PT90727B - Processo para a preparacao de uma proteina possuindo um ou mais determinantes imuno-reactivos e/ou antigenicos de um antigenio de superficie eimeria e de vacinas contra a coccidiose que a contem - Google Patents

Description

KEHÓRIA DESCRITIVA

DA

PATENTE DE INVENÇÃO ^N2 90.727

F. Hoffmann-La Roche & Cie. Société Anonyme , suiça, com sede em Basileia, Suíça,

EPÍGRAFE:

Processo para a preparaçao de uma proteína possuindo um ou mais determinantes imuno-reactivos e/ou antigénicos de um antigénio de superfície Eimeria e de vacinas contra a coccidiose que a contêm

INVENTORES: Werner Altenburger, Mary-Helen Binger,

Richard Anthony Chizzonite, Richard Allen Kramer,

Peter Thomas Lomedico, Stephen J. McAndrew,

Reivindicação do direito de prioridade' ao abrigo do artigo 42 da Convenção da União de Paris de 20 de Março de 1883.

Prioridade:- U.S.A., 03.06.1988, sob ο N9 202,721

F. HOFFMANN-LA ROCHE & Cie. SOCIÊTÊ ANONYME

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UMA PROTEÍNA POSSUINDO UM OU

MAIS DETERMINANTES IMUNO-REACTIVOS E/OU ANTIGÉNICOS DE UM.

ANTIGÉNIO DE SUPERFÍCIE EIMERIA E DE VACINAS CONTRA A COCCIDIOSE QUE A CONTÉM

A coccidiose é uma doença das aves domésticas causada por parasitas protozoários intra celular es do genero Eimeria .

A doença é largamente endémica, devido à intensa reprodução das aves domésticas e estima-se gue o custo do controlo da doença através de quimioterapia exceda, anualmente, os 100 milhões de dólares, apenas nos Estados Unidos da América . 0 desenvolvimento contínuo da resistência aos fármacos a nt i - co cc i d io se necessita de um contínuo desenvolvimento de novos agentes, num momen. to em que o desenvolvimento do fármaco se torna cada vez mais dispendioso e a aceitação pelo consumidor dos resíduos do fármaco nos animais comestíveis se torna cada vez menor.

Encontra - se bem documentada a protecção imunitária à infecção natural pela coccidiose. A administração diária, controlada, de um pequeno número de oocistos viáveis, durante várias semanas, demonstrou originar uma completa imunidade para uma infecção provocada por uma dose norma Imente v i ru 1 enta £ Rose et al., Pa ra s i to lo gy , 7 3:25 (1 9 76 ); Rose et al., Pa ra s i to 1 o gy , 8 8 :

99 (1 984 ) _7 · A demonstração da resistência adquirida à infecção sugere a possibilidade da construção de uma vacina gue confira imunidade às aves jovens, contornando a necessidade de coccidios táticos químicos. Na realidade, ensaiou-se um tal conceito na formulação Cocciva formulação de Sterwin Laboratories, Opelika,

A la ba ma , E.U.A.

No sentido de se produzir uma vacina contra a coccidio se,Murray et al pedido de patente de invenção europeia, publicação NS 1 67 443, prepararam extractos de esporozóitos ou de oocis_ tos esporula do s de Eimer ia tenella que contêm, pelo menos, 15 polipéptidos, a maioria dos quais se encontra associada à super_ fície do esporozóito. A inj ecção destes extractos nas aves de capoeira reduziu as lesões cecais a seguir à inoculação oral com oocistos esporulados infecciosos de E_. tenel la . Mais recentemente, Schenkel et al., na patente de invenção norte-americana

N° 4 650. 676, descreveram a produção de anticorpos monoclona is contra os merozó ito s da E. tenella . Utilizando estes anticorpos, Schenkel e outros, identificaram diversos antigénios contra os quais os anticorpos se dirigiam. Por incubação prévia dos esporozóitos da E_. tenel la com estes anticorpos e introduzindo, depois, os esporozóitos tratados no cego de aves de capoeira, Schendal e outros demonstraram que existia alguma redução nos níveis de le sões cecais, guando comparados com os esporozóitos de controlo nã o tratados.

Avanços na tecnologia do ADN recombinante tornaram possível uma outra abordagem, isto é, vacinas em subunidades.

Na aplicação dos procedimentos correntes de ADN recombinante^ inseriram-se sequência s específicas de ADN no interior de veículos de ADN ou vectores apropriados, para formar moléculas de

ADN recombinante que eram capazes de se aplicarem nas células hospedeiras. Utilizam-se frequentemente como vectores moléculas de ADN de cordão duplo, circulares, designadas por plasmi dos, e a preparação de tais formas de ADN recombinante implica a utilização de enzimas endonucleases de restrição gue podem cli

va r o ADN em sítios específicos da sequência de bases. Uma vez efectuados os cortes por um enzima de restrição num plasmido e no segmento do ADN estranho que se pretende inserir, podem ligar-se por cova 1 ência as duas moléculas de ADN por uma enzima conheci da como uma ligase. Cohen e outro s , fpa tente de invenção norte-americana Ns 4 237 224 J, Collins et al. £ patente de in venção norte-americana N? 4.304 863 J e Maniatis et al. / Mol ecula r Clonig: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory

982 J, descreveram os métodos gerais para a preparação de tais moléculas de ADN recombinante. Incluem-se aqui como referência essas referências, uma vez que elas ilustram melhor o estado da té eni ca .

Uma vez preparadas, as moléculas de ADN recombinante, podem utilizar-se para originar o produto especificado pela sequência do gene inserido, mas apenas se se verificarem diversas condições. É necessãrio, principa1 mente, que a molécula recombinante seja compatível com a célula hospedeira e, por esse motivo, capaz de se replicar de modo autónomo na célula hospedeira. Trabalhos mais recentes. têm utilizado a Escherichia coli como o organismo hospedeiro, devido ao facto de ser compatível com uma grande va r ieda de de plasmidos recombinantes. Dependendo do sistema vector/célula hospedeira utilizado, introduz-se a molécula de ADN recombinante no hospedeiro por transformação, transdução ou tra nsf ecção .

Pode detectar-se a presença de plasmidos recombinantes nas células hospedeiras através da utilização de actividades indicadoras de plasmidos, tal como a resistência antibióti_ ca. Assim, podia sei ecciona r-se um hospedeiro portador de um plasmido que codifique a produção de uma enzima de degradação

-4de ampicilina, a partir das células inalteradas, desenvolvendo o hospedeiro num meio contendo ampicilina. Podem tirar-se outras vantagens de indicadores de resistência antibiótica guando um plasmido codifica uma segunda actividade de degradação antibiótica num sítio onde a endonuclea se de restrição seleccionada o corta e se insere a sequência do gene estranho. As células hospedeiras contendo plasmidos r ecomb i na nte s adequados ca ra eter i za r - s e-ã o pela resistência ao primeiro antibiótico e sensibilidade ao segundo .

A mera inserção de um plasmido r ecomb ina nte numa célula hospedeira e o isolamento do hospedeiro modificado não assegurará que se produzam quantidades significativas do gene que se pretende. Para que isto se realize, a sequência do gene estranho tem de se fundir numa relação de afinidade correcta com uma região de informação do plasmido, designa da por promotor, para a transcrição do ADN. Em a 1 terna tiva , o ADN estranho pode engloba r o seu próprio promotor, desde que este seja reconheci^ do pelo hospedeiro. Qualquer que seja a sua origem, o promotor é uma sequência de ADN que comanda a ligação da ARN polimerase e, por esse motivo, promove a transcrição do ADN para o ARN mensa geiro (mARN). Dada uma forte promoção que pode proporcionar grandes quantidades de mARN, a produção final do produto genético desejado dependerá da eficácia da transferência do mARN para a proteína . Isto, por sua vez, depende da eficácia de ligação ribossómica ao mARN. Na E_. coli, o sítio de ligação ribossómica do mARN inclui um codão de iniciação (AUG) e uma sequência Sh ine - Da 1 ga r no ( S D ) a montante. Esta sequência , que con têm 3-9 nucleótidos e está localizada 3-11 nucleótidos do codão AUG, é complementar do ARN (rARN) ribossómico da extremida-5-

de 3' da E_. coli 16S £ Shine e Dalgarno, Na ture, 254:34,1975 J.

Aparentemente, a ligação ribossómica ao mARN é facilitada pelo emparelhamento de bases entre a sequência SD do mARN e a sequên.

cia da extremidade 3' do rARN 165. Para uma análise da maximização da expressão dos genes, ver Roberts e Lauer, Methods in

Enzymology, 68 : 473, 1 9 79.

Desenvolveu-se um sistema de expressão, a 1 ter na tivo, com base no operão lacZ em combina ção com os vectores bacteriófagos lambda (Huynh et al., in DNA Cloning: Volume I, D.M. Glover,

Ed.). Neste sistema, construiu-se no fago vector o gene estrutural da β - ga la eto s i da se con j unta mente com o promotor , susceptível de ser induzido, que controla a sua expressão. Um único sítio de clonagem na extremidade 3' do gene da β-ga la eto si da^se originou uma fusão do gene após a inserção de uma cópia de cADN de um mARN ou de um fragmento de ADN genómi co, contendo uma região que codifica uma proteína .

A expressão do gene da β - ga la eto s i da d e origina a pro. dução de uma proteína de fusão que contem 114 Kd de β-galacto. sidase e um polipéptido na extremidade carboxi codificado pela inserção de cADN, desde que a inserção contenha uma sequência de informa ção aberta no mesmo registo da sequência de informação de β-galacto si da se. Pode, então, identificar-se, um bacte riófago que contenha um gene cujo produto é reconhecido por um anti-soro monoclonal ou policlonal, através de rastreios imunológicos das bibliotecas, a seguir à indução da expressão da proteína de fusão utilizando β-D-tio-galaeto-piranosido (IPTG) para inactivar o repressor la cZ . Este sistema de expressão do vector combina a eficiência do sistema de bacteriófagos na embalagem do ADN e a sua introdução dentro das células da E. coli.

com um aumento de estabilidade das fusões dos polipéptidos com 3β- ga la c to s i da se.

' No melhoramento de vacinas por su b - u n i da d e s , fornece-se uma sub-unidade da totalidade do organismo infeccioso ao animal hospedeiro num contexto imunologicamente relevante. A sub_ -unidade pode ser uma proteína purificada do parasita, uma proteí_ na recombina nte ou um fragmento de proteína expresso num sistema heterólogo, um polipéptido de síntese que compreende um único determinante neutra1izante ou uma proteína introduzida por um vector virai tal como a vacinia. O sistema imunológico hospedeiro reage d_e um modo específico à sub-unidade sem ter sido nunca exposto ao parasita total. Após ter sido sensibilizado com uma dose virulenta do organismo infeccioso, o sistema imunológico hospedeiro monta uma defesa eficaz instruída, apenas, pela sub-unidade de vacina à qual foi previamente exposto.

Pode encontrar-se a verificação deste facto na literatura de desenvolvimento dos anticorpos circulantes, secr eçã o de

IgA no epitélio intestinal £ Davis et al., Immunology , 34:879,

978 J, e no sistema imunológico mediado pela célula £ Giambroni et al., Poultry Science, 59_: 38, 1 980 J na resistência adquirida à coccidiose. Para uma análise, ver P.S. Davis in Avian Immunology,

M.E. Rose, Ed., British Poultry Science, Ltd., Edenberg, pp. 361-385 (1 981 ) . 0 envolvimento provav el de diversas armas do sistema imunológico significa que a protecção completa e final pode neces s i ta r da capacidade de imitar aspectos específicos do processo infeccioso natural. Estes aspectos incluem a exposição local no sítio em que é necessária a protecção, a evocação de uma resposta inflamatória às células que processam de modo ordena do os antigé nios, a apresentação de um antigénio de um parasita apropriado e,

possivelmente,a associação com determinantes MHC numa configuração especia 1 de membrana .

A presente invenção proporciona proteína s purificadas ou seus fragmentos, tendo um ou mais determinantes imuno - rea ct i vos e/ou antigénicos de um antigénio de superfície de Eimeria .

De um modo mais particular, a presente invenção proporciona proteína s que possuem um ou mais determinantes imuno-reac tivos e/ou a ntigénico s de um antigénio de superfície de Eimeria, tendo este antigénio de superfície um peso molecular aparente de cerca de 28, 37, 1 20 ou mais do que 200 Kilo-daltons e que se liga e sp e c íf i ca m ente a um ou mais anticorpos monoclonais que se encontram depositados na American Type Culture Collection (ATCC) e com os números de depósito de HB 9707 a HB 9712.

Constituem exemplos das referidas proteínas as proteínas que têm as sequência s aminoã cida s indicadas na Fig. 15, Fig. 17, Fig. 1 9 e na Fig. 21 e os seus equivalentes funcionais. Os re feridos equ iva 1 entes funcionais sao proteínas com uma sequência de aminoácidos derivada das sequência s de aminoácidos anteriormente referidas, por adições, e 1 imina ções, inserções e substituições de aminoácidos, o que faz com que estas proteína s conservem um ou mais determ ina ntes imuno-reactivos e/ou antigénicos de um antigénio de superfície de Eimeria . Pode utilizar-se a referida proteína para a imunização das aves domésticas contra a coccidiose .

A presente invenção proporciona, ainda, anticorpos contra as proteína s anteriormente referidas, especialmente anticorpos tais como os anticorpos monoclonais com os números de aceitação HB 9 707, HB 9708, HB 9709, HB 9710, HB 9711 e HB 9712.

Para além disto, a presente invenção proporciona, ain

da , sequências de ADN que codificam as proteínas anteriormente referidas, vectores recombinantes que englobam tais sequência s de ADN, especialmente vectores recombinantes que são capazes de comandar a expressão das referidas sequências de ADN em organis mos hospedeiros compatíveis e em organismos hospedeiros transfor_ mados com tais vectores recombinantes, espec ialmente organismos hospedeiros trans forma do s capazes de expressar as sequências de

ADN que codificam uma proteína anteriormente referida compreendida no referido vector recombinante.

A presente invenção propor ciona ,a inda , um processo para a prepa ra ção de uma proteína que possua um ou mais determinantes imuno-reactivos e/ou a ntigéni co s de um antigénio de superfície de

Eimer ia tenella , compreendendo esse processo:

aja cultura de um organismo hospedeiro transformado ^c°m um vector recombinante que compreende uma sequência de ADN que codifique a referida proteína sob condições nas quais se expressa a sequência de ADN; e,

b) isolamento da proteína ou do fragmento de proteína a partir da cultura .

A presente invenção proporciona, ainda, um processo para a preparação de um organismo hospedeiro transformado anteriormente referido, compreendendo este processo a transformação do organismo hospedeiro com um vector recombinante que compreenda a sequência de ADN que codifica uma proteína da presente invenção, utilizando métodos jê conhecidos.

A presente invenção proporciona, ainda, vacinas para a protecção das aves doméstica s contra a coccidiose e que são cons tituídas por uma ou mais das proteínas da presente invenção e P°r um veículo f i s io 1 o g i ca mente a ceitavel . Para além disto, a

ί

Ρr es ente i ην ençã ο proporciona, ainda , vacinas para a protecção das aves doméstica s contra a coccidiose que compreendem um vector virai que contém uma sequência de ADN ou um seu fragmento que co difica uma proteína da presente invenção, sendo este vector virai susceptível de expressar a sequência de ADN ou um seu fragmento e um veículo fisiologicamente aceitável.

A presente invenção proporciona ,ainda, um método para a protecção das aves domésticas contra a coccidiose, compreendendo este método a administração de uma quantidade eficaz de uma va_ cina da presente invenção a uma ave doméstica jovem sensível à coccidio se.

Compreender-se-á melhor a presente invenção ao longo da descrição da invenção que a seguir se proporciona e, através do exemplo em conexão com as Figuras seguintes, nas quais:

A Fig. 1 apresenta o resultado de um ELISA de esporozóito de E. tenella . Incuba ram- se diluições de soro imunológ ico

A 4 de rato (MS 107-2; fá ) e soro de controlo de rato (X) com 4x10 esporozóitos vivos purificados. Detectou-se o anticorpo específico ligado aos esporozóitos com um anticorpo anti-IgG do rato conjugado com per ox ida se e o substrato de peroxidase, O-fenilenodiamina . Efectuou-se a leitura da DO 492 numa placa de leitu(r) ra Titertek Multiscarrc

A Fig. 2 a presenta o resultado de um ensaio de mancha

Western efectuado com proteínas so lub i 1 iza da s a partir de esporozóitos de ténia Eimeria . Separaram-se as proteínas solubilizadas dos esporozóitos por electroforese SDS redutora em gel de po 1 ia cr ilami da , em geles a 12,5%, transferiram-se para membranas de n i tro celu lo se e fizeram-se reagir com cada um dos anticorpos.

V i sua 1 i zara m - s e as proteínas específ ica s reconhecidas por cada um

-ΙΟι

/ dos anticorpos, com anticorpo antilgG de rato conjugado com peroxidase e com o substrato de peroxídase 4-cloro -1-nafto 1 . Obser va-se na porção superior das faixas o anticorpo gue reagiu com cada uma das faixas.

A Fig. 3 a presenta os resultados de um ensaio de mancha Western efectuado com proteínas solub il iza da s a partir de es_ porozóitos e merozóitos de E_. tenella e de esporozóitos de E_.

acervu1ina . Incubaram-se diversos anticorpos monoclonais e soros com proteína s de Eimer ia ligadas a nitrocelulo se e visualizaram-se conforme descrito na Fig. 2. Os anticorpos monoclonais utili_ zados incluíam ο 3A 5 (1), o 2OC6 (2), o 7D1 (3), ο 13A6 (4), o

6A 5 (5) e um anticorpo de controlo que não era reactivo com as proteinas de Eimeria . Os soros utilizados incluíam o soro imunológico de rato NQ 107-2 (7) e o soro de controlo (8).

A Fig. 4 apresenta no painel à esquerda o resultado de um ensaio de imu no pr ec i p i ta çã o com proteínas de superfície marca_ 12 5 das com I de esporozóitos de E_. tenel la . Marcaram-se as proteínas da superfície dos esporozóitos quer pelo método de IODOGEN

Ou de IODOBEADS, so1ubi1izaram-se e v i sua 1 i za ra m - s e a seguir a electroforese 5DS em gel de po1 ia crilamida em geles a 12,5% por auto-radiografia . 0 painel à direita apresenta os resultados da imunoprecipitação de proteínas de superfície de esporozóitos mar 1 25 ca da s com I, pelo soro de ratos imunizados com esporozoitos vivos. Incubaram-se os soros de ratos imunizados (105-1 , 105-2,

105-3, 107-1 , 107-2 e 107-3) e soro de rato de controlo (Controlo) com proteína s de superfície dos esporozóitos marcadas com

125 , ,

I e ca ptura ram- se os complexos imuno logιcos através de um anticorpo de rato acoplado a a ga ro s e . So 1 u b i 1 i za ra m-s e os complexos imunológ ico s com tampão simples de Laemmli, separaram-se por

-11 {

SDS em geles a 12,5% e visualizaram-se por auto-radiografia. M representa os pesos moleculares das proteínas indica dora s normalizadas, em Kiloda 1 tons .

A Fig. 5 representa os resultados da imunoprecipita12 5 ção das proteína s de superfície esporozóitos marcadas com I pelos anticorpos monoclonais. Na descrição da Fig. 4, refere-se o procedimento utilizado para identificação das proteínas marca125 das com I captadas por cada um dos anticorpos. Indicam-se, no topo de cada uma das pistas de gel, os anticorpos monoclonais especif ico s para os esporozóitos utilizados e o anticorpo de con trolo (controlo). Indicam-se em Kilodaltons os pesos moleculares das proteínas indicadoras normalizadas.

A Fig. 6 representa micrografia s de contra ste de fase e micrografias normalizadas coradas por imunofluorescência utilizando diversos anticorpos monoclona i s, de lâminas com preparaçõ e s de esporozóitos de E_. t en el la 1 io f i 1 i za do s . As lâminas â es querda dos painéis A, B, C e D são micrografias de contra ste de íase mostrando esporozóitos alongados intactos, com uma porção posterior grande e refrangente (PRB), uma pequena porção anterior refrangente (ARB) e a ex tremida de apical (A) oposta à porção refrangente posterior. 0 lado direito dos painéis A, B, C e D mostram, respectivamente, lâminas tratadas com anticorpos monoclona is 14C3 (específicos para os antigénios de superfície), 6A5 (específico para as proteínas de superfície e da porção refrangente), 11D2 (específico da porção apical dos esporozóitos) e anticorpos de controlo. Localizaram-se os anticorpos que se ligaram às preparações com anticorpos de rato conjugados com roda_ mina, visualizaram-se por ep i f luorescência utilizando um microscópio Leitz Dialux 2^^. Todas as micrografias foram efectuadas

-1 2com uma ampliação de 630 vezes.

A Fig. 7 representa anticorpos corados dos esporozóitos intracélulares e o desenvolvimento do parasita nas células do rim de galináceos. Infectaram-se as células do rim de ga linaceos com esporozóitos e nos intervalos de tempo indicados após a infecção processa ram-se as células para colora ção com a n_ ticorpos. Lavaram-se as culturas antes de se fixarem para se re moverem quaisquer esporozóitos ex tra celulares. Ef ectua ram-se micrografias de contraste de fase e microgra f ia s correspondentes por imunofluorescência utilizando os anticorpos 7D4, 8A2, 7B2 e

5A 3, conforme indicado. Lo ca 1 iza ram-se os anticorpos que se ligaram às preparações com anticorpos do rato conjugados com rodamina e vi sua 1 iza ram-se por epifluorescência . Todas as micrograf ia s foram efectuadas com uma ampliação de 630 vezes.

A Eig. 8 representa a coloração de esporozóitos intracelulares e o desenvolvimento do parasita nas células do rim de galináceos. Ef ectua ra m-se micrografias de contraste de fase e microgra f ia s correspondentes imunof1uorescentes, utilizando os anticorpos monoclonais 14B1 e 19D6, soros imunológicos de galináceos e anticorpos fluorescentes secundários, nos intervalos de tempo indicados.

A Fig. 9 representa a neutralização do desenvolvimento de esporozóitos intra célula res pelos anticorpos anti-esporozóitos. Incubaram-se previamente esporozóitos purificados de E_. tenella , durante 1 hora a 40° C com quaisquer dos anticorpos de controlo (X) ou anticorpos a n t i - e s po ro z ó i to 7D4 (Ο), 8A2 (O), 1431 (9) ou 6A 5 ( ) e depois deixaram-se infectar as culturas de células

MDBK. Também se incubaram previamente os esporozóitos com meio ( Δ ) ou com o fármaco anti-coccidia no, lasalocid (*).

-13Após infecção, mediu-se o desenvolvimento do esporoj ^zóito intracelular pela incorporação de H-ura cilo nas culturas celulares. Uma vez que o la salo ci d evita o desenvolvimento intracelular dos e s por o zó ito s , as culturas previamente tratadas com este fãrmaco apresentaram uma incorporação mínima de ^H-uracilo.

^Λ Fig. 10 representa os resultados de uma electroforese SDS em gel de poliacrilamida / analise da mancha Western de amostras de proteínas de fusão de β-ga la cto si da se de 65 Kd ou de outras amostras, conforme se pode observar. Efectuou-se a analise de mancha Western utilizando anticorpos de murino anti- β -ga la cto si da se (painel A) ou agregados dos anticorpos monoclona i s

7D1, 7D4 e 2OC6 (painel B) em conjunção com anti-corpos do rato desenvolvidos na cabra e conjugados com HPOD. Em cada um dos pai néis, as faixas representam β-ga la ctosi da se (1), indicadores de peso molecular previamente corados, cujas dimensões se indicam à esquerda do painel A em Kd (m), as proteínas totais do agregado de células (2), as proteínas libertadas do agregado celular por ultra-sons (3) e as proteínas solubilizados (4), a partir do agre gado, por gua nidina -HCL , após ter-se submetido aquele a ultra-sons .

A Fig. 11 é uma representa ção esquemática do plasmido pEv/2-4, um plasmido de expressão de proteínas de 65 Kd, contendo uma inserção de ADN EcoRI de 1,7 Kb do ba eter iófa go \m2-4 . Indicam-se, na inserção, as posições dos diversos sítios de enzimas de restrição rela tivamente ao sítio EcoRI, incluindo o PstI (P, o pb 5 3 e 776 ), Kpnl (K, no pb 202), BstNI (Β, no s pb 584, 1 303 e 1412) e Sa u 3A (S, nos pb 1017 e 1 439).

A Fig. 12 representa um mapa de pEV3-SEQ, que contém uma região de ligação múltipla com os sítios indicados inseridos

-14!

!

entre os sítios EcoRI e Sall de pEV-vrf 3 Utilizou-se o ol igonucleó_ tido de síntese CGGTCGACTCGAGCCA, Indicado pela seta a tracejado, como um precursor para análise sequencial da cadeia terminal de

ADN .

A Fig. 13 é um mapa de restrição dos clones de cADN gue codificam as proteína s reconhecidas pelo anticorpo monoclona 1

6A 5 . Apresentam-se os sítios de endonucleases de restrição utilizados para a análise sequencia 1 do ADN de Ma x a m-G i 1 b er t do cADN de

1,1 Kb . 0 sítio EcoRI, entre parênteses, encontra-se na extremidade do cADN de 0,9 Kb . A barra gue se encontra por cima do mapa indica a sequência aberta de leitura previsível a partir da sequência de ADN, com o potencial péptido de sinal, comp1 ementarizado . As linhas gue se encontram na parte inferior do mapa indicam as eliminações exoll utilizadas na análise sequencial do terminu s da cadeia .

A Fig. 14 indica a sequência de nucleótidos da molécula de cADN de 1,1 Kb, que codifica a proteína de 20 Kd reconhecida pe lo anticorpo monoclona 1 6A5 .

A Fig. 15 representa a sequência de aminoácidos da proteína da Fig. 14, previsível a partir da sequência de nucleótidos daquela figura .

A Fig. 16 representa a sequência de nucleótidos da molécula de cADN de 1,7 Kb que codifica a proteína de 65 Kd reconhecida pelos anticorpos monoclonais 7D1, 7D4 e 2OC6.

A Fig. 17 representa a sequência de aminoácidos da pro teína da Fig. 16, previsível a partir da sequência de nucleótidos daquela figura e confirmada pela análise sequencia 1 dos péptidos trípticos produzidos a partir da proteína de 65 Kd expressa. As regiões na sequência de aminoácidos total que correspondem a alguns destes péptidos encontram-se sublinhadas.

-15ί

Α Fig. 18 representa a sequência de nucleótidos da mo lécula de cADN de 1,1 Kh, que codifica a proteína de 28 Kd r e conhecida pelo anticorpo monoclonal 8A 2 .

A Fig. 19 representa a sequência aminoá cida da prote/ na da Fig. 18, previsível a partir da sequência de nucleótidos daquela figura .

A Fig. 20 representa a sequência de nucleótidos da molécula de cADN de 3,2 Kb que codifica a proteína reconhecida pe_ lo anticorpo monoclonal 7B2.

