JP3051130B2 - 組換えコクシジウム症ワクチン類 - Google Patents

組換えコクシジウム症ワクチン類

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Description

【発明の詳細な説明】 コクシジウム症（coccidiosis）は、アイメリア（Eim
eria）属の細胞内の原虫類の寄生生物類（protozoan pa
rasaite）による家禽の疾患である。この疾患は、大規
模な風土病であり、集約的な家禽の育種の確立および化
学療法による該疾患の管理の見積もり費用は、米国だけ
でも毎年100億ドルを越える。抗コクシジア薬に対する
耐性の発現は、新規薬剤の継続的な開発を必要とし、同
時に薬剤の開発にますます費用が掛かりつつあり、かつ
消費者の食用動物類虫の薬剤残留に対しての容認がます
ます小さくなる。
自然のコクシジウム症の感染に対する保護的免疫は、
よく典拠されている。管理された数週間にわたる、小数
の成育可能な接合子嚢（oocyt）の毎日の投与は、通常
には有毒な投与量の誘発的な感染（challenge infectio
n）に対して完全な免疫をもたらすことが示されている
〔RoseらのParasitology 73:25（1976）;RoseらのParas
itology 88:199（1984）〕。感染に対して獲得された抵
抗力の証明は、化学的なコクシジウム症薬に対する要求
を迂回して、若いニワトリに免疫を誘発するワクチンの
構築ができることを示唆している。事実、その様な考え
は、米国、アラバマ州、オペリカ、Sterwin Laboratori
es、Coccivac（商標）薬剤について試験されている。
コクシジウム症ワクチンの製造の目的で、Murrayら
（モーロッパ特許出願、発行番号167,443）は、それら
の多くが胞子小体（スポロゾイト:sporozoite）の表面
に会合していた少なくとも15種のポリペプチドを含有す
るEimeria tenellaの胞子小体類または胞子化接合子嚢
（オーシスト:oocyst）類からの抽出物類を調製した。
これらの抽出物類のニワトリへの注射は、E.tenellaの
毒性量の胞子化接合子嚢の経口接種の結果である。盲腸
障害（cecal lesions）を減少させた。更に最近、Schen
kelら〔米国特許第4,650,676〕は、E.tenellaの分裂小
体（モロゾイト:morozoite）類に対するモノクローナル
抗体類の製造を開示した。これらの抗体類を使用して、
Schenkelらは、該抗体が支配される多数の抗原を同定し
た。E.tenellaの胞子小体類とそれらの抗体類の前培
養、続いての処理された該胞子小体類のニワトリの盲端
（ceca）への挿入によって、Schenkelらは、胞子小体で
処理されなかった対照に比べて盲腸障害の評価値がやや
低下することを示すことができた。
組換えDNA技術に於ける進展は、他の取り掛かり、す
なわち、サブユニットワクチン（subunit vaccine）類
の入手を可能にしている。現在の組換えDNA法の応用に
於いて、特定のDNA配列が、適当なDNAベヒクルまたはベ
クターに挿入され、宿主細胞中で複製できる組換えDNA
分子類を形成する。プラスミドと称される環状二重鎖DN
A分子類は、ベクター類として頻繁に使用されており、
また該組換えDNA形態類の調製は、特定の塩基配列部位
に於て開裂できる制限エンドヌクレアーゼ酵素類の使用
を伴なう。一旦、プラスミド中および挿入されるべき外
来DNAの分節中に、制限酵素によって切断がなされた後
には、２種のDNA分子を、リガーゼとして知られている
酵素によって共有的に結合し得る。この様な組換えDNA
分子類の一般的な調製方法は、Cohenら〔米国特許第4,2
37,224号〕、Collinsら〔米国特許第4,304,863号〕およ
びManiatisら〔Molecular Cloning:A Laboratory Manua
l,1982,Cold Spring Harbor Laboratory〕によって記述
されている。これらは多くの技術の情況を説明している
ので、これらの参考文献を参照して以下に示す。
多くの条件が適合する場合に限り、一度調製された組
換えDNA分子類は、挿入された遺伝子配列によって特定
された生成物を調製するのに使用されることができる。
組換え分子が適合しえ、従って、宿主細胞中で自律的に
複製しうるということが第１位の必要条件である。ごく
最近の研究には、広範囲の組換えプラスミド類に適合す
るため、宿主微生物としてEscherichia coliが使用され
ている。使用されるベクター／宿主細胞系に応じて、組
換えDNA分子は、形質転換、トランスダクションまたは
トランスフェクションによって宿主中に導入される。
宿主細胞中の組換えプラスミド類の存在の検出は、フ
ラスミドマーカー活性、例えば抗生物質耐性を使用する
ことによって都合よく達成される。従って、アンピシリ
ン分解酵素の産生をコードするプラスミドを有する宿主
は、アンピシリンを含有する培地中で、宿主を成育させ
ることにより非改造細胞（unaltered cell）から選択す
ることができる。更に別の利点は、選択された制限ヌク
レアーゼが切断し、更に外来遺伝子が挿入される部位に
於いて、第２番目の抗生物質分解活性をコードするプラ
スミドである抗生物質耐性マーカーを取っても良いこと
である。次に組換えプラスミドを正しく含有している宿
主細胞は、第１番目の抗生物質に耐性であるが第２番目
のものには感受性であることによって特徴付けられる。
宿主細胞中への組換えプラスミドの単なる挿入および
変更された宿主の単離は、著量の所望の遺伝子産物が産
生されるということをそれ自体で保証するものではな
い。これが生ずるため、外来遺伝子配列は、プロモータ
ーと称されるDNA転写のためのシグナル領域と正しい関
係でプラスミド中に融合されなければならない。別法と
して、外来遺伝子は、これが宿主によって認識される限
り、それ自体のプロモーターを有していても良い。その
由来を問わず、プロモーターは、RNAポリメラーゼの結
合を支配し、従って、メッセンジャーRNA（mRNA）に対
するDNAの転写を“促進する"DNA配列である。
多量のmRNAを与えることができる強い促進が与えられ
た場合に、所望の遺伝子産物の最終的な産生は、mRNAか
ら蛋白質への変換の有効性に依存するであろう。また逆
にこれは、mRNAに対するリボゾーム結合の効率に依存す
る。E.coli中、mRNA上のリボゾーム結合部位は、開始コ
ドン（AUG）および上流のシャイン・ダルガーノ（SD）
配列を包含する。３−９個のヌクレオチドを包含し、そ
してAUGコドンから３−11個のヌクレオチドに位置する
この配列は、E.coli 16SリボゾームRNA（rRNA）の３′
末端に相補的である〔ShinおよびDalgarno,Nature254:3
4（1975）〕。明らかに、mRNAに対するリボゾーム結合
は、mRNA中のSD配列と16S rRNA 3′末端に於ける配列と
の間の塩基対によって促進される。遺伝子発現の最大化
に対しての再吟味のためには、RobertsおよびLauerのMe
thods in Enzymology68:473（1979）を参照。
別の発現系が、ラムダファージベクターとの組合せに
於いてlacZオペロンに基づいての開発がなされている
（HuynhらのIn DNA Cloning:I巻、D.M.Glover,Ed.）。
この系に於いて、その発現を制限する誘発可能なプロモ
ーターを伴ったβ−ガラクトシダーゼの構造遺伝子が、
ファージベクター中に巧みに処理されている。β−ガラ
クトシダーゼに対する遺伝子の３′末端における特異的
なクローニング部位は、mRNAのcDNAの複製または蛋白質
コード領域を包含するゲノムDNA断片の挿入によって遺
伝子の融合をもたらす。
挿入物がβ−ガラクトシダーゼのための読み出しわく
として同一のレジスター中に開始読み出しわくを包含す
る場合に於いて、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現
は、114kdのβ−ガラクトシダーゼおよびcDNA挿入物に
よってコードされたカルボキシ末端ポリペプチドを含む
融合蛋白質の産生をもたらす。生成物がモノクローナル
またはポリクローナル抗血清によって認識される様な遺
伝子を包含するファージは、従って、lacZレプレッサー
を不活性化させるためにβ−Ｄ−チオガラクトシピラノ
シド（IPTG）を用いて該融合蛋白質の発現の誘発に続い
て該ライブラリーの免疫スクリーニングにより同定され
うる。この発現ベクター系は、DNAの充填およびそのE.c
oli細胞中への導入におけるファージ系の効率とβ−ガ
ラクトシダーゼとのポリペプチドの融合の安定性の増加
とを兼ね備える。
ワクチンサブユニットの研究による方法では、完全な
伝染性の生物のサブユニットは、免疫学的に適切な情況
下、宿主動物に搬入される。該サブユニットは、寄生生
物からの精製された蛋白質、組換え蛋白質または異種の
系に於いて発現された蛋白質の断片、単一の中和決定因
子から成る合成ペプチドまたはウイルス性のベクター、
例えばワクチンによって導入された蛋白質であっても良
い。該宿主免疫系は、寄生生物全体にさらされることな
しに、サブユニットに対する特異的応答を果す。それま
でにさらされたことのあるワクチンサブユニットによっ
てのみ指示されると、染色性の生物の有毒な投与量に対
する誘発によって、該宿主免疫系は、好結果の防御を果
す。
証拠は、コクシジウム症に対する獲得耐性に於いては
循環している抗体類、腸管上皮中の分泌IgA〔Davisらの
Immunology 34:879（1978）〕、および細胞伝達免疫系
〔GiambroniらのPoultry Sience 59:38（1980）〕が関
与している文献中に見出される。再吟味のためにP.S.Da
vis in Avian Immunology,M.E.Rose著、British Poultr
y Scince,Ltd.エデンバーグpp.361−385（1981）参照。
免疫系の各種の支流のありうるかかわりは、完全でまた
永続する保護が、自然な感染の過程の特異的な面をまね
る能力を必要とするであろうことを意味する。これらの
面は、保護が望まれる部位に於ける局所的な露呈、配列
抗原加工細胞に対しての炎症性の応答の喚起、適切な寄
生生物の抗原の提示およびおそらく特別な膜配列に於け
るMHC決定因子との会合を含む。
本発明は、アイメリア表面抗原の免疫反応性および／
または抗原性の１種もしくはそれ以上の決定因子を有す
る精製された蛋白質またはその断片を提供する。
更に詳しくは、本発明は、表面抗原が約28、37、120
または200kd（Kilodalton）よりも大きい見かけの分子
量を有し、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン（American Type Culture Collection:ATCC）に寄
託されており、かつ寄託番号HB 9707からHB 9712が割り
当てられた１種もしくはそれ以上のモノクローナル抗体
類に特異的に結合するアイメリア表面抗原の免疫反応性
および／または抗原性の１種もしくはそれ以上の決定因
子を有する蛋白質を提供するものである。該蛋白質の例
は、第15図、第17図、第19図および第21図に示されたア
ミノ酸配列を有する蛋白質およびこれと機能的に同等な
蛋白質である。該機能的に同等な蛋白質は、付加、削
除、挿入およびアミノ酸置換による前記したアミノ酸配
列から誘導されたアミノ酸配列を有する蛋白質類であ
り、これらの蛋白質は、アイメリア表面抗原の免疫反応
性および／または抗原性の１種もしくはそれ以上の決定
因子を有する蛋白質類である。該蛋白質類を、コクシジ
ウム症に対する家禽の免疫化に使用してもよい。
更に本発明は、前記蛋白質類に対して支配される抗体
類、特に例えば寄託番号HB 9707、HB 9708、HB 9709、H
B 9710、HB 9711およびHB 9712を伴うモノクローナル抗
体を提供する。
更にまた本発明は、前記蛋白質類をコードするDNA配
列類、該DNA配列類を包含する組換えベクター類、特に
適合しうる宿主微生物類中で該DNA配列類の発現を支配
しうる組換えベクターおよび該組換えベクターで形質転
換された宿主微生物類、特に前記蛋白質をコードする該
組換えベクター中に包含されたDNA配列類を発現しうる
