung wurde durch Zugabe von 300 ul Hybridomaüberstand oder verdünntem Antiserum auf 250 ul von ¹²&sup5;I-markierten Sporozoitenproteinen (1 x 10&sup5; cpm) in Puffer I (0.25 % NP-40, 10 mM Tris- HCl, pH 7.5, 0.15 M NaCl) durchgeführt. Nach der Inkubation für 16 Stunden bei 4ºC wurden 100-200 ul von einer 50 % Suspension von Ziegenantimaus IgG, gekoppelt an Agarose (Sigma Chemical Co.), zugegeben und die Mischung wurde auf einem Rotationsmischer 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Kügelchen wurden durch Zentrifugation für eine Minute bei 12'000 x g pelletiert und 3 x in Waschpuffer (0.1 % SDS, 0.5 % NP-40, 0.2 % Natriumdeoxycholat, 10 mM PMSF, 10 mM Tris-HCl, pH 8.5, 0.15 M NaCl) gewaschen.
Die ¹²&sup5;I-markierten Proteine, die an die Festphasenantikörper gebunden waren, wurden freigesetzt und durch Zugabe von 60 ul 2 x Laemmliprobenpuffer denaturiert und für 3 Minuten bei 95ºC erhitzt. Die immungefällten ¹²&sup5;I-markierten Sporozoitenproteine wurden durch SDS Polyacrylamidgelelektrophorese in einem 12.5 % Gel aufgetrennt und durch Autoradiographie sichtbar gemacht.
Die Ergebnisse des Immunpräzipitationsassays mit dem Immunmausserum sind in Fig. 4, rechtes Panel, gezeigt. Von den Hybridomaantikörpern, die im Sporozoiten-ELISA positiv waren, waren 74 bei dem Immunprazipitationsassay positiv. Wie in Fig. 5 gezeigt, fallen die Hybridomantikörper in zwei Kategorien, solche, die nur einzelne Proteine präzipitieren (beispielsweise 3C4, 6A5, 7D4, 8A2, 11D2 und 20C6), und solche, die zwei oder mehrere Proteine fällen (beispielsweise 12B2, 15A3, 15C4 und 19D6).

1.7. IMMUNOFLUORESSENZASSAYS MIT GEREINIGTEN SPOROZOITEN

Sporozoiten ( 1 x 10&sup5;) wurden auf 8-Kammerobjektträger (Lab Tek) in PBS, pH 7.0, gegeben und bei 37ºC 12 Stunden luftgetrocknet. Die Objektträger wurden mit 10 % normalem Ziegenserum 2 Stunden bei 37ºC abgesättigt. Verdünntes Antiserum oder Hybridomaüberstände wurden zu jeder Kammer zugegeben und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Objektträger wurden gewaschen und ein Rhodamin-konjugierter Antimausantikörper (verdünnt in PBS, pH 7.0, 0.3 % Triton X-100) wurde für eine Stunde bei Raumtemperatur zugegeben. Nach dem Waschen des Objektträgers wurde der gebundene Antikörper durch Fluoressenz sichtbar gemacht.
Die meisten der Antikörper zeigten spezifische Immunfluoressenz entweder für die Oberflächenmembrane und/oder den refraktilen Körper der luftgetrockneten Sporozoiten (Fig. 6, Panels A und B). Einige Antikörper markierten intensiv die apicale Spitze des Sporozoiten und markierten nur leicht die verbleibende Sporozoitenoberfläche (Fig. 6, Panel C). Eine Veranschaulichung der luftgetrockneten gereinigten Sporozoiten kann in Fig. 6, linker Hand Objektträger der Panels A, B, C und D gesehen werden. Die gereinigten Sporozoiten waren intakt und elongiert und zeigten vorwiegend grosse posteriore refraktile Körper (PRB) und die kleineren anterioren refraktilen Korper (ARB). Das apicale Ende (A) von dem Sporozoiten lag gegenüber dem posterioren refraktilen Körper. Es gab auch eine leichte Verunreinigung der Präparationen durch intakte Sporozysten (Panel B, linker Objektträger) und gebrochene Sporozystenmembranen.

1.8. ZUSAMMENFASSUNG VON ELISA, WESTERNBLOT, IMMUNPRÄZIPITATION UND IMMUNFLUORESSENZERGEBNISSE

Eine Zusammenfassung der Ergebnisse der obengenannten Analysen von 55 monoklonalen Antikörpern ist in Tabelle 2 gezeigt. TABELLE 2 ZUSAMMENFASSUNG VON MONOKLONALEN ANTIKÖRPERANALYSEN WESTERNBLOT Antikörper E. tenella Spz.a Nieder Spz.b E. acervulina Spz.c E. tenella Mz.d IFAe Immuno-ppt.f TABELLE 2 (Fortsetzung) WESTERNBLOT Antikörper E. tenella Spz.a Nieder Spz.b E. acervulina Spz.c E. tenella Mz.d IFAe Immuno-ppt.f
a. Angegebene Werte sind die Molekurlargewichte von E. tenella Sporozoiten (Spz.) Proteine, die durch die Antikörper in Westernblots erkannt werden oder Gruppen von erkannten Proteinen, die Molekulargewichte von 40-150 kd (M¹), 120 und 80-150 kd (M²) und 25 und 40-150 kd (M³) haben.
b. Westernblotassays wurden mit 1/5 mit der üblichen Menge von E. tenella Sporozoiten (Spz.) Protein durchgeführt. Antikörper, die eine positive Reaktion zeigten, hatten somit eine höhere Affinität.
c. Westernblotreaktivität ist gegen E. acervulina Sporozoiten (Spz.) Protein gezeigt.
d. Westernblotreaktivität ist gegen E. tenella Merozoit (Mz.) Proteine gezeigt.
e. Immunfluoressenzassay (IFA) Markierungsmusterergebnisse sind für indirekten Assay für luftgetrocknete E.tenella Sporozoiten als (1) Oberfläche, (2) Spitze, (3) flächige Oberfläche, (4) glänzende Oberfläche, (5) helle Oberfläche, (6) diffuse Oberfläche, (7) refraktiler Körper und (8) punktierte Markierung zusammengefasst.
f. Molekulargewichte von ¹²&sup5;I-markierten E. tenella Sporozoitenproteinen, die durch die Antikörper in Immunfällungs (Immunoppt.)-Assays gefangen wurden, sind gezeigt.
Monoklonale Antikörper 7D4, 7D1, 20C6, 8A2, 6A5 und 7B2, die bevorzugt sind, sind in Form von Hybridomazellen, die diese Antikörper sektretieren, bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, U.S.A. unter den Bedingungen des Budapester Vertrags hinterlegt worden und es wurden ihnen die Bezugsnummern HB 9707, HB 9708, HB 9709, HB 9710, HB 9711 und HB 9712, respektive zugeordnet.

1.9. IN VITRO INFEKTIONSASSAYS

Pirmäre Hühnernierenepithelzellen wurden gemäss der Methode von Doran et al., J. Protozool. 25, 544 (1978) etabliert und bis 40% - 50 % Zusammenwuchs in 4-Kammern Lab-Tek Objekträgern wachsen gelassen. MDBK (Madin-Darby Rindernieren)-Zellen (ATTC-CCL 22) wurden auch anstelle der Hühnernierenepithelzellen verwendet.
Die Zellen wurden mit 50'000 oder 200'000 gereinigten Sporozoiten inokuliert. 16 Stunden nach der Infektion wurden die Zelleinzelschichten mehrere Male gewaschen, um jedwelche Sporozoiten zu entfernen, die die Zellen nicht penetriert hatten. Repräsentative inokulierte Zellkulturen wurden in 100 % Methanol (Raumtemperatur, für 5 Minuten) 3, 16, 24, 48, 64, 96 und 120 Stunden nach der Infektion fixiert. Fixierte Objektträger wurden in 1 % BSA in PBS, pH 7.0, bei 4ºC gelagert bevor sie, wie oben beschrieben, für die Immunfluoressenz verarbeitet wurden. Die Markierungsmuster, die mit verschiedenen Antikörpern erhalten wurden, sind in Fig. 7 gezeigt.
Zwischen 3 und 24 Stunden nach Infektion, zeigten die fixierten Kulturen intrazelluläre Sporozoiten (Fig. 7, 7D4 bei 3 Stunden und 8A2 bei 19 Stunden). Etwas später degenerierten die Sporozoiten nur zu refraktilen Körpern (7D4, 60 Stunden). Die Oberfläche und die apicale Spitze von den intrazellulären Sporozoiten markierte glänzend mit Antikörper 7D4 (Fig. 7, 7D4 bei 3 Stunden), aber dieser Antiköper markierte nicht die Oberfläche von den infizierten Zellen.
Nach 24 Stunden begannen die Sporozoiten zu degenerieren und zu Schizonten zu entwickeln, die während der folgenden 48 Stunden reiften. Antikörper 7D4 reagierte weiter mit den degenerierten Sporozoiten aber reagierte nicht mit den unreifen Schizonten (Fig. 7, 7D4, 60 Stunden). Zu dem Zeitpunkt als die Schizonten reiften, begann jedoch 7D4 mit Strukturen in den Schizonten ( Fig. 7, 7D4, 100 Stunden) zu reagieren. Diese Strukturen waren die entwickelnden Merozoiten, und Antikörper 7D4 reagierte weiter mit einem Oberflächenantigen der reifen und freigesetzten Merozoiten (Fig. 7, 7D4, 120 Stunden).
Somit identifizierte 7D4 ein 120 kd Membranantigen, das auf E. tenella Sporozoiten und Merozoiten anwesend war. Dieses Antigen wurde nicht während dem Schizontstadium der Parasitenentwicklung, bis unreife Merozoiten sich in den Schizonten entwickelten, exprimiert.
Antikörper 14B1 zeigte ein Reaktivitätsmuster ähnlich dem von Antikörper 7D4 durch Markieren der Oberfläche und Spitze von den intrazellulären Sporozoiten (Fig. 8, 14B1, 16 Stunden) und eine diffuse Markierung des Cytoplasma in der unmittelbaren Nachbarschaft des intrazellulären Sporozoiten. Das Antigen, erkannt durch 14B1, ist auf der apicalen Spitze vom unreifen Merozoiten in dem reifen Schizont (Fig. 8, 14B1, 100 Stunden) und apikale Spitze von reifen freigesetzten Merozoiten (Fig. 8, 14B1, 100 Stunden) anwesend. Die Markierungsmuster, die durch Antikörper 7D4 und 14B1 gezeigt wurden, sind ähnlich, aber die Proteine, die diese Antikörper erkennen, haben sehr unterschiedliche Molekulargewichte von etwa 120 und 6 kd, respektive.
Obwohl die Antikörper 7D4 und 14B1 mit den meisten Stadien der Parasitenentwicklung reagierten, reagierten andere Antikörper nur mit dem Oberflächeantigen (Fig. 7, 15A3) oder mit dem refraktilen Körper (Fig. 7, 7A2 ) der intralzellulären Sporozoiten und nicht mit dem Schizont oder Merozoitenstadien von dem Parasiten.
Zwei einzigartige Antikörper, 8A2 und 19D6, wurden durch den Infektionsassay nachgewiesen. Antikörper 8A2 reagierte mit einem 37 kd Protein, das auf der Oberfläche von Sporozoiten anwesend ist (Fig. 7C, 8A2, 19 Stunden), in allen Stadien des entwickelten Schizonten (Fig. 7C, 8A2, 120 Stunden) und auf der Oberfläche von freigesetzten Merozoiten (Fig. 7C, 8A2, 120 Stunden). Unähnlich den Proteinen, die durch die Antikörper 7D4 und 14B1 erkannt wurden, wurde das 37 kd Protein während der intrazellulären Entwicklung des Parasiten synthetisiert.
Antikörper 19D6 reagierte nicht nur mit einem 180 kd Sporozoitenoberflächenprotein sondern auch mit einem Protein im Cytoplasma von Sporozoiten-infizierten Zellen (Fig. 8, 19D6 bei 3 Stunden). Das zytoplasmatische Protein, das durch Antikörper 19D6 erkannt wurde, könnte durch den Sporozoit nach der Zellinfektion abgedeckt worden sein, da das Protein während der unreifen Schizontentwicklung verschwand und im reifen Schizont und in den freigesetzten Merozoiten (Fig. 8B, 19D6, 120 Stunden) wieder erschien.
Serumantikörper von Hühnern, die eine E. tenella Infektion überstanden haben, markieren die apicale Spitze und die Oberfläche von intrazellulären Sporozoiten (Fig. 8B, Immunhühnerseren, 3 Stunden) in einem Muster ähnlichen dem Markierungsmuster von Antikörper 7D4, aber nicht die refraktilen Körper von den intrazellulären Sporozoiten.
Die Immunfluoressenzstudien mit Sporozoiten-infizierten Hühnernierenzellen identifizierten Antigene, die (a) spezifisch für die Sporozoiten (beispielsweise grösser als 200 und 28 kd Proteine, erkannt durch Antikörper 7B2 und 6A5, respektive) sind, (b) in allen Stadien von dem intrazellulären Parasiten (beispielsweise 37 kd Protein, erkannt durch 8A2) gefunden wurden und (c) spezifisch für Sporozoiten und Merozoiten aber nicht für den Schizont (beispielsweise die 120 und 6 kd Proteine, erkannt durch Antikörper 7D4 und 14B1, respektive) sind.

