KR0156545B1 - 재조합 포자충증 백신 - Google Patents

재조합 포자충증 백신 Download PDF

Info

Publication number
KR0156545B1
KR0156545B1 KR1019890007661A KR890007661A KR0156545B1 KR 0156545 B1 KR0156545 B1 KR 0156545B1 KR 1019890007661 A KR1019890007661 A KR 1019890007661A KR 890007661 A KR890007661 A KR 890007661A KR 0156545 B1 KR0156545 B1 KR 0156545B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
protein
spore
cells
dna
antibodies
Prior art date
Application number
KR1019890007661A
Other languages
English (en)
Other versions
KR910000183A (ko
Inventor
알텐부르거 베르너
빙거 매리-헬렌
안토니 치조니트 리차드
앨렌 크레이머 리차드
토마스 로메디코 피터
제이. 맥앤드류 스테펜
Original Assignee
쟝-작끄 오가이, 프리돌린 클라우스너
에프. 호프만-라 로슈 앤드 캄파니 아크티엔게젤샤프트
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 쟝-작끄 오가이, 프리돌린 클라우스너, 에프. 호프만-라 로슈 앤드 캄파니 아크티엔게젤샤프트 filed Critical 쟝-작끄 오가이, 프리돌린 클라우스너
Publication of KR910000183A publication Critical patent/KR910000183A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR0156545B1 publication Critical patent/KR0156545B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
    • C07K14/455—Eimeria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/20—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans from protozoa
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