形質転換宿主微生物類を提供するものである。
更にまた本発明は、アイメリア表面抗原の免疫反応性
および／または抗原性の１種もしくはそれ以上の決定因
子類を有する蛋白質の製造方法に於いて、 （ａ） 該蛋白質をコードするDNA配列を包含する組換
えベクターで形質転換させた宿主微生物を、DNA配列が
発現する条件下に培養し；更に （ｂ） 培養物から蛋白質を単離する することを特徴とする蛋白質の製造方法を提供するもの
である。
更にまた本発明は、それ自体公知の方法を使用し、本
発明の蛋白質をコードするDNA配列を包含する組換えベ
クターで宿主微生物を形質転換させることを特徴とする
前記形質転換宿主微生物の製造方法を提供するものであ
る。
更にまた本発明は、１種もしくはそれ以上の本発明の
蛋白質類および生理学的に許容しうる担体を包含するコ
クシジウム症に対して家禽を保護するためのワクチン類
を提供するものである。
更にまた本発明は、本発明の蛋白質をコードするDNA
配列またはその断片を包含し、該DNA配列または断片を
発現しうるウイルス性のベクターおよび生理学的に許容
しうる担体を包含するコクシジウム症に対して家禽を保
護するためのワクチン類を提供するものである。
更にまた本発明は、コクシジウム症を受けやすい若い
鳥に有効量の本発明のワクチンを投与することを特徴と
するコクシジウム症に対して家禽を保護するための方法
を提供するものである。
本発明は、本発明の以下の記載および以下の図面と関
連する実施例によってより容易に理解されるであろう。
第１図は、E.tenellaのスポロゾイト類のELISAの結果
を示す。免疫マウス血清（MS 107−2;Δ）および対照マ
ウス血清（Ｘ）の希釈物を、４×104の生精製スポロゾ
イト類と共に培養させた。スポロゾイト類に結合した特
異的抗体を、ペルオキシダーゼ接合抗マウスIgG抗体お
よびペルオキシダーゼ基質のｏ−フェニレンジアミンで
測定した。OD492がTitertek Multiscan（商標）プレー
ト読み取り機によって読まれた。
第２図は、E.tenellaのスポロゾイトから可溶化させ
た蛋白質類を用いて行なったウエスタン・ブロット検査
の結果を示す。可溶化させたスポロゾイト蛋白質類を、
12.5％のゲル中、還元性SDS−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動によって分離させ、ニトロセルロース膜に移
し、更に各抗体と反応させた。各抗体によって認識され
た特異的蛋白質類を、ペルオキシダーゼ接合抗マウスIg
G抗体およびペルオキシダーゼ基質の４−クロロ−１−
ナフトールで可視化させた。各帯と反応させた抗体は、
該帯の上部に示されている。
第３図は、E.tenellaのスポロゾイトおよびモロザイ
トおよびE.acervulinaのスポロゾイトから可溶化させた
蛋白質類を用いて行なったウエスタン・ブロット検査の
結果を示す。各種のモノクローナル抗体類および血清類
を、ニトロセルロース結合アイメリア蛋白質と共に培養
させ、更に第２図の説明で述べられていると同様に可視
化させた。使用したモノクローナル抗体類は、3A5
（１）、20C6（２）、7D1（３）、13A6（４）、6A5
（５）およびアイメリア蛋白質に不反応であった対照抗
体を包含していた。使用した血清は、マウス番号107−
２免疫血清（７）および対照血清（８）を包含してい
た。
第４図の左のパネルは、E.tenellaのスポロゾイトの
125I−標識表面蛋白質類による免疫沈澱検査の結果を示
す。スポロゾイト表面蛋白質類を、IODOGENまたはIODOB
EADS法のいずれかで標識し、オートラジオグラフィーに
よる12.5％のゲル中でのSDS−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動に続いて可視化させた。右のパネルは、生スポ
ロゾイト類で免疫させたマウスからの血清による125I−
標識スポロゾイト表面蛋白質類の免疫沈澱の結果を示
す。免疫マウス血清（105−１、105−２、105−３、107
−１、107−２および107−３）および対照マウス血清
（対照）を、125I−スポロゾイト表面抗体と共に培養
し、免疫複合体を、アガロースに結合した抗マウス抗体
によって捕らえた。該免疫複合体を、Laemmli試料緩衝
液で可溶化させ、12.5％のゲル中、SDS−ゲル電気泳動
によって分離させ、オートラジオグラフィーによって可
視化させた。Ｍは、kd（kilodalton）での標準マーカー
蛋白質の分子量を示す。
第５図は、モノクローナル抗体による125I−スポロゾ
イト表面蛋白質類の免疫沈澱の結果を示す。各抗体によ
る125I−蛋白質結合の同定の方法は、第４図の記述に説
明されている。使用された特異的スポロゾイトおよび対
照抗体（対照）は、各レーンの上部に示されている。標
準マーカー蛋白質の分子量は、kdで示されている。
第６図は、空気乾燥させたE.tenellaのスポロゾイト
の固体調製物類の相対比顕微鏡写真および各種のモノク
ローナル抗体類を使用する免疫蛍光検査の染色模様の顕
微鏡写真を示す。パネルＡ、Ｂ、ＣおよびＤの左側は、
大きな後方の屈折性組織（lorge posterior refractill
e body）（PBR）、小さな前方の屈折性組織（small ant
erior refractile body）（ARB）および該後方の屈折組
織の反対側の先端末（Ａ）による完全に伸長されたスポ
ロゾイト類を示す相対比顕微鏡写真である。パネルＡ、
Ｂ、ＣおよびＤの右側は、それぞれモノクローナル抗体
14C3（表面抗体に特異的）、6A5（表面および屈折性組
織蛋白質に特異的）、11D2（スポロゾイト先端の先端部
に特異的）および対照抗体で処理されたスライドを示
す。ポリペプチドに結合した抗体は、ローダミン結合抗
マウス抗体類によって局在化させ、leitz Dialux 22
（商標）顕微鏡を使用するエピ蛍光（epifluorescenc
e）によって可視化させた。全ての顕微鏡写真は、630倍
である。
第７図は、細胞内のスポロゾイト類の抗体染色および
ニワトリ腎臓細胞内に於ける発育寄生生物を示す。ニワ
トリ腎臓細胞を、スポロゾイト類で感染させ、感染後、
示された時間に細胞は、抗体染色処理された。固定の前
に、培養物を洗浄し、全ての細胞外のスポロゾイト類を
除去した。相対比および対応する免疫蛍光顕微鏡写真
を、示された様に抗体類7D4、8A2、7B2および15A3を使
用して作成した。調製物に結合した抗体類をローダミン
結合抗マウス抗体類によって局在化させ、エピ蛍光によ
って可視化させた。全ての顕微鏡写真は、630倍であ
る。
第８図は、細胞内のスポロゾイト類の抗体染色および
ニワトリ腎臓細胞内に於ける発育寄生生物を示す。相対
比および対応する免疫蛍光顕微鏡写真を、示された時間
に、モノクローナル抗体類14B1および19D6、免疫ひよこ
血清および蛍光第２抗体を使用して作成した。
第９図は、抗スポロゾイト抗体類による細胞内のスポ
ロゾイトの発育の中和を示す。精製されたE.tenellaの
スポロゾイト類を、40℃で１時間、対照抗体（×）かま
たは抗スポロゾイト抗体類7D4（□）、8A2（○）、14B1
（●）あるいは6A5（■）かと共に前培養させ、次いでM
DBK細胞培養物で感染させた。更に、スポロゾイト類
を、培地（△）または抗コクシジウム薬、ラサロシド
（lasalocid）（×）と共に前培養させた。
感染後、細胞内のスポロゾイトの発育を、細胞培養物
中への3H−ウラシルの取り込みによって測定した。ラサ
ロシドは、スポロゾイトの細胞内の発育を阻止するた
め、この薬剤と共に調製された培養物は、3H−ラウシル
最小取り込みを示した。
第10図は、示されている様に、65 Kd−β−ガラクト
シダーゼ融合蛋白質試料または他の試料のSDS−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動の１ウェスタン・ブロット分
析の結果を示す。ウェスタン・ブロット分析は、マウス
抗−β−ガラクトシダーゼ抗体（パネルＡ）またはヤギ
抗マウスHPOD接合体に接合する貯蔵されたモノクローナ
ル抗体類7D1、7D4および20C6（パネルＢ）を使用して行
なった。両方のパネル中のレーンは、（１）β−ガラク
トシダーゼ、（ｍ）表示された分子量のマーカー類、そ
の大きさはパネルＡの左側にkdで示されている。（２）
全ての細胞ペレット蛋白質、（３）超音波処理により該
細胞ペレットから遊離した蛋白質および（４）超音波処
理後の該ペレットからのグアニジン−HClで可溶化した
蛋白質を示す。
第11図は、ファージλm2-4から1.7KbのEcoR I DNA挿
入を含み65kdの蛋白質発現プラスミドであるプラスミド
pEV/2−４の模式的表示を示す。挿入中の各種の制限酵
素部位の位置が、Pst I（P,bp53および776に於ける）、
Kpn I（K,bp202に於ける）、BstN I（B,bp584,1303およ
び1412に於ける）およびSau3A（S,bp1017および1439に
於ける）を含めEcoR I部位に関して示されている。
第12図は、pEV−vrf3のEcoR IとSal Iとの間に挿入さ
れた表示された部位を伴うポリリンカーを含むpEV3−SE
Qの地図を示す。ダッシュ矢印で示された合成オリゴヌ
クレオチドCGGTCGACTCGAGCCAが、鎖停止DNA配列分析の
ためのプライマーとして使用された。
第13図は、モノクローナル抗体6A5で認識される蛋白
質をコードするcDNAクローンの制限地図を示す。1.2kb
cDNAのMaxam−Gilbert DNA配列分析のために使用される
制限エンドヌクレアーゼ部位が示されている。括弧内の
EcoR I部位は、0.9kb cDNAの末端の位置である。地図上
の棒は、充填された潜在的シグナルペプチドを伴う、DN
Aから断定された開始読みわくを示す。地図の下の線
は、鎖停止配列分析に使用されたoxoI II削除を示す。
第14図は、モノクローナル抗体6A5によって認識され
る20kb蛋白質をコードする1.1kb cDNA分子のヌクレオチ
ド配列を示す。
第15図は、第14図のヌクレオチド配列から調製した蛋
白質のアミノ酸配列を示す。
第16図は、モノクローナル抗体7D1、7D4および20C6に
よって認識される65kd蛋白質をコードする1.7kb cDNA分
子のヌクレオチド配列を示す。
第17図は、第16図のヌクレオチド配列から断定され、
発現された65kb蛋白質から調製されたトリプシンの蛋白
質類の配列分析により確認された蛋白質のアミノ酸配列
を示す。該蛋白質類のいくつかに対応する全体にわたる
アミノ酸配列中の領域が、下線で示されている。該蛋白
質類の測定された配列は、上線付けされている。
第18図は、モノクローナル抗体8A2によって認識され
る28kdの蛋白質をコードする1.1kd cDNA分子のヌクレオ
チド配列を示す。
第19図は、第18図のヌクレオチド配列から推定される
蛋白質のアミノ酸配列を示す。
第20図は、モノクローナル抗体7B2によって認識され
る蛋白質をコードする3.3kb cDNA分子のヌクレオチド配
列を示す。
第21図は、第20図のヌクレオチド配列から推定される
蛋白質のアミノ酸配列を示す。
第22図は、免疫アフィニティー精製された65kbの蛋白
質のSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す。
ゲルは、コマシーブルー染色およびウェスタン・ブロッ
ト分析によって可視化された。レーン２と４および３と
５は、２種の調製物からの精製された蛋白質を含む。レ
ーン１と６は、図の左右に示された分子量を有する分子
量マーカー蛋白質類の混合物を含む。
第23図は、カラム保持時間を関数とする215mμに於け
る吸光度を示す。65kbの蛋白質のβ−メルカプトエタノ
ール還元（パネルＡ）および未還元（パネルＢ）トリプ
シン消化のHPLC溶出曲線を示す。
第24図は、ワクチンウイルスへのコクシジア抗体類を
コードする遺伝子の組換えに使用される基本ベクターの
４種の要素の制限地図を示す。これらの要素は、7.5Kプ
ロモーター要素（ａおよびｂ、左）、TK遺伝子座（ａお
よびｂ、右）、プラスミドpUC8（ｃ）の一部およびM13t
g131からのポリクローン部位を含む。ウイルス7.5Kおよ
びTKプロモーターの転写の方向は、左から右、すなわ
ち、ポリリンカー中、Bal IIからEcoR I制限部位であ
る。