A Fig. 21 representa a sequência de aminoácidos da pro_ teína da Figura 20, previsível a partir da sequência de nucleótidos daquela figura.

A Fig. 22 representa uma análise el e ct ro f o r ê t i ca SDS ,

Sm gel de poliacrilamida , da proteína de 65 Kd purificada por imunoa f inida de . Vi sua 1izou-se o gel por coloração com azul de

Coomassie e por análise da mancha Western. As pistas 2 e 4 e 3 e 5 contêm as proteínas purificadas das duas preparações. As pis_ tas 1 e 6 contêm uma mistura de proteína s indicadoras de peso molecular possuindo os pesos moleculares indicados à esquerda e à direita da figura.

A Fig. 23 representa um gráfico da eluição de HPLC da digestão tríptica reduzida (painel A) e não reduzida (painel B) por β -mer ca ptoeta no 1 da proteína de 65 Kd, mostrando a absorção a 215 mju, em função do tempo de retenção na coluna .

A Fig. 24 a presenta os mapas de restrição de quatro ele mentos do vector base utilizado para recombinação dos genes que codificam os antigénios coccidianos no vírus da vacina . Estes elementos incluem o elemento promotor de 7,5 Kb (a e b, à esquerda), o locus TK (a e b, à direita), parte do plasmídio pUC8

-16( t

/ (c) e o sítio de clonagem múltipla de Ml3tgl31 (d). O sentido transcrição dos promotores virais 7,5K e TK é da direita para a esquerda (isto é, de BglII para o sítio de restrição EcoRI na região de ligação múltipla). A Fig. 25 apresenta a se quência de aminoácidos da extremidade 1! do antigénio de Eimeria reconhecido pelo anticorpo monoclona 1 8A2 (A) expresso a par_ tir de uma construção que contém o codão de início de transferência AUG no elemento de ligação múltipla do vector da Fig.

24, e (B) fundido com o segmento pr inci pa 1 de 190 Kd da malária (primeiros 34 aminoácidos) e a região de ligação múltipla do vsc tor de clonagem de Fig. 24 (os 13 aminoácidos seguintes). Durante o processo de maturação da proteína , os primeiros 19 aminoácidos da extremidade N podem clivar-se na posição indicada por dois pontos.

tf figuras, utiliza ram-se abreviaturas normalizadas de uma só letra para representar os nucleótidos e abreviaturas ⁿ°rmalizadas de uma ou três letras para representar os aminoácidos. Os significados destas abreviaturas podem encontrar-se ^em tratados de bioquímica, tais como Lehninger, Pr inci pies of

B io ch em i str y, New York, Worth Publishers, Inc. , 1 984, pp. 96,

798. Na presente invenção utiliza ram-se as seguintes expressões, com os seguintes significados:

proteína de 20 Kd significa uma proteína recombinan te ou de síntese possuindo um peso molecular aparente de cerca de 20 Kilodaltons em e 1 ectro f o r es e SDS em gel de poliacrilamida, que se liga es pe c i f i ca mente ao anticorpo monoclona 1 6A 5 . Este anticorpo também reage de um modo específico com o antigénio de superfície de Eimeria (a partir do extracto total das proteínas de Eimeria ) possuindo um peso molecular aparente de cerca de 28

-1 7ό.

Kilodaltons em geles SDS. Este antigénio encontra-se presente na fase de desenvolvimento do esporozóito. Nas Figs 14 e 15, respectivamente, apresenta-se a sequência de nucleótidos de uma molécula de cADN que codifica esta proteína e a sequência de aminoácidos previsível a partir dela.

proteína de 65 Kd significa uma proteína recombina n_ te ou de síntese, que possui um peso molecular aparente de cerca de 65 Kilodaltons em el e ctr o f o r es e SDS em gel de poliacrilamida que se liga especif icamente aos anticorpos monoclonais 7D1, 7D4 e

20c6 . Estes anticorpos também reagem, de um modo específico, com um antigénio de superfície de extractos de Eimeria possuindo um peso molecular a pa rente de cerca de 120 Kilodaltons em geles SDS.

Este antigénio encontra-se presente, nos estádios de desenvolvimento esporozóito, esqu izonte e merozóito. Nas Figs 16 e 17, respectivamente, apresentam-se as sequências de nucleótidos da molécula de cADN que codifica esta proteína e a sequência de aminoácidos pr ev i s ív el a partir dela .

proteína 28 Kd refere-se a uma proteína recombinan_ te ou de síntese que possui um peso molecular aparente de cerca de 28 Kilodaltons em electrof orese SDS em gel de poliacrilamida, que se liga especif icamente ao anticorpo monoclonal 8A 2 . Es t e anticorpo também reage específicamente com um antigénio de su perfície de Eimeria que possui um peso molecular aparente de cerca de 37 Kilodaltons, em geles SDS. Este antigénio encontra -se presente nos e s tá d io s de desenvolvimento esporozóito, esqui zonte e merozóito. Nas Figs 18 e 19, respectivamente, indicam-se a sequência de nucleótidos de uma molécula de cADN gue codi fica esta proteína e a sequência de aminoácidos previsível a par tir desta .

-18i proteína de 45 Kd refere-se a uma proteína que possui um peso molecular a pa rente de cerca de 45 Kiloda Itons em el ectrofor ese SDS em gel de poliacrilamida, que se liga de um modo específico ao anticorpo monoclonal 7B2. Este anticorpo também reage especificamente com um antigénio de superfície de

Eimeria que possui um peso molecular aparente superior a 200 Ki ioda itons em geles SDS. Este antigénio encontra-se presente no estádio de desenvolvimento do esporozóito. As Eigs. 20 e 21 apre sentam, respectivamente, a sequência de nucleótidos de uma molé_ cuia de cADN que codifica esta proteína e a sequência de aminoa eidos que se prevê a partir dela.

A expressão proteína que possui um ou mais determinantes imuno-react ivo s e/ou antigénicos de um antigénio de super fície de Eimer ia refere-se a uma proteína gue possui uma ou mais regiões ou epítopes gue são capazes de extrair uma resposta imunológica num organismo hospedeiro competente e/ou sao capazes de se ligarem especificamente a um anticorpo complementa r .

Devido à degenerescência do código genético, compreen der-se-á que existem muitas sequências de nucleótidos potência i s (equivalentes funcionais que podiam codificar as sequências de aminoácidos apresentadas nas Figs 15, 17, 19 e 21). Também deverá entender - se que as sequência s de nucleótidos das sequências de ADN e fragmentos da presente invenção inseridos no interior de vectores podem englobar nucleótidos que não fazem parte dos actuais genes estruturais, desde que os vectores recombinantes ^e fragmentos sejam capazes de comandar a produção, num organis mo hospedeiro adequado, de uma proteína ou fragmento que possua ^um ou mais determinantes imuno-reactivos e/ou antigénicos de um antigénio de superfície de Eimeria.

-1 9/

Para além disto, as substituições aminoacidas nas proteína s, que não alteram essencialmente as actividades biológica e imunológ ica são conhecida s e foram descritas, por exemplo, por Neurath et al. in Th e Pro teins, New York, Academic

Press, 1979, especialmente na Fig. 6, pagina 14. As substituições aminoacidas mais frequentemente observadas são Ala / Ser,

Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr , Ser /Asn , Ala /Va 1 ,

Ser/Gly , Tyr/Phe, Ala / Pro , Lys/Arg, Asp /Asn , Leu / Ile, Leu /Va 1 ,

Ala/Glu, Asp/Gly, e vice-versa.

Tais variações de sequências de nucleótidos funcional_ mente equivalentes e substituições aminoacidas dos aspectos ex emp 1 i f i ca tivo s da presente invenção encontram-se abrangidas pelo âmbito da presente invenção desde que as proteínas resultantes conservem um ou mais determinantes imuno-reactivos e/ou antigénicos de um antigénio de superfície de B im e r ia .

termo fragmento refere-se a uma sequência de ADN ou proteína que compreenda uma su b sequência de um dos cADNs ou proteína s da presente invenção . Tais fragmentos podem ser produzidos por clivagem enzimática das moléculas maiores utilizan do endonuclea ses de restrição para o ADN e protea ses para as proteínas. Contudo, os fragmentos da presente invenção, não se limitam aos produtos de qualquer forma de clivagem enzimática, mas incluem subsequências cujas extremidades não correspondem a quaisquer pontos de clivagem. Podem produzir-se tais fragmen tos, por exemplo, por síntese química, utilizando os dados sequenciais que aqui se fornecem. Podem produzir-se os fragmentos de ADN por síntese incompleta do ADN (cADN) complementar a

Partir do ARN mensageiro (mARN) isolado. Podem também produzir-se os fragmentos de proteína expressando os fragmentos de

-20/

ADN que codificam os fragmentos de proteína. Estes fragmentos de proteína podem ser úteis na presente invenção se contiveram ^um número de resíduos de aminoácidos suficiente para constituir um determina nte imuno-rea ctivo e/ou antigénico. De um modo geral, são necessários, pelo menos, 7 ou 8 resíduos. Conforme se expõe a seguir, pode ser necessário acoplar estes fragmentos a uma molécula imunogénica de transporte, para torná-los imuno-reactivos .

Podem produzir-se as proteínas da presente invenção segundo métodos conhecidos na especia 1 i da de, a ss im como pela metodologia do ADN recombinante, síntese química ou isolamento das preparações de Eimeria .

O ADN necessá r io para se produzirem as proteínas da presente invenção pode ser sintetizado quimicamente, utilizando a informa ção sobre as sequência s de nucleótidos fornecida nas Figs. 14, 16, 18 e 20. Pode efectuar-se esta síntese quími ca utilizando qualquer dos métodos conhecidos, apesar de se pre ferir o método de suporte sólido de fosforamidite de Matteucci e outros Ç J. Am . Chem. Soc. , 10 3: 31 85, 1 981 J.

Pode produz ir-se o cADN de um modo alternativo, a par tir do mARN de Eimeria . Pode isolar-se o ARN mensageiro a partir dos oocistos ou merozóitos da esporulação de Eimeria, utilizando técnicas norma 1 izada s . Podem, então, utilizar-se estas amostras de mARN para produzir cADN de cordão duplo, conforme descrito por Maniatis e outros, su pra . Depois, pode inserir-se este cADN no interior de um vector de clonagem adequado que se pode utilizar para transformar a E_. co li, para produzir uma biblioteca de cADN.

Depois, pode rastrear-se a biblioteca de cADN utili-21-

zando os genes cionados da presente invenção, ou seus fragmen tos, como sondas. Tais genes ou fragmentos podem ser marcados ra dioa ctivamente, por exemplo por marcação radioactiva do ADN ( nick-translation) utilizando ADN polimera se Pol I, na presença de quatro desoxi-ribonucleótidos, um dos guais contém 3 2

P na posição oc (Mania tis e outros, supra , P. 109), para serem utilizados como sondas.

Embora no exemplo seguinte se utilize a Eimer ia tenella como uma fonte de mARN, podem utilizar-se os genes clo_ nados desta espécie como sondas para se isolarem os genes de outras espécies de E ime r ia, devido à homo1 o g ia da sequência de

ADN entre as diver sa s espécies.

Uma vez identificados e isolados, inserem-se os genes de E imeria da presente invenção num veículo de expressão adequado gue contém os elementos necessa io s para a transcrição e transferência das sequências do gene inser ida s . Os veículos de clonagem adequados podem consistir em segmentos de sequências de ADN cromossómico, não cromossómico e de síntese, bem como de diversos plasmidos bacterianos conhecidos, ADN de bacteriófagos, combinações de ADN s pia smídico s e de ADNs de bac^zer iofagos, bem como os plasmidos gue se modificaram para se empregar ADN de bacteriófago ou outras sequências de controlo de expressão, ou plasmidos de leveduras. Veículos de clonagem especif ico s que se podem utilizar e que são do conhecimento dos especialistas incluem mas não se limitam aos plasmidos pEV-vrf (pEV-vrfl, -2 e -3); SV 40; adenovírus; leveduras; lambda gt-WES-lambda B; Charon 4A e 28; la mb da - gt-11 - la mb da B; vectores derivados de M13 tais como pUC8, 9, 18 e 19, pBR 31 3, 322 e 325 ;

PAC105; pVA51 ; pACY177; pKH47; pACYCl 8 4 ; pUBl 10 ; pMB9; colEl;

-22pSClOl; pml21; RSF2124; pCRl ou RP4.

Realiza-se facilmente a inserção dos genes de Eimeria no interior de um vector de clonagem guando os genes e o veículo de clonagem desejado foram cortados com a mesma enzima ou enzimas de restrição, uma vez que a ex tremida de complementar do ADN se produz deste modo. Se isto não se puder realizar, pode ser necessá r io modif ica r as extremidades de corte que se produziram, invertendo a digestão do ADN de cordão simples para se produzirem ex tremida des complementares, ou pode atingir-se o mesmo resultado comp1 ementarizando as ex tremida des cordão simples com uma ADN polimerase adequada. Deste modo, pode efectuar-se a ligação das extremidades complementares com uma enzima tal como a ADN ligase T4. Alternativamente, pode pro_ duz ir-se qualquer sítio desejado ligando as sequência s de nucleótidos (1 iga ntes ) à extremidade do ADN. Estes ligantes podem compreender sequências de o 1 i gonu cl eót i do s específicas que codificam sequência s de reconhecimento dos sítios de restrição. 0 vector clivado e os genes de Eimer ia podem também modificar_

-se por corte homopo1imérico conforme descrito por Morrow £ Methods in Enzymology, 68: 3, 1 9 79 }.

Muitos dos veículos de dona gem que se podem utilizar na presente invenção contêm um ou mais actividades indicadoras que se podem utilizar para seleccionar os t ra n sf o rma nte s desejados, tal como a resistência â ampicilina e à tetraciclina no pBR322, a resistência à ampicilina e a divida de β-ga la c_ tosidase no pUC8, e resistência à ampicilina no pEV-vrf 2. A selecção da célula hospedeira dentro da qual se inseriram estes vectores é grandemente simplificada quando as células hospedei_ ras, de um modo diferente, perdem as actividades para as quais

os vectores contribuíram.

Deve ter-se em conta que as sequências de nucleótidos dos genes de Eimeria inseridos num sítio seleccionado de um veículo de clonagem podem incluir nucleótidos que não façam parte dos actuais genes estruturais. De um modo a Iterna ti_ vo, o gene pode conter apenas em parte o gene completo de tipo selvagem. 0 que é necessário é que os fragmentos de genes inseridos no veículo de clonagem sejam capazes de comandar a produção num organismo hospedeiro adequado, de um polipéptido ou proteína que possua, pelo menos, um determinante imuno-reac tivo e/ou antigénico de um antigénio de superfície de Eimeria .

A selecção de um organismo hospedeiro adequado é afec_ tada por numerosos factores conhecidos na especialidade. Estes factores incluem, por exemplo, a compatibilidade com o vector escolhido, a tox icida de das proteínas codificadas pelo plasmido híbrido, facilidade de recuperação da proteína desejada, características de expressão, segurança biológica e custos. De ve fazer-se um balanço destes factores, e deve ter-se em atenção que os hospedeiros não sao todos igualmente eficazes na ex_ pressão de uma dada mol éc ila de ADN recombínante.

Os organismos unicelulares hospedeiros que se podem utilizar na presente invenção incluem, mas não se limitam a cé_ lulas de plantas, de mamíferos e de levedura s e bactérias tais como a Escherichia coli, o Ba ci 1lu s subtilis, o Ba cillus sstea rothermophilu s e o Actinomgces. Prefere-se, especialmente, a estirpe MC1O61 da Escherichia coli, que foi descrita por

O³ sa da ba n e outros í J. Mo 1 . Biol . , 1 3 8 :1 7 9 , 1980 J. Pode utilizar-se esta estirpe ou qualquer outra estirpe K-l 2 de E_. co 1 i que contenha o plasmido pRK248c!ts. 0 plasmido pRK248c!ts para

-24/ i

_ser utilizado noutras estirpes K-12 de E_. coli encontra -se disponível na American Type Cúlture Collection e possui o número de depósito 33766 ATCC. -A estirpe MC1061 de E_. coli também se encontra depositada e possui o número de depósito 53338, do ATCC.

A transferência do vector de clonagem recombinante para o interior da célula hospedeira pode ser efectuada de diversos mo do s . Dependendo do sistema particular v e cto r / cé 1 u la hospedeira es colhido, essa transferência pode ser efectuada por transformação, transdução ou transfecção. Uma vez produzida uma tal célula modificada, pode cultivar-se a célula e pode isolar-se da cultura o produto de expressão da proteína.

Podem identif ica r-se os clones que produzem as proteínas de Eimer ia da presente invenção utilizando anticorpos adequados marcados especif ico s para as proteínas. Podem preparar-se os anticorpos monoclonais preferidos utilizando métodos normalizados, conforme se segue.

Utiliza ram-s e as proteínas a ntigéni ca s da Eimer ia tenella para imunizar animais tais como ratos, ratazanas, cavalos, ovídeos, porcos, coelhos, etc., para se obterem células somáticas produtoras de anticorpos para fusão com células de mieloma .

As células somáticas com potencial para produzirem anticorpos, especialmente as células B, são adequadas para fusão com uma linha de células de mieloma. Estas células somáticas podem ser derivadas de nódulos linfáticos, baço e sangue periférico de ani^ma ί s aprontados. No aspecto preferido da presente invenção, utilizam-se células do baço de rato, em parte devido ao facto destas ^células produzirem uma percentagem r ela tiva mente alta de fusões estáveis com linhas de mieloma de rato. No entanto, seria possível utilizar células de rato, coelho, rã ou ainda outras células.

Des envo Iv era m - s e as linhas de células especializadas de mieloma a partir de tumores linfocíticas, para se utilizarem nos pro. cedimento s de fusão para produção do hibridoma £ Kohler e Milstein, Eur . J . Immunol . 6.:511 (1 976 ); Shulman et al., Na ture,

276:269, 1 9 78 ; Volk et al., J_. V i ro 1 . , 42:220, 1 982 2, Desenvolve, ram-se estas linhas de células, pelo menos por três razões. A pri. meira consiste em facilitar a selecção dos hibridomas fundidos dos não fundidos e das célula s de mieloma que se a u to - p ro pa ga m de ^modo semelhante e indefinidamente.

Isto r ea 1 iza - se , habitualmente, utilizando mieloma s com de f i ciência s enz imatica s que os tornam inca pazes de desenvolver em determinados meios sei ectivo s que sustentam o crescimento dos hibridomas. A segunda razão reside na capacidade inerente das cé_ lulas tumorais linfocíticas para produzirem os seus próprios anticorpos. A f ina 1 ida de da util iza ção de técnicas monoclonais é a obtenção de linhas de células híbridas fundida s com um tempo de vida ilimitado que produzem os únicos anticorpos desejados sob o controlo genético das células somáticas componentes do hibridoma.

Para se eliminar a produção de anticorpos de células tumorais pelos hibridomas, utilizam-se linhas de células de mieloma incapazes de produzir cadeias de i mu no g 1 o bu 1 i na leves ou pesadas ou mecanismos deficientes na secreção de anticorpos. A terceira razão para selecção destas linhas de células reside no facto de serem adequadas e eficazes para fusão.

Podem utilizar-se muitas linhas de células de mieloma para a produção de híbridos celulares fundidos, incluindo, por exemplo, P3/X63-Ag 8, P3/NSI/l-Ag 4-1, SP2/O-Ag-14 e S1 9 4 / 5. XXO. BU. 1 .

As linhas de células P 3 /X 63-Ag 8 e P3/NSI/l-Ag 4-1 foram descritas por Kohler e Milstein £ Eur. J. Immunol., 6:511, 1976 J.

Shulman e outros } Natur e , 276:269, 1 978 J desenvolveram a linha de células de mieloma Sp 2/O-Agl 4 . A linha SI 94/5.XXO.BU.1 foi referida por Trowbridge } }· Ex p . Med. , 1 4 8 : 31 3. 1 979 3 . No exem. pio da presente invenção, utilizou-se a linha de células de rato PAI-O (um sub-clone de P3/X63-Ag 8 não produtor de Ig).

Os métodos para se originarem h íbr ido s de células do baço, de células de nódulos linfáticos ou de células de mieloma produtoras de anticorpos envolve, usualmente, a mistura de células somáticas com células de mieloma numa proporção, r espectivaMente, de 10:1 (embora a proporção possa variar de cerca de 20:1 a cerca de 1:1), na presença de um agente ou agentes (químicos, ^V1rais ou eléctricos) que promovem a fusão das membranas celulares. Será preferível que a mesma espécie de animal sirva como fonte das células somáticas e de mieloma utilizadas nos procedimentos de fusão. Os métodos de fusão foram descritos por KÕhler e Μ i 1 st ei n } Na tur e , 25 6 : 49 5 , 1 9 7 5, e Eur . J . Immunol . , 6_: 511 , 19 76}, por Gefter e outros } Somat i c Cell Genet. 3.:231, 1 9 77 }, e por Volk e outros LL· V i rol . 4 2: 220, 1 982 }. Os agentes promotores de fusão utilizados por estes investigadores foram o vírus Sendai e o po1ieti1enog1ico1 (PEG). Nos procedimentos de fusão do exemplo da presente invenção utiliza-se o PEG.

Devido ao facto dos procedimentos de fusão produzirem híbridos viáveis a uma frequência muito baixa (por exemplo, quando se utilizam células de baço como fonte de células somáticas, apenas se obtêm um híbrido, de um modo rudimentar, por cada 1X10$ células de baço), é essencial possuir meios para a selecção das células híbridas fundidas das restantes células que não se fundiram, especia lmente das células de mieloma que não se fundiram. Também é necessário um meio para se detecta r em os híbrido-27-

ma s desejados, produtores de anticorpos, de entre as outras célu.

la s híbridas resultantes .

Geralmente, efectua-se a selecção das células híbridas fundidas efectuando uma cultura das células num meio gue sustente o crescimento dos hibridomas e evite o crescimento das células de mieloma gue, normalmente, se dividiriam indefinidamente. (As células somáticas utilizadas na fusão não conservam uma via_ bilidade a longo prazo na cultura i n vitro e, por isso, não cons.

tituem problema). No exemplo da presente invenção, utilizam-se células de mieloma gue não possuem Hipoxantina-fosfo-ribosilo-transferase (HPRT negativas). A selecção destas células realiZa-se em meio de h i pox a nt ina/a m i no pte r i na /1 im i d i na (HAT), um meio no gual as células híbridas fundida s sobrevivem devido ao genóti. Po HPTR positivo das células de baço. Também ê possível a utilização de células de mieloma com deficiências genética s diferentes (sensibilidade aos fármacos, etc.) gue se podem seleccionar em meio gue su por te o crescimento de híbridos g eno t i p i ca mente com.

Petentes.

São necessárias algumas semanas para se cultivarem selectivamente as células h í brida s fundidas. No início deste inter. valo de tempo é necessário identificar os híbridos que produzem o anticorpo desejado, depois do que se podem subsequentemente cionar e propagar. De um modo geral, cerca de 10% dos híbridos obtidos produzem o anticorpo deseja do, embora não seja raro um intervalo entre 1 e 30%. A detecção dos híbridos produtores do anticorpo pode r ea 1 iza r-se por qualquer dos diversos métodos de ensaio normalizados, incluindo o imuno-ensa io ligado a uma enzima e técnica s de rádio-imuno-ensa io descr íta s na literatura £ ver, por exemplo, Kennet e outros (editores), Monoclonal

-28Antibodies e Hybri domas: A New Dimension in Biological Analy ses,

New York Plenum Press, 1 980, pp. 376-384 J. No exemplo da presen.

te invenção util iza ram-se diversos métodos de detecção .

dma vez seleccionadas as células híbridas fundidas que se pretendem e dona da s em linhas de células indivídua i s produtoras do anticorpo, cada linha de células pode propagar-se segun. do dois modos normalizados. Pode injectar-se uma suspensão de cé lulas de hibridoma num animal histocompa tivel . O animal injectado desenvolverá, então, tumores que segregarão o anticorpo monoclonal produzido pelas células híbridas fundidas. Podem drenar-se os fluidos orgânicos do animal, tais como soro ou fluido ascítico, para proporcionar anticorpos monoclona is em alta concentração. De um modo alternativo, podem propagar-se as linhas de células indi_ viduais, in vitro, em tubos de cultura laboratorial. 0 meio de cultura, contendo elevadas concentrações de um único anticorpo monoclona 1 específico, pode ser recolhido por decantação, filtra, ção ou centrifugação.

Se produzidas na E_. co li, as proteínas de Eimeria mantêm-se no citoplasma ou nos corpos de inclusão. Para libertar as

Proteínas é, portanto, necessário romper a membrana exterior. Is to realiza-se, de preferência, por tra tamento com ultra-sons, ou segundo outros meios mecânicos para ruptura de membranas, tal como uma célula de pressão Francesa ou homogeneíza dor Gaulin.

Também se pode realizar a ruptura da célula por meios mecâ n i co s ou enz imát i co s. Dado que são muitas vezes necessários catiões bivalentes para a integridade da membrana celular, o tra tamento com agentes tais como o EDTA ou EGTA pode proporcionar ruptura suficiente de modo a facilitar a cisão das proteínas das células. De modo idêntico, utilizaram-se enzimas tais como a liso

z ima para se atingir o mesmo resultado. Aquela enzima hidrolisa a estrutura de pept i dogl ica no da parede celular.

Também se pode aplicar o choque o smóti co. Resumidamente, pode realizar-se isto colocando em primeiro lugar as células numa solução hipertónica que fará com que elas percam água e se contraiam. A colocação subsequente numa solução hipotónica de choque levaria a um rápido influxo de água para o interior das células com a expulsão das proteínas desejadas.

Uma vez libertas das células, podem concentra r-se as pro_ teínas de Eimer ia por precipitação com sais tais como o sulfato de sódio ou de amónio, por u 1 tra f i Itra ção ou segundo outros méto_ dos bem conhecidos pelo especialista . Depois, pode realizar-se a purificação segundo as técnicas normalizadas de purificação de proteínas incluindo, mas não se 1 im ita ndo , a filtração sobre ge les, cromatografia de permuta iónica, el e ctro f o r e se preparatória

Sobre gel tampão ou de barragem, localização i so e 1 éctr i ca , fraccionamento do dissolvente orgânico a baixa temperatura, ou distribuição em contra -cor r ente. No entanto, a purificação efectua-se, de preferência, por cromatografia de imuno-a f in i da de , confor me se descreve adiante.

Também se podem sintetizar qu im i ca mente as proteínas da presente invenção ou os seus fragmentos, de acordo com um método adequado, tal como síntese exclusiva em fase sólida, métodos de fase sólida parcial, síntese por condensa ção do fragmento ou síntese de solução clássica . Dá-se preferência à síntese em fase sólida conforme descrito por Merrífield £ J. Am. Chem. Soc., 85:

2149 , 1 96 3 J.