내용 없음

Description

재조합 포자충증 백신
제1도는 에이메리아 테넬라(Eimeria tenella) 포자소체를(sporozoite) ELISA 분석한 결과를 도시한 것이다.
제2도는 이.테넬라 포자소체로부터 용해시킨 단백질로 수행한 웨스턴 블롯 분석 결과를 도시한 것이다.
제3도는 이.테넬라의 포자소체 및 난충(merozoite), 및 이. 아세르불리나(E. acervulina)의 포자소체로부터 용해시킨 단백질로 수행한 웨스턴 블롯 분석 결과를 도시한 것이다.
제4도는 이.테넬라 포자소체의125I-표지된 표면 단백질로 면역 침전 분석한 결과 및 생(生) 포자소체로 면역시킨 마우스로부터의 혈장으로125I-표지된 포자소체 표면 단백질을 면역 침전 분석한 결과이다.
제5도는 모노클로날 항체에 의한125I-포자소체 표면 단백질의 면역 침전 결과를 도시한 것이다.
제6도는 공기-건조시킨 이.테넬라 포자소체 슬라이드 제제의 위상차 현미경 사진 및 다양한 모노클로날 항체를 사용한 면역형광 염색 패턴 현미경 사진이다.
제7도는 닭(chicken)의 신장 세포에서 세포내 포자소체 및 발생 기생충을 항체 7D4, 8A2, 7B2 및 15A3 염색한 위상차 현미경 사진 및 면역 형광 현미경 사진이다.
제8도는 닭의 신장세포에서 세포내 포자소체 및 발생 기생충을 모노클로날 항체 14B1 및 19D6, 면역 병아리 혈청 및 형광성 제2항체로 항체 염색한 위상차 현미경 사진 및 면역형광 현미경 사진이다.
제9도는 항-포자층 항체에 의한 세포내 포자소체 발생의 중화를 도시한 것이다.
제10도는 65kd β-갈락토시다제 융합 단백질 샘플 또는 다른 샘플의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동/웨스턴 블롯 분석 결과를 도시한 것이다.
제11도는 파아지 λm 2-4로부터의 1.7kd EcoRI DNA 삽입체를 함유하는 65kd 단백질 발현 플라즈미드인 pEV/2-4를 도시한 것이다.
제12도는 pEV-vrf3의 EcoRI 및 SalI 부위사이에 삽입된 지시 부위와 폴리링커를 함유하는 pEV3-SEQ의 지도이다.
제13도는 모노클로날 항체 6A5에 의해 인식되는 단백질을 암호화하는 cDNA 클론의 제한지도이다.
제14도는 모노클로날 항체 6A5에 의해 인식되는 20kd 단백질을 암호화하는 1.1kb cDNA 분자의 뉴클레오타이드 서열이다.
제15도는 제14도의 뉴클레오타이드 서열로부터 추정되는 단백질의 아미노산 서열이다.
제16도는 모노클로날 항체 7D1, 7D4 및 20C6에 의해 인식되는 65kd 단백질을 암호화하는 1.7kb cDNA 분자의 뉴클레오타이드 서열이다.
제17도는 제16도의 뉴클레오타이드 서열로부터 추정되고, 발현된 65kd 단백질로부터 생성된 트립신 분해 펩타이드의 서열 분석에 의해 확인된 단백질의 아미노산 서열이다.
제18도는 모노클로날 항체 8A2에 의해 인식되는 28kd 단백질을 암호화하는 1.1kb cDNA 분자의 뉴클레오타이드 서열이다.
제19도는 제18도의 뉴클레오타이드 서열로부터 추정된 단백질의 아미노산 서열이다.
제20도는 모노클로날 항체 7B2에 의해 인식되는 단백질을 암호화하는 3.2kb cDNA 분자의 뉴클레오타이드 서열이다.
제21도는 제20도의 뉴클레오타이드 서열로부터 추정된 단백질의 아미노산 서열이다.
제22도는 면역친화성-정제된 65kd 단백질의 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 분석을 나타낸 것이다.
제23도는 컬럼 체류 시간의 함수로써 215mμ에서의 흡광도를 나타내는, 65kd 단백질의 β-머캅토에탄올 환원된 (A) 및 비환원된 (B) 트립신 분해물의 HPLC 용출 프로필이다.
제24도는 포자충증(coccidial) 항원을 암호화하는 유전자를 백시니아 바이러스에 재조합시키는데 사용되는 기본 벡터의 4가지 인자의 제한 지도를 도시한 것이다.
제25도는 모노클로날 항체 8A2에 의해 인식되는 에이메리아 항원의 N-말단부의 아미노산 서열을 나타낸 것으로, (A)는 제24도의 벡터의 폴리링커 인자내에 AUG 해독 개시 코돈을 함유하는 작제물로부터 발현된 것이고 (B)는 말라리아원충의 190kd 리더 단편(처음 34개의 아미노산) 및 제24도의 클로닝 벡터의 폴리링커(다음 13개 아미노산)에 융합된 것이다.
포자충증은 에이메리아(Eimeria) 속의 세포내 원생동물 기생충에 의해 야기된 가금의 질병이다. 이 질병은 대규모로 밀집된 가금 사육장에서 풍토병적으로 유발되며 화학요법으로 질병의 억제에 드는 비용이 미합중국에서만 매년 1억 달러를 초과한다. 약의 개발이 점차적으로 비싸지고 식용 동물중에 잔여되는 약에 대한 수요자 허용이 감소하고 있는 때에 항-포자충증 약에 대한 내성의 진전은 계속적인 새로운 약제의 개발을 불가피하게 한다.
자연적인 포자충증 감염에 대한 보호 면역성은 이미 밝혀져 있다. 수주일 동안 소수의 생존 난모 세포를 매일 조절 투여한 결과 정상적인 발병 투여량의 챌린지(challenge) 감염에 대해 완전한 면역성을 나타냈다[참조; Rose et al., Parasitology 73:25(1976); Rose et al., Parasitology 88:199(1984)]. 감염에 대한 후천적 내성이 나타내는 것은, 어린 닭에서 면역성을 유도하여 화학적 포자충증상태에 필요한 치료를 우회시키는 백신 제조의 가능성을 제시한다. 사실상, 이러한 개념은 미합중국 알라바마 오펠리카 소재의 스터윈 래보러토리스(Sterwin Laboratories)의 코시백(Coccivac
Figure kpo00002
) 제제로 시험되었다.
포자충증 백신을 제조하기 위해, 머레이(Murray)등은 15개 이상의 폴리펩타이드를 함유하는 에이메리아 테넬라의 포자소체 또는 포자형성된 난모세포로부터 추출물을 제조하였고, 이중 많은 것이 포자소체의 표면과 관련되어 있다[ckaqg; 유럽 특허원 공개공보 제167,443호]. 발병성 이.테넬라 포자형성된 난모세포로 경구접종한후 이러한 추출물을 닭에 주사한 결과 맹장의 병변을 감소시켰다. 최근에, 쉔켈(Schenkel) 등의 미합중국 특허 제4,650,676호에는 이.테넬라 난충에 대한 모노클로날 항체의 제조방법이 기술되어 있다. 이 항체를 사용하여, 쉔켈 등은 항체에 관련되는 많은 항원을 확인하였다. 이들은 이러한 항체와 함께 이.테넬라 포자소체를 예비 배양하고 닭의 맹장에 처리된 포자소체를 도입시킴으로써, 비처리된 포자소체 대조군에 비해 맹장의 병변이 감소되는 것을 보여줄 수 있었다.
재조합 DNA 기술의 진전으로 또다른 시도, 즉 아단위 백신이 이용 가능하게 되었다. 최근 재조합 DNA 공정의 적용에서는, 특정 DNA 서열을 적당한 DNA 비히클 또는 벡터에 삽입시켜 숙주 세포에서 복제될 수 있는 재조합 DNA 분자를 형성한다. 플라즈미드라 불리는 환상의 이본쇄 DNA 분자가 흔히 벡터로서 사용되고 이러한 재조합 DNA 형태의 제제는 특정 염기 서열 부위에서 DNA를 절단할 수 있는 제한 엔도뉴클라아제 효소의 사용을 수반한다. 우선 플라즈미드 및 삽입될 외래 DNA의 단편을 제한 효소로 절단한 후, 두 DNA 분자를 리가제로 공지된 효소에 의해 공유 결합시킬 수 있다. 이러한 재조합 DNA 분자의 제조에 대한 일반적인 방법은 문헌에 설명되어 있다[참조; Cohen et al., 미합중국 특허 제4,237,224호; Collins et al., 미합중국 특허 제4,304,863호; Maniatis et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory]. 상기 문헌은 많은 기술을 설명하고 있으며, 본원에 참조 문헌으로 인용된다.
일단 제조된 재조합 DNA 분자는 많은 조건이 만족되는 경우에만 삽입된 유전자 서열에 의해 특정화된 생성물을 제조하는데 사용할 수 있다. 첫번째는 재조합 분자가 적합한 것이어서 숙주 세포에서 자동 복제가 가능해야 한다. 보다 최근의 연구는 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli)가 다양한 재조합 플라즈미드에 대해 적합성을 갖기 때문에, 이를 숙주 유기체로서 이용하고 있다. 사용된 벡터/숙주 세포계에 따라, 재조합 DNA 분자를 형질 전환, 형질 도입 또는 형질 감염에 의해 숙주에 도입시킨다.
숙주 세포내 재조합 플라즈미드 존재의 검출은 통상적으로 항생 물질 내성과 같은 플라즈미드 마커 활성을 이용하여 이루어질 수 있다. 따라서, 암피실린-분해 효소 생성물을 암호화하는 플라즈미드를 함유하는 숙주는 암피실린을 함유한 배지에 숙주를 배양시켜 변형되지 않은 세포로부터 선택할 수 있다. 플라즈미드가 선택된 제한 엔도뉴클레아제로 절단되고 외래 유전자 서열이 삽입되는 부위에 제2의 항생물질-분해 활성물을 암호화하는 경우, 항생물질 내성 마커를 이용하는 것이 더욱 유리할 수 있다. 이때 적당한 재조합 플라즈미드를 함유하는 숙주 세포는 제1항생물질에 대한 내성 및 제2항생물질에 대한 민감성에 의해 특징화될 것이다.
숙주 세포에 재조합 플라즈미드를 단순히 삽입시키고 변형된 숙주를 분리하는 것은 그 자체로는 상당량의 목적하는 유전자 생성물이 제조될 것이라고 확신할 수 없다. 이를 위해서는, 외래 유전자 서열을 프로모터(promoter)라 불리우는, DNA 전사를 위한 플라즈미드내 시그널 영역에 적당한 관계로 융합시켜야 한다. 달리는 외래 DNA가 숙주에 의해 인식되는 한 그 자신의 프로모터를 수반할 수 있다. 기원에 무관하게, 프로모터는 RNA 폴리머라제의 결합을 지시하고 DNA의 mRNA로의 전사를 촉진시키는 DNA 서열이다.
대량의 mRNA를 제공할 수 있도록 강력하게 촉진되는 경우, 목적하는 유전자 생성물의 궁극적인 생성은 mRNA로부터 단백질로의 해독 효율성에 따라 좌우될 것이다. 이것은 또한 mRNA에 대한 리보좀 결합 효율에 좌우된다. 이.콜라이에서, mRNA 상의 리보좀-결합부위는 개시 코돈(AUG) 및 상향 샤인-달가르노(Shine-Dalgarno:SD) 서열을 함유한다. 3 내지 9개 뉴클레오타이드를 함유하고 AUG 코돈으로부터 3 내지 11개 뉴클레오타이드가 위치하는 이 시열은 이.콜라이 16S 리보좀 RNA(rRNA)의 3' 말단에 상보적이다[참조; Shine and Dalgarno, Nature 254:34(1975)]. 뚜렷하게는, mRNA에 대한 리보좀의 결합은 mRNA내의 SD 서열과 16S rRNA 3' 말단 서열 사이의 염기 짝짓기에 의해 이행된다. 유전자 발현의 최대화에 대해서는 문헌을 참조한다[참조; Roberts and Lauer, Methods in Enzymology 68:473(1979)].
람다 파아지 벡터와 조합한 lacZ 오페론을 기본으로 하는 다른 발현 시스템이 개발되었다[참조; Huyhn et al., DNA Cloning:Vol. I, D.M. glover, Ed.]. 이 시스템에서는, 발현을 조절하는 유도성 프로모터와 함께 β-갈락토시다제에 대한 구조 유전자가 파아지 벡터내로 조작되었다. β-갈락토시다제에 대한 유전자의 3' 말단에 있는 독특한 클로닝 부위에 단백질-암호화 영역을 함유하는 게놈성 DNA 단편 또는 mRNA의 cDNA 복사물을 삽입하면 유전자 융합된다.
β-갈락토시다제 유전자가 발현되면 114kd의 β-갈락토시다제 및 cDNA 삽입물에 의해 암호화된 카복시 말단 폴리펩타이드를 함유하는 융합 단백질이 생성되며, 단 이때 삽입물은 β-갈락토시다제에 대한 리딩(reading) 프레임과 같은 레지스터로 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 함유해야한다. 유전자의 생성물이 모노클로날 또는 폴리클로날 항혈청에 의해 인식되는 유전자를 함유하는 파아지는, lacZ 리프레서(repressor)를 불활성화시키기 위해 β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 사용하여 융합 단백질의 발현을 유도시킨 후 라이브러리를 면역학적으로 선별하여 확인할 수 있다. 이 발현 벡터 시스템은, DNA를 패키지하여 이것을 이.콜라이 세포에 도입시키는데 있어서 파아지 시스템의 효율성과 β-갈락토시다제와 융합된 폴리펩타이드 융합물의 증가된 안정성을 합한 것이다.
아단위 백신의 시도에서는, 전체 감염성 유기체의 아단위를 면역학적으로 관련되는 숙주 동물에 투여한다. 아단위는 기생충으로부터 정제된 단백질, 이종 시스템에서 발현된 재조합 단백질 또는 단백질 단편, 단일 중화 결정소를 함유하는 합성 펩타이드 또는 백시니아와 같은 바이러스 벡터에 의해 도입된 단백질일 수 있다. 숙주 면역 시스템은 전체 기생충에 노출되지 않고도 아단위에 대한 특정 반응을 개시한다. 발병 용량의 감염성 유기체로 챌린지하는 경우, 숙주 면역 시스템은 단지 이미 노출되었었던 백식 아단위에 의해서만 지시된 성공적인 방어를 개시한다.
포자충증에 대한 후천적 내성에 있어서, 순환하는 항체, 장의 상피에 있는 분비성 IgA[참조; Davis et al., Immunology 34:879(1978)] 및 세포-중재된 면역 시스템[참조; Giambroni et al., Poultry Science 59:38(1980)]의 관련성에 대한 증거를 문헌에서 찾을 수 있다[참조; P.S. Davis, Avian Immunology, M.E. Rose, Ed., British Poultry Sceince, Ltd. Edenberg, pp. 361-385(1981)]. 다양한 면역 시스템의 가능한 관련성은, 완전하고 지속적인 보호에 천연적인 감염 과정의 특정한 양상을 모방하는 능력이 필요할 수 있음을 의미한다. 이러한 양상에는 보호가 요구되는 부위에의 국부적인 노출, 항원 프로세싱(processing) 세포를 집결시키기 위한 염증성 반응의 유도, 적합한 기생충 항원의 제시 및 가능하게는 특정한 막 구성에 있어서 MHC 결정소와의 결합이 포함된다.
본 발명은 에이메리아 표면 항원의 면역반응성 및/또는 항원성 결정소 하나 이상을 갖는 정제된 단백질 또는 이의 단편을 제공한다.
좀 더 특히는, 본 발명은 표면 항원의 겉보기 분자량이 약 28, 37, 120 또는 200킬로달톤 이상이고, 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션(ATCC)에 기탁 번호 제HB 9707호 내지 제HB 9712호로 기탁된 모노클로날 항체 하나 이상에 특이적으로 결합하는, 에이메리아 표면 항원의 면역 반응성 및/또는 항원성 결정소 하나 이상을 갖는 단백질을 제공한다. 상기 단백질에 대한 예는 제15, 17, 19 및 21도에서와 같은 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 이의 작용적 등가물이다. 상기 작용적 등가물은 첨가, 결실, 삽입 및 아미노산 치환에 의해 상기 언급된 아미노산 서열로 부터 유도된 아미노산 서열을 갖는 단백질이며, 이때 이러한 단백질은 에이메리아 표면 항원의 면역반응성 및/또는 항원성 결정소 하나 이상을 보유하여야 한다. 상기 단백질은 포자충증에 대한 가금의 면역화에 사용할 수 있다.
본 발명은 추가로 상기-언급된 단백질에 대해 지시된 항체, 특히 기탁 번호 제HB 9707호, 제HB 9708호, 제HB 9709호, 제HB 9710호, 제HB 9711호 및 제HB 9712호인 모노클로날 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 상기-언급한 단백질을 암호화하는 DNA 서열, 이러한 DNA 서열을 함유하는 재조합 벡터, 특히 적합한 숙주 유기체에서 상기 DNA 서열의 발현을 지시할 수 있는 재조합 벡터 및 이러한 벡터로 형질전환된 숙주 유기체, 특히 상기 재조합 벡터에 함유된 상기 언급한 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 발현시킬 수 있는 형질전환된 숙주 유기체를 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 재조합 벡터로 형질전환시킨 숙주 유기체를 DNA 서열이 발현되는 조건하에서 배양시키고; (b) 배양물로부터 단백질 또는 단편을 분리함을 특징으로 하여, 에이메리아 테넬라 표면 항원의 면역 반응성 및/또는 항원성 결정소를 하나 이상 갖는 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 공지된 방법을 사용하여, 본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 재조합 벡터로 숙주 유기체를 형질전환시킴을 특징으로 하는 상기-언급된 형질전환된 숙주 유기체의 제조방법도 제공한다.
또한, 본 발명은 하나 이상의 본 발명의 단백질 및 생리학적으로 허용되는 담체를 함유함을 특징으로 하는, 포자충증으로부터 가금을 보호하는 백신을 제공한다.
본 발명은 본 발명에 따른 단백질의 암호화 DNA 서열 또는 이의 단편을 함유하고 이의 DNA 서열 또는 단편을 발현할 수 있는 바이러스 벡터 및 생리학적으로 허용되는 담체를 함유함을 특징으로 하는, 포자충증에 대한 가금 보호용 백신을 또한 제공한다.
본 발명은 추가로 포자소체중에 민감한 어린 가금에 본 발명의 백신을 유효량으로 투여함을 특징으로 하는, 포자충증으로부터 가금을 보호하는 방법을 제공한다.
본 발명은 하기에 발명의 상세한 설명, 실시예 및 도면을 참고로 하여 좀 더 쉽게 이해될 수 있다.
제1도는 에이메리아 테넬라 포자소체를 ELISA 분석한 결과를 도시한 것이다. 면역마우스 혈청 희석액(MS 107-2; △) 및 대조용 마우스 혈청(X)를 4×104개의 정제된 생 포자소체와 함께 배양한다. 포자소체에 결합된 특이적 항체는 퍼옥시다제-결합된 항-마우스 IgG 항체 및 퍼옥시다제 기질 O-페닐렌 디아민으로 검정한다. OD492nm를 타이터텍 멀티스캔(Titert다 Multiscan
Figure kpo00003
) 플레이트 판독기로 판독한다.
제2도는 이.테넬라 포자소체로부터 용해시킨 단백질로 수행한 웨스턴 블롯 분석의 결과를 도시한 것이다. 용해된 포자소체 단백질을 12.5% 겔에서 SDS-폴리 아크릴아미드 겔 전기 영동을 환원시켜 분리하고 이것을 니트로셀루로즈 막에 옮긴 후 각 항체와 반응시킨다. 각 항체에 의해 인식되는 특이적 단백질은 퍼옥시다제-결합된 항-마우스 IgG 항체 및 퍼옥시다제 기질 4-클로로-1-나프톨로 가시화된다. 각 스트립(strip)과 반응된 항체는 스트립 상단에 나타내었다.
제3도는 이.테넬라의 포자소체 및 난충 및 이.아세르불리나의 포자소체로부터 용해시킨 단백질로 수행한 웨스턴 블롯 분석 결과를 도시한 것이다. 여러가지 모노클로날 항체 및 혈청을 에이메리아 단백질이 결합된 니트로셀룰로즈와 함께 항온처리하면 제2도의 설명에서와 같이 가시화된다. 사용된 모노클로날 항체는 3A5(1), 20C6(2), 7D1(3), 13A6(4), 6A5(5) 및 에이메리아 단백질과 비반응성인 대조용 항체를 포함한다. 사용된 혈청은 마우스 번호 107-2 면역 혈청(7) 및 대조용 혈청(8)을 포함한다.
제4도의 좌측 패널은 이.테넬라 포자소체의125I-표지된 표면 단백질로 면역 침전 분석한 결과이다. 포자소체 표면 단백질은 IODOGEN 또는 IODOBEADS 방법으로 표지하여 용해시키고 12.5% 겔에서 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동한 후 방사능 사진으로 가시화한다. 우측 패널은 생존 포자소체로 면역시킨 마우스로부터의 혈청으로125I-표지된 포자소체 표면 단백질을 면역 침전 분석한 결과이다. 면역 마우스 혈청(105-1, 105-2, 105-3, 107-1, 107-2 및 107-3) 및 대조용 마우스 혈청(대조용)을125I-포자소체 표면 단백질과 항온처리하고 면역 복합체를 아가로즈에 커플링된 항-마우스 항체에 의해 포착시킨다. 면역 복합체를 라엠리(Laemmli) 샘플 완충액에 용해시키고, 12.5% 겔에서 SDS-겔 전기영동으로 분리한 후 방사능 사진으로 가시화한다. M은 표준 마커 단백질의 분자량을 킬로 달톤으로 나타낸 것이다.
제5도는 모노클로날 항체에 의한125I-포자소체 표면 단백질의 면역 침전 결과를 도시한 것이다. 각 항체에 의해 결합된125I-단백질을 확인하는 방법은 제4도에 설명한 것이다. 사용된 특이적 포자소체 모노클로날 항체 및 대조용 항체(대조용)는 각 겔 레인의 상단에 나타내었다. 표준 마커 단백질의 분자량은 킬로 달톤으로 나타내었다.
제6도는 공기-건조시킨 이.테넬라 포자소체 슬라이드 제제의 위상차 현미경사진 및 다양한 모노클로날 항체를 사용한 면역형광 염색 패턴 현미경 사진이다. 패널 A, B, C 및 D의 좌측은 큰 후면 굴절체(PRB), 작은 전면 굴절체(ARB) 및 후면 굴절체의 반대쪽에 있는 정점 말단부를 갖는 온전한 신장된 포자소체를 보여주는 위상차 현미경 사진이다. 패널 A, B, C 및 D의 우측은 모노클로날 항체 14C3(표면 항원에 특이적), 6A5(표면 및 굴절체 단백질에 특이적), 11D2(포자소체 정점끝에 특이적) 및 대조용 항체로 각각 처리된 슬라이드를 보여주는 것이다. 제제에 결합된 항체는 로다민-결합된 항-마우스 항체를 사용하여 국소화시키고 라이쯔 디알럭스(Leitz Dialux 22
Figure kpo00004
) 헌미경을 사용하여 에피플루오레센스로 가시화한다. 모든 현미경 사진은 630배 확대한 것이다.
제7도는 닭의 신장세포에 있는 세포내 포자소체 및 발생 기생충의 항체 염색을 보여주는 것이다. 닭의 신장 세포를 포자소체로 감염시키고 감염 후 지시된 시간에서 세포를 항체 염색 처리한다. 배양물을 고정시키기 전에 세포의 포자소체를 제거하기 위하여 세척한다. 위상차 및 이에 상응하는 면역형광 현미경사진은 지시된 바와 같이 항체 7D4, 8A2, 7B2 및 15A3을 사용한 것이다. 제제에 결합된 항체를 로다민-결합된 항-마우스 항체로 국소화시키고 에피플루오레센스를 사용하여 가시화한다. 모든 현미경사진은 630배 확대한 것이다.
제8도는 닭의 신장 세포에 있는 세포내 포자소체 및 발생 기생충의 항체 염색 사진이다. 위상차 현미경 사진 및 이에 상응하는 면역형광 현미경사진은 모노클로날 항체 14B1 및 19D6, 면역 병아리 혈청 및 형광성 제2항체를 사용하여 지시된 시간에 찍은 것이다.
제9도는 항-포자소체 항체에 의한 세포내 포자소체 발생의 중화를 도시한 것이다. 정제된 이.테넬라 포자소체를 40℃에서 1시간 동안, 대조용 항체(X) 또는 항-포자소체 항체 7D4(□), 8A2(○), 14B1(●) 또는 6A5(■)와 함께 예비 배양한 후 MDBK 세포 배양물을 감염시킨다. 포자소체는 또한 배지(△) 또는 항-포자소체 약물인 라살로시드(*)와 예비배양한다.
감염 후, 세포내 포자소체의 발생은 세포 배양액내로3H-우라실을 혼입시켜 측정한다. 라살로시드는 포자소체의 세포내 발생을 방지하기 때문에, 이 약물로 예비처리한 배양물은3H-우라실의 최소 혼입을 나타낸다.
제10도는 65kd β-갈락토시다제 융합 단백질 샘플 또는 다른 샘플의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동/웨스턴 블롯 분석 결과를 도시한 것이다. 웨스턴 블롯 분석은 염소 항-마우스 HPOD 결합체와 함께 쥐(murine)의 항-β-갈락토시다제 항체(패널 A) 또는 푸울링된(pooled) 모노클로날 항체 7D1, 7D4 및 20C6(패널 B)을 사용하여 수행한다. 두 패널의 레인은 (1) β-갈락토시다제, (m) 예비염색된 분자량 마커(크기는 플레이트 A의 좌측에 kd으로 나타내었다.), (2) 총 세포 펠렛 단백질, (3) 세포 펠렛으로부터 음파파쇄에 의해 방출된 단백질 및 (4) 음파파쇄후 펠렛으로부터 구아니딘-HCl에 의해 용해된 단백질을 나타낸다.
제11도는 파아지 λm 2-4로부터의 1.7kb EcoRI DNA 삽입체를 함유하는 65kd 단백질 발현 플라즈미드인 pEV/2-4를 도시한 것이다. Pst I(P, 염기쌍 53 및 776), Kpn I(K, 염기쌍 202), BstNI(B, 염기쌍 584, 1303 및 1412) 및 Sau 3A(S, 염기쌍 1017 및 1439)를 포함한 삽입체내의 다양한 제한 효소 부위의 위치는 EcoRI 부위에 대하여 나타낸 것이다.
제12도는 pEV-vrf 3의 EcoRI 및 SalI 부위사이에 삽입된 지시부위와 폴리링커를 함유하는 pEV 3-SEQ의 지도이다. 점선 화살표로 나타낸 합성 올리고뉴클레오타이드 CGGTCGACTCGAGCCA는 쇄-종결 DNA 서열 분석을 위한 프라이머로서 사용된다.
제13도는 모노클로날 항체 6A5에 의해 인식되는 단백질을 암호화하는 DNA 클론의 제한지도이다. 1.1kb cDNA의 막삼-길버트(Maxam-Gilbert) DNA 서열 분석에 사용되는 제한 엔도뉴클레아제 부위가 나타나 있다. 괄호안의 EcoRI 부위는 0.9kb cDNA의 말단에 있다. 지도상의 바(bar:
Figure kpo00005
는 잠정적인 시그널 펩타이드(검게 나타낸 부분)와, DNA 서열로부터 추정된 오픈 리딩 프레임을 나타낸다. 지도 아래의 선(―)은 쇄-종결 서열 분석에 사용된 exo III 결실부를 나타낸다.
제14도는 모노클로날 항체 6A5에 의해 인식되는 20kd 단백질을 암호화하는 1.1kb cDNA 분자의 뉴클레오타이드 서열이다.
제15도는 제14도의 뉴클레오타이드 서열로부터 추정되는 단백질의 아미노산 서열이다.
제16도는 모노클로날 항체 7D1, 7D4 및 20C6에 의해 인식되는 65kd 단백질을 암호화하는 1.7kb cDNA 분자의 뉴클레오타이드 서열이다.
제17도는 제16도의 뉴클레오타이드 서열로부터 추정되고, 발현된 65kd 단백질로부터 생성된 트립신 분해 펩타이드의 서열 분석에 의해 확인된 단백질의 아미노산 서열이다. 전체 아미노산 서열에서 이러한 펩타이드 중 일부에 상응하는 영역은 선 아래에 나타나 있다. 이러한 펩타이드의 결정된 서열은 선 위에 있는 것이다.
제18도는 모노클로날 항체 8A2에 의해 인식되는 28kd 단백질을 암호화하는 1.1kb cDNA 분자의 뉴클레노타이드 서열이다.
제19도는 제18도의 뉴클레오타이드 서열로부터 추정된 단백질의 아미노산 서열이다.
제20도는 모노클로날 항체 7B2에 의해 인식되는 단백질을 암호화하는 3.2kb cDNA 분자의 뉴클레오타이드 서열이다.
제21도는 제20도의 뉴클레오타이드 서열로부터 추정된 단백질의 아미노산 서열이다.
제22도는 면역친화성-정제된 65kd 단백질의 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 분석을 나타낸 것이다. 겔은 쿠마시 블루 염색 및 웨스턴 블롯 분석하여 가시화한다. 레인 2 및 4 및 3 및 5는 두 제제로부터 정제된 단백질을 함유한 것이다. 레인 1 및 6은 도면의 좌측 및 우측에 나타낸 분자량을 갖는 분자량 마커 단백질의 혼합물을 함유한 것이다.
제23도는 컬럼 체류 시간의 함수로써 215mμ에서의 흡광도를 나타내는, 65kd 단백질의 β-머캅토에탄올 환원된 (A) 및 비환원된 (B) 트립신 분해물의 HPLC 용출 프로필이다.
제24도는 포자충증 항원을 암호화하는 유전자를 백시니아 바이러스에 재조합시키는데 사용되는 기본 벡터의 4가지 인자의 제한 지도를 도시한 것이다. 이러한 인자에는 7.5K 프로모터 인자(a 및 b, 좌측), TK 좌우(a 및 b, 우측), 플라즈미드 pUC 8의 일부(c) 및 M 13tgl 31로부터의 폴리클로닝 부위(d)가 포함된다. 바이러스 7.5K 및 TK 프로모터의 전사 방향은 좌에서 우이다(즉, 폴리링커의 BglII에서 EcoRI 제한부위로).
제25도는 모노클로날 항체 8A2에 의해 인식되는 에이메리아 항원의 N-말단부의 아미노산 서열을 나타낸 것으로, (a)는 제24도의 벡터의 폴리링커 인자내에 AUG 해독 개시 코돈을 함유하는 작제물로부터 발현된 것이고 (B)는 말라리아원충의 190kd 리더 단편(처음 34개 아미노산) 및 제24도의 클로닝 벡터의 폴리링커(다음 13개 아미노산)에 융합된 것이다. 단백질의 성숙 과정 동안, N-말단부에 처음 19개 아미노산이 클론(:)으로 나타낸 위치에서 절단될 수 있다.
도면에서, 표준 단일 문자 약어는 뉴클레오타이드를 나타내기 위해 사용된 것이고 표준 1 또는 3 문자 약어는 아미노산을 나타내기 위해 사용된 것이다. 이 약어의 의미는 표준 생화학 교과서[참조; Lehninger, Principles of Biochemistry, 1984, Worth Publishers, Inc. New York, pp. 96, 798]에서 알 수 있다.
본원에 사용된 하기 용어는 하기의 의미를 가진다:20kd 단백질은 모노클로날 항체 6A5에 특이적으로 결합하는, SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서 약 20kd의 겉보기 분자량을 나타내는 재조합 또는 합성 단백질을 의미한다. 이 항체는 또한 특히 SDS 겔에서 약 28kd의 겉보기 분자량을 갖는(에이메리아 단백질의 총 추출물로부터의) 에이메리아 표면 항원과 반응한다. 이 항원은 포자소체 발생단계에 존재한다. 이 단백질을 암호화하는 cDNA 분자의 뉴클레오타이드 서열 및 이로부터 추정된 아미노산 서열은 각각 제14도 및 15도에 나타나 있다.
65kd 단백질은 모노클로날 항체 7D1, 7D4 및 20C6에 특이적으로 결합하는, SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서 약 65kd의 겉보기 분자량을 갖는 재조합 또는 합성 단백질을 의미한다. 이러한 항체는 또한 특이적으로 SDS 겔에서 약 120kd의 겉보기 분자량을 나타내는, 에이메리아 추출물로 부터의 표면 항원과 반응한다. 이 항원은 포자소체, 열충(schizont) 및 난충 발생 단계에 존재한다. 이 단백질을 암호화하는 cDNA 분자의 뉴클레오타이드 서열 및 이로부터 추정된 아미노산 서열은 각각 제16도 및 17도에 나타나 있다.
28kd 단백질은 모노클로날 항체 8A2에 특이적으로 결합하는, SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서 약 28kd의 겉보기 분자량을 갖는 재조합 또는 합성 단백질을 의미한다. 이러한 항체는 또한 특이적으로 SDS 겔에서 약 37kd의 거토기 분자량을 나타내는 에이메리아 표면 항원과도 반응한다. 이 항원은 포자소체, 열충 및 난충 발생 단계에 존재한다. 이 단백질을 암호화하는 cDNA 분자의 뉴클레오타이드 서열 및 이로부터 추정된 아미노산 서열은 각기 제18도 및 19도에 나타나 있다.
45kd 단백질은 모노클로날 항체 7B2에 특이적으로 결합하는, SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서 약 45kd의 겉보기 분자량을 갖는 재조합 또는 합성 단백질을 의미한다. 이 항체는 또한 SDS 겔에서 200kd 이상의 겉보기 분자량을 갖는 에이메리아 표면 항원과도 특이적으로 반응한다. 이 항원은 포자소체 발생 단계에 존재한다. 이 단백질을 암호화하는 cDNA 분자의 뉴클레오타이드 서열 및 이로부터 추정된 아미노산 서열은 제20도 및 21도에 각각 나타나 있다.
에이메리아 표면 항원의 면역반응성 및/또는 항원성 결정소 하나 이상을 가진 단백질이란 면역학적 컴피턴트(competent) 숙주 유기체에서 면역 반응을 유도해낼 수 있고/있거나 상보적인 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 영역 또는 에피토프(epitope)를 갖는 단백질을 의미한다.
유적적 암호의 축퇴성 때문에, 제15, 17, 19 및 21도에 나타난 아미노산 서열을 암호화할 수 있는 많은 잠정적 뉴클레오타이드 서열(작용적 등가물)이 있다는 것을 이해할 것이다. 또한 벡터에 삽입된 본 발명의 DNA 서열 및 단편의 뉴클레오타이드 서열은, 이러한 서열 및 단편을 함유하는 재조합 벡터가 적당한 숙주 유기체에서 에이메리아 표면 항원의 하나 이상의 면역반응성 및/또는 항원성 결정소를 갖는 단백질 또는 단편의 생성을 지시할 수 있는 한, 실제 구조 유전자의 일부가 아닌 뉴클레오타이드를 포함한다는 것도 이해될 것이다.
더구나, 근본적으로 생물학적 및 면역학적 활성을 변형시키지 않는 단백질의 아미노산 치환은 이미 공지되어 있고 문헌[참조; Neurath et al., The Proteins Academic Press, New York(1979), 특히 14페이지의 제6도]에 설명되어 있다. 가장 흔히 관찰되는 아미노산 치환은 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 및 그 역이다.
본 발명의 예시적인 양태에 대한 이러한 작용적으로 동등한 뉴클레오타이드 서열 변형 및 아미노산 치환은, 생성 단백질이 에이메리아 표면 항원의 하나 이상의 면역 반응성 및/또는 항원성 결정소를 보유하는 한, 본 발명의 범위에 속한다.