1.10. IN VITRO SPOROZOITENNEUTRALISIERUNGSASSAY

In einer Modifizierung der Methode von Schmatz et al., J. Protozool, 33, 109 (1986), wurden MDBK Zellen tryptisch verdaut und suspendiert in Minimal Essential Medium (Gibco), dem 1 % FBS bei einer Dichte von 7.5 x 10&sup4; Zellen/ml zugegeben war. Zu jeder Vertiefung einer Mikrotiterplatte (Gewebekultur behandelte 96-Löcher) wurden 1.5 x 10&sup4; Zellen zugegeben und 48 Stunden bei 40ºC inkubiert. Gereinigte Sporozoiten wurden entweder mit Antikörper 1 Stunde bei 40ºC vorbehandelt oder vor der Infizierung der Zelleinzelschichten unbehandelt gelassen. Die Antikörper (entweder Gewebekulturüberstände, Ascitesflüssigkeit oder Antiserum) wurden extensiv gegen PBS dialysiert, pH 7.0, Hitze inaktiviert bei 56ºC in 30 Minuten und zur Verwendung sterilisiert.
Sofort nach Infektion wurde [5, 6]-³H-Uracil zu allen Vertiefungen bis auf eine endgültige Konzentration von 5uCi/ml zugegeben. 19 Stunden nach der Infektion wurde das Medium entfernt und die Kulturen einmal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden mit Trypsin-EDTA für 15 Minuten bei 40ºC freigesetzt und auf Glasfieberfiltern geerntet. Die Filter wurden getrocknet, in Zählflüssigkeit (READY-SOLV , New England Nuclear) gegeben und auf gebundene Radioaktivität gezählt. Die Fähigkeit der Antikörper, die Sporozoitenpenetration und/oder die Entwicklung zu inhibieren wurde durch Vergleich der inkorporierten Radioaktivität in die mit nichtbehandelten Sporozoiten infizierten Zellen mit der von mit Antikörper behandelten Sporozoiten infizierten Zellen bestimmt.
Sporozoiten wurden auch mit Kontrollantikörpern, Puffer oder Lasalocid, einem Kokzidiostatikum vorinkubiert. Lasalocid blockiert vollständig die Sporozoitenentwicklung in den MDBK Zellen und reduziert in grossem Mass den Einbau von ³H-Uracil.
Die Ergebniss sind in Fig. 9 gezeigt, wo man sehen kann, dass Antikörper 7D4 ( ), 8A2 (O) und 14B1 ( ) 3H-Uridineinbau in die infizierte MDBK Kulturensignifikant inhibierten. Antikörper 6A5 ( ) war weniger effektiv, aber zeigte etwas inhibierung. Die Behandlung mit Puffer (Δ) und Kontrollantikörper (X) produzierte keine Inhibierung, während Lasalocid (*) im wensentlichen vollständige Inhibierung produzierte.

2. KONSTRUKTION VON cDNS ESSPRESSIONSBANKEN

2.1. HERSTELLUNG VON SPORULIERENDEN OOZYSTEN

Ceca wurden aus 3 Wochen alten Hühnern (Hubbard Cross; Avian Services, Frenchtown, New Jersey, U.S.A.) 7 Tage nach der oralen Inokulierung mit 50'000 E. tenella sporulierten Oozysten pro Vogel entfernt und in einem Waringblender mit destilliertem Wasser 1 Minute lang gerieben. Das Volumen wurde auf 1 Liter mit destilliertem Wasser aufgefüllt und Pepsin (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, U.S.A.) wurde bis zu 3 g/l zugegeben. Der pH wurde auf 2.0 mit konzentrierter HCl eingestellt und die Mischung für 2 bis 3 Stunden bei 39ºC, oder bis eine einzige Oozystensuspension beobachtet wurde, inkubiert und gerührt. Nach Spaltung wurde der pH auf 8.0 mit 10 N NaOH eingestellt und 3 Liter destilliertes Wasser zugegeben. Die Mischung liess man über Nacht absetzen. Der Überstand wurde dann entfernt und das Sediment mit Wasser gewaschen bis der Überstand klar war. Die Oozysten wurden durch Einblasen von Luft durch die Suspension in destilliertem Wasser bei Raumtemperatur sporuliert. Die Sporulierung wurde nach 24 Stunden fiir die RNS Präparierung abgestoppt.

2.2. ISOLIERUNG VON SPORULIERENDEN OOZYSTEN mRNS

Gesamt-RNS wurde druch eine Modifikation der Guanidinium/Cesiumchloridmethode, beschrieben von Maniatis et al., s. o., Seite 196, hergestellt. Die Oozysten wurden mit PBS (0.15 M NaCl, 20 mM Natriumphosphat, PH 7.9) gewaschen und durch leichtes Mischen auf einem Vortex in 10 ml einer Lösung, enthaltend 5 M Guanidiniumisothiocyanant, 50 mM Tris-HCl, 10 mM Ethylenediaminetetraessigsäure (EDTA), 0.5 % Sarkosyl (Sodium N- Lauroyl-Sarcosin, Sigma Chemical Co.) und 0.1 M β-Mercaptoethanol, pH 7.4 mit 5 ul Antischaum A (Union Carbide, Danbury, Conneticut, U.S.A.) oder einem anderen bevorzugt zugegebenen Antischaumagenz resuspendiert. Die Zellsuspension wurde homogenisiert bis mikroskopisch ein gutes Aufbrechen der Oozysten beobachtet wurde.
Nichtlösliche zelluläre Bruchstücke wurden durch Zentrifugation bei niederer Geschwindigkeit entfernt und das Homogenat wurde in 4 Teile aufgeteilt und auf 1.2 ml 5.7 M CsCl, 0.1 M EDTA, pH 7.5 in 12-ml Polycarbonatröhrchen aufgegeben. Die Röhrchen wurden bei 40'000 rpm in einem Beckman SW 50.1 Rotor 17 Stunden bei 15ºC zentrifugiert. Die Überstandflüssigkeit wurde verworfen, die Wände des Röhrchens wurden getrocknet und die Niederschläge wurden in 1.25 ml 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 1 % Natriumdodecylsulfat (SDS), pH 7.5 mit 200 ul/ml Proteinas K (Boehringer-Mannheim) resuspendiert. Nach Inkubation bei 37ºC für 30 Minuten wurde die Lösung 3 mal mit Phenol extrahiert. Die RNS in der endgültigen wässrigen Phase wurde 3 mal mit Ethanol gefällt und dann in 1 ml Wasser aufgelöst.
Polyadenylierte RNS [poly(A)&spplus;] wurde durch zweimaliges Durchlaufen lassen von etwa 2 mg Gesamt-RNS über eine Oligo(dT)-Zellulosesäule (Pharmacia Fine Chemicals), wie von Maniatis et al., s. o., Seite 197, beschneben, hergestellt. Die poly(A)&spplus; RNS wurde zweimal mit Ethanol gefiillt und in 200 ul Wasser aufgelöst. Die Ausbeute betrug etwa 26 ug, berechnet nach der optischen Dichte bei 260 nm.

2.3. HERSTELLUNG VON MEROZOITEN

Merozoiten von E. tenella wurden von der Ceca von 50 infizierten Huhnern (3 Wochen alte Hubbard Cross, Avian Services, Frenchtown, NJ) 5 Tage nach der Infektion mit 50'000 der obengenannten sporulierenden Oozysten pro Vogel geerntet. Die Ceca wurden entfernt und mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (PBS) 15 Minuten auf einem magnetischen Rührer gewaschen. Die Epithelbruchstrücke wurden teilweise bei Zentrifugation mit geringer Geschwindigkeit (50 x g) entfernt und die rohen Merozoiten wurden durch 10 Minuten Zentrifugation bei 2'000 x g bei 4ºC entfernt. Der Niederschlag wurde in Lysierpuffer (8.29 g/l NH&sub4;Cl, 0.372 g/l Na&sub2;EDTA, 1.0 g/l KCO&sub3;, pH 7.6) resuspendiert und auf Eis 30 Minuten inkubiert. Die Merozoiten wurden durch Zentrifugation gesammelt, einmal in PBS gewaschen und über eine Säule, die 1.0 g gesponnene Nylonfaser (Scrub Nylon Fiber, Fenwall Laboratories, Deerfield, Illinois, U.S.A.) enthält, in eine Trenneinrichtung gegeben. Die Merozoiten wurden durch Zentrifugation, wie oben beschrieben, gesammelt und für die Isolierung der RNS auf Trockeneis gefroren oder weiter in Diethylaminoethylzellulose (DEAE, Whatman DES 2, Whatman, Clifont, New Jersey, U.S.A.) für die Westernblotanalyse gereinigt.
Zur Reinigung in DEAE Zellulose wurden etwa 1 x 10&sup9; Merozoiten in PBS auf eine Säule mit 10-ml Bettvolumen aufgegeben und mit PBS elutiert. Die Merozoiten wurden in den ersten 100 ml des Durchlaufs wiedergewonnen, im wesentlichen frei von roten Blutzellen und anderen Zellrückständen.

2.4. ISOLIERUNG VON mRNS VON MEROZOITEN

Gefrorene Merozoitenpellets, die 1 x 10&sup9; bis 1 x 10¹&sup0; Organismen enthielten, wurden in 10 ml TEL/SDS Puffer (0. 2 M Tris HCl, 0.1 M LiCl, 25 mM EDTA, 1 % (w/v) Natriumdodecylsulfat (SDS), pH 8.8), enthaltend 1 mM Dithiothreitol (DTT) und 300 Einheiten von RNasin (Promega Biotec, Madison, Wisconsin, U.S.A.), aufgetaut und mit 10-12 Schlägen in einem mit Teflon ausgegleiteten Gewebehomogenisierer homogenisiert. Unlösliche Bruchstücke wurden durch Zentrifugation in der Kälte bei 3'000 x g abgetrennt. Die Überstandsflüssigkeit wurde zweimal mit mit TEL Puffer equilibriertem Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (24:24:1, Vol/Vol) extrahiert.
Die wässrige Phase wurde mit 100 ug/ml Proteinase K bei 37ºC 30 Minuten verdaut und wieder extrahiert mit einem gleichen Volumen von Phenol:Chloroform (1.1) und die Nukleinsaure wurde mit zwei Volumen Ethanol in 1 Stunde auf Trockeneis oder uber Nacht bei -20ºC gefällt. Der Niederschlag, nach Zentrifiigation bei 10'000 x g für eine Stunde, wurde in TE (10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM EDTA) resuspendiert und durch ein 4 ml CsCl Kissen (5.7 M CsCl, 0.1 M EDTA) bei 150'000 x g und 15ºC 20 Stunden zentrifugiert. Das RNS Pellet wurde aus 0.2 M Potassiumacetat mit 2.5 Volumen Ethanol wieder gefällt. Diese Gesamt-RNS wurde einmal über eine Oligo-dT-Zellulose gegeben, um poly(A)&spplus; RNS anzureichern, wie bei Maniatis, s.o., Seite 197 beschrieben. Eine typische Ausbeute von 1.9 mg von Gesamt-RNS von 5 x 10&sup9; Merozoiten enthielt etwa 20 ug poly(A)&spplus; RNS.

2.5. SYNTHESE VON OOZYSTEN UND MEROZOITEN cDNS UND EINFÜGUNG IN PHAGENVEKTOREN

Doppelsträngige cDNS wurde von 6 ug poly(A)&spplus; RNS von den sporulierenden Oozysten wie von Gubler et al., Gene 25, 263 (1983) beschrieben, unter der Verwendung von Reverse Transkritptase (BRL) synthetisiert, um von einem Oligo(dt)-Primer zu verlängern und RNase H (BRL) und E. coli DNS Polymerase I (New England Biolabs), um den komplementären Strang zu synthetisieren. Die doppelsträngige cDNS wurde dann mit T4 DNS Polymerase (BRL) stumpfendig gemacht und EcoRI Linker (GGAATTCC, Collaborative Research) wurden nach Behandlung mit EcoRI Methylase (New England Biolabs) gemäss den Angaben des Herstellers angefügt.
Nach dem Verdauen der so präparierten cDNS mit EcoRI wurde eine Bank in λgtll (Stratagene Cloning Systems, San Diego, California, U.S.A.) wie von Huynh et al., in D. Glover (ed.), DNS Cloning Vol. I: A Practical Approach, 1985, IRL Press, Washington, D.C., S. 49-78 beschrieben, hergestellt. Die EcoRI cDNS Fragmente wurden an EcoRI verdaute dephosphorylierte λgtll Arme ligiert (Stratagene Cloning Systems) und die daraus entstehende DNS wurde in Phagen mit dem Gigapack Kit (Stratagene Clomng Systems) nach den Angaben des Herstellers verpackt.
Die dadurch entstandene Bank wurde durch Aufplattieren auf Y1088 Wirtszellen (ATCC Nr. 37195) amplifiziert. Der Prozentsatz von Rekombinanten wurde von dem Verhältnis von blauen zu farblosen Flecken auf X-gal Platten (Maniatis, s.o., Seite 24) in der Gegenwart von Isopropyl-β- D-Thiogalactopyranosid (IPTG, Sigma Chemical Co.) auf etwa 90 % geschätzt.
Doppelsträngige cDNS Kopien von den Merozoiten poly(A)&spplus; RNS wurden im wesentlichen, wie oben beschrieben, synthetisiert. Die doppelstängige cDNS, die in der Herstellung der Bank verwendet wurde, enthielt etwa 200 bis 4'500 Basenpaaren (bp), wie durch das Laufen in denaturierenden Gelen [Bailey et al., Anal. Biochem. 70, 75 (1976)] geschätzt wurde.
Die Merozoiten cDNS wurde methyliert und wie oben beschrieben, ausser dass CCGAATTCGG Linker (Collaborative Research) verwendet wurden, an EcoRI Linker legiert. Nach dem Verdauen mit EcoRI wurden die cDNS in Biogel A-50M fraktioniert, um Überschuss an Linkermolekülen und cDNS, die kleiner sind wie etwa 300 bp, wie von Huynh et al., s.o. beschrieben, zu entfernen.
Die cDNS wurden an λgt11 Arme legieft und DNS wurde, wie oben beschrieben, in Phagen verpackt. Die resultierende Bank, die etwa 50'000 Phagen enthielt, wurde durch Plattieren auf Y1088 Wirtszellen amplifiziert. Die Fleckenanalyse von X-gal Platten von IPTG zeigte etwa 90 % Rekombinante.