Efectua-se esta síntese com aminoácidos protegidos na extremidade alfa-amino. Também se protegem com grupos adequados

-30J i

os aminoácidos tr ifunciona is com cadeias laterais lábeis, para se evitar a possível ocorrência de uma reacção química neste lo cal do pe'ptido durante a associação do péptido. Remove-se o gru_ po protector do grupe alfa -amino para permitir gue a reacção se realize na extremidade amino. As condições para a remoção do gru po protector do grupo a lf a -amino não causam desprotecção dos gru pos protectores de cadeia lateral.

Os grupos protectores do grupo a 1 fa -amino são os que são conhecidos na especia 1 ida de da síntese de péptidos passo a passo. Incluem os grupos protectores de tipo acilo (por exemplo, formilo, tr ifluoroa cetilo, acetilo), grupos protectores de tipo uretana aromática (por exemplo, b enz i lox i - ca r bon i 1 o (Cbz ) e benzi loxicarboni1 o substituído), grupos protectores de tipo uretana a 1 if ática (por exemplo , t-bu t i lox i - ca r bo n i 1 o (Boc), i so p ro p i 1 ox i_ ca rbonilo, ciclo-hex il oxi -ca rbonilo) e grupos protectores de tipo ãlquilo (por exemplo, benzilo, trifenil-metilo). 0 grupo protector preferido é o Boc. Os grupos protectores da cadeia lateral para a Tyr, incluem o tetra-hidro-propanilo, o t_-butilo, o triilo, o ben zilo, Cbz, 4-Br-Cbz e 2, 6-dicloro-benz ilo . 0 grupo protector preferido para a Tyir é o 2,6-dicioro-benzi1 o. Os grupos protectores da cadeia lateral para a Asp incluem o benzilo, o 2,6-dicloro-benzilo, o metilo, o etilo e o ciclo-bexilo. 0 grupo protector preferido da cadeia lateral para a Asp é o ciclo-hexilo. Os grupos protectores da cadeia lateral para a Thr e Ser incluem o acetilo, o benzoilo, o tr i tilo, o t et ra -h i d r o - p i ra η i 1 ο , o benzilo, o 2, 6-dicl oro-benzi1 o e Cbz. O grupo protector preferido para a Thr e para a Ser é o benzilo. Os grupos protectores da ca deia lateral para a Arg incluem o nitro, Tos, Cbz, a da ma nt i 1 ox i - ca r bo nilo ou Boc. O grupo protector preferido para a Arg é o Tos. Po-31-

dem proteger-se os grupos amino da cadeia lateral da Lys com Cbz ,

2-ClCbz, Tos ou Boc. O grupo 2-Cl-Cbz é o grupo protector preferido para a Lys. A selecção dos grupos protector es da cadeia lateral baseiam-se no seguinte: que os grupos protectores de cadeia latera 1 se mantenham intactos durante o acoplamento e que não se separem durante a desprotecção do grupo protector da ex tremi da de amino ou nas condições de acoplamento. Os grupos protectores da cadeia lateral devem ser removíveis após ter-se completado a síntese do péptido final, utilizando condições de reacção que não a 1teram o péptido alvo.

Efectua-se, ha bitua Imente, a síntese em fase sólida a partir da extremidade carboxi por acoplamento do aminoácido alfa -amino protegido (cadeia lateral protegida) a um suporte sólido adequado. Forma-se uma ligação éster quando se efectua a ligação a uma resina clorometila da ou de hidrox i-metilo e o péptido alvo resultante possuirá um grupo carboxilo livre na extremidade

C. Como alternativa, utiliza-se uma resina de benz idr ilamina ou de p-met i 1 benz i dr i la m ina , formando-se, neste caso, uma ponte amida e o péptido alvo resultante possuirá um grupo ca r box i-a m i da na ex tremida de C. Estas resinas encontram-se comercialmente disponíveis e Stewart e outros descrevem a sua preparação em Sol id Pha se

Peptide Synthesis (2½ Edição, Pierce Chemical Co., Rockford, Ll.,

1984).

Acoplou-se o aminoácido da extremidade C, Arg, protegido na cadeia lateral com Tos e na função alfa-amino com Boc, a uma resina de benz idr ilamina utilizando diversos agentes activadores incluindo a d i c i c 1 o-h ex i 1 - ca r bo d i im i da (DCC), Ν , N ' - d i i so pro p i 1-carbodiimida e carbonil-diimidazol. A seguir à ligação ao supor te de resina, remove-se o grupo protector alfa-amino, utili.

-3 2ou ácido clorídrico em dioxano a entre 0° e 2 5°C . Adiciona - se sulfu ácido tr í f 1 uoroa cét i co (TFA) uma temperatura compreendida reto de dimetilo ao TFA após a introdução de metionina (Met) para suprimir a possível S-a 1 gu i la çã o . Após remoção do grupo pro. tector do grupo alfa-amino, juntam-se os restantes aminoácidos passo a passo, segundo a ordem requer ida para se obter a sequên. cia peptidica de se ja da .

Podem utilizar-se diversos agentes activadores para as reacções de acoplamento, incluindo DDC, N, N ' - d i - i so pro p i 1 - ca r bo.

diimida, hexafluoro-fosfato de benzotriazol-1 -i1-oxi-tris-(dimetilamino)-fosfónio (BOP) e DCC-Hidroxi-benzotriaζo 1 (HOBt). Utiliza-se cada um dos aminoácidos protegidos em excesso ( > 2, 5 equi_ valentes) e, norma lmente, efectuam-se as ligações em DMF, CH ?C1 ? ou misturas dos mesmos. Acompanha-se em cada um dos passos, o com pleto acoplamento, pela reacção de n i n i dr i na , conforme descrito por Kaiser ^e °utros, Anal. Biochem ., 34 : 595 , 1 9 70. Nos casos em que se deter mina um acoplamento incompleto repete-se a reacção de a copla mento .

Podem efectuar-se as rea cções de acoplamento, automática mente, num Vega 250, sintetiza dor da Applied Biosystems ou noutro instrumen. to que se encontre co m e r c ia 1 me n t e disponível. Após ligação comple. ta do péptido alvo, d e sp r ote g e - s e o páptido-resína com TFA/ditio-etano e, depois, cliva-se com um rea gente tal como HF líquido, durante 1-2 horas a 0°C, o que cliva o péptido da resina e remove todos os grupos protectores da cadeia lateral.

A cicl ização da cadeia la tera1 sobre o suporte sólido requer a utilização de um esquema de protecção ortogonal que possibilite a clivagem selectiva das funções da cadeia lateral dos aminoácidos 3 cídico s (por exemplo, Asp) e dos aminoácidos básicos (por exemplo, Lys). Com esta finalidade pode utilizar-se o grupo protector

9-fluorenil-metilo (OEm) para a cadeia lateral da Asp e o grupo protector 9-fluorenil-metoxi-carbonilo (Fmoc) para a cadeia lateral da Lgs. Nestes casos os grupos protectores da cadeia la te ral do peptido-resina protegidos com Boc são selectivamente removidos com pi per idina em dimetilformamida . Realiza-se a ciclização sobre suporte sólido utilizando diversos agentes activadores, incluindo. DCC, DCC/HOBt ou BOP. Efectua-se a reacção HF no péptido-resina ciclizado conforme anteriormente descrito.

Pode efectuar-se a purificação das proteínas de síntese, conforme anteriormente descrito para as proteínas produz ida s de modo recombinante.

Também se podem recuperar as proteínas Eimer ia a partir de extractos das proteínas da membrana da E_. tenella ou de ou_ tras espécies de E im er ia por imunoprecip ita ção ou por cromatograf ia de imuno-a f inida de. Conforme já anteriormente observado, estes métodos podem produzir as proteína s completas de tipo primiti_ vo . Nalguns casos, estas proteínas são maiores do que as proteínas produzidas pela metodologia do ADN recombinante. Os anticorpos monoclona i s para esta f ina 1 ida de podem produzir-se conforme anteriormente descrito, utilizando como antígeno, proteínas Eimeria de síntese ou naturais.

Outras prote ina s úteis que possuem os determinantes imu no reactivos e/ou a nt i gén i co s necessários são os anticor pos ou seus fragmentos que são anti-idiotípicos no que respeita ao deter minante ou determinantes activos das proteínas da presente inven ção. Podem dirigir-se estes anticorpos anti-idiotípicos contra outros anticorpos gue sejam específicos para os determinantes das proteínas da presente invenção (isto é, os anticorpos anti-idiotípicos são a nt i-a nt i co r po s ) . De um modo preferencial, utilizam-347 ~se anticorpos monoclonais anti-idiotípicos. Podem administrar-se estes anticorpos como uma vacina, do mesmo modo que se podem utilizar as próprias proteínas de Eimeria .

Podem formular-se uma ou mais proteínas e anticorpos a nt i - i d io t í p i co s , em vacinas que compreendam as proteína s e um veículo f i s iolo g i camente aceitável. Os veículos adequados incluem, por exemplo, tampão fosfato 0,01 a 0,1 M de pH neutro ou solução salina fisiológica. Pode produzir-se uma imunidade reforçada con tra a coccidiose, segundo uma de duas vias. Em primeiro lugar, po de adicionar-se à vacina um adjuvante ou imuno-potencia dor. Em se gundo lugar, podem a dm in i s tra r - s e as proteínas da presente invenção a um animal que se pretende imunizar, segundo uma forma mais ampla, quer como um complexo ligado de modo reticular, quer conjugado com uma molécula veículo.

Os adjuvantes adequados para a vacinação de animais incluem, mas não se limitam ao Adjuvante 65 (contendo óleo de amen_ doim, mono-oleato de manitol ma nnide e monoestea ra to de alumínio); geles minerais tais como o hidróxido de alumínio, o fosfato de alumínio e alúmen; agentes tensioa ctivos tais como a hexadecilami na octadecilamina , lisolecitina , brometo de dimet i 1 - dio ca tdeci 1 -a món io , N,N-dioctadecil-N',N'-bis ( 2-hidrox imetil )-propanodiamina , metoxi -hexa dsei 1 -glicero 1 e polióis plurónicos. Poli-aniões tais como o pirano, sulfato de dextrano, poli IC, ácido poliacrílico e car hopol; péptidos tais como o dipéptido de muramilo, dimetilglicina e tuftsina ; e emulsões oleosas. Podem, também, a dm in i s tra r - se as proteínas depois de serem inco r po rada s nos lipossomas ou outros micro-veículos.

A incor pora ção dentro dos lipossomas ou de outros micro

-veículos proporciona um meio pelo qual a libertação das vacinas

pode ser mantida utilizar-se uma i da d e .

durante um período de tempo prolongado . Pode bomba tal como uma bomba Alza com a mesma fina

Pode intensificar-se a imunogenicida de das proteína s da presente invenção, especialmente dos fragmentos mais pequenos, pela ligação reticular ou por acoplamento a uma molécula veículo imunogénica (isto é, uma macromolécula que possui a propr ieda de de despoletar, de modo independente, uma resposta imunológica num animal hospedeiro, ao qual se podem ligar por cova 1 ência as proteínas e os fragmentos de proteínas da presente invenção ) . É necessária a ligação reticular ou a conjugação com uma molécula vej culo, devido ao facto de os pequenos fragmentos de proteínas a ctua_ rem algumas vezes como haptenos (moléculas que são capazes de se ligarem especif icamente a um anticorpo mas que são inca pazes de despoleta rem a produção de anticorpos, isto é, não são imunogénicas). A conjugação de tais fragmentos a uma molécula imunogénica de transporte torna os fragmentos imunogénicos , pelo que é habitua 1 mente conhecido pelo efeito de transporte .

As moléculas de transporte adequadas incluem, por exem pio, proteínas e compostos poliméricos naturais ou de síntese, tais como polipéptidos, po 1 i s sa ca r í deo s , 1 i po po 1 i s sa ca r í deo s , etc. Um veículo útil é um glicósido denominado Quil A, gue foi descrito por Morein e outros, Na tu r e, 308 :45 7, 1 984. Dá-se especial preferência às moléculas veículo proteicas, incluindo mas não se limitando às proteínas do soro dos mamíferos tais como a hemocianina de molusco, ga ma g 1 o bu 1 i na humana ou de bovino, seroalbumina de coelho ou de bovino, quer metiladas, quer outros derivados de tais proteínas. 0 especialista verificará existirem outras proteínas de transporte. De preferência, mas não necessa-36-

r iamente, a proteína veículo será estranha ao organismo hospedei, ro no gua1 se pretende criar anticorpos contra as proteínas de

Eimeria .

Pode efectuar-se uma ligação covalente à molécula veí. ^cu 1 o utilizando métodos bem conhecidos na especia 1 ida de , sendo a escolha exacta ditada pela natureza da molécula de transporte utilizada . Quando a molécula imunogénica de transporte é uma pro. teína, as proteínas da presente invenção ou os seus fragmentos podem ser ligados util iza ndo, por exemplo, ca rbodi imida s solúveis em água tais como a d i ci cio-h ex i 1 - ca rbod i im i da ou o g 1 u ta ra 1 d e í do .

Também se podem utilizar agentes de ligação como estes para ligar reticula rmente as proteínas e seus fragmentos uns aos outros sem se utilizar separada mente uma molécula veículo. Esta ligação reticular em agregados de proteína s ou de fragmentos de proteínas também pode aumentar a imuno gen i c i da de .

A administração de uma quantida de eficaz de vacinas da presente invenção pode proteger as aves domésticas da infecção pela E. tenella . Os anticorpos monoclonais contra os antigénios da E_. tenella reagem de modo cruzado com a E_. a cervu1ina e com a E. maxima, in vitro, indicando que também se pode conferir protecção contra estas espécies. Uma dose eficaz de proteína s ou de fragmentos de proteína s encontra -se compreendida entre cerca de lO e cerca de 50 m i cr o gra ma s / Kg de peso do corpo do animal vacinado. É preferível utilizar-se uma dose de cerca de 25-50 Jtg/Kg.

De um modo preferencial as vacinações iniciais são seguidas de vacinações de reforço administradas uma a várias semanas mais tar. de. Devem a dministrar-se reforços múltiplos. As dosagens desses reforços encontram-se, geralmente, compreendidas entre cerca de 5 e 50 yUg/Kg, de pr ef er ência cerca de 20 a 50 Jrg/Kg. Podem uti-37-

lizar-se as vias de administração normalizadas, tais como a subcutânea, a intra dérm i ca , a intramuscular, a oral, a anal ou a administração no ovo.

A apresentação dos antigénios coccidianos da presente invenção aos sistemas imu no log i co s das aves de ca poeira pode con ^seguir-se por clonagem dos genes gue codificam os antigénios na bactéria (por exemplo, E_. coli ou Sa lmonella) ou nos vírus / por exemplo, vírus de varicela (pox) ou vírus de herpes J e, administrando às aves, os sistemas vectores vivos, por via oral, por injecção ou por outras vias utilizadas habitualmente. Carbit e ou tros £ sm : Va ccines, Cold Spring Harbor Laboratory, 1 987, pp. 68-71 } descreveram a utilização da E_. Coli, enqua nto Clements fPa thol . Immuno pa thol . Res. , 6_:1 37, 1 98 7 J descreveram a utilização da Sa Imonel la . Moss e outros C Ann. Rev. Immunol. , 5 : 30 5,

1987 J analisaram a utilização de sistemas vectores virais empregando vírus de varíola (pox) recombinantes. Pode utilizar-se uma espécie de vírus de varicela ( pox ), os vírus va ccinia , para testar a disseminação de antigénios coccidianos em culturas celu lares e em animais. Para estudos analíticos, descobriu-se que os vírus va ccin ia eram mais ef ícazes do que os vírus de varicela (pox) das aves, um outro veículo de vírus de varicela (pox) que se pode utilizar. Isto deve-se ao facto de os vírus va ccinia se multiplicarem mais rapidamente do que o vírus das aves e possui_{r um} âmbito de hospedeiros que não se restringe às células das aves de capoeira. Podem inserir-se grandes quantidades de ADN heterólogo no genoma virai de va ccinia sem se inibir a maturação virai e a infecção £ Smith e outros, Gen e, 25 : 21 , 1 983 J . A inserção e ex pressão de genes heterólogos múltiplos utilizando o vírus despoleta a produção de anticorpos contra os antigénios ex -38-

985 J. As técnicas util iza da s para se produzirem vírus va ccin ia recombinantes pode ser facilmente adaptada por procedimentos de rotina para os sistemas dos vírus varíola ( pox ) das aves ou do herpes. A utilização de tais vírus recombinantes como veículos nas vacinas contra a coccidio se é especialmente vantajosa pelo facto de as aves vacinadas desenvolverem imunidade contra o antigénio coccidiano e contra o veículo virai (isto ê, tais vaci_ nas são bivalentes). Pode aumentar-se, ainda mais, a utilidade de tais vacinas, inserindo genes adicionais nos vírus veículos.

Podem, por exemplo, inserir-se partes do genoma virai da doença de Newca stl e conjuntamente com um gene de antigénio coccidiano no vírus da varicela (pox) das aves, conferindo, desse modo, imunidade contra a doença de Newcastle, coccidiose e vírus pox das aves, tudo com apenas uma única vacina . Pode efectuar-se a administração de vacinas vector vivas da presente invenção, segundo numerosos métodos bem conhecidos na especia 1 í da de . Pode uti. lizar-se, por exemplo, o método de penetração ha b itua Imente uti lizado para vacinar as aves domésticas contra o vírus pox das aves. Este método consiste em fazer penetrar ou picar a pele das asas com uma agulha aguçada mergulhada na vacina. A agulha possui habitualmente um orifício próximo da ex tremida de semelhante a uma agulha de máquina de costura que transporta uma gota de va_ ^cina. Como alternativa podem administrar-se as vacinas vivas por injecção subcutânea ou intradérmica na asa ou qualquer outro loca 1 .

Também se podem adicionar as vacinas vector vivas à água para beber ou mesmo em aspersões sobre as aves de capoeira que se pretendem vacinar. Também se podem administrar na a 1 imenta ção, de

preferêncía após encapsulamento protector C Balançou e outros, Na ture, 3 2 2 : 3 73, 1 986 J, ou no ovo. No último método, as vacinas virais injectam-se directamente nos embriões das aves de capoeira Sharma, Avian Dis . . 2 5 : 11 55, 1 985 J.

EXEMPLO

Salvo indicação em contrário, as percentagens que a seguir se fornecem para sólidos em misturas sólidas, líquidos em líquidos e sólidos em líquidos são em, respectivamente, peso/peso, vol/vol e peso/volume base.

1. PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS

CONTRA ANTIGÉNIOS EIMERIA

1.1. PREPARAÇÃO DE PARASITAS

Isolaram-se esporozóitos de E_. tenella, E. acervulina,

E_. brunetti e E_. max ima , a partir de oocistos esporulados, de acordo com procedimentos norma 1iza dos . P esumindo , lavaram-se os oocistos esporulados com água destilada _t lixívia a 20% e, depois, com água destilada . Efectuou-se a ruptura dos oocistos num homo geneiza dor tecidular e recolheu-se o material insolúvel, incluin do os esporocistos, por centrifugação. Efectuou-se a suspensão dos esporoci stos libertados e de outro material agregado em tripsina a 0,25% e bílis de galinha em solução salina de Hank, a pH 8, e incubou-se durante duas horas a 40°C. Removeu-se a solu ção de excisão media nte duas lava gens com meio RPMI-1640 conten-40do soro de feto bovino a 10% (FBS), seguida de duas lavagens em PBS a pH 7,4.

Pur if ica ram - se, então, os esporozó ito s num gradiente de metrazimida fyísher et al., Pa ra s it io 1 ogy , 88_: 51 5 , 1 984 J.

Resum i da mente , efectuou-se nova suspensão dos esporozóitos em ml de PBS, a pH 7,0, e colocou-se 1 ml da suspensão sobre um gradiente de metrazimida de 15 ml. O gradiente compunha-se de ml de metrazimida a 12%, 18% e 24% em PBS, a pH 7,0. Os esporo zóitos sedimenta ram por centrifugação a 900 x g, durante 40 minu tos. Isolaram-se os esporozóitos purificados da face intermédia com metrazimida entre 19% e 24%, por inserção de uma agulha de calibre 21 do lado do tubo e por aspiração dos esporozóitos para uma seringa .

Lava ram-se três vezes com PBS, a pH 7,0, os esporozóitos purificados e utilizaram-se imedia tamente para imuniza ções,

5 estudos inf ecciosos, marcação ra dioa ctiva de superfície com I, ensa ios de imunofluorescência ou electroforese SDS sobre geles de P° 1 ia cr í lam i da £ Laemmli, Na ture, 2 27: 680, 1 970 J e estudos de manchas Western .

isola ram-se os merozóitos da E_. tenella conforme se descreve a seguir na Secção 6.2.3.. Utilizaram-se os merozóitos para imunizações e so 1 ub i 1 i za ra m - s e com tampão de amostra de

Laemmli para electrof orese SDS em gel de poliacrilamida e estudos de manchas Western.

1.2. IMUNIZAÇÕES

Imun iza ram-se 8 ratos fêmeas Balb/c (Charles River, Wilmington, MassJ, com esporozóitos vivos purificados, de acordo com o esquema seguinte:

19 dia	1	X	io7	esporozóitos	por via intravenosa (i.v·)
7° dia	6	X	io6	esporozó itos	por via intra j.	:eritonea1 (i.p.)
859 dia	6	X	io6	esporozóitos	i.p.
1209 dia	3	X	io7	esporozó itos	i.p.
2449 dia	Reforços	de imunização para pré-fu são
1 9 dia	5	X	io6	esporozó itos	6 i.v., 5 x 10	esporozóitos i.p.
2° dia	o	mesmo	que no 19 dia
59 dia	fu são de	esplenocitos	h i per-imunes	e de células de miei orna

Ensaiou-se o soro de cada um dos ratos quanto a anticorpos anti-esporozóito, de acordo com o ELISA com proteínas de esporozóitos purificados, por ensaios de manchas Mestern com proteínas so lu b i 1 iza da s de esporozóitos por imunoprecipita ção com proteínas de superfície , 125 de esporozoitos marcadas com I e por ensaios de imunofluorescen cia com esporozóitos purificados. Escolheu-se para reforços de imu_ nização de pré-fusão, o rato que apresentou a mais alta reacção de anticorpos contra os esporozóitos (ver Fig. 1 para análise ELISA deste anti-soro). No quinto dia, sacrificou-se o rato e removeu-se o baço para a preparação de esplenócito s.

1.3. CULTURA DE CÉLULAS E FUSÃO DE CÉLULAS

Dois dias antes da fusão prepararam-se ^as células nutritivas e s ρ 1 eno c í t i ca s , a partir de ratos (naive mice), em meio cag pleto £ meio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM, Gibco) com FBS a 10%, glutamina (2,0 mM ) e 2-me r ca p to eta no 1 (100 JIM ) J mais

HAT (hipoxantina 100 JUM, amínopterina 0.4 JA.M e timidina 16 JlM ) . Utilizando uma modif ica ção do procedimento de ST. Groth e outros £ J. Immunol . Methods, 3 5:1, 1980 7, f un di ra m-se 108 células a splé t

-42Q nicas com 10 células PAI-0 de mieloma de rato. Podia utilizar-se quaisquer outras células de mieloma, adequadas para a preparação de hibridomas. 0 especialista na matéria tem conhecimento de um número apreciável de tais células de mieloma e dos locais onde se encontram disponíveis.

Misturaram-se as células e agregaram-se por centr i fuga ção e efectuou-se nova suspensão sob uma agitação consta nte e suave em 1,0 ml de po1ieti1enog1ico1 a 35% (v/v) em IMDM a 37°C, durante 1 minuto. Decorridos 3 minutos de incubação a 3 7° C, agrega ram-se novamente as células e efectuou-se a sua r e s su s pensã o , cuidadosamente, em 10 ml de IMD + HAT. Depois, diluíram-se as células para 1x10 células /ml em meio completo + HAT e efectuou

-se a sua dispersão em placas de microtitulação de 24 cavidades (1 ml/cavidade) contendo 5x10$ células a 1 imenta do ra s esplenocíticas em 1 ml de meio completo.

Ensaiaram-se os sob r ena da nte s de hibridomas quanto aos anticorpos anti-esporozóitos segundo o ELISA com esporozóitos purificados, por mancha Western com proteína s de esporozóitos, por imunoprecipita ção com proteínas de superfície dos esporozói_ 125 tos marcadas com I e por imunofluorescência com esporozoitos purificados e com células infectadas por esporozóitos. Cionaram

-se os hibridomas por diluição limitante.

1.4 ELISA DE ESPOROZÓITOS

A d i c io na ra m - s e esporozóitos purificados (4x10 ) a cada um dos tubos de uma placa de PVC de 9 6 cavidades de fundo em U, gue se tinha bloqueado previamente com BSA a 1% em PBS, a pH 7,0.

Os esporozóitos sedimentaram no fundo das cavidades por centrífu

-4 3-

gação a lOOOxg, durante 5 minutos. Efectuou-se novamente a sus pensão dos esporozó ito s em 100 jUl de a nti - soro de sobrena da ntes de hibridoma e incubaram-se durante duas horas à tempera tu_ ra ambiente com BSA a 1% em PBS, a pH 7,0, para se removerem °s anticorpos gue não se ligaram.

Para detectar os anticorpos específicos ligados aos esporozóitos, a dicionaram-se 100 de anti-IgG do rato desenvolvida na cabra e conjugada com perox ida se aos esporozóitos que se encontravam nova mente em suspensão e incubou-se a suspensão durante 2 horas à temperatura ambiente. Lavaram-se os esporozói.

tos e os anticorpos gue se ligaram foram visualizados pela adição de uma solução de substrato ( o_-f en i 1 eno dia mi na , 0,4 mg/ml em citrato tampão 0,1 M, a pH 4,5 e peróxido de hidrogénio a 0,12%), durante 30 minutos a temperatura ambiente. Inter rompeu- se a reac ção pela adição de H ^SO 2,5 M contendo meta bi ssul f ito de sódio mM . Determinou-se a quantidade de anticorpos ligados pela lei tura de DO _A „ da cor do substrato.

8 8

De um total de 480 cavidades da fusão célula r ,433 revelaram-se positiva s quanto ao crescimento do hibridoma . Destes, 358 hi. bridomas apresentaram testes positivos no que respeita à produÇao de anticorpos no primeiro ELISA de esporozóitos. Durante a expansão e passagem destas células de hibridoma originais e pa rentes, 104 morreram ou interromperam a sua produção de anticor pos e, por isso, foram negativas em rastreios subsequentes com o ELISA de esporozóitos e ensaios de manchas Mestern. Pelo ELISA de esporozóitos identif ica ram-se 205 hibridomas que produziam anticorpos a lOx os níveis antecedentes.