第25図は、（Ａ）第24図のベクターのポリリンカー要
素中、AUG翻訳部位コドンを含む構築物から発現させ、
（Ｂ）マラリアの190kdリーダー切片（始めの34個のア
ミノ酸）および第24図（次の13個のアミノ酸）のクロー
ンベクターのポリリンカーに融合させたモノクローナル
抗体8A2によって認識されたアイメリア抗原のＮ−末端
のアミノ酸配列を示す。蛋白質の形質転換工程中、Ｎ−
末端に於ける始めの19個のアミノ酸を、クローンによっ
て示された位置に於いて開裂させても良い。
図中、標準の単一文字の略号は、ヌクレオチド類を示
すために使用され、更に標準の１または３つの文字の略
号は、アミノ酸類を示すために使用される。それらの略
号の意味は、例えばLehniger,Principles of Biochemis
try,1989 Worth Publishers,Inc.,ニューヨーク、pp.9
6,798等の標準的生化学の教科書中に見出すことができ
る。
以下に使用されるように、次の用語は、次の意味を持
つものとする： “20kd蛋白質”は、SDSポリアクリルアミドゲル電気
泳動において約20キロダルトンの見かけの分子量を有す
る組換えまたは合成蛋白質であって、モノクローナル抗
体6A5に特異的に結合するものを意味する。この抗体
は、SDSゲルにおいて約28キロダルトンの見かけの分子
量を有するアイメリア表面抗原（アイメリア蛋白質類の
全抽出物由来）とも特異的に反応する。この抗原は、ス
ポロゾイト発生段階中に存在する。この蛋白質をコード
するcDNA分子のヌクレオチド配列およびそれから推定さ
れるアミノ酸配列は、それぞれ第14図および第15図に示
されている。
“65kd蛋白質”は、SDSポリアクリルアミドゲル電気
泳動において約65キロダルトンの見かけの分子量を有す
る組換えまたは合成蛋白質であって、モノクローナル抗
体7D1、7D4および20C6に特異的に結合するものを意味す
る。これらの抗体は、SDSゲルにおいて約120キロダルト
ンの見かけの分子量を有するアイメリア抽出物由来の表
面抗原とも特異的に反応する。この抗原は、スポロゾイ
ト、ジゾントおよびメロゾイト発生段階において存在す
る。この蛋白質をコードするcDNA分子のヌクレオチド配
列およびそれから推定されるアミノ酸配列は、それぞれ
第16図および第17図に示されている。
“28kd蛋白質”は、SDSポリアクリルアミドゲル電気
泳動において約28キロダルトンの見かけの分子量を有す
る組換えまたは合成蛋白質であって、モノクローナル抗
体8A2に特異的に結合するものを意味する。この抗体
は、SDSゲルにおいて約37キロダルトンの見かけの分子
量を有するアイメリア表面抗原とも特異的に反応する。
この蛋白質をコードするcDNA分子のヌクレオチド配列お
よびそれから推定されるアミノ酸配列は、それぞれ第18
図および第19図に示されている。
“45kd蛋白質”は、SDSポリアクリルアミドゲル電気
泳動において約45キロダルトンの見かけの分子量を有す
る組換えまたは合成蛋白質であって、モノクローナル抗
体7B2に特異的に結合するものを意味する。この抗体
は、SDSゲルにおいて約200キロダルトン以上の見かけの
分子量を有するアイメリア表面抗原とも特異的に反応す
る。この抗体は、スポロゾイト発生段階において存在す
る。この蛋白質をコードするcDNA分子のヌクレオチド配
列およびそれから推定されるアミノ酸配列は、それぞれ
第20図および第21図に示されている。
“アイメリア表面抗原の免疫反応性および／または抗
原性の１種もしくはそれ以上の決定因子を有する蛋白
質”なる用語は、免疫学的に適合する宿主生物中に免疫
応答を誘導することが可能であるか、および／または相
補的な抗体に対して特異的に結合することが可能な１以
上の領域もしくはエピトープを有する蛋白質を意味す
る。
遺伝子コードの縮重性のために、第15図、第17図、第
19図および第21図に示されるアミノ酸配列をコードし得
る多くの可能なヌクレオチド配列（機能的な同等物）が
あるものと理解されるであろう。また、ベクター中に挿
入された該発明のDNA配列および断片のヌクレオチド配
列は、そのような配列および断片を含む該組換えベクタ
ーが、アイメリア表面抗原の免疫反応性および／または
抗原性の１以上の決定因子を有する蛋白質または断片の
適当な宿主生物中における産生を支配することができる
かぎりにおいて実際の構造遺伝子の部分ではないヌクレ
オチドも包含することができる。
更には、生物学的および免疫学的活性を本質的に変え
ることがない蛋白質中のアミノ酸の置換が知られてお
り、そして例えばNeurathらの“The Proteins"Academic
Perss,New York（1979）、特に第14頁の第６図中に記
載されている。最も頻繁に観察されるアミノ酸の置換
は、Ala/ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、V
la/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pr
o、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、As
p/Glyおよびその逆である。
この発明の例証的態様のこのような機能的に同等なヌ
クレオチド配列変異体およびアミノ酸置換体は、得られ
る該蛋白質は、アイメリア表面抗原の免疫反応性および
／または抗原性の１種以上の決定因子を保有している限
り、本発明の範囲内になる。
“断片”なる用語は、本発明のcDNAまたは、蛋白質の
うちの一つの部分配列からなるDNA配列または蛋白質を
意味する。このような断片は、DNAに対しては制限エン
ドヌクレアーゼを、また蛋白質に対してはプロテアーゼ
を用いてより大きい分子を酵素的に開裂することにより
製造することができる。しかしながら、本発明の断片
は、酵素的開裂の何れかの形態の生成物に限定されるも
のではなく、何れの酵素的開裂点にも対応しない末端の
部分配列を包含する。このような断片は、例えば、ここ
に与えられている配列を用いて化学合成により作ること
ができる。DNA断片は、単離されたメッセンジャーRNA
（mRNA）から不完全相補的DNA（cDNA）合成により製造
することができる。蛋白質断片は、該蛋白質断片をコー
ドするDNAを発現させることによっても製造することが
できる。このような蛋白質断片は、それらが免疫反応性
および／または抗原性の決定因子を構成するために充分
な数のアミノ酸残基を有する場合には、本発明において
有用である。一般的には、約７または８残基が必要であ
る。以下に説明するように、それらを免疫反応性とする
には、それらのような断片を免疫原性担体分子と結合さ
せる必要があるであろう。
本発明の該蛋白質類は、例えば組換えDNA技術、化学
合成またはアイメリア調製物からの単離などのこの分野
で知られた多くの方法により製造することができる。
本発明の該蛋白質を製造するために必要なDNAは、第1
4図、第16図、第18図および第20図に与えられたヌクレ
オチド配列の情報を使用して、化学的に合成することが
できる。このような化学合成は、公知のどのような方法
によっても行なうことができるが、Matteuciからのホス
ホルアミダイト固体支持体法〔J.Am.Chem.Soc.103:3185
（1981）〕が好適である。
別法として、cDNAは、アイメリアmRNAから作ることが
できる。メンセンジャーRNAは、アイメリアの胞子を形
成する卵原細胞またはメロゾイトから標準的な方法によ
り単離することができる。次いでこれらのmRNA試料は、
Maniatisらの前出文献のようにして二重鎖cDNAを製造す
るために使用することができる。このcDNAは、E.coliの
形質転換に使用できる適当なクローニング用ベクター中
に挿入され、cDNAライブラリーが調製される。
次いで、該cDNAライブラリーは、本発明のクローン化
遺伝子またはその断片をプローブとして選別され得る。
このような遺伝子または断片は、例えば１種類がα位に
32Pを含む４種のデオキシリボヌクレオチド類の存在下
でPol I DNAポリメラーゼを使用するニック−トランス
レーション（Maniatisらの前出文献）により、プローブ
として使用するために放射能標識され得る。
下記の実施例においては、mRNAの供給源としてEimeri
a tenellを用いたが、この種由来のクローン化遺伝子
は、種々の種間のDNA配列の同一性によって、アイメリ
アの他の種由来の遺伝子を単離するためのプローブとし
て使用することができる。
一旦、同定され、そして単離されてのち、本発明の該
アイメリア遺伝子は、挿入される遺伝子配列の転写およ
び翻訳に必要な要素を含んだ適当な発現ベヒクル中に挿
入される。有用なクローン化ベヒクルは、染色体性、非
染色体性および合成のDNA配列、例えば、種々の細菌性
プラスミド類、ファージDNA、ファージDNAもしくは他の
発現制御配列を用いるべく修飾されたプラスミドのよう
なプラスミドとファージDNAとの組合せ、またはイース
トのプラスミドの分節からなっていてもよい。使用可能
であり、かつ当業者に知られた特定のクローン化ベヒク
ルは、限定されるものではないが、pEV−vrfプラスミド
類（pEV−vrf1、−２および−３）;SV40;アデノウイル
ス；酵母；ラムダ−gt−WES−ラムダB;シャロン4Aおよ
び28;ラムダ−gt−11−ラムダB;pUC8,9,18および19,pBR
313,322および325等のM13誘導ベクター類;pAC105;pVA5
1;pACY177;pKH47;pACYC184;pUB110;pMB9;colE1;pSC101;
pm121;RSF2124;pCR1またはRP4を包含し得る。
クローン化ベクターへのアイメリア遺伝子の挿入は、
遺伝子類および所望のクローン化ベヒクルの両者が同じ
制限酵素または酵素類により切断されたものであると、
これにより相補的なDNA末端が形成されるために、容易
に行われる。これを行えない場合には、一本鎖DNAを消
化して平滑末端を生成させることによるか、あるいは適
当なDNAポリメラーゼを用いて一本鎖末端を充足して同
様な結果を達成することにより、切断末端を修飾する必
要があるであろう。このようにして、平滑末端の連結
が、T4 DNAリガーゼ等の酵素を用いて行なわれるであろ
う。別法として、所望のいかなる部位も該DNA末端にヌ
クレオチド配列（リンカー類）を連結することにより生
成させることができる。このようなリンカー類は、制限
部位認識配列をコードする特定のオリゴヌクレオチド配
列を含んでもよい。開裂されたベクターおよびアイメリ
ア遺伝子は、Morrow〔Method in Enzymology 68:3（197
9）〕により記述されたように、ホモポリマー様テーリ
ング（homopolymeric tailing）により修飾されてもよ
い。
本発明において使用されうる多くのクローン化ベヒク
ルは、pBR322中のアンピシリンおよびテトラサイクリン
耐性、pUC8中のアンピシリン耐性およびβ−ガラクトシ
ダーゼ活性、pEV−vrf2中のアンピシリン耐性のように
所望の形質転換体を選択するために使用されうる１種以
上のマーカー活性を含んでいる。このようなベクターが
挿入された宿主細胞の選択は、該宿主細胞が該ベクター
類による寄与である活性を別な形で欠落している場合に
非常に単純である。
クローン化ベヒクル中の選択された部位に挿入された
該アイメリア遺伝子のヌクレオチド配列は、実際の構造
遺伝子の部分ではないヌクレオチドを含んでもよいもの
と理解されるべきである。別法としては、該遺伝子は、
完全な天然型遺伝子の部分のみを含んでもよい。必要と
されることの全ては、クローン化ベヒクル中に挿入され
た遺伝子断片が、適当な宿主生物中で、アイメリア表面
抗原の少なくとも１種の免疫反応性および／または抗原
性の決定因子を有するポリペプチドまたは蛋白質の産生
を支配し得ることである。
適当な宿主生物の選択は、この分野で知られた多くの
因子に影響される。これらの因子は、例えば、選択した
ベクターとの適合性、該融合プラスミドによりコードさ
れる蛋白質類の毒性、所望の蛋白質の回収の容易性、発
現特性、生物学的安全性およびコストを含む。これらの
因子のつり合いは見出だされねばならず、またすべての
宿主が特定の組換えDNA分子の発現に対して同等に有効
であるとは限らないと理解されるべきである。
本発明に使用され得る好適な宿主単細胞生物は、限定