3. IMMUNOLOGISCHES SCREENING VON cDNS BANKEN

Die λgt11 Merozoiten cDNS Expressionsbank wurde auf Y1090 Zellen (ATCC Nr. 37197) bei einer Dichte von etwa 10'000 Plaques pro 150 mm Platten plattiert. Sechs solche Platten wurden für 3.5 Stunden bei 42ºC inkubiert und mit Nitrozellulosefiltern überlagert, die kurz vorher in 10 mM IPTG eingeweicht worden waren, um die Expression von dem β- Galactosidasefusionsprotein zu induzieren und für weitere 4-5 Stunden bis über Nacht bei 37ºC inkubiert. Die Filter wurden von den Platten entfernt und mehrmals topfweise mit TBS (20 mM Tris, pH 8.0, 0.15 M NaCl) gewaschen. Nichtspezifische Proteinbindungsstellen wurden durch Inkubation in 20 % fötalem Kälberserum (FCS) in TBS für 2-4 Stunden auf einem Rotationsschüttler bei 4ºC blockiert.
Ascitesflüssigkeit für 9 monoklonale Antikörper, die bekannterweise mit Merozoitenantigenen reagieren (bezeichnet 7D4, 7D1, 20C6, 13A6, 20Cl, 11B6, 3A5, 13A1 und 15B2) wurden gesammelt, auf 20 % FCS eingestellt und 0.15 M NaCl in einem Endvolumen von 100 ml und auf jeden der Filter in Petrischalen gegeben, zwei Filter pro Schale. Die Filter wurden mit dem ersten monoklonalen Antikörperpool bei 4ºC über Nacht auf einem rotierenden Schüttler inkubiert. Nichtgebundener Antikörper wurde durch 5-6 mal Waschen der Filter mit TBS bei Raumtemperatur entfernt. Gebundener Antikörper wurde durch inkubieren der Filter mit Ziegenantimausmeerretichperoxidase (HPOD)-Konjugat (Boehringer Mannheim) nachgewiesen, gefolgt von einer Farbentwicklung mittels 3 mg/ml 4-Chlor-1-Naphtol (Bio Rad) und 0.18 % H&sub2;O&sub2; wie von Hawkes et al., Anal. Biochem 119, 142 (1982) beschrieben.
Positive Plaques, identifiziert in dem ursprünglichen Hochdichtescreen, wurden in einem zweiten Screen mittels demselben monoklonalen Antikörperpool aus gepoolten Plaques gereinigt. Jeder Positive wurde einem induviduellen Antikörper von dem Pool durch Platzieren der Positiven in Vielfachnetze zugeordnet, jeder von denen wurde durch IPTG induziert, auf Nitrozellulose übertragen und mit einem der Monoklonalen von dem Pool inkubiert. Ein positiver Phage mit der Bezeichnung λm2-4, wurde identifiziert, der durch drei von den acht Antikörpern im Pool erkannt wurde, Antikörper 7D1, 7D4 und 20C6.
Ähnliche Methoden wurden verwendet, um die sporulierenden Oozyten cDNS Bank zu screenen, ausser dass ein Pool von monoklonalen Antikörpern, enthaltend Antikörper 6A5, 7B2, 15A3 und 20C6 für das ursprüngliche Screening verwendet wurde; 7B2, 15A3, 20C6 und 8A2 wurden in einem zweiten Screening verwendet; und 15A3, 7B2 und 20C6 wurden in einem dritten Screening verwendet; und der Inkubationspuffer enthielt zusätzlich 0.05 % Tween-20 [Polyoxyethylen(20 Sorbitanmonolaurat]. Auf diese Weise wurden Plaques bezeichnet λS1-3, λS1-4 und λS1-7; λS2-1, λS2-4 und λS2-5; und λS3-1, die von den monoklonalen Antikörpern 6A5, 8A2 und 7B2 respektive erkannt wurden, in der Oozyten cDNS Bank identifiziert. DNS, die von den Protein produzierenden Phagen gemacht wurde, die mit dem 6A5 Antikörper reagierte, wurde durch Verdauen mit EcoRI und Elektrophorese auf Agarosegelen (Maniatis et al., s.o., Seite 150) analysiert. Drei verschiedene Einfiigungen mit Grössen von etwa 1150, 890 und 615 bp wurden so gefunden.

4. EXPRESSION VON EIMERIAGENEN IN E. COLI

Die 1.1 kb und 0.9 kb EcoRI-DNS Moleküle von den Phagen λS1-7 und XS1-3, respektive wurden isoliert und in die EcoRI Stelle von jedem von drei variablen Lesemusterexpressionsvektoren, pEV-vrfl, pEV-vrf2 und pEV- vrf3, wie von Crowl et al. Gene 38, 31 (1985) beschrieben, eingeführt und konstruiert. Plasmide, die die Einfügungen in beiden möglichen Orientierungen enthielten, wurden, wie von Mandel et al. [J. Mol. Biol. 53, 159 (1970)] beschrieben, in den E. coli Stamm MC1061 transformiert, der das kompatible Plasmid pRK248cIts, beschrieben von Bernard et al. [Methods in Enzymology 68, 482 (1979)], trägt. Der Stamm MC1061 und das Plasmid pRK248cIts sind bei der American Type Culture Collection hinterlegt worden und es wurden ihnen die Bezugsnummern ATCC 53338 und 33766, respektive zugeordnet.
Die bakteriellen Transformanten wurden bei 30ºC in M9 Medium [Maniatis et al., s.o., Seite 68] mit 0.5 % Glucose und 0.5 % Casaminosäuren wachsen gelassen und auf 42ºC bei einer O.D. von 0.5 (550 um), wie bei Crowl et al., s.o., beschrieben, umgestellt, um die Transkription des λPL Pomoters zu induzieren. Nach Inkubierung für 2-3 Stunden wurden 1 ml Proben genommen und die Zellen in den Proben durch Zentrifugation gesammelt. Die Zellniederschläge wurden, wie bei Crowl et al., s.o., beschrieben, behandelt und die Lysate wurden zur Natriumdodecylsulfat (SDS) Polyacyrlamidgelelektrophorese wie bei Laemmli, Nature 227, 680 (1970) beschrieben, gegeben. Nach der Elektrophorese wurden die Proteine in den Gelen entweder mit Coomassiebrilliantblau gefärbt oder auf Nitrozellulosemembranen für eine Westernblotanalyse [Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 76, 4350 (1979); Burnetti, Anal. Biochem. 112, 195 (1981)] unter Verwendung des 6A5 monoklonalen Antikörpers und Ziegenantimaus-HPOD-Konjugats zum Nachweis übertragen.
Diese Analyse zeigte, dass das 0.9 kb cDNS Molekül in einer Orientierung im Vektor pEV-vrf1 ein 20 kd Protein produzierte, das mit dem 6A5 Antikörper reagierte. Keine Expression wurde mit dem 1.1 kb Molekül beobachtet, wahrscheinlich weil es 5' nichtkodierende Sequenzen enthielt. Um die Ausbeute von diesem Protein zu optimieren, wurden verschiedene Expressionsmedien untersucht. Es wurde gefunden, dass das bevorzugte Medium pro Liter (± 10 %) 6.0 g KH&sub2;PO&sub4;, 4.0 g K&sub2;HPO&sub4;, 5.0 g (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 3.5 g MgSO&sub4;-7H&sub2;O, 21.0 g Hefeextrakt, 3.5 g Bacto-Trypton, 1.0 ml LB625 Antischaum, 25 g Glucose, 70 mg Thiamin-HCl, 2.5 ml Vitaminlösung [GIBCO MEM (100X) Vitaminklösung] und 1.0 ml Spurenelemente enthält. LB625 Antischaum, ein Produkt von Union Carbide, ist ein lineares Polymer von Ethylen und Polypropylenoxid mit einer Viskosität von 625 Saybolt Universal Seconds bei 37.8ºC.
Vitamine pro Liter Fermentationsbrühe enthielten 0.25 mg jeweils von D-Ca Pantothenat, Cholinchlorid, Folsäure, Nikotinimid, Pyridoxal-HCl und zusätzlich Thiamin-HCl; 0.50 mg i-Inositol; und 0.025 mg Riboflavin. Spurenelemente pro Liter Brühe beinhalteten 2.7 mg FeCl&sub3;-6H&sub2;O; 0.8 mg jeweils von ZnSO&sub4;-7H&sub2;O und CuSO&sub4;-5H&sub2;O; 0.7 mg jeweils von CoCl&sub2;-6H&sub2;O und Na&sub2;MoO&sub4;-2H&sub2;O; 0.2 mg von H&sub3;BO&sub3;; und 0.5 mg von MnSO&sub4;-H&sub2;O.
Die Natur des immunreaktiven Proteins, exprimiert durch den Phage λm2-4, wurde zuerst in einem Lysogen untersucht, das von einer Infektion von Y1090 Zellen durch differentielles Wachstum bei der permissiven (30ºC) und nichtpermissiven (42ºC) Temperatur isoliert wurde. Für die Westernblotanalyse von den durch dieses Lysogen synthetisierten Proteine, wurde eine 50 ml Kultur bei 30ºC in LB Medium [Maniatis et al., s.o., Seite 69] bis zu einer O.D. (550 mu) von 0.5 wachsengelassen und auf 42ºC übertragen, um die Replikation von dem Phagen zu induzieren. Nach 15 Minuten bei 42ºC wurden IPTG bis zu 10 mM zugegeben und die Inkubation wurde bei 37ºC für 30 Minuten fortgesetzt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 4ºC geerntet und durch Kochen für 5 Minuten in Laemmliprobenpuffer (0.125 M Tris, pH 6.8, 1 % (w/v) SDS, 1.4 M β- Mercaptoethanol, 001 % Bromophenolblau (w/v), 20 % (v/v) Glycerol lysiert.
Das Äquivalent eines Milliliters der Kultur wurde durch Elektrophorese in einem 12.5 % SDS-Polyacrylamidgel aufgelöst, elektrophoretisch auf Nitrozellulose übertragen und mit einem Pool von 3 monoklonalen Antikörpern (7D1, 7D4 und 20C6), die den λm2-4 Phagen identifzierten, wie oben beschrieben, nachgewiesen, . Die Entwicklung von dem Westernblot ergab ein Fusionsprotein, das grösser als 150 kd war, das in dem induzierten Lysogen anwesend war (Fig. 10, Panel B, Linie 2). Antikörper spezifisch für β-Galactosidase reagierten auch mit diesem Hochmolekulargewichtsprotein und mit einem Protein von etwa 114 kd, die erwartete Grösse von β-Galactosidase (siehe Fig. 10, Panel A, Line 2).
Die Phagen λm2-4 DNS wurde mit EcoRI verdaut, um ein 1.7 kb DNS Molekül herzustellen. Dieses Molekül wurde in einen EcoRI-linearisieten Plasmidpool, enthaltend Plasmide pEV-VRF1, 2 und 3 [Crowl et al., s.o.], unterkloniert und in den E. coli Stamm MC1061 transformiert, der das Plasmid pRK248cIts enthielt, wie oben beschrieben. Die Transformanten wurden auf Expression eines immunreaktiven Proteins nach Temperaturinduktion mittels des Pools von drei monoklonalen Antikörpern, von denen gezeigt wurde, dass sie mit dem Fusionsprotein in dem λm2-4 Lysogen reagieren, abgesucht. Das immunreaktive rekombinante Protein wurde weiter durch Westernblotanalyse der E. coli Lysate unter Verwendung von einem der drei monoklonalen Antikörper, 7D4, aus dem Pool charakterisiert. Von jeder der positiven Kolonien wurde gefunden, dass sie die Plasmid DNS mit der erwarteten 1.7 kb Einfügung enthielt und die Synthese von einem Protein von etwa 65 kd nach Induktion leitet, wie durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophoretischeanalyse bestimmt.
Es wurde gefunden, dass die Expression von diesem 65 kd Protein relativ insensitiv ist bezüglich Variationen im Wachstumsmedium und dem Induktionsprotokoll. Das Protein wurde quantitativ im Überstand nach Schallaufreissen des Zellniederschlages wieder gewonnen.
Das Expressionsplasmid, das die 1.7 kb Einfügung enthält, wurde in der folgenden Produktion von rekombinantem Protein verwendet und ist schematisch in Figur 11 dargestellt. Dieses Plasmid wurde in MC 1061 Wirtszellen, die für λcI857 lysogen sind (hergestellt mittels Standardmethoden für die Herstellung von λ Phagenlysogenen, beschrieben von Arber et al., in Cold Spring Harbor Monograph, Lambda II, 1983, Hendrix et al., Eds., Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, S. 450) bei 30ºC propagiert, um den repressierten Status von dem PL Promoter im Plasmid aufrechtzuhalten.
Unter Verwendung ähnlicher Methoden wurde die Expression von einem 28 kd Protein, kodiert von einem sporulierenden Oozysten cDNS Segrnent mit etwa 1.1 kb, durchgeführt. Dieses Protein bindet spezifisch an den monoklonalen Antikörpr 8A2. Expression von einem 45 kd Protein, kodiert von cDNS von sporulierendem Oozysten von etwa 1.2 kb, wurde auch durchgeführt. Dieses Protein bindete spezifisch an den monoklonalen Antikörper 7B2.