단편이란 본 발명의 cDNA 또는 단백질 중 하나의 아서열을 함유하는 DNA 서열 또는 단백질을 의미한다. 이러한 단편은, DNA에 대해서는 제한 엔도뉴클레아제 및 단백질에 대해서는 프로테아제를 사용함으로써, 큰 분자를 효소적 절단하여 제조할 수 있다. 그러나, 본 발명의 단편은 특정 형태의 효소적 절단 생성물에 제한되지 않으며, 말단부가 특정 효소적 절단점에 해당하지 않는 아서열도 포함한다. 이러한 단편은 예를 들어 화학적 합성에 의해, 본원에 제공된 서열 데이타를 사용하여 제조될 수 있다. DNA 단편은 분리된 mRNA로부터 불완전한 상보적 DNA(cDNA) 합성에 의해 제조될 수 있다. 단백질 단편도 단백질 단편을 암호화하는 DNA 단편을 발현시켜 생성할 수 있다. 이러한 단백질 단편은 이들이 면역반응성 및/또는 항원성 결정소를 구성하기에 충분한 수의 아미노산 잔기를 함유한다면 본 발명에 유용할 수 있다. 일반적으로, 적어도 약 7 또는 8개 잔기가 필요하다. 하기 설명되는 것과 같이, 이러한 단편을 면역 반응성이 되게하기 위해서, 면역원성 담체 분자에 커플링시킬 필요가 있다.
본 발명의 단백질은 재조합 DNA 방법, 화학적 합성 또는 에이메리아 제제로부터의 분리에 의해서와 같이 당해 기술분야에 공지된 방법으로 제조할 수 있다.
본 발명의 단백질을 제조하는데 필요한 DNA는 제14, 16, 18 및 20도에 제공된 뉴클레오타이드 서열정보를 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 화학적 합성은 공지된 방법은 어느 것이라도 사용하여 수행할 수 있지만, 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법[참조; Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc. 103:3185(1981)]이 바람직하다.
다르게는, cDNA를 에이메리아 mRNA로부터 제조할 수 있다. mRNA는 표준 기술을 사용하여 에이메리아 포자형성 난모 세포 또는 난충으로부터 분리할 수 있다. 이러한 mRNA 샘플을 문헌[참조:Maniatis et al., 상기 참조]에 설명된 바와 같이 cDNA를 제조하는데 사용할 수 있다. 이 cDNA는 cDNA 라이브러리를 제조하기 위하여, 이.콜라이를 형질전환시키는데 사용할 수 있는 적당한 클로닝 벡터에 삽입시킬 수 있다.
cDNA 라이브러리는 프로브로서, 본 발명의 클론된 유전자 또는 이의 단편을 사용하여 선별할 수 있다. 이러한 유전자 또는 이의 단편은, 예를 들어 4가지 데옥시리보뉴클레오타이드의 존재하에[이중 하나는 프로브로서 사용하기 위해 α위치에32P를 함유한다[참조:Maniatis et al., 상기 참조, p109)] Pol I DNA 폴리머라제를 사용한 닉(nick)-해독에 의해 방사능 표지할 수 있다.
에이메리아 테넬라가 하기 실시예에서는 mRNA 공급원으로 사용되지만, 이 종으로부터 클론된 유전자는, 여러가지 종 사이에 DNA 서열 상동성이 있으므로, 에이메리아의 다른 종으로부터 유전자를 분리하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다.
일단 본 발명의 에이메리아 유전자가 확인되고 분리되면, 이것을 삽입된 유전자 서열의 전사 및 해독에 필요한 인자를 함유하는 적당한 발현 비히클에 삽입시킨다. 유용한 클로닝 비히클은 염색체성, 비염색체성 및 합성 DNA 서열의 단편으로 이루어진, 예를 들어 다양한 공지된 세균 플라즈미드, 파아지 DNA, 파아지 DNA 또는 다른 발현 조절 서열을 사용하기 위하여 변형시킨 플라즈미드와 같은 플라즈미드와 파아지 DNA의 조합체, 또는 효모 플라즈미드일 수 있다. 당해 기술분야의 숙련가들에게 공지되어 있고 사용할 수 있는 특정 클로닝 비히클에는 하기의 것들이 포함되지만 이에 제한하는 것은 아니다; pEV-vrf 플라즈미드(pEV-vrf1, -2 및 -3); SV40; 아데노바이러스; 효모; 람다 gt-WES-람다 B; 캐론(Charon) 4A 및 28; 람다-gt-11-람다 B; M13-유래된 벡터 예를 들어, pUC 8, 9, 18 및 19, pBR 313, 322 및 325; pAC 105; pVA 51; pACY 177; pKH 47; pACYC 184; puB 110; pMB 9; colE1; pSC 101; pm 121; RSF 2124; pCR1 또는 RP 4.
클로닝 벡터에 에이메리아 유전자를 삽입하는 것은, 유전자 및 목적하는 클로닝 비히클을 상보적인 DNA 말단부를 생성하기 위해 동일한 제한 효소(들)로 절단하에 쉽게 수행한다. 이것을 수행할 수 없는 경우는, 평활 말단을 만들기 위해 일본쇄 DNA를 분해하거나, 적합한 DNA 폴리머라제로 일본쇄 말단부를 메움으로써 절단 말단부를 변형시킬 필요가 있다. 이런 방법으로, T4 DNA 리가제와 같은 효소로 평활-말단 결합 반응을 수행할 수 있다. 다르게는, DNA 말단부상에 뉴클레오타이드 서열(링커)을 결합시켜 목적하는 특정 부위를 생성할 수 있다. 이러한 링커는 제한 부위 인식 서열을 암호화하는 특정 올리고뉴클레오타이드 서열을 함유할 수 있다. 절단된 벡터 및 에이메리아 유전자는 또한 모러(Morrow)의 문헌[참조:Methods in Enzymology 68:3(1979)]에 설명된 것과 같은 호모중합체 테일링(tailing)에 의해 변형시킬 수 있다.
본 발명에 사용될 수 있는 많은 클로닝 비히클은 목적하는 형질전환체를 선택하는데 사용할 수 있는 하나 이상의 마커 활성물을 함유한다:예를 들어 pBR 322내 암피실린 및 테트라사이클린 내성, pUC8내 암피실린 내성 및 β-갈락토시다제 활성, 및 pEV-vrf2내 암피실린 내성. 숙주 세포가 벡터에 의해 부여 받은 활성이 없는 경우 이러한 벡터가 삽입된 숙주 세포의 선별은 매우 간단하다.
클로닝 비히클의 선택된 부위에 삽입된 에이메리아 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 실제 구조 유전자의 일부가 아닌 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 다르게는, 유전자가 완전한 야생형 유전자의 일부만을 함유할 수 있다. 반드시 필요한 조건은, 적당한 숙주 유기체에서 에이메리아 표면 항원의 면역반응성 및/또는 항원성 결정소 하나 이상을 갖는 폴리펩타이드 또는 단백질의 생성을 지시할 수 있는 클로닝 비히클에 유전자 단편이 삽입되는 것이다.
적당한 숙주 유기체의 선택은 당해 기술에 공지된 많은 요인에 의해 영향받는다. 이러한 요인에는 예를 들어, 선택된 벡터와의 적합성, 하이브리드 플라즈미드에 의해 암호화된 단백질의 독성, 목적하는 단백질의 회수 용이성, 발현 특징, 생체안정성 및 비용이 포함된다. 이러한 요인의 균형이 이루어져야 하며, 모든 숙주가 특정 재조합 DNA 분자의 발현에 동일하게 유효하지는 않다는 것이 이해되어야 한다.
본 발명에 사용될 수 있는 적당한 숙주 단세포 유기체는 식물, 포유동물 또는 효모 세포 및 에쉐리키아 콜라이, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus) 및 액티노마이세스(Actinomyces)와 같은 세균을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 특히는 이.콜라이 균주 MC 1061[참조; Casadaban et al., J. Mol. Biol. 138:179(1980)]이 바람직하다. 이 균주 또는 플라즈미드 pRK 248cITs를 함유하는 이.콜라이 K-12의 다른 균주를 사용할 수 있다. 다른 이.콜라이 K-12 균주에 사용하기 위한 플라즈미드 pRK 248cITs는 ATCC로부터 입수 가능하며 기탁 번호는 제ATCC33766호이다. 이.콜라이 균주 MC 1061도 또한 기탁되어 있고 기탁번호는 제ATCC 53338호이다.
숙주 세포에 재조합 클로닝 벡터를 삽입하는 것은 여러가지 방법으로 수행할 수 있다. 선택된 특별한 벡터/숙주 세포 시스템에 따라, 이러한 삽입은 형질전환, 형질도입 또는 형질 감염으로 수행될 수 있다. 이와 같이 변형된 숙주 세포가 생성되면, 세포를 배양할 수 있고 배양물로부터 단백질 발현 생성물을 분리할 수 있다.
본 발명의 에이메리아 단백질을 생성하는 클론은 이 단백질에 특이적인 적당히 표지된 항체를 사용하여 확인할 수 있다. 바람직한 모노클로날 항체는 하기와 같은 표준 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
에이메리아 테넬라로부터의 항원성 단백질을 사용하여 마우스, 래트, 말(horse), 양(sheep), 돼지(pig), 토끼(rabbit) 등과 같은 동물을 면역시키고 골수종 세포에 융합시키기 위한 항체-생성 체세포를 수득한다.
항체, 특히 B 세포를 생성하는데 유효한 체세포는 골수종 세포주와의 융합에 적당하다. 이러한 체세포는 자극을 받은 동물의 림프절, 비장 및 말초 혈액으로부터 유도될 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태에서는 마우스 비장 세포를 사용하는데, 이는 부분적으로 이러한 세포가 비교적 높은 비율로 마우스 골수종 세포주와의 안정한 융합체를 생성하기 때문이다. 그러나, 이 대신 래트, 토끼, 개구리(frog) 또는 다른 세포를 사용할 수 있다.
특수화된 골수종 세포주는 하이브리도마-생성 융합 방법[참조; Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511(1976); Shulman et al., Nature 276:269(1978); Volk et al., J. Virol. 42:220(1982)]에 사용하기 위한 림프종양으로부터 개발되어 왔다. 이러한 세포주는 3가지 이상의 이유로 개발되어 왔다. 첫번째는 무한히 자가증식하는 비융합된 유사 골수종 세포로부터 융합된 하이브리도마를 용이하게 선별하기 위함이다. 일반적으로, 이것은 하이브리도마의 성장을 유지하는 선택적 배지에서 성장할 수 없도록 효소가 결핍된 골수종을 사용하여 달성한다. 두번째 이유는 림프구의 종양 세포가 자신의 항체를 생성하는 고유의 능력으로부터 야기된다. 모노클로날 기술을 사용하는 목적은 하이브리도마의 체세포 성분의 유전적 조절하에 목적하는 단일 항체를 생성하는 무제한 수명을 가진 융합된 하이브리드 세포주를 수득하는 것이다. 하이브리도마에 의한 종양 세포 항체의 생성을 배제하기 위하여, 경쇄 또는 중쇄 면역글로불린을 생성할 수 없거나 항체 분비 작용이 결핍된 골수종 세포주를 사용한다. 이러한 세포주를 선택하는 세번째 이유는 융합에 대한 적합성 및 효율성 때문이다.
많은 골수종 세포주가 융합된 세포 하이브리드의 생성을 위해 사용될 수 있으며, 예를 들어, P3/X63-Ag8, P3/NSI/1-Ag 4-1, SP2/O-Ag-14 및 S194/5, XXO. BU. 1이 있다. P3/X63-Ag8 및 P3/NSI/1-Ag 4-1 세포주는 쾰러 및 밀스타인에 의해 설명되어 있다[참조; Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511(1976)]. 슐만(Shulman) 등은 Sp2/O-Ag14 골수종 세포주를 개발하였다[참조; Nature 276:269(1978)]. S194/5. XXO. BU. 1주는 트로우브릿지(Trowbridge)가 발표되었다[참조; J. Exp. Med. 148:313(1979)]. 본 발명의 실시예에서는 PAI-O 마우스 세포주(P3/X63-Ag8의 Ig-비생성 아클론)가 사용된다.
항체-생성 비장 또는 림프절 세포 및 골수종 세포의 하이브리드를 제조하는 방법은, 일반적으로 세포막 융합을 촉진시키는 시약(들)(화학적, 바이러스성 또는 전기적)의 존재하에 각기 체세포와 골수종 세포를(약 20:1 내지 약 1:1로 다양할 수 있지만) 10:1비로 혼합하는 것을 수반한다. 동일 종의 동물이 융합 과정에 사용되는 체세포 및 골수종 세포의 공급원인 것이 바람직하다. 융합 방법은 문헌[참조; Kohler and Milstein, Nature 256:495(1975) 및 Eur. J. Immunol. 6:511(1976); Gefter et al., Somatic Cell Genet. 3:231(1977); Volk et al., J. Virol. 42:220(1982)]에 설명되어 있다. 상기 연구자들에 의해 사용된 융합-촉진제는 센다이(Sendai) 바이러스 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)이다. 본 발명의 실시를 위한 융합 방법에서는 PEG을 사용한다.
융합 방법은 매우 저빈도로 생존가능한 하이브리드를 생성하기 때문에(예를 들어, 비장이 체세포의 공급원으로서 사용되는 경우, 거의 약 1×105개의 비장 세포에 대해 단지 하나의 하이브리드가 수거된다). 남아 있는 비융합된 세포 특히 비융합된 골수종 세포로부터 융합된 세포 하이브리드를 선택하는 방법이 반드시 있어야 한다. 결과로 생성된 다른 융합된 세포 하이브리드중에서 목적하는 항체-생성 하이브리도마를 검출하는 방법도 필요하다.
일반적으로, 융합된 세포 하이브리드의 선별은, 하이브리도마의 성장은 유지해 주지만 통상적으로 무한히 분열하는 골수종 세포의 성장은 제한하는 배지에 세포를 배양함으로써 수행한다(융합에 사용되는 체세포는 시험관내 배양에서 장기간 생존력을 유지하지 못하므로 문제되지 않는다). 본 발명의 실시에서는, 하이포크산틴 포스포리보실 트랜스퍼라제가 결핍된(HPRT-음성) 골수종 세포가 사용된다. 이러한 세포에 대한 선별은 하이포크산틴/아미노프테린/티미딘(HAT) 배지에서 수행하는데, 이 배지에서 융합된 세포 하이브리드는 비장 세포의 HPRT-양성 인자형에 의해 생존할 수 있다. 인자형으로 적당한 하이브리드의 성장을 유지하는 배지에서 선별될 수 있는 상이한 유전적 결핍성(약물 감성 등)을 가진 골수종 세포의 사용도 가능하다.
융합된 세포 하이브리드를 선택적으로 배양하는데는 수주일이 필요하다. 이러한 기간중 초기에는 목적한 항체를 생성하는 하이브리드를 확인하여 계속 클론화 시키고 증식시킬 필요가 있다. 일반적으로, 수득된 하이브리드중 약 10%가 목적하는 항체를 생성하지만, 1 내지 30% 범위가 일반적이다. 항체-생성 하이브리드의 검출은 효소-결합 면역검정 및 방사능 면역 검정 기술[참조; Kennet et al.(편집인), Monoclonal Antibodies and Hybridomas:A New Dimension in Biological Analyses, pp. 376-384, Plenum Press, New York(1980)]을 포함하며, 몇가지 표준 검정 방법 중 어느 것으로도 수행할 수 있다. 몇가지 검출 방법이 본 발명의 실시에 사용된다.
목적하는 융합된 세포 하이브리드를 선별하여 개별적인 항체-생성 세포주에 클론화시킨 후, 각 세포주를 두가지 표준 방법 중 하나로 증식시킬 수 있다. 하이브리도마 세포의 현탁액을 조직 친화성이 있는 동물에 주입할 수 있다. 주입된 동물은 융합된 세포 하이브리드에 의해 생성된 특이적 모노클로날 항체를 분비하는 종양을 발생할 것이다. 혈청 또는 복수와 같은 동물의 체액을 트래핑하여 모노클로날 항체를 고농도로 제공할 수 있다. 다르게는, 각 세포주를 실험실 배양 용기에서 시험관 내에서 증식시킬 수 있다. 고농도의 일특이적 모노클로날 항체를 함유하는 배양 배지는 경사분리시키고, 여과 또는 원심분리시켜 회수할 수 있다.
이.콜라이에서 생성되는 경우, 에이메리아 단백질은 세포질, 또는 봉입체(inclusion body)에 남아 있다. 단백질을 방출시키기 위해 외막을 파괴시켜야 한다. 바람직하게는 음파 파쇄, 다른 기계적 파괴 방법, 예를 들어, 프렌치(French) 프레스 셀 또는 가울린(Gaulin) 분쇄기로 수행한다.
세포 파괴는 화학적 또는 효소학적 방법으로 수행할 수 있다. 2가 양이온은 종종 세포막 보존에 필요하기 때문에, EDTA 또는 EGTA와 같은 적당한 킬레이팅 시약으로의 처리는 세포로부터 단백질의 방출을 용이하게 하기에 충분히 파괴적일 수 있다. 유사하게는 리소자임과 같은 효소를 사용하여 동일한 결과를 얻어 왔다. 이 효소는 세포벽의 펩티도글리칸 골격을 가수분해시킨다.
삼투압 쇼크의 적용도 또한 이용될 수 있다. 간단하게 설명하면, 우선 세포를 물이 빠져 수축되는 고장액에 넣는다. 이어서 저장성 쇼크 용액으로 대체시키면 목적하는 단백질이 빠지면서 물이 세포로 빠르게 유입된다.
일단 에이메리아 단백질이 세포로부터 방출되면, 나트륨 또는 암모늄 설페이트와 같은 염으로의 침전, 한외여과 또는 당해 기술의 숙련가들에게 공지된 다른 방법에 의해 농축할 수 있다. 추가 정제는 겔 여과, 이온-교환 크로마토그래피, 제조용 디스크-겔 또는 커튼 전기영동, 등전성 포커싱, 저온 유기 용매 분획화, 또는 역전류 분포를 포함하여(이로 제한되지는 않는다) 통상적인 단백질 정제 기술에 의해 수행할 수 있다. 그러나, 정제는 바람직하게는 하기 설명되는 것과 같이 면역친화성 크로마토그래피에 의해 수행한다.
본 발명의 단백질 또는 이의 단편은 또한 독점점 고체상 합성, 부분적 고체상 방법, 단편 축합 또는 고전적인 용액 합성과 같은 적당한 방법에 의해 화학적으로 합성할 수도 있다. 고체상 합성이 바람직하다[참조; Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149(1963)].
이러한 합성은 알파-아미노-말단부가 보호된 아미노산으로 수행한다. 불안정한 측쇄를 가진 3작용성 아미노산은 또한 펩타이드의 조립 동안 불안정한 측쇄 부위에서 일어나는 화학 반응을 막아 주는 적당한 그룹으로 보호한다. 알파-아미노 보호 그룹을 선택적으로 제거시켜 여속한 반응이 아미노-말단부에서 일어날 수 있게 한다. 알파-아미노 보호 그룹의 제거를 위한 조건은 측쇄 보호 그룹의 탈보호반응을 일으키지 않는다.
알파-아미노 보호 그룹은 펩타이드의 단계적 합성 기술에 유용하다고 공지된 것들이다. 아실형 보호 그룹(예, 포밀, 트리플루오로아세틸, 아세틸), 방향족 우레탄형 보호 그룹(예, 벤질옥시카보닐(Cbz) 및 치환된 벤질옥시 카보닐), 지방족 우레탄 보호 그룹(예, t-부틸옥시카보닐(Boc), 이소프로필옥시카보닐, 사이클로헥실옥시카보닐) 및 알킬 형 보호 그룹(예, 벤질, 트리페닐메틸)이 포함된다. 바람직한 보호 그룹은 Boc이다. Tyr에 대한 측쇄 보호 그룹은 테트라하이드로피라닐, 3급-부틸, 트리일, 벤질, Cbz, 4-Br-Cbz 및 2,6-디클로로벤질이 포함된다. Tyr에 대한 바람직한 측쇄 보호 그룹은 2,6-디클로로벤질이다. Asp에 대한 측쇄 보호 그룹에는 벤질, 2,6-디클로로벤질, 메틸, 에틸 및 사이클로헥실이 포함된다. Asp에 대한 바람직한 측쇄 보호 그룹은 사이클로헥실이다. Thr 및 Ser에 대한 측쇄 보호 그룹은 아세틸, 벤조일, 트리틸, 테트라하이드로피라닐, 벤질, 2,6-디클로로벤질 및 Cbz를 포함한다. Thr 및 Ser에 대한 바람직한 보호 그룹은 벤질이다. Arg에 대한 측쇄 보호 그룹에는 니트로, Tos, Cbz, 아다만틸옥시 카보닐 또는 Boc가 포함된다. Arg에 대한 바람직한 보호 그룹은 Tos이다. Lys의 측쇄 아미도 그룹은 Cbz, 2-ClCbz, Tos 또는 Boc로 보호될 수 있다. 2-Cl-Cbz 그룹은 Lys에 대한 바람직한 보호그룹이다. 측쇄 보호 그룹의 선택은 하기와 같은 것을 기본으로 한다:측쇄 보호 그룹은 커플링 동안 그대로 남아 있으며 아미노-말단부 보호 그룹의 탈보호 동안 또는 커플링 상태동안 제거되지 않는다. 측쇄 보호 그룹은, 표적 펩타이드를 변형시키지 않는 반응 조건을 사용하는 경우, 최종 펩타이드의 합성의 완료시 제거가능하여야 한다.
고체상 합성은 일반적으로 적당한 고체 지지체에 알파-아미노 보호된(측쇄 보호된) 아미노산을 커플링시킴으로써 카복시-말단부로부터 수행한다. 클로로메틸 처리되거나 하이드록시메틸 수지에 결합되어 그 결과 생성된 표적 펩타이드가 C-말단부에 유리 카복실 그룹을 갖게 되는 경우에 에스테르 결합이 형성된다. 다르게는, 아미드 결합이 형성되어 그 결과의 표적 펩타이드가 C-말단부에 카복사미드 그룹을 갖게 되는 경우에 벤즈하이드릴아민 또는 P-메틸벤즈하이드릴아민 수지가 사용된다. 이러한 수지는 시판품을 이용할 수 있으며 이의 제조는 문헌[참조; Stewart et al., Solid Phase Poptide Synthesis(2nd Edition, Pierce Chemical Co., Rockford, IL., 1984)]에 설명되어 있다.
측쇄에서 Tos로 및 알파-아미노 작용기에서 Boc로 보호된 C-말단의 아미노산 Arg를 디사이클로헥실카보디이미드(DCC), N,N'-디이소프로필카보디이미드 및 카보닐디이미다졸을 포함하여 여러가지 활성화제를 사용하여 벤즈하이드릴아민 수지에 커플링시킨다. 수지 지지체에 결합시킨 후 알파-아미노 보호 그룹은 0° 내지 25℃ 온도에서 디옥산 중 트리플루오로아세트산(TFA) 또는 HCl을 사용하여 제거한다. 가능한 S-알킬화를 억제하기 위하여 메티오닌(Met)의 도입 후 TFA에 디메틸 설파이드를 가한다. 알파-아미노 보호 그룹을 제거한 후, 나머지의 보호된 아미노산을 필요한 순서대로 단계적으로 커플링하여 목적하는 펩타이드 서열을 수득한다.
커플링 반응에는 DDC, N,N'-디이소프로필카보디이미드, 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-(디메틸아미노)-포스포늄 헥사 플루오로포스페이트(BOP) 및 DCC-하이드록시벤조트리아졸(HOBt)을 포함하여, 다양한 활성화제가 사용될 수 있다. 각각 보호된 아미노산은 과량(2.5당량 이상)으로 사용하며, 커플링 반응은 DMF, CH2Cl2또는 이의 혼합물에서 수행한다. 커플링 반응의 완성 정도는 닌하이드린 반응[참조; Kaiser et al., Anal. Biochem. 34:595(1970)]에 의해 각 단계에서 모니터한다. 커플링 반응이 불완전하다고 결정되는 경우는 커플링 반응을 반복한다. 커플링 반응은 베가(Vega) 250, 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems) 합성기 또는 다른 시판용 기구를 사용하여 자동화할 수 있다. 표적 펩타이드가 전체적인 조립체를 이룬 후, 펩타이드-수지를 TFA/디티오에탄으로 탈보호 하고 0℃에서 1 내지 2시간 동안 액체 HF와 같은 시약으로 처리하여 수지로부터 펩타이드를 절단하고 모든 측쇄 보호 그룹을 제거한다.
고체 지지체상에서 측쇄 대 측쇄 폐환화에는 산성 아미노산(예, Asp) 및 염기성 아미노산(예, Lys)의 측쇄 작용기를 선택적으로 절단할 수 있는 직각의 보호 반응 계획이 필요하다. Asp의 측쇄에 대한 9-플루오레닐메틸(OFm) 보호 그룹 및 Lsy의 측쇄에 대한 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 보호 그룹은 이러한 목적을 위해 사용할 수 있다. 이러한 경우, Boc-보호된 펩타이드-수지의 측쇄 보호 그룹은 DMF 중 피페리딘으로 선택적으로 제거한다. 폐환 반응은 DCC, DCC/HOBt 또는 BOP를 포함하여 많은 활성화제를 사용하여 고체 지지체상에서 이루어진다. HF 반응은 상술한 바와 같이 폐환된 펩타이드-수지상에서 수행된다.
합성 단백질의 정제는 재조합적으로 제조된 단백질에 대해 상술한 바와 같이 수행할 수 있다.
에이메리아 단백질은 또한 이.테넬라 또는 다른 에이메리아 종으로부터의 막 단백질 추출물로부터 면역 침전 또는 면역친화성 크로마토그래피에 의해 회수할 수 있다. 이미 설명한 바와 같이, 이러한 방법으로 완전한 야생형 단백질을 제조할 수 있다. 어떤 경우에서는, 이러한 단백질이 재조합 DNA 방법에 의해 제조된 단백질보다 크다. 이 목적을 위한 모노클로날 항체는 상술한 것과 같이, 항원으로서 합성 또는 천연 에이메리아 단백질을 사용하여 제조될 수 있다.
필요한 면역반응성 및/또는 항원성 결정소를 가진 다른 유용한 단백질은 본 발명의 단백질상의 활성 결정소(들)에 대한 항-이디오타입 항체 또는 이의 단편이다. 이러한 항-이티오타입 항체는 본 발명의 단백질상의 결정소에 특이적인 다른 항체에 대해 야기될 수 있다(즉, 항-이디오타입 항체는 항-항체이다). 바람직하게는, 모노클로날 항-이디오타입 항체를 사용한다. 이러한 항체는 에이메리아 단백질을 사용할 수 있는 동일한 방법으로 백신으로서 투여할 수 있다.
본 발명의 하나 이상의 에이메리아 단백질 및 항-이디오타입 항체는 단백질 및 생리학적으로 허용되는 담체를 함유하는 백신으로 제형화할 수 있다. 적당한 담체에는 예를 들어, 0.01 내지 0.1M 인산염 완충액(중성 pH) 또는 생리학적 염수용액이 포함된다.
포자소체중에 대한 강화된 면역성은 두가지 중 한가지 방법으로 형성시킬 수 있다. 첫째는 백신에 애쥬번트 또는 면역 강화제를 가할 수 있다. 두번째는 본 발명의 단백질을, 가교결합된 복합체 또는 담체분자에 결합시킨 보다 큰 형태로 면역시킬 동물에 투여할 수 있다.
동물의 예방 접종을 위한 적당한 애쥬번트에는 애쥬번트 65(낙화생유, 만니드 모노올레에이트 및 알루미늄 모노스테아레이트를 함유); 수산화 알루미늄, 인산 알루미늄 및 명반과 같은 무기 겔; 헥사데실아민, 옥타데실아민, 리소레시틴, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드, N,N-디옥타 데실-N',N'-비스(2-하이드록시메틸)프로판디아민, 메톡시 헥사데실글리세롤 및 플루로닉폴리올과 같은 계면 활성제; 피란, 덱스트란 설페이트, 폴리 IC, 폴리아크릴산 및 카보풀과 같은 폴리음이온; 무라밀 디펩타이드, 디메틸글리신 및 터프트신과 같은 펩타이드; 및 오일 유액이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 단백질은 또한 리포좀 또는 다른 미소담체에 혼입한 후 투여할 수도 있다.
리포좀 또는 다른 미소담체에의 혼입은 백신의 방출이 오랜 기간동안 방출될 수 있는 수단을 제공하는 것이다. 앨자(Alza) 펌프와 같은 펌프를 동일 목적으로 사용할 수 있다.
본 발명의 단백질, 특히 더 작은 단편의 면역원성은 면역원성 담체 분자에 가교 결합시키거나 커플링시킴으로써 강화될 수 있다(즉, 숙주 동물에서 면역학적 반응을 독립적으로 유도하는 특징을 가진 거대분자에 본 발명의 단백질 및 단백질 단편을 공유 결합시킬 수 있다). 때때로 작은 단백질 단편이 합텐(항체에 특이적으로 결합할 수 있지만 항체생성은 유도할 수 없는 분자, 즉 면역원성이 아니다)으로서 작용하기 때문에, 가교 결합 또는 담체분자에의 결합이 필요할 수 있다. 면역원성 담체 분자에 이러한 단편을 결합시키는 것은 이 단편을 면역원성으로 만들며, 이는 일반적으로 담체 효과로 공지되어 있다.
적당한 담체 분자에는 예를 들어, 단백질 및 천연 또는 합성 중합체 화합물(예, 폴리펩타이드, 다당류, 리포 다당류 등)이 포함된다. 유용한 담체는 퀼(Quil) A라 불리는 글리코사이드이다[참조; Morein et al., Nature 308:457(1984)]. 단백질 담체 분자가 특히 바람직하고, 여기에는 키홀 림펫(Keyhole limpet) 헤모시아닌, 사람 또는 소의 감마글로불린, 사람, 소 또는 토끼의 혈청 알부민과 같은 포유동물의 혈청 단백질 또는 이러한 단백질의 메틸화된 또는 다른 유도체가 포함되며 이로 제한되지는 않는다. 기타 단백질 담체도 당해 기술의 숙련가들에게 익히 공지되어 있다. 바람직하게는, 반드시 필요한 것은 아니지만, 단백질 담체가 에이메리아 단백질에 대한 항체가 유도되는 숙주 동물에 대해 외래성이 될 것이다.
담체 분자에 대한 공유 커플링은 당해 기술에 공지된 방법으로 수행할 수 있으며, 이의 정확한 선택은 사용되는 담체 분자의 특징에 따른다. 면역원성 담체분자가 단백질인 경우, 본 발명의 단백질 또는 단편은 예를 들어, 디사이클로 헥실카보디이미드와 같은 수용성 카보디이미드 또는 글루타르 알데하이드를 사용하여 커플링시킬 수 있다.
상기의 커플링 시약은 따로 분리된 담체 분자를 사용하지 않고 단백질 및 단편을 그 자신에 가교결합시키는데도 사용될 수 있다. 이러한 단백질 또는 단백질 단편 응집체로의 가교 결합은 면역원성을 증가시킬 수 있다.
유효량의 본 발명의 백신을 투여하는 것은 이.테넬라에 의한 감염으로부터 가금을 보호할 수 있다. 이.테넬라 항원에 대한 모노클로날 항체는 이.아세르불리나 및 이.맥시마(E. maxima)와 시험관 내에서 가교반응하며, 이것은 이러한 종에 대한 보호 반응도 제공될 수 있다는 것을 나타낸다. 단백질 또는 이의 단편의 유효 용량은 에방 접종되 동물 체중 kg당 약 10 내지 약 50㎍의 범위이다. 약 25 내지 50㎍/kg의 용량이 바람직하다. 초기 예방접종 후 바람직하게는 1 내지 수주일 후에 부스터 접종을 수행한다. 다수의 부스터를 투여할 수 있다. 이러한 부스터의 용량은 일반적으로 약 5 내지 50㎍/kg, 바람직하게는 약 20 내지 50㎍/kg의 범위이다. 투여의 표준 경로는 피하, 경피내, 근육내, 경구, 항문 또는 난(ovo)내 투여와 같은 것을 이용할 수 있다.
가금의 면역 시스템에 본 발명의 포자충증 항원을 투여하는 것은, 항원을 암호화하는 유전자를 세균(예, 이.콜라이 또는 살모넬라) 또는 바이러스(예, 폭스바이러스 또는 헤르페스 바이러스)에 클로닝시키고 생 벡터 시스템을 조류에 경구적으로나, 주사하거나, 통상적으로 사용되는 다른 경로에 의해 투여함으로써 수행할 수 있다. 카비트(Carbit)등은 이.콜라이의 사용을 설명하였고[참조; Vaccines, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory, pp. 68-71], 클리멘츠(Clements)는 살모넬라의 사용을 설명하고 있다[참조; Pathol. Immunopathol. Res 6:137(1987)]. 모스(moss) 등은 재조합 폭스 바이러스를 사용한 바이러스 벡터 시스템의 사용을 검토하였다[참조; Ann. Rev. Immunol. 5:306(1987)].
폭스바이러스중 한 종류인 백시니아 바이러스는 세포 배양물 및 동물에서 포자충증 항원의 생성을 시험하는데 사용될 수 있다. 분석적 연구에서, 백시니아 바이러스는 사용될 수 있는 또다른 폭스바이러스 담체인 파울폭스(fowlpox) 바이러스 보다 더 효과적인 것으로 밝혀졌다. 이는 백시니아 바이러스가 조류성 바이러스보다 더 빠르게 증식하고 닭 세포에 제한되지 않는 숙주 범위를 가지기 때문이다. 다량의 이종성 DNA를 바이러스 돌연변이화 및 감염성을 억제하지 않으면서 백시니아 바이러스 게놈에 삽입시킬 수 있다[참조; Smith et al., Gene 25:21(1983)]. 바이러스를 사용한 다수의 이종성 유전자의 삽입 및 발현은 감염된 동물에서 발현된 항원에 대한 항체 생성을 유도한다[참조; Perkus et al., Science 229:981(1985)].
재조합 백시니아 바이러스를 생성하는데 사용되는 기술은 파울폭스 또는 헤르페스 바이러스 시스템에 통상적인 방법에 의해 쉽게 적응시킬 수 있다. 포자충증에 대한 백신에서 담체로서 이러한 재조합 바이러스의 사용은, 예방 접종된 가금이 포자충증 항원과 바이러스 담체 모두에 대한(즉, 이러한 백신은 이중성이다) 면역성을 형성한다는 점에서 특히 유리하다. 이러한 백신의 유용성은 또한 추가의 유전자를 담체 바이러스에 삽입시킴으로써 강화될 수 있다. 예를 들어, 뉴캐슬(Newcastle) 병원성 바이러스 게놈의 일부를 포자충증 항원 유전자와 함께 파울폭스 바이러스에 삽입시킬 수 있고, 이에 의해 단일 백신으로 뉴캐슬 질병, 포자충증 및 파울폭스에 대한 면역성이 부여될 수 있다.
본 발명의 생 벡터 백신의 투여는 선행기술에 공지된 많은 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 파울폭스 바이러스에 대해 가금을 예방접종하는데 통상적으로 사용되는 스틱(stick)방법이 이용될 수 있다. 이 방법은 백신에 담갔던 예리한 바늘을 날갯 가지에 꽂거나 찌르는 것이다. 바늘은 일반적으로 재봉틀 바늘과 같이 끝 가까이에 눈을 가져 백신 방울을 나르는 것이다. 다르게는, 생 백신을 날갯가지 또는 다른 부위에 경피 또는 피하내 주사할 수 있다.
재조합 생 벡터 백신은 또한 식수에 가하거나 예방 접종시킬 병아리에 분무할 수도 있다. 또한 바람직하게는 보호성 캡슐화 후, 사료에 또는 난에 투여할 수 도 있다[참조; Balancou et al., Nature 322:373(1986)]. 후자의 방법에서, 바이러스 백신은 직접 닭의 배에 주사한다[참조; Sharma, Avian Dis 25:1155(1985)].
본 발명은 제5도에 나타낸 아미노산 서열을 갖거나 이의 작용성 등가물인 단백질에 관한 것이다.
본 발명은 제17도에 나타낸 아미노산 서열을 갖거나 이의 작용성 등가물인 단백질에 관한 것이다.
본 발명은 제19도에 나타낸 아미노산 서열을 갖거나 이의 작용성 등가물인 단백질에 관한 것이다.
본 발명은 제21도에 나타낸 아미노산 서열을 갖거나 이의 작용성 등가물인 단백질에 관한 것이다.
본 발명은 제14도에 나타낸 뉴클레오타이드 서열 전체 또는 일부를 포함함을 특징으로 하는 DNA 서열에 관한 것이다.
본 발명은 제16도에 나타낸 뉴클레오타이드 서열 전체 또는 일부를 포함함을 특징으로 하는 DNA 서열에 관한 것이다.
본 발명은 제18도에 나타낸 뉴클레오타이드 서열 전체 또는 일부를 포함함을 특징으로 하는 DNA 서열에 관한 것이다.
본 발명은 제20도에 나타낸 뉴클레오타이드 서열 전체 또는 일부를 포함함을 특징으로 하는 DNA 서열에 관한 것이다.