I

-441.5 MANCHA WESTERN DE PROTEÍNAS DE ESPOROZÔITOS

So 1 u b i 1 i za ra m - s e esporozóitos purificados (5x10 esporozóitos por ml por gel) em tampão amostra de Laemmli, separaram-se por electrof orese SDS em gel de poliacrilamida quer em gel a l2,5%,quer em gel com um gradiente compreendido entre 7,5 e 20% (Laemmli, supra ) e tra nsf er iram-se por e 1 ectroforese para Placas de nitrocelulo se. Bloquea ram-se as lâminas em tampão de gelatina a 3% (gelatina a 3%, Tris-HCl, a pH 7,5, NaCl 0,15 M) e cortaram-se em tiras e deixa ra m-se as tiras reagir com anti-soro diluído ou sobrenadante de hibridoma durante 12 horas a o . _z

C em tampao BSA a 1% (BSA a 1%, fosfato de sodio 50 mM, a pH

6,5, NaCl 0,5 M, Tween-20 a 0,05%). Lavaram-se as tiras em PBS, a pH 7,4, Tween-20 a 0,05%, e detectou- se o anticorpo especi f icamente ligado com um a nt i-a nt i cor po do rato conjugado com pero xidase. Vi sua 1 iza ram-se os anticorpos ligados pela adição de uma solução de substrato £ 4-cloro-1-nafto 1 (30 mg dissolvidos em ml de metanol arrefecido em gelo e 50 ml de Tris-HCl, a pH 7,5), NaCl 0,15 Μ, H £0 a uma concentra ção final de 0,015% } du rante 30 minutos à temperatura ambiente. Interrompeu-se a reacção por lavagem exaustiva com água destilada .

Dos anticorpos gue se revelaram positivos no ELISA de esporozóitos, 160 revelaram-se também positivos à análise de mancha Western utilizando proteínas solubilizadas de esporozóitos.

A análise da mancha Western (ver Fig. 2) indicou gue os anticorpos monoclona i s se inseriam num de três padrões de reacção: a) aqueles que se ligam a proteínas Eimer ia simples (por exemplo, 11A1 e 11D1), b) aqueles que se ligam a 2 ou 3

-4 5proteínas (por exemplo 6A5 e 20C6) e c) aqueles que se ligam a proteínas múltiplas (por exemplo, 11A5, 13A6 e 14B5).

Para além disto, caracterizaram- se os anticorpos por análise da mancha Western utilizando proteína s de merozóitos de E_. tenella e esporozóitos de E_. a cervul ina (Fig. 3). Diversos anticorpos, incluindo ο 3A5, o 1 3A 6, 7D1 e 2OC6, reconheceram as proteína s isoladas dos esporozóitos de E_. t enella e de E. acervu lina e dos merozóitos de E_. tenel la . Outros anticorpos, tal co_ mo ο 6A 5, demonstraram ser específicos de espécie e de estádio e ligarem-se apenas a proteína s dos esporozóitos da E_. tenel la .

Apresenta-se no quadro 1 um resumo dos resultados obti_ dos com alguns dos anticorpos, indicando-se a especificidade dos anticorpos quer em termos de a ) origem e dimensões da(s) proteína (s 1 nos geles aos quais os anticorpos se ligam, quer b) dimen125 soes das proteínas da Eimer ia tenel la marcadas com I precipitadas pelos anticorpos (coluna da direita). Para além disso, os anticorpos encontram-se ca ra eter iza do s no Quadro pelo isotipo.

QUADRO 1

ANÁLISES DE MANCHAS WESTERN

Dimensões da proProteína Eimeria (dimensão em gel em Kd) teína Precipitada

Tenella Acervulina Maxima

Anticorpo	Isotipo	Spz	Mrz	Spz	Spz	(Kd)
7B2	G2a	>200	-	-	-	-
7D4	G1	120	120	120	-	110
7D1	G1	120	120	120	N.D.	110
2OC6	G1	120	120	120	N.D.	110
3A5	M	120	120	120	1 7	120
19D6	G3	180	180	-	-	120
8A2	G 2a	37	-	-	-	37
6A5	G 2b	28/26	-	-	-	25
14B5	N.D.	>150	N.D.			N.D.
15B3	N.D.	>150	N.D.			N.D.
14B1	G3	6	6	-	-	24/1 7
12B2	°3	28/26	-	-	-	24/17
15A3	G1	28/6	-	-	-	17/15/6
15C4	M	28/26	-	-	-	105/15/6
12C3	G 3	28	-	N.D.	N.D.	25
5B6	C3	-	N.D.			6
3C4	M	m	m	m	-	70
16D2	M	m	m	rn	-	70/85
13A6	M	m	m	m	-	110
11B6	G3	m	m		-	105
12A3	G3	m		m	-	24/1 7
12D4	gi	m	N.D.			N.D.
Spz e Mrz	são abreviaturas	para esporozóito e	merozóito ,	respectiva,
G e M referem-se a	IgG e a	IgM, respectivamente.
m indica <	gue os anticorpos	se ligaram	a múltipla s proteínas	a tingindo

a mis do gue 200 Kd em tamanho.

Os valores indicados por N.D. não foram determinados.

-471.6. IMUNOPRECIPITAÇÃO DAS PROTEÍNAS DE SUPERFÍCIE DOS ESPORO12 5

ZÕITOS MARCADAS COM_£

Marcaram-se as proteína s de superfície dos esporozói 12 5 tos purificados com I pelo método do IODOGÊNIO (Pierce Che_ mical Co . ) ou utilizando GOTAS DE IODO (IODOBEADS) (Pierce Che_ ^mical Co . ) . Para o último procedimento lavaram-se quatro GOTAS

DE IODO 3 vezes com fosfato de sódio 0,2 M, a pH 7,5, e adicio1 25 na ram-se 1-3 mCi de

I-Na e incubou-se dura nte 5 minutos à

ficados (3x10 ) em 200 tf¹ de PBS, a pH 7,0, e prosseguiu-se a incuba ção durante 15 minutos . No final da incubação, adicionou -se f luoreto de feniImetano-su1foni1 o (PMSF) até uma concentra_ ção final de 0, 5mM .

Re cu pera ra m-s e os esporozóitos da mistura de incubação por centrifugação a 12 OOOx g durante 30 segundos e solubilizaram-se em 1 ml de dodecil-sulfato de sódio a 2% (SDS) ou em

Triton X-100 a 1% em PBS, a pH 7,0. Removeu-se o material insolúvel por centrifugação durante 30 minutos a 12 OOOx g. Dialisaram-se as proteínas dos esporozóitos solubilizadas contra 3 litros de PBS, a pH 7,0, a 4°C, utilizando uma membra na de separação para peso molecular 3500 para remover qualquer

25 residual, livre. Armazenaram-se a 4 C,até serem utilizadas, as 12 5 8 proteínas de esporozóitos marcadas com I (usualmente 1,5x10 cpm incorporado nas proteínas). A ra d ioa ct iv i da de precipitavel de TCA excedeu ha b i tua 1 me nte em 95% a ra d ioa ct iv i da de total. Na

Fig. 4, no painel á esquerda, apresenta-se a analise electroforética SDS sobre gel de poliacrilamida das proteínas dos espo125 _τ rozoitos marcadas com I.

Efectuou-se a imunop r eci p ita çã o adicionando 300 J&l de sobrena da nte de hibridoma ou de anti-soro diluído a 250 12 5 5 de proteínas de esporozóitos marcadas com I (1x10 cpm) em tampão I (NP-40 a 0,25%, Tris-HCl lOmM, a pH 7,5, NaCl 0,15 M).

A seguir á incubação durante 16 horas a 4° C, a diciona ram-se 100-200 Jfl de uma suspensão a 50% de anti-IgG do rato desenvolvida na cabra acoplada a agarose (Sigma Chemical Co . ), e incubou-se a mistura num misturador rotativo durante 2 horas â temperatura ambiente. Agregaram-se as gotas por centr ifuga ção durante 1 minuto a 12 OOOx g e lavaram-se 3 vezes em tampão de

Lavagem (SDS a 0,1%, NP-40 a 0,5%, desoxicolato de sódio a 0,2%,

PMSF lOmM, Tris-HCl lOmM, a pH 8,5 e NaCl 0,15 M).

Libertaram-se e desnaturaram-se as proteína s marcadas

125 com I ligadas aos anticorpos de fase solida, por adição de

Jíl de tampão amostra de Laemmli duas vezes e aquecimento durante 3 minutos a 95°C. Separaram-se as proteínas dos esporo , . 125 zoitos marcadas com I, por el e c t ro f o r e s e SDS sobre gel de po 1 ia cr i la m i da num gel a 12,5% e v i sua 1 i za ra m-se por auto-radiografia .

Na Fig. 4, no painel à direita, a pre sen ta m-s e os resultados do ensaio de imuno pr ec i p ita çã o com o soro de rato imu_ nizado. Dos anticorpos de hibridoma que se revelaram positivos por ELISA de esporozóitos, 74 revelaram-se positivos por ensaio de i mu no pr ec i p i ta çã o . Conforme se indica na Fiq. 5, os anticorpos de hibridoma inserem-se em duas categorias, os que precipitam apenas proteínas simples (por exemplo, o 3C4, 6A 5, 7D4, 8A2,11D2 e 2OC6) e os que precipitam duas ou mais proteínas (por exemplo,

12B2, 15A3, 15C4 e 19D6).

1.7. ENSAIOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA COM ESPOROZÓITOS

PURIFICADOS

A dicionaram-se esporozóitos (1x10 ) a 8 lâminas compartimentadas (La b Tek) em PBS, a pH 8,0, e seca ram-se ao ar a 3 7° C, durante 12 horas. Bloquearam-se as lâminas com soro normal de cabra a 10%, durante 2 horas a 37° C. Adicionou-se a ca_ da compartimento anti-soro diluído ou sobrenadante de hibridoma e incubou-se durante duas horas à temperatura ambiente. Lavaram-se as lâminas e adicionou-se um anti-anticorpo do rato con. jugado com rodamina (diluído em PBS, a pH 7,0 e Triton X — 100 a

0,3%), durante 1 hora à tempera tura ambiente. Após lavagem das lâminas, visua 1izou-se por imunofluorescência o anticorpo gue se ligou.

A maioria dos anticorpos apresenta imunof1uorescência específica para a membra na de superfície e/ou para o corpo r ef ra ngente dos esporozóitos secos ao ar livre (Eig. 6, painéis

A e B). Alguns anticorpos coram intensamente a extremidade apical dos esporozóitos e apenas tingem de modo ténue a resta nte superfície dos esporozóitos. (Eig. 6, painel C). Na Fig. 6 pode observa r-se uma representação dos esporozóitos purificados secos ao ar livre, nas lâminas à esquerda dos painéis A, B, C e

D. Os esporozóitos purificados encontravam-se intactos e alongados e apresentavam o grande corpo refráctil posterior proeminente (PBR) e o corpo refrangente anterior e mais pequeno (ARB).

Λ ex tremida de apical (A) do esporozóito encontrava - se em sentido oposto ao corpo refrangente posterior, ^ambém existia uma leve contamina ção das prepa ra ções por esporocistos intactos (painel B, lâmina à esquerda ) e membranas de esporocistos fragmen-50-

ta da s .

1.8. RESUMO DOS RESULTADOS DOS ENSAIOS ELISA, MANCHAS WESTERN,

IMUNOPRECIPITAÇÃO Ε IMUNOFLUORESC£NCIA

No Quadro 2 apresenta-se um resumo dos resultados das análises anteriores de 55 anticorpos monoclonais.

RESUMO DAS ANÃLISES DOS ANTICORPOS MONOCLONAIS

QUADRO 2

MANCHA WESTERN

E. tenella	Low Spz.b	E. acervulina Spz.C	E.tenella d Mz .	IFA6	Imunopre cipita ção
icorpo	a Spz .
3C4	M1					60-80
I1B6	ML	+	+	+	1,2,4	105
12A5	M1	-		-	1	—
14D4	M1	+	+	4-	1,3,4	6ó
15B6	M1·				1,4,7	20-24
17A5	M1		+		1	150/83
18B6	M1	+	+	4-	-	<25/20,
						[66/60
19C6	M1	+	4-	f-	1,2	25/20
20A2	M1·	+	+	4-	5	66/60
20B4	M1	+	+	k	1,4	86/60
11C4	M2		+	-	1,6	-
12A3	M2	-	-	-	1,4,7	22/24
13A6	M2	+	+	1-	1,5	110
14B6	M2				1,4,7	105-120
14D1	M2				—	120
9B2	M3	+	+		5	66/45
12B1	M3	4-	-	-	6	26-28
14C6	M3	-	-	-		105
15C4	M3	+	-	-	6	105
16D2	M3				-	60-80
20C3	M3	+	+	f-	3	14-17
3A5	120	+	+	+	3	-
6A4	120				-	“·
7D1	120			1-	1,2,4	110
7D4	120		4-	4-	5,1	110
10A6	120	4-	-	-	1,2,6	105
11D2	120	—	-	-	4,1,2	105
14A1	120	-	-	-	6,1	110
17B6	120	-	-	-	1,6,7	120
17C6	120		-	-	8,1	105
19D6	120	4-	-	-	3	120
20C6	120	4-	+		1,2	110

QUADRO 2 (continuação _MANCHA WESTERN

Anticorpos	B.tenella ~ a	Low b	E.acervulina c	E.tenella d	e	Imunopre
Spz.	/PA.·....	Spz.	i-lz .	TFA	cipitação
10A5	>150				7,5	105
11A6	>150	-	-	-	3	-
7132	>200	+			-	>200

11B1 11D4 11D6 12C3 15B2	>150,200 120/24 120/24 120/24 120/24	+ + + +	+		1,7,6 1 2 1,8,2 3	27 27 25
15A3	90/10-14	+	-	-	1,6	28/14-17
14C3	60	-	-	-	1,4	6
14A5	120/6	-	-	-	1,3,6	6
8A2	37	+	+	-	1.4	37
5A5	28, 10-14	+	-	-	1,6	25-28
11A1	24	+	-	-	1-6	-
11C1	24	+	-	-	-	-
12B2	24	+	-	-	1,5	24/120
12C6	24	+	-	-	—	—
16B1	24	+	-	-	1,4	6/14-17
18D5	24	+	-	-	1,6	48/25/6
20C4	24				1,3	5/14-17
14B1	< 6	+	-	-	1,6	20-24
10A2	-	-			1,2.4	6/105
5B6	-				1,6	6/17/15

a . Os valores indica dos são os pesos moleculares das proteínas dos esporozóitos (Spz ) da E_. t enel la reconhecidos pelos an ticorpos em Manchas Western ou grupos de proteínas reconhecidas possuindo pesos moleculares de 40-150 Kd (M³ ), 120 e 80-150 Kd (Μ²1 e 25 e 40-1 50 Kd ( M³ ) .

b · Ef ectua ram-se os ensaios de Mancha de Western com 1/5 da auan tidade habitual de proteína de esporozóito (Spz.) de E_. tenel la Os anticorpos que apresentaram uma reacção positiva possuem, deste modo, uma afinidade mais elevada.

c. Observa -se reacção da Mancha Western contra as proteína s dos esporozóitos (Spz.) de E_. a cervu1 i na .

d. Observa -se reacção da Mancha Western contra as proteínas dos merozóitos (M z. ) da E_. tenel la .

e. Os resultados dos diagramas de coloração dos ensaios de imunofluor escência (IFA) encontram-se resumidos por ensaio indirecto de esporozóitos de E_. tenel la secos ao ar livre como 1 ) superfície^ ) extremidade, 3 ) superfície a p i ca 1, 4 ) superfície brilhante, 5) superfície luminosa, 6) superfície di fusa, 7) corpo ref ráctil, 8 ) coloração pontual.

f. Indicam-se os pesos moleculares das proteínas dos esporozói_

5 tos de E_. tenel la marcadas com I, capturadas pelos anticorpos em ensaios de imunoprecip ita ção (Immunoppt . ) .

Os anticorpos monoclonais 7D4, 7D1, 20C6 , 8A2, 6A 5 e 7B2, a que se deu preferência, foram depositados na forma de células de hibridoma que segregam estes anticorpos monoclonais no American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive,

Rockville, Maryland, U.S.A., de acordo com o estabelecido no

Tratado de Buda peste e com os números de depósito HB 9707, HB

9708, BB 9709, HB 9710, HB 9711 e 9712, respectivamente.

¹·9. ENSAIOS DE INFECÇÃO IN VITRO

Em primeiro lugar, ensaiaram-se as células epitelia i s de rim de aves de capoeira, de acordo com o método de Doran e outros, J_. Pro tozool . , 2 5 : 544, 1 978, e d e senv o lv era m-se até uma confluência de 40-50% em quatro lâminas compartimentadas La b

Tek. Também se utilizaram em vez das células epitel ia i s de rim de ave doméstica, células MDBK (rim de bovino de Madin-Darby) (ATTC-CCL 22).

Inocularam-se as células com 50 000 ou 20 000 esporozóitos purificados. Decorridas 16 horas após a infecção, lavaram-se as mono-camadas de células diver sa s vezes para remover quaisquer esporozóitos que não tivessem penetra do nas células. As culturas representativas de célu la s inoculadas f ixa ram-se com metanol a 100% (à temperatura ambiente durante 5 minutos) 3,

6, 24, 48, 64 , 96 e 120 horas após a infecção. Arma z ena ram-se as lâminas fixadas em BSA a 1% em PBS, a pH 7,0, a 4°Caté se processarem para imunofluorescência conforme anteriormente des

Crito. Na Fig. 7 apresentam-se os diagramas de coloração obtidos com diversos anticorpos.

Entre 3 e 24 horas após a infecção, as culturas fixa-55da s revelaram esporozóitos intracélulares (Fig. 7, 7D4 decorridas 3 horas e 8A2 decorridas 19 horas). Algum tempo depois os esporozóitos degeneraram apenas para corpos refrácteis (7D4, de corridas 60 horas). A superfície e a ex tremida de apical dos esporozóitos intracelulares corou-se de um modo br ilha nte com o anticorpo 7D4 (Fig. 7, 7D4 decorridas 3 horas), mas este anticorpo não corou a superfície das células infectadas.

Decorridas 24 horas, os esporozóitos começaram a degenerar e originaram esquizontes gue sofreram o seu processo de maturação durante as 40 horas seguintes. O anticorpo 7D4 continuou a reagir com os esporozóitos em degenerescência mas não rsa_ giram com os esgu izontes imaturos (Fig. 7, 7D4, decorrida s 60 horas). No entanto, à medida gue os esquizontes amadureciam, o

7D4 começava a reagir com estruturas dos esquizontes (Fig. 7,

7D4, decorridas 100 horas). Estas estrutura s eram os merozóitos em desenvolvimento, e o anticorpo 7D4 continuou a reagir com o antigénio de superfície dos merozóitos maduros e 1iberta do s (Fig. 7, 7D4, 120 horas).

Deste modo, o 7D4 identificou um antigénio de membra_ na de 120 Kd que se encontrava presente nos esporozóitos e merozóitos de E_. tenel la . Este antigénio não se expressou dura nte a fase esquizonte do desenvolvimento do parasita até os merozói_ tos imaturos se desenvolverem nos esquizontes.

anticorpo 14B1 apresentou um diagrama de reactividade semelha nte ao do anticorpo 7D4, tingindo a superfície e a ex tremida de dos esporozóitos intra célula r e s (F i g . 8 ,14Bl, 16 horas)e apresentou uma coloração difusa do citoplasma na vizinhança imediata dos esporozóitos intracelulares. 0 antigénio reconhecido pelo 14B1 encontra-se presente na extremidade apical dos

-56» /

L merozóitos imaturos nos esqu izontes maduros(Fig. 8, 14B1, 100 horas) e a extremidade apical dos merozóitos maduros libertados (Fig. 8, 14B1, 120 horas). Os padrões de colora ção exibidos pelos anticorpos 7D4 e 14B1 são semelha ntes, mas as proteínas que estes anticorpos reconhecem possuem pesos moleculares muito diferentes, de cerca de 120 e 6 Kd, respectivamente.

Apesar dos anticorpos 7D4 e 14B1 reagirem com a maioria dos estádios do desenvolvimento parasitário, outros anticor. pos reagem apenas com antigénios de superfície (Fig. 7, 15A3) ou com o corpo refrangente (Fig. 7, 7A2) dos esporozóitos intra_ celulares e não com os estádios de esquizonte ou de merozóito do pa ra s ita .

Pelos ensaios de infecção identificaram — se dois únicos anticorpos, 8A 2 e 19D6. 0 anticorpo 8A2 reagiu com uma proteína de 37 Kd presente na superfície dos esporozóitos (Fig. 7C, 8A2, horas), em todos os estádios de desenvolvimento do esquizonte (Fig. 7C, 8A2, 120 horas) e na superfície dos merozóitos libertados (Fig. 70, 8A2, 120 horas). Ao contrário das proteínas rconhecidas pelos anticorpos 7D4 e 14B1, a proteína de 37 Kd foi sintetiza da ao longo do desenvolvimento intracelular do parasita .

O a nticor po 19D6 reagiu não só com uma proteína de 180

Kd da superfície do esporozóito, mas também com uma proteína no citoplasma das células infectadas pelo esporozóito (Fig. 8, 19D6, horas). A proteína citoplá smica reconhecida pelo anticorpo 19D6 pode ter sido emitida pelo esporozóito após a infecção celular, uma vez gue a proteína desapareceu durante o desenvolvimento do esquizonte imaturo e reapareceu no esquizonte maduro e nos mero zóitos libertados (Fig. 8B, 19D6, 120 horas).

Os anticorpos séricos das aves de ca poeira que sobre viveram a uma infecção pela E_. tenella coraram a ex tremida de apical e a superfície dos esporozóitos intracelulares (Fig.8B,

Soros de Aves Imunizadas, 3 horas) de um modo semelhante ao dia grama de coloração do anticorpo 7D4, mas não os corpos ref rangentes dos esporozóitos intracelulares.

Os estudos de imunofluorescência com células de rim de aves doméstica s infectadas com esporozóitos identificaram antigénios que eram a ) específicos para o esporozó ito (por exemplo, as proteínas superiores a 200 e 28 Kd reconhecidas pelos anticorpos 7B2 e 6A 5 , respectivamente), b) que se encontravam presentes em todos os estádios de desenvolvimento do parasita (por exemplo, a proteína de 37 Kd reconhecida pelo 8A2) e c) especí ficos para os esporozóitos e merozó ito s mas não para os esquizontes (por exemplo, as proteínas de 120 e de 6 Kd reconhecidas pelos anticorpos 7D4 e 14B1, respectivamente).

1.10. ENSAIOS DE NEUTRALIZAÇÃO DOS ESPOROZÓITOS IN VITRO

De acordo com uma modificação do método de Schmatz e outros, J_. Protozool . , 33 :109, 1 986, trataram-se com tripsina ^as células MDBK e efectuou-se a sua suspensão em Meio Mínimo Essencial (Cibco) enriquecido com FBS a 1%, a uma densidade de 7,5X10 células/ml. A cada uma das cavidades de uma placa de mi.

crotitulação (96 cavidades de cultura de tecidos tratados), adi 4 cionaram-se 1,5X10 células e incubou-se durante 48 horas a

C. Os purificados foram tratados previamente com um anticorpo dura nte 1 hora a 40 C ou não foram tratados antes de infectarem as monocamadas de células. Efectuou-se a diálise

exaustiva dos anticorpos (quer de sobrenadantes de culturas de tecidos, fluído a scático, quer de anti-soros) contra PBS, a pH 7,0, ina eti varam-se pelo calor a 5 6° C durante 30 minutos e e_s terilizaram-se por filtração antes de se utilizarem.

Imedia tamente após a infecção, adicionou-se r 5,6 jH-ura cilo a todos os tubos de ensaio para propor ciona r um ní_ vel f ina1 de 5 Ad /ml. Decorridas 19 horas sobre a infecção, removeu-se o meio e lavaram-se as culturas uma vez em PBS. Libertaram-se as células com tripsina-EDTA, durante 15 minutos a 40° ç _e r eco lheram-se sobre filtros de fibra de vidro. Secaram-se os filtros, colocaram-se em fluido de cintilação (READYSOL Λ New England Nuclear) e efectuou-se a contagem da radioac. tividade ligada . A capacidade dos anticorpos para inibir a penetração e/ou desenvolvimento dos esporozóitos determinou-se pela radioactividade incorporada nas células infectadas com es porozóitos não tratados, por comparação com as células infecta_ das com esporozóitos tratados com anticorpos.

Também se incubaram pr ev ia mente os esporozóitos com anticorpos de controlo, tampão ou lasalocid, um fármaco cocei d io s tá t i co . 0 lasalocid bloqueia compl eta mente o desenvolv imento dos nas células HDBK e reduz largamente a incorporação de H-uracilo.

Os resultados a pr e senta m-s e na Fig. 9, onde se pode observar que os anticorpos 7D4 (O ), 8A 2 ( O ) e 14B1 ( φ ) inibem de modo significativo a incorporação de ^H-uridina nas culturas infectadas de tiDBK. O anticorpo 6A5 ( M ) ^erã menos eficaz mas apresentou a mesma inibição . O tratamento com tampão ( Δ ) e anticorpo de controlo (X) não produziu inibição, enquan

-5 9-

to o lasalocid ( * ) produziu essencialmente inibição com pl eta .

2. CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECAS DE EXPRESSÃO DE cADN

2.1. PREPARAÇÃO DE OOCISTOS EM ESPORULAÇÃO

Removeram-se os cegos de frangos de 3 semanas de ida_ de (Hubbard Cross; Avian Services, Frenchtown, New Jersey, U.S.A.) 7 dias após a inoculação oral de 50 OOO oocistos esporulados de E. tenella por

3ve e desenvolveram-se num misturador Waring com água destilada durante 1 minuto. Ajustou-se o volume para 1 litro com água destilada e adicionou-se Pepsina (Sigma Chemical Co . , St. Louis,

Missouri, E.U.A.) até uma concentração de 3 g/1. Ajustou-se o pH para 2,0 com HCl concentrado e incubou-se a mistura e agitou-se durante 2 a 3 horas a 39°C, ou até se observar uma única suspensão de oocistos. Após digestão, ajustou-se o pH para 8,0 com

NaOH 10 N e a diciona ram-se 3 litros de água destilada. Deixou-se a mistura em repouso durante a noite. Depois, removeu-se o sobrenadante e lavou-se o sedimento com água até o sobrenadante se tornar claro. Os oocistos esporula ram mediante a introdução de bo_ lhas de ar através da suspensão em água destila da à temperatura ambiente. Pôs-se termo à esporulação decorridas 24 horas para a

Preparação de ARN.

2.2. ISOLAMENTO DE mARN DE OOCISTOS EM ESPORULAÇÃO

Preparou-se o mARN total de acordo com uma modificação do método de gua n i d i na / cl o r eto de cé s io , des cr i to por Maniatis e outros, supra, página 196. Lavaram-se os oocistos com PBSS

-60/' (NaCl 0,15 M, fosfato de sódio 20 mM, a pH 7,9) e voltou a efec tuar-se nova suspensão misturando em turbilhão, cuida dosamente, em 10 ml de uma solução contendo i sotiocia na to de gua nídio 5 M, Tris-HCCl 50 mM, ácido etilenodiaminotetracético 10 mM (EDTA), Sarkosyl a 0,5% (N - la ur i 1 - sa r co s ina de sódio, Sigma Chemical Co . ) e p-mercapto-etanol 0,1 M, a pH 7,4, com 5 jpl de Anti-espuma A (Union Carbide, Danbury, Connecticut, E.U.A.) ou de outro agente anti-espuma preferido adicionado. Homogeneizou- se a suspensão cef-^ular até se observa r microscopicamente uma boa ruptura dos oocis_ to s .