5. DNS SEQUENZANALYSE

Im allgemeinen wurde eine Isolierung in kleinem Massstab von Plasmid DNS von 1 ml von gesättigten Über-Nacht-Kulturen mittels des Verfahrens von Birnboim et al. [Nucleic Acids Research 7, 1513 (1979)] durchgeführt. Dieses Verfahren erlaubt die Isolierung von einer kleinen Menge von DNS von einer Bakterienkolonie für analytische Zwecke. Grössere Menge von Plasmid DNS wurden mittels 1-Liter Kulturen nach einem Standardprotokoll mit Cesiumchloridzentrifugation [Maniatis et al., s.o., Seite 93] hergestellt.
Die DNS Sequenzen von cDNS von der sporulierten Oozystenbank wurden durch die chemische Spaltungsmethode von Maxam et al., Methods in Enzymology 65, 499 (1980) und durch die Kettenbeendigungsmethode von Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1977) bestimmt, wie für doppelsträngige Plasmid DNS durch Smith et al., Cell 16, 753 (1979) und Wallace et al., Gene 16, 21 (1981) modifiziert. In dem Kettenbeendigungstextprotokoll wurde 7-deaza-dGTP [Barr et al., BioTechniques 4, 428 (1986)] für dGTP verwendet, um G-C Kompressionsartefakte zu eliminieren.
Um die Sequenzanalyse zu vereinfachen, wurde das 1.1 kb EcoRI Molekül von λS1-7 auf das Plasmid pEV3-SEQ (Fig. 12) übertragen, das einen Polylinker neben der EcoRI Stelle von pEV-vrf3 hat. Dieser Polylinker wurde verwendet, um das Plasmid an der BamHI und KpnI Stelle zu linearisieren, um in eine Richtung gerichtete Deletion mit Exonuklease III zu generieren [Henikoff, Gene 28, 351 (1984)]. Die XbaI Seite in dem Polylinker wurde verwendet, um am 3'-Ende für die Maxam-Gilbert Sequenzierung der Deletionen zu markieren, und der Primer CGGTCGACTCGAGCCA wurde für die Sanger Sequenzierung verwendet. Dieser Primer wurde mit ³²P an seinem 5'Ende mittels [γ-³²P]ATP (ICN) und Polynukleotidkinase markiert, wie von Maniatis et al., s.o., Seite 122 beschrieben.
Fig. 13 zeigt die Restriktionsseiten in dem 1.1 kb EcoRI Molekül, das zur Maxam-Gilbert Sequenzierung verwendet wurde. Die Position der EcoRI Stellen in dem 0.9 kb Molekül sind auch gezeigt, da diese auch verwendet wurden. Die Endpunkte der Deletionen, gemacht mit Exonuklease III, sind auch gezeigt. Diese wurden entweder von der XbaI Stelle in dem pEV3-SEQ Polylinker durch die Maxam-Gilbert Methode oder mit einer Primerextension (Fig. 12) durch die Sanger Methode sequenziert. Beide Stränge der gesamten cDNS wurden durch eine oder beide dieser Methoden sequenziert. Aufgrund eines hohen G-C Gehalts in der DNS, wurden die Maxam-Gilbert Reaktionen normalerweise in beiden, 8 %- und 15 %-Polyacrylamid-Hahnstoffgelen, aufgetrennt.
Primerextension wurde durch Inkubieren von 1.5 ug poly(A)&spplus; RNS mit 2 pmol des 5'- markierten synthetischen Oligonukleotideprimers, GAGGTCTGCCATTTTGC, durchgeführt für 60 Minuten bei 42ºC in 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 8 mM MgSO&sub4;, 0.1 M NaCl, 2 mM Dithiothreitol, 2 mM von jedem Deoxynukleotidetriphosphat (dNTP, Pharmacia Fine Chemicals), 20 Einheiten RNasin (Promega Biotec, Madison, WI) und 20 Einheiten AMV Reversetranskriptase (Pharmacia, Piscataway, NJ, FPLCpure). Die Produkte wurden in den 8 % Polyacrylamid-Hahnstoffgelen analysiert, die für die Sequenzanalyse verwendet wurden, mit ³²P-markierten HpaII verdauter pBR322 DNS als Molekulargewichtsmarker.
Für die Sequenzanalyse wurden die primären Prokukte von dem Gel eluiert und durch chemische Spaltungsmethode von Maxam et al., s.o., analysiert oder ddNTPs wurden in der Extensionreaktion verwendet [Tolan et al., J. Biol. Chem. 259, 1127 (1984); Graves et al., J. Biol. Chem. 261, 11409 (1986)]. Die Reaktionen wurden in 8 % Polyacrylamid-Hahnstoffgelen analysiert.
Die Nukleotidsequenz von dem 1.1 kb cDNS Molekül ist in Fig. 14 gezeigt. Die Sequenz von dem 0.9 kb Molekül erstreckt sich von Base 188 bis Base 1082 innerhalb dieses grösseren Molekül s. Die Aminosäuresequenz, die durch offene Leserahmenanalyse von dieser Nukleotidsequenz vorhergesagt wurde, ist in Fig. 15 gezeigt. Die Korrektheit der vorhergesagten Aminosäuresequenz, gezeigt in Fig. 15, wurde wie folgt bestätigt.
Synthetische Polypeptide wurden mit Aminosäuresequenzen, die den Resten 41-54 und 145-164 der Fig. 15 entsprechen, hergestellt. Hasenantisera, die gegen beide von diesen Peptiden entwickelt worden waren, wurden in der Westernblotanalyse von Gesamtsporozoitenproteinen und einem Lysat von einem E. coli Transformanten, der die 0.9 kb cDNS exprimiert, verwendet. Die Antikörper gegen beide Polypeptide binden die Proteine in beiden Westernblots.
Von der Verwendung ähnlicher Methoden wurde die Nukleotidsequenz von der 1.7 kb Einfügung, die das 65 kd Protein im Phagen λm2-4 kodiert, bestimmt, mit dem Resultat, das in Fig. 16 gezeigt wird. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz von dem Protein, das durch diese DNS Sequenz kodiert wird, ist in Fig. 17 gezeigt. Diese Sequenz wurde durch Aminosäuresequenzanalyse bestätigt, durchgeführt mit Polypeptiden, die durch tryptischen Verdau von dem exprimierten 65 kd Protein, wie oben beschrieben, hergestellt wurden. Regionen in der Aminosäuregesamtsequenz, die einigen von diesen Peptiden entsprechen, sind in Fig. 17 unterstrichen.
Kurioserweise würde man erwarten, dass der offene Leserahmen der DNS Sequenz für das 1.7 kb Molekül für ein Protein von etwa 33,349 Daltons kodieren würde. Doch wandert das Expressionsprodukt von diesem DNS Fragment in SDS Gelen mit einem anscheinenden Molekulargewicht von etwa 65 kd. Der Grund für diese Diskrepanz zwischen der vorhergesagten und beobachteten Proteingrösse ist unbekannt. Dieses Protein wird hierin allgemein als das "65 kd" Protein bezeichnet.
In ähnlicher Weise wurden die Nukleotid- und die vorhergesagten Aminosäuresequenzen von den cDNS Molekülen, die für das 28 kd Protein kodieren, das durch den monoklonalen Antikörper 8A2 erkannt wurde, bestimmt, mit den Ergebnissen, die in den Fig. 18 und 19 respektive gezeigt sind.
In ähnlicher Weise wurde die Nukleotid- und vorhergesagte Aminosäuresequenz von der 1.2 kb 7B2 cDNS bestimmt. Da ein durchlaufender offener Leserahmen gefunden wurde und das Protein, isoliert von Sporozoiten durch Immunpräzipitation, grösser als 200 kd ist, wurde die Bank nach grösseren cDNS unter Verwendung der 1.2 kb cDNS als Probe abgesucht. Eine 3.2 kb cDNS wurde so mit der Nukleotid- und der vorhergesagten Aminosäuresequenz, die in Fig. 20 und 21, respektive gezeigt sind, erhalten.

6. REINIGUNG UND CHARAKTERISIERUNG DES 65 KD PROTEINS

6.1. PROTEINREINIGUNG

Fermentation bei hohen Zelldichten von E. coli MC1061 (pRK248cIts), enthaltend das pEV/2-4 Expressionsplasmid, wurde in 10-Liter Fermentern in 1.5 x M-9 Medium durchgeführt unter der Verwendung eines Standardprotokolls für Temperaturinduktion, wie oben beschrieben, nach etwa 4 Stunden des Wachstums bei permissiver Temperatur. Die Zellmasse wurde 5 Stunden nach Induktion geerntet und ergab 500 Gramm Zellpaste.
Fünfzig Gramm E. coli Zellpaste wurde gesamthaft in 500 ml von 10 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, pH 8.0, suspendiert und bei 2-8ºC für zwei Stunden gerührt. Die Suspension wurde durch einen Gaulin Homogenisator (APV Gaulin, Everett, Massachusetts, U.S.A.) zwei bis drei mal bei 7'000 psi passiert. Das Zelllysat wurde bei 24'000 x g eine Stunde in einer Sorvall RC-R Zentrifuge zentrifugiert und das Pellet wurde verworfen. Festes Ammoniumsulfat wurde zum Überstand (Endkonzentration 80 %) zugegeben. Dieser wurde bei 4ºC für zwei Stunden gehalten und dann bei 24'000 g eine Stunde zentrifugiert. Das Pellet wurde in 20 mM Kalziumphosphat, pH 6.8, aufgelöst. Nach Zentrifugation wurde der Überstand gegen 20 mM Kalziumphosphat, pH 6.8, dialysiert.
Eine Pharmacia Glassäule ( 5 cm Durchmesser x 10 cm Länge) wurde mit NuGel P-DE 2000 (200 Angström, 40-60 um, schwacher Anionaustauscher, Separation Industries, Metuchen, NJ) Kiesselgel- Material gepackt. Das Gel wurde mit 20 mM Kalziumphosphat, pH 6.8, equilibriert. Die Probe wurde geladen (10 ml/Min), mit Equilibrierungspuffer gewaschen und mit 20 mM Kalziumphosphat, enthaltend 0.4 M NaCl, pH 6.8, eluiert. Die Fraktionen der Säule wurden mittels Westernblotting mit dem Antikörper 7D4 analysiert, um das 65 kd Protein nachzuweisen.
Eine Immunaffinitätsäule wurde verwendet, um das 65 kd Protein weiter zu reinigen. Das Adsorbent für diese Säule wurde durch Immobilisierung des monoklonalen Antikörpers 7D4 an NuGel P- polyaldehyd (500 Angström, 40-60 um, Separation Industries, Metuchen, New Jersey, U.S.A.) Kiesselgel-Material hergestellt. Das Immobilisierungsverfahren beinhaltete das Folgende: 10 Gramm von Polyaldehydträgermaterial wurden suspendiert und mit 0.1 M Kalziumphosphat, 0.1 M NaCl, pH 6.8, gewaschen und quantitativ in einen Erlenmeyer-Kolben gegeben, der 20 ml des monoklonalen Antikörpers 7D4 bei einer Proteinkonzentration von 8 mg/ml enthielt. Natriumcyanborhydrid (4 mg) wurde dann zu der Suspension zugegeben. Die Mischung wurde leicht bei 4ºC 16 Stunden geschüttelt. Das Gel wurde filtiert und mit 0.1 M Kalziumphosphat, 0.1 M NaCl, pH 6.8, gewaschen. Die gepoolten Filtrate wurden auf nichtgebundenen Antikörper überprüft. Die Bindungsdichte betrug 8 mg/g Trägermaterial. Nichtgekoppelte aktive Stellen wurden durch Suspension des Gels in 20 ml 1 M Ethanolamin, pH 7.5, blockiert. Natriumcyanborhydrid (4 mg) wurde zu der Suspension zugegeben, die dann bei 4 ºC für 16 Stunden geschüttelt wurde. Das Gel wurde gesammelt und stark mit kaltem Kopplungspuffer gewaschen.
Um die Immunoaffinitätschromatographie durchzuführen, wurde eine Saule ( 1 cm x 10 cm) mit dem immobilisierten 7D4 Antikörper gepackt und mit kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung, enthaltend 0.1 % Triton X-100, equilibriert. Gesammelte Fraktionen von der NuGel P-DE 200 Säule, enthaltend 65 kd Protein, wurden 2 x mit PBS enthaltend 0.1 % Triton X-100, verdünnt und auf die Säule bei einer Flussrate von 10 ml/Min. geladen. Nach Ladung wurde das Gel mit PBS gewaschen, um nichtadsorbiertes Material zu entfernen. Das adsorbierte immunoreaktive Material wurde mit 0.3 M Essigsäure, 0.1 M NaCl, pH 2.7, Puffer eluiert. Das Protein wurde dann in einem Amicon Stircell Apparat unter Verwendung einer YM 10 Membrane (Amicon, Div. W.R. Grace & Co. Danvers, Massachusetts, U.S.A.) konzentriert.
Die Reinheit des Proteins wurde durch SDS Polyacrylamidgelelektrophorese, wie bei Laemmli [Nature 227 680 (1970)] beschrieben, bestimmt. Das Gel wurde mit Coomassieblau angefärbt. Westernblotanalyse wurde unter Verwendung des 7D4 monoklonalen Antikörpers mit einem Ziegenantimausmeerretichperoxidasekonjugat durchgeführt. Die Resultate sind in Fig. 22 gezeigt. Linien 2, 3, 4 und 5 enthalten gereinigtes Protein von zwei Präparationen. Linien 1 und 6 enthalten eine Mischung von Molekulargewichtsmarkerproteinen mit den Molekulargewichten, die an der linken und rechten Seite der Figur gezeigt sind. Zehn Mikrogramm des Proteins wurden in jeder Linie laufen gelassen.
In Fig. 22, kann man sehen, dass das gereinigte Protein im SDS Gel als eine starke Bande mit einem anscheinenden Molekulargewicht von etwa 65 kd mit weniger starken Banden mit höheren und niederen Beweglichkeiten wandert.

6.2. DIE BESTIMMUNG DES ISOELEKTRISCHEN PUNKTES

Zehn Mikrogramm des gereinigten 65 kd Proteins wurden der isoelektrischen Fokusierung in einem vorgeformten isoelektrischen Fokusierungsgel, das von den LKB Instrumenten erhalten wurde, ausgesetzt, Gaithersburg, Maryland, U.S.A. Eine Mischung von Standardproteinen mit bekannten isoelektrischen Punkten wurden zur selben Zeit laufen gelassen. Das Gel wurde 2 Stunden bei 50 mA, 1'500 V gemäss den Anweisungen des Herstellers mit einem Gradienten von 3.5-9.5 pH laufen gelassen.
Nach Beendigung der Elektrofokusierung wurde das Gel mit Coomassieblaufarbstoff geüärbt, um die Proteinbanden nachzuweisen. Der isoelektrische Punkt des gereinigten Proteins wurde dann durch Messen der Position der Bande innerhalb des pH Gradienten in Beziehung den Positionen der Standardproteine bestimmt. Der isoelektrische Punkt des Proteins wurde so auf 4.6 bestimmt.

6.3. AMINOSÄUREZUSAMMENSETZUNGSANALYSE

Die Analyse der Zusammensetzung der Aminosäuren wurde mittels einer Nachsäulenreaktion mit Fluoressenzamin, wie von Pan et al. in Methods of Protein Microcharacterization, 1986, Shively, ed., The Humana Press, S. 105-119, beschrieben, durchgeführt. Proben, enthaltend 3 ug des 65 kd Proteins wurden in 6 N HCl, enthaltend 4 % Thioglycolsäure, bei 110ºC für 20 bis 24 Stunden im Vakuum hydrolysiert und 10 % des Hydrolysats wurden für die Analyse verwendet. Cysteinwerte wurden nach Oxidation mit Performsäure bestimmt. Die Resultate sind in Tabelle 3 gezeigt. TABELLE 3 AMINOSÄUREZUSAMMENSETZUNGSANALYSE DES 65 KD PROTEINS AMINOSÄURE MOL PROZENT ND = Nicht bestimmt

6.4. N- UND C-TERMINALE SEQUENZANALYSE

Zweihundert Picomol des Proteins (wie durch Aminosäurezusammensetzung bestimmt) wurden zur N-terminalen Analyse verwendet mittels der Methode von Hewick et al., J. Biol. Chem. 256, 7990 (1981) und einer Applied Biosystems Model 470A Sequenziermaschine (Applied Biosystems, Inc., Forster City, California, U.S.A). Die so bestimmte N-terminale Sequenz war M-N-K-N-S-?-L-G-G-F-?- S-M-Q-E-S-P-P-P-. Die Identitäten der Aminosäurereste an durch Fragezeichen angegebenen Positionen sind unbekannt, weil die Ausbeute von PTH-Cys niedrig war und Cysteinreste in Disulfidlinker involviert sein könnten [Hewick et al., J. Biol. Chem. 256, 7990 (1981)].
C-terminale Analyse wurde mit 1200 Picomol des 65 kd Proteins durch Verdau mit Carboxypeptidase Y während eines bestimmten Zeitverlaufs, wie von Hayashi, Methods in Enzymology 47, 84 (1977) beschrieben, durchgeführt. Carboxypeptidase Y (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) wurde bei einer Konzentation von 0.8 ug/35 ul in 0.05 M Natriumacetpuffer, pH 5.9, verwendet und Probenanteile wurden nach 0, 2, 5, 10, 20 und 30 Minuten für die Analyse genommen. Die Probenteile wurden mit HCl angesäuert, um die weitere Reaktion abzustoppen, und dann zur Aminosäureanalyse, wie oben beschrieben, gegeben. Diese Analyse zeigte, dass die Aminosäuresequenz am C-Terminus wahrscheinlich (Met, Trp)- Ma-Ser ist. Es wurde beobachtet, dass Tryptophan gleichzeitig mit Methionin ansteigt, aber Trp ist schwierig quantitativ in dem Fluoressenzaminanalysator zu bestimmen, weil er eine geringe Reaktivität mit Fluoressenzamin zeigt. Deshalb konnten die relativen Positionen von Trp und Met nicht mit Sicherheit durch diese Analyse bestimmt werden.