본 발명은 재조합 벡터가 적합한 숙주 유기체에서 DNA 서열의 발현을 지시할 수 있는 재조합 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 이.콜라이 벡터인 재조합 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 pEV/2-4인 재조합 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 재조합 벡터내에 포함된 겉보기 분자량이 약 28, 37, 120 또는 200킬로달톤 이상이고 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션에 기탁번호 제HB 9707호 내지 제9712호로 기탁된 하나 이상의 모노클로날 항체와 특이적으로 결합하는 에이메리아 표면 항원의 면역반응성 및/또는 항원성 결정소 하나 이상을 갖는 단백질, 제15도에 나타낸 아미노산 서열을 갖거나 이의 작용성 등가물인 단백질, 제17도에 나타낸 아미노산 서열을 갖거나 이의 작용성 등가물인 단백질, 제19도에 나타낸 아미노산 서열을 갖거나 이의 작용성 등가물인 단백질, 또는 제21도에 나타낸 아미노산 서열을 갖거나 이의 작용성 등가물인 단백질의 암호화 DNA 서열을 발현할 수 있는 형질 전환된 숙주 유기체에 관한 것이다.
본 발명은 상술한 단백질에 대해 유도되는 모노클로날 항체에 관한 것이다.
본 발명은 ATCC 제HB 9707호, 제HB 9708호, 제HB 9709호, 제HB 9710호, 제HB 9711호 및 제HB 9712호로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 모노클로날 항체에 관한 것이다.
본 발명은 포자충증에 약한 어린 가축에 겉보기 분자량이 약 28, 37, 120 또는 200킬로달톤 이상이고 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션(ATCC)에 기탁번호 제HB 9707호 내지 제9712호로 기탁된 하나 이상의 모노클로날 항체와 특이적으로 결합하는 에이메리아 표면 항원의 면역반응성 및/또는 항원성 결정소 하나 이상을 갖는 단백질 하나 이상 및 생리학적으로 허용되는 담체를 함유하는 포자충증에 대해 가금을 보호하기 위한 백신 또는 재조합 폭스바이러스 벡터를 함유하는 포자충증에 대해 가금을 보호하기 위한 백신 유효량을 투여함을 특징으로 하여, 포자충증에 대해 가금을 보호하는 방법에 관한 것이다.
[실시예]
다른 명시가 없는한 하기 고체 혼합물 중 고체, 액제 중의 액체 및 액체 중의 고체에 대해 나타낸 %는 각각 wt/wt, vol/vol 및 wt/vol를 기준으로 한다.
1. 에이메리아 항원에 대한 모노클로날 항체의 제조
1.1 기생충 제제
이.테넬라, 이.아세르불리나, 이.브루네티(E. brunetti) 및 이.맥시마의 포자소체를 표준 방법에 의해 포자형성된 난모세포로부터 분리한다. 간단하게는, 포자형성된 난모세포를 증류수 및 20% 표백제로 세척한 다음 증류수로 세척한다. 난모 세포를 조직 분쇄기로 파괴하여 포자를 포함하여 불용성 물질을 원심분리로 회수한다. 펠렛중의 방출된 포자 및 기타 물질을 핸크 염 용액(pH 8)중의 0.25% 트립신 및 닭의 담즙에 재현탁시키고 40℃에서 2시간동안 배양한다. 절단용 용액을 10% 태 송아지 혈청(FBS)을 함유하는 RPMI-1640 배지로 2회 세척하여 제거한 후 pH7.4의 PBS로 2회 세척한다.
포자소체는 메트라지미드 구배상에서 정제한다[참조; Wisher et al., Parasitiology 88:515(1984)]. 간단하게는, 포자소체를 2ml PBS(pH 7.0)에 재현탁시키고 현탁액 1ml를 15ml 메트리자미드 구배에 중층한다. 구배는 PBs(pH 7.0)중의 12%, 18% 및 24% 메트라지미드 각각 5ml로 이루어져 있다. 포자소체는 40분 동안 900xg에서 원심분리하여 침전시킨다. 정제된 포자소체는 18%와 24$ 메트리자미드 사이의 경계면으로부터 튜브의 측면을 통해 21게이지 바늘을 삽입하고 주사기에 포자소체를 흡입시켜 분리한다.
정제된 포자소체를 PBS(pH 7.0)로 3회 세척하고 면역, 감염 연구,125I로 표면 표지화, 면역형광분석 또는 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동[참조; Laemmli Nature 227:680(1970)] 및 웨스턴 블롯팅 연구에 즉시 사용한다.
이.테넬라의 난충은 하기 6.2.3부에 설명되는 것과 같이 분리한다. 정제된 난충은 면역화를 위해 사용하고 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 웨스턴 블롯팅 연구를 위해 라엠리 샘플 완충액으로 용해시킨다.
1.2. 면역화
8마리 암컷 Bal b/c 마우스(Charles River, Wilmington, Mass.)를 하기 계획에 따라 정제된 생 포자소체로 면역시킨다.
Figure kpo00006
각 마우스로부터의 혈청을 정제된 포자소체 단백질을 사용한 ELISA, 용해된 포자소체 단백질을 사용한 웨스턴 블롯팅 분석,125I-표지된 포자소체 표면 단백질의 면역 침전, 및 정제된 포자소체를 사용한 면역형광 분석에 의해 항-포자소체 항체에 대해 시험한다. 가장 높은 포자소체 항체 반응성을 가진 마우스(마우스 107-2)를 융합전 면역 부스터를 위해 선택한다(제1도 참조; 이 항혈청의 ELISA 분석). 5일째에 마우스를 죽이고 비장을 비장 세포 제조를 위해 수득한다.
1.3. 세포 배양 및 세포 융합
융합 2일 전에, 비장세포 공급 세포를 오염되지 않은 마우스로부터 HAT(100μM 하이포크산틴, 0.4μM 아미노프테린 및 16μM 티미딘)가 첨가된 완전 배지[Iscove의 변형된 Dulbecco 배지(IMDM, Gibco):10% FBS, 글루타민(2.0mM) 및 2-머캅토에탄올(100μM) 함유]에서 제조한다. 문헌[참조; de st. Groth et al., J. Immunol. Methods 35:1(1980)]의 방법을 변형시켜 사용하여, 108개의 비장 세포를 108개의 PAI-O 마우스 골수종 세포와 융합한다. 하이브리도마의 제조에 적당한 다른 골수종 세포를 사용할 수 있다. 이러한 많은 골수종 세포는 공지되어 있고 당해 기술의 숙련가에게 입수용이하다.
세포를 혼합하고, 원심분리하여 펠렛화하고 일정하고 조심스럽게 교반하면서 37℃, 1분에 걸쳐 IMDM 중의 35%(vol/vol) 폴리에틸렌 글리콜 1.0ml에 조심스럽게 재현탁한다. 37℃에서 3분간 항온처리한 후 세포를 다시 펠렛화하고 IMDM+HAT 10ml에 조심스럽게 재현탁한다. 세포를 완전 배지+HAT에 1×106개 세포/ml까지 희석하고 완전 배지/ml중 5×105개 비장세포 공급 세포를 함유하는 24-웰 미세역가 플레이트에 분산한다(1ml/웰).
하이브리도마 상등액은 정제된 포자소체를 사용한 ELISA, 포자소체 단백질을 사용한 웨스턴 블롯팅,125I-표지된 포자소체 표면 단백질을 사용한 면역 침전 및 정제된 포자소체 및 포자소체-감염된 세포를 사용한 면역 형광에 의해 항-포자소체 항체에 대해 분석한다. 하이브리도마를 제한 희석하여 클론화한다.
1.4. 포자소체 ELISA
미리 PBS(pH 7.0)중 1% BSA로 차단시킨 96-웰 U-바닥 PVC 플레이트의 각 웰에 정제된 포자소체(4×104개)를 가한다. 포자소체는 5분동안 1000xg에서 원심분리하여 웰의 바닥에 침강시킨다. 포자소체를 희석 항혈청 또는 하이브리도마 상등액 100㎕를 재현탁하고 일정하게 교반시키면서 실온에서 2시간동안 배양한다. 포자소체를 PBS(pH 7.0)중 1% BSA로 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거한다.
포자소체에 결합된 특이적 항체를 검출하기 위하여, 퍼옥시다제-결합된 염소 항-마우스 IgG 100㎕를 재현탁된 포자소체에 가하고, 현탁액을 실온에서 2시간동안 배양한다. 포자소체를 세척하고 결합된 항체를 기질 용액(0.1M 시트레이트 완충액(pH 4.5)중의 0.4mg/ml o-페닐렌디아민, 0.12% 과산화수소)을 실온에서 30분 동안 가하여 가시화한다. 반응은 50mM 나트륨 메타비설파이트를 함유하는 2.5M H2SO4를 가하여 중지시킨다. 결합된 항체량은 기질 색상을 OD488에서 기록하여 결정한다.
세포 융합물을 도말한 총 480개 웰 중 432개는 하이브리도마 성장에 대해 양성이다. 이중 358개 하이브리도마는 1차 포자소체 ELISA에서 항체 생성에 대해 양성으로 시험되었다. 이러한 고유의 모(parental) 하이브리도마 세포의 증식 및 페세지(passage) 동안 104개가 사멸하거나 항체의 생성을 중단하므로 포자소체 ELISA 및 웨스턴 블롯 분석으로 계속 선별하면 음성을 나타낸다. 포자소체 ELISA로 기저치의 10배로 항체를 생성하는 205개의 하이브리도마를 확인하였다.
1.5. 포자소체 단백질의 웨스턴 블롯팅
정제된 포자소체(겔당 ml당 약 5×107개 포자소체)를 라엠리 샘플 완충액에 용해시키고, 12.5% 겔 또는 7.5 내지 20% 구배 겔(라엠리, 상기 참조)에서 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동하여 분리하고 전기영동적으로 니트로셀룰로오즈 쉬트에 옮긴다. 쉬트를 3% 젤라틴 완충액(3% 젤라틴, 트리스-HCl, pH 7.5, 0.15M NaCl)중에 차단시키고, 스트립으로 자른 후, 스트립을 희석된 항혈청 또는 하이브리도마 상등액과 4℃에서 12시간동안 1% BSA 완충액(1% BSA, 50mM 인산나트륨, pH 6.5, 0.5M NaCl, 0.05% 트윈-20)에서 반응시킨다. 이 스트립들을 PBS(pH 7.4), 0.05% 트윈-20으로 세척하고, 특이적으로 결합된 항체를 퍼옥시다제-결합된 항-마우스 항체로 검출한다. 결합된 항체는 기질 용액[4-클로로-1-나프톨(10ml의 빙냉 메탄올 및 50ml의 트리스-HCl(pH 7.5)에 용해시킨 30mg), 0.15M NaCl, 0.015% 최종 농도의 H2O2]을 실온에서 30분동안 가함으로써 가시화한다. 반응은 증류수로 충분히 세척하여 중지시킨다.
포자소체 ELISA에서 양성을 보인 항체 중 160개는 용해된 포자소체 단백질을 사용한 웨스턴 블롯팅 분석에 의해서도 양성이다.
웨스턴 블롯 분석(제2도 참조)은 모노클로날 항체가 3가지 반응패턴 중 하나에 속하는 것으로 나타났다:(a) 단일 에이메리아 단백질과 결합하는 패턴(예, 11A1 및 11D1), (b) 2 또는 3개의 단백질에 결합하는 패턴(예, 6A5 및 20C6), 및 (c) 다수의 단백질에 결합하는 패턴(예, 11A5, 13A6 및 14B5).
항체는 또한 이.테넬라 난충 및 이.아세르불리나 포자소체 단백질을 사용한 웨스턴 블롯 분석에 의해 특징화 된다(제3도). 3A5, 13A6, 7D1 및 20C6을 포함하여 많은 항체가 이.테넬라 및 이.아세르불리나의 포자소체 및 이.테넬라의 난충으로부터 분리된 단백질을 인식한다. 6A5와 같은 다른 항체는 종 및 단계 특이적이고 이.테넬라 포자소체로부터의 단백질에만 결합하는 것으로 나타난다.
몇몇 항체에 대해 수득된 결과의 개요가 표 1에 나타나 있으며, 여기에서 항체의 특이성은 (a) 항체가 결합하는 겔 중의 단백질(들)이 기원 및 크기 및 (b) 항체에 의해 침전된125I-표지된 에이메리아 테넬라 단백질의 크기(우측 컬럼)의 면에서 나타내었다. 표에서 항체는 또한 이소타입에 의해 더욱 특징지워진다.
Figure kpo00007
Spz 및 Mrz는 각각 포자소체 및 난충에 대한 약자이다.
G 및 M은 각각 IgG 및 IgM을 말한다.
m은 항체가 23 내지 200kd 이상의 크기 범위에 속하는 여러 단백질에 결합한다는 것을 가리킨다.
N.D.라고 나타낸 것은 측정하지 않은 것이다.
1.6. I-표지된 포자소체 표면 단백질의 면역침전
정제된 포자소체의 표면 단백질을 IODOGEN 방법(Pierce Chemical Co.) 또는 IODOBEADS(Pierce Chemical Co.)의 사용에 의해 I로 표지한다. 후자의 방법을 위해서는 4 IODOBEADS를 0.2M 인산나트륨(pH 7.5)으로 3회 세척하고 I-Na 1 내지 3mCi를 가한 후 실온에서 5분 동안 배양한다. 200㎕ PBS(pH 7.0)중의 정제된 포자소체(3×10 개)를 반응 바이알에 가하고 15분 동안 계속 배양한다. 배양 말기에 페닐메탄설포닐 플루오라이드(PMSF)를 0.5mM의 최종 농도로 가한다.
배양 혼합물을 30초동안 12,000xg에서 원심분리하여 포자소체를 회수하고 PBS(pH 7.0)중의 1% 트리톤 X-100 또는 2% 나트륨 도데실설페이트(SDS) 1ml에 용해시킨다. 불용성 물질은 3분 동안 12,000xg에서 원심분리하여 제거한다. 용해된 포자소체 단백질은 3,500 분자량 분리막을 사용하여 4℃에서 3ℓ PBS(pH 7.0)에 대해 투석하여 남아 있는 유리 I를 제거한다. I-표지된 포자소체 단백질(전형적으로는 1.5×10 cpm이 단백질에 혼입됨)은 사용할때까지 4℃에서 저장해둔다. TAC 침전 가능한 방사능은 전형적으로는 총 방사능의 95%를 초과한다. I-표지된 포자소체 단백질의 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 분석은 제4도의 좌측 패널에 나타나 있다.
면역 침전은 완충액 I(0.25% NP-40, 10mM 트리스-HCl, pH 7.5, 0.15M NaCl) 중의 I-표지된 포자소체 단백질(1×10 cpm) 250㎕에 하이브리도마 상등액 또는 희석된 항혈청 300㎕를 가함으로써 수행한다. 4℃에서 16시간동안 배양한 후, 아가로즈(sigma Chemical Co.)에 커플링된 염소 항-마우스 IgG의 50% 현탁액 100 내지 200㎕를 가하고, 혼합물을 실온에서 2시간동안 교반 혼합기에서 배양한다. 비드(bead)를 1분동안 12,000xg에서 원심분리하여 펠렛화하고 세척 완충액(0.1% SDS, 0.5% NP-40, 0.2% 나트륨 데옥시콜레이트, 10mM PMSF, 10mM 트리스-HCl, pH 8.5, 0.15M NaCl)으로 3회 세척한다.
고체상 항체에 결합된 I-표지된 단백질을 라엠리 샘플 완충액을 60㎕에 2회 가하고 3분 동안 95℃에서 가열하여 해리 및 변성시킨다. 면역침전된 I-표지된 포자소체 단백질을 12.5% 겔에서 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동하여 분리하고 방사능 사진을 찍어 가시화한다.
면역 마우스 혈청을 이용한 면역침전 검정의 결과는 제4도 우측 패널에 나타나 있다. 포자소체 ELISA에 의해 양성이었던 하이브리도마 항체중 74개가 면역 침전 분석에 의해서도 양성이었다. 제5도에서 보는 바와 같이, 하이브리도마 항체는 단지 하나의 단백질을 침전시키는 것(예, 3C4, 6A5, 7D4, 8A2, 11D2 및 20C6)과 2개 이상의 단백질을 침전시키는 것(예, 12B2, 15A3, 15C4 및 19D6)의 두 범주에 속한다.
1.7. 정제된 포자소체를 이용한 면역형광 분석
포자소체(1×10 개)을 PBS(pH 7.0)에서 8-챔버 슬라이드(Lab Tek)에 가하고 12시간 동안 37℃에서 공기 건조시킨다. 슬라이드를 37℃에서 2시간 동안 10% 정상 염소 혈청으로 차단시킨다. 각 챔버에 희석된 항혈청 또는 하이브리도마 상등액을 가하고 실온에서 2시간동안 배양한다. 슬라이드를 세척하고 로다민-결합된 항-마우스 항체(PBS, pH 7.0, 0.3% 트리톤 X-100으로 희석)를 실온에서 1시간동안 가한다. 슬라이드를 세척한 후, 결합된 항체는 형광에 의해 가시화한다.
대부분 항체는 표면 막 및/또는 공기-건조시킨 포자소체의 굴절체에 대해 특이적 면역형광을 나타낸다(제6도, 패널 A 및 B). 몇몇 항체는 포자소체의 정점을 강하게 염색하고 나머지 포자소체 표면은 단지 연하게 염색한다(제6도, 패널 C). 공기-건조시킨 정제된 포자소체의 출현은 제6도, 패널 A, B, C 및 D의 좌측 슬라이드에서 볼 수 있다. 정제된 포자소체는 온전한 상태의 것으로 신장되었으며, 현저하게 큰 후면 굴절체(PRB) 및 작은 전면 굴절체(ARB)를 보인다. 포자소체의 정점 말단(A)은 후면 굴절체 반대편이다. 온전한 포자(패널 B, 좌측 슬라이드) 및 파괴된 포자막에 의해 제제가 약간 오염되었다.
1.8. ELISA, 웨스턴 블롯, 면역침전 및 면역형광 결과의 개요
상기의 55개 모노클로날 항체의 분석 결과가 표 2에 요약된다.
Figure kpo00008
Figure kpo00009
a. 나타낸 값은 웨스턴 블롯에서 항체에 의해 인식된 이.테넬라 포자소체(Spz) 단백질 또는 40-15kd(M ), 120 및 80-150kd(M ) 및 25 및 40-150kd(M )의 분자량을 가진 인식된 단백질 그룹의 분자량이다.
b. 웨스턴 블롯 분석을 이.테넬라 포자소체(Spz) 단백질의 통상적인 양의 1/5를 사용하여 수행한 것이다. 따라서 양성반응을 보인 항체의 친화성이 보다 크다.
c. 웨스턴 블롯 반응성을 이.아세르불리나 포자소체(Spz) 단백질에 대하여 나타낸 것이다.
d. 웨스턴 블롯 반응성을 이.테넬라 난충(Mz) 단백질에 대하여 나타낸 것이다.
e. 면역형광 검정(IFA) 염색 패턴 결과는 (1) 표면, (2) 정점, (3) 패치 표면, (4) 선명한 표면, (5) 엷은 표면, (6) 확산된 표면, (7) 굴절체 및 (8) 작은 반점 염색과 같은, 공기-건조시킨 이.테넬라 포자소체의 간접적 검정에 대한 요약이다.
f. 면역 침전에서 항체에 의해 포착된 I-표지된 이.테넬라 포자소체 단백질의 분자량을 나타낸다.
바람직한 모노클로날 항체 7D4, 7D1, 20C6, 8A2, 6A5 및 7B2는 이들 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마 세포의 형태로 부다페스트 조약하에 1988년 5월 5일자로 각각 기탁번호 제HB 9707호, 제HB 9708호, 제HB 9709호, 제HB 9710호, 제HB 9711호 및 제HB 9712호로 미합중국 매릴랜드 록크빌 파크론 드라이브 12301에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에 기탁되어 있다.
1.9. 시험관내 감염 분석
닭의 주요 신장 상피세포를 문헌[참조:Doran et al., J. Protozool. 25:544(1978)]에 따라 설정하고 4-챔버 랩-텍 슬라이드에서 유착도가 40 내지 50%가 될때까지 성장시킨다. MDBK(Madin-Darby 소 신장) 세포(ATCC-CCl 22) 또한 닭의 신장 상피세포 대신에 사용한다.
세포를 50,000개 또는 200,000개의 정제된 포자소체로 접종한다. 감염 16시간 후, 세포 단층을 수회 세척하여 세포에 침투되지 않은 포자소체를 제거한다. 전형적인 접종된 세포 배양액을 감염후 3, 16, 24, 48, 64, 96 및 120시간에서 100% 메탄올중에서 고정시킨다(실온에서 5분동안). 고정된 슬라이드를 상술된 바와 같은 면역 형광법을 진행하기전까지 4℃, PBS(pH 7.0)중의 1% BSA중에 저장한다. 여러가지 항체로 수득된 염색 패턴은 제7도에 나타나 있다.
감염후 3 내지 24시간 사이에, 고정된 배양액에는 세포내 포자소체가 나타났다(제7도, 3시간에서의 7D4 및 19시간에서의 8A2). 시간이 경과한 후, 포자소체는 굴절체로 퇴화된다(7D4, 60시간). 세포내 포자소체의 표면 및 정점은 항체 7D4(제7도, 3시간에서 7D4)로 뚜렷하게 염색되나, 항체는 감염된 세포의 표면을 염색시키지 않는다.
24시간 후에 포자소체는 퇴화되기 시작하여 다음 48시간 동안에 성숙한 열층이 된다. 항체 7D4는 퇴화되는 포자소체와는 계속 반응하지만 미성숙된 열충과는 반응하지 않는다(제7도, 7D4, 60시간). 열충이 성숙되었을대, 7D4는 열충내의 구조물과 반응하기 시작한다(제7도, 7D4, 100시간). 이들 구조물이 발생중인 난충이고, 항체 7D4는 성숙한 방출 난충의 표면 항원과 반응을 계속한다(제7도, 7D4, 120시간).
따라서, 7D4는 이.테넬라 포자소체 및 난충에 존재하는 120kd의 막 항원을 확인한다. 이 항원은 미성숙된 난충이 열충내에서 성숙되기까지는 기생충 발생의 열충단계 동안에는 발현되지 않는다.
항체 14B1은 세포내 포자소체의 표면 및 정점을 염색시키고(제8도, 14B1, 16시간), 세포내 포자소체에 바로 인접한 세포질을 확산 염색시키는 항체 7D4의 반응성과 유사한 패턴을 나타낸다. 14B1에 의해 인식된 항원은 성숙된 열충내의 미성숙된 난충의 정점(제8도, 14B1, 100시간) 및 성숙되어 방출된 난충의 정점(제8도, 14B1, 120시간)에 존재한다.
항체 7D4 및 14B1에 의해 나타난 염색 패턴은 유사하나, 이들 항체가 인식한 단백질은 분자량이 각각 약 120 및 6kd으로 분자량이 매우 다르다.
항체 7D4 및 14B1은 기생충 발생의 대부분의 단계와 반응하나, 다른 항체는 표면 항원(제7도, 15A3)과만 반응하거나 세포내 포자소체의 굴절체(제7도, 7A2)와만 반응하며 기생충의 열충 또는 난충 단계와는 반응하지 않는다.
2개의 독특한 항체 8A2 및 19D6은 감염분석으로 확인된다. 항체 8A2는 발생중인 열충의 모든 단계(제7c도, 8A2, 120시간)에서, 포자소체의 표면(제7c도, 8A2, 19시간) 및 방출된 난충의 표면(제7c도, 8A2, 120시간)상에 존재하는 37kd 단백질과 반응한다. 항체 7D4 및 14B1에 의해 인식된 단백질과 달리, 37kd의 단백질은 기생충의 세포내 성장을 통해 합성된다.
항체 19D6은 180kd의 포자소체 표면 단백질 뿐만 아니라 포자소체-감염된 세포의 세포질의 단백질과도 반응한다(제8도, 19D6, 3시간). 항체 19D6에 의해 인식된 세포질 단백질은 단백질이 미성숙된 열충 발생단계 동안에는 나타나지 않고 성숙된 열충 및 방출된 난충에서 다시 나타나기 때문에, 세포 감염후 포자소체에 의해 발산된다(제8b도, 19D6, 120시간).
이.테넬라 감염후 생존하는 닭의 혈청 항체는 항체 7D4의 염색 패턴과 유사한 패턴으로 세포내 포자소체의 정점 및 표면(제8b도, 면역병아리 혈청, 3시간)을 염색시키나, 세포내의 포자소체의 굴절체는 염색시키지 않는다.
포자소체-감염된 닭의 신장 세포를 이용한 면역형광 연구는 (a) 포자소체에 특이적이고(예; 항체 7B2 및 6A5에 의해 인식된 200 이상 및 28kd 단백질), (b) 세포내 기생충의 모든 단계에서 발견되며(예:8A2에 의해 인식된 37kd의 단백질) (c) 포자소체 및 난충에 대해 특이적이나 열충에 대해 비특이적인(예:각각, 항체 7D4 및 14B1에 의해 인식된 120 및 6kd의 단백질) 항원을 확인한다.
1.10. 시험관내 포자소체 중화검정
문헌[참조:Schmatz et al., J. Protozool. 33:109(1986)]의 방법을 변형함에 있어서, MDBK 세포를 트립신분해시키고 7.5×10 개 세포/ml의 밀도로 1% FBS를 보충한 최소 필수 배지(Gibco) 중에 현탁시킨다. 미세역가 플레이트의 각 웰(조직 배양액 처리된 96-웰)에, 1.5×10 개의 세포를 첨가하고 40℃에서 48시간동안 배양한다. 정제된 포자소체를 40℃에서 1시간동안 항체로 전처리하거나 세포 단층을 감염시키기 전에 비처리된 상태로 남겨둔다. 항체(조직 배양 상등액, 복수체액 또는 항 혈청)를 PBS(pH 7.0)에 대해 강하게 투석시키고, 56℃에서 30분 동안 열불활성화시킨 다음 사용하기 전에 멸균 여과시킨다.
감염 직후에, [5,6]- H-우라실을 모든 웰에 가해 최종 농도 5μCi/ml을 수득한다. 감염 19시간후에, 배지를 제거하고 배양액을 PBS로 1회 세척한다. 세포를 40℃에서 15분동안 트립신-EDTA를 사용하여 방출시킨 다음 유리 섬유 필터상에서 수거한다. 필터를 건조시키고, 섬광유체(READY-SOLV
Figure kpo00010
, New England Nuclear)에 넣은 다음 결합된 방사능을 계수한다. 포자소체 침투 억제 및/또는 포자소체 발생을 억제하는 항체의 능력을, 항체 처리된 포자소체로 감염된 세포와 비교하여, 비처리된 포자소체로 감염된 세포내로 혼입된 방사능으로 측정한다.
포자소체는 또한 대조 항체, 완충액 또는 라살로시드, 포자소체 정균제로 전처리한다. 라살로시드는 MDBK 세포내의 포자소체의 발생을 완전히 차단하고3H-우라실의 혼입을 크게 감소시킨다.
결과는 제9도에 기재되어 있으며, 항체 7D4(□), 8A2(○) 및 14B1(●)은 감염된 MDBK 배양액 내로3H-우리딘의 혼입을 크게 억제함을 알 수 있다. 항체 6A5(■)은 덜 효과적이나 다소의 억제를 나타낸다. 완충액(△) 및 대조 항체(×)로 처리되는 경우 억제하지 못한다. 반면 라살로시드(*)는 실질적으로 완전히 억제한다.
2. cDNA 발현 라이브러리의 작제
2.1. 포자형성 난모세포의 제조
조류당 50,000개의 이.테넬라 포자형성된 난모 세포로 경구접종한 7일후에 3주된 병아리(Hubbard Cross:Avian Services, Frenchtown, New Jersey, U.S.A.)의 맹장을 꺼내어 워링(Waring) 블랜더내에서 1분동안 분쇄한다. 증류수를 사용하여 용적이 1ℓ가 되게 조정하고, 펩신(Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, U.S.A.)을 3g/ℓ까지 가한다. 농 HCl을 사용하여 pH를 2.0으로 조정하고, 혼합물을 배양하고 39℃에서 2 내지 3시간 동안 또는 단일 난모세포 현탁액이 관측될때까지 교반시킨다. 분해시킨 후, 10N NaOH를 사용하여 pH 8.0까지 조정하고, 증류수 3ℓ를 가한다. 혼합물을 밤새 방치한다. 그후 상등액을 제거하고 침전물을 상등액이 투명해질때까지 물로 세척한다. 실온에서 증류수중의 현탁액에 공기를 버블링시킴으로써 난모세포를 포자형성시킨다. RNA 제조를 위해 24시간 후에 포자형성을 종결시킨다.
2.2. 포자 형성 난모세포 mRNA의 분리
총 RNA를 문헌[참조문헌:Maniatis et al., 상기 참조 page 196]에 기술된 구아니디늄/세슘 클로라이드의 방법을 변형하여 제조한다. 난모세포를 PBS(0.15M NaCl, 20mM 인산나트륨, pH 7.9)로 세척하고 소포제 A(Union Carbide, Danbury, Connecticut U.S.A.) 또는 바람직하게는 또다른 소포제 5㎕와 함께 5M 구아니디늄 이소티오시아네이트, 50mM 트리스-Hcl, 10mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 0.5% 사르코실(Sarkosyl)(나트륨 N-라우로일 사르코신, Sigma Chemical Co.) 및 0.1M β-머캅토에탄올(pH 7.4)를 함유하는 용액 10ml중에서 온화한 볼텍스 혼합으로 재현탁시킨다. 세포 현탁액을 난모세포 파괴가 현미경적으로 관측될때까지 마쇄시킨다.
불용성 세포 파편을 저속 원리분리로 제거하고, 마쇄물을 4개의 분취액으로 나누고 12ml 폴리카보네이트 튜브에서 5.7M CsCl, 0.1M EDTA(pH 7.5) 1.2ml상에 층을 입힌다. 튜브를 Beckman SW 50.1로터 내에서 40,000rpm으로 15℃, 17시간 동안 원심분리시킨다. 상등액을 경사분리하고, 튜브의 벽을 건조시킨 다음, 펠릿을 프로테인아제 K(Proteinase K:Boehringer Mannheim) 200ug/ml을 사용하여 10mM 트리스-HCl, 1mM EDTA, 1% 나트륨 도데실 설페이트(SDS)(pH7.5) 1.25ml중에 재현탁시킨다. 37℃에서 30분동안 배양한 후, 용액을 페놀로 3회 추출한다. 최종 수상내의 RNA를 에탄올로 3회 침전시킨 다음 물 1ml중에 용해시킨다.
폴리아데닐화된[폴리(A)+] RNA는 무넌[참조:Maniatis et al., 상기 참조, page 197]에 기술된 올리고(dT)-셀룰로우즈 컬럼(Pharmacia Fine Chemicals)상에서 약 2mg의 총 RNA를 2회 통과시켜 제조한다. 폴리(A)+RNA를 에탄올을 사용하여 2회 침전시키고 물 200㎕ 중에 용해시킨다. 260nm에서의 흡광도로 측정된 수율은 약 25ug이다.
2.3. 난충의 제조방법
이.테넬라의 난충은 조류당 상기 포자형성 난모 세포 50000개로 감염시킨지 5일후 감염된 닭(3주된 Hubbard Cross:Avian Services, Frenchtown NJ) 50마리의 맹장으로부터 수득한다. 맹장을 꺼내고 자기 교반기상에서 인산염 염수(PBS)를 사용하여 15분동안 세척한다. 상피 파편을 저속 원심분리(50xg)로 부분적으로 제거하고 조 난충을 2000xg, 4℃에서 10분 동안 원심분리로 회수한다. 펠렛을 용해 완충액(8.29g/ℓ NH4Cl, 0.372g/ℓ, Na2EDTA, 1.0g/ℓ KCO3, pH 7.6)중에 재현탁시키고 얼음상에서 30분동안 배양한다. 난충을 원심분리로 수집하고, PBS중에서 1회 세척한 다음, 분액 깔대기 내에서 1.0g의 스펀 나일론 섬유(Scrub Nylon Fiber. Fenwall Laboratories, Deerfield, Illinois, U.S.A.)를 함유하는 컬럼상에 통과시킨다. 난충을 원심분리로 수거하고 RNA를 분리하기 위하여 드라이아이스상에서 동결시키거나, 웨스턴 블롯 분석을 위하여 디에틸아미노 에틸 셀룰로우즈(DEAE, Whatman DE 52, Whatman, Clifton, New Jersey, U.S.A.)에서 더 정제한다.
DEAE 셀룰로우즈에서 정제하기 위하여, 약 1×109개의 난충을 PBS 중에서 10ml 베드 용적 컬럼에 적용하고 PBS를 사용하여 용출시킨다. 난충을 필수적으로 적혈구 세포 및 다른 세포파편이 없는, 최초 유출물(flow-through) 100ml중에서 회수한다.
2.4. 난충 mRNA의 분리
1×109내지 1×1010개의 유기체를 함유하는 동결된 난충 펠릿을 1mM의 디티오 트레이톨(DTT) 및 300단위의 RN 아신(Promega Biotec, Madison, Wisconsin, U.S.A.)을 함유하는 10ml의 TEL/SDS 완충액(0.2M 트리스 HCl, 0.1M LiCl, 25mM EDTA, 1%(w/v) 나트륨 도데실 설페이트(SDS), pH 8.8)중에 해동시키고 테플론-피복된 조직 마쇄기중에서 10 내지 12스트로크로 마쇄시킨다. 불용성 파편을 3,000xg에서 냉원심분리로 분리한다. 상등액을 TEL 완충액으로 평형시킨 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올(24:24:1, v/v)을 사용하여 2회 추출한다.
수상을 37℃에서 30분동안 100ug/ml의 프로테인아제 K를 사용하여 절단하고 등용적의 페놀:클로로포름(1:1)을 사용하여 재추출하며, 헥산올 2용적의 에탄올을 사용하여 드라이아이스상에서 1시간 동안, 또는 -20℃에서 밤새 침전시킨다. 10,000xg에서 1시간 동안 원심분리한 후에, 펠렛을 TE(10mM 트리스, pH 7.5, 2mM EDTA)중에 재현탁시키고 15℃, 20시간 동안 150,000xdg에서 4ml CsCl 쿠션을 통하여 회전시킨다. RNA 펠렛을 2.5용적의 에탄올을 사용하여 0.2M 칼륨 아세테이트로 부터 재침전시킨다. 문헌[참조:Maniatis, 상기 참조, page 197]에 기술된 바와 같이, 모든 RNA를 올리고-dt 셀룰로오즈 상에 1회 통과시켜 폴리(A)+RNA를 농축시킨다. 5×109개의 난충으로부터 전형적으로 수득되는 총 RNA 1.9mg에는 약 20㎍의 폴리(A)+RNA가 함유되어 있다.
2.5. 난모세포 및 난충 cDNAs의 합성 및 파아지 벡터로의 삽입
문헌[참조:Gubler et al., Gene 25:263(1983)]에 기술된 바와 같이 역전사 효소(BRL)를 사용하여 올리고(dT) 프라이머로부터 확장시키고 RNase H(BRL) 및 이.콜라이 DNA 폴리머라제 I(New England Biolabs)를 사용하여 상보적인 쇄를 합성하여, 6ug의 포자형성 난모세포 폴리(A)+RNA로부터 이본쇄 cDNA를 합성한다. 이본쇄 cDNA를 T4 DNA 폴리머라제(BRL)을 사용하여 평활말단을 형성하고, 제조 프로토콜에 따라 EcoRI 메틸라아제(New England Biolabs)로 처리한 후 EcoRI 링커(GGAATTCC, Collaborative Research)를 가한다.
이같이 제조된 cDNA를 EcoRI으로 절단한 후, 문헌[참조:Huynh et al., D. Glover(ed., DNA Cloning Vol. I; A Practical Approach, 1985, IRL Press, Washington, D.C., pp. 49-78]에 따라 라이브러리를 λgt 11[Stratagene Cloning Systems, San Diego, California, U.S.A.]에서 제조한다. EcoRI cDNA 단편을, EcoRI 분해되고 탈인산화된 λgt 11 암(Stratagene Cloning Systems)에 결합하고 생성된 DNA를 제조 프로토콜에 따라 Gigapack
Figure kpo00011
키트(Stratagene Cloning Systems)를 사용하여 파아지내로 팩키징한다.
생성된 라이브러리를 Y1088 숙주 세포(ATCC 제37195호) 상에 도말함으로써 증폭시킨다. 제조합율 %는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG, Sigma Chemical Co.)의 존재하에 X-갈 플레이트상에서 청색 대 무색 플라크의 비로부터 측정하면 약 90%이다.