されるものではないが、植物、哺乳類、または酵母細
胞、ならびにEscherichia coli,Bacillus subtilds,Bac
illus stearotermophilusおよびActinomyces等の細菌を
含む。特に好適には、Escherichia coli株MC1061であっ
て、これは、Casadabanらの〔J.Mol.Biol.138:179（198
0）〕により記述されている。この株、またはプラスミ
ドpRK248cItsを含む他のE.coli K−12株が使用できる。
他のE.Coli K−12株において使用するプラスミドpRK248
cItsは、American Type Culture Collectionから入手可
能であって、受託番号ATCC33766を有している。E.coli
株MC1061もまた寄託されており、受託番号ATCC 53338を
有している。
組換えクローン化ベクターの宿主細胞中への移動は、
種々の方法により行なうことができる。選択した特定の
ベクター／宿主系従って、このような移動は、形質転
換、トランスダクションまたはトランスフェクションに
より行なうことができる。一旦このような修飾された宿
主細胞が生成された後は、該細胞が培養され、そして蛋
白質生成物が培養物から単離される。
本発明のアイメリア蛋白質を産生するクローンは、適
当に標識された該蛋白質に特異的な抗体類により同定さ
れ得る。モノクローナル抗体類が好適であるが、これら
は標準的な方法を用いて以下のように調製され得る。
Eimeria Tenella由来の抗原性蛋白質は、マウス、ラ
ット、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギ等の動物を免疫化
し、ミエローマ細胞と融合するための抗体産生体細胞を
得るために使用される。
抗体産生能を有する体細胞、特にβ細胞類は、ミエロ
ーマ細胞と融合するために適している。これらの体細胞
は、誘発された動物のリンパ節、ヒ臓および末梢血から
誘導されてもよい。本発明の好ましい実施態様において
は、マウスミエローマ株と比較的高い割合で安定した融
合物を生成することもその一部の理由として、マウスヒ
臓細胞が使用される。しかしながら、これに代えて、ラ
ット、ウサギ、カエルまたは他の細胞を用いることもで
きる。
特殊化したミエローマ細胞株が、ハイブリドーマ生成
融合処理に使用するためにリンパ球腫瘍から開発されて
いる〔KohlerおよびMilsteinのEur.J.Immunol.6:511（1
976）;ShlmanらのNature 276:269（1978）;VolkらのJ.V
irol.42:220（1982）〕。これらの細胞株は、少なくと
も３つの理由のために開発されている。第１には、非融
合であってかつ類似している無限に自己−繁殖するミエ
ローマ細胞の中からの融合ハイブリドーマの選択を容易
にすることである。通常、これは、ハイブリドーマの生
育を支えるある種の選択された培地中において、生育が
不可能となるような酵素欠損を有したミエローマ類を用
いることにより行なわれる。第２の理由は、自体の抗体
類を産生するリンパ球腫瘍細胞の本来の能力に由来す
る。モノクローナル技術を使用する目的は、所望の単一
の抗体をハイブリドーマの体細胞成分の遺伝子的制御下
で産生する無限の寿命を有した融合ハイブリドーマ細胞
株を得ることにある。該ハイブリドーマ細胞による腫瘍
細胞に対する抗体の産生を除くため、軽または重免疫グ
ロブリン鎖を産生できないか、あるいは抗体分泌機構を
欠失したミエローマ細胞株が使用される。これらの細胞
株を選択する第３の理由は、融合に対してのそれらの適
合性および効率である。
例えばP3/X63−Ag8、P3/NSI/1−Ag 4−１、SP2/0−Ag
−14およびS194/5.XXO.BU.1を含めた多くのミエローマ
細胞株が、融合細胞ハイブリッドの生成のために使用さ
れることができる。該P3/X63−Ag8およびP3/NSI/1−Ag
4−１細胞株は、KohlerおよびMilstein〔Eur.J.Immuno
l,６:511（1976）〕により記述されている。Shulmanら
は、Sp2/0−Ag14ミエローマ株を開発した〔Nature 276:
269（1978）〕。該S104/5.XXO.BU.1株は、Trowbridgeに
より報告されている〔J.Exp.Med.148:313（1979）〕。
本発明の実施例においては、該PAI−０マウス細胞株（P
3/X63−Ag8の非−Ig−産生サブクローン）が使用され
た。
抗体産生ヒ臓またはリンパ節細胞およびミエローマ細
胞の融合物を創生するための方法は、通常、細胞膜の融
合を促進する試薬または試薬類（化学的、ウイルス的ま
たは電気的）の存在下において、体細胞とミエローマ細
胞とをそれぞれ10:1の割合（但し、この割合は、約20:1
から約1:1まで変えてもよい）で混合することを含む。
該融合操作において使用される体細胞およびミエローマ
細胞の供給源としては、同じ種の動物が好ましい。融合
方法は、KohlerおよびMilstein〔Nutere 256:495（197
5）およびEur.J.Immunol.６:511（1976）〕、Gefterら
〔Somatic Cell Genet.３:231（1977）〕およびVolkら
〔J.Virol.42:220（1982）〕により記述されている。こ
れらの研究者らにより使用された融合−促進試薬は、セ
ンダイウイルスおよびポリエチレングリコール（PEG）
であった。本発明の実施例のための融合操作では、PEG
を用いている。
融合操作は、生存可能なハイブリッドを非常に低い頻
度で生ずるため（例えばヒ臓を体細胞の供給源とした場
合、わずか１つのハイブリッドがおよそ１×105のヒ臓
細胞毎に得られる）、融合細胞ハイブリッドを残る非融
合細胞、特に非融合ミエローマ細胞から選択する方法を
持っていることは基本的なことである。所望の抗体−産
生ハイブリドーマを他に得られた融合細胞ハイブリッド
の中から検出する方法もまた必要である。
一般的には、融合細胞ハイブリッドの選択は、ハイブ
リドーマの生育を助けるが、通常、無限に分裂を続ける
ミエローマ細胞の生育を妨げる培地中にて細胞を培養す
ることにより行なわれる。（融合において用いた体細胞
は、インビトロ培養においては長期間の生存を維持しな
いので問題を有さない。）本発明の実施例においては、
ヒポキサンチン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ
を欠損したミエローマ細胞（HPRT−ネガティブ）を使用
した。これらの細胞に対しての選択は、ヒポキサンチン
／アミノプテリン／チミジン（HAT）培地中で行なわ
れ、この培地においては、融合細胞ハイブリッドは、ヒ
臓細胞のHPRT−ポジティブ遺伝子型のために生存する。
別の遺伝子的欠陥（薬物感受性等）を有したミエローマ
細胞は、遺伝子的に適合するハイブリッドの生育を支持
する培地中において選択可能であり、これらの使用も可
能である。
融合細胞ハイブリッドの選択的培養には、数週間が必
要である。この期間の初期には、所望の抗体を産生する
ハイブリッド類を同定することが必要であり、これによ
って、それらは引き続いてクローン化され、そして繁殖
される。一般的には、得られたハイブリッドの約10％が
所望の抗体を産生するが、これが１から30％までの範囲
にあることは異常なことではない。抗体−産生ハイブリ
ッドの検出は、文献に記述されている酵素−結合免疫試
験および放射免疫試験〔例えば、Kennetら（編集者）の
Monoclonal Antibodies and Hybridomas:A New Dimensi
on in Biological Analyses:376−384頁、Plenum Pres
s,New York（1980）参照〕を含む数種の標準的試験方法
のいずれか１つにより行なえる。数種の検出方法が、本
発明の実施例において用いられた。
一旦、所望の融合細胞ハイブリッドが選択され、個々
の抗体−産生細胞株にクローン化された後には、それぞ
れの細胞株が、２種の標準的な方法のいずれかによって
繁殖され得る。該ハイブリドーマ細胞の懸濁液は、組織
適合性動物中に注射され得る。該注射された動物は、該
融合細胞ハイブリッドにより産生される特定のモノクロ
ーナル抗体を分泌する腫瘍を発生する。血清または腹水
等の該動物の体液は、高い濃度でモノクローナル抗体を
与えるため採取され得る。別法として、個々の細胞株
は、研究室用培養器中でインビトロにおいて繁殖され得
る。高濃度の単一の特定モノクローナル抗体を含む培地
は、傾瀉、ロ過または遠心分離により採集され得る。
E.coli中で産生されるのと同様に、該アイメリア蛋白
質は、細胞質または包接体中に残留する。該蛋白質を遊
離するために、該外部膜を破壊することが必要である。
これは、好ましくは超音波処理またはフレンチプレッシ
ャーセルもしくはGaulinホモジナイザー等の機械的破砕
手段により行なわれる。
細胞破壊は、化学的または酵素的手段によっても行な
える。細胞膜の完全性のためには普通、２価の陽イオン
が要求されるので、EDTAまたはEGTA等の適当なキレート
化剤による処理は、細胞からの該蛋白質の漏出を促進す
るために充分に破壊的である。同様に、リゾチーム等の
酵素類が同様な結果を達成するために使用されている。
その酵素は、該細胞壁のペプチドグルカン骨格を加水分
解する。
浸透圧的衝撃の適用もまた使用され得る。これは、概
略的には第１に該細胞を高張溶液中に置き、それらの水
を失なわせて収縮せしめることにより行ない得る。引続
き、低張の“衝撃”溶液中に置くことによって、所望の
蛋白質の排除を伴う該細胞中への水の急速な流入が導か
れる。
一旦、該細胞から遊離された後、該アイメリア蛋白質
は、硫酸ナトリウムまたはアンモニウム等の塩による沈
澱、限外ロ過またはこの分野でよく知られた他の方法に
よって濃縮され得る。更なる精製は、限定されるもので
はないが、ゲルロ過、イオン交換クロマトグラフィー、
調製用ディスク−ゲルまたはカーテン電気泳動、等電的
フォーカシング、低温度有機溶媒分画、または逆流分配
を含む通常の蛋白質精製技術により行ない得る。しかし
ながら、精製は、後述するように免疫アフィニティーク
ラマトグラフィーにより好適に実施される。
本発明の該蛋白質またはその断片は、全固相合成、部
分固相合成、断片縮合または古典的液相合成等の好適な
方法により、化学的に合成することもできる。Merrifie
ld〔J.Am.Chem.Soc.85:2149（1963）により記述されて
いる固相合成法が好ましい。
このような合成は、アルファーアミノ末端が保護され
たアミノ酸を用いて行なわれる。不安定な側鎖を有する
三官能性アミノ酸も、ペプチドの組み上げ時にその部位
において化学反応が起こることを避けるような適当な保
護基により保護される。該アルファーアミノ保護基は、
該アミノ末端において続く反応が行なわれるように選択
的に除去される。該アルファーアミノ保護基の脱離条件
は、側鎖保護基の脱保護を引き起こさない。
該アルファーアミノ保護基は、段階的ペプチド合成の
分野で有用な公知のものである。アクリル型保護基（例
えばホルミル、トリフルオロアセチル、アセチル）、芳
香族性ウレタン型保護基（例えばベンジルオキシカルボ
ニル（Cbz）および置換ベンジルオキシカルボニル）、
脂肪族性ウレタン保護基（例えば、ｔ−ブチルオキシカ
ルボニル（Boc）、イソプロピルオキシカルボニル、シ
クロヘキシルオキシカルボニル）ならびにアルキル型保
護基（例えば、ベンジル、トリフェニルメチル）が含ま
れる。好適な保護基は、Bocである。Tyrのための側鎖保
護基は、テトラヒドロピラニル、tert−ブチル、トリチ
ル、ベンジル、Cbz、４−Br−Cbzおよび2,6−ジクロロ
ベンジルを含む。Tyrのための好ましい側鎖保護基は、
2,6−ジクロロベンジルである。Aspのための側鎖保護基
は、ベンジル、2,6−ジクロロベンジル、メチル、エチ
ルおよびシクロヘキシルを含む。Aspのための好ましい
側鎖保護基は、シクロヘキシルである。ThrおよびSerの
ための側鎖保護基は、アセチル、ベンゾイル、トリチ
ル、テトラヒドロピラニル、ベンジル、2,6−ジクロロ
ベンジルおよびCbzを含む。ThrおよびSerのための好ま
しい側鎖保護基は、ベンジルである。Agrのための側鎖
保護基は、ニトロ、Tos、Cbz、アダマンチルオキシカル
ボニルまたはBocを含む。Argのための好ましい保護基