6.5. ANALYSE TRYPTISCHER PEPTIDE

Um teilweise die Aminosäuresequenz, die von der Nukleotidsequenz der cDNS, die das 65 kd Protein kodiert, zu verifizieren, wurde ein Teil des Proteins mit Trypsin (Cooper Biomedical, Philadelphia, Pennsylvania, U.S.A) verdaut und die entstehenden Peptide, wie oben beschrieben, sequenziert.
Tryptische Verdaus wurden über Nacht bei 37ºC mit 148 ug Protein in 0.2 M Ammoniumbicarbonat, pH 8, mittels eines Enzym-zu- Substratverhältnisses von 1:30 (Gewicht oder Molarbasis?) durchgeführt. Die so generierten Peptide wurden in einem Waters HPLC System mittels einer Altex Ultrasphere 250 x 4.6 mm C-18 Säule (Beckman Instruments, Fullerton, CA) mit einem 0 bis 55 % Gradienten von ansteigendem Acetonitril in 0.1 % (Basis) Trifluoressigsäure aufgetrennt. Vor der HPLC Auftrennung wurde der Verdau mit β-Mercaptoethanol 30 Minuten bei 37ºC reduziert, um Disulfidbrücken in den Peptiden zu brechen. Der Säulenauslauf wurde bei 215 ug mittels eines Labordatenkontrolldedektors (Laboratory Data Control, Rivera Beach, Florida, U.S.A.) verfolgt. Die HPLC Säule löste 8 grössere Peaks, wie in Fig. 23A gezeigt, auf.
Jeder Peak wurde zuerst durch Aminosäureanalyse, wie oben beschrieben, analysiert, um die Quantität und die Zusammensetzung der Peptide zu bestimmen. Dann wurden die meisten Peptidpeaks der HPLC Säule durch automatischen Edman Abbau unter Verwendung eines Applied Biosystem Model 470A Gasphasensequensators sequenziert. Phenylthiohydantoin (PTH) Aminosäurederivate wurden in einem Water HPLC System mittels einer Mtex Ultrasphere C-18 Säule, wie von Hawke et al. [Anal. Biochem. 120, 302 (1982)] beschrieben, oder in einem Applied Biosystem Model 120A on-line PTH Aminosäureanalysator, identifiziert.
Die Aminosäuresequenzen von einigen von diesen Peptiden sind unter den unterstrichenen Regionen der Fig. 17 gezeigt. Die Anzahl von jedem dieser Peptide (entsprechend der Anzahl von HPLC Peaks) ist in Kreisen neben den entsprechenden Sequenzen gezeigt. Unsicherheit in der Identität von einigen von den Resten in den Peptidsequenzen ist durch ein Fragezeichen an solchen Position angegeben, obwohl die Aminosäurezusammensetzungsanalyse von den Peptiden zeigte, dass die Aminosäuren, angegeben in den entsprechenden Positionen der vorhergesagten Sequenz, in den Peptiden vorhanden waren. Die Unsicherheit der Identität in einigen der Peptidreste war die Folge der niederen Reaktivität von Tryptophan mit Fluoressenzamin.
Peptid 6, das dem N-Terminus des kompletten 65 kd Proteins entspricht, enthält 4 Reste an seinem N-Terminus, die durch Nukleotide im Expressionsplasmid kodiert werden. Die Analyse des Peptids 8 produzierte eine Aminosäuresequenz, die ähnlich der des Peptids 3 war, aber der die 4 C-terminalen Reste fehlten, so dass zu vermuten war, dass es wahrscheinlich das Ergebnis von einem unvollständigen tryptischen Verdau war. Peptid 5 wurde nicht sequenziert, weil die Aminosäurezusammensetzungsanalyse von diesem Peptid zeigte, dass es dasselbe wie Peptid 6 war, ohne die ersten 3 Aminosäurereste am N- Terminus.
HPLC Analyse des tryptischen Verdaus, der wie oben beschrieben durchgeführt worden war, aber ohne vorherige Merkaptoethanolreduktion, produzierte ein Elutionsprofil, in dem die Peaks 4, 7 und 8 abwesend waren (Fig. 23 B). Diese Beobachtung lässt vermuten, dass diese Cysteinenthaltenden Peptide wahrscheinlich in die Disulfidbrückenbindung im nichtreduzierten Protein involviert sind.

7. GEFLÜGELIMMUNISIERUNG

7.1. VERWENDUNG DES 65 KD ANTIGENS

Um zu bestimmen, ob die Administration von gereinigtem rekombinantem 65 kd Protein Hühner gegen die Provokation durch Eimeria tenella sporulierende Oozysten schützen könnte, wurde eine Serie von Immunisierungsexperimenten durchgeführt. In diesen Experimenten wurden ein bis drei Tage alte Leghorn Hühner (Avian Services, Frenchtown, New Jersey, U.S.A.) in einem sauberen Raum gehalten und durch Pfleger versorgt, die keinen Kontakt mit anderen Vögeln bis zum Zeitpunkt der Provokation hatten. Die Vögel wurden in elektrisch geheizten Brutschränken gehalten, bis sie 3 oder 4 Wochen alt waren und wurden dann in Aufzuchtkäfige transferiert.
Nicht mit Medikamenten versetztes Hühnerstartfutter und Wasser wurden in beliebiger Menge während der Experimente zur Verfügung gestellt. Zum Zeitpunkt der Provokation mit den Oozysten wurden die Vögel in ein anderes Gebäude transferiert, wo sie bis zum Ende der Experimente gehalten wurden. Die klinischen Bedingungen der Tiere wurden wenigstens dreimal wöchentlich vor der Immunisierung und jeden Tag nach der Immunisierung überprüft. Die Vögel wurden individuell durch Flügelbänder im Alter von 3 oder 4 Wochen identifiziert, bevor sie zufällig auf verschiedene Testgruppen verteilt wurden.
Verschiedene Proben des 65 kd Proteins, durch Immunoaffinitätschromatographie, wie oben beschrieben, gereinigt, wurden als Immunogen verwendet. Diese Proben des Immunogens enthielten eine bakterielle Endotoxinaktivität im Bereich von etwa 0.3 bis etwa 50 Endotoxineinheiten pro ug Protein, wobei die Aktivität bestimmt und definiert wurde, wie in the United States Pharmacopeia, 21st Revision, 1985, United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Md., S. 1165-1167 beschrieben. Das Protein wurde in 0.02 M K&sub2;HPO&sub4; Puffer, pH 6.8, vor Verwendung gelöst und mit demselben Puffer wie benötigt verdünnt.
Rinderserumalbumin (BSA, Pentex) wurde als Kontrolle verwendet. Da Pyrogenaktivität in dem verwendeten Immunogen vorhanden war, wurden ungefähr gleiche Mengen solcher Aktivität zu allen BSA Kontrollen gegeben, um jeden nichtspezifischen Effekt, der auf Grund dieser Aktivität auftauchen könnte, Rechnung zu tragen. Diese Pyrogenaktivität wurde zum BSA in der Form von nichtransformiertem E. coli Lysat zugegeben, das durch Auseinanderreissen von E. coli durch Beschallen und dann Filtrieren des Materials durch ein 0.45 u Milliporfilter hergestellt worden war.
Verdünnte Proben von Kontroll BSA oder dem Eimeria Antigen wurden zu einem gleichen Volumen von Adjuvanzien gegeben und kräftig in einer Glasspritze mit einer 18 Gauge Nadel vor der Administration vermischt. Freunds vollständiges und unvollständiges Adjuvant wurden für die erste und Boosterimmunisierung, respektive verwendet. Beide Adjuvanzien wurden von GIBCO, Grand Island, New York, U.S.A., erhalten.
Erste Immunisierungen wurden subcutan in dem hinteren Teil des Körpers an der Basis des Nackens gemacht, als die Vögel vier Wochen alt waren. Einige Vögel erhielten auch Boosterimmunisierungen bei einem Alter von 6 Wochen. Das Volumen des injizierten Materials war im Bereich von etwa 0.4 bis 2.4 ml. Für die grösseren Volumen wurde die Dosis auf 2 Injektionen aufgeteilt. Zwei oder drei Wochen nach der letzten Vakzination wurden die Vögel mit 25'000 oder 50'000 sporulierenden Oozysten von E. tenella, die oral gegeben wurden, provoziert. Sieben Tage nach der Infektion wurden die überlebenden Vögel getötet, nekropsiert und bezüglich deutlicher krankhafter Veränderung klassifiziert. Alle Vögel, die während der Experimente starben, wurden auch nekropsiert. Diagnosen wurden gemacht und die krankhaften Veränderungen wurden klassifiziert als 0 = normal, 1 = leichte Heimsuchung, 2 = moderate Heimsuchung, 3 = schwere Heimsuchung und 4 = Tod. Die erhaltenen Ergebnisse wurden als der Durchschnittsgrad der Infektion von jeder Gruppe von Vögeln zusammengefasst. Die Vögel wurden auch zum Zeitpunk der Infektion und sieben Tagen nach der Infektion gewogen. Einige Vögel wurden nicht mit BSA oder Kokzidialantigen vakziniert aber als infizierte oder nichtinfizierte nichtvakzinierte Kontrollen behandelt.
Die Ergebnisse von zwei solchen Experimenten sind in Tabelle 4 gezeigt. TABELLE 4 WIRKUNG VON SUBCUTANER IMMUNISIERUNG VON HÜHNERN, DIE EINE ODER ZWEI IMPFUNGEN MIT GEREINIGTEM REKOMBINANTEM 65 KD ANTIGEN ERHALTEN HATTEN Dosierung (ug) bei Alter Anzahl Vögel Behandlunga Krankhafte Veränderungb Gewichtsgewinn/Verlustc (Gramm) Wochen Experiment Antigen
a- IUC, Antigen, BSA und UUC beziehen sich auf infizierte (mit Oozysten) nichtimmunisierte Kontrollen, gereinigtes 65 kd Protein, Rinderserumalbumin und nichtinfizierte nichtimmunisierte Kontrollen, respektive.
b- In Experiment 1 wurden Vögel, die einfach immunisiert worden waren, drei Wochen später mit 50'000 sporulierten Oozysten von E. tenella provoziert; solche mit einer Boosterimpfung wurden 2 Wochen nach dieser mit 25'000 Oozysten provoziert. In Experiment 2 war der zeitliche Verlauf der Oozystenprovokation derselbe aber 25'000 Oozysten wurden zu beiden, einfach vakzinierten und Boostervögeln, gegeben. Infizierte nichtimmunifizierte Kontrollen wurden für jedes Experiment durchgeführt und identische Anzahl von sporulierten Oozysten im selben Alter gegeben, sieben Tage bevor sie getötet wurden. Die Ergebnisse basieren auf einer Klassifikation von 0-4, wie im Text beschrieben.
c- Die gezeigten Werte sind der Unterschied zwischen dem Gewicht zum Zeitpunkt der Infektion und dem Gewicht sieben Tage nach der Infektion.
d- Diese Gruppe enhielt ursprünglich 9 Vögel, aber ein Vogel starb nach einer Woche.
e- p≤ 0.05 verglichen zu IUC.
Die Daten von Tabelle 4 zeigen, dass die Impfung mit dem 65 kd Protein im allgemeinen zahlenmässig geringere krankhafte Veränderungen erzeugte im Vergleich zu infizierten aber nichtimmunisierten Kontrollen. Zwei Gruppen von Vögeln, denen Boostervakzinierungen in Experiment 1 gegeben worden sind (bezeichnet durch das hochgestellte e in der Tabelle), zeigten reduzierte krankhafte Veränderungen, die statistisch signifikant waren. In anderen Fällen war die Reduzierung in krankhaften Veränderungen nicht so gross, aber der Gewichtsgewinn war nichts desto Trotz allgemein in den geimpften Vögeln verbessert.
Um zu überprüfen, ob eine dritte Impfüng den Schutz weiterhin verstärken könnte, wurde ein Experiment durchgeführt, in der eine Gruppe von 8 Vögeln als infizierte oder nichtinfizierte nichtvakzinierte Kontrollen oder vakziniert mit BSA oder dem Merozoitenprotein bei 3 und 5 Wochen Alter oder bei 3, 5 und 7 Wochen Alter behandelt wurden. Die ersten zwei Vakzinierungen wurden mit Freunds vollständigem Adjuvant durchgeführt. Wo eine dritte Impfung gegeben wurde, wurde diese mit Freunds unvollständigem Adjuvant gegeben. Inoculationen wurden subcutan, wie oben beschrieben, gegeben.
Zwei Wochen nach der letzten Impfung wurde jeder Vogel mit 25'000 sporulierten Oozysten von E. tenella durch orale Gabe provoziert. Körpergewichte wurden zu dem Zeitpunkt der Provokation und 7 Tage danach bestimmt, zu welchem Zeitpunkt die Vögel getötet wurden und cecale krankhafte Veränderungen bestimmt wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. TABELLE 5 WIRKUNG VON SUBCUTANER IMMUNISIERUNG VON HÜHNERN, DENEN ZWEI ODER DREI IMPFUNGEN MIT GEREINIGTEM REKOMBINANTEM 65 KD ANTIGEN GEGEBEN WURDEN Dosierung (ug) bei Alter Behandlunga Krankhafte Veränderungb Gewichtsgewinn/Verlustc (Gramm) Wochen Antigen
a- IUC, Antigen, BSA und UUC beziehen sich auf infizierte (mit Oozysten) nichtimmunifizierte Kontrollen, gereinigtes 65 kd Protein, Rinderserumalbumin und nichtinfizierte nichtimmunisierte Kontrollen, respektive.
b- Vögel wurden 2 Wochen nach der letzten Vakzination mit 25'000 E. tenella sporulierten Oozysten provoziert oder sieben Tage vor dem Töten bei den infizierten nichtimmunisierten Kontrollen. Diese Kontrollen waren sieben und neun Wochen alt bei doppel und dreifach Immunisierungsstudien, respektive, wenn infiziert. Die Ergebnisse basieren auf einer Klassifikation von 0-4, wie im Text beschrieben.
c- gezeigte Werte stellen den Unterschied zwischen Gewicht zum Zeitpunkt der Infektion und Gewicht sieben Tage nach Infektion dar.
Die Werte in Tabelle 5 zeigen, dass die Immunisierung nicht durch Gabe einer dritten Impfung verbessert werden konnte. Grösserer Schutz, gezeigt durch reduzierte cecale krankhafte Veränderungswerte, wurde durch das Antigen im Vergleich zu nicht behandelten, infizierten Kontrollen oder Vögeln, die mit BSA geimpft wurden, verliehen.
Um zu bestimmen, ob eine andere Art und Weise der Administration als subcutane Injektion bessere Ergebnisse hervorrufen könnte, wurden zwei Dosierungen des 65 kd Proteins 3 mal mit Unterschied von zwei Wochen einer Gruppe von 8 drei Wochen alten Leghornhühnern mittels intradermaler, subcutaner, intramuskulärer, oraler und analer Administrationsweise gegeben. Zwei Wochen nach der letzten Gabe des Immunogens wurden die Vögel mit 25'000 sporulierenden Oozysten von Eimeria tenella, oral gegeben, provoziert. Die Vögel wurden eine Woche nach Provokation getötet und die krankhaften cecal Veränderungen wurden bestimmt.
Subcutane Injektionen wurden, wie oben beschrieben, gegeben. Intramuskuläre Injektionen wurden tief in die äussere Seite des Oberschenkels gemacht. Intradermale Injektionen wurden in die anteriore Seite des rechten Flügels gemacht. Orale Administration wurde mit einer 5 cm langen 18 Gauge Nadel mit Kugelspitze, wobei das Inoculum in den Kropf des Vogels geführt wurde, ausgführt. Anale Administrationwurde mit einer 5 cm langen 18 Gauge olivenspitzenförmigen Nadel gemacht, und zwar durch Einführung der maximalen Länge in die cloacale Öffnung. Nach oraler und analer Gabe wurden die Vögel in stehender und invertierter Position, respektive für mehrere Minuten gehalten, um den möglichen Ausstoss des Inoculums zu vermeiden.
Die subcutane Dosierungsform wurde, wie oben beschrieben, mit Freunds vollständigem Adjuvant für die erste Injektion und Freunds unvollständiger Adjuvant für die Boosterinjektion durchgeführt. Dosierungsformen für die anderen Administrationsweisen enthielten Protein wie angegeben in 0.02 M K&sub2;HPO&sub4; Puffer, pH 6.8.
Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Tabelle 6 gezeigt. TABELLE 6 WIRKUNG VON VERSCHIEDENEN WEISEN DER GABE DES 65 KD ANTIGENS ZUR HÜHNERIMMUNISIERUNG Dosierung (mg) bei Alter Behandlunga Weise der Administration Krankhafte Veränderungb Klassifikation Gewichtsgewinn/Verlustc (Gramm) Wochen Antigen
a- IUC, Antigen, BSA und UUC beziehen sich auf infizierte (mit Oozysten) nichtimmunisierte Kontrollen, gereinigtes 65 kd Protein, Rinderserumalbumin und nichtinfizierte nichtimmunisierte Kontrollen, respektive. SC, IM, A, O und ID beziehen sich auf subkutane, intramuskuläre, anale, orale und intradermale Arte der Gaben, respektive.
b- Vögel wurden 2 Wochen nach der letzten Vakzination mit 25'000 E. tenella sporulierenden Oozysten provoziert oder sieben Tage vor dem Töten bei infizierten nichtimmunisierten Kontrollen. Diese Kontrollen waren 9 Wochen alt, wenn sie infiziert wurden. Die Ergebnisse basieren auf einer Klassifikation von 0-4, wie im Text beschrieben.
c- Werte zeigen die Differenz zwischen dem Gewicht zum Zeitpunkt der Infektion und dein Gewicht sieben Tage nach Infektion.
d- P< 0.05 verglichen zu IUC.
Tabelle 6 zeigt, dass die niedersten Werte krankhafter cecal Veränderungen in Vögeln beobachtet wurden, die mit 5 ug des Antigens oral und mit 25 ug des Antigens durch intradermale Gabe geimpft wurden. Diese Ergenbisse waren statistisch signifikant. Numerisch niedere Werte krankhafter Veränderungen wurden für andere Administrationsweisen und Dosierungen gesehen, die dadurch einen Trend des Schutzes anzeigen. Die Unterschiede zwischen diesen Werten und solchen der IUC Vögel waren jedoch nicht statistisch signifikant.
Nichtbeobachten von linearen Dosierungsantworten in den vorausgehenden Experimenten kann möglicherweise auf die Unterschiede in Spurenkontaminanten und/oder pyrogenem Inhalt in der 65 kd Antigenpräparation oder auf andere Faktoren zurückzuführen sein.