난충 폴리 (A)+RNA의 이본쇄 cDNA 복사물을 기본적으로는 상술된 바와 같이 합성한다. 라이브러리의 작제시 사용된 이본쇄 cDNA는 변성 겔에서의 이동[참조:Bailey et al., Anal. Biochem. 70:75(1976)]으로 판단된 바와 같이, 약 200 내지 4,500개의 염기쌍을 함유한다.
난충 cDNA는 메틸화되고 CCGAATTCGG 링커(Collaborative Research)를 사용하는 것을 제외하고는 문헌에 기재된 바와 같이 EcoRI 링커에 결합된다. EcoRI를 사용하여 절단한 후, cDNA를 바이오겔 A-50M에서 분획화하여 Huynh 등에 의해 기술된 바와 같이, 과량의 링커 분자 및 약 300염기쌍보다 작은 cDNA를 제거한다.
cDNA를 λgt 11암에 결합시키고, DNA를 상술한 바와 같이 파아지내에 팩키징한다. 약 50,000개의 파아지를 함유하는, 생성된 라이브러리를 Y1088 숙주 세포상에 도말시킴으로써 증폭시킨다. IPTG의 존재하에 X-갈 플레이트 상에서의 플라크 분석하면 약 90%가 재조합체라는 것이 나타난다.
3. cDNA 라이브러리의 면역학적 선별법
λgt 11 난충 cDNA 발현 라이브러리를 150mm 플레이트당 플라크 약 10,000개의 밀도로 Y1090 세포(ATCC 제37197호)상에 도말한다. 이러한 플레이트 6개를 42℃에서 3.5시간동안 배양하고, 먼저 10mM IPTG에 담근 니트로셀룰로오즈 필터로 중층하여 β-갈락토시다제 융합 단백질의 발현을 유도한 다음, 37℃에서 추가의 4 내지 5시간 내지 밤새 배양한다. 필터를 플레이트로부터 제거하고 TBS(20mM 트리스, pH 8.0, 0.15M NaCl)를 사용하여 배치식으로 수회 세척한다. 비특이적 단백질 결합 부위는 4℃에서 회전 진탕기상에서 TBS중의 20% 태송아지 혈청(FCS)중에서 2 내지 4시간 동안 배양시킴으로써 차단된다.
난충 항원과 반응하는 것으로 공지된 9개의 모노클로날 항체(7D4, 7D1, 20C6, 13A6, 20C1, 11B6, 3A5, 13A1 및 15B2로 표기됨)를 위해 복수를 모으고, 최종 용적이 100ml이 될때까지 20% FCS 및 0.15M NaCl을 가한 다음 페트리디쉬 내의 각각 필터(2개/접시)에 적용시킨다. 필터를 1차 모노클로날 항체 풀(pool)과 함께 4℃의 회전 진탕기상에서 밤새 배양한다. 비결합된 항체를 필터를 실온에서 TBS를 사용하여 5 내지 6회 세척함으로써 제거한다. 결합된 항체는 필터를 염소 항-마우스 양고추냉이 퍼옥시다제(HPOD) 결합체(Boehringer Mannheim)와 배양시키고 문헌[참조:Hawkes et al., Anal. Biochem. 119:142(1982)]에 기술된 바와 같이 3mg/ml 4-클로로-1-나프톨(Bio Rad) 및 0.018% H2O2를 사용하여 발색시킴으로써 검출한다.
초기 고밀도 선별법에서 확인된 양성 플라크를 동일한 모노클로날 항체 풀을 사용하여 제2의 선별법으로 플라크 정제한다. 각각의 양성 플라크를, 다수의 그리드 배열에 도말하고, 이들 각각을 IPTG로 유도시키고, 니트로 셀룰로우즈에 이동시키고 풀로부터의 모노클로날중 하나와 배양 시킴으로써, 풀로부터의 개개의 모노 클로날로 할당한다. 풀의 8개의 항체중 세개의 항체, 항체 7D1, 7D4 및 20C6에 의해 인식된 λm 2-4로 표기된 1개의 양성 파아지를 확인한다.
항체 6A5, 7B2, 15A3 및 20C6을 함유하는 모노클로날 항체의 풀을 초기 선별에 사용하고; 7B2, 15A3, 20C6 및 8A2를 함유하는 모노클로날 항체의 풀을 제2의 선별에 사용하며; 15A3, 7B2 및 20C6을 함유하는 모노클로날 항체의 풀을 제3의 선별에 사용하고 배양 완충액이 0.05% 트윈-20[폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우레이트]를 함유한다는 것을 제외하고는, 유사한 방법을 사용하여 포자형성 난모세포 cDNA 라이브러리를 선별한다. 이 방법에서, 플라크는 λS 1-3, λS 1-4 및 λS 1-7; λS 2-1, λS 2-4 및 λS 2-5로 표기하고; 각각의 모노클로날 항체 6A5, 8A2및 7B2에 의해 인식된 λS 3-1가 난모세포 cDNA 라이브러리에서 확인된다. 6A5 항체와 반응하는 단백질을 형성하는 파아지로부터 제조된 DNA는 EcoRI를 사용하여 절단하고 아가로즈 겔에서 전기영동시킴으로써 분석된다[참조:Maniatis et al., 상기 참조, page 150]. 따라서 크기가 약 1150, 890 및 615bp인 3개의 다른 삽입물이 수득된다.
4. 이.콜라이에서 에이메리아 유전자의 발현
파아지 λS 1-7 및 λS 1-3 각각의 1.1kb 및 0.9kb의 EcoRI DNA 분자를 분리하고, 문헌[참조:Crowl et al., Gene 38:31(1985)]에 기술된 바와 같이 작제한, 3개의 여러가지 리딩 프레임 발현 벡터, pEV-vrf 1, pEV-vrf 2 및 pEV-vrf 3 각각의 EcoRI 부위내에 삽입한다. 가능한 두 배향으로 삽입물을 함유하는 플라즈미드는 문헌[참조:Mandel et al., J. Mol. Biol. 53:159(1970)]에 기술된 바와 같이 문헌[참조:Bernard et al., Methods in Enzymology 64:482(1979)]에 기술된 적합한 플라즈미드 pRK 248 cIts를 함유하는 이.콜라이 균주 MC 1061내에 형질전환시킨다. 균주 MC1061 및 플라즈미드 pRK 248 cIts는 각각 기탁번호 ATCC 제53338호 및 제33766호로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁되어 있다.
세균 형질전환체는 30℃에서 0.5% 글루코즈 및 0.5% 카사미노산을 함유하는 M9 배지[참조:Maniatis et al., 상기 참조, page 68]에서 성장시키고 Crowl 등의 문헌에서 기술된 바와 같이 흡광도(550mμ) 0.5에서 42℃로 변화시켜 λPL프로모터에서 전사를 유도한다. 2 내지 3시간 동안 배양한 후, 1ml의 샘플을 취하고, 샘플중의 세포를 원심분리로 수집한다. 세포 펠렛을 Crowl 등의 문헌에서 기술된 바와 같이 처리하고 용해물을 문헌[참조:Laemmli, Nature 227:680(1970)]에 기술한 바와 같이 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동시킨다. 전기영동시킨 후, 겔 중의 단백질을 쿠마시(Coomassie) 브릴런트 블루로 염색하거나 6A5 모노클로날 항체 및 검출용 염소 항-마우스 HPOD 결합제를 사용하면서 웨스턴 블롯 분석[참조:Towbin et al., Proc. Natal. Acad. Sci. USA 76:4350(1979):Burnetti, Anal. Biochem. 112:195(1981)]을 위해 니트로셀룰로오즈막에 이동시킨다.
벡터 pEV-vrf1에 한방향으로 삽입된 0.9kb cDNA분자가 6A5 항체와 반응하는 20kd의 단백질을 생성한다는 것이 이 분석으로 밝혀졌다. 1.1kb 분자는 발현되지 않은 것으로 관찰되었는데 이는 5' 비암호화 서열을 함유하기 때문일 것이다. 여러가지 발현 배지를 조사하여 본 단백질의 수율을 최적화한다. 바람직한 배지는 ℓ당(±10%) 6.0g KH2PO4, 4.0g K2HPO4, 5.0g(NH4)2SO4, 3.5g MgSO4-7H2O, 21.0g 효모 추출물, 3.5g 박토 트립톤, 1.0ml LB 625 소포제, 25g 글루코우즈, 70mg 티아민-HCl, 2.5ml 비타민 용액[GIBCO MEM(100X) 비타민 용액] 및 1.0ml 미량 원소를 함유하는 것으로 밝혀졌다. LB625 소포제(Union Carbide)는 37.8℃에서 점도가 625세이볼트 유니버살 세컨드(Saybolt Universal Second)인 에틸렌과 폴리프로필렌 옥사이드의 선형 중합체이다.
발효 육즙 1ℓ당 포함된 비타민은 각각 0.25mg D-Ca 판토테네이트, 콜린클로라이드, 폴산, 니코틴이미드, 피리독살-HCl 및 추가의 티아민-HCl; 0.50mg의 i-이노시톨; 및 0.025mg의 리보플라빈이다. 육즙 1ℓ당 포함된 미량원소는 2.7mg의 FeCl3-6H2O, 각각 0.8mg의 ZnSO4-7H2O 및 CuSO4-5H2O, 각각 0.7mg의 CoCl2-6H2O 및 Na2MoO4-2H2O, 0.2mg의 H3BO3및 0.5mg의 MnSO4-H2O이다.
파아지 λm 2-4에 의해 발현된 면역반응성 단백질의 특성은 먼저 허용되는 온도(30℃) 및 허용되지 않는 온도(42℃)에서 차별 성장시킨 감염된 Y1090 세포로부터 분리된 라이소겐에서 조사한다. 라이소겐에 의해 합성된 단백질의 웨스턴 블롯 분석을 위하여, 50ml의 배양액을 30℃에서 LB 배지[참조:Maniatis et al., 상기 참조, page 69]주에서 배양시켜 흡광도(550mμ)가 0.5가 되게 하고, 42℃로 온도를 올려 파아지의 복제를 유도한다. 42℃에서 15분후에, IPTG를 10mM이 되기까지 가하고, 37℃에서 30분동안 지속적으로 배양시킨다. 세포를 4℃에서 원심분리시켜 수득하고 라엠리 샘플 완충액[0.125M 트리스, pH 6.8, 1%(w/v)SDS, 1.4M β-머캅토에탄올, 0.01% 브로모페놀블루(w/v), 20%(v/v) 글리세롤]중에서 5분동안 비등시킴으로써 용해시킨다.
배양액 1.0ml을 12.5% SDS-폴리아크릴아미드 겔중에서 전기영동시켜 분리하고 전기영동적으로 니트로셀룰로오즈에 이동시키고 상술한 바와 같이 λm 2-4 파아지를 확인하는 세개의 모노클로날 항체(7D1, 7D4 및 20C6)의 풀을 사용하여 조사한다. 웨스턴 블롯의 전개시 유도된 라이소겐에 존재하는 크기가 150kd 이상인 융합 단백질을 보인다(제10도, 패널 B, 레인 2). β-갈락토시다제에 특이적인 항체가 또한 이러한 고분자량 단백질과 반응하고, β-갈락토시다제 단독의 예상된 크기인 약 114kd의 단백질에 반응한다(제10도, 패널 A, 레인 2).
파아지 λm 2-4 DNA는 EcoRI으로 절단되어 1.7kb의 DNA 분자를 생성한다. 이 분자를 플라즈미드 pEV-vre 1, 2 및 3[참조:Crowl et al., 상기 참조]를 함유하는 EcoRI-선형화된 플라즈미드 풀내에 아클론시켜, 상술된 바와 같이, 플라즈미드 pRK 248 cITs를 함유하는 이.콜라이 균주 MC1061을 형질전환시킨다. 형질전환체를 λm 2-4 라이소겐중에서 융합 단백질과 반응하는 것으로 공지된 3개의 모노클로날 항체의 풀을 사용하여, 온도 유도에 따른 면역반응성 단백질의 발현에 대해 선별한다. 면역반응성 재조합 단백질은 풀로부터의 3개의 모노클로날 항체중 하나인 7D4를 사용하여, 이.콜라이 용해물의 웨스턴 블롯 분석에 의해 특성화된다. 양성 콜로니 각각은 기대되는 1.7kb 삽입물을 가진 플라즈미드 DNA를 함유하며, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동분석으로 측정하면 유도시 약 65kd의 단백질의 합성을 지시한다는 것이 밝혀졌다.
이러한 65kd 단백질의 발현은 성장배지 및 유도 프로토콜에 있어서의 변화에 비교적 덜 민감하다는 것이 밝혀졌다. 단백질은 세포 펠렛을 음파 분쇄시킨 후 상등액 중에서 정량적으로 회수된다.
1.7kb 삽입물을 함유하는 발현 플라즈미드는 재조합 단백질의 연속한 합성에 사용되고 제11도에 도식적으로 기재되어 있다. 이 플라즈미드는 λcI 857[문헌(Arber et al., Cold Spring Harbor Monograph, Lambda II, 1983, Hendrix et al., Eds., Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, p. 450)에 기술된 파아지 라이소겐의 형성을 위한 표준 방법을 사용하여 제조됨]에 대해 용균성인 MC1061 숙주세포내에서 30℃에서 증식되어 플라즈미드내의 PL프로모터의 억제 상태를 유지시킨다.
유사한 방법을 사용하여, 약 1.1kb의 포자형성 난모세포 cDNA 단편에 의해 암호화된 28kd의 단백질의 발현을 수행한다. 이 단백질은 모노클로날 항체 8A2에 특이적으로 결합한다. 또한, 약 1.2kb의 포자형성 난모세포 cDNA에 의해 암호화된 45kd 단백질의 발현을 수행한다. 이 단백질은 모노클로날 항체 7B2에 특이적으로 결합한다.
5. DNA 서열 분석
일반적으로, 밤새 배양한 포화 배양액 1ml로부터 플라즈미드 DNA를 소규모로 분리하는 것은 문헌[참조:Birnboim et al., Nucleic Acids Research 7:1513(1979)]의 방법을 사용하여 수행한다. 이 방법은 분석 목적으로 세균 콜로니로 부터 소량의 DNA를 분리하는 것을 허용한다. 대량의 플라즈미드 DNA를 세슘 클로라이드 원심분리를 이용하여 표준 프로토콜에 따라 1ℓ 배양액을 사용하여 제조한다[참조:Maniatis et al., 상기 참조, page 93].
포자형성 난모세포 라이브러리의 cDNA의 DNA 서열은 문헌[참조:Maxam et al., Methods in Enzymology 65:499(1980)]에 따른 화학적 절단 방법 및 문헌[참조:Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463(1977), 이본쇄 플라즈미드 DNA에 대한 변형:Smith et al., Cell 16:753(1979) and Wallace et al., Gene 16:21(1981)]에 따른 쇄-말단화 방법으로 측정한다. 쇄 말단 프로토콜에서, 7-데아자-dGTP[참조:Berr et al., BioTechniques 4:428(1986)]를 dGTP 대신으로 치환하여 G-C 압축물질을 제거한다.
서열분석을 용이하게 하기 위해, λS1-7로부터의 1.1kb의 EcoRI 분자를 pEV-vrf3의 EcoRI 부위 다음에 폴리링커를 갖는 플라즈미드 pEV 3-SEQ로 옮긴다(제12도). 이 폴리링커는 BamHI 및 KpnI 부위에서 플라즈미드를 선형화하는데 사용하여, 엔도뉴클레아제 III로 일방향 결실물을 생성한다[참조:Henikoff, Gene 28:351(1984)]. 폴리링커내의 XbaI 부위는 결실물의 막삼-길버트 서열화를 위해 3'-말단 표지화에 사용되고, 프라이머 CGGTCGACTCGAGCCA는 생거(Snager) 서열화에 사용된다. 이 프라이머는 문헌[참조:Maniatis et al., 상기 참조, page 122]에 기술된 바와 같이 [γ-32P]ATP(ICN) 및 폴리뉴클레오타이드 키나제를 사용하여 이의 5' 말단에서32P 표지한다.
제13도는 막삼-길버트 서열화에 사용되는 1.1kb의 EcoRI 분자의 제한부위를 나타낸다. 0.9kb 분자내의 EcoRI 부위의 위치도 나타나있다. 엑소뉴클레아제 III로 수행한 결실물의 말단점 또한 나타나있다. 이들은 마감-길버트 방법에 의해 pEV 3-SEQ 폴리 링커내의 XbaI 부위로부터 또는 생거 방법에 의해 프라이머 연장으로(제12도) 서열화된다. 전체 cDNA 쇄 둘다를 이들 방법중 하나 또는 둘다를 사용하여 서열화한다. DNA의 높은 G-C 함량에 의해, 막삼-길버트 반응물은 8% 및 15% 폴리아크릴아미드-우레아 겔 모두에서 분획화된다.
프라이머 연장은, poly(A)+RNA 1.5㎍을 50mM 트리스-HCl, pH 8.0, 8mM MgSO4, 0.1M NaCl, 2mM 디티오 트레이톨, 각각 2mM의 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트(dNTP, Pharmacia Fine Chemicals), 20단위의 RN아신(Promega Biotec, Madison, WI) 및 20단위의 AMV 역전사효소(Pharmacia, Piscataway, NJ, FPLCpure) 중에서 42℃에서 60분동안 5'-말단 표지화된 합성 올리고뉴클레오타이드 프라이머, GAGGTCTGCCATTTTGC 2피코몰과 함께 항욘처리하여 수행한다. 생성물을 서열 분석을 위해 사용된 8% 폴리아크릴아미드-우레아 겔 중에서 분자 크기 마커로서32P-표지화된 Hpa II 분해된 pBR 322 DNA를 사용하여 분석한다.
서열 분석을 위하여, 1차 생성물을 겔로부터 용출시키고 막삼등의 화학적 절단 방법에 의해 분석하거나 ddNTP를 문헌[참조:Tolan et al., J. Biol. Chem. 259:1127(1984):Graves et al., J. Biol. Chem. 261:11409(1986)]의 연장반응에 사용한다. 반응물을 8% 폴리아크릴아미드-우레아 겔 중에서 분석한다.
1.1kb cDNA 분자의 뉴클레오타이드 서열은 제14도에 기재되어 있다. 0.9kb 분자의 서열은 이의 거대분자내에서 염기 188부터 염기 1082까지 연장된다. 이러한 뉴클레오타이드 서열의 오픈 리딩 프레임 분석으로부터 예측된 아미노산 서열은 제15도에 기재되어 있다. 제15도에 기재된 예측된 아미노산 서열의 정확성은 하기와 같이 확인된다.
제15도의 잔기 41 내지 54 및 145 내지 164에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 합성 폴리펩타이드를 제조한다. 이들 폴리펩타이드 모두에 대해 유도된 토끼 항혈청은 총 포자소체 단백질 및 0.9kb의 cDNA를 발현하는 이.콜라이 형질전환체의 용해물의 웨스턴 블롯 분석에서 사용한다. 폴리펩타이드 둘 모두에 대한 항체는 웨스턴 블롯의 단백질 둘 모두에 결합된다.
유사한 방법을 사용하여, 파아지 λm 2-4의 65kd 단백질을 암호화하는 1.7kb 삽입물의 뉴클레오타이드 서열을 결정하고, 결과는 제16도에 기재하였다. 이러한 DNA 서열에 의해 암호화된 단백질의 예측된 아미노산 서열은 제17도에 기재되어 있다. 이 서열은 하기 기술된 바와 같이, 발현된 65kb 단백질의 트립신 분해로 생성된 폴리펩타이드 상에서 수행된 아미노산 서열분석으로 확인된다. 이들 펩타이드의 몇몇에 상응하는 총 아미노산 서열에서의 영역은 제17도에서 밑줄 그어져 있다.
이상하게도, 1.7kb 분자에 대한 DNA 서열의 오픈 리딩 프레임은 약 33.349달톤의 단백질을 암호화하는 것으로 예측된다. 그러나, 이러한 DNA 단편으로 부터의 발현 생성물은 SDS 겔에서 약 65kd의 겉보기 분자량으로 이동된다. 예측된 단백질 크기와 관측된 단백질 크기가 불일치하는 이유는 밝혀지지 않았다. 이 단백질은 본원에서 65kd 단백질로서 언급한다.
유사한 양상에서, 모노클로날 항체 8A2에 의해 인식된 28kd 단백질을 암호화하는 cDNA 분자의 뉴클레오타이드 및 예측된 아미노산 서열을 결정하고, 그 결과를 각각 제18도 및 19도에 나타내었다.
윳하게, 1.2kb 7B2 cDNA의 뉴클레오타이드 및 예측된 아미노산 서열을 결정한다. 연속적인 오픈 리딩 프레임이 밝혀졌고 면역 침전에 의해 포자소체로부터 분리된 단백질은 200kd 보다 크기 때문에, 라이브러리를 프로브로서 1.2kb DNA를 사용하여 거대 cDNA에 대해 선별한다. 따라서, 각각 제20도 및 제21도에 기재된 뉴클레오타이드 및 예측된 아미노산 서열을 갖는 302kb cDNA를 수득한다.
6. 65kD 단백질의 정제 및 특성화
6.1. 단백질 정제
pEV/2-4 발현 플라즈미드를 함유하는 이.콜라이 MC1061(pRK 248 cIts)의 고밀도 세포 발효는 허용된 온도에서 약 4시간 동안 생장시킨 후 상술된 바와 같은 유도 온도의 표준 프로토콜을 이용하여 10ℓ 발효조내의 1.5×M-9 배지중에서 수행한다. 유도시킨지 5시간 후에 세포 매쓰를 수거하여 세포 페이스트 500g을 수득한다.
이.콜라이 세포 페이스트 50g을 10mM 트리스-HCl, 5mM EDTA, pH 8.0 500ml 중에 균일하게 현탁시키고 2 내지 8℃에서 2시간동안 교반한다. 현탁액을 7,000psi에서 가울린 마쇄기(APV Gaulin, Everett, Massachusetts, U.S.A.)를 통해 2 내지 3회 통과시킨다. 세포 용해물을 Sorvall RC-5 원심 분리기 내에서 24,000xg에서 1시간 동안 원심분리시키고, 펠렛을 버린다. 고체 황산암모늄을 상등액(최종 농도 80%)에 가한다. 이를 4℃에서 2시간 동안 방치하고, 24,000xg에서 1시간 동안 원심분리한다. 펠렛을 20mM 인산칼륨(pH 6.8)중에 용해시킨다. 원심분리후, 상등액을 20mM 인산칼륨(pH 6.8)에 대해 투석한다.
파마시아(Pharmacia) 유리컬럼(5cm 직경×10cm 길이)을 NuGel P-DE 200
Figure kpo00012
(200Å, 40-60㎛, 약음이온 교환기, Separation Industries, Metuchen, NJ) 실리카 지지체로 충전시킨다. 겔은 20mM 인산칼륨(pH 6.8)으로 평형화한다. 샘플을 로딩하고(10ml/분), 평형 완충액으로 세척한 다음 0.4M NaCl(pH 6.8)을 함유하는 20mM 인산칼륨으로 용출한다. 컬럼 분획을 항체 7D4를 사용하여 웨스턴 블롯팅으로 분석하여 65kd의 단백질을 검출한다.
면역친화성 컬럼을 사용하여 65kd 단백질을 더 정제한다. 이 컬럼을 위한 흡착제를 NuGel P-폴리알데하이드
Figure kpo00013
(500Å, 40 내지 60㎛, Separation Industries, Metuchen, New Jersey, U.S.A.) 실리카 지지체상에 모노클로날 항체 7D4를 고정시켜 제조한다. 고정화 방법에는 하기가 포함된다:10g의 폴리알데하이드 지지체를 현탁시키고 0.1M 인산칼륨, 0.1M NaCl(pH 6.8)로 세척하여 8mg/ml의 단백질 농도에서 20ml의 모노클로날 항체 7D4를 함유하는 삼각 플라스크내에 정량적으로 이동시킨다. 그후 수소화시안화붕소나트륨(4mg)을 현탁액에 가한다. 혼합물을 4℃에서 16시간동안 온화하게 진탕한다. 겔을 여과시키고 0.1M 인산칼륨, 0.1M NaCl(pH 6.8)로 세척한다. 모은 여과액을 비결합된 항체에 대해 검사한다. 결합 밀도는 8mg/지지체 g이다. 커플링되지 않은 활성화 부위는 겔을 1M 에탄올 아민(pH 7.5) 20ml중에 현탁시킴으로써 차단된다. 수소화시안화 붕소 나트륨(4mg)을 현탁액에 가하고 난 다음, 이를 4℃에서 16시간 동안 교반한다. 겔을 수집하고 냉 커플링 완충액으로 철저하게 세척한다.
면역친화성 크로마토그라피를 수행하기 위해, 컬럼(1cm×10cm)을 고정화된 7D4 항체로 충전하고 0.1% 트리톤 X-100을 함유하는 냉 인산염 완충염수(PBS)로 평형화시킨다. 65kd 단백질을 함유하는 NuGel P-DE 200
Figure kpo00014
컬럼으로부터의 분획의 풀을 0.1% 트리톤 X-100을 함유하는 PBS로 2회 세척하고 10ml/분의 유속에서 컬럼상에 로딩한다. 로딩 후, 겔을 PBS로 세척하여 비흡착 물질을 제거한다. 흡착된 면역 반응성 물질을 0.3M 아세트산, 0.1M NaCl(pH 2.7) 완충액으로 용출시킨다. 그후 단백질을 YM 10 막(Amicon, Div. W.R. Grace Co. Danvers, Massachusetts, U.S.A.)를 사용하여 Amicon Stircell
Figure kpo00015
기구중에서 농축시킨다.
단백질의 순도는 문헌[참조:Laemmli Nature 227:680(1970)]에 기술된 바와 같이 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 측정한다. 겔을 쿠마시에 블루로 염색한다. 웨스턴 블롯 분석은 또한 염소 항-마우스 양고추냉이 퍼옥시다제 결합체와 함께 7D4 모노클로날 항체를 사용하여 수행한다. 결과는 제22도에 기재되어 있다. 레인 2, 3, 4 및 5는 2개의 제제로부터 정제된 단백질을 함유한다. 레인 1 및 6은 도면의 좌측 및 우측에 기재된 분자량을 갖는 분자량 마커 단백질의 혼합물을 함유한다. 10㎍의 단백질을 각 레인에서 진행시킨다.
제22도에서, 정제된 단백질이 겉보기 분자량이 약 65kd인 주밴드로서 더욱 높고 더욱 낮은 이동성을 갖는 부밴드와 함께 SDS 겔에서 이동된다는 것을 볼 수 있다.
6.2. 등전점 측정
정제된 65kd 단백질 10ug을 미합중국 매릴랜드 가이더스버그 소재의 LKB Instruments로부터 구입한 등전점 포커싱 겔중에서 등전기적 포커싱시킨다. 공지된 등전점을 갖는 표준 단백질의 혼합물을 동시에 적용시킨다. 겔을 3.5 내지 9.5의 pH 구배를 사용하여, 제조업자의 지시에 따라 50mA, 1500V에서 약 2시간 동안 진행시킨다.
전기 포커싱이 종결되었을때, 겔을 쿠마시에 블루 염료로 염색하여 단백질 밴드를 검출한다. 그후 정제된 단백질의 등전점을 표준 단백질의 위치와 관련지어 pH 구배내의 밴드의 위치를 측정함으로써 결정한다. 따라서 측정된 단백질의 등전점은 4.6이다.
6.3. 아미노산 조성 분석
아미노산 조성의 분석은 문헌[참조:Pan et al., Methods of Protein Micro Characterization 1986, Shively, ed., The Humana Press, pp.105-119]에 기술된 바와 같이, 플루오레스카민과의 포스트 컬럼 반응을 이용하여 수행한다. 65kd 단백질 3ug을 함유하는 샘플을 4% 티오글리콜산을 함유하는 6N HCl 중에서 110℃ 진공에서 20 내지 24시간동안 가수분해시키고, 분석용으로 10% 가수분해물을 사용한다. 과포름산 산화후에 시스테인값을 측정한다. 결과는 표 3에 기재되어 있다.
Figure kpo00016
Figure kpo00017
6.4. N- 및 C-말단서열 분석
20 피코몰의 단백질(아미노산 조성 분석으로 측정된 바와 같음)을 문헌[참조:Hewick et al., J. Biol. Chem. 256:7990(1981)]의 방법 및 어플라이드 바이오 시스템스 모델 470A 서열 분석기(Applied Biosystems, Inc., Foster City, California, U.S.A.)를 사용하여 N-말단 분석에 적용한다. 측정된 N-말단 서열은 M-N-K-N-S-?-L-G-G-F-?-S-M-Q-E-S-P-P-P-이다. 물음표로 나타낸 위치에서의 아미노산 잔기의 확인은 불확실한데 왜냐하면 PTH-Cys의 회수가 낮고, 시스테인 잔기가 디설파이드 결합에 포함될 수 있기 때문이다[참조:Hewick et al., J. Biol. Chem. 256:7990(1981)].
C-말단분석은 문헌[참조:Hayashi, Methods in Enzymology 47:84(1977)]에 기술된 바와 같은 시간 경과 카복시펩티다제 Y 분해에 의해 1200 피코몰의 65kd 단백질상에서 수행된다. 카복시펩티다제 Y(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)는 0.05M 아세트산나트륨 완충액(pH 5.9)중에서 0.8ug/350ul의 농도로 사용되고, 샘플 분취액은 분석을 위해 0, 2, 5, 10, 20 및 30분후에 수득된다. 샘플 분취액을 HCl을 사용하여 산성화시켜 반응을 종료시키고 난 다음 상술한 바와 같이 아미노산 분석을 적용한다. 이러한 분석은 C-말단에서의 아미노산 서열은 아마(Met, Trp)-Ala-Ser이라는 것을 나타낸다. 트립토판은 메티오닌과 동시에 증가하는 것으로 관찰되지만 Trp는 플루오레스카민과의 반응성이 낮기 때문에 플루오레스카민 분석기로 정량하기가 어렵다. 따라서, Trp 및 Met의 상대적인 위치는 이 분석으로는 정확히 측정할 수 없다.
6.5. 트립신 분해 펩타이드 분석
부분적으로는 65kd 단백질을 암호화하는 cDNA의 뉴클레오타이드 서열로부터 예측된 아미노산 서열을 확인하기 위해 몇가지의 단백질을 트립신(Cooper Beiomedical, Philadelphia, Pennsylvania, U.S.A.)으로 절단하고, 생성된 펩타이드를 하기와 같이 서열화한다.
트립신 분해는 효소 대 기질비가 1:30(중량 또는 몰비)이 되게 사용하여, 37℃에서 0.2M 중탄산암모뮴(pH 8)중의 148ug 단백질상에서 밤새 수행된다. 생성된 펩타이드를 알텍스(Altex) 초미소구 250×4.6mm C-18 컬럼(Beckman Instrucments, Fullerton, CA)을 사용하는 Waters HPLC 시스템에서 0.1%(기본) 트리플루오로아세트산중의 0 내지 55%의 증가하는 아세토니트릴 구배를 사용하여 분리한다. HPLC 분리에 앞서, 분해물을 37℃에서 30분동안 β-머캅토에탄올을 사용하여 환원시켜 펩타이드내의 특정 디설파이드 결합을 파괴한다. 컬럼 유출물을 실험실 데이타 대조 검출기(Laboratory Data Control, Rivera Beach, Florida, U.S.A)를 사용하여 215mu에서 모니터 한다. HPLC 컬럼 제23a도에 기재된 바와 같이 8개의 주피크를 분리한다.
먼저 상술한 바와 같이 각각의 피크를 아미노산 분석으로 분석하여 펩타이드의 정량 및 조성을 결정한다. 그후, HPLC 컬럼의 펩타이드 피크의 대부분을 어플라이드 바이오시스템스 모델 470A 기상 서열 분석기를 사용하여, 자동 에드만(Edman) 분해로 서열화한다. 페닐티오하이단토인(PTH) 아미노산 유도체를 문헌[참조:Hawke et al. Anal. Biochem. 120:302(1982)]에 기술된 바와 같이 알텍스 초미소구 C-18 컬럼을 사용하여 Waters 시스템으로 확인하거나, 어플라이드 바이오시스템스 모델 120A 온-라인 PTH 아미노산 분석기로 확인한다.
이들 펩타이드의 아미노산 서열은 제17도의 밑줄그은 영역하에 기재되어 있다. 이러한 각 펩타이드의 수(HPLC 피크수와 상응)는 이에 상응하는 서열옆의 원안에 기재되어 있다. 펩타이드의 아미노산 조성 분석은 예측된 서열의 상응하는 위치에 나타낸 아미노산이 펩타이드 내에 존재한다는 것을 나타내지만, 펩타이드 서열의 몇몇 잔기의 확인에 있어서 불확실성은 이들 위치에서의 물음표로 나타낸다. 펩타이드 잔기의 몇몇을 확인하기 어려운 것은 플루오레스카민과 트립토판의 낮은 반응성에 기인한다.
완전한 65kd 단백질의 N-말단에 상응하는 펩타이드 6은 발현 플라즈미드내의 뉴클레오타이드에 의해 암호화된 이의 N-말단에서 4개 잔기를 함유한다. 불완전한 트립신 분해의 결과로 부터 알 수 있듯이, 펩타이드 8의 분석은 4개의 C-말단 잔기가 결여된 것을 제외하고는 펩타이드 3의 아미노산 서열과 유사한 아미노산 서열을 생성한다. 펩타이드 5의 아미노산 조성 분석은 N-말단의 처음 3개의 아미노산 잔기 외에는 펩타이드 6과 동일하다는 것을 나타내기 때문에, 펩타이드 5는 서열화하지 않았다.
앞서의 머캅토에탄올 환원은 없이 상술한 바와 같이 수행한 트립신 분해물에 대한 HPLC 분석은 피크 5, 7 및 8이 존재하지 않는 용출 프로필을 갖는다(제23b도). 이러한 관측은 이들 시스테인 함유 펩타이드가 비환원된 단백질 내에서 디설파이드 결합에 수반된다는 것을 제시한다.
7. 가금 면역화
7.1. 65kd 항원의 용도
정제된 재조합 65kd 단백질을 투여하여 에이메리아 테넬라 포자형성된 난충에 의한 챌린지에 대해 닭을 보호할 수 있는지를 측정하기 위해, 일련의 면역화 실험을 수행한다. 이들 실험에서, 1일 내지 3주된 레그홈(Leghorn) 닭(Avian Services, Frenchtown, New Jersey, U.S.A.)을 청정실에 가두고 챌린지전까지 다른 닭과 접촉하지 못하게 한다. 닭을 생후 3 또는 4주가 될때까지 전기적으로 가열된 인공부화장에 넣어두고, 이후에 이들을 부화장으로부터 꺼내 성장질로 옮긴다.
약물 처리가 되지 않은 브로일너 스타터 사료 및 물을 실험동안 임의로 공급한다. 난모세포로 챌린지시킬 시기에, 닭을 실험 말기까지 넣어둘 다른 장소로 이동시킨다. 동물의 임상 조건을 면역시키기 전에 매주 적어도 3회 및 면역 후 1일 1회 조사한다. 닭을 여러가지 시험 그룹으로 무작위로 나누기 전에 생후 3 또는 4주에 날개 밴드를 사용하여 각각 확인한다.
상술된 바와 같은 면역친화성 크로마토그라피로 정제된 65kd 단백질의 여러 로트를 면역원으로 사용한다. 이러한 로트의 면역원은 문헌[참조:United States Pharmacopea, 21st Revision, 1985, United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Md., pp. 1165-1167]에 기술된 바와 같이 측정되고 정의된 활성을 갖는 단백질 ㎍당 약 0.3 내지 약 50내독소 단위의 범위에 속하는 세균의 내독소 활성을 함유한다. 단백질을 사용하기 전에 0.02M K2HPO4완충액(pH 6.8)중에 용해시키고 경우에 따라 동일한 완충액으로 희석한다.
소 혈청 알부민(BSA, Pentex)을 대조물질로서 사용한다. 발열활성물이 사용된 면역원 내에 존재하기 때문에, 이런 활성에 기인할 수 있는 어떠한 비특이적 효과를 설명하기 위해 이런 활성을 나타낼 수 있는 대략 등량의 물질을 BSA 대조 그룹에 가한다. 이 발열 활성물은 이.콜라이를 음파 분쇄시킨 다음 0.45μ 밀리포어 필터로 여과시킴으로써 제조된 형질전환되지 않은 이.콜라이 용해물의 형태로 BSA에 가한다.