Removeram-se os vestígios celula res insolúveis por cen tr ifuga ção a velocida de reduzida e dividiu-se o homogenato em 4 alíquotas e dispôs-se em camadas sobre 1,2 ml de CsCl 5,7 M,EDTA

0,1 MapH 7,5, em tubos de 12 ml de policarbonato. Centri fugaram-se os tubos a 40 000 rpm num rotor Beckman SW, durante 17 horas a 1 5° C . Pôs-se de lado o fluido sob r ena da nte, seca ram-se as pare des dos tubos e efectuou-se nova suspensão dos a grega dos em 1,25 ml de Tris-HCl 10 mM, EDTA ImM, do d e c i 1 su 1 f a to de sódio (SDS) a 1%, a pH 7,5, com 200 j&g/ml de Proteína se K (Boehringer-Mannheim).

Após incubação a 3 7° C, durante 30 minutos, extraiu-se a solução 3 vezes com fenol. Precipitou-se o ARN na fase aquosa final, 3 vezes com etanol e, depois, dissolveu-se em 1 ml de água .

Preparou-se o ARN po 1 ia den i la do C poli(A)⁺ J, fazendo passar duas vezes cerca de 2 mg do ARN total sobre uma coluna de celulose oligo (dT) (Pharmacia Fine Chemicals), conforme descrito por Mania ti s e outros, supra, página 196. Preci pitou-se o ARN poli(A)⁺ duas vezes com etanol e dissolveu-se em 200 yzl de água. Produziu-se cerca de 26 j&g, conforme calculado a partir da densidade óptica a 2 60 nm .

2.3. PREPARAÇÃO DE MEROZÓITOS

Recolheram-se os merozóitos de E.tenella a partir do cego de 50 frangos infectados (Hubbard Cross de 3 semanas de idade; Avian Services, Erenchtown, NJ) 5 dias após a infecção com 50 000 dos oocistos esporula do s anteriores por ave. Removeram-se os cegos e lavaram-se com solução salina de tampão fosfato (PBS) durante 15 minutos, num agitador magnético. Os detritos epiteliais foram parcialmente removidos por centrifugação a velocida de reduzida (50Xg) e recupera ra m-se os merozóitos brutos por centr i fuga ção a 2 OOOXg, a 4° C, durante 10 minutos. Voltou a efectuar-se a suspensão do agregado em Tampão de Lise (8,29 g/1 de NH^Cl, 0,372 g/1 de Na ₂ EDTA, 1,0 g/1 de KCOa pH 7,6) e incubou-se em gelo dura nte 30 minutos. Recolheram-se os merozóitos por centrifugação, lavaram-se uma vez em PBS e pa s saram-se através de uma coluna contendo l_ro g de fio fibra de nylon (Scrub Nylon F iber, Eenwall Laboratories, Deerfield, Illinois,

E.U.A.) num funil de separação. Re co 1 h era m-se os merozóitos por centrifugação conforme anteriormente referido e congela ra m-se em neve carbónica para isolamento do ARN, ou foram, ainda, purificados em dietilamino eti1 -celulo se (DEAE , Whatman DE 5 2 , Whatman,

Clifton, New Jersey, E.U.A.) para analise de mancha Western.

Para purificação em DEAE-celulose, aplicaram-se 1X10 merozóitos em PBS a uma coluna com um leito de 10 ml de volume e eluiu-se com PBS. Recuperaram-se os merozóitos nos primeiros 10 ml do fluxo através da coluna, essencialmente isento de glóbulos vermelhos e de outros detritos celulares.

2.4 ISOLAMENTO DO mARN DOS MEROZÓITOS

Descongelaram-se os agregados de merozóitos congela9 10 úos contendo de 1X10 A 1X10 organismos em 10 ml de tampão TEL/SDS (Tris-HCl 0,2 M, Li Cl 0,1 M, EDTA 25 mM, do deci 1 su 1 fa_ to de sódio (SDS) a 1% (p/v), a pH 8,8) contendo ditiotreitol (DTT) 1 mM e 300 unidades de RNa sin (Promega Biotec, Madison,

Wisconsin, E.U.A .) e homogeneizaram-se com 10-12 movimentos num homogeneíza dor de tecidos revestido de teflon. Sepa ra ram-se os detritos insolúveis por centrifugação, no frio, a 3 OOOXg.

Extraiu-se duas vezes o líquido sobrenadante com fenol : clorofórmio: álcool isoamílico (24:24:1, v/v) que se equilibrou com tampão TEL .

Efectuou-se a digestão da fase aquosa com 100 p.1 /ml de proteínaseK, a 37° C, durante 30 minutos e voltou a extrair-se com um igual volume de f eno 1 : cl o r of ó rm io (1:1) e precipitou, -se o ácido nucleico com dois volumes de etanol, durante 1 hora em neve carbónica, ou durante a noite a - 20°C. Voltou a efectuar-se nova suspensão do agregado, após centrifugação a

OOOXg, durante 1 hora, em TE (Tris 10 mM, a pH 7,5, EDTA 2

J e passado através de uma almofada de 4 ml de CsCl (CsCl

5,7 M, EDTA O,1M) a 150 OOOXg durante 20 horas a 15° C. Voltou ^a efectuar-se a precipitação do agregado de ARN a partir de acetato de potássio 0,2 M com 2,5 volumes de etanol. Fez-se pa s sa r este ARN total uma vez através de uma coluna de celulose oligo-dT para enriquecê-lo de ARN poli (A) , conforme descrito por Maniatis, su pra , página 197. Uma produção típica de 1,9 g mg de ARN total a partir de 5X10 merozoitos continha aproximadamente 20 ju.g de ARN poli (A ) ⁺ .

2. 5 SÍNTESE DE cADNs DE OOCISTOS E DE MEROZÔITOS E INSERÇÃO

DENTRO DE VECTORES BACTERIÔFAGOS

Sintetizou-se o cADN de cordão duplo a partir de 6 de ARN poli (A) de ooci stos em esporula ção , conforme des_ crito por Gubler e outros, Gene, 25 : 263, 1 983, utilizando trans. criptase inversa (BRL) para alongar a partir de um precursor oligo (dT) e RNase H (BRL) e ADN polimerase I de E_. Coli (New England Biolabs) para se sintetizar o cordão complementar. Depois, nivelaram-se as extremidades do cADN de cordão duplo com ADN polimerase T4 (BRL) e a diciona ram-se 1 iga ntes EcoRI (GGAATTCC,

Co 1 la bora tiv e Research), após tratamento com EcoRI metilase (New England Biolabs), de acordo com as instruções dos fabricantes .

Depois de se ter efectuado a digestão dos cADNs assim preparados com EcoRI, preparou-se uma biblioteca no Xgtll (Stratagene Cloning Systems, San Diego, Califórnia, E.U.A) conforme descrito por Huynh e outros em D. Glover (ed. ) , DNA Cloning,

Vol. I: A Practical Approach, Washington, D.C. , IRL Press, 1 985 , pp. 49- 78. Ligaram-se os fragmentos EcoRI cADN às extremidades receptora s de Xgtll desfosforiladas, digeridas com EcoRI (Stratagene Cloning Systems), e o ADN resultante foi introduzido dentro do fago, com um conjunto Gigapack^ (Stratagene Cloning Systems), de acordo com as instruções do fabricante.

Ampl if icou- se a biblioteca resultante por colocação em ^células hospedeiras Y1O88 (ATCC N3 371 95 ). Estimou-se a percentagem de recombina ntes a partir do facto de ser de cerca de 90% a proporção de placas azuis a incolores nas placas de X-gal (Maniatis, supra , pagina 24) na presença de isopropi1 - β- D-tio -64-

-ga la cto-p ira no s ido (IPTG, Sigma Chemical Co.).

Sintetizaram-se as cópias de cADN de cordão duplo do

ARN poli (A) dos merozóitos essenciaImente conforme descrito ^antes. O cADN de cordão duplo utiliza do na construção das biblio_ tecas continha de cerca de 200 a 4 500 pares de bases (pb ), con forme se julgou pela migração em geles de desnaturação £ Bailey et al., Anal . Bioch em. , 70: 75, 1 976 J.

O cADN dos merozóitos foi metilado e ligado aos ligan tes EcoRI, conforme anteriormente descrito, com excepção de se terem utilizado ligantes CCGAATTCGG (Co1 laborative Research).

A seguir à digestão com EcoRI f ra cciona ram-se os cADNs num Biogel

A-50M para se remover o excesso de moléculas ligantes e de cADNs menores do que, aproximadamente, 300 pb , conforme descrito por

Huynh e outros, supra .

Ligaram-se os cADNs às extremidades receptoras do Agtll e introduziu-se o ADN no fago, conforme anteriormente descrito.

Amp 1 i f i cou - se a bibl ioteca resultante, que contém cerca de 50000 óãgos, colocando-a em células hospedeiras Y1O88. A análise da placa em lâminas X-gal na presença de IPTG indicou cerca de 90% de recombinantes.

3. RASTREIO IMUNOLÕGICO DAS BIBLIOTECAS DE cADN

Colocou-se nas células Y1090 (ATCC N9 3 71 9 7 ) a biblioteca de expressão de cADN dos merozóitos de Ag Hl a uma densidade de cerca de 10 000 placas por 150 mm de lâmina . Incubaram-se seis destas lâminas durante 3,5 horas a 4 2° C, cobriram-se com fi 1 tros de nitrocelulose previamente embebidos em IPTG 10 mM para induzir a expressão da proteína de fusão β - ga la cto s i da s e ,

-65Ζ

noite, a 37 C. Removeram-se os filtros das lâminas e submeteram-se a diversos grupos de lavagens com TBS (Tris 20 mM, a

PH 8,o, NaCl 0,15 M). Foram bloqueados sítios não específicos de 1 iga ção de proteína s pela incuba ção em soro de feto de vite_ la a 20% (FCS) em TBS durante 2-4 horas num agitador rotativo, a 4°C .

Agregou-se o fluido a scítico para nove anticorpos monoclonais que se sabia reagirem com os antigénios dos merozóitos (designados por 7D4, 7D1, 2OC6, 1 3A 6, 20C1 , 11B6, 3A 5, 13A1 e

15B2), ajustou-se para FCS a 20% e NaCl 0,15 M num volume final de 100 ml e aplicou-se a cada um dos filtros em caixas de petri, dois filtros por caixa. Incubaram-se os filtros com o primeiro a grega do de anticorpo monoclonal a 4° C durante a noite num agi. tador rotativo. Removera m-se os anticorpos que não se ligaram por lavagem dos filtros 5-6 vezes com TBS â tempera tura ambiente. Detecta ram-se os anticorpos ligados incubando os filtros com um a nt i -a nt i co r po do rato desenvolvido na cabra e conjugado com peroxidase de rábano (HPOD) (Boehr inger- Mannheim), segu indo-se o desenvolvimento da côr utilizando 3 mg /ml de 4-cloro-l-na f tol (Bio-Rad e H₂°2 ³ 0,018%, conforme descrito por Hawkes et al., Anal . Biochem . , 11 9 :1 4 2, 1 98 2).

As placas positivas identificadas no ra streio inicial de alta densidade foram purificadas por placa num rastreio secundário utilizando o mesmo agregado de anticorpos monoclona is .

Atribuiu-se cada uma das placas positivas a um anticorpo monoclonal individual do a grega do colocando as placas positivas em filas ordenadas de grelhas múltiplas, cada uma das quais se induziu com IPTG, transf er iram-se para nitrocelulose e incuba ram-6 6-

-se com um dos anticorpos monoclonais do agregado. Identíficou-se uma bacteriófago positivo designado por \m2-4 que foi reconhecido por três dos oito anticorpos do agregado, os anti corpos 7D1, 7D4 e 20C6.

U t i 1 i za ra m-se métodos idênticos para efectuar o rastreio da biblioteca de cADN dos oocistos em esporula ção, com ex cepção de se ter utilizado no primeiro rastreio um agregado de anticorpos monoclonais contendo os anticorpos 6A 5, 7B2, 1 5A 3 e

2OC6 ; no segundo rastreio u ti 1 i za ra m-se os anticorpos 7B2 , 15A3, lOcô e 8A 2; e no terceiro rastreio util iza ram-se os anticorpos 15A 3, 7B2 e 2OC6; e o tampão de incuba ção continha também Tween-20 a 0,05% Cmono laureato so r b i ta no de polioxietileno (20) J.

Deste modo, i dent i f i ca ra m-s e na bibl ioteca de cADN dos oocistos as placas designadas por \si-3, ÁSl-4, Xs 1 - 7; \S2-1, \S2-4 e \S2-5; e \S3-1 que foram reconhecidas, respectivamente, pe los anticorpos monoclonais 6A5, 8A 2 e 7B2. Analisou-se o ADN sin tetizado a partir do fago que produz a proteína que reagiu com o anticorpo 6A5, por digestão com EcoRI e electroforese em geles de agarose (Maniatis e outros, supra , página 150), Descobri ra m-se _t a s s im , três inserções diferentes possuindo as dimensões de, a prox ima damente , 11 50, 8 90 e 615 pb .

4. EXPRESSÃO DOS GENES DE EIMERIA NA E. COLI

Isolaram-se e inseriram-se as moléculas de ADN EcoRI de 1,1 Kb e de 0,9 Kb, respectivamente, dos fagos )lSl-7 e Xsl-3, no sítio EcoRI de cada um dos três v ecto r e s, ex p r e s sã o de sequência de leitura variável, PEV-vrfl, PEV-vrf2 e PEV-vfr3, construídos conforme descrito por Crowl e outros, Gene 38:31,

-671 985. Tra ns forma ram-se os plasmidos que continham as inserções em ambas as direcções possíveis, conforme descrito por Mandei et al. £ J · Mol . Biol . , 5_3_:1 59, 1 970 J na estirpe M 1061 de

E_. coli que contém o plasmido compatível pRK248cIts descrito por Berna rd e outros £ Methods in Enzymology, 68_:482, 1 979 J. A es_ tirpe MC1061 e o plasmido pRK248cIts foram depositados no American, Type Culture Collection e foram-lhes atribuídos os H5s de depósito 33766 e 53338, respectivamente.

Desenvolveram-se os transf ormantes bacterianos a 30° C em meio M9 £ Maniatis e outros, supra , página 68 £ com glucose a 0,5% e ácidos ca samínicos a 0,5% e fez-se subir a temperatura para 4 2° C a uma D.0. (550 m jl ) de 0,5, conforme descrito por

Croul e outros, su pra , para induzir a transcrição do promotor λΡ_γ - Após incuba ção durante 2-3 horas, tomou-se amostras de 1 ml e recolheram-se as células das amostras por centrifugação.

Trataram-se os agregados de células conforme descrito por Czowl e outros, supra, e submeteram-se os lisatos a e1ectroforese com do dec i 1 sul f a to de sódio (SDS), em geles de poliacrilamida, conforme descrito por Laemmli, Nature, 227:680, 1980. A seguir à electrof orese, ou se coraram as proteínas nos geles com azul brilhante de Coomassie ou se transferiram para membranas de nitrocelulose para a ná 1 i se da mancha Western £ Towbin e outros,

Proc. Na tl . Acad. Sei . USA, 76 : 4350, 1 979 ; Burnetti, Anal. Biochem

2:1 95 (1 981 ) J. utilizando o anticorpo monoclonal 6A 5 e um an tianticorpo de rato desenvolvido na cabra e conjugado com HPOD, pa ra detecçã o .

Esta análise indicou que a molécula de cADN de 0,9 kb, num sentido no vector pEV-vrfl produziu uma proteína de 20 Kd que reagiu com o anticorpo 6A 5 . Não se observou qualquer expressão

-68com a molécula de 1,1 kb , devido provavelmente ao facto de con ter sequências não codificantes na extremidade 5'. Para se opti mizar a produção desta proteína, examina ram-se diversos meios de expressão. Descobriu-se que o meio preferido continha , por litro (- 10%) 6,0 g de KH?Ρ0₄, 4,0 g de K^PO^, 5,0 g de (NH ) 2SO4' 7 d^e NgSO ₄~7H ^O, 21,0 g de Extracto de Levedura , 3,5 g de Bacto Tryptone, 1,0 ml de Anti-espuma LB625, 25 g de glicose, mg de Tiamina-HCl, 2,5 ml de solução de vitaminas £ GIBCO MEM (lOOx ) Vitamin Solution J e 1,0 ml de elementos de reforço. O anti-espuma LB625, um produto da Union Ca rbide, e um polímero linear de etileno e um óxido de propi1eno que possui uma viscosidade de 6 25 Saybolt Universal Seconds a 37,8° C.

As vitaminas por litro de caldo de fermentação incluíam

0,25 mg de pantotenato de D-Ca , 0,25 mg de cloreto de colina,

0,25 mg de ácido fólico, 0,25 mg de n i co t i na m i da , 0,25 mg de piridoxal-HCl e tiamina -HC1 adicional; 0,50 mg de i-inositol; e

0,025 mg de riboflavina. Os elementos de reforço incluíam por i tro de ca 1 do

2,7 mg de FeCl^-ôH^O; 0,8 mg de ZnSO ₄~7H ?0 e

0,8 mg de CuSO^-íH^O; 0,7 mg de CoCl^ôH^O e 0,7 mg de Na^MoO^-2H^0; 0,2 mg de H^BO^; e 0,5 mg de MnSO ^-H ^0.

Investigou-se a natureza da proteína imu no - r ea ct iva expressa pelo fago \m2-4, em primeiro lugar num 1 i sogénio iso_ lado a partir de células Y1090 infectadas, por crescimento diferencial às temperaturas permissiva (30° C) e não permissiva (4 3° C) . Para análise da mancha Western das proteína s sintetiza, das por este lisogénio, desenvolveu-se uma cultura de 50 ml a 30°C em meio LB (Maniatis e outros, supra , página 69) a uma D.O. (550 m jx ) de 0,5 e elevou-se a temperatura para 4 2° C, para induzir a replicação do ba cteriófago. Decorridos 15 minutos a 4 2° C ,

-69<a di cionou-se IPTG até 10 mM e continuou-se a incuba ção a 37 C, durante 30 minutos. Recolheram-se as células por centrifugação a 4° C e efectuou-se a sua lise por eluição durante 5 minutos em tampão de amostra de Laemmli £ Tris 0,125 M, a pH 6,8, SDS a 1% (p/v), β -mercapto-etanol 1,4 M, azul de bromo-fenol a

0,01% (p/v), glicerol a 20% (v/v) J. Resolveu-se o equivalente de 1,0 ml de cultura por electroforese num gel de poliacrilamida - SDS a 12,5%, transferiu-se electroforeticamente para nitrocelulose e sondou-se conforme anteriormente descrito com um agregado de três anticorpos monoclonais (7D1, 7D4 e 2OC6), os quais identificaram o fago ^m2-4. O desenvolvimento da man. cha Western revelou uma proteína de fusão com dimensão superior a 150 Kd, que se encontrava presente no 1isogénio induzido (Fig. 10, painel B, pista 2). O anticorpo específico para a β - ga la cto s ida se também reagiu com esta proteína de alto peso molecular, e com uma proteína de aproximadamente 114 Kd, o tamanho previsto apenas para a β -ga la ctosida se (ver Fig. 10, pa nel A , p ista 2 ) .

Efectuou-se a digestão do ADN do bacteriófago \m2-4 com EcoRI para produzir a molécula de ADN de 1,7 Kb . Subclonou-se esta molécula numa associação plasmídica linearizada por EcoRI, contendo os plasmidos pE7-VRFl, 2 e 3 £ Crowl e outros, supra J e transformou-se na estirpe MC1061 da E_. co 1 i , contendo o plasmido pRK248cIts, conforme anteriormente descrito. Efectuou-se o rastreio dos transformastes quanto à expressão de uma proteína imunologicamente reactiva após indução pela temperatura , utilizando a reunião de três anticorpos monoclonais que demonstraram reagir com a proteína de fusão no 1 i sogénio de J\m2-4.

Para além disso, ca ra eter i z ou - s e a proteína recombinante imuno- 70-reactiva por análise da mancha Western dos lisatos de E_. coli, empregando um dos três anticorpos monoclona i s, o 7D4, da associação. Descobriu-se gue cada uma das colónias positivas conti_ nha o ADN pia smídico com a esperada inserção de 1,7 Kb e gue co_ mandava a síntese de uma proteína de aproximadamente 65 Kd, con forme se determinou por análise electrofor ética SDS sobre geles de poliacrilamida .

Descobriu-se gue a ex pressão desta proteína de 65 Kd era rela tivamente insensível às variações do meio de crescimento e de indução. Recuperou-se quantitativamente a proteína no so br ena da nte a seguir à ruptura por ultra-sons das células do agre ga do .

Utilizou-se o pia smido de expressão contendo a inserção de 1,7 Kb na produção subsequente de proteínas recombinantes e, r ep r e s enta - s e , esquematicamente, na Fig. 11. Propagou-se este plasmido em células hospedeiras MC1061 lisogénicas para o \cI857 (que se preparou utilizando os métodos norma 1 iza do s para se gerarem os lisogénios do bacteriófago λ descritos por Arber e outros, in Cold Spring Harbor Monogra ph , Lambda II, 1 983,

Hendrix e outros, Eds., Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, p. 450) a 30° C, para manter o estado de repressão do promotor PL no plasmido.

Utilizando métodos semelhantes, levou-se a efeito a ex pressão de uma proteína de 28 Kd codificada por um segmento de cADN de oocisto em esporulação, que possuía cerca de 1,1 Kb . Esta proteína ligou-se especif i ca mente ao anticorpo monoclona 1 8A2.

Também se levou a efeito a ex pressão de uma proteína de 45 Kd co_ dif içada por um cADN de oocisto em esporula ção de cerca de 1,2

Kb. Esta proteína ligou-se especif icamente ao anticorpo monoclo

-71nal 7B 2 .

5. ANÁLISE DA SEQUÊNCIA DE ADN

Efectua-se, regra geral, o isolamento do ADN plasmí dico em pequena escala, a partir de 1 ml de culturas saturadas de uma noite, utilizando o procedimento de Birnboim e outros fNucleic Acids Research, 7.:1 51 3, 1 979 J. Este procedimento permi.

te o isolamento de uma pequena quantidade de ADN a partir de uma colónia bacteriana para fins analíticos. Preparam-se grandes quan. tidades de ADN utilizando culturas de 1 litro, seguindo um protocolo normalizado com centrifugação em cloreto de césio C Mania, tis e outros, supra, página 93 J.

Determinaram-se as sequência s de ADN dos cADNs das bibliotecas de oocistos em esporulação pelo método de clivagem quí. mica de Maxam e outros, Methods in Enzgmo logg, 65.:49 9, 19 80, e se.

gundo o método de ter mi nu s de ca d eia de Sa nger e outros, Proc.

Na tl . Acad. Sei . U SA , 74:5463, 1 9 77, modificado para ADN plasmídico de cordão duplo por Smith e outros, Cell, 1 6 : 753, 1 9 79, e Wallace e outros, Gene, 16.:21, 1981. No protocolo do terminus de ca d eia substituiu-se 7- dea za - dGTP í Barr et a 1 . , BioTechniques, 4.:428, 1 986 J por dGTP para se eliminarem os a rtefa cto s de compres.

são G-C .

Para facilitar a análise sequencial, tra nsf er iu- se a molécula EcoRI de 1,1 Kb do Sl-7 para o plasmido pEV 3-SEQ (Fig. 12), que possui uma região de ligação múltipla a seguir ao sítio EcoRI de pVE-vrf 3. Utilizou-se esta região de ligação múl. tipla para linearizar o pia smido nos sítios BamHI e Kpnl para se originarem eliminações unidireccionais com ex onucl ea se III

( Henikof f, Gene , 28 : 351 , 1 984). Utilizou-se o sítio X ba I, na região de ligação múltipla, para marcar radioacti vamente a extremidade 3’ para sequenciação de Maxam-Gi1bert das eliminações e utilizou-se o precursor CGGTCGACTCGAGCCA para a sequenciação 3 2 de Sanger. Este precursor foi marcado radioa ctivamente com P 3 2 na sua extremidade 5’ utilizando f P J ATP (ICCN) e polinucleo tidoquinase, de acordo com o descrito por Maniatis e outros, supra , página 122.

A Figura 13 a presenta os sítios de restrição na molécula de EcoRI de 1,1 Kb util iza da para a sequencia ção de Maxam-Gilbert . Também se indica a posição dos sítios EcoRI na molécu la de 0,9 Kb, uma vez que estes também foram utilizados. Também se indicam os pontos extremos das eliminações efectuadas com

Sx onucl ea se III. Estes foram sequenciados ou a partir do sítio

Xba na região de ligação múltipla de pEV3-SEQ, segundo o método de Ma x a m-G i 1 be r t ou com uma extensão precursora (Fig.12) segundo o método de Sanger. Efectuou-se a sequ encia ção de ambos os cordões de cADN, de acordo com um ou com ambos os métodos. Devido ao elevado conteúdo de G-C no ADN, f ra cciona ra m-se, gera Imen. te, as reacções de Max a m-Gi 1 ber t em geles de po1 ia crila mi da-ureia a 8% e a 15%.

Efectuou-se a extensão precursora, incubando 1,5 ju.g

-h de ARN poli(A) com 2 pmoles do precursor oligonucleotidico de síntese marcado na extremidade 5', GA GGTCTGCCATTTTGC, durante 30 minutos a 42°C em Tris-HCl 50 mM, a pH 8,0, MgSO 8 mM, NaCl 01 M, di tiotrei tol 2mM, 2 mM de cada um dos f os fatos desoxinucleotídico s (dNTOP, Pharmacia Fine Chemicals), 20 unidades de RNasin (Promega Biotec, Madison, WI) e 20 unidades de tra nscr ipta se in versa AMV (Pharmacia, Piscataway, NJ, FPLCpure). Ana 1 i sa ra m-se

os produtos sobre geles de poliacrilamida-ureia a 8% utilizados para análise de sequencia ção, com ADN de pBR322 digerido com 3 2

Hpall marcado com P, como um indica dor de tamanho molecular.

Para análise sequencial eluíram-se os produtos primários a partir do gel e analisaram-se pelo método de clivagem química de Maxam e outros, supra , ou utilizaram-se ddNTPs na reacção de extensão £ To lan e outros, J. Biol . Chem. , 259 :11 27,

1984 ; Graves e outros, J. Biol . Ch em. , 2 61 :11409, 1986 J. Analisaram-se as reacções sobre geles de poliacrilamida-ureia a 8%.

Na Fig. 14 apresenta-se a sequência de nucleótidos da molécula de cADN de 1,1 Kb . A sequência da molécula de 0,9 Kb estende-se desde a base 188 até à base 1082 nesta grande molécu la. Na Fig. 15 apresenta-se a sequência de aminoácidos previsí_ vel a partir da a ná 1 i s e da sequência de leitura aberta . Confirmou-se a exactidão da sequência de aminoácidos prevista apresen ta da na Fig. 15, conforme se segue:

Pr epa ra ra m-se polipéptidos de sintese possuindo as se quências de aminoácidos correspondentes aos resíduos 41-57 e

145-1 64 da Fig 15. Utilizaram-se anti-soros de coelho contra es tes polipéptidos na análise de mancha Western das proteínas totais dos esporozóitos e um lisato de transformantes de E. coli que ex pressa vam o cADN de 0,9 Kb. Os anticorpos contra ambos os polipéptidos ligaram-se às proteínas em ambas as análises de man cha Western.