は、Tosである。Lysの側鎖アミノ基は、Cbz、２−ClCb
z、TosまたはBocにより保護されてよい。２−Cl−Cbz
が、Lysの好ましい保護基である。側鎖保護基の選択
は、以下に基づく：側鎖保護基は、カップリング中には
元のまま残り、かつ、アミノ末端保護基の脱保護の間お
よびカップリング条件において分離しない。該側鎖保護
基は、最終ペプチドの合成の完成にあたって、目的ペプ
チドを変化させない条件を使用して脱離可能でなければ
ならない。
固相合成は、通常、アルファーアミノ保護（側鎖保
護）アミノ酸を適当な固体支持体に結合することによ
り、カルボキシ末端から行なわれる。クロロメチル化ま
たはヒドロキシメチル化樹脂に対して固定がなされた場
合は、エステル結合が形成され、得られる目的ペプチド
は、Ｃ−末端に遊離のカルボキシル基を有するであろ
う。別法として、ベンズヒドリルアミンまたはｐ−メチ
ルベンズヒドリルアミン樹脂が使用された場合、アミド
結合が形成され、得られる目的ペプチドは、Ｃ−末端に
カルボキシアミド基を有するであろう。これらの樹脂
は、商業的に入手可能であり、それらの調製は、Stewar
tらの“Solid Phase Peptide Synthesis"（第２版、Pie
rce Chemical Co.,Rockford,IL,1984）により記述され
ている。
側鎖においてTosにより保護され、アルファーアミノ
官能基においてBocにより保護されたＣ−末端アミノ酸A
rgは、ベンズヒドリルアミン樹脂に対してジシクロヘキ
シルカルボジイミド（DCC）、N,N′−ジイソプロピルカ
ルボジイミドおよびカルボニルジイミダゾールを含む種
々の活性化剤を用いて連結される。樹脂支持体への固定
に続き、アルファーアミノ保護基が、トリフルオロ酢酸
（TFA）またはジオキサン中のHClを用いて０℃と25℃と
の間の温度で除去される。ジメチルスルフィドがメチオ
ニン（Met）の導入後に起こり得るＳ−アルキル化を抑
制するために、TFAに添加される。アルファーアミノ保
護基の除去の後に、残りの保護されたアミノ酸が所望の
ペプチド配列が得られるように必要な順序をもって段階
的に結合される。
DDC、N,N′−ジイソプロピルカルボジイミド、ベンゾ
トリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−（ジメチル
アミノ）−ホスホニウムヘクサフルオロホスフェート
（BOP）およびDCC−ヒドロキシベンゾトリアゾール（HO
Bt）を含む種々の活性化剤が結合反応のために使用され
得る。各々の保護アミノ酸が過剰量（＞2.5当量）をも
って使用され、そして通常は該結合反応は、DMF、CH2Cl
2またはそれらの混合物中で行なわれる。該結合反応の
完了の程度は、KaiserらのAnal.Biochem.,34:595（197
9）により記述されているようにニンヒドリン反応によ
って各段階で監視される。不完全な結合が検出された場
合には、該結合反応は繰り返される。該結合反応は、Ve
ga250、Applied Biosystems Synthesizerまたは他の商
業的に入手可能な装置において自動的に行なうことがで
きる。目的ペプチドの全体の組立て後に、該ペプチド−
樹脂は、TFA/ジチオエタンを用いて脱保護され、次いで
該ペプチドを樹脂から開裂させると共にすべての側鎖保
護基を脱離させる液体HF等の試薬により１−２時間、０
℃にて開裂される。
固体支持体上での側鎖と側鎖との間の閉環は、酸性ア
ミノ酸類（例えば、Asp）および塩基性アミノ酸類（例
えば、Lys）の側鎖官能基類の選択的な開裂を可能とす
る直交保護機構（orthogonal protection scheme）を必
要とする。この目的のためには、Aspの側鎖に対しての
９−フルオルエニルメチル（OFm）保護、および、Lysの
側鎖に対しての９−フルオルエニルメトキシカルボニル
（Fmoc）保護基が使用できる。これらの場合において
は、Boc−保護ペプチド−樹脂の側鎖保護基は、DMF中に
おいてピペリジンを用いて選択的に除去される。固体支
持体上での環化は、DCC、DCC/HOBtまたはBOPを含む種々
の活性化剤を使用して達成される。HF反応は、上述した
ように閉環したペプチド−樹脂上で行なわれる。
合成蛋白質の精製は、組換え的に製造された蛋白質に
ついて上述したのと同様にして行なわれる。
アイメリア蛋白質類は、E.tenellaまたは他のアイメ
リア種由来の膜蛋白質の抽出物から免疫沈澱または免疫
アフィニティークロマトグラフィーによって回収される
ことも可能である。既に記したように、このような方法
では、完全な天然型蛋白質の製造が可能である。ある場
合には、これらの蛋白質は、組換えDNA法により製造さ
れた蛋白質より大きい。この目的のためのモノクローナ
ル抗体類は、上述したように合成または天然アイメリア
蛋白質類を抗原として使用して製造することができる。
必要な免疫反応性および／または抗原性の決定因子を
有する他の有用な蛋白質類は、本発明の蛋白質類上の活
性決定因子または決定因子類に対して抗−イディオタイ
プ的な抗体類またはその断片である。このような抗−イ
ディオタイプ的抗体類は、本発明の蛋白質上の決定因子
類に対して特異的な他の抗体類に対して生じされ得る
（すなわち、該抗−イディオタイプ的抗体類は、抗−抗
体である）。好ましく、はモノクローナル抗−イディオ
タイプ的抗体類が使用される。このような抗体類は、該
アイメリア蛋白質類自体が使用され得るのと同様な方法
において、ワクチンとして投与され得る。
本発明の１種またはそれ以上の該アイメリア蛋白質類
および抗−イディオタイプ的抗体類は、該蛋白質類およ
び生理学的に許容される担体を含有するワクチン類とし
て製剤化され得る。好適な担体は、例えば0.01から0.1M
の中性pHのリン酸緩衝剤または生理的食塩溶液を含む。
コクジウム症に対する増強された免疫は、２種類の方
法の１つにより作られ得る。第１には、アジュバントま
たは免疫増強剤がワクチンに対して添加され得る。第２
には、本発明の蛋白質類は、免疫されるべき動物に対し
て交差結合複合体として、または担体分子に結合された
より大きい形態をもって提示され得る。
動物のワクチン接種のための好適なアジュバントは、
限定されるものではないが、アジュバント65（ピーナッ
ツ油、マンニドモノオレートおよびアルミニウムモノス
テアレートを含む）；水酸化アルミニウム、リン酸アル
ミニウムおよびミョウバン等の鉱物ゲル；ヘキサデシル
アミン、オクタデシルアミン、リゾレシチン、ジメチル
ジオクタデシルアンモニウムブロマイド、N,N−ジオク
タデシル−Ｎ′,N′−ビス（２−ヒドロキシメチル）プ
ロパンジアミン、メトキシヘキサデシルグリセロールお
よびプロン酸ポリオール等の界面活性剤；ピラン、硫酸
デキストラン、ポリIC、ポリアクリル酸およびカルボポ
ール等の多価陰イオン類；ムラミルジペプチド、ジメチ
ルグリシンおよびタフトシン等のペプチド類；ならびに
油懸濁物を含む。該蛋白質類は、リポゾームまたは他の
微少担体への取込後に投与することもできる。
リポゾームまたは他の微少担体への取込は、これによ
ってワクチン類の放出が長期間に亘って維持され得る手
段を提供する。Alzaポンプ等のポンプは、同様の目的の
ために使用され得る。
本発明の蛋白質は、特により小さい断片の免疫原性
は、交差結合、または免疫原性担体分子（すなわち、本
発明の蛋白質または蛋白質断片を共有的に結合すること
ができ、独立して宿主動物中に免疫応答を誘発する性質
を有する巨大分子）に対して結合することにより増強さ
れ得る。小さい蛋白質断片は、しばしばハプテン（抗体
に対して特異的に結合することができるが、抗体の産生
を誘発できない、すなわち免疫原性でない）として挙動
するため、交差結合、または担体分子への結合が必要と
なることもある。このような断片の免疫原性担体分子へ
の結合は、“担体効果”として通常知られていることの
ために、該断片が免疫原性となる。
好適な担体分子は、例えば蛋白質類およびポリペプチ
ド、多糖類、リポ多糖類等の天然または合成の高分子化
合物を含む。有用な担体は、QuilAと称されるグリコシ
ドであって、これらMoreinらのNature 308:457（1984）
に記述されている。蛋白質担体分子は、特に好適であっ
て、限定されるものではないが、キーホールリンペット
のヘモシアニン、ヒトもしくはウシガンマグロブリン、
ヒト、ウシもしくはウサギ血清アルブミン、またはこの
ような蛋白質類のメチル化もしくは他の誘導体を含む。
他の蛋白質担体類は、当業者には自明であろう。必須で
はないが、好ましくは、該蛋白質担体は、アイメリア蛋
白質類に対する抗体が誘発される宿主動物に対して外来
性であるだろう。
担体分子に対する共有的結合は、この分野において良
く知られた方法を用いて行なうことができ、その正確な
選択は、使用される担体分子の性質により要件が書かれ
る。該免疫原性担体分子が蛋白質である場合には、本発
明の蛋白質または断片は、例えは、ジシクロヘキシルカ
ルボジイミドまたはグルタルアルデヒド等の水溶性カル
ボジイミド類を用いて結合され得る。
これらのような結合剤は、別の担体分子を使用するこ
となく、蛋白質類および断片類それら自体を交差結合す
るためにも使用することができる。このような蛋白質ま
たは蛋白質断片凝集体への交差結合も、また、免疫原性
を増大することができる。
本発明のワクチン類の有効量の投与は、E.tenellaに
よる感染に対して家禽を保護し得る。E.tenella抗原に
対するモノクローナル抗体類は、インビトロにおいてE.
acervulinおよびE.maximaと交差反応し、これらの種に
対する保護も与えられるであろうことを示している。該
蛋白質または蛋白質断片の有効な投与量は、ワクチン接
種される動物の体重において、約10から約50マイクログ
ラム/kgの範囲を有する。約25−50μg/kgの投与量が好
ましい。最初のワクチン接種は、好ましくは、１ないし
数週間後に与えられる増進用ワクチン接種に引き継がれ
る。複数回の追加が投与されてもよい。このような追加
の投与量は、一般的には約５から50μg/kg、好ましくは
約20−50μg/kgである。皮下、皮内、筋内、経口、肛門
または卵内投与等の標準的投与経路が使用できる。
鳥類の免疫系に対する本発明のコクシジア抗原の提示
は、該抗原をコードする遺伝子を細菌（例えばE.coliま
たはSalmonella）中、またはウイルス（例えばpoxvirus
またはherpesvirus）中にクローン化し、そして該生ベ
クター系を鳥類に経口的、注射により、または他の通常
使用されている経路により投与することにより達成でき
る。Carbitら〔Vaccines,1987,Cold Spring Harbor Lab
oratory,68−71中〕は、E.coliの使用を記述し、一方、
Clements〔Pathol.Immunopathol.Res.６:137（1987）〕
は、Salmonellaの使用を記述した。Mossら〔Ann.Rev.Im
munol.５:305（1987）〕は、組換えポックスウイルス
（poxvirus）を使用したウイルスベクター系の使用を評
論している。
ポックスウイルスの一種であるワクシニアウイルス
（vaccinia virus）は、細胞培養物中および動物中でコ
クシジア抗原の放出の試験のために使用し得る。分析的
な研究のために、ワクシニアウイルスは、使用し得る他
のポックスウイルス担体であるfowlpox virusよりも効
果的であることが見出された。これは、ワクシニアウイ
ルスが鳥類のウイルスより急速に複製され、かつニワト
リ細胞に限定されない宿主範囲を有するためである。大
量の異種DNAが、ウイルスの成熟および感染力を阻害す
ることなしにワクシニアウイルスのゲノム中に挿入され
得る〔SmithらのGene 25:21（1983）〕。ウイルスを使
用した多重異種遺伝子の挿入および発現は、感染を受け
た動物中に発現された抗原に対する抗体の産生を誘発す
る〔PerkusらのScience 229:981（1985）〕。
組換えワクシニアウイルスの製造のために用いた技術
は、fowlpoxまたはherpesvirus系に対する一定の処理手
続に容易に適合させることができる。このような組換え
ウイルスのコクシジウム症に対するワクチン中の担体と
しての使用は、ワクチン接種された鳥類がコクシジア抗
原およびウイルス担体の両者に対して免疫を発生する