대조 BSA 또는 에이메리아 항원의 희석된 샘플을 등용적의 애쥬번트와 합하고 투여하기 전에 18게이지 바늘이 장착된 유리 주사기에서 철저하게 혼합한다. 프로인트(Frend)의 완전 및 불완전 애쥬번트를 각각 1차 면역화 및 부스터 면역화에 사용한다. 애쥬번트 둘다는 미합중국 뉴욕 그랜드 아일랜드 소재의 GIBCO사로 부터 입수한다.
1차 면역화는 조류가 생후 4주가 되었을때, 목 아래 등에 피하적으로 수행된다. 몇몇의 닭은 생후 6주에 부스터 면역화를 수행한다. 주사물질의 용적은 약 0.4 내지 2.4ml 범위이다. 용적이 큰 경우에, 용량은 2회로 나누어 투여된다. 최종 예방 접종 2 내지 3주후, 닭을 이.테넬라의 25,000 내지 50000개의 포자형성된 난모세포로 경구투여하여 챌린지시킨다. 감염 7일 후, 생존하는 닭을 죽이고, 부검한 다음 총 병변에 대해 평가한다. 실험 동안 죽은 모든 닭을 또한 부검한다. 진단을 수행하여, 장내 병변을 0=정상, 1=경미한 침습, 2=중간 침습, 3=심각한 침습 및 4=치사로 평가한다. 수득된 평가치를 각 그룹의 닭에 대한 평균 감염도로 요약한다. 또한 감염시 및 감염 7일째에 닭의 체중을 잰다. 몇몇 닭은 BSA 또는 포자소체 항원으로 예방접종하지 않고 감염 또는 비감염된 예방 접종하지 않은 대조 그룹으로 처리된다.
이러한 2가지 실험의 결과는 표 4에 기재되어 있다.
Figure kpo00018
a-IUC, 항원, BSA 및 UUC는 각각(난모세포로) 감염된 비면역화된 대조그룹, 정제된 65kd 단백질, 소 혈청 알부민 및 비감염되고 비면역화된 대조 그룹으 의미한다.
b-실험 1에서, 1회 면역화된 닭은 3주후에 이.테넬라의 50,000개의 포자형성된 난모세포로 챌린지시키고; 상기 부스터 예방 접종된 닭은 2주후에 25,000개의 난모 세포로 챌린지한다. 실험 2에서, 난모세포 챌린지 시기는 동일하나, 단일 예방 접종된 닭 및 부스터 예방 접종된 닭 모두에게 25,000개의 난모세포를 투여한다. 감염되고 면역화되지 않은 대조 그룹을 각 실험동안 유지시키고, 죽이기 7일 전에 같은 시간에 동일수의 포자 형성된 난모세포를 투여한다. 결과는 기술된 바와 같이 0 내지 4의 점수에 근거한다.
c-기재된 수치는 감염시의 체중과 감염 7일 후의 체중 사이의 차이를 나타낸다.
d-이 그룹은 원래 9마리로 이루어지나, 1주후에 1마리가 죽었다.
e-P≤0.05(IUC에 비해)
표 4의 데이타는, 일반적으로 65kd 단백질로의 예방접종은, 감염되었으나 면역화되지 않은 대조그룹과 비교하여 수치상으로 낮은 병변스코어를 나타낸다는 것을 보여준다. 실험 1의 부스터 예방 접종된 닭의 2개의 그룹(표의 우측 상단문자 e로 나타냄)은 통계학적으로 중요한 감소된 병변스코어를 나타낸다. 다른 경우에서 병변 스코어의 감소도는 별로 크지 않으나, 일반적으로 예방 접종된 닭의 체중은 증가되었다.
3차의 예방 접종으로 방어력이 더 증진되는지를 측정하기 위해, 8마리의 닭으로 이루어진 각 그룹을 생후 3주 및 5주, 또는 생후 3주, 5주 및 7주에, 감염 또는 비감염된, 예방접종시키지 않은 대조군 또는 BSA 또는 난충 단백질로 예방 접종시 처리하여 실험을 수행한다. 처음 2번의 예방 접종은 프로인트 완전 애쥬번트로 수행된다. 3차 예방접종이 수행되는 경우 프로인트 불완전 애쥬번트로 수행된다.
최종 예방 접종 2주후, 각각의 닭을 경구 경로로 이.테넬라의 25,000개의 포자형성된 난모세포로 감염시킨다. 챌린시 및 챌린지 7일째에 체중을 측정하고, 7일째에 닭을 죽이고 맹장의 병변을 조사한다. 결과는 표 5에 기재되어 있다.
Figure kpo00019
a-IUC, 항원, BSA 및 UUC는 각각(난모세포로) 감염되고 비면역화된 대조그룹, 정제된 65kd 단백질, 소 혈청 알부민 및 비감염된 비면역화된 대조 그룹을 의미한다.
b-닭을 최종 예방 접종 2주후, 또는 감염된 비면역화된 대조그룹을 죽이기 7일 전에 이.테넬라의 25000개의 포자 형성된 난모세포로 챌랜지시킨다. 이들 대조그룹은 감염시, 이중 및 삼중 면역화 연구를 위해 각각 생후 7주 및 9주된 닭이다. 결과는 문헌에 기술된 바와 같이 0 내지 4의 스코어로 나타낸다.
c-기재된 수치는 감염시의 체중과 감염 7일 후의 체중 사이의 차이를 나타낸다.
표 5의 데이타는 3차 예방 접종에 의해 면역성이 개선되지 않았음을 나타낸다. 감소된 맹장 병병스코어로 나타난 더 큰 방어력은 BSA를 사용하여 예방접종된 닭 또는 비처리된 감염된 대조그룹과 비교하여 항원에 의해 크게 개선되었다.
피하주사 이외의 투여 경로가 더 나은 결과를 나타낼 수 있을지의 여부를 측정하기 위해, 2가지 용량 수준의 65kd 단백질을 생후 3주된 8마리의 레그혼 닭에게 2주 간격으로 3회 피내, 피하, 근육내, 경구 및 항문투여한다. 최종 면역원 투여 2주 후에, 닭을 에이메리아 테넬라의 25000개의 포자형성 난모세포로 경구 챌린지시킨다. 닭을 챌린지 1주후에 죽이고, 맹장 병변 스코어를 측정한다.
피하주사를 상술한 바와 같이 투여한다. 근육내 주사는 좌측 대퇴부의 외측에 깊게 투여한다. 피내주사는 우측 날개의 앞쪽에 투여한다. 경구투여는 길이 5cm 18게이지 볼-팁 바늘을 사용하여, 접종물을 닭의 모이에 혼합함으로써 투여한다. 항문 투여는 길이 5cm 18게이지 올리브형-팁 바늘을 사용하여, 이의 최대 길이를 개방된 총 배설강내로 주입하여 수행한다. 경구 및 항문투여후, 닭을 각각 수분 동안 거꾸로 서있는 자세를 취해 접종물의 배출을 가능한 억제시킨다.
피하 용량형은 상술한 바와 같이 1차 주사용으로 프로인트 완전 애쥬번트를 사용하고 부스터 주사용으로는 프로인트 불완전 애쥬번트를 사용한다. 다른 투여경로를 위한 용량형은 0.02M KHPO완충액(pH 6.8)중에 지시된 수준의 단백질을 함유한다.
이 실험의 결과는 표 6에 기재되어 있다.
Figure kpo00020
a-IUC, 항원, BSA 및 UUC는 각각(난모세포로) 감염된 비면역화된 대조 그룹, 정제된 65kd 단백질, 송아지 혈청 알부민 및 비감염된 비면역화된 대조그룹을 의미한다. SC, IM, A, O 및 ID는 각각 피하, 근육내, 항문내, 경구 및 피내 투여경로를 의미한다.
b-닭을 최종 예방 접종 2주후, 또는 감염된 비면역화된 대조 그룹을 죽이기 7일전에 이.테넬라의 25000개의 포자형성된 난모세포로 챌린지시킨다. 이들 대조 그룹은 감염시 생후 9주된 것이다. 결과는 시험에서 기술된 바와 같이 0 내지 4의 스코어로 나타낸다.
c-기재된 수치는 감염시의 체중과 감염 7일 후의 체중의 차이이다.
d-P0.05(IUC에 비해)
표 6은 5ug의 항원을 경구투여하여 면역화된 닭 및 25ug의 항원을 피내투여하여 면역화된 닭에서 가장 낮은 맹장의 병변스코어가 관찰되었다는 것을 나타낸다. 이들 결과는 통계학적으로 중요하다. 수치상으로 낮은 병변 스코어가 다른 투여 경로 및 다른 투여용량 수준에 대해 나타났으며, 이는 보호성 경향을 나타내는 것이다. 이들 스코어와 IUC 닭의 스코어 사이의 차는 통계학적으로 중요하지 않다.
상기 실험에서 직선적 투여 반응이 관찰되지 않는 것은 65kd의 항원 제제중의 미량의 오염 물질 및/또는 발열 성분의 차이, 또는 다른 요소에 의한 것일 수 있다.
7.2. 백시니아 벡터 예방 접종
닭에게 더욱 효과적인 방법으로 본 발명의 이.테넬라 항원을 면역화시키기 위해, 모노클로날 항체 6A5에 의해 인식되는 20kd 단백질을 암호화하는 1.1kb DNA(제14도) 및 모노클로날 항체 8A2에 의해 인식되는 28kd 단백질을 암호화하는 1.1kb DNA 분자(제18도)를 백시니아 바이러스 내에 클론시키고 하기에 기술된 바와 같이 닭을 예방접종하는데 사용한다.
7.2.1. 벡터 제조방법
제조된 모든 재조합체는 문헌[참조:Mackett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7415(1982)]에 기술된 바와 같이 바이러스성 티미딘 키나제(TK) 좌위에서의 상동성 재조합을 기준으로 한다. TK 좌위는 백시니아 바이러스(VV) Hind III J 단편[참조:Hruby et al., J. Virol 43:403(1982)]에 지도화 되었으며, 이 단편의 일부가 서열화되었다.
재조합을 위한 벡터를 작제하기 위해, VV Hind III J 단편을 pUC 8내로 아클론시킨다(제24a도). 이 작제물은 Hpa II로 절단된다. 단편을 이.콜라이 DNA 폴리머라제 클레나오 단편(klenow)으로 처리하고 Hind III로 재절단하며, 바이러스성 TK 유전자를 함유하는 조각을 저융점 아가로즈로부터 분리한다. 분리된 단편을 pUC 8 벡터의 Hind III 및 평활 말단(S1 처리) EcoRI 부위 내에 결합시킨다(제24b도 우측). 이어서, Hind III 부위를 Hind III 분해된 DNA를 클레나우로 처리하고 벡터 단편과 결합시킴으로써 제거한다. VV 프로모터(7.5K 프로모터로 표시됨)를 삽입하기 위하여, 벡터를 ClaI 및 EcoRI으로 절단한다.
VV 7.5K 프로모터를 바이러스의 가장 작은 SalI 단편 중 하나에 위치시킨다[참조:Venkatesan et al., Cell 25:805(1981)]. 상응하는 단편을 M13mp9내로 클론시킨다. 전사방향이 M13mp8의 EcoRI 부위를 향하는 클론을 선택한다(제24a도, 좌측). DNA를 ScaI 및 SmaI으로 절단하고, BglII 링커를 가하고 DNA를 재결합시킨다(제24b도). 바이러스 프로모터 단편을 함유하는 EcoRI-AccI 단편을 M13 작제물로부터 분리하고 상술된 바와 같이 pUC 8-TK 단편내에 결합시켜 벡터 pUC 8-TK-7.5K 를 수득한다. 신규한 벡터를 BglII 및 EcoRI으로 절단한다.
다수의 클로닝 부위를 갖는 벡터를 제조하기 위하여, 적절한 폴리링커를 상기 작제물에 포함시킨다. 이런 목적을 위하여 M13tgl31(Amersham)내에 포함된 폴리링커를 선택한다(제24d도). 폴리링커 단편을 파아지 DNA를 BglII 및 EcoRI로 분해함으로써 분리하고, 단편을 pUC 8-TK-7.5K 작제물 내로 삽입시켜 외래 항원을 VV내에 재조합시키기 위한 최종 기본 벡터, pUC 8-TK-7.5K를 수득한다.
모노클로날 항체 8A2에 결합하는 28kd 단백질을 암호화하는 EcoRI 단편은 단백질의 N-말단 부위에 대한 서열을 함유하지 않는다. 단백질의 고유의 개시 코돈 및 리더 서열은 손실된다.
이들 손실 부위를 보충하기 위하여, 2개의 다른 작제물이 제조되고 발현에 대해 시험된다. 첫번째 작제물에서, 프레임내 개시 코돈은 pUC 8-TK-7.5K 재조합용 기본 벡터의 폴리링커 부분을 결실시켜 제조한다(제24c도). 벡터를 EcoRV 및 SamI으로 절단하여, 폴리링커 부분을 삭제한 다음(제24d도), 재결합시킨다. 이의 조작에 의해, SphI 제한 부위에 함유된 ATG 코돈은 EcoRI 단편상에 난모세포 단백질의 암호화 영역에 대해 정확한 리딩(reading) 프레임으로 위치하게 된다. 성공적인 조작은 새로운 폴리링커 단편을 서열화함으로써 확인된다. 이러한 작제에 의해 암호화된 단백질의 예측된 N-말단 아미노산 서열은 제25a도에 기재되어 있다.
DNA 서열에서 개시 코돈 뿐만 아니라 손실된 리더 서열을 보충하기 위하여, EcoRI 단편을 말라리아 항원의 리더 서열 뒤에 정확한 판독 프레임으로 위치시킨다. 리더 서열을 분리하는데 사용된 말라리아 항원은 Ro-33[참조:Certa et al., EMBO J 6:4137(1987)]으로서 기술된 190kd 단백질이다. 그러나 포자소체의 리더 서열과 같은 다른 리더 서열이 동일한 목적으로 사용될 수 있다는 것을 주목해야만 한다.
리더 서열을 함유하는 DNA 단편을 분리하기 위해, Ro-33 DNA를 DraI로 절단한다. 제한효소 PvuII 및 Hind III에 대한 인식부위를 함유하는 단편을 분리하고 Hind III로 절단한다.
고유의 벡터 작제물 pUC 8-TK-7.5K(제24c도)는 SalI로 절단되고, 클레나우로 처리된 다음 Hind III로 절단된다. 이러한 벡터 단편에서, 분리된 DraI-Hind III 말라리아 항원 리더 단편을 클론시킨다. 작제물을 사용하여 피.팔시파룸(P. falciparum) 190kd 단백질과 항체 8A2에 의해 인식되고 EcoRI 단편에 의해 암호화된 이.테넬라 항원사이의 융합 단백질을 발현시킨다. 융합 단백질의 예측된 N-말단 아미노산 서열은 제25b도에 기재되어 있다.
28kd 단백질을 암호화하는 EcoRI 단편을 기본 벡터에 함유된 폴리링커의 EcoRI 부위내에 클론시킨다(제24c도). 정확한 방향의 단편을 함유하는 작제물을 증식시키고 백시니아 바이러스 내에서 재조합시키는데 사용한다.
단편의 해독을 위한 개시 부위가 기본벡터(상기 참조) 중에서 조작되는 방식 때문에, 2개의 다른 N-말단 서열이 재조합 백시니아 바이러스에 의해 발현되는 유전자에 대해 예측된다(제25도). 단지 3개의 추가의 아미노산(Met, Arg 및 Trp)을 첫번째 작제물의 고유의 서열에 가하는 한편(제25a도), 두번째 작제물에서 190kd의 말라리아 항원의 리더 서열로부터 유도된 총 47개의 아미노산 서열은 모노 클로날 항체 8A2에 의해 인식된 폴리펩타이드의 N 말단에 융합된다. 리더 서열의 잠정적 절단 부위에서의 프로세싱으로, 추가의 19개의 아미노산을 제거하며, 완성 단백질이 Val, Thr, His로 시작되게 한다.
모노클로날 항체 6A5에 의해 인식되는 20kd의 단백질을 암호화하는 EcoRI 단편은 모든 서열을 함유한다. 이 단편을 더 조작하지 않고 상술된 바와 같이 VV 벡터의 EcoRI 부위내로 클론시킨다.
포자소체 항원을 암호화하는 상기 유전자를 균주 WR 백시니아 바이러스와 재조합시키는 것은 재조합 바이러스의 선택을 위한 2단계 방법을 사용하여 수행한다.
첫번째 단계에서, CV1 원숭이 세포를 배지 I[이글스 최소 필수 배지(MEM), 5% 태 송아지 혈청(FCS:Amimed), 페니실린/스트렙토마이신(100단위/ml 및 100ug/ml, 각각), 및 2mM 글루타민:모든 시약은 Gibco사 제품]를 넣은 8cm 배양 플레이트중에서 성장시켜 80 내지 90%가 유착되게 한다. 배지를 제거하고 0.1 플라크 형성 단위(pfu)/세포의 감온성 백시니아 바이러스 균주 ts N7[참조:Drillen et al., Virology 131:385(1983)]을 함유하는 바이러스 현탁액 0.2ml으로 대체한다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 방치한 후, 2ml의 배지 I를 각 플레이트에 가하고 플레이트를 33℃(이 바이러스에 대한 성장허용 온도)의 CO배양기에서 2시간 동안 배양한다[참조:Kieny et al., Nature 312:163(1984)].
상기 배양 기간 종료 한시간전에, DNA-함유 인산 칼슘 침전물을 제조한다. 이는 총 용적 0.55ml로 HeBS 완충액[280mM NaCl, 1.5mM 인산수소나트륨, 50mM HEPES], 200ng의 정제된 백시니아 균주 WR 바이러스 DNA 및 플라즈미드 DNA를 함유하는 200ng의 정제된 포자소체중 항원 유전자를 함유한다. 1ul의 TE-완충액(10mM 트리스-HCl, pH 7.5, 1mM EDTA)중에 각각의 DNA를 가한다. 0.55ml의 250mM 염화칼슘 용액을 온화하게 와류시키면서 이 용액에 가한다. 이 용액을 실온에서 20분동안 방치한다.
2시간 배양한 후, 배양 플레이트의 배지를 흡출시키고 0.25ml의 상기 DNA-함유 칼슘 침전물로 대체하며 실온에서 1시간 동안 방치한다. 이어서, 2ml의 배지 I을 각 플레이트에 가하고, 플레이트를 39.5℃의 5% CO배양기(참조:Kieny et al. 상기 참조)중에서 2시간 동안 배양한다. 이 온도에서는, ts N7 바이러스가 복제할 수 없으므로, 적어도 ts N7 좌위에서 재조합된 바이러스에 대한 선택은 할 수 있다. 실질적으로 인산칼슘이 세포 성장을 억제하므로써, 상기 2시간 배양 후에 배지를 제거하고 세포를 온화한 와류하에 1ml의 PBS를 사용하여 3회 세척한다. 최종 PBS 용액을 흡입시키고, 2ml의 배지 I을 각 플레이트에 가한다. 39.5℃의 CO배양기에서 2일 동안 계속 배양시킨다.
배양 2일 후, 배지 및 세포를 함유하는 배양액 플레이트를 단시간 동안 -30℃에서 놓고 난 다음 해동시키고 여전히 부착된 세포를 플레이트의 바닥으로부터 긁어내고 현탁액을 상술한 바와 같이 음파 분쇄한다. 이 분쇄물은 제2의 선별 단계에서 사용한다.
이 단계에서, 8cm 의 배양 플레이트에서 성장하는 사람 143B TK 세포(ATCC 제CRL 8303호)의 거의 유착된 륜(lawn)의 배지를 제거하고 0.2ml의 희석되지 않은 분쇄물 또는 PBS로 1:5 또는 1:30(용적:용적)으로 희석된 분쇄물로 대체한다. TK 세포의 감염은 실온에서 1시간동안 진행된다.
배양후, 0.1mg/ml의 브로모데옥시우리딘(BudR, Sigma Chemical Co.)을 함유하는 2ml의 반고형 배지 II[비필수 아미노산(GIBCO:주문 번호 043-1140). 필수 비타민(GIBCO 주문 번호 042-1120) 및 1% 아가로즈를 함유하는 배지 I]를 세포에 가한다. 그후 플레이트를 37℃의 CO배양기에서 16 내지 24시간 동안 배양한다. 상기 성분 외의 0.2% 뉴트럴 레드를 함유하는, 반고형 배지 II의 2번째 층을 세포상에 놓고 플레이트를 추가의 16 내지 24시간 동안 배양한다. 명백히 감지할 수 있는 무색 플라크가 나타나고, 바이러스는 파스퇴르 피펫을 사용하여 플라크 영역을 관통시킴으로써 각각의 클론으로서 회수한다(플라크 정제). 이런 방법으로 회수된 바이러스를 상술한 바와 같이 CV1 세포상에서 성장시키고 143B TK 세포상에서 제2 및 3회의 플라크 정제에 적용시킨다. 이들 플라크-정제된 바이러스를 상술한 바와 같이 성장시키고 정제시킨다.
재조합 바이러스에 의한 포자충증 항원의 발현을 시험하기 위해, 재조합 바이러스로 감염된 CV 1 세포를 테이블-탑 원심 분리기(Hettich Mikrorapid K, 100% 20℃에서 3분동안)로 침전시키고, 펠렛을 PBS로 2회 세척하고, 재원심분리시키고 PBS 중에서 재현탁시킨다. 세포 현탁액을 유리 현미경 슬라이드(Flwo)에 놓고 건조시킨다. 제2의 방법은 현미경 슬라이드(Miles Lab-Tek 4808)상에서 CVI 세포를 직접적으로 성장시키고, 세포를 바이러스로 감염시키며 1 내지 2일 동안 배양하는 것으로 이루어진다. 그후 세포를 PBS로 세척하여 성장배지가 없게하고 실온의 슬라이드상에서 건조시킨다. 세포를 고정하기 위하여, -30℃에서 적어도 1시간 이상 동안 슬라이드를 아세톤중에 침지시키고 실온에서 건조시킨다.
PBS로 희석된 마우스 항-포자소체중 항원 모노클로날 항체를 세포를 액체로 균일하게 덮기 위해 현미경 슬라이드 상에 중층한다. 슬라이드를 37℃에서 1시간 동안 습윤 챔버에 넣고 이어서 PBS로 수회 세척한다. 슬라이드를 건조시키지 않고, PBS로 희석시킨 제2의 항체(FITC 표지된 염소 항-마우스 IgG, Nordic)를 슬라이드상에 중층하고, 슬라이드를 37℃의 습윤챔버내에 1시간 동안 넣어 항체를 반응시킨다. PBS로 수회 세척한 후, 슬라이드를 완전히 건조시킨다. 물중의 20%(용적/용적) 글리세린 몇방울을 슬라이드상에 피펫팅하고, 커버글라스(Menel 24×60)를 정점에 놓는다. 그후 세포 제제의 형광성을 UV 광선하에 현미경으로 모니터한다(Zeiss ICM 405, F10 또는 Planapo 63 objective).
WR 균주 바이러스는 거의 모든 세포형에서 증식될 수 있고[참조:Drillen et al., J. Virology 28:843(1978)], 이의 증식은 플라크 형성을 통해서 직접적으로 관측할 수 있다. 그러나, 대부분의 경우에, 병아리 배의 섬유아세포(CEF)는 바이러스의 대형 원료를 제조하는데 사용된다.
CEF 세포를 수득하기 위해, 생후 11일된 배를 달걀로부터 분리하고, 이의 선단으로부터 유리하며, 소형 조각으로 절단한 다음 실온에서 2시간동안 0.25% 트립신 용액(Difco)중에 재현탁시킨다. 현탁액을 1용적의 배지 I로 희석하고 세포체(Bellco, 150메쉬)로 여과한 다음, 세포를 침전시킨다(Hermie 테이틀-탑 원심분리기, 5분, 2000rpm, 실온). 세포 펠렛을 배지 I의 고유 용적의 1/4중에 재현탁시키고 이 CEF 세포 현탁액을 세포 배양 플레이트내에 접종시킨다. 출발 세포 밀도에 따라, 배양액을 1 내지 2일 동안 성장시키고 직접적으로 또는 1 내지 2일이 더 경과한 후에 감염시키기 위해 사용한다. 이와 같은 1차 배양액을 설정하기 위한 개요는 문헌[참조:Frehney, Culture of Animal Cells, Alan R. Liss Verlag, New York 1983, Chapter 11, p 99]에 공지되어 있다.
감염을 위하여, 배지를 175cm 배양 플라스크(Falcon 3028)내에서 성장하는 80 내지 90%의 유착 CEF 세포로부터 제거하고, 세포를 실온에서(20℃) 바이러스(0.1pfu/세포, 0.01ml/cm )를 함유하는 PBS 용액 중에서 1시간동안 배양한다(PBS/Dulbecco, Amimed). 그후 배지 I를 가하고(0.2ml/cm ), 플라스크를 약 80%의 세포가 용해될때까지 37℃에서 2 내지 3일 동안 배양한다. 생성된 원액을 바이러스 정제전에 -30℃에서 고유의 배양 플라스크 중의 세포 및 배지와 함께 직접적으로 저장한다.
하기 정제 단계를 이용하여 모든 숙주세포 특이성분이 없는 바이러스 제제를 수득한다. -30℃에서 저장된 감염된 세포 배양액을 해동시키고 잔여의 세포를 흔들거나 긁어서 플라스크의 표면으로부터 유리시킨다. 세포 및 바이러스를 원심분리시켜 배지로부터 제거한다(Sorvall 원심분리기, GSA 로터, 10℃, 5000rpm에서 1시간). 세포 및 바이러스 입자의 펠렛을 PBS(10 내지 20X 펠렛의 용적)중에 재현탁시키고 상기와 같이 재원심분리시킨다. 그후 펠렛을 10배 용적의 PBS 완충액(10mM 트리스-HCl, pH 8.0, 10mM KCl, 1mM MgCl)중에 재현탁시킨다.
나머지 온전한 세포를 용해시키고 세포막으로부터 바이러스를 유리하기 위하여, 상기 현탁액을 음파 분쇄한다(2회, 실온 60와트에서 10초동안, 4mm 프로브가 장착된 Labsonic 1510). 그후 혼합물을 3000rpm, 10℃에서 3분 동안 Sorval GSA 로터로 원심분리시킨다. 세포핵 및 대형 세포 파편을 제거시킨 바이러스 현탁액을 제조한다. 상등액을 주의해서 제거하고, 펠렛을 PSB 완충액 중에 재현탁시키며, 초음파 분리한 다음 상기와 같이 원심 분리시킨다.
2차 상등액을 1차 상등액과 합하고, 10ml의 35% 수크로즈 큐션(Fluka, 10mM의 트리스-HCl, 8.0)상에 중층하고, 90분 동안 14000rpm, 10℃에서 Kontron TST 28.38/17로터(Beckman SW 27 애낼로그)로 원심분리시킨다. 상등액을 경사분리시키고 바이러스 입자의 펠렛을 10ml의 10mM 트리스-HCl(pH 8.0)중에 재현탁시키며, 음파 분쇄시켜 혼합물을 분쇄시키고(상술한 바와 같이 실온에서 10분동안 2회) 더 정제하기 위해 단계구배상에 로딩한다.
단계 구배는 20%, 25%, 30%, 35% 및 40%의 10mM 트리스-HCl(p(H 8.0)중의 5ml 분취액의 수크로즈로 이루어진다. 이 구배는 14000rpm, 10℃에서 Kontron TST 28.38/17 로터로 35분 동안 원심분리시킨다. 바이러스 입자를 함유하는 몇몇 밴드는 30% 내지 40% 수크로즈 영역에서 볼 수 있다. 구배의 이 부분을 제거하고(10ml), 수크로즈 용액을 PBS(20ml)로 희석하여 바이러스 입자를 침전시킨다(Kontron 로터, 14000rpm, 10℃에서 90분). 펠렛은 거의 바이러스 입자만을 함유한다(하기와 같이, OD 측정치 및 플라크 분석을 비교하여 판단). 펠렛을 PBS중에 재현탁시켜 바이러스 농도가 평균 1 내지 5×10 pfu/ml이 되게 한다. 이 바이러스 원액을 직접 사용하거나 PBS로 희석하여 사용한다.
바이러스 농도 및 바이러스 원액의 순도를 측정하기 위하여, 2가지 방법을 사용한다. 바이러스 입자의 절대 농도는 통상적으로 260nm(OD/260)에서 분광광도계로 원액의 흡광도(OD)를 측정함으로써 수득되는데, 여기에서 1OD/260은 ml당 약 1.2×10 개의 입자와 동일하다[참조:Joklik, Virology 18:9(1962)]. 바이러스 농도는 또한 세포상의 바이러스를 적정함으로써 수득되는데(플라크 분석), 60개 바이러스 입자중 단지 하나만이 세포를 감염시킬 수 있다고 추정된다.
배양된 세포상에서 바이러스 농도를 적정하기 위하여, CEF 세포를 8cm 플라스틱 배양 플레이트(Falcon 3001)상의 배지 I에서 성장시킨다. 세포의 유착도가 80 내지 90%에 다다르는 경우, 배지를 제거하고, PBS중의 희석된 바이러스 용액 0.2ml으로 대체한 다음, 실온에서 1시간동안 방치한다. 바이러스 원액을 10회 단계로 희석한다. 실온 배양후에, 2ml의 반고형 배지 I(배지 I+1% 아가로우즈)를 각 플레이트에 가하고, 플레이트를 CO배양기내에 16 내지 24시간 동안 넣는다. 이어서, 0.2% 뉴트럴 레드(Fluka 72210)를 함유하는 2ml의 반-고형 배지 I를 중층하여 생세포를 염색하고, 플레이트를 추가로 16 내지 24시간동안 배양한다. 그후 무색 플라크를 현미경하에서 계수한다.
7.2.2. 병아리의 면역화
모노클로날 항체 8A2 및 6A5에 특이적으로 결합하는 이.테넬라 단백질을 암호화하는 유전자를 함유하는 백시니아 바이러스성 벡터가 이.테넬라의 병원성 균주(균주 T2-750/7, T7-776/1 또는 T6-771)의 포자 형성된 난모세포에 의한 챌린지에 대해 닭을 보호할 수 있는지를 측정하기 위하여, 하기 시험을 수행한다.
모든 시험은 스위스연방 소재의 Hatchery E. Wuthrich, Belp.에서 공급된 층-사육된 어린 수탉(Warren)을 사용하여 수행한다. 생후 1일된 병아리를 지시된 기간까지 가열된 배터리 인공 사육기에서 사육한 후, 이들을 여러가지 시험 그룹으로 나누고 철사로 마루를 깐 닭장에 포자소체중의 감염이 없이 사육한다. 시험동안, 옥수수, 밀 및 대두분을 기초재료로 한 시판용 육계-성장 사료(조 단백질 21.7%)를 공급한다.
첫번째 시험에서, 42일된, 체중이 동일한 각 6마리의 병아리를 3그룹으로 무작위로 나눈다. 3일 후, 병아리를 재조합 또는 야생형 백시니아 바이러스 각각의 바이러스 현탁액 50㎕(10 pfu/PBS 1ml)을 우측 날개웹에 피하 주사함으로써 상기 바이러스로 면역화시킨다. 2개의 재조합 백시니아 바이러스가 사용되는데, 이들 둘다는 항체 8A2에 특이적으로 결합하는 이.테넬라 단백질을 암호화하는 DNA를 함유한다. 바이러스(37K M3으로 표기됨)중 하나는 190kd 말라리아성 항원의 리더 서열을 함유하고:다른 바이러스(37K K3으로 표기됨)는 이 리더 서열이 결여되어 있다. 야생형 백시니아 균주 WR은 음성 대조그룹으로 사용된다.
첫번째 주사 1주후, 상기 사용된 동일한 형의 백시니아 바이러스를 사용하여 부스터 주사를 동일한 조건 하에 병아리의 왼쪽 날개웹에 투여한다. 부스터 주사 1주후(59일), 2ml의 혈샘플을 모든 닭으로부터 채취하고 ELISA에 의해 혈청 내의 특이성 항체의 존재를 분석한다. 요약하여, 미소 역가 플레이트(NUNC 면역 플레이트 F96)의 웰을 이.테넬라(10000개 세포/ml)의 포자소체의 현탁액으로 피복하고 희석율을 증가시키면서 닭의 혈청과 함께 배양한다. 검출제로서 양고추냉이-퍼옥시다제에 결합된 염소 항-닭의 면역 글로불린(Kirkegard and Perry Laboratory, Gaithersburg, U.S.A.)을 기질로서 테트라메틸벤지딘과 함께 사용한다. 전개된 청색은 Titertek Multiskan MCC/340MKII로 파장 450nm에서 확인된다. 역가는 적어도 기저치의 2배의 흡광도를 나타내는 혈청 희석액의 역가의 역수로서 정의된다(표 7).
첫번째 주사 4주후(73일) 병아리를 50000개의 포자 형성된 난모세포로 챌린지한다. 생리식염수 1ml 중에 현탁된 포자소체의 접종물은 눈금이 매겨진 주사기의 뭉툭한 바늘을 사용하여 병아리의 모이에 경구 투여한다. 80일째, 모든 병아리를 죽이고, 부검한 다음, 맹장의 총 병변을 측정한다(스코어 0=정상, 1=경미한 감염, 2=중간 감염, 3=심각한 병변, 4=포자소체중으로 인해 죽은 갉). 감염 사이클의 최종 2일째에 배설물을 정량적으로 수집하고, 배출된 낭충의 수를 대표적인 배설물 샘플에서 측정한다. 결과는 표 7에 기재되어 있다.
Figure kpo00021
a-바이러스 37M3은 190kd 말라리아성 항원의 리더 서열을 함유하며:바이러스 37K3은 함유하지 않았다. 야생형 바이러스는 백시니아 균주 WR이다.
b-2마리의 병아리는 포자소체 챌리지전에 죽었다.
표 7은 기생충에 특이적인 항체 생산을 유도하고 난모세포의 감염을 다소 보호할 수 있는 29kd 단백질을 암호화하는 DNA를 함유하는 바이러스를 맹장의 병변스코어의 감소 및 감소된 난모세포의 배출의 측면에서 야생형 대조 그룹 바이러스와 비교하여 나타낸다. 포자충증에 대한 보호에 대하여 2개의 바이러스는 동등하게 효과적이나, 닭의 말라리아성 리더(37M3)를 갖는 작제물은 표준 바이러스 작제물(37K3)보다 포자소체 항원에 대해 더 높은 항체 역가를 나타내며, 이는 융합 단백질이 더 유리하다는 것을 나타낸다.
두번째 시험에서, 수탉을 사육하고 22일째에 상술한 바와 같이 면역화시킨다. PBS 100ml중의 2×10 pfu의 바이러스 용량을 22일째 투여한다. 사용된 바이러스는 말라리아성 리더 서열을 함유하지 않거나(37K5로 표기됨) 함유한(37M19로 표기됨) 28kd 단백질을 암호화하는 DNA를 함유하는 백시니아 바이러스의 다른 제제이다. 동일한 야생형 균주 WR 바이러스가 대조 그룹으로서 사용된다. 첫번째 주사 1주 또는 2주후에 동일한 용량으로 우측 날개웹에 부스터 주사를 수행한다.
57일째(첫번째 주사 5주후), 모든 닭을 50000개의 포자형성된 난모세포로 감염시킨다. 1주 후에, 닭을 죽이고, 부검한 다음 상기와 같이 스코어를 측정한다. 감염후 1일 체중 증가량 및 최종 2일 동안 난모세포 배출량 또한 측정한다.
결과는 표 8에 기재되어 있다.
Figure kpo00022
a-바이러스 37M 19는 190kd 말라리아성 항원의 리더서열을 함유한다. 바이러스 37K5는 함유하지 않는다. 야생종 바이러스는 백시니아 균주 WR이다.
표 8은 병원성 난모세포의 감염을 어느정도 보호하는 포자소체 DNA를 함유하는 바이러스를 체중증가량, 맹장병변스코어 및 난모세포 배출의 측면에서 야생형 대조 바이러스와 비교하여 나타내었다. 바이러스는 둘다 동등하게 효과적이다. 첫번째 주사 1주후 부스터 주사를 투여한 경우 체중이 더 많이 증가되고 난모세포의 배출은 적어졌으나, 맹장 병변 스코어는 두 부스터 스케줄 모두에 대해 거의 동일했다.
세번째 시험에서, 3번의 예방 접종 효과가 시험되었다. 21일에 야생형 백시니아 바이러스 또는 모노클로날 항체 6A5에 특이적으로 결합하는 20kd 단백질을 암호화하는 DNA를 함유하는 바이러스의 현탁액의 2개의 50ul 분취액(3×10 pfu/ml)을 닭에게 주사한다. 28일째에 모든 닭의 좌측 날개웹에 동일한 용량의 부스터 주사를 제공한다. 몇몇의 닭에게 35일째에 양측 날개웹에 추가의 동일 용량의 부스터 주사를 제공한다. 다른 닭은 다른 대조 그룹으로서, 예방 접종하지 않은채 남겨둔다.
42일째, 혈샘플을 모든 닭으로부터 채취하고 상술한 바와 같이 기생충의 포자소체 단계에 대한 특이 항체의 존재에 대해 ELISA로 분석한다. 49일째(최초 주사후 4주) 모든 닭을 50000개의 포자형성된 난모세포로 감염시킨다. 1주 후에, 닭을 죽이고, 부검한 다음 상술한 바와 같이 맹장의 총병변에 대해 스코어를 측정한다. 1일 체중 증가량을 측정하기 위해 체중을 주마다 기록하고, 감염 사이클의 최종 2일에 배설물을 수집하여 난모세포 배출을 측정한다. 결과는 표 9에 기재되어 있다.
Figure kpo00023
rVV 포자소체 DNA를 갖는것
wT 야생형
N 없음
표 9의 데이타는 3회 주사시 포자소체중 항원을 형성하는 바이러스는 포자소체 단백질에 대해 특이적인 높은 항체역가를 갖는 항체를 생성한다는 것이 밝혀졌다. 그러나, 이러한 형의 재조합 바이러스로 처리하는 경우, 증가된 체중 증가량, 감소된 맹장 병변스코어 및 저하된 난모세포 배출의 측면에서 난모세포 감염에 대해 다서 보호될 수 있다는 것을 나타낸다. 예방 접종되지 않은 대조 그룹을 사용하여 수득된 결과를 비교하면 야생형 백시니아 바이러스로 예방 접종시 보호되지 않는다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 포자소체 DNA를 함유하는 바이러스에 의한 보호는 특이적이며 백시니아 바이러스 그 자체에 노출됨으로써 발생된 전반적인 면역 자극에 기인하지는 않는다. 3회의 예방 접종은 2회의 예방 접종보다 더 효과적이다.
본 발명의 여러가지 변형 및 변화가 이의 취지 및 범주를 벗어남 없이 수행될 수 있다는 것은 본 분야의 숙련가에게는 명백할 것이다. 본원의 특이 태양은 실시예의 방법으로만 제공되며, 본 발명은 첨부된 청구범위의 항들에 의해서만 제한된다.