Utilizando métodos semelhantes, determinou-se a sequência de nucleótidos da inserção de 1,7 Kb que codifica a proteína de 65 Kd no bacteriófago \m2-4, com os resultados que se Apresentam na Fig. 16. Na Fig. 17 apresenta-se a sequência de aminoácidos da proteína codificada por esta sequência de ADN.

Confirmou-se esta sequência pela análise da sequência de aminoácidos efectuada em polipéptidos produzidospor digestão tríptica da pro teína de 65 Kd expressa, conforme se descreve a dia nte. As regiões na sequência de aminoácidos total que correspondem a alguns des tes péptidos encontram-se sublinhadas na Fig. 17.

Cur io samente, esperar-se-ia que a faixa de leitura aberta da sequência de ADN para a molécula de 1,7 Kb codificasse uma proteína de cerca de 33 349 da 1 tons . No entanto, o produto de expressão deste fragmento de ADN migrou nos geles SDS com pe so molecular aparente de cerca de 65 Kd . De s co nh e ce-s e a razão desta di scr epa ncia entre o ta ma nho previsto para a proteína e o tamanho observa do . Daqui em diante referir-se-á esta proteína como a proteína de 65 Kd

De um modo semelha nte, determinaram-se as sequência s de aminoácidos previstas e as de nucleótidos do cADN de 7B2 de

1,2 Kb . Apesar de ter sido descoberta uma faixa de leitura aber ta contínua e de a proteína isolada a partir dos esporozóitos

Por imunoprecipitação ser superior a 200 Kd, efectuou-se o rastreio da biblioteca para cADNs maiores, utilizando o cADN de 1,2 Kb como uma sonda . 0bteve-se,assim, um cADN de 3,2 Kb, possuindo as sequências de aminoácidos previsíveis e as sequências de nucleótidos apresentadas nas Figs. 20 e 21, respectivamente.

6. PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DA PROTEÍNA DE 65 KD

6.1. PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA

Efectuou-se a fermentação de alta densidade celular da E_. coli MC1O61 (pRK248cIts) contendo o plasmido de expressão pEV/2-4, em fermenta dores de 10 litros em meio 1,5 X M-9, utili-75zanão protocolos normalizados de indução de temperatura, confor me anteriormente descrito, após, a prox ima damente, 4 horas de cres_ cimento â temperatura permissiva. Recolheu-se a massa celular 5 horas após a indução , produzindo 500 gramas de pasta celular.

Efectuou-se uma suspensão uniforme de 50 g de pasta celular de E_. coli, em 500 ml de Tris-HCl 10 mM, EDTA 5 mM, a pH 8,0, e agitou-se a uma tempera tura compreendida entre 2° e 8°C durante duas horas. Fez-se passar a suspensão através de homoge_ ⁿeizador Gaulin (APV Gaulin, Everett, Ma s sa chu setts, U.S.A.) duas a três vezes a 7 000 psi. Centrifugou-se o lisato celular a

000 X g durante uma hora numa centrífuga Sorvall RC-5 e pôs-se o agregado à parte. Adicionou-se sulfato de amónio sólido ao sobrenadante (concentração final de 80%). Conservou-se a 4°C du rante duas horas e, depois, centrifugou-se a 24 000 X g durante 1 hora. Dissolveu-se o agregado em fosfato de potássio 20 mM, a pH 6,8. Após centrifugação, efectuou-se a diálise do sobrenadante contra fosfato de potássio 20 mM, a pH 6,8.

Encheu-se uma coluna de vidro Pharmacia (de 5 cm de diâmetro X 10 cm de comprimento) com um suporte de sílica NuGel P-DE-20 (200 Angstrom, 40-60 jHm, de fraca permuta aniónica,

Separation Industries, Metuchen, NJ). Equ i 1 ibrou-se o gel com fos_ fato de potássio 20 mM, a pH 6,8. Carregou-se a amostra (10 ml /min), lavou-se com tampão de equilíbrio e eluiu-se com fosfato de potás sio 20 mM contendo NaCl 0,4 M, a pH 6,8. Ana 1 i sa ram-se as fracções da coluna por análise de mancha Western com o anticorpo 7D4 para detectar a proteína de 65 Kd.

Utilizou-se uma coluna de imuno-a f inida de para purificar ainda mais a proteína de 65 Kd. Preparou-se o adsorvente para esta coluna imobilizando o anticorpo mono dona 1 7D4 num su- 7 6porte de sílica NuGel P-polialdeído^ (500 Angstrom . , 40-60 jj.m,

Separation Industries, Metuchen , New Jersey, E.U.A.). 0 procedi_ mento de imobilização envolveu o seguinte: efectuou-se a suspen são de 10 gramas de suporte de polialderdo e lavou-se com fosfato de potássio 0,1 M, NaCl O,1M, a pH 6,8, e transferiu-se quan t i ta t iva mente para um balão de Ehrlenneyer contendo 20 ml do anticorpo monoclonal 7D4 a uma concentração de proteína de 8 mg/ml.

Adicionou-se â suspensão cianoboro-hidreto de sódio (4 mg). Agitou-se suavemente a mistura a 4° C. durante 16 horas. Filtrou-se o gel e lavou-se com fosfato de potássio O,1M, NaCl O,1M, a pH

6,8. Ex am ina ram-se para se verificarem os anticorpos não ligados aos agregados filtrados. A densida de de ligação foi de 8 mg / g do suporte. B1 o qu ea ra m - s e os sítios activados não ligados, efectuan do uma suspensão do gel em 20 ml de etanolamina IM, a pH 7,5. Adi cionou-se â suspensão cianoboro-hidreto de sódio (4 mg), que depois se agitou a 4°C durante 16 horas. Recolheu-se o gel e lavem -se cuidadosamente com tampão de ligação frio.

Para efectuar a cromatografia de imu no-a f in i da de , en cheu-se uma coluna (1 cm X 10 cm) com o anticorpo 7D4 imobilizado e equi1ibrou-se com solução salina de tampão fosfato (PBS) frio, contendo Triton X-100 a 0,1%. Diluiu-se uma mistura de frac_ (F)

Çoes provenientes da coluna NuGel P-DE 200^, contendo a proteína de 65 Kd, duas vezes com PBS contendo Triton X-100 a 0,1% e ca r regou-se na coluna a um caudal de 10 ml/minuto. Após carregamento, lavou-se o gel com PBS para se remover o material não adsorvido. Eluiu-se o material imuno-reactivo adsorvido com ácido acé tico 0,3 M, NaCl 0,1 N, a pH 2,7 e tampão. Concentrou - se depois

F) a proteína num aparelho Amicon Stircelr utilizando uma membrana

YM 10 (Amicon , Div . 17. R . Grace & Co., Danvers, Ma ssa chu setts , E.U.A.).

-77Determinou-se a pureza da proteína por electroforese em gel de poliacrilamida SDS, conforme descrito por Laemmli

Na tur e, 227:680, 1 980 J. Corou-se o gel com azul de Coomassie. Efectuou-se também a análise de mancha Western, utiliza ndo o anticorpo monoclona 1 7D4 como a nt i-a nt i cor po de rato desenvolvido na cabra e conjugado com perox ida se de rábano. Na fig. 22 a pr esentam-se os resultados. As pistas 2, 3, 4 e 5 con.

têm proteínas pur if ica da s a partir de duas prepa ra ções. As pis tas 1 e 6 contêm uma mistura de proteínas indicadoras de peso molecular gue possuem os pesos moleculares indicados à esquerda e à direita da Figura. Verteu-se em cada pista dez microgra. mas de proteína .

Na Fig. 22, pode ver-se que a proteína purificada mi.

grou no gel SDS como a maior banda possuindo um peso molecular aparente de cerca de 65 Kd, com bandas menores possuidoras de mobilidade superior e inferior.

6.2. DETERMINAÇÃO DO PONTO ISOELÉCTRICO

Submeteram-se dez mi crogra ma s de proteína de 65 Kd pur i f ica da a foca li zação isoel éctr ica num gel de foca li zação i-soei éctr ica pré-formado obtido a partir de LKB Instruments,

Ga ither sbur g , Margland, E.U.A. Fez-se passar ao mesmo tempo mistura de proteinas-padrão com pontos i so e 1 é ct r i co s conhe.

eidos. Fez-se passar o gel durante cerca de 2 horas a 50 mA ,

500 V de acordo com as instruções dos fabricantes, utilizando um gra diente de pH compreendido entre 3,5 e 9,5.

Após ter-se completado a focalização i so e 1 é c tr i ca , corou-se o gel com o corante azul de Coomassie para se detecta

- 7 8-

rem as bandas proteicas. Determinou-se, depois, o ponto isoeléctrico da proteína purificada, medindo a posição da banda no gradiente de pH em relação às posições das proteína s padrão.

ponto isoeléctr ico da proteína assim determinado foi 4,6.

6.3. ANÃLISE DA COMPOSIÇÃO DE AMINOÃCIDOS

Efectuou-se a análise da composição de aminoácidos utilizando uma reacção post-coluna de suporte com fluorescami. na, conforme descrito por Pa n e outros, em Methods of Protein

Micro characteriza tion . Shively, ed. , The Humana Press, 1 986, pp. 105-119. H i dro 1 i sa ra m-se as amostras gue continham 3 ^.g da pro teína de 65 Kd em HCL 6N contendo ácido tiogl i icól i co a 4% a 110°C, durante 20 a 24 horas, sob vazio, e utilizou-se para anali_se io% do hidrolisado. Determinaram-se os valores da cisteína após oxidação com ácido perfórmico. No Quadro 3 apresentam-se os resultados.

-79/

QUADRO 3

ANÁLISE DA COMPOSIÇÃO DE AMINOÁCIDOS DA	PROTEÍNA DE 65 KD
AMINOÁCIDOS	PERCENTAGEM EM MOLES
Asp	6,06
Thr	6,07
Ser	7,27
Glu	18,24
Pro	5 , 35
Gl y	16,76
Ala	11,71
Cys	4,45
Va 1	4,88
Met	2,08
11 e	2,1 7
Leu	3,22
Tyr	2, 20
Ph e	2,13
His	1,07
Lys	2, 72
Arg	3, 61
Trp	ND

ND= Não determinado

-80ί .s

6.4. ANÁLISE SEQUENCIAL DA EXTREMIDADE C E DA EXTREMIDADE N

Submeteram-se duzentas picomoles da proteína (conforme determinado pela análise da composição de aminoácidos) a uma análise da extremidade N, utilizando o método de Hewick e outros ; J_. Biol . Chem. , 25 6 : 7 9 90 , 1 981, e um sequenciador

Applied Biosystems, modelo 47OA (Applied Biosystems, Inc., Foster

City, Califórnia, E.U.A.). A sequência da extremidade N assim determinada era M-N-K-N-S-?-L-G-G-F-?-S-M-Q-E-S-P-P-P-. A identidade dos resíduos aminoácidos nas posições indicadas por pontos de interroga ção são incertas devido ao facto da recupera ção de PTH-Cys ser lenta e os resíduos de cisteína poderem estar envolvidos em ligações dissulfureto £ Hewick et al., J. Biol. Chem . ,

256:7990, 1981 J .

Efectuou-se a análise da ex tremida de C com 1 200 picomoles de proteína de 65 Kd por digestão com ca rbox ipeptida se Y, conforme descrito por Hayashi, Methods in Enzymology, 4 7 : 84 , 1 9 7 7.

Utilizou-se a ca r box i p e p t i da s e Y ( Boehr inger Mannheim, Indianapolis, IN) a uma concentração de 0,8 pg/350 pl em tampão de acetato de sódio 0,05 M,apH 5,9, e tomaram-se alíquotas após 0, 2,

5, 10, 20 e 30 minutos para análise. Acidif ica ram-se as alíquotas das amostra s com HC1 para pôr completamente termo à reacção e de pois submeteu-se a análise de aminoácidos, conforme descrito antes. Esta análise demonstrou que a sequência de aminoácidos na extremidade C era provavelmente (Met, Tr p ) -Ala -Ser . Observou-se o aumento simultâneo do triptofano e da metionina, mas o Trp é difícil de quantificar num analisador de f 1 uo r e s ca m i na devido ao facto de possuir uma baixa reactividade com a f 1 uor es ca mina . Por esse motivo, não foi possível determinar com exactidão, através

-81/ desta análise, as posições relativas do Trp e da Met.

.X ⁶-5. ANÃLISE DOS PEPTIDOS TRÍPTICOS

Em parte para se verificar a sequência de aminoá ci dos previsível a partir da sequência de nucleótidos do cADN que codifica a proteína de 65 Kd, efectuou-se a digestão de alguma proteína com tripsina (Cooper Biomedical, Ph i la del ph ia , Pennsylvania ,

E.U.A.) e efectuou-se a sequenciação dos peptidos resultantes, con forme a seguir se descreve.

Ef ectua ram-se as digestões trípticas durante a noite, a 37°c com 148 jj.g de proteína em hidrogeno carbonato de amónio 0,2 Μ, a pH 8, utilizando uma r ela çã o de enz ima substrato de 1:30 (peso ou base molar ). Separaram-se os peptidos assim originados num sistema Maters de HPCL utilizando uma coluna C-18 de

250 X 4,6 mm Altex ultrasphere (Beckman Instruments, Fullerton,

CA) com um gradiente de O a 55% de aumento de acetonitrilo em (base) de ácido tr if luoroa cético a 1%. Antes da separação por HPLC, reduziu-se a digestão com β -mer ca p to-eta no 1 , durante 30 minutos a 37°C,para quebrar quaisquer pontes de dissulfureto nos péptidos. Analisou-se o efluente da coluna a 215 jg.g utilizando um detector (La bora tor y Data Control , Rivera Beach, Florida, E.U.A.). A coluna de HP^ç desenvolveu 8 picos pr inci pa i s, conforme se indica na

Fig. 23A .

Ana 1isou-se cada um dos picos, em primeiro lugar, por análise de aminoácidos, conforme anteriormente descrito, para se determinar a quantidade e a composição dos peptidos. Depois, efec tuou-se a sequenciação da maioria dos picos dos peptidos a partir da coluna de HPLC, por degradação de Edman automática, utili

-8 2-

zando um sequencia dor de fase gasosa Modelo 47OA , Applied Biosys tems. Identificaram-se os derivados aminoácidos da fenil-tio-hidantoína (PTH) num sistema HPCL da Waters utilizando uma coluna C-18 Altex ultrasphere, conforme descrito por Hawke et al.

£ Anal . Biochem . , 1 20 : 30 2 , 1 982 J ou num analisador de aminoácidos PTH em linha com um Applied Biosgstems, Modelo 120A.

Indicam-se as sequência s de aminoácidos de alguns des_ tes pe'ptidos sob as regiões sublinhadas, na Fig. 17. Indica-se o número de cada um destes peptidos (gue correspondem aos números dos picos de HPCL) rodeados por um círculo próximo da sequên. cia correspondente. A incerteza na identidade de alguns dos resíduos nas sequências peptídica s indica-se por um ponto de inter. rogação naquelas posições, apesar de a análise das composições de aminoácidos dos peptidos indicar que os aminoácidos indicados nas posições correspondentes da sequência previsível se encontravam presentes nos peptidos. A incerteza na identidade de alguns dos resíduos peptídicos deve-se à fraca reactividade do triptofano com a f luor esca mina .

O péptido 6 que corresponde à extremidade N da proteína de 65 Kd completa . contém 4 resíduos na sua extremidade iV que são codificados por nucleótidos no pia smido de expressão. A a ná_ lise do pe'ptido 8 produziu uma sequência de aminoácidos semelhan. te à do péptido 3, mas a que faltavam os 4 resíduos da extremida. de C, sugerindo que era, p rova v e 1 m en t e, o resultado de digestão tríptica incompleta . Não se ef ectuou a sequencia ção do péptido devido ao facto de a análise da composição de aminoácidos des te péptido indica r que este era idêntico ao péptido 6, com ex cep_ ção dos 3 primeiros resíduos aminoácidos da ex tremi da de N.

Efectuou-se a análise HPLC do material digerido trip-8 3tica mente, conforme descrito antes, mas sem redução prévia, com mer ca p to e ta no 1, o que produziu um tipo de eluição do qual os pi cos 4, 7 e 8 esta vam ausentes (Fig.23B). Esta observação sugere que estes péptidos contendo cisteína se encontram, provav el_ mente, envolvidos na formação da ponte de dissulfureto na proteína não r eduz i da .

7. IMUNIZAÇÃO DOS PINTOS

7.1. UTILIZAÇÃO DO ANTIGÉNIO DE 65 KD

Para se determinar se era possível que a administração da proteína de 6 5 Kd recombina nte purificada protegesse as aves de ca poeira contra a agressão pelos oocistos esporulados da Eimer ia tenella , efectuou-se uma série de ensaios de imuniza ção. Nestas experiências, conserva ram-se pintos Leghorn de 1 dia a hres semanas de idade (Avian Services, Frenchtown, New Jersey,

E.U.A.) num compartimento limpo e tratados por assistentes que não estavam em contacto com outras aves durante o tempo de agres são ( chalenge ). Conserva ram-se as aves em gaiolas para ninhadas aquecidas el e ctr i ca mente até às 3 ou 4 semanas de idade, após o que se transferiram para gaiolas de crescimento.

Forneceu-se a d 1i bi tum, ao longo da experiência, água e alimentos fervidos à partida isentos de medicamentos. Na altu ra da agressão com oocistos, tra nsf er iram-se as aves para um outro edifício onde se mantiveram atê ao fim das experiências. Exa minaram-se as condições clínicas dos animais, pelo menos três ve zes por semana, antes da imunização e diariamente após a imuniza_ ção. Identificaram-se indivídua Imente os animais através de ban-84-

ãa s nas asas às 3 ou 4 semanas de idade antes de se dividirem aleatoriamente em diversos grupos de ensaio. Utilizou-se como imunogénio diversos lotes de proteína de 65 Kd purificada por ^cromatografia de a f inida de , conforme anteriormente descr ito.Estes lotes de imunogénio continham actividade de endotox ina bacteriana num intervalo compreendido entre cerca de 0,3 e cerca de unidades de endotox ina por Jtg de proteína , com actividade de terminada e definida de acordo com o descrito na United Sta tes

Pha rmacope ia,Ro ckvi11e, Md, United States Pharmacopeia1 Convention

Inc., 21½ Revisão, 1985, pp. 1165-1167. Dissolveu-se a proteína em tampão K^HPO^ 0,02 M a pH 6,8, antes de se utilizar, e diluiu.

-se com o mesmo tampão conforme necessário.

Utilizou-se albumina de soro de bovino (BSA, Pentex ) como controlo . Uma vez que existia actividade pirogénica no imu. nogénio utilizado, a di ciona ra m-se qua ntida des aproximadamente iguais de tal actividade a todos os controlos BSA, para evitar quaisquer efeitos não específicos que possam dever-se a esta a c_ tividade. Adicionou-se esta actividade pirogénica ao BSA sob a forma de um lisato de E. coli não transformada que se preparou por ruptura da E_. coli com ultra-sons tendo-se, depois, filtrado o material através do filtro Millipore de 0,45 JI.

Combinaram-se amostras diluídas de BSA de controlo ou o antigénio de Eimeria com um volume igual de adjuvantes e misturou-se cu i da do sa mente em seringas de vidro munidas de agulhas de calibre 18, antes da administração. Utilizaram-se os adjuvar tes completo e incompleto de Freund, respectivamente, para as imunizações iniciais e de reforço. Obtivera m-se os adjuvantes em

GIBCO, Grand Island, New York, E.U.A..

-8 5-

Efectuaram-se as primeiras imuniza ções por via subcutânea na porção posterior do corpo, na base do pescoço, quando as aves tinham 4 semanas de idade. Algumas aves também receberam imuniza ções de reforço às 6 semanas de idade. O volume do material injectado encontrava - se compreendido entre cerca de 0,4 a 2,4 ml. Para maiores volumes, dividiu-se a dose em duas injecções. Duas ou três semanas após a última vacinação, inocula ram-se as aves com 25 000 ou 50 000 oocistos esporula dos de E_. tenel la administrados por via oral. Sete dias após a inm-se as aves sobreviventes, ef ectuou-se a sua ificaram-se em relação às grandes lesões. Também se efectuou a necropsia de todas as aves que morreram duran £ ^s as experiências. Ef ectua ram-se os diagnósticos e classificaram-se as lesões intestinais como O=normal, 1= leve infestação,

2= infestação moderada, 3= infestação grave e 4- morte. Resumiram-se as leituras obtidas como o grau médio de infecção de cada grupo de aves. Também se pesaram as aves na altura da infecção e 7 dias após a infecção. Algumas aves não se encontravam vacinadas com BSA ou com o antigénio coccidiano, mas trataram-se como infectadas ou não infectadas, controlos não vacinados.

No Quadro 4 apresentam-se os resultados de duas destas experiências.

QUADRO 4

EFEITO DA IMUNIZAÇÃO DE PINTOS POR VIA SUBCUTÂNEA DADA UMA OU DUAS VACINAÇÕES COM O ANTIGÉNIO DE 65 KD RECOMBINANTE PURIFICADO

Peso

	Dose (j^g)	na Idade de	Registo de	Adquirido /Perdi do
NS de Aves	â Tra tamento	4 semanas	6 semanas Experiência 1	lesões	(grama s)
10	IUC	-	-	2,8	-25
8	Antigénio	3,25	-	2,4	-44
10	Antigénio	12,25	-	2,5	-10
6	BSA	17,5	-	3,0	+ 40
10	UUC	-	-	0	+107
10	IUC	-	-	2,9	-40
8	Antigénio	3,25	1,6	2,0e	-15
10	Antigénio	2 7,5	13,2	1,8S	+ 5
8	BSA	12, 25	13,2	2,5	-13
10	UUC		Experiência 2	0	+ 87
8à	IUC	-	-	2,6	-11
10	Antigénio	4	-	2,2	+ 65
10	Antigénio	20	-	2,0	+19
9	Antigénio	100	-	2,9	+14
10	BSA	100	-	2,4	-7
10	IUC	-	-	2,5	+15
10	Antigénio	4	4	2,1	+ 35
10	Antigénio	20	20	2,0	+ 74
8	Antigénio	100	100	2,1	+ 81
10	BSA	100	100	2,4	+ 69
4	UUC	-	-	0	-3

-8 7a- IUC, Antigénio, BSA e UUC referem-se, respectivamente, a controlos não imunizados infectados (com oocistos), proteína de 65 Kd purificada, albumina de soro de bovino e controlos não imunizados não infectados.

b- Na experiência 1 as aves a gue se administrou uma única imu nização foram inoculados 3 semanas mais tarde com 50 000 oocis_ tos esporulados de E_. tenel la ; aqueles a quem se administrou uma vacinação de reforço foram inoculados 2 semanas depois com

000 oocistos. Na experiência 2, os tempos de inoculação com oocistos foram os mesmos, mas a dministraram-se 25 000 oocistos As aves unicamente vacinadas e às aves a que se administraram reforços. Mantiveram-se para cada uma destas experiências os con trolos infectados não imunizados e propor ciona ram-se números idênticos de oocistos esporulados para as mesmas idades, sete dias antes de se sacrificarem as aves. Os resultados baseiam-se numa escala de O a 4, conforme descrito no texto.

c- Os va lores apresentados são a diferença entre o peso no momento da inf ecção e o peso sete dias após a infecção .

d- Este grupo continha originalmente 9 aves, mas uma morreu após uma sema na .

e- p < 0,05 comparado com IUC.

Os dados do Quadro 4 indicam que a vacinação com a pro teína de 65 Kd produziu geralmente registos de lesões numericamente inferiores, em comparação com os controlos i nf ecta do s mas não imunizados. Dois grupos de aves a quem foram administradas vacinações de reforço na Experiência 1 (assinalado pelo expoen te e no Quadro) a presenta ram classificações de lesão reduzidas, o que foi estatisticamente significativo. Noutros casos, o grau de redução das classificações de lesão não foi tão significativo,

-8 8-

ma s o peso adquirido foi, no entanto va cina da s .

geralmente maior nas aves

Para se determinar se uma terceira vacinação aumentaria mais, ainda, a protecção, levou-se a efeito uma experiência na qual se trataram grupos de 9 aves como infectadas ou não infectadas, controlos não vacinados ou vacinados com BSA ou com proteína dos merozóitos às 3, 5 e 7 semanas de idade. As duas pr imeira s vacinações foram efectuadas com adjuvante completo de

Freund. Quando se administrou a terceira vacinação, esta foi admi. nistrada com adjuvante incompleto de Freund. Propor ciona ram-se os reforços por via subcutânea, conforme anteriormente descri.

to .

Duas semanas após a última vacinação desafiou-se cada

3ve com 25 000 oocistos esporulados de E_. ten el la por via oral .

Determina ram-se os pesos corporais na altura da inoculação e 7 dias depois, altura em que se sacrificaram as aves e se avaliaram as lesões cecais. A pr e s enta m-s e no Quadro 5 os resultados.

-89}

J

QUADRO 5

EFEITO DA	IMUNIZAÇÃO	SUBCUTÂNEA	DE PINTOS A QUE SE	ADMINISTRA -
RAM DUAS	OU TRÊS VACINAÇÕES COM	0 ANTIGÉNIO RECOMBINANTE PURI-
FICADO DE	6 5 KD
	Dose ( jig)	na idade de	Avaliação^	Peso Adquirido/Perdido
Tratamento a	3 sema na s	5 semanas 7	semanas de lesões	( gra mas )
IUC	-	-	2,13	+ 59
Antigénio	4	4	1,75	+122
Antigénio	4	4	2,88	+128
Antigénio	20	20	1,88	+ 87
Antigénio	20	20	1,88	+ 69
BSA	20	20	3,13	+106
BSA	20	20	2, 38	+131
uuc	-	-	0	+131
IUC	-	-	2,25	+ 23
Antigénio	4	4	4 2,25	+ 91
Antigénio	20	20	20 2,25	+ 86
BSA	20	20	20 1,75	+ 78

a- IUC, Antigénio, BSA e UUC referem-se, respectivamente, a con trolos infectados (com oocistos) não imunizados, proteína de 65

Kd purificada, albumina de soro de bovino e controlos não infec tad_os não imunizados.

b- Inocula ram-se as aves 2 semanas após a última vacinação com 25 Ooo oocistos esporula do s de E_. tenella , ou sete dias antes de se sacrificarem os controlos não imunizados infectados. Para estudos de imuniza ção dupla e tripla estes controlos possuíam, res_ pectivamente, sete e nove semanas de idade. Os resultados baseiam.

-se numa escala de 0-4, conforme descrito no texto.

c- Os valores apresentados são a diferença entre o peso no momen_ to da infecção e o peso sete dias após a infecção.

Os dados do Quadro 5 indicam que não se melhorou a imunidade media nte a administração de uma terceira vacinação.