（すなわち、このようなワクチン類は、二価である）点
において特に優れている。このようなワクチン類の有用
性は、付加的な遺伝子類を担体ウイルス中に挿入するこ
とにより、更に増強され得る。例えば、ニューカッスル
病ウイルスゲノムの部分がコクシジア抗原遺伝子と共に
fowlpox virus中に挿入され得、これによりニューカッ
スル病、コクシジウム症および鶏痘のすべてに対して単
一のワクチンにより免疫が与えられる。
本発明の生ベクターワクチンの投与は、この分野でよ
く知られた多くの方法により行なうことができる。例え
ば、鶏痘ウイルスに対して家禽にワクチン接種するため
に通常使用されている“突きさし”法が使用される。こ
の方法は、ワクチン中に浸された鋭い針により、翼の の皮膚を突くまたは刺すことからなる。この針は、通常
ミシン針のように先端近くに目を有し、これによりワク
チンの滴を運ぶ。別法として、該生ワクチンは、翼の または他の部位に皮下的または皮内的に注射することが
できる。
該組換え生ベクターワクチンは、飲料水中に添加され
てもよく、またワクチン接種される鳥に噴霧することも
できる。それらは、飼料中において、好ましくは保護的
なカプセル化の後に〔BalancouらのNature322:373（198
6）〕、または卵内的に投与することもできる。後者の
方法においては、ウイルスワクチンは、直接的に鶏胚中
に注射される〔SharmaのArian Dis.25:1155（198
5）〕。
実施例 別途特定しない限り、以下では、固体混合物中の固体
のパーセントはwt/wt（重量／重量）、液体中の液体の
パーセントはvol/vol（容量／容量）、液体中の固体の
パーセントはwt/vol（重量／容量）をそれぞれ基準とす
る。
1.アイメリア抗原に対するモノクローナル抗体の調製 1.1 宿主調製 E.テネラ（E.tenella）,E.アセルブリナ（E.acervuli
na）,E.ブルネッティ（E.Brunatti），及びE.マキシマ
（E.Maxima）のスポロゾイトが通常の方法で胞子形成し
た接合子嚢（sporulated oocyte）から単離された。簡
単に述べると、胞子形成した接合子嚢は蒸留水及び20％
漂白剤で洗浄し、そして、蒸浄水で洗浄される。接合子
嚢は組織ホモジェナイザーで破壊され、スポロシストを
含む不溶材料は遠心分離により回収された。沈澱中の放
出されたスポロシスト及び他の材料は0.25％トリプシ
ン、ヒナ鶏胆汁含有pH8のハンクス氏塩溶液に再懸濁さ
れ、40℃で２時間インキュベートされた。切除溶液は、
10％牛胎児血清（FBS）を含有するRPMI−1640培地で２
度洗浄し、pH7.4のPBSで２度洗浄することで除去され
た。
次に、スポロゾイドは、次にメトラジミドのグラジエ
ント（勾配）により精製された。〔ウィシャー（wishe
r）他、パラジトロジー88巻P.515（1984）〕。簡単に述
べるとスポロゾイドは、pH7.0のPBS 2mlに再懸濁され、
懸濁液1mlが15mlのメトリザミドのグラジエントに重層
された。グラジエントは、12％、18％、24％のメトラジ
ミド含有PBS、pH7.0、それぞれ5mlからなっている。ス
ポロゾイトは900×g 40分間の遠心分離により沈降され
る。精製されたスポロゾイトは、21ゲージの針をチュー
ブの側面を通して18％と24％のメトリザミド間の界面へ
挿入し、注射器へスポロゾイトを吸引することにより分
離された。精製されたスポロゾイトはpH7.0のPBSで３度
洗浄され、直ちに免疫、感染研究、125Iによる表面ラベ
ル、蛍光免疫分析、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（Laemmli,Nature 227:680（1970）〕及びウェスタ
ンブロッティング研究に使用された。
E.テネラ（E.tenella）のメロゾイトは以下6.2.3節に
記載されるように分離された。精製されたメロゾイトは
免疫に用いられ、そして、SDS−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動及びウェスタンブロッティング研究用のLaem
mli試料緩衝液で可溶化された。
1.2 免 疫 以下のスケジュールにしたがい、精製された生存スポ
ロゾイトで８匹のメスのBalb/cマウス（Charles River,
Wilmington,Mass）が免疫された。
1日目 １×107スポロゾイト静脈注射（i.v.） 7日目 ６×107スポロゾイト腹膜腔内注射（i.p.） 85日目 ６×106スポロゾイトi.p. 120日目 ３×107スポロゾイトi.p. 244日目 融合前 免疫促進剤（ブースター） １日目 ５×106スポロゾイトi.v, ５×106スポロゾイトi.p, ２日目 １日目と同じ ５日目 過免疫脾臓細胞とミエローマ細胞との融合 各々のマウスからの血清は、抗スポロゾイト抗体につ
いて、精製スポロゾイト蛋白質を用いてELISAにより、
可溶化スポロゾイト蛋白質を用いてウェスタンブロッテ
ィングアッセイにより、125Iでラベルされたスポロゾイ
ト表面蛋白質の免疫沈澱により、そして、精製スポロゾ
イトを用いる免疫蛍光分析によりテストされた。もっと
も高いスポロゾイト抗体反応性を示したマウス（マウス
107−２）が融合前免疫ブースターに選ばれた（この抗
血清のELISA分析に関し、図１参照）。５日目に当該マ
ウスは屠殺され、脾細胞調製のため脾臓が取り除かれ
た。
1.3 細胞培養及び細胞融合 融合２日前に、脾臓細胞のフィーダー細胞が純粋なマ
ウスから完全培地〔イソコフの修正ダルベッコ培地（IM
DM,Gibco）に10％FBS,グルタミン（2.0mM）及び２−メ
ルカプトエタノール（100μＭ）を加えたもの〕及びHAT
（100μＭヒポキサンン、10μＭアミノプテリン、及び1
6μＭキミジン）中に調製された。de st Groth他の方法
〔J.Immunol,Methods 35:1（1980）〕の変法により、10
8コの脾臓細胞が108個のPAI−Ｏマウスミエローマ細胞
と融合された。パイブリドーマの調製に好適ないかなる
他のミエローマ細胞をも用い得る。多くのそのようなミ
エローマ細胞は公知であり、当業者に入手可能である。
細胞は混合され、遠心分離により沈澱され、1mlの35
％（vol/vol）ポリエチレングリコールを含むIMDMに37
℃で１分間ゆっくりかく拌し続け、再懸濁された。
37℃で３分間の培養後、上記細胞は再度沈澱させられ
10mlのIMDM＋HATにゆっくり再懸濁された。細胞は次に
１×106細胞/mlになるように完全培地＋HAT中へ希釈さ
れ、1mlの完全培地に５×105脾臓フィーダー細胞を含有
する24穴マイクロタイタープレート（1ml/穴）へ分散さ
れた。
ハイブリドーマ上清は、精製スポロゾイトを用いELIS
Aにより、スポロゾイト蛋白質を用いウェスタンブロッ
ティングにより、125Iラベルされたスポロゾイト表面蛋
白質を用い免疫沈降法により、及び精製スポロゾイト及
びスポロゾイト感染細胞を用い免疫蛍光により抗スポロ
ゾイト抗体が分析（アッセイ）された。ハイブリドーマ
は限界希釈によりクローン化された。
1.4 スポロゾイトELISA あらかじめ１％BSA含有pH7.0、PBSでブロックされた9
6穴Ｕ−底PVCプレートの各穴に精製されたスポロゾイト
（４×104）が加えられた。スポロゾイトは５分間1000
×ｇの遠心分離で穴の底へ沈降された。スポロゾイトは
100μの希釈抗血清又はハイブリドーマ上清中に再懸
濁され、連続かく拌しながら室温で２時間培養された。
スポロゾイトへ結合した特異的抗体の検出のためにパ
ーオキシダーゼ結合した抗−マウス（IgG）ヤギIgGが再
懸濁されたスポロゾイトへ添加され、懸濁液は室温で２
時間培養された。スポロゾイトは洗浄され、結合した抗
体は、基質溶液（ｏ−フェニレネジアミン0.4mg/ml含有
0.1Mクエン酸緩衝液、0.12％過酸化水素）を添加、室温
30分で可視化された。ファン嚢は、50mMメタビスルファ
イトナトリウム含有2.5M H2SO4を添加することで停止さ
れた。結合抗体量は基質呈色のOD488の読み取りにより
決定された。
細胞融合から培養された合計480のウエル（穴）の
内、432がハイブリドーマ成長に陽性であった。この
内、358のハイブリドーマが一次スポロゾイトELISAにお
いて抗体酸性が陽性であった。これらのもとの親ハイブ
リドーマ細胞の増殖及び継代中に、104の細胞は死滅す
るか、抗体産生を停止し、したがって、その後のスポロ
ゾイトELISA及びウェスタンブロットアッセイによるス
クリーニングでは陰性であった。スポロゾイトELISAに
より10×バックグランドレベルで抗体を産している205
のハイブリドーマが同定された。
1.5 スポロゾイト蛋白質のウェスタンブロッティング 精製されたスポロゾイト（約５×107スポロゾイトml/
gel）がLaemmliの試料緩衝液に可溶化され、12.5％ゲル
または、7.5から20％の勾配ゲル（Laemmil,supra）を用
いるSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、分
離され、電気泳動的にニトロセルロースシートへ移され
た。該シートは30％ゼラチンバッファー（３％ゼラチ
ン,Tris−HCl,pH7.5,0.15M NaCl）でブロックされ細片
に切断され、細片は希釈抗血清又はハイブリドーマ上清
と12時間４℃で１％BSA緩衝液（１％BSA,50mMリン酸ナ
トリウムpH6.5,0.5M NaCl,0.05％Tween−20）中で反応
させられた。細片はpH7.4,0.05％Tween−20PBS中で洗浄
され、特異的結合抗体は、パーオキシダーゼ結合抗マウ
ス抗体により検出された。結合抗体は基質溶液〔４−ch
loro−１−naphthol（10mlの氷温メタノール及び50mlの
Tris−HCl pH7.5中に30mg溶解された）、0.15M NaCl,0.
015％最終濃度H2O2〕を添加室温で30分で可視化され
た。反応は蒸留水で過度に洗浄することで終結された。
スポロゾイトELISAにおいて陽性であった抗体のうち、
可溶化スポロゾイト蛋白質で用いるウェスタンブロッテ
ィング分析によっても160が陽性であった。
ウェスタンブロット分析（第２図参照）により、モノ
クローナル抗体は３種類の反応性（ａ）単一のアイメリ
ア蛋白質（例、IIAI及びIIDI）に結合するもの、（ｂ）
２又は３の蛋白質（例、6A5及び20C6）に結合するも
の、及び（ｃ）多数の蛋白質（例、IIA5,13A6及び14B
5）に結合するもの、の一つにあてはまることが示され
た。
抗体は、更にE.テネラメロゾイト及びE.アセルブリナ
のスポロゾイト蛋白質を用いるウェスタンブロット分析
により特徴づけられた（第３図）。3A5,13A6,7D1,及び2
0C6を含む多数の抗体はE.テネラ及びE.マセルブリナの
スポロゾイトから単離された蛋白質及びE.テネラのメロ
ゾイトから単離された蛋白質を認識した。6A5のような
他の抗体は種及び段階特異的であり、E.テネラのスポロ
ゾイトにのみ結合することが示された。
いくつかの抗体について得られた結果の要約が第１表
に示されており、抗体の特異性は（ａ）抗体が結合する
ゲル中の蛋白質の起源及びサイズ、及び（ｂ）抗体で沈
降された125I−ラベルされたアイメリアテネラ蛋白質の
大きさの両者で示された（右欄）。抗体は更にアイソタ
イプにより表中で特徴づけられた。
・Spz及びMrzは、それぞれスポロゾイト及びメロゾイト
の略号である。
・Ｇ及びＭは、それぞれIgG及びIgMを示す。
・ｍは、24〜200kd以上のサイズの範囲の複数の蛋白質
と抗体が結合することを示す。
・N.Dで示される価は決定（定量）されなかった。
1.6125I−ラベルされたスポロゾイト表面蛋白質の免疫
沈降 精製されたスポロゾイトの表面蛋白質はIODOGEN法（P
ierce Chemical社）又はIODOBEADS（Pierce Chemical
社）を用いて125Iでラベルされた。後者の手法の場合、
４つのIODOBEADSは、pH7.5 0.2Mのリン酸ナトリウム溶
液で３度洗浄され、１−3mCiの125I−Naが添加され、室
温で５分間培養された。精製されたスポロゾイト（３×
108）を含む200μのPBS pH7.0が反応バイヤルへ添加
され、培養は15分間続けられた。培養終了時にフェニル
メタンスルフォニルフルオライド（PMSF）が最終濃度0.