Claims (10)

  1. 겉보기 분자량이 28, 37, 120 또는 200킬로달톤이고, 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션(American Type Culture Collection)에 기탁번호 제HB 9707호 내지 제HB 9712호로 기탁된 모노클로날 항체와 특이적으로 결합하는 에이메리아(Eimeria) 표면항원의 면역반응성 및 항원성 결정소를 갖는 단백질.
  2. 제1항에 따른 단백질을 암호화하며 제14도, 제16도, 제18도 및 제20도에 도시된 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 DNA 서열.
  3. 제2항에 따른 DNA 서열을 함유하며 폭스바이러스(poxvirus) 벡터, 이.콜라이 벡터 및 pEV/2-4로 이루어진 그룹 중에서 선택된 재조합 벡터.
  4. 제3항에 있어서, 폭스바이러스(poxvirus) 벡터인 재조합 벡터.
  5. 제3항 또는 제4항에 따른 재조합 벡터로 형질전환된, 식물, 포유동물, 효모 세포 및 세균으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 숙주 유기체.
  6. 모노클로날 항체 ATCC 제HB 9707호, 제HB 9708호, 제HB 9709호, 제HB 9710호, 제HB 9711호 및 제HB 9712호로 이루어진 그룹중에서 선택된, 제1항에 따른 단백질에 대한 모노클로날 항체.
  7. 제1항에 있어서, 포자충증에 대해 가금을 면역화시키기 위한 단백질.
  8. (a) 제1항에 따른 단백질을 암호화하며 제14도, 제16도, 제18도 및 제20도 중에서 선택된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 서열을 함유하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 유기체를 배양하고; (b) 배양물로부터 단백질을 면역친화성 크로마토그래피에 의해 분리함을 특징으로 하는, 제1항에 따른 단백질의 제조방법.
  9. 제1항에 따른 단백질 하나 이상 및 생리학적으로 허용되는 담체를 함유하는, 포자충증에 대해 가금을 보호하기 위한 백신.
  10. 제3항에 따른 재조합 폭스바이러스 벡터를 함유하는, 포자충증에 대해 가금을 보호하기 위한 백신.
KR1019890007661A 1988-06-03 1989-06-03 재조합 포자충증 백신 KR0156545B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US20272188A 1988-06-03 1988-06-03
US202721 1988-06-03
US202,721 1988-06-03