A protecção maior, conforme verificado pela baixa classificação das lesões cecais, foi conferida pelo antigénio, em comparação com os controlos não infectados não tratados ou aves vacinadas com BSA.

Para se determinar se outras vias de administração, que ⁿao a injecção subcutânea, podiam produzir melhores resultados, administraram-se dois níveis de dosagem da proteína de 65 Kd três ^vezes, com intervalo de duas semanas, a grupos de 8 pintos Legho r n de 3 semanas de idade, utilizando as vias de administração intraúérmica, subcutânea, intramuscular, oral e anal. Decorridas duas semanas sobre a última administração imunogénica, i no cu la ra m - s e as aves com 25 000 oocistos esporula do s de Eimeria tenella , administrados por via oral. Sa cr if ica ram-se as aves e determinou-se a classificação de lesões cecais.

Administraram-se as injecções subcutânea s, conforme

anteriormente descrito. Efectua ram-se as injecções intramusculares profundamente no lado exterior da coxa esquerda. Administraram-se as inj ecções intra dérmica s no lado anterior da asa direita . A administração oral foi efectuada utilizando uma agulha de calibre 18 com uma ex tremida de em balão e depositando o inoculum no papo da ave. A administração anal efectuou-se utilizando uma agulha de ex tremida de em oliva de calibre 18 com 5 cm de comprimento, que se introduziu até ao máximo do seu comprimento na abertura cloacal. Após as administrações oral e anal coloca ram-se as aves, respectivamente, nas posições de pé e invertida, durante alguns minutos, para evitar a possível expulsão do ino cu 1 um .

A forma de dosagem subcutânea processou-se conforme a n_ ter iormente descrito, com adjuvante completo de Freund para a injecção inicial e adjuvante incompleto de Freund para as injecções de reforço. As formas de dosagem para outras vias de administração continham proteína nos níveis indica do s em tampão K^PO 0,02 M, a pH 6,8.

No Quadro 6 a presentam-se os resultados desta experiên.

cia .

-9 2EFEITO DE DIVERSAS VIAS DE ADMINISTRAÇÃO NA VACINAÇÃO DE PINTOS

QUADRO 6

COM 0 ANTIGÉNIO DE 65 KD

Peso

Tratamento/	Dose (mg)	na Idade	de	Classificação	Adquirido/Perdido
/Viaã	3 semanas 5	semanas	7 semanas	de lesões	( Gra mas )
iuc	-	-	-	2,9	+58
Antigeno/SC	5	5	5	2,3	+ 66
Antigeno/SC	25	25	25	2,8	+ 68
BSa/SC	25	25	25	2,8	+ 47
Antigeno/IM	5	5	5	2,3	+ 33
Antigeno/IM	25	25	25	2,3	+ 72
Antigeno/A	5	5	5	2,5	+ 53
Antigeno/A	25	25	25	2,6	+ 50
Antigeno/O	5	5	5	l,8d	+ 67
Antigeno/0	25	25	25	2,5	+ 87
Antigeno/ID	5	5	5	2,1	+ 26
Antigeno/ID	25	25	25	l,9d	+114
UUC	-	-	—	0	+114

-9 3/ a- IUC, Antigénio, BSA e UUC referem-se, respectivamente, a con trolos infectados (com oocistos) não imunizados, proteína purificada de 65 Kd, albumina de soro de bovino e controlos não infectados não imunizados. SC, IM, A, O e ID, referem-se, respectivamente, às vias de administração subcutânea, intramu scula r, ^a na 1 , oral e intradérmica.

b- De sa f ia ram-se as aves 2 semanas após a última vacinação com

000 oocistos esporulados de E_. tenel la , ou sete dias antes de se sacrificarem os controlos não imunizados. Estes controlos tinham 9 semanas de idade guando foram infectados. Os resultados baseiam-se numa escala de 0-4, conforme descrito no texto.

c- Os valores a pr esenta do s são a diferença entre o peso no momen to da infecção e o peso 7 dias após a infecção.

d- P< 0,05 comparado com IUC.

O Quadro 6 indica gue se observaram os números mais ba i_ xos de lesões cecais nas aves imunizadas com 5 j\g de antigénio por via oral e com 25 /19 de antigénio por via intradérmica . Estes resultados são estatisticamente significativos. Observaram-se avaliações de lesões numericamente mais baixas para outras ^v ia. s de administração e para outros níveis de dosagem, indi ca ndo uma tendência protectora . As diferenças entre estes registos e °s das aves IUC não foram, contudo, estatisticamente significativo s.

É possível que o insucesso na observação de respostas lineares à dose nas experiências antecedentes se tenha devido a diferenças nos vestígios de contaminantes e/ou conteúdo pirogéni. co nas preparações do antigénio de 65 Kd ou a outros factores.

7.2. VACINAÇÃO COM 0 VECTOR VACCINIA

Para se produzir um meio mais eficaz para se imu nizarem os pintos com os antigênios de E_. tenella da presente invenção, clonaram-se no vírus vaccinia o cADN de 1,1 Kb que codifica a proteína de 20 Kd reconhecida pelo anticorpo monoclo nal 6A 5 (Fig. 14) e a molécula de cADN de 1,1 Kb que codifica a proteína de 28 Kd reconhecida pelo anticorpo mono dona 1 8A 2 e utilizaram-se para vacinar as aves de capoeira, conforme anteriormente descrito.

7.2.1.PREPARAÇÃO DO VECTOR

Produz iram-se todos os r ecomb ina nte s com base na recom binação homóloga no interior do locus da t im i d i no qu ina s e (TK) vi ral, de a cor do com o descrito por Ma ckett et a 1 . £ Proc. Na tl .

Acad. Sei . USA, 79 : 741 5 , 1 982 J . Ca r to g ra f ou - s e o locus TK para o fragmento HindIII J do vírus vaccinia (VV) £ Hrubg et al., J_. Virol., 43:403, 1982 J e efectuou-se a sequenciação de parte des te fragmento í Weir et a 1 . , J . Virol , 4 6 5 30 , 1 9 8 3 J .

Para se construir um vector para recombinação, subclonou-se o fragmento VV HindIII J no interior de pUC8 (Fig. 24a ).

Clivou-se esta construção com Hpall. Trataram-se os fragmentos

Com o fragmento Klenow de ADN polímerase da E_. co 1 i (Klenow) e voltou a clivar-se com HindIII e isolou-se a porção contendo o gene virai TK, a partir de agarose de baixo ponto de fusão. Ligou-se o fragmento isolado no sítio HindIII e no sítio EcoRI de extremidades com pl ementa r iza da s (tratamento SI ) de um vector pUC8 (Fig. 24b, à direita). Subsequentemente, eliminou-se o sítio

-9 5HindlII por tratamento do ADN digerido com HindIII com Klenow e voltando a efectuar a ligação do fragmento vector. Para inserção do promotor VV ( designado por promotor de 7,5 K), clivou-se o vector com Cia I e EcoRI.

promotor VV de 7,5 K encontra-se loca 1iza do num dos fragmentos Sall mais pequenos do vírus £ Venkatesan et al.,

Cell, 25:805, 1981 £. Clonou-se o fragmento correspondente no in terior de M13mp8. Seieccionou-se um clone no qual o sentido de transcrição se dirigia para o sítio EcoRI de M13mp8 (Fig. 24a, ^ã esquerda ). Cl ivou - se o ADN com Seal e Smal, a di ciona ram-se li.

gantes BglII e religou-se o ADN (Fig. 24b). Isolou-se o fragmento EcoRi-Acçq contendo o segmento promotor virai, a partir da construção Ml 3 e ligou-se no interior do fragmento pUCS-TK, anteriormente descrito, de que resultou o vector pUC8-ΤK-7,5K* .

Efectuou-se a digestão deste novo vector com BglII e EcoRI.

Para se criar um vector com sítios de dona gem múltiplos, incluiu-se uma região de ligação múltipla adequada na cons.

trução anterior. Com esta f ina 1 ida de escolheu-se a região de ligação múltipla contida no M13tgl31 (Amersham) (Fig. 24d). Inseriu-se o fragmento de ligação múltipla isolado por digestão do

ADN do bacteriófago com BglII e EcoRI, na construção pUC8-TK-7,5K*, originando o vector básico final para a recombinação dos antigénios estranhos no VV (Fig. 24c) que é o pUC8-TK-7,5K.

fragmento EcoRI que codifica a proteína de 28 Kd que se liga ao anticorpo monocional 8A 2 não contém a sequência para a porção da extremidade N da proteína. Faltam o codão inicial de partida e a sequência principal (leader) para a proteína .

Para compensar estas regiões em falta, ef ectua ram-se duas construções diferentes e ensaiaram-se para ex pressão . Na pri

meira construção, originou-se um codão de início de sequência por eliminação de uma porção da região de ligação múltipla no vector base para recombina ção de pUC8-TK-7, 5K (Fig. 24c). Efec tuou - se a digestão do vector com EcoRV e Smal, ei imina ndo pa r_ te da região de ligação múltipla (Fig. 24d) e depois religando.

-o a esta manipulação, o codão ATG contido no sítio de restrição Sphl foi colocado na sequência de informação correcta para a região codif ica nte da proteína dos oo ci sto s no fragmento EcoRI.

Confirmou-se o êxito da manipulação pela sequenciação do novo fragmento de ligação múltipla . Na Fig. 25A, apresenta-se a sequência de aminoácidos da extremidade N prevista para a proteína codificada por esta construção.

Para com pensa r na sequência de ADN não só a falta do co dão inicial mas também a sequência principal, colocou-se o fragmento EcoRI na sequência de informação correcta próx imo de uma sequência principal de um antigénio de malária. O antigéno da malária utilizado para se isolar a sequência principal era a proteí. na de 190 Kd descrita como Ro-33 £ Certa et al., EMBO J_. , 6_:4137,

987 J. No entanto, deve ter-se em conta que se podem utilizar, com o mesmo propósito, outras sequências principais tal como as sequências principais coccidianas.

Para se isolar o fragmento de ADN que contém a sequên. cia principal, efectuou-se a digestão de Ro-33 com DraI. Isolou-se o fragmento contendo os sítios de reconhecimento para as enzimas de restrição PVu.II e HindiII e digeriu-se com HindIII. Cli vou-se a construção vector original pUC8-TK-7,5K (Fig. 24c) com

Sall, tra tou- se com Klenow e, depois, digeriu-se com Hind III.

Neste fragmento vector, clonou-se o fragmento principal do antigénio da malária, Dra I - Η i n d 111. Utilizou-se esta construção

-97j t

/ i

para expressar uma proteína de fusão entre a proteína de 190 Kd de P. fa 1 ci pa rum e o antigénio da E~. tenella reconhecido pelo anticorpo 8A 2 e codificado pelo fragmento EcoRI. Na Fig. 25B, in dica-se a sequência de aminoácidos previsível da ex tremida de N desta proteína de fu sã o .

Clonou-se o fragmento EcoRI que codifica a proteína de

Kd no sítio EcoRI da região de ligação múltipla contida no vector básico (Fig. 24c). Propa ga ram-se as construções contendo ° fragmento no sentido correcto e u t i 1 i za ra m-se para recombinação nos vírus va ccinia . Devido ao modo como se construiu o sítio úe iniciação de transferência no vector básico (ver acima) esperavam-se duas sequências diferentes da ex tremida de N para o gene ^a ser expresso pelos vírus recombinantes de vaccinia (Fig. 25).

Enquanto apenas se adicionaram 3 aminoácidos a di ciona i s (Met, Arg e Trp) à sequência original na primeira constru çã o (Fig. 25A), na segunda fundiram-se um total de 47 aminoácidos derivados da sequência principal do antigénio da malária de 190 Kd com a extre midade N do polipéptido reconhecido pelo anticorpo monoclona 1 8A2 (Fig. 25B). Por processamento no sítio de clivagem potencial da sequência principal, removeram-se 19 dos aminoácidos adicionais, o que conduziu a uma proteína madura que se inicia com Vai, Thr,

His .

fragmento EcoRI gue codifica a proteína de 20 Kd reconhecida pelo anticorpo monoclonal 6A 5 contém a sequência completa . Clonou-se este fragmento, sem mais manipulação no sítio

EcoRI do vector VV , conforme anteriormente descrito.

Efectuou-se a recombinação dos genes anteriores que co dificam os antigénios coccidianos na estirpe WR do vírus vaccinia, utiliza ndo um procedimento em dois passos para a selecção

do vírus recombinante.

No primeiro passo, desenvolveram-se células de macaco

C VI em meio I £ Meio Mínimo Essência 1 de Eagle (MEM), soro de feto de vitela a 5% (ECS; da Amimed), P en i ci 1 i na / E str eptom i ci na (100 unidades/ml e 100 unidades jrg/ml, respectivamente, e glutamina 2 mM; todos os reagentes foram da Gibco £ em placas de cultura de 8 cm 2 até uma confluência de 80-90%. Removeu-se o meio e substituiu-se por 0,2 ml de uma suspensão virai contendo a estirpe ts N7 do vírus va ccinia sensível à temperatura £ Drillen et al., Virology, 1 31 : 385, 1 98 3 £ até 0,1 unidades formando placa (pf u)/cé1ula . Deixaram-se as pia ca s à tempera tura ambiente du

mina e incubaram-se os recipientes durante 2 horas a 33 C (a temperatura permissiva de crescimento para este vírus) num incubador de CO 2 £ Kieny et al., Na ture, 31 2:1 63, 1 984 £.

Meia hora antes do fim do período de incubação anterior, preparou-se um precipitado de fosfato de cálcio contendo ADN. Es_ te continha tampão HeBS £ NaCl 280 mM, hidrogeno fosfato de sódio 1,5 mM, HEPES 50 mM £, 200 ng de ADN purificado da estirpe

NR do vírus vaccinia e 200 ng do ADN plasmídico contendo o gene do antigénio coccidiano purificado, num volume total de 0,55 ml. Adicionou-se cada um dos ADNs a 1 tf de tampão TE (Tris-HCl 10 ruM, a pH 7,5, EDTA 1 mM) . Adicionou-se a esta solução, gota a goe agitando cu i da do sa mente, 0,55 ml de uma solução de cloreto de cálcio 250 mH. Deixou-se a mistura à temperatura ambiente durante 20 minutos.

Decorridas duas horas de incubação, aspirou-se o meio dos recipientes de cultura e substituiu-se por 0,25 ml do anterior precipitado de cálcio contendo ADN e deixou-se à temperatu-99χ fi /

ra ambiente durante uma hora . Subsequentemente, adicionaram-se 2 ml de Meio I a cada recipiente e incuba ram-se os recipientes durante duas horas a 39,5°C num incubador de COa 5% (Kieny e outros, su pra ) . A esta temperatura, o vírus ts N7 ⁿão se pode replicar, daí resultando a selecção de vírus que se tenham recombinado, pelo menos no locus ts7. Devido ao facto de o fosfato de cálcio ser eventualmente um inibidor do cr escimen. to celular, removeu-se o meio após 2 horas de incubação e lava ram-se as células 3 vezes com 1 ml de PBS com agitação cuidado.

sa . Aspirou-se a solução PBS final e a di ciona ram- s e 2 ml de Meio

Ia ca da . A incuba ção a 39,5 C num incubador de CO prosseguiu dura nte 2 dias

Decorridos dois dias de incuba ção, colocaram-se os ,o de cultura com o meio e as células a -30 C dura nte um curto intervalo de tempo e, depois, de s con g e la ra m-s e , raspa.

ram-se do fundo do recipiente as células que ainda se encontravam agarradas e tratou-se a suspensão por ultra-sons, conforme anteriormente descrito. Utilizou-se este homogenato para o segundo passo de selecção.

Neste passo, removeu-se o meio de uma extensão quase confi_uent_e de células humanas 143 TK (ATCC CRL 8303) que se de2 senvolv iam em recipientes de cultura de 8 cm e substituiu-se por 0,2 ml de homogenato não diluído ou de homogenato diluído a 1:5 ou 1:30 (vol/vol) com PBS. Deixou-se prosseguir a infecção das células TK , à temperatura ambiente, durante 1 hora .

Após incubação, a diciona ram-se às células 2 ml de um

Meio II semí-sólido (Meio I com aminoácidos não essenciais (GIBCO;

número de ordem 043-1140), vitaminas essenciais (GIBCO; número de ordem 042-11 20) e agarose a 1%) contendo 0,1 mg/ml de bromo-100!

-desoxi-uridina . Depois, incubaram-se os dura nte

16-24 horas a 37 C num incuba dor de COColocou-se sobre as células uma segunda camada de Meio II semi-sólido, contendo ver_ melho neutro a 0,2% além dos componentes referidos antes, e in cubaram-se os recipientes durante mais 16-24 horas. Apareceram placas incolores gue eram cia ramente visíveis e recuperou-se o vírus como clones individuais por penetração da região da placa com uma pipeta Pasteur (purificação em placa). Desenvolveram-se os vírus recuperados deste modo em células CVl, conforme anteriormente descrito, e submeteram-se a uma segunda e terceira sé_ ries de purificação em placa nas células 143B TK . Estes vírus purificados em placa desenvolveram-se e pur if i ca ram-se, conforme

Anteriormente descrito.

Para se ensaiar a expressão dos antigénios coccidianos Pelos vírus r ecomb ina nte s , sedimenta ram-se células CVl infecta_ das com vírus r ecomb ina ntes numa centr ifuga dora de bancada ( ta b 1 e-to p ) (Hettich Mikrorapis K, a 100%, durante 3 minutos a 20° C), e lavou-se o agregado duas vezes com PBS, voltou a cen trifugar-se e a efectuar-se nova su spensão em PBS. Aplicou-se a suspensão celular a uma lâmina de vidro de microscópio (FloW) e deix ou-se secar. Um segundo método consistiu em desenvolver as células CVl directa mente em lâminas de microscópio (t-liles

Lab-Tek 4808), infectando as células com vírus e incubando-as durante 1-2 dias. Depois lavaram-se as células livres do meio de crescimento em PBS e deixaram-se secar nas lâ mina s à temperatura ambiente. Para se fixarem as células, mergulharam-se as lâminas em acetona durante, pelo menos, uma hora a -30°C e deixaram-se secar à temperatura ambiente.

Verteram-se anticorpos monoclonais do rato para os an-101 tf tigénios a nti-a ntigénio s coccidianos diluídos em PBS, pelo gue as células ficaram uniformemente cobertas com o líquido. Colocaram-se as lâminas num compartimento húmido a 37° C, durante 1 hora, e lavaram-se a seguir diversas vezes com PBS. Sem permitir que as lâminas secassem, verteu-se sobre elas um segundo anticorpo (anti-IgG do rato desenvolvido na cabra marcado com FITC,

Nordic) diluído em PBS e colocaram-se as lâminas num compartimento húmido a 37° C, durante uma hora, para permitir que os anticorpos reagissem. Após diversas lavagens com PBS, deixaram-se secar completamente as lâminas. Pipetaram-se sobre as lâminas algumas gotas de glicerina em água, a 20% (v/v), e colocou-se sobre elas uma cobertura de vidro (Menzel 24x 60). Determinou-se, então, a fluorescência da prepa ra ção de células sob luz UV num microscópio (Zeiss ICM 405, com uma objectiva FIO ou Planapo

63) .

A estipe WR do vírus pode mu 1 t i pl i ca r - s e em quase todos ° s tipos de células £ Drillen et al., J_. V i ro lo gg , 28_: 843, 1 9 78 / e pode observar-se directamente a sua multipl i ca ção através da formação de placas. Na maioria dos casos, contudo, u ti 1iza ra m-se as células f i broblá stica s embrionárias (CEF) de pintos para se prepararem grandes reservas de vírus.

Para se obterem células CEF, isolaram-se dos ovos embriões de 11 dias sem as suas ex tremida des, cortaram-se em pequenos fragmentos e efectuou-se a sua suspensão numa solução de tripsina a 0,25% (Difco) durante duas horas à temperatura ambiente. Di lu iu —se esta suspensão com um volume de Meio I e fil_ trou-se a través de um peneiro celular (B el 1 co, malha 150) e sedimentaram-se as células (centrífuga de bancada Hermie, duran te 5 minutos, a 2 000 rpm, à temperatura ambiente) . Efectuou-se

-102-

nova suspensão do agregado celular em 1/4 do volume inicial de

Meio I e inoculou-se esta suspensão celular CEF nos recipientes de cultura de células. Dependendo da densidade inicial das célula s, deixaram-se densenvolver as culturas durante 1-2 dias e utilizaram-se para infecção directamente ou após 1-2 passagens adicionais. Pode encontrar-se uma sinopse para o estabelecimento de tais cul tura s primárias em Frehneg, Culture of

Anima 1 Cells, New York, Alan R. Liss Verlag, 1 983, Capítulo 11, p . 99 .

Para infecção removeu-se o meio de 80-90% de células

CEF confluentes que se desenvolviam em balões de cultura de 175 cm^ (Falcon 3028) e incuba ram-se as células numa solução de PBS , , 2 contendo vírus (0,1 pfu/celula, 0,01 ml/cm ) durante uma hora à temperatura ambiente (20° C ) ( PBS / Du 1 becco , Amimed). Adicionou- se , então. Meio I (0,2 ml / cm ? ) e incuba ram-se os ba Iões a 3 7° C durante 2-3 dias até cerca de 80% das células terem sido destruídas. Armazenou-se a solução de reserva resultante directamente com as células e o meio nos balões de cultura originais a -30°C antes da purificação dos vírus.

Utilizaram-se os passos de purificação gue se seguem para se obter uma preparação de vírus isenta de todos os compo nentes específicos das células hospedeiras. Descongela ram-se as culturas de células infectadas gue se haviam armazenado a -30°C e libertaram-se as células resta ntes da superfície do balão por agitação ou raspagem. Centr i f u ga ra m-se as células e os vírus fo ra do meio ( centr if uga dora Sorvai, rotor GSA , durante 1 hora a 5 000 rpm, a 10°C). Efectuou-se a suspensão dos a grega dos de cé lulas e de partículas de vírus, em PBS (10-20 X o volume do agregado) e voltou a centr if uga r - s e - como antes. Depois, voltou

-103a efectuar-se uma suspensão deste agregado em dez vezes o vo lume de tampão RSB (Tris-HCl 10 mM, a pH 8,0, KC1 10 mM,

M gd 2 1 mM ) .

Para se efectuar a lise das restantes células intactas e para libertar os vírus das membranas celulares, submeteu ~se a suspensão anterior a tratamento por ultra-sons (duas vezes, durante 10 segundos a 60 Watts, à tempera tura ambiente,

Labsonic 1510 com uma sonda de 4 mm). Depois, centrifugou-se a mistura num rotor Sorvai GSA, durante 3 minutos a 3 000 rpm, a 10°C. Produz iu-se, a ssim , uma su spensão de vírus isenta de núcleos celulares e de grandes fragmentos celulares. Removeu-se cuida dosamente o sobrena da nte e efectuou-se nova suspensão do a grega do em tampão RSB, tratou-se novamente por ultra-sons e centrifugou-se como anteriormente.

Combinou-se o segundo sobrenadante com o primeiro, verteu-se sobre uma almofada de 10 ml de sacarose a 3 5% (Fluka, em TrisHCl 10 mM, a pH 8,0) e centrifugou-se, durante 90 minutos a

000 rpm, num rotor Kontron TST 28.38/1 7 (análogo ao Beckman SW 27), a 10° C. Decantou-se o sobrenadante e efectuou-se nova suspensão do agregado de partículas do vírus em 10 ml de TrisHCl 10 mM, a pH 8,0, tratou-se por ultra-sons para homogeneizar ^a mistura (2 vezes durante 10 segundos à temperatura ambiente, conforme anteriormente descrito) e carregou-se num gradiente des Contínuo (step) para subsequente purificação.

O gradiente descontínuo (step) era constituído por alíquotas de 5 ml de sacarose em Tris -HC1 10 mM, a pH 8,0, com as seguintes concentrações : 20%, 25%, 30%, 35%, e 40%. Centrifugou-se este gradiente num rotor Kontron TST 28.38/1 7 durante 35 minutos a 14 000 rpm, a 10°C. Ha região de sacarose a 30%-40%

-104 eram visíveis diversas bandas de partículas de vírus. Removeu-se esta região do gra diente (10 ml), diluiu-se a solução de sacarose com PBS (20 ml ) e sedimenta ra m-se as partículas de ví_ rus (rotor Kontron, durante 90 minutos a 14 000 rpm, a 1O°C).

O a grega do continha quase ex clusiva mente partículas de vírus (conforme se julgou por comparação da medição de D.O. e ensaio de placa, ver a seguir). Voltou a efectuar-se a suspensão deste agregado em PBS, pelo que a concentração dos vírus se encontra9 va em média compreendida entre 1 e 5 X 10 pfu/ml. Utilizou-se esta reserva de vírus directamente ou diluida com PBS.

Para se determinar a concentra ção de vírus e a pureza da reserva de vírus, utilizaram-se dois métodos. Obteve-se de modo conveniente a concentra ção absoluta das partículas de vírus, medindo a densidade óptica (D.O. ) da solução de reserva num espectro fotómetro (Uvikon 860) a 260 nm ( D . 0 . / 2 60 ) , em que 1 D.O./260 é igual a cerca de 1,2 XIO^^ partículas por ml £ Joklik,

V i rolo gy, 1 8 : 9 , 1 962 J. Obteve-se, também, a concentra ção dos ví_ rus por titulação dos vírus nas células (ensaio de placa) partin do do princípio que apenas uma entre 60 partículas de vírus pode infectar uma célula .

Para se efectuar a titula ção da concentra ção dos vírus nas células cultivadas, desenvoIveram-se células CEF em Meio I sobre placas plásticas de cultura de 8 cm (Falcon 3001 ). Quando as células atingiram uma confluência de 80-90%, removeu-se o meio, substituiu-se por 0,2 ml de uma solução de vírus diluída em PBS e de ix ou -s e perma necer â tempera tu ra ambiente durante 1 hora . Di luiu-se dez vezes a solução de reserva de vírus. Após incubação a tempera tura ambiente, a diciona ram-se a cada recipiente 2 ml de (Meio I semi-sólído (Meio I + agarose a 1%) e colocaram-se os re-105cipientes durante 16-24 horas num temente, verteram-se sobre eles 2 tendo vermelho neutro' a 0,2% para cubaram-se os recipientes por mais microscópio as placas incolores.

7.2.2. IMUNIZAÇÃO DE PINTOS incubador de CO Sub sequenml de Meio I semi-sóli do con corar as células vivas e in16-24 horas. Contaram-se num

Para se determinar se os vectores virais de vaccinia portadores dos genes que codificam as proteína s de E_. tenella que se ligam de um modo específico aos anticorpos monoclona i s

8A 2 e 6A 5 podiam proteger os pintos contra a infecção por oocis tos esporula do s de uma estirpe patogéníca de E_. tenella (estirpes T2-75O/7, T7- 776/1 ou T6-771)_t efectuaram-se os testes seguin tes .