5mMになるように添加された。
スポロゾイトは12,000×g 30秒の遠心分離により培養
混合液から回収され、２％SDS又は１％Triton X−100を
含むpH7.0 PBS中で可溶化された。不溶成分は12,000×g
3分間の遠心分離により除去され、該可溶化スポロゾイ
ト蛋白質は３のpH7.0 PBAに対し４℃でカットオフ分
子量3500の（透析）膜を用いて残留自由125Iを除去する
ために透析された。
125I−ラベルされたスポロゾイト蛋白質（典型的には
1.5×108cpmが蛋白質にとり込まれている。）は使用時
まで４℃で貯蔵された。TCAで沈降可能な放射能は典型
的には全放射能の95％を超えていた。125Iでラベルされ
たスポロゾイト蛋白質のSDSポリアクリルアミドゲル電
気泳動分析が図４左部分に示されている。
免疫沈降は、300μのハイブリドーマ上清又は希釈
抗血清を250μの125Iでラベルされたスポロゾイト蛋
白質（１×105cpm）を含有するBuffer I（0.25％NP−4
0,10mM Tris−HC1,pH7.5,0.15M NaCl）に添加すること
で行なわれた。４℃で16時間培養後、アガロース（Sigm
a Chemical社）にカップリングされた抗マウス ヤギIg
Gの50％懸濁液100μ−200μが添加され、混合液は
室温で２時間回転ミキサーで培養された。ビーズは12,0
00×ｇで１分間遠心分離して沈澱され、洗浄バッファー
（0.1％SDS,0.5％NP−40,0.2％デオキシコール酸ナトリ
ウム,10mM PMSF,10mM Tris−HC1,pH8.5,0.15M NaCl）で
３度洗浄された。
固相抗体に結合した125I−ラベル蛋白質ははずされ、
２×Laemli試料緩衝液を60μ添加し、95℃で３分間加
熱することにより変性された。免疫沈降させられた125I
−ラベルされたスポロゾイト蛋白質は12.5％ゲル中での
SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離さ
れ、オートラジオグラフィーにより可視化された。
免疫マウス血清を用いた免疫沈降アッセイの結果は図
４右欄に示されている。スポロゾイトELISAで陽性であ
ったハイブリドーマ抗体のうち、74が免疫沈降によって
も陽性であった。第５図に示されたようにハイブリドー
マ抗体は２つのカテゴリー、すなわち一つの蛋白質を沈
降させるもの（例、3C4,6A5,7D4,8A2,11D2及び20C6）、
及び２以上の蛋白質を沈降させるもの（例、12B2,15A3,
15C4及び19D6）にあてはまる。
1.7 精製スポロゾイトを用いる免疫蛍光分析 pH7.0PBS中の８室あるスライドガラスにスポロゾイト
（１×105）が添加され、37℃で12時間空気乾燥され
た。スライドは10％正常ヤギ血清を用い２時間、37℃で
ブロックされた。希釈された抗血清又はハイブリドーマ
上清が各々の室（チャンバー）へ添加され室温で２時間
培養された。スライドは洗浄され、ローダミンの結合し
た抗マウス抗体（PBS pH7.0,0.3％Triton X−100で希
釈）が室温で１時間添加された。スライドを洗浄後、結
合抗体は蛍光で可視化された。
抗体の大部分は表面膜及び／又は空気乾燥されたスポ
ロゾイトの屈折体（reflactile body）に対して特異的
免疫蛍光を示した。ある抗体はスポロゾイトの頂部末端
（apical tip）を強く染色し、残りのスポロゾイト表面
は（第６図、パネルＣ）はわずかに染色した。
空気乾燥した精製スポロゾイトは図６、パネルＡ、
Ｂ、Ｃ及びＤの左側スライドに示されている。精製スポ
ロゾイトは元通りであり、伸長しており、優性後部大屈
折体（PRB）及び前部小屈折体（ARB）を示した。そのス
ポロゾイト頂部端（Ａ）は、後部屈折体の反対側にあっ
た。完全スポロシスト（パネルＢ、左側）及び破壊スポ
ロシスト膜により調製物は若干コンタシ（汚染）されて
いた。
1.8 ELISA、ウェスタンブロット、免疫沈降及び免疫蛍
光の結果のサマリー 55のモノクローナル抗体の上記分析から生じた結果の
サマリーが第２表に示されている。
a. 示される価は、ウェスタンブロッティングで、抗体
により認識されるE.テネラスポロゾイト蛋白質又は、40
−150kd（M1）、120及び80−150kd（M2）並びに25及び4
0−150kd（M3）の分子量を持つ認識された蛋白質群の分
子量である。
b. ウェスタンブロットアッセイは、通常のE.テネラス
ポロゾイト蛋白質の1/5で行なわれた。したがって、陽
性反応を示す抗体は、高親和性を有している。
c. ウェスタンブロット反応性は、E.アセルブリナスポ
ロゾイト蛋白質に対して示されている。
d. ウェスタンブロット反応性は、E.テネラメロゾイト
蛋白質に対して示されている。
e. 免疫螢光分析（IFA）染色のパターンの結果は、空
気乾燥E.テネラスポロゾイトの間接分析として（１）表
面、（２）頂部、（３）パッチ表面、（４）ブライト表
面、（５）ライト表面、（６）拡散表面、（７）屈折体
及び（８）パンクテート染色として要約されている。
f. 免疫沈降において抗体により捕えられた125I−ラベ
ルされたE.テネラスポロゾイト蛋白質の分子量が示され
ている。
好適なモノクローナル抗体7D4,7D1,20D6,8A2,6A5及び
7B2,はこれらのモノクローナル抗体を分泌するハイブリ
ドーマの形でATCC 12301 Parklawn Drive,Rockville Ma
rylandブタペスト条約上の寄託をされ、それぞれ寄託番
号はHB 9707,HB 9708,HB 9709,HB 9710,HB 9711,及びHB
9712である。
1.9 インビトロ感染アッセイ 一次鶏ジン臓上皮細胞がDoran等のJ,Protozool25:544
（1978）の方法に従って樹立された、４−室のLab−Tek
slideで40−50％になるまで培養されたMDBK（Madin−D
arby bovine kidney）細胞（ATCC−CL 22）がニワトリ
ジン臓上皮細胞のかわりに用いられた。
細胞は50,000又は200,000の精製されたスポロゾイト
を接挿された。感染16時間目に細胞単層は細胞に侵入し
なかったスポロゾイトを除去するため数回洗浄された。
感染後3,16,24,48,64,96及び120時間目に100％メタノー
ル（室温で５分間）で代表的な接挿細胞培養物は固定さ
れた。固定されたスライドは、上述のように免疫螢光で
現象されるまでpH7.0,1％BSA含有PBS中に４℃で保存さ
れた。多様な抗体で得られた染色パターンは第７図に示
されている。
感染後３時間目と24時間目の間に、固定された培養物
は、細胞間にスポロゾイト（第７図、３時間目に7D4及
び19時間目に8A2）。その後、スポロゾイトは屈折体の
みへ退化した（7D4,60時間）。細胞内スポロゾイトの表
面及び頂部端は、7D4抗体（第７図、7D4,3時間目）で明
るく染色された。しかしこの抗体は感染された細胞の表
面は染色しなかった。
24時間後スポロゾイトは変性し始め、シゾント（分裂
前体）に発育し、次の48時間でシゾントへ成熟した。抗
体7D4は変性しているスポロゾイトと反応し続けたが未
成熟のシゾント（第７図、7D4,60時間）と反応しなかっ
た。しかしながら、シゾントが成熟するにつれ、シゾン
ト（第７図、7D4、100時間）内の構造物と7D4は反応し
始めた。これらの構造は、発育中のメロゾイトであり、
7D4抗体は成熟と放出されたメロゾイト（第７図、7D4,1
20時間）の表面抗原と反応し続けた。
このように7D4は、E.テネラスポロゾイト及びメロゾ
イト上に存在120kg膜抗原と同定した。
この抗原は、未成熟メロゾイトがシゾント中で発育す
るまで寄生虫発育のシゾント段階では発現されなかっ
た。
抗体14B1は抗体7D4のそれと類似の反応性パターン、
すなわち、細胞内スポロゾイト（第８図、14B1,16時
間）の表面及び頂部を染色し、細胞内スポロゾイトの直
接近接部における細胞質（サイトプラズム）を拡散染色
することを示した。14B1に認識された抗原は、成熟シゾ
ント（第８図、14B1,100時間）中の未成熟メロゾイトの
頂部及び成熟し放出されたメロゾイトの頂部（第８図、
14B1,120時間）に存在する。抗体7D4及び14B1により示
される染色パターンは類似している。しかし、これらの
抗体が認識する蛋白質はそれぞれ120kdと6kdと非常に異
なる分子量を有している。
しかしながら抗体7D4及び14B1は寄生虫の発育の大部
分の段階と反応するが他の抗体は表面抗原のみ（第７
図、15A3）又は細胞内スポロゾイト屈折体と反応し寄生
虫のシゾント又はメロゾイトの段階とは反応しない。
２つの独特な抗体、8A2及び19D6は感染分析により固
定された。8A2抗体は、スポロゾイトの表面（第７図C,8
A2,19時間）、発育中のシゾントの全ての段階（第７図
Ｃ、8A2,120時間）及び放出されたメロゾイトの表面
（第７図Ｃ、8A2,120時間）に存在する37kdの蛋白質と
反応する。7D4及び14B1抗体により認識される蛋白質に
は類似せず、37kd蛋白質は、寄生虫の細胞内での発育期
間中合成された。
抗体19D6は18kdスポロゾイト表面抗原蛋白質と反応す
るのみならず、スポロゾイト感染細胞（第８図、３時間
後19D6）の細胞質中の蛋白質とも反応した。19D6抗体に
より認識された細胞質内蛋白質は細胞感染後スポロゾイ
トにより出されたものかもしれない。というのは、未成
熟シゾント発育中には上記蛋白質は消失し、成熟したシ
ゾント及び放出されたメロゾイト中に再び現われるから
である。
E.テネラの感染を生きのびた、ニワトリからの抗体血
清は7D4抗体の染色と同様なパターンで、細胞内スポロ
ゾイトの頂部端及び表面を染色する（第８図Ｂ免疫ニワ
トリ血清,3時間）が、しかし、細胞内スポロゾイトの屈
折体は染色しない。
スポロゾイトに感染したニワトリ腎臓細胞を用いる免
疫螢光研究は、（ａ）スポロゾイト（例えば200kd以上
及び28kdの蛋白質でそれぞれ7B2及び6A5により認識され
るもの）に特異的で、（ｂ）細胞内寄生体のすべての段
階（例えば8A2により認識される37kd蛋白質）にみら
れ、そして（ｃ）スポロゾイト及びメロゾイトに特異的
であるがシゾント（例えば120kd及び6kdの蛋白質でそれ
ぞれ7D4抗体及び14B1抗体により認識されるもの）には
特異的ではない抗原と確認された。
1.10 インビトロでのスポロゾイト中和分析 SchmatzらのJ.Protozool 33:109（1986）の方法の一
修正手法において、MDBK細胞はトリプシン処理され、１
％FBSを追加した最小限必須培地中に7.5×104細胞/mlの
濃度で懸濁された。マイクロタイタープレートの各々の
穴（組織培養処理された96穴）へ1.5×104の細胞が添加
され、40℃で48時間培養された。精製されたスポロゾイ
トは単層細胞への感染に先だち、40℃で１時間抗体と前
処理されるか、又は未処理で放置された。抗体（組織培
養物、腹水又は抗血清のいずれか）は、pH7.0 PBSに対
して十分に透析され、56℃30分間熱失活させられ、使用
前に除菌濾過された。
感染直後、〔5,6〕−3H−ラウシルが最終濃度５μCi/
mlとなるように全穴に添加された。感染19時間後、上記
培地は除去され、培養物はPBSで一回洗浄された。
上記細胞はトリプシン−EDTAで40℃15分間処理するこ
とではがされ、ガラスファイバーフィルター上へ集めら
れた。
上記フィルターは乾燥され、シンチレーション液体
（READY−SOLV New England Nuclear）上に置かれ、
結合放射能がカウントされた。抗体のスポロゾイト侵入
及び又は発育の阻害能力は、抗体処理されたスポロゾイ
トで感染された細胞と比較した。未処理スポロゾイトで
感染された細胞へ取り込まれた放射能により定量され
た。
スポロゾイトは、また対照抗体、バッファー又はラサ
ロシド（lasalosid）、つまり静球虫剤で前処理され
た。ラサロシドは、MDBK細胞中におけるスポロゾイトの
発育を完全に阻止し、3H−ウラシルの取り込みを大きく
低下させた。
結果は、第９図に示されている。7D4抗体（□） 8A2抗体（○）、及び14B1抗体（●）は、感染MDBK培
養物への3H−ウリジンの取り込みを大きく阻害した。6A
5（■）抗体あまり有効ではないが、いくらかの阻害を
示した。
バッファー（△）及び対照抗体（×）で処理では阻害
を起こさなかったが、ラサロシド（×）は実質的に完全
な阻害を起こした。
2.cDNA発現ライブラリーの作成 2.1 胞子形成した接合子嚢の調製 ３週令のニワトリ（ヒュバードクロス，アビアンサー
ビスフレンチダウン，ニュージャージー,U.S.A）から。
一羽につき、50,000 E.テネラの胞子形成接合子嚢で経
口接種した後７日目に盲腸が除去され、蒸留水を用いワ
ーリングブレンダー中で１分間ですりつぶされた。
容量は蒸留水で１に調整されペプシン（シグマケミ
カルCo.セントルイス，ミズリー,U.S.A.）が3g/にな
るように加えられた。pHは濃塩酸で2.0に調整され、混
合物は２〜３時間、即ち単一の接合子嚢懸濁液が得られ
るまで、39℃で培養およびかく拌がなされた。消化後、
10N NaOHによりpHを8.0に調整し、３の蒸留水を添加
した。混合物は沈澱のため一晩放置された。上清は取り
除かれ沈澱は上清が透明になるまで洗浄された。接合子
嚢は室温で蒸留水中で懸濁物に泡だて通気することで胞
子形成させられた。胞子形成は、24時間後RNA調製のた
めに停止された。
2.2 胞子形成接合子嚢mRNAの単離 全RNAは、マニアティス（Maniatis et al）らの前述
文献p196に記載された、グアニジニウム／塩化セシウム
法の修正法により調製された。接合子嚢はPBS（0.15M N
aCl,20mMリン酸ナトリウム,pH7.9）で洗浄され、そして
5Mグアニジニウムイソチアシアネート,50mM Tris−HCl,
10mMエチレンジアミンテトラアセテート（EDTA）,0.5％
サルコシル（Sarkosyl:N−ラウロイルサルコシンナトリ
ウム，シグマケミカルCo.）及び0.1Mβ−メルカプトエ
タノールを含有し、５μのアンチフォームＡ（ユニオ
ンカーバイド，ダンブリー，コネチカットU.S.A.）又は
他の消泡剤が好適には添加された溶液10ml中でゆるやか
に渦流かく拌を行ない再懸濁された。細胞懸濁液は、顕
微鏡で観察した時、接合子嚢が良好に破壊されたと見え
るまで上記細胞懸濁液はホモゲナイズされた。
不溶細胞断片は低速遠心分離により除去され、ホモジ
ネートは４分画に分けられ、12mlのポリカーボーネー
ト、遠心管中で5.7M CsCl,0.1M EDTA,pH7.5の溶液1.2ml
の上へ重層された。遠心管はベックマンSW 50.1ロータ
ー中で4000rpmで15℃17時間遠心された。上清液体は捨
てられ、遠心管壁は乾燥せられ、ペレットは200μg/ml
のプロテインキナーゼ（ベーリンガーマンハイム）を添
加した、10mM Tris−HCl,1mM EDTA,1％ドデシル硫酸ナ
トリウム（SDS）,pH7.5溶液1.25ml中に再懸濁させた。3
7℃で30分間培養後、上記溶液はフェノールで３回抽出
された。最終水相中のRNAは、エタノールで３回沈澱せ
られ、1mlの水に溶解せられた。
ポリアデニル酸化（ポリ（Ａ）＋）RNAは、マニアテ
ィス（Maniatis）ら前述文献p197に記載されたオリゴ
（dT）−セルロースカラム（ファルマシアファインケミ
カル）上で全RNA 2mgを２度通過させて調製された。ポ
リ（Ａ）+RNAはエタノールで２度沈澱され、水200μ
に溶解された。生成量は260nmのODから測定された所、
約26μｇであった。
2.3 メロゾイトの調製 E.テネラのメロゾイトは、一羽につき50,000の前述胞
子形成接合子嚢で感染後５日目に、50匹の感染ニワトリ
（３週令、ヒュバードクロス，トリ（アビアン）サービ
スフレンチタウム,NJ）の盲腸から得られた。
盲腸は取り出され、リン酸緩衝塩溶液（PBS）でマグ
ネチックスターラーを用い15分間洗浄された。
上皮破片は、低速度遠心分離により部分的には除去さ
れ、粗メロゾイトは2000×g 4℃10分間の遠心分離によ
り回収された。沈澱は、溶解バッファー（8.29g/ NH4
Cl,0.372g/ Na2 EDTA,1.0g/ KCO3,pH7.6）に再懸濁
され、氷上で30分間培養された。
メロゾイトは、遠心分離により回収され、PBSで一度
洗浄され、分離用ロート中に紡糸ナイロンファイバー
（スクラブナイロンファイバーフェンウォールラバラト
リーU.S.A.イリノイ州、ディアフィールド）1gを含有す
るカラムを通過させられた。メロゾイトは前述のよう
に、遠心分離で回収され、RNA単離のためにドライアイ
ス上で凍結されるか、または更にジエチルアミノエチル
セルロース（DEAE,ワットマンDE52,ワットマン,U.S.A.