7.2. VACCINIAVEKTORVAKZINIERUNG

Um ein wirksameres Mittel zur Immunisierung von Hühnern mit E. tenella Antigenen von dieser Erfindung herzustellen, wurde die 1.1 kb cDNS, die das 20 kd Protein kodiert, das durch den monoklonalen Antikörper 6A5 (Fig. 14) erkannt wurde, und das 1.1 kb cDNS Molekül, das für das 28 kd Protein kodiert, das durch den monoklonalen Antikörper 8A2 (Fig. 18) erkannt wurde, in den Vacciniavirus kloniert und zur Vakzinierung von Hühnern, wie unten beschrieben, verwendet.

7.2.1. VEKTORHERSTELLUNG

Alle Rekombinanten wurden basierend auf homologer Rekombination in den viralen Thymidinkinase (TK) Locus, wie von Mackett et al. beschrieben, gemacht [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 7415 (1982)]. Der TK Locus wurde auf das Vacciniavirus (VV) HindIII J Fragment [Hruby et al., J. Virol. 43, 403 (1982)] kartiert und ein Teil dieses Fragments wurde sequenziert [Weir et al., J. Virol. 46, 530 (1983)].
Um einen Vektor zur Rekombination zu konstruieren, wurde das VV HindIII J Fragment in pUC8 (Fig. 24a) subkloniert. Dieses Konstrukt wurde mit HpaII gespalten. Die Fragmente wurden mit E. coli DNS Polymerase Klenow Fragment (Klenow) behandelt und wieder mit HindIII gespalten und das Stück, das das virale TK Gen enthält, wurde von leicht schmelzender Agarose isoliert. Das isolierte Fragment wurde in die HindIII und stumpfendige (S1 Behandlung) EcoRI Stelle eines pUC8 Vektors ligiert (Fig. 24b, rechts). Anschliessend wurde die HindIII Stelle durch Behandlung der HindIII verdauten DNS mit Klenow eleminiert und in das Vektorfragment religiert. Für die Einfügung des VV Promoters (bezeichnet der 7.5K Promoter) wurde der Vektor mit ClaI und EcoRI gespalten.
Der VV 7.5K Promoter ist in einem der kleinsten SalI Fragmenten des Virus plaziert [Venkatesan et al., Cell 25, 805 (1981)]. Das entsprechende Fragment wurde in M13mp8 kloniert. Ein Klon wurde selektiert, in dem die Tanskriptionsrichtung in Richtung auf die EcoRI Stelle von M13mp8 war (Fig 24a, links). Die DNS wurde mit ScaI und SmaI gespalten, Bg1II Linker zugegeben und die DNS wurde religiert (Fig. 24b). Das EcoRI-AccI Fragment, enthaltend das virale Promotersegment, wurde von dem M13 Konstrukt isoliert und in das pUC8-TK Fragment, wie oben beschrieben, ligiert und gab den Vektor pUC8-TK-7.5K*. Dieser neue Vektor wurde mit BglII und EcoRI verdaut.
Um einen Vektor mit Vielfachklonierungsstellen zu konstruieren, wurde ein geeigneter Polylinker in das obige Konstrukt eingefligt. Zu diesem Zweck wurde der Polylinker, der in M13tg131 (Amersham) enthalten ist, ausgewählt (Fig. 24d). Das Polylinkerfragment wurde durch Verdau der Phagen DNS mit BgIII und EcoRI isoliert und das Fragment wurde in das pUC8-TK-7.5K* Konstrukt eingefügt und ergab den endgültigen Grundvektor für die Rekombination von Fremdantigenen in VV (Fig 24c), der pUC8-TK-7.5K ist.
Das EcoRI Fragment, das für das 28 kd Protein kodiert, das den monoklonalen Antikörper 8A2 bindet, enthält nicht die Sequenz für den N- terminalen Teil des Proteins. Der ursprüngliche Startkodon und die Leitungssequenz für das Protein fehlen.
Um für diese fehlende Regionen zu kompensieren, wurden zwei verschiedene Konstrukte gemacht und auf Expression getestet. In dem ersten Konstrukt wurde ein Staftkodon in Leserichtung durch Deletion eines Teils von dem Polylinker in dem Grundvektor, zur Rekombination pUC8-TK-7.5K generiert (Fig. 24 c). Der Vektor wurde mit EcoRV und SmaI verdaut und dadurch ein Teil des Polylinkers deletiert (Fig. 24 d) und dann religiert. Durch diese Manipulation wurde der in der SphI Restriktionsstelle enthaltene ATG Kodon in das korrekte Lesemuster für die kodierende Region von dem Oozystenprotein auf dem EcoRI Fragment plaziert. Die erfolgreiche Manipulation wurde durch Sequenzierung des neuen Polylinkerfragments bestätigt. Die vorhergesagte N-terminale Aminosäuresequenz des Proteins, kodiert von diesem Konstrukt, ist in Fig. 25A gezeigt.
Um in der DNS Sequenz nicht nur für den fehlenden Startkodon sondern auch für die fehlende Leitersequenz zu kompensieren, wurde das EcoRI Fragment in den korrekten Leserahmen hinter eine Leitersequenz eines Malariaantigens plaziert. Das Malariantigen, das verwendet wurde, um die Leitersequenz zu isolieren, war das 190 kd Protein, das als Ro-33 beschrieben wurde [Certa et al., EMBO J. 6, 4137 (1987)]. Es muss jedoch bemerkt werden, dass andere Leitersequenzen, so wie kokzidial Leitersequenzen auch für denselben Zweck verwendet werden könnten.
Um das die Leitersequenz enthaltene DNS Fragment zu isolieren, wurde Ro-33 DNS mit Dral verdaut. Das Fragment, das die Erkennungsstellen für die Restriktionsenzyme PvuII und HindIII enthielt, wurde isoliert und mit HindIII verdaut. Das ursprüngliche Vektorkonstrukt pUC8-TK-7.5K (Fig 24c) wurde mit SalI gespalten, mit Klenow behandelt und dann mit HindIII verdaut. In dieses Vektorfragment wurde das isolierte DraI-HindIII Malariaantigenleiterfragment kloniert. Dieses Konstrukt wurde verwendet, um ein Fusionsprotein zwischen dem P. falciparum 190 kd Protein und dem E. tenella Antigen, das durch den Antikörper 8A2 erkannt und durch das EcoRI Fragment kodiert wurde, zu exprimieren. Die vorhergesagte N-terminale Aminosäuresequenz für dieses Fusionsprotein ist in Fig. 25B gezeigt.
Das EcoRI Fragment, das das 28 kd Protein kodiert, wurde in die EcoRI Stelle des Polylinkers, der in dem Grundvektor enthalten ist (Fig. 24c), kloniert. Konstrukte, die das Fragment in der korrekten Orientierung enthalten, wurden propagiert und zur Rekombination in den Vacciniavirus verwendet.
Aufgrund der Art und Weise wie die Initiationsstelle für die Translation des Fragmentes in den Grundvektor (siehe oben) eingebaut wurde, wurden zwei verschiedene N-terminale Sequenzen für das zu exprimierende Gen durch den rekombinanten Vacciniavirus (Fig. 25) erwartet. Während nur 3 zusätzliche Aminosäuren (Met, Arg und Trp) zu der ursprünglichen Sequenz in dem ersten Konstrukt (Fig. 25A) zugefügt wurden, wurden in dem zweiten eine Gesamtheit von 47 Aminosäuren, abgeleitet von der Leitersequenz des 190 kd Malariaantigens, an den N- Terminus von dem Polypeptid fusioniert, das durch den monoklonalen Antiköper 8A2 (Fig. 25B) erkannt wird. Durch Prozessierung der möglichen Spaltstelle der Leitersequenz werden 19 der zusätzlichen Aminosäuren entfernt, was zu einem reifen Protein, das mit Val, Thr, His startet, führt.
Das EcoRI Fragment, das für das 20 kd Protein kodiert, das durch den monoklonalen Antikörper 6A5 erkannt wird, enthält die vollständige Sequenz. Dieses Fragment, ohne weitere Manipulation, wurde in die EcoRI Stelle des VV Vektors, wie oben beschrieben, kloniert.
Rekombination von obigen Genen, die für Kokzidialantigene kodieren, in einen WR Vacciniavirusstamm, wurde mittels eines Zweistufenverfahrens zur Selektion des rekombinanten Virus durchgeführt.
Im ersten Schritt wurden CV1 Affenzellen in Medium I [Eagle's Minimal Essential Medium (MEM), 5 % fötales Kälberserum (FCS; von Amimed), Penicillin/Streptomycin (100 Einheiten/ml und 100 ug/ml, respektive) und 2 mM Glutamin; alle Reagenzien von Gibco] in 8 cm² Kulturplatten bis 80-90 % zusammengewachsen waren, aufgewachsen. Das Medium wurde entfernt und durch 0.2 ml von einer Virussuspension ersetzt, die den temperatursensitiven Vacciniavirusstamm ts N7 [Drillen et al., Virology 131, 385 (1983)] in einer Konzentration von 0.1 plaqueformierenden Einheiten (pfu)/Zelle enthielt. Die Platten wurden bei Raumtemperatur 1 Stunde gelassen, wonach 2 ml von Medium I jeder Platte zugegeben wurden und die Platten 2 Stunden bei 33ºC in einem CO&sub2; Inkubator (die Wachstumspermissivtemperatur für diesen Virus) [Kieny et al., Nature 312, 163 (1984)] inkubiert wurden.
Eine halbe Stunde vor dem Ende der obigen Inkubationsperiode wurde ein DNS-enthaltendes Kalziumphosphatpräzipitat hergestellt. Dieses enthielt HeBs Puffer [280 mM NaCl, 1.5 mM Natriumhydrogenphosphat, 50 mM HEPES], 200 ng gereinigte Vacciniastamm WR Virus DNS und 200 ng gereinigtes kokzidial Antigengen, enthaltend Plasmid DNS, in einem Gesamtvolumen von 0.55 ml. Jede DNS wurde in 1 ul TE-Puffer (10 mM Tris- HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA) zugegeben. Zu dieser Lösung wurden tropfenweise und unter leichtem Schütteln 0.55 ml einer 250 mM Kalziumchloridlösung zugegeben. Diese Mischung wurde bei Raumtemperatur 20 Minuten stehen gelassen.
Nach der 2 stündigen Inkubation wurde das Medium von den Kulturplatten abgesaugt und durch 0.25 ml von dem obigen DNS- enthaltenden Kalziumpräzipitat ersetzt und bei Raumtemperatur für eine Stunde stehengelassen. Anschliessend wurden 2 ml Medium I zu jeder Platte zugegeben und die Platten wurden 2 Stunden bei 39.5ºC in einem 5 % CO&sub2; Inkubator inkubiert (Kieny et al., s.o.). Bei dieser Temperatur kann der ts N7 Virus nicht replizieren, was zu einer Auswahl derjenigen Viren führt, die wenigstens im ts7 Locus rekombiniert sind. Da das Kalziumphosphat möglicherweise für das Zellwachstum inhibitorisch ist, wurde das Medium nach der obigen zweistündigen Inkubation entfernt und die Zellen wurden 3 mal mit 1 ml PBS unter leichtem Schütteln gewaschen. Die endgültige PBS Lösung wurde abgesaugt und 2 ml Medium I wurden zu jeder Platte gegeben. Inkubation bei 39,5ºC in einem CO&sub2; Inkubator wurde für 2 Tage fortgesetzt.