Conduz iram-se todos os testes utilizando pintos de uma gama reprodutora (Warren) fornecidos pelo aviário E. Wuthrich,

Belp ,	Switzer la nd .	De ix aram-se	crescer	as avos	com	um	dia de	i da
de em	compartimentos aquecidos	por uma	bateria	até	à s	ida des	i n
d ica da	s a pós o que	se dividiram	em diversos grupos	de	ensaio	e

se mantiveram livres de coccidiose em gaiolas com pavimento de rede. Ao longo dos ensaios forneceu-se uma dieta comercial de crescimento fervida, à base de milho, trigo e farinha de soja (21,7% de proteína bruta ) .

No primeiro ensaio, no 4 2? dia, dividiram-se aleatória mente as aves de peso equivalente em três grupos de seis aves ca da um. Três dias mais tarde, imu n i za ra m - s e as aves com o vírus de vaccinia de tipo selvagem ou recombinante por meio de duas in jecções de 50 cada da suspensão do vírus respectivo (1O^° pfu/ml

-106 em PBS), ministra da por via subcutânea na asa esquerda . Utilizaram-se dois vírus de vaccinia recombinantes, os quais continham ambos ADN que codificava a proteína da E_. tenella que se ligava especif icamente ao anticorpo 8A 2. Um dos vírus (designa, do por 37K M3) continha a sequência pr inci pa 1 do antigénio da malária de 190 Kd; o outro vírus (designado por 37K K3) não pos. suía esta sequência . A estirpe WR de vaccinia de tipo selvagem serviu como um controlo negativo.

Uma semana após a primeira injecção efectuou-se uma injecção de reforço na asa esquerda das aves sob condições idên ticas, utilizando o mesmo tipo de vírus de vaccinia anteriormen. te utilizado. Uma semana após o reforço (5 9? dia), tiraram-se amostras de sangue de 2 ml cada de todas as aves e a na 1 isou-se o soro para verificar a presença de anticorpos ELISA específicos.

Em resumo, cobriram-se as cavidades de uma placa de microtitulação (Imunopla ca F96, NUNC) com uma suspensão de esporozóitos de E_. tenel la (10 000 células/ml) e incubaram-se com soro de galinha a proporções de diluição crescentes. Utilizaram-se como agen tes de detecção a nti-imunoglobulina s de galinha desenvolvidas na cabra e conjugadas com perox ida se de rábano (Kirkegaard and Perrg

Laboratory, Ga ither sburg, E.U.A.) conjunta mente com tetrametilbenzidina como substrato. Leu-se o desenvolvimento da côr azul num Titertek Multiskan MCC/340 Mkll, a um comprimento de onda de 450 nm. Definiu-se o título como o valor inverso da diluição do soro que proporciona uma densidade óptica de pelo menos o dobro do valor de fundo. (Quadro 7).

Quatro semanas após a cularam-se os pintos com 50 000 primeira injecção (7 3. dia), ino.

oocistos esporulados. Administrou-se oralmente, directamente no papo das aves, através de uma

-107!

I agulha romba numa seringa calibrada, o inoculo coccidiano de gue se havia efectuado uma suspensão em 1 ml de solução salina fisio. lógica. Ao 80? dia, sacrificaram-se todos os pintos, efectuou-se ^a sua necropsia e cia ssif ica ram-se as grandes lesões no cego (O-normal, l=leve infestação, 2 = inf esta ção média, 3=inf estação gra_ ^ve, 4=aves mortas por coccidiose). Juntaram-se quantitativamente as fezes dura nte os últimos dois dias e determinou-se o número de oocistos excretados numa amostra representa tiva de fezes. No

Quadro 7, indicam-se os resultados.

ί

-108

QUADRO 7

VACINAÇÃO DE PINTOS COM 45 DIAS DE IDADE COM VÍRUS VACCINIA QUE

EXPRESSAM A PROTEÍNA DE 28 KD

Vírus3	Número de Pintos	Titulação de anticorpos	Avaliação das lesões cecais	Ex ereção diária de oocistos/ave (xlO~6)
37 K3	6	430	1,33	149
37 M3	6*	1360	1,50	107
Wild-Type	6	200	2, 67	271

a- 0 vírus 37 M3 continha a sequência principal do antigénio da malária de

190 Kd; o vírus 37 K3 não continha. 0 vírus de tipo selvagem era a estirpe

WR de vaccinia .

b- Sacrificaram-se dois pintos antes da inocula ção da coccidiose.

-109-

O Quadro 7 indica que, por comparação com o vírus de con trolo de tipo selvagem, ambos os vírus contendo ADN que codifica para a proteína de 28 Kd induz iram a produ ção de anticorpos específicos para o parasita e conferiram a 1 guma protecção contra a ofensiva de oocistos, em termos de uma redução da avaliação de lesões cecais e redução da excreção de oocistos. No que respeita â protecção contra a coccidiose, os dois vírus foram igualmente eficazes, tendo, no entanto, a construçã o com a sequ ência pr incipa 1 do vírus da malária (37 M3), origina do uma titulação de anticorpos mais ele vada contra o antigénio dos esporozóitos do que a construção virai normalizada (37 K3) nos pintos, indicando uma vantagem para a fusão da construção.

No segundo ensaio deixa ram-se crescer os pintos e imunizaram- se conforme anteriormente descrito, mas começa ndo no 2 2? dia .

Q

Nessa altura, a dm i n i s tr ou - s e uma dose virai de 2X10 pfu em 100 ml de PBS. Os vírus que se utilizaram eram de preparações diferentes do vírus de va ccinia contendo ADN que codificava para a proteína de 28 Kd sem (designada por 37 K5 ) ou com (designada por 37 M19) a sequência principal da malária. Utilizou-se a mesma estirpe WR de vírus de tipo selvagem como um controlo.

No 57? dia (5 semanas após a primeira injecção), inocularam-se todas as aves com 50 000 oocistos esporulados. Uma sema.

na mais tarde, sa cr if ica ram-se todas as aves, efectuou-se a sua necropsia e cla s s i ca ra m - s e conforme anteriormente descrito. Deter, minou-se, também, o aumento diário de peso a seguir à infecção e à excreção de oocistos durante os últimos dois dias. No Quadro 8, ¹ndicam-se os resultados.

-110-

QUADRO 8

VACINAÇÃO DE PINTOS COM 22 DIAS DE IDADE COM VÍRUS VACCINIA QUE

EXPRESSAM A PROTEÍNA DE 28 KD

Avaliação das Excreção

Tem po pa ra	Número de	Aumento diário	lesões	diária de
	Reforço				oocistos/pintos
Vírus	( semanas )	Pintos	de peso (g)	cecais	(xlO-6)

37 K5	1	8	11,45	2,38	21,0
37 M19	1	8	15, 61	2,13	24,0
Tipo selvagem	1	8	8, 77	2, 50	33,1
37 K5	2	8	5,14	2, 25	22,3
3 7 Ml 9	2	8	11,79	2,13	32, 7
Tipo selvagem	2	8	8, 34	2, 63	37,0
a- o vírus 37 Ml 9	continha a	sequ ência	principa 1	do antigénio da malária de
190 Kd. 0 vírus	37 K5 não	continha .	0 vírus de	tipo selvagem foi a	estirpe

WR de vaccinia .

-111L,

Quadro 8 indica que, quando se faz a comparação com os vírus de controlo de tipo selvagem, ambos os vírus que continham ADN coccidiano conferiram alguma protecção contra o desafio patogénico por oocisticos, em termos de peso adquirido, grau de lesões cecais e de excreção de oocistos. Ambos os vírus se revelaram de uma eficácia aproximadamente igual. A administra, ção do reforço, uma semana após a primeira injecção, produziu uma aquisição de peso algo melhor e uma excreção mais baixa de oocis tos, mas o grau de lesões cecais foi aproximadamente o mesmo para ambos os reforços.

No terceiro ensaio, examinou-se o efeito das três vacina ções . 'In jecta ram-se as aves (na asa direita) com duas alíg quota s de 50 F¹ (3X10 pfu/ml) de suspensões de vírus de vac cima de tipo selva gem ou de vírus contendo o ADN que codifica para a proteína de 20 Kd que se liga especif icamente ao anticor. po monoclona 1 6A5, aos 21 dias de idade. Todas as aves receberam a mesma dose de injecções de reforço no 28? dia na asa esquerda . Algumas aves receberam injecções de reforço a di ciona i s com a mesma dose nas asas de ambos os lados ao 3 5? dia . Mantivera m-se outras aves sem vacinação, como controlos adicionais.

No 42? dia, recolheram-se amostras de sangue de todas as aves e ensa ia ram-se pelo ELISA quanto à presença de anticorpos específicos contra o estádio de esporozóito do parasita, con. forme se descreveu anteriormente. Ao 49? dia (4 semanas após a primeira injecção), inocula ram-se todas as aves com 50 000 oocis.

tos esporulados. Uma semana mais tarde, sa cr if ica ram-se as aves, efectuou-se a sua necrópsia e cia ssif ica ram-se as lesões cecais graves , conforme anteriormente descrito. Controlou-se o peso corporal sema na Imente para o calculo da aquisição diária de peso

-11 21 _____ e reuniram-se as fezes nos dois últimos dias do ciclo inf eccio_ so para se determinar a excreção de oocistos. No Quadro 9, indicam-se os resultados.

-113-

QUADRO 9

VACINAÇÃO DE PINTOS COM 21 DIAS DE IDADE COM O VÍRUS DE VACCINIA

QUE EXPRESSA A PROTElNA DE 20 KD

VV	Número de Injecções	Número de Pintos	Título de Anticorpos	Aumento dia'rio	Avaliação de lesões cecais	Ex ereção de oocistos/g de fezes (xlO )
de peso	(9)
rVV	2	6	210	2,9		2,33	1,69
rVV	3	6	7200	/2		1,67	1,32
WT	3	6	560	-4,1		2,67	2,09
N	—	6	0	-3,8		2,83	1,75

rVV com ADN coccidiano

WT de tipo selvagem nenhuma

-114-

Os dados do Quadro 9 indicam que quando se injectam três vezes os vírus produtores do antigénio coccidiano se origina um título elevado de anticorpos específicos contra as pro teínas dos esporozóitos. Para além disso, ambos os tratamentos com este tipo de vírus recombinante proporcionam alguma protec ção contra a infecção por oocistos, em termos de acréscimo do peso a dquir ido, de redução do grau de lesões cecais e da diminuição da excreção de oocistos. A comparação dos resultados °btidos com os controlos não vacinados indica que a vacinação com o vírus de vaccinia de tipo selvagem não confere protecção . Do entanto, a protecção conferida pelo vírus por ta dor do ADN coccidiano foi específica e não se deveu a uma estimulação imu nológica generalizada provocada por exposição ao próprio vírus de va ccinia . Três vacinações foram mais eficazes do gue duas.

Como o especialista verificará, podem efectuar-se di versas modificações e variações da presente invenção sem fugir ao âmbito e espírito da mesma. Proporcionam-se os aspectos espe cíficos aqui descritos apenas a título de exemplo, sendo a presente invenção apenas 1 imita da pelas reivindicações em anexo.

f /

-115

Claims (7)

1. REIVINDICAÇÕES

   1.- Processo para a preparação de uma proteína possuindo um ou mais determinantes imuno-reactivos e/ou antigénicos de um antigénio de superfície Eimeria, caracterizado pelo facto:

   a) de se cultivar um organismo hospedeiro transformado contendo um vector recombinante que inclui uma sequência de DNA que codifi ca uma proteína possuindo um ou mais determinantes imuno-reactivos e/ou antigénicos de um antigénio de superfície Eimeria, tendo este último um peso molecular aparente de cerca de 28, 37, 120 ou maior do que 200 Kilodaltons e ligando-se especificamente a um ou mais anticorpos monoclonais depositados na American Type Culture Collection com os n?s de depósito HB97O7 a HB9712, nas condições em que se expressa a sequência de DNA ou o fragmento; e

   b) de se isolar a proteína da cultura.
2. 2 .-

   2.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar um organismo hospedeiro transformado contendo um vector recombinante que inclui na sequência de DNA que codifica uma proteína possuindo sequência de aminoácidos seguintes:

   -116

   10 Met Ala Asp Leu Phe Ser Gly Leu Vai Gly Gly Vai Vai Gly Ala Vai Ala Ala Ala •W .. v Asp 30 40 Leu Pro Ala Glu Gly Glu Arg Ala Pro Arg Pro Ala Pro Gly Thr Ala Trp Thr Cys Cys 50 60 Cys Ser Lys Leu Gin Glu Gly Ala Arg Glu Leu Glu Gly Phe Vai Gin Gin Leu Ser Phe 70 80 Vai Ala Gly Lys Leu Ala CyB Cys Leu Arg Vai Gly Ala Glu Gin Leu Ala Arg Cys Ala 90 100 Ala Glu Gly Arg Leu Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Cye Cys Ala Leu Leu Gin Leu 110 120 Glu Lys Gin Asp Leu Glu Gin Ser Leu Glu Ala Gly LyB Gin Gly Ala Glu Cys Leu Leu 130 140 Arg Ser Ser Lys Leu Ala Leu Glu Ala Leu Leu Glu Gly Ala Arg Vai Ala Ala Thr Arg 150 160 Gly Leu Leu Leu Vai Glu Ser Ser Lys Asp Thr Vai Leu Arg Ser Ile Pro His Thr Gin 170 180 Glu Lys Leu Ala Gin Ala Tyr Ser Ser Phe Leu Arg Gly Tyr Gin Gly Ala Ala Ala Gly 190 200 Arg Ser Leu Gly Tyr Gly Ala Pro Ala Ala Ala Tyr Gly Gin Gin Gin Gin Pro Ser Ser 210 216 Tyr Gly Ala Pro Pro Ala Ser Ser Gin Gin Pro Ser Gly Phe Phe Trp

   ou um seu equivalente funcional.

   -117í ·1
3. 3,- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar um organismo hospedeiro transformado contendo um vector recombinante que inclui uma sequência de DNA que codifica uma proteína possuindo a sequência de aminoácidos seguintes:

   10 20 30 40 50 60 70 (6) SCI.GGFCSMQ E5PPPAAGGL YCGQTLEQQG IAVRETASCS ENPCPIDATC GEXTEYSACS RTCGGGTQER

   MNKNS?LGGF7?MQ (4) ETAS7S ENP7PIDA7? G

   80 90 100 110 120 130 140 (3) KREPWLDNAQ 1IGGRTCMEQY PDGPISVREC NTQPCPVDEV VCDWEDWCQC SEQCGGGKRT RNRGPSKQEA (7)

   KREPWLDNAQ NRCPSKQEA

   150 160 170 180 190 200 210 (l) MFGGKTVAQQ NAELPEG£K I EWQEEGCNE VPCGPCTLPF SEWTECESCS GHRTRESAVA FDYTDRMCSG

   MFGGKTVAQQ NAELP (?) @ ESAVA EDYTDR

   220 230 240 250 260 270 280

   DTHEVQSCEE YCSQNAGGGA GGDGGAGGGT GGSGEEEGKE ESSGFPTAAV AGGVAGGVLA lAAGAGAFVG

   290 300 310 320

   LSGGSAAAAT EAGAEVWTEA GTSNAAEVEK ESLISAGEQS EMWAS ou um seu equivalente funcional.
4. 4.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar um organismo hospedeiro transformado contendo um vector recombinante que inclui uma sequência de DNA que codifica uma proteína possuindo a sequência de aminoácidos seguinte:

   -118-

   10 20

   Glu Phe 'Pro Thr Ser Arg Glu Ala Pro Gly Ala Ser Pro Pro Ala Lys Arg Arg Arg Thr

   30 40

   Ser Leu Gly Ala Pro Ala Ala Gly Glu Gly Pro Leu Arg Arg Trp Glu Gin Pro Ala Ala

   50 60

   Gly Thr Ala Ala Ala Ile Arg Gin Gin Ala Gly Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Arg 70 60 Ala Ala Ala Ala Ala Arg Ala Arg Thr Pro Gly Arg Ala Ala Ala Vai Gin Ala Arg Leu Asn Ala Trp Vai Ala 90 Glu Gly Asn Lys Leu Pro Glu Ser Glu 100 Arg Arg Arg Arg Met Leu Glu Glr. Tyr Met Asn 110 Leu Glu Lys Vai Lys Lys Leu Arg Lys 120 Lys Leu Asp Glu Glu Ala Glu Ala Arg Ala Lys 130 Tyr Ile Glu Gly Gly Vai Gin Lys Glu 140 Pro Pro Leu Gly Ala Pro Gin Gly Arg Lys Pro 150 Phe Ala Ala Phe Cys Pro Glu Arg Gly 160 Arg Arg Gly Leu Gin Ala Vai Arg Gin Gly Arg 170 Ser Leu Cys Gly Ala Pro Gin Gly Glu 180 Asp Ala Ala Gly Pro Gin Glu Vai Lys Gin Gin 190 Gin Gin Gin Gin Gin Gin Arg Gin Arg 200 Gin Arg Gin Gly Arg Arg Arg Arg Gin Gly Gly 210 Phe Cys Phe Glu Leu Phe Arg Glu Arg 220 Ala Glu Gly Ser Arg Gly Vai Cys Thr Ala Arg 230 Glu Arg Gly Gly Ser Cys Leu Gly Vai 240 Gly Phe Arg Leu Gin Lys Thr Arg Ser Lys Leu 250 Asn Trp Gin Lys Phe His Phe Ser Thr 260 Leu Lys Cys His Phe Cys Ser Leu Tyr ou um seu equivalente funcional. 5.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza-

   do pelo facto de se utilizar um organismo hospedeiro transformado contendo um vector recombinante que inclui uma sequência de DNA gue ccdifica uma proteína possuindo a sequência de aminoácidos

   -119seguintes:

   Pro ' Gin ¹ Thr Ala Lys Arg Gly Asn Ile 10 Leu Gly Leu Vai Gly Met Vai Ala Ala Vai 20 Vai Vai Thr Phe Thr Glu Ala Gly Phe Gly 30 Gin His Tyr Leu Leu Phe Phe Ala Thr Ala 40 Ala Pro Ala Leu Gly Leu Gly Leu Tyr Ile 50 Ala Gin Ser Vai Asn Met Thr Glu Met Pro 60 Gin Leu Vai Ala Leu Phe His Ser Phe Vai 70 Gly Leu Ala Ala Vai Met Vai Gly Phe Ala 80 Asn Phe His Ser Pro Ala Gly Vai Glu Arg 90 Ala Ser Ser Leu Leu Arg Leu Leu Glu Vai 100 Tyr Ala Gly Vai Phe Vai Ala Gly Ile Thr 110 Phe Thr Gly Ser Vai Vai Ala Ala Ala Lys 120 Leu His Gly Ser Met Glu Ser Arg Ser Leu 130 Arg Vai Gly Arg His Ala Leu Asn Thr 140 Ala Thr Ile Ala Ala Ile Gly Vai Leu Gly 150 Ala Leu Phe Cys Vai Ser Ser Gly His Phe 160 Thr Arg Met Leu Cys Leu Tyr Vai Asn Ala 170 Gly Leu Ser Met Trp Leu Gly Phe His Leu 180 Vai Ala Ala Ile Gly Gly Ala Asp Met Pro 190 Vai Vai Ile Ser Leu Leu Asn Ser Tyr Ser 200 Gly Vai Ala Leu Ala Ala Ser Gly Phe Met 210 Leu Asp Asn Asn Leu Leu Ile Ile Ala Gly 220 Ala Leu Ile Ala Ser Ser Gly Ala Ile Leu 230 Ser Tyr Ile Met Cys Lys Gly Met Asn Arg 240 Ser Leu Trp Asn Vai Vai Leu Gly Gly Phe 250 Glu Glu Ala Glu Asp Vai Gly Ala Ala Ser 260 Pro Gin Gly Ala Vai Gin Gin Ala Thr Ala 270 Asp Gin Vai Ala Asp Glu Leu Leu Ala Ala 280 Arg Lys Vai Leu Ile Vai Pro Gly Tyr Gly 290 Met Ala Vai Ala Arg Cys Gin Ser Glu Leu 300 Ala Asp > Ile Ala Lys Asn Leu Met Asn Cys 310 Gly Ile Vai Asp Phe Gly Ile His Pro 320 Vai

   330 340

   Ala Gly Arg Met Pro Gly His Met Asn Vai Leu Leu Ala Glu Ala Asp Vai Pro Tyr Lys

   -120-

   Ile Val Lys ι Glu htet Ser Glu Val Asn 350 Pro Glu Met Ser Ser Tyr Asp Val Val Leu 360 Val Val Gly Ala Asn Asp Thr Val Asn Pro 370 Ala Ala Leu Glu Pro Gly Ser Lys Ile Ser 380 Gly Met Pro Val Ile Glu Ala Trp Lys Ala 390 Arg Arg Val Phe Val Leu Lys Arg Ser Met 400 Ala Ala Gly Tyr Ala Ser Ile Glu Asn Pro 410 Leu Phe His Leu Glu Asn Thr Arg Met Leu 420 Phe Gly Asn Ala Lys Asn Thr Thr Ser Ala 430 Val Phe Ala Arg Val Asn Ala Arg Ala Glu 440 Gin Met Pro Pro Ser Ala Ala Arg Asp Asp 450 Leu Glu Ala Gly Leu Leu Glu Phe Asp Arg 460 Glu Glu Arg Val Asp Pro Ser Ser Trp Pro 470 Tyr Pro Arg Met Ala Val Gly Val Leu Arg 480 Asp Ser Asn Gly Ser Val Met Val Pro Val 490 Ala Pro Lys Phe Vai Pro Lys Leu Arg Lys 500 Leu Ala Phe Arg Val Asn Val Glu Ser Gly 510 Ala Gly Ala Asp Ala Gly Phe Thr Asp Glu 520 Glu Tyr Arg Arg Ala Gly Ala Glu Val Leu 530 Ser Gly Pro Asp Ala Vai Ile Asn Gin Ser 540 Gin Val Leu Leu Arg Val Ser Ala Pro Ser 550 Pro Asp Leu Val Ser Arg Ile Pro Arg Asp 560 Lys Val Leu Ile Ser Tyr Leu Phe Pro Ser 570 Ile Asn Gin Gin Ala Leu Asp Met Leu Ala 580 Arg Gin Gly Val Thr Ala Leu Ala Val Asp 590 Glu Val Pro Arg Vai Thr Arg Ala Gin Lys 600 Leu Asp Val Lys Ser Ala Met Gin Gly Leu 610 Gin Gly Tyr Arg Ala Val Ile Glu Ala Phe 620 Asn Ala Leu Pro Lys Leu Ser Lys Ala Ser 630 Ile Ser Ala Ala Gly Arg Val Glu Ala Ala 640 Lys Val Phe Val Ile Gly Ala Gly Val Ala 650 Gly Leu Gin Ala Ile Ser Thr Ala His Gly 660 Leu Gly Ala Gin , Val ??? Gly His Asp Val 670 Arg Ser Ala Thr Arg Glu Glu Val Glu Ser 680 Cys

   690 700

   Gly Gly Lys Phe Ile Gly Leu Arg Met Gly Glu Glu Gly Glu Val Leu Gly Gly Tyr ria

   -121-

   Arg Glu Met Gly Asp Ala Tyr Gin Arg 710 Ala Gin Arg Glu Met Ile Ala Asn Thr Ile 720 Lys His Cys Asp Vai Vai Ile Cys Thr Ala 730 Ala Ile His Gly Arg Pro Ser Pro Lys Leu 740 Ile Ser Arg Asp Met Leu Arg Ser Met Lys 750 Pro Gly Ser Vai Vai Val Asp Leu Ala Thr 760 Glu Phe Gly Asp Vai Arg Ser Gly Trp Gly 770 Gly Asn Vai Glu Vai Ser Pro Lys Asp Asp 780 Gin Ile Vai Vai Asp Gly Vai Thr Vai Ile 790 Gly Arg Arg Arg Ile Glu Thr Arg Met Pro 800 Ile Gin Ala Ser Glu Leu Phe Ser Met Asn 810 Ile Cys Asn Leu Leu Glu Asp Leu Gly Gly 820 Gly Ser Asn Phe Arg Ile Asn Met Asp Asp 830 Glu Vai Ile Arg Gly Leu Val Ala Val Tyr 840 Gin Gly Arg Asn Vai Trp Gin Pro Ser Gin 850 Pro Thr Pro Vai Ser Arg Pro Pro Arg 860 Gly Gin Met Pro Pro Pro Ser Ala Pro Gly 870 Ala Pro Ala Pro Glu Lys Pro Gly Ala Phe 880 Ala Gin Ala Leu Ala Ser Asp Ala Phe Phe 890 Ala Met Cys Leu Vai Val Ala Ala Ala Val 900 Val Gly Leu Leu Gly Ile Vai Leu Asp Pro 910 Vai Glu Leu Lys His Leu «TV,— Leu Leu Gly 920 Leu Ser Leu Ile Vai Gly Tyr Tyr Cys Vai 930 Trp Ala Vai Thr Pro Ser Leu His Thr Pro 940 Leu Met Ser Vai Thr Asn Ala Leu Ser Gly 950 Vai lie Vai Ile Gly Cys Met Leu Glu Tyr 960 Gly Thr Ala Met Ile Ser Gly Phe Thr Leu 970 Leu Ala Leu Ile Gly Thr Phe Leu Ala Ser 980 Val Asn Vai Ala Gly Gly Phe Phe Vai Thr 990 His Arg Met Leu Lys Met Phe Gin 998 Ile

   ou um seu equivalente funcional.
5. 6.- Processo para a preparaçao de um organismo hospedeiro transformado susceptível de expressar uma sequência de DNA que codifica uma proteína tal como definida em uma qualquer das reivin-122 dicações 1 a 5, caracterizado pelo facto de se transformar um orga nismo hospedeiro com um vector recombinante que inclui o referido

   DNA.
6. 7.- Processo para a preparaçao de anticorpos dirigidos contra uma proteína tal como definida em uma qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo facto de se injectar a referida proteína num animal que é susceptível de fazer surgir uma resposta imune contra a referida proteína e de se isolar os anticorpos produzidos .
7. 8.- Processo para a preparação de uma vacina para a imunização de aves domésticas contra a coccidiose, caracterizado pelo facto de se misturar uma proteína, quando preparada pelo processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 5 com um veículo farmaceuticamente aceitável,

   Lisboa, 02 de Junho de 1989

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   RESUMO

   Processo para a preparação de uma proteína possuindo um ou mais determinantes imuno-reactivos e/ou antigénicos de um antigénio de superfície Eimeria e de vacinas contra a coccidiose que a contêm

   A presente invenção refere-se a sequências de DNA que codificam antigénios de superfície Eimeria, vectores recombinantes contendo tais sequências de DNA, organismos hospedeiros transformados contendo tais vectores, e processos para a prepara ção de antigénios que utilizam os microrganismos transformados. Também se proporcionam processos para a protecção de aves domésticas contra a coccidiose utilizando antigénios de superfície Eimeria. Os antigénios de superfície podem ser administrados para conferir uma tal protecção ou como proteínas purificadas ou sob a forma de DNA que codifica as proteínas num vector virai adequado tal como vírus vaccinia.

   Lisboa

   Lisboa, 02 de Junho de 1989 O Agsiíe Oficial da Prcpr'*dade Industrial