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR910000183A KR910000183A (ko) 1991-01-29
KR0156545B1 true KR0156545B1 (ko) 1998-11-16

Family

ID=22750986

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019890007661A KR0156545B1 (ko) 1988-06-03 1989-06-03 재조합 포자충증 백신

Country Status (22)

Country Link
US (2) US5661015A (ko)
EP (1) EP0344808B1 (ko)
JP (1) JP3051130B2 (ko)
KR (1) KR0156545B1 (ko)
CN (3) CN1040126C (ko)
AR (1) AR241942A1 (ko)
AT (1) ATE120489T1 (ko)
AU (1) AU635704B2 (ko)
CA (1) CA1340538C (ko)
DE (1) DE68921923T2 (ko)
DK (1) DK272889A (ko)
ES (1) ES2070866T3 (ko)
FI (1) FI101453B (ko)
HU (1) HU212505B (ko)
IE (1) IE67544B1 (ko)
IL (1) IL90489A0 (ko)
MC (1) MC2039A1 (ko)
NO (1) NO303876B1 (ko)
NZ (1) NZ229377A (ko)
PT (1) PT90727B (ko)
YU (1) YU47880B (ko)
ZA (1) ZA893740B (ko)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5174993A (en) * 1981-12-24 1992-12-29 Health Research Inc. Recombinant avipox virus and immunological use thereof
US5273901A (en) * 1984-07-05 1993-12-28 Enzon Corp. Genetically engineered coccidiosis sporozoite 21.5 Kb antigen, ac-6b
US5279960A (en) * 1984-07-05 1994-01-18 Enzon Corp. 25 KD coccidial antigen of eimeria tenella
US5824656A (en) * 1988-01-15 1998-10-20 Merck & Co., Inc. Recombinant and native group B eimeria tenella immunogens useful as coccidiosis vaccines
ATE144146T1 (de) * 1988-07-05 1996-11-15 British Tech Group Usa Gentechnologisch hergestellter coccidiose- impfstoff
ZA902147B (en) * 1989-03-28 1990-12-28 Akzo Nv Coccidiosis vaccine
EP0403698B1 (en) * 1989-06-21 1993-09-08 Akzo Nobel N.V. Eimeria tenella vaccine
ZA9010461B (en) * 1990-01-26 1991-10-30 Hoffmann La Roche Recombinant coccidiosis vaccines-5-7 eimeria surface antigen
ES2090324T3 (es) * 1991-03-14 1996-10-16 British Tech Group Usa Vacuna anticoccidica recombinante.
US5403581A (en) * 1991-07-12 1995-04-04 Hoffmann-La Roche Inc. Coccidiosis vaccines
US6008342A (en) * 1991-07-12 1999-12-28 Roche Vitamins Inc. DNA encoding eimeria antigen
SK282436B6 (sk) 1995-06-07 2002-02-05 Pfizer Inc. Živé sporocysty alebo oocysty Eimeria alebo ich zmesi na výrobu očkovacej látky
ATE200029T1 (de) 1995-06-07 2001-04-15 Pfizer In ovo impfung gegen coccidiose
NZ286915A (en) 1995-07-03 1998-03-25 Akzo Nobel Nv Protein with one or more antigenic determinants of eimeria lactate dehydrogenase, its production and use
EP0921814A4 (en) * 1996-03-29 2001-10-04 Life Technologies Inc Process for increasing the viability and transformation efficiency of bacteria during storage at low temperatures
US6632923B1 (en) * 1996-11-27 2003-10-14 Boston Heart Foundation, Inc. Low density lipoprotein binding proteins and their use in diagnosing and treating atherosclerosis
US6627205B2 (en) 1997-12-01 2003-09-30 Pfizer Incorporated Ovo vaccination against coccidiosis
US6984378B1 (en) 1999-02-26 2006-01-10 Pfizer, Inc. Method for the purification, recovery, and sporulation of cysts and oocysts
ZA200400479B (en) * 2001-07-06 2006-05-31 Abic Biolog Lab Teva Nucleic acids encoding recombinant 56 a 82 KDA antigens from gametocytes of Eimeria maxima and their use
ATE484573T1 (de) 2001-08-30 2010-10-15 Embrex Inc Verbesserte verfahren zur herstellung von oozysten
KR100490669B1 (ko) * 2001-08-30 2005-05-19 (주)아비코아생명공학연구소 조류 콕시듐증을 유발하는 에이메리아 종의 포자소체 표면항원에 대한 ｓｃＦｖ 재조합 항체
JP3995541B2 (ja) * 2002-06-28 2007-10-24 株式会社ゲン・コーポレーション 抗鶏コクシジウム症組成物
DE10330235A1 (de) * 2003-07-04 2005-01-20 Bayer Healthcare Ag Neues Eimeria Gen und Protein sowie deren Verwendung
CA2579635A1 (en) * 2003-09-10 2005-03-17 Baxter International Inc. Peptides that inhibit complement activation
WO2005089262A2 (en) * 2004-03-12 2005-09-29 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Novel peanut skin extract as a vaccine adjuvant
US7087425B2 (en) * 2004-03-31 2006-08-08 Embrex, Inc. Method of purifying oocysts using enzymatic digestion of fecal debris
US20110078828A1 (en) * 2004-09-10 2011-03-31 Guardian Biotechnologies Inc. Multi epitope vaccine for poultry
EP1666489B1 (en) * 2004-12-01 2007-11-21 Zeon Corporation DNA encoding an antigenic protein of eimeria apical membrane antigen 1 and use thereof
CN100398156C (zh) * 2005-11-23 2008-07-02 南京农业大学 用于预防鸡球虫病的免疫调节型dna疫苗
US20080194006A1 (en) * 2007-02-08 2008-08-14 Embrex, Inc. Methods of releasing sporocysts from oocysts using controlled shear forces
US11701683B2 (en) 2010-12-22 2023-07-18 The Procter & Gamble Company Methods for foil stamping parts having asymmetrical edges
MX2019007583A (es) 2016-12-22 2019-09-04 Intervet Int Bv Vacuna de eimeria con una eficacia mejorada.
US20220243281A1 (en) * 2019-05-28 2022-08-04 Case Western Reserve University Compositions and methods for preserving dna methylation

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4237224A (en) 1974-11-04 1980-12-02 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University Process for producing biologically functional molecular chimeras
DE2814039C3 (de) 1978-03-31 1981-02-19 Gesellschaft Fuer Biotechnologische Forschung Mbh (Gbf), 3300 Braunschweig Verfahren zur Herstellung von Hybrid-Bakterien
EP0135073A3 (en) * 1983-08-19 1987-05-27 American Cyanamid Company Antigens and monoclonal antibodies reactive against merozites of eimeria spp.
US4650676A (en) 1983-08-19 1987-03-17 American Cyanamid Company Antigens and monoclonal antibodies reactive against merozoites of Eimeria spp.
US4710377A (en) * 1983-08-19 1987-12-01 American Cyanamid Company Antigens and monoclonal antibodies reactive against sporozoites of Eimeria spp.
EP0135712A3 (en) * 1983-08-19 1987-05-27 American Cyanamid Company Antigens and monoclonal antibodies reactive against sporozoites of eimeria spp.
US5187080A (en) * 1984-06-05 1993-02-16 Solvay & Cie S.A. DNA encoding an antigenic protein derived from Eimeria tenella and vaccines for prevention of coccidiosis caused by Eimeria tenella
US4874705A (en) * 1985-05-16 1989-10-17 Solvay & Cie, S.A. DNA encoding an antigenic protein derived from Eimeria tenella and vaccines for prevention of coccidiosis caused by Eimeria tenella
CA1340520C (en) * 1984-06-05 1999-05-04 Karel Z. Newman Jr. Antigenic proteins and vaccines containing them and protective antibodies directed to them for prevention of coccidiosis caused by eimeria tenella and eimeria necatrix
US4639372A (en) * 1984-06-29 1987-01-27 Merck & Co., Inc. Coccidiosis vaccine
WO1986000528A1 (en) * 1984-07-05 1986-01-30 Genex Corporation Cloned gene and method for making and using the same
US5273901A (en) * 1984-07-05 1993-12-28 Enzon Corp. Genetically engineered coccidiosis sporozoite 21.5 Kb antigen, ac-6b
EP0453054B1 (en) * 1985-12-03 1996-07-03 SOLVAY (Société Anonyme) Antigenic proteins and vaccines containing them for prevention of coccidiosis
EP0241139A3 (en) * 1986-03-13 1989-04-19 Merck & Co. Inc. Anti-idiotypic vaccine for coccidiosis
US5496550A (en) * 1986-08-14 1996-03-05 Chilwalner Method of reducing the output of Eimeria oocysts from a newborn chick
ATE145245T1 (de) * 1987-03-06 1996-11-15 Amgen Boulder Inc Polypeptide zur verwendung bei der diagnose von kokkidien-infektion und rekombinant-dns, verfahren zur herstellung derselben
EP0315073A2 (en) * 1987-11-02 1989-05-10 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. A composition for pattern forming materials
NZ227597A (en) * 1988-01-15 1991-11-26 Merck & Co Inc Eimeria tenella group b immunogens and their production
NZ227595A (en) * 1988-01-15 1991-11-26 Merck & Co Inc Recombinant production of eimeria tenella antigens and their use
AU620366B2 (en) * 1988-02-12 1992-02-20 United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The Cloned genes coding for avian coccidiosis antigens which induce a cell-mediated response and method of producing the same
DE3926461A1 (de) * 1989-07-15 1991-01-24 Suttner Gmbh & Co Kg Ventilpistole, insbesondere fuer ein hochdruckreinigungsgeraet

Also Published As

Publication number Publication date
NZ229377A (en) 1992-06-25
HUT52963A (en) 1990-09-28
CN1076204C (zh) 2001-12-19
IE891812L (en) 1989-12-03
ZA893740B (en) 1990-02-28
HU212505B (en) 1996-07-29
ES2070866T3 (es) 1995-06-16
KR910000183A (ko) 1991-01-29
NO303876B1 (no) 1998-09-14
FI892714A (fi) 1989-12-04
US5661015A (en) 1997-08-26
US20030175311A1 (en) 2003-09-18
EP0344808A1 (en) 1989-12-06
PT90727A (pt) 1989-12-29
IL90489A0 (en) 1990-01-18
AU635704B2 (en) 1993-04-01
NO892251L (no) 1989-12-04
ATE120489T1 (de) 1995-04-15
DK272889D0 (da) 1989-06-02
CN1186695A (zh) 1998-07-08
IE67544B1 (en) 1996-04-17
JPH037594A (ja) 1991-01-14
CN1187368A (zh) 1998-07-15
PT90727B (pt) 1994-11-30
DK272889A (da) 1989-12-04
DE68921923D1 (de) 1995-05-04
MC2039A1 (fr) 1990-05-30
FI101453B1 (fi) 1998-06-30
AU3601689A (en) 1989-12-07
CA1340538C (en) 1999-05-11
YU113889A (en) 1991-10-31
CN1038837A (zh) 1990-01-17
CN1077438C (zh) 2002-01-09
NO892251D0 (no) 1989-06-02
FI101453B (fi) 1998-06-30
JP3051130B2 (ja) 2000-06-12
AR241942A1 (es) 1993-01-29
DE68921923T2 (de) 1995-08-10
FI892714A0 (fi) 1989-06-02
EP0344808B1 (en) 1995-03-29
CN1040126C (zh) 1998-10-07
YU47880B (sh) 1996-05-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR0156545B1 (ko) 재조합 포자충증 백신
Langford et al. Anchoring a secreted plasmodium antigen on the surface of recombinant vaccinia virus-infected cells increases its immunogenicity
US5656485A (en) Eimeria antigenic composition which elicits antibodies against avian coccidiosis
JPH0699475B2 (ja) コクシジウムのモノクロ−ナル抗体
EP0390267B1 (en) Coccidiosis vaccine
CA2071395A1 (en) Coccidiosis poultry vaccine
DE69432137T2 (de) Impfstoff gegen Geflügelkokzidose
US5597570A (en) Protein recognized by antibodies raised against native P28 of schistosoma mansoni
JP3450018B2 (ja) コクシジウム症ワクチン
EP0486106A2 (en) Marek's disease virus vaccine
SA91110265B1 (ar) أمصال الكوكسيديوزيز المعادة الاتحاد5-7 مولدات أجسام مضادة سطحية لطفيل الايميريا
DE69521007T2 (de) Impfstoff gegen Geflügelkokzidose
CA2067469C (en) Recombinant vaccine against marek's disease
US6008342A (en) DNA encoding eimeria antigen
Scallon et al. Characterization of a large gene family in Schistosoma japonicum that encodes an immunogenic miracidial antigen
EP0992582A2 (en) Schistosoma recombinant fusion protein vaccine

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20070102

Year of fee payment: 9

LAPS Lapse due to unpaid annual fee