Nach der zweitägigen Inkubation wurden die Kulturplatten mit dem Medium und den Zellen für eine kurze Zeit bei 30ºC gehalten und dann aufgetaut, die noch anhaftenden Zellen wurden vom Boden der Platte abgekrazt und die Suspension wurde, wie oben beschrieben, beschallt. Dieses Homogenat wurde für den zweiten Selektionsschritt verwendet.
In diesem Schritt wurde Medium von einem fast zusammengewachsenem Rasen von human 143B TK Zellen (ATCC CRL 8303), die in 8 cm² Kulturplatten wuchsen, entfernt und durch 0.2 ml von nichtverdünntem Homogenat oder Homogenat verdünnt 1:5 oder 1:30 (Vol/Vol) mit PBS ersetzt. Infektion der TK Zellen konnte für eine Stunde bei Raumtemperatur erfolgen.
Nach der Inkubation wurden 2 ml von semifestem Medium II (Medium I mit nichtessentiellen Aminosäuren (GIB CO; Bestellnr. 043- 1140), essentielle Vitamine (GIBCO; Bestellnr. 042-1120) und 1 % Agarose, enthaltend 0.1 mg/ml Bromdeoxyuridin (BUdR, Sigman Chemical Co.), den Zellen zugegeben. Die Platten wurden dann 16-24 Stunden bei 37ºC in einen CO&sub2; Inkubator inkubiert. Eine zweite Schicht von semifestem Medium II, enthaltend 0.2 % Neutralrot zusätzlich zu den obigen Koponenten, wurde über die Zellen gegeben und die Platten wurden weitere 16-24 Stunden inkubiert. Farblose Plaques erschienen, die klar sichtbar waren, und der Virus wurde als individuelle Klone durch Stechen der Plaqueregion mit einer Pasteur Pipette (Plaquereinigung) wiedergewonnen. Der in dieser Weise wiedergewonne Virus wurde auf CV1 Zellen gewachsen, wie oben beschrieben, und einer zweiten und dritten Runde von Plaquereinigung auf 143B TK- Zellen ausgesetzt. Diese plaquegereinigten Viren wurden, wie oben beschrieben, aufgewachsen und gereinigt.
Um die Expression des Kokzidialantigens durch den rekombinanten Virus zu testen, wurden CV1 Zellen mit rekombinantem Virus infiziert, in einer Tischzentrifuge sedimentiert (Hettich Mikrorapid K, 100 % für 3 Minuten bei 20ºC) und das Pellet wurde 2 mal mit PBS gewaschen, wieder zentrifugiert und resuspendiert in PBS. Die Zellsuspension wurde auf einem Glasmikroscopobjektträger aufgegeben (Flow) und trocknen gelassen. Eine zweite Methode bestand darin, dass CV1 Zellen direkt auf Mikroskopobjektträgern (Miles Lab-Teck 4808) aufgewachsen wurden, die Zellen mit Virus infiziert und für 1 bis 2 Tage inkubiert wurden. Die Zellen wurden dann mit PBS frei von Wachstumsmedium gewaschen und auf den Objektträgern bei Raumtemperatur trocknen gelassen. Um die Zellen zu fixieren, wurden die Objektträgr in Aceton für wenigstens eine Stunde bei -30ºC gebettet und bei Raumtemperatur trocknen gelassen.
Mausantikokzidialantigen-monoklonaler Antikörper, in PBS verdünnt, wurden auf Mikroskopobjektträger aufgelagert, so dass die Zellen gleichmässig von der Flüssigkeit bedeckt waren. Die Objektträger wurden in eine Humidkammer bei 37ºC eine Stunde lang gegeben und anschliessend mehrere Male mit PBS gewaschen. Ohne dass man die Objektträger trocknen liess, wurde ein zweiter Antikörper (FITC markierter Ziegenantimaus IgG, Nordic) auch in PBS verdünnt, auf die Objektträger gegeben und die Objektträger wurden in eine Humidkammer bei 37ºC eine Stunde gegeben, so dass die Antikörper reagieren konnten. Nach mehrmaligem Waschen mit PBS wurden die Objektträger vollständig trocknen gelassen. Einige wenige Tropfen von 20 % (vol/Vol) Glyzerin in Wasser wurden auf die Objektträger pipetiert und ein Deckgläschen (Menzel 24x60) wurde darauf gegeben. Die Fluoressenz der Zellpräparation wurde dann unter UV Licht in einem Mikroskop verfolgt (Zeiss ICM 405, F10 oder Planapo 63 Objektive).
Der WR Stammvirus kann sich in fast allen Zelltypen multiplizieren [Drillen et al., J. Virology 28, 843 (1978)] und seine Multiplikation kann direkt durch die Bildung von Plaques verfolgt werden. In fast allen Fällen jedoch wurden Embryofibroblastenzellen (CEF) verwendet, um grosse Vorräte an Virus herzustellen.
Um CEF Zellen zu erhalten, wurden 11 Tage alte Embryonen von Eiern isoliert, von ihren Extremitäten befreit, in kleine Stücke geschnitten und in einer 0.25 % Trypsinlösung (Difco) bei Raumtemperatur 2 Stunden resuspendiert. Diese Suspension wurde mit einem Volumen Medium 1 verdünnt und durch ein Zellsieb (Bellco, 150 Maschen) filtriert und die Zellen wurden sedimentiert (Hermie Tischzentrifuge, 5 Minuten, 2'000 rpm, Raumtemperatur). Der Zellniederschlag wurde in ein 1/4 des ursprünglichen Volumen von Medium I resuspendiert und diese CEF Zellsuspension in die Zellkulturplatten inokuliert. Abhängig von der Ausganszelldichte konnten die Kulturen 1-2 Tage wachsen und wurden direkt oder nach 1-2 weiteren Passagen zur Infektion verwendet. Eine Synopsis für die Herstellung von solchen Primärkulturen kann man bei Frehney, Culture of Animal Cells, Man R. Liss Verlag, New York 1983, Kapital 11, S.99 finden.
Zur Infektion wurde das Medium von 80-90% zusammengewachsenen CEF Zellen, die in 175 cm Kulturflaschen wuchsen (Falcon 3028), entfernt und die Zellen in einer PBS Lösung, die den Virus (0.1 pfu/Zelle; 0.01 ml/cm²) enthält, eine Stunde bei Raumtemperatur (20ºC) inkubiert (PBS/Dulbecco, Amimed). Medium I wurde dann zugegeben (0.2 ml/cm²) und die Flaschen wurden bei 37ºC 2-3 Tage inkubiert bis etwa 80 % der Zellen lysiert waren. Die so entsandene Vorratslösung wurde direkt mit Zellen und Medium in den Originalkulturflaschen bei -30ºC vor Virusreinigung gelagert.
Die folgenden Reinigungsschritte wurden verwendet, um eine Viruspräparation frei von allen wirtszellspezifischen Komponenten zu erhalten. Infizierte Zellkulturen, die bei -30ºC gelagert worden waren, wurden aufgetaut und die verbliebenen Zellen wurden von der Oberfläche von der Flasche durch Schützen und Kratzen entfernt. Die Zellen und Viren wurden aus dem Medium zentrifugiert (Sorvall Zentrifuge, GSA Rotor, 1 Stunde bei 5'000 rpm, 10ºC). Das Pellet der Zellen und Viruspartikel wurde in PBS (10-20 x das Volumen des Pellets) resuspendiert und wie oben nochmals zentrifugiert. Dieses Pellet wurde dann in einem 10 fachen Volumen von RSB Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM KCl, 1 mM MgCl&sub2;) resuspendiert.
Um die verbliebenen intakten Zellen zu lysieren und den Virus von der Zellmembrane zu befreien, wurde die obige Suspension der Beschallung ausgesetzt (zweimal, 10 Sekunden bei 60 Watt, Raumtemperatur, Labsonic 1510 mit 4 mm Probe). Die Mischung wurde dann in einem Sorval GSA Rotor 3 Minuten bei 3'000 rpm, 10ºC zentrifugiert. Eine Virussuspension frei von Zellkernen und grossen Zellbruchstücken wurde so hergestellt. Der Überstand wurde sorgfältig entfernt und das Pellet wurde in RSB Puffer resuspendiert, wieder beschallt und wie oben zentrifugiert.
Der zweite Überstand wurde mit dem ersten verbunden auf 10 ml 35 % Sukrosekissen gelagert (Fluka, in 10 mM Tirs-HCl, pH 8.0) und 90 Minuten bei 14'000 rpm in einem Kontron TST 28.38/17 Rotor (Beckman SW 27 Analog) bei 10ºC zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und das Pellet von Viruspartikeln wurde in 10 ml 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, resuspendiert, beschallt, um die Mischung zu homogenisieren (2 mal für 10 Sekunden bei Raumtemperatur, wie oben beschrieben), und zur weiteren Reinigung auf einen Stufengradienten gegeben.
Der Stufengradient bestand aus 5 ml Teilen von Sukrose in 10 mM Tris- HCl, pH 8.0, der folgenden Konzentrationen: 20 %, 25 %, 30 %, 35 % und 40 %. Dieser Gradient wurde in einem Kontron TST 28.38/17 Rotor 35 Minuten bei 14'000 rpm, 10ºC zentrifügiert. Verschiedene Banden, die Viruspartikel enthielten, waren in der 30 % - 40 % Sucroseregion sichtbar. Diese Region des Gradienten wurde entfernt (10 ml), die Sucroselösung wurde mit PBS verdünnt (20 ml) und die Viruspartikel wurden sedimentieft (Kontronrotor, 90 Minuten bei 14'000 rpm, 10ºC). Das Pellet enthielt fast ausschliesslich Viruspartikel (beurteilt durch Vergleich der OD Bestimmung und Plaqueassay, siehe unten). Dieses Pellet wurde resuspendiert in PBS, so dass die Viruskonzentration im Durchschnitt 1-5 x 10&sup9; pfu/ml betrug. Der Virusvorrat wurde entweder direkt oder verdünnt mit PBS verwendet.
Um die Viruskonzentration und die Reinheit des Virusvorrats zu bestimmen, wurden 2 Methoden verwendet. Die absolute Konzentration der Viruspartikel wurde bequemerweise durch Messung der optischen Dichte (OD) der Vorratslösung in einem Spektrophotometer (Uvikon 860) bei 260 nm (OD/260) erhalten, wobei 1 OD/260 etwa 1.2 x 10¹&sup0; Partikeln pro ml entspricht [Joklik, Virology 18, 9 (1962)]. Viruskonzentration wurde auch durch Titrieren des Virus auf Zellen (Plaqueassay) erhalten unter der Annahme, dass nur einer von 60 Viruspartikeln eine Zelle infizieren kann.
Um die Viruskonzentration auf kultivierten Zellen zu titrieren, wurden CEF Zellen in Medium I auf 8 cm² Plastikkulturschalen (Falcon 3001) aufgewachsen.Wenn die Zellen 80-90 % zusammengewachsen waren, wurde das Medium entfernt, mit 0.2 ml verdünnte Viruslösung in PBS ersetzt und eine Stunde bei Raumtemperatur gelassen. Die Virusvorratslösung wurde in 10 fachen Schritten verdünnt. Nach der Raumtemperaturinkubation wurden 2 ml von semifestem Medium I (Medium I + 1 % Agarose) zu jeder Platte gegeben und die Platten wurden 16-24 Stunden in einem CO&sub2; Inkubator plaziert. Anschliessend wurden 2 ml semifestes Medium I, enthaltend 0.2 % Neuralrot (Fluka 72210) überlagert, um die lebenden Zellen anzufärben und die Platten wurden weitere 16-24 Stunden inkubiert. Die farblosen Plaques wurden dann unter dem Mikroskop gezählt.

7.2.2. HÜHNERIMMUNISIERUNG

Um zu bestimmen, ob die Vacciniaviralvektoren die Gene beinhalten, die für das E. tenella Protein kodieren, das spezifisch die monoklonalen Antikörper 8A2 und 6A5 bindet, und Hühner gegen die Provokation durch sporulierende Oozysten von einem pathogenen Stamm von E. tenella (Stamm T2-750/7, T7-776/1 oder T6-771) schützen kann, wurden die folgenden Tests durchgeführt.
Alle Tests wurden unter Verwändung von Hähnchen von einer Legehennenbrut (Warren), die von der Brutanstalt E. Wuthrich, Belp, Schweiz, geliefert wurden, durchgeführt. Ein Tag alte Hühner wurden in geheitzten Batteriebrütern aufgezogen bis zu den angegebenen Altern, wonach sie in verschiedene Testgruppe aufgeteilt wurden und in kokzidiosefreien Drahtbodenkäfigen gehalten wurden. Während der Tests wurde eine kommerziell erhältliche Hüneraufzuchtdiät, basierend auf Mais, Weizen und Sojabohnenmehl (Rohprotein 21.7 %), gefüttert.
Im ersten Test wurden am Tag 42 Hühner von gleichem Gewicht willkürlich in 3 Gruppen von jeweils 6 Vögeln aufgeteilt. Drei Tage später wurden die Hühner entweder mit rekombinantem oder Wildtypvacciniavirus durch 2 Injektionen von 50 ul von der entsprechenden Virussuspension (10¹&sup0;) pfu/ml in PBS) subcutan in das rechte Flügelgewebe gegeben, immunisiert. Zwei rekombinante Vacciniaviren wurden verwendet, von denen beide DNS enthielten, kodierend für das E. tenella Protein, das spezifisch den Antikörper 8A2 bindet. Eines von den Viren (bezeichnet 37K M3) enthielt die Leitersequenz des 190 kd Malariaantigens; das andere Virus (bezeichnet 37K K3) enthielt nicht diese Leitersequenz. Der Wildtypvacciniastamm WR diente als negative Kontrolle.
Eine Woche nach der ersten Injektion wurde eine Boosterinjektion in das linke Flügelgewebe der Hühner unter identischen Bedingungen gemacht, unter Verwendung desselben Typs von Vacciniavirus, der ursprünglich verwendet wurde. Eine Woche nach dem Boost (Tag 59) wurden Blutproben von jeweils 2 ml von allen Hühnern genommen und das Serum wurde auf die Gegenwart von spezifischen Antikörpern durch ELISA getestet. Kurz, der Boden von Mikrotiterplatten (NUNC Immunoplatte F96) wurde mit einer Suspension von Sporozoiten von E. tenella (10'000 Zellen/ml) beschichtet und mit dem Hühnerserum bei zunehmenden Verdünnungsraten inkubiert. Als Nachweisagenz wurden Ziegenantihühnerimmunoglobuline, konjugiert an Meerettichperoxydase (Kirkegaard und Perry Laboratory, Gaithersburg, U.S.A.), zusammen mit Tetramethylbenzidin als Substrat verwendet. Die sich entwickelnde blaue Farbe wurde in einen Titertek Multiskan MCC/340 MkII bei einer Wellenlänge von 450 nm gelesen. Der Titer wurde als der reziproke Wert der Serumverdünnung, die eine optische Dichte von wenigstens dem doppelten Hintergrundwert ergab (Tabelle 7), definiert.
Vier Wochen nach der ersten Injektion (Tag 73) wurden die Hühner mit 50'000 sporulierten Oozysten provoziert. Das Inoculum der Kokzidiale, das in 1 ml physiologischer Kochsalzlösung suspendiert wurde, wurde oral in den Kropf der Hühner mittels einer stumpfen Nadel auf einer kalibrierten Spritze gegeben. Am Tag 80 wurden alle Hühner getötet, nekropsiert und bezüglich grosser krankhafter Veränderung in der Ceca kassifiziert (Klassifizierung 0 = normal, 1 = leichte Heimsuchung, 2 = mittlere Heimsuchung, 3 = schwere Heimsuchung, 4 = Huhn starb an Kokzidiose). Exkremente wurden quantitativ über die letzten zwei Tage des Infektionszyklus gesammelt und die Anzahl von ausgeschiedenen Oozysten wurde in einer repräsentativen Probe von Feces bestimmt. Diese Resultate sind in Tabelle 7 gezeigt. TABELLE 7 VAKZINIERUNG VON 45 TAGE ALTEN HÜHNERN MIT VACCINIAVIREN, DIE DAS 28 KD PROTEIN EXPREMIEREN Virusa Anzahl von Hühnern Antikörpertiter Cecale krankhafte Veränderung Klassifikation Tägliche Ausscheidung von Oozyten/Huhn (x10&supmin;&sup6;) Wildtyp
a- Viurs 37 M3 enthielt die Leitersequenz des 190 kd Malariaantigens; Virus 37 K3 erhielt diese nicht. Der Wildtypvirus war Vacciniastamm WR.
b- Zwei Hühner wurden vor der Kokzidioseprovokation getötet.
Tabelle 7 zeigt, dass im Vergleich zum Wildtypkontrollvirus beide Viren die DNS, kodierend für das 28 kd Protein, enthielten, die Produktion von Antikörpern spezifisch für den Parasiten induzierten und etwas Schutz gegen Oozystenprovokation übertrugen sowohl in Bezug auf Reduzierung von cecalen krankhaften Veränderungen und reduzierter Oozystenausscheidung. Bezüglich des Schutzes gegen Kokzidiose waren die zwei Viren gleichermassen wirksam, jedoch die Konstruktion mit dem Malarialeiter (37 M3) generierte einen grösseren Antikörpertiter gegen das Sporozoitenantigen als das Standardviruskonstrukt (37 K3) in dem Huhn, das auf einen Vorteil für das Fusionskonstrukt hinweist.
Im zweiten Test wurden Hähnchen aufgezogen und, wie oben beschrieben immunisiert, aber beginnend am Tag 22. Eine virale Dosis von 2 x 10&sup8; pfu in 100 ml PBS wurde zu dieser Zeit gegeben. Die verwendeten Viren waren von verschiedenen Präparationen von Vacciniavirus, das DNS enthält, die für das 28 kd Protein kodiert ohne (bezeichnet 37 K5) oder mit (bezeichnet 37 M19) der Malarialeitersequenz. Derselbe Wildtypstamm WR Virus wurde als Kontrolle verwendet. Boosterinjektionen in dem rechten Geflügelgewebe mit der gleichen Dosis wurden entweder eine oder zwei Wochen nach der ersten Injektion gegeben.
Am Tag 57 (5 Wochen nach der ersten Injektion) wurden alle Hühner mit 50'000 sporulierten Oozysten provoziert. Eine Woche später wurden die Hühner getötet, nekropsiert und klassifiziert, wie oben beschrieben. Der tägliche Gewichtsgewinn nach Infektion und Ausscheidung der Oozysten während der letzten zwei Tagen wurde auch bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt. TABELLE 8 VAKZINATION VON 22 TAGE ALTEN HÜHNERN MIT VACCINIAVIREN, DIE DAS 28 KD PROTEIN EXPRIMIEREN Virusa Zeit für Booster (Wochen) Anzahl von Hühnern Täglicher Gewichtsgewinn (g) Cecale krankhafte Veränderungb Klassifikation Tägliche Ausscheidung von Oozysten/Hühnchen (x10&sup6;) Wiltdtyp
a- Virus 37 M19 enthielt die Leitersequenz des 190 kd Malariaantigens. Virus 37 K5 enthielt dies nicht. Der Wildtypvirus war Vacciniastamm WR.
Tabelle 8 zeigt, dass verglichen zu dem Wildtypkontrollvirus beide Viren, die die kokzidial DNS enthalten, etwas Schutz gegen die pathogene Oozystenprovokation übertrugen und zwar bezüglich Gewichtsgewinn, cecaler krankhafter Veränderung und Oozystenausscheidung. Beide Viren waren etwa gleich effektiv. Die Gabe der Booster 1 Woche nach der ersten Injektion produzierte etwas besseren Gewichtsgewinn und weniger Oozystenausscheidung, aber die cecale krankhafte Veränderung war etwa dieselbe für beide Boosterschemata.
In dem dritten Test wurde der Effekt von drei Vakzinationen untersucht. Hühner wurden bei 21 Tagen Alter injiziert (rechtes Flügelgewebe) etwa 50 ul (3 x 10&sup9; pfu/ml) einer Suspension von einem Wildtypvacciniavirus oder Virus, enthaltend DNS, kodierend für das 20 kd Protein, das spezifisch an den monoklonalen Antikörper 6A5 bindet, injiziert. Allen Hühnern wurde dieselbe Dosierungsboosterinjektion bei Tag 28 in das linke Flügelgewebe gegeben. Einigen Hühner wurden zusätzliche Boosterinjektionen derselben Dosierung am Tag 35 in das Flügelgewebe von beiden Seiten gegeben. Andere Hühner wurden ohne Vakzinationen als weitere Kontrollen gehalten.
Am Tag 42 wurden Blutproben von allen Hühnern genommen und durch ELISA auf die Anwesenheit von spezifischen Antikörpern gegen das Sporzoitenstadium des Parasiten, wie ursprünglich beschrieben, getestet. Am Tag 49 (4 Wochen nach den ersten Injektionen) wurden alle Hühner mit 50'000 sporulierenden Oozysten provoziert. Eine Woche später wurden die Hühner getötet, nekropsiert und, wie oben beschrieben, bezüglich signifikanter cecaler krankhafter Veränderungen klassifiziert. Körpergewicht wurde wöchentlich zur Kalkulation des täglichen Gewichtsgewinns aufgenommen und die Ausscheidungen wurden über die letzten zwei Tage des Infektionszyklus gesammelt, um die Oozystenexkretion zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 gezeigt. TABELLE 9 VAKZINIERUNG VON 21 TAGEN ALTEN HÜHNERN MIT VACCINIAVIRUS, DER DAS 20 KD PROTEIN EXPRIMIERT Nr. von Injektionen Anzahl von Hühnern Antikörpertiter Täglicher Gewichtsgewinn (g) Cecale krankhafte Veränderung Klassifikation Oozystenausscheidung/g Feces (x10&supmin;&sup6;) rVV Mit kokzidial DNS W T Wildtyp N Keine
Die Werte der Tabelle 9 zeigen, dass, wenn dreimal injiziert, der Virus, der das Kokzidialantigen produziert, einen hohen Titer eines Antikörpers spezifisch gegen die Sporozoitenproteine erzeugt. Ausserdem gaben beide Behandlungen mit diesem Typ von rekombinantemVirus etwas Schutz gegen Oozysteninfektion bezüglich vergrössertem Körpergewicht, reduzierter cecaler krankhafter Veränderung, reduzierter Ausscheidung von Oozysten. Vergleich der Resultate erhalten mit nichtvakzinierten Kontrollen zeigte, dass die Vakzinierung mit dem Wildtypvacciniavirus keinen Schutz gab. Deshalb war der, der durch den Virus, der die kokzidial DNS enthält, übertragene Schutz spezifisch und beruhte nicht auf einer allgemeinen Immunstimmulation, verursacht durch die Exposition gegenüber dem Vacciniavirus selbst. Drei Vakzinationen waren effektiver als zwei.
Viele Modifikationen und Variationen von dieser Erfindung können, ohne von ihrem Geist und Umfang abzuweichen, gemacht werden, wie es für den Fachmann offensichtlich wird. Die spezifischen Verkörperungen, die hierin beschrieben sind, sind nur beispielhaft offenbart und die Erfindung wird nur durch die Ausdrücke der angeschlossenen Ansprüche begrenzt.

Claims

1. Ein Protein mit einer oder mehreren immunreaktiven und/oder antigenischen Determinanten eines Eimeriaoberflächenantigens, wobei das Oberflächenantigen eine der in den Figuren 17, 19 oder 21 gezeigten Aminosäuresequenzen hat oder ein funktionelles Äquivalent davon ist und spezifisch einen oder mehrere der bei der American Type Culture Collection hinterlegten monoklonale(n) Antikörper mit den zugeteilten Zugangsnummern HB9707 bis HB9710 und HB9712 bindet.

2. Eine DNS-Sequenz, die für ein Protein gemäss Anspruch 1 kodiert.

3. Die DNS-Sequenz von Anspruch 2, die die gesamte oder Teile der in Figur 16 gezeigten Nukleotidsequenz umfasst.

4. Die DNS-Sequenz von Anspruch 2, die die gesamte oder Teile der in Figur 18 gezeigten Nukleotidsequenz umfasst.

5. Die DNS-Sequenz von Anspruch 2, die die gesamte oder Teile der in Figur 20 gezeigten Nukleotidsequenz umfasst.

6. Ein rekombinanter Vektor, der eine DNS-Sequenz gemäss irgendeinem der Ansprüche 2 bis 5 umfasst.

7. Ein rekombinanter Vektor gemäss Anspruch 6, der ein Expressionsvektor ist.

8. Der rekombinante Vektor der Ansprüche 6 und 7, der ein Poxvirusvektor ist.

9. Der rekombinante Vektor der Ansprüche 6 oder 7, der ein E. coli Vektor ist.

10. Ein mit einem Vektor gemäss irgendeinem der Ansprüche 6 bis 9 transformierter Wirtsorganismus.

11. Ein Antikörper, der gegen ein wie in Anspruch 1 beanspruchtes Protein gerichtet ist.

12. Ein Antikörper gemäss Anspruch 11, der ein monoklonaler Antikörper ist.

13. Ein monoklonaler Antikörper gemäss Anspruch 12 ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den ATCC-Nrn. HB9707, HB9708, HB9709, HB9710 und HB9712.

14. Ein Protein gemäss Anspruch 1 zur Immunisierung von Geflügel gegen Kokzidiose.

15. Ein Verfahren zur Herstellung des Proteins von Anspruch 1, wobei das Verfahren:

(a) die Kultivierung eines mit einem rekombinanten Vektor, der eine für besagtes Protein kodierende DNS-Sequenz umfasst, transformierten Wirtsorganismus unter Bedingungen, unter denen die DNS-Sequenz exprimiert wird; und

(b) die Isolierung des Proteins aus der Kultur umfasst.

16. Ein Verfahren zur Herstellung eines transformierten Wirtsorganismus gemäss Anspruch 10, welcher die Transformation eines Wirtsorganismus mit einem rekombinanten Vektor gemäss irgendeinem der Ansprüche 6 bis 9 mittels an sich bekannter Methoden umfasst.

17. Ein Vakzin zum Schützen von Geflügel gegen Kokzidiose, das eines oder mehrere wie in Anspruch 1 definierte Proteine und einen physiologisch verträglichen Träger umfasst.

18. Ein Vakzin zum Schützen von Geflügel gegen Kokzidose, das einen rekombinanten Poxvirusvektor gemäss Anspruch 8 umfasst.