ニュージャージー州、クリフトン）中でウェスタンブロ
ット分析のために精製された。
DEAEセルロースでの精製のため、約１×109のメロゾ
イトがPBS中で10mlのベット容量のカラムにかけられ、P
BSで溶出された。メロゾイトは、最初の100mlの実質的
に赤血球や他の細胞破片のない、溶出液中に回収され
た。
2.4 メロゾイトmRNAの単離 １×109〜１×1010の個体を含有する冷凍メロゾイト
ペレットは1mMのジチオスレイトール（DTT）及び300単
位のRNasin（プロメガバイオテック，マジソン，ウィス
コンシン,U.S.A.）を含有するTEL/SDSバッファー（0.2M
Tris−HCl,0.1M LiCl,25mM EDTA,1％（w/v）ドデシル
硫酸ナトリウム（SDS）,pH8.8）10ml中へ溶解され、テ
フロンコートされた組織ホモゲナイザー中で10−12スト
ロークでホモゲナイズされた。不溶破片は、冷却下3000
×ｇで遠心分離により分けられた。上清液体はTELバッ
ファーで平衡化されたフェノール：クロロフォルム：イ
ソアミルアルコール（24:24:1,v/v）で２回で抽出され
た。
水相は、プロティナーゼK 1000μg/mlで37℃30分間消
化（分解）され、同量のフェノール：クロロフォルム
（1:1）で再抽出され、核酸は２倍容量のエタノールで
ドライアイス上で１時間、又は−20℃で一晩で沈降され
た。ペレット（沈澱）は、10,000×g 1時間の遠心分離
後、TE（10mM Tris,pH7.5,2mM EDTA）中に再懸濁され、
20時間15℃で、150,000×ｇで4mlのCsClクッション（5.
7M CsCl,0.1M EDTA）を通し回転された。
RNAの沈澱は0.2M酢酸カリウム溶液から2.5倍容量のエ
タノールで再沈降された。この全RNAはアニアティス前
述文献p197に記載されたようにポリ（Ａ）+RNAを濃縮す
るためにオリゴ−dTセルロース上を一度通過させられ
た。典型的には、５×109のメロゾイトからの全RNA 1.9
mgの産量には、約20μｇのポリ（Ａ）+RNAを含有してい
る。
2.5 接合子嚢及びメロゾイトのcDNAの合成及びファー
ジベクターへの挿入 ２本鎖cDNAは、胞子形成している接合子嚢ポリ（Ａ）
+6μｇから、グブラー（Gubler）らによりGene 25:263
（1983）に記載された方法で、オリゴ（dT）プラノマー
から伸長させるための逆転写酵素（BRL）及び相補鎖を
合成するためのE.Coli DNAポリメラーゼＩ（ニューイン
グランド バイオラブズ）を用いて、合成された。２本
鎖cDNAはT4 DNAポリメラーゼ（BRL）で非付着性ブラン
ト末端化され、そしてEcoR Iメチラーゼ（ニューイング
ランド バイオラブズ）で処理後EcoR Iリンカー（GGAA
TTCC,コラボレーティブリサーチ）が、製造元のプロト
コールにしたがって、付加された。
このようにして調製されたcDNAをEcoR Iで（切断）消
化した後、ヒュン（Huynh）らによりディー・グローバ
ー（D.Glover）編DNAクローニング巻１、実際的アプロ
ーチ、1985、IRLプレス，ワシントン,D.C.p49−78に記
載されたように、λgt11（ストラジーンクローニングシ
ステムズ，サンジェゴ，カリフォルニア,U.S.A.）中に
ライブラリーが調製された。EcoR I cDNA断片は、EcoR
Iで分解（切断）し、脱リン酸化したλgt11の腕（スト
ラタジーンクローニングシステムズ）へ結合（ライゲー
ト）された。得られたDNAはGigapack キット（スラタ
ジーンクローニングシステム）で、製造元のプロトコー
ルにしたがい、ファージ中へパッケージされた。
得られたライブラリーは、Y1088の宿主細胞（ATCC N
o.37195）上でプレーティングすることにより増幅させ
られた。組換えの比率は、（マニアティス、前述文献、
p24）イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
（IPTG,シグマケミカルCo.）の存在下で、Ｘ−galプレ
ート上で青と無色のプラークの比から約90％と見積られ
た。
メロゾイトポリ（Ａ）+RNAの２本鎖cDNAのコピーは、
実質的には、上述のように合成された。変性ゲルでの移
動から判断して〔ベイリー（Bailey）らAnal,Biochem,7
0:75（1976）〕、ライブラリーの構築に用いられた２本
鎖cDNAは約200〜4,500塩基対を含む。
メロゾイトcDNAはメチル化されCCGAATTCGGリンカー
（コラボレイティブリサーチ）が用いられた点を除いて
は、先述のように、EcoR Iリンカーへ結合された。EcoR
Iでの分解（切断）の後、cDNAはBiogel A−50M中で過
剰のリンカー分子、及び約300b.pより小さいcDNAを除去
するためにHuynhらの前述の文献に記載されたように、
分画された。
cDNAはλgt11の腕へ結合され、先述のように、上記DN
Aは、ファージへパッケージされた。得られたライブラ
リーは、約50,000のファージを含んでおり、Y1088宿主
細胞上でプレーティングすることにより増幅させられ
た。IPTG存在下でのＸ−galプレート上でのプラーク分
析により約90％の組換えが示された。
3.cDNAライブラリーの免疫学的スクリーニング λgt11メロゾイドcDNA発現ライブラリーは、150mmプ
レートあたり10,000プラークの濃度でY1090細胞（ATCC
No.37197）上へプレートされた。６枚の上記プレート
は、42℃で3.5時間培養され、β−ガラクトシダーゼ融
合蛋白質の発現を誘導するために、あらかじめ10mM IPT
Gに浸たされたニトロセルロースフィルターで重層さ
れ、37℃で更に４〜５時間から１晩培養された。フィル
ターは、プレートから取り除かれTBS（20mM Tris,pH8.
0,0.5M NaCl）で数回のバッチ式洗浄に付された。非特
異的な蛋白質結合部位は、20％牛胎児血清含有TBSで４
℃でロータリーシェーカー上で２〜４時間培養すること
でブロックされた。
メロゾイト抗原と反応することが公知の９種のモノク
ローナル（7D4,7D1,20C6,13A6,20C1,11B6,3A5,13A1及び
15B2と命名）のための腹水がプールされ、最終容量100m
l中に20％FCS、0.15M NaClとなるよう調整され、ペトリ
皿あたり２フィルターの割合で、ペトリ皿中の各々のフ
ィルターに注がれた。フィルターは、一次モノクローナ
ル抗体プールと４℃で一晩ロータリーシェーカー上で培
養された。非結合抗体は、室温で、TBSでフィルターを
５〜６回洗浄することにより除去された。結合抗体は、
ホークス（Hawkes）ら、Anal.Biochem 119:142（1982）
に記載されたように、フィルターをホースラディシュペ
ルオキシダーゼ（HPOD）結合（ベーリンガーマンハイ
ム）抗−マウスヤギ抗体とフィルターを培養し、次に3m
g/mlの４−クロロ−１−ナフトール（バイオラッド）及
び0.018％H2O2を用い発色させることにより検出され
た。
初期の高濃度スクリーニングで同定された陽性プラー
クは、同じモノクローナル抗体プールを用いる２次スク
リーニングでプラーク精製された。各々の陽性のもの
は、陽性のものを多重グリッドアレイにプレートし、そ
の各々がIPTGで誘導され、ニトロセルロースに移され、
上記プールからのモノクローナル抗体の一つと培養され
た。λm2−４と命名された一つの陽性ファージは、上記
プール中の８つの抗体の内３つの抗体、すなわち7D1抗
体、7D4抗体及び20C6抗体により認識されると同定され
た。
最初のスクリーニングには、6A5,7B2,15A3,及び20C6
抗体を含むモノクローナル抗体を用いられ、２次スクリ
ーニングでは、7B2,15A3,20C6,及び8A2が用いられ、15A
3,7B2及び20C6が３次スクリーニングでは用いられ、培
養バッファーが更に0.05％のtween−20〔ポリオキシエ
チレン（20）ソルビタンモノラウリル酸）を含有する点
を除いて、胞子形成接合子嚢cDNAライブラリーのスクリ
ーニングにも同様な方法が用いられた。このようにし
て、λS1−３、λS1−４及びλS1−7;λS2−１、λS2−
４及びλS2−5;並びにλS3−１と命名された。それぞれ
モノクローナル抗体6A5,8A2及び7B2により認識されるプ
ラークが接合子嚢のcDNAライブラリー中に同定された。
6A5抗体と反応する蛋白質を産生するファージから作ら
れたDNAがEcoR Iによる消化（切断）及びアガロースゲ
ル中での電気泳動（マニアティス（Mgniatis）ら、前述
文献p150）により分析された。ほぼ1150、890及び615の
塩基対のサイズを持つ３つの異なる挿入部がこのように
して発見された。
4. 大腸菌中でのアイメリア（EIMERIA）遺伝子の発現 ファージλS1−７とλS1−３からの1.1Kbと0.9kb Eco
R I DNA分子がそれぞれ分離され、そして３つの可変読
み枠発現ベクター、すなわちpEV−vrf1、pEV−vrf2及び
pEV−vrf3、のそれぞれのEcoR Iの部位に挿入された。
これらのベクターはGene 38:31（1985）にCrowl等によ
って述べられているようにして組み立てられた。両方の
可能な方向づけでそう入物を含むプラスミドが、Bernar
d等によって述べられている〔Methods in Enzymology 6
8:482（1979）〕適合するプラスミドpRK248cItsを保持
する大腸菌株MC1061中に、Mandel等によって述べられて
いる〔J.Mol.Biol,53:159（1970）〕ようにしてトラン
スフォームされた。菌株MC1061とプラスミドpRK248cIts
はATCC（American Type culture Collection）に寄託さ
れておりそれぞれ受け入れ番号ATCC 33766及び53338が
付与された。
細菌のトランスフォーマント（形質転換体）は0.5％
のグルコースと0.5％のカザミノ酸を含有するM9培地〔M
aniatis等、上記、68ページ〕中30℃で生育させられ、
λPLプロモーターでの転写を誘発させるために、Crowl
等、上記、によって述べられているようにO.D.（550m
μ）が0.5の時点で42℃に変えられる。２〜３時間の培
養（incubation）の後、1mlの試料を取り、そして試料
中の細胞は遠心分離により集められた。細胞のペレット
はCrowl等、上記、によって述べられているように取り
扱われ、そのリゼートはLaemmli等、Nature 227:680（1
970）、によって述べられているようにドデシル硫酸ナ
トリウム（SDS）ポリアクリルアミドゲル電気泳動にか
けられた。電気泳動に続いて、ゲル中の蛋白質はクマシ
ー（Coomassie）ブリリアントブルーで着色されたか、
又は6A5モノクローナル抗体及びヤギ抗−マウスHPODコ
ンジュゲート（Conjugate）を検出のために使用する、
ウェスタン・ブロット分析〔Towbin等、Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 76:4350（1979）;Burnetti,Anal.Biochem.11
2:195（1981）〕のためのニトロセルロース膜に移され
た。
この分析は、ベクターpEV−vrfl中の１方向での0.9kb
cDNA分子が6A5抗体と反応する20kbの蛋白質を生産する
ということを示していた。1.1kb分子に関しては、それ
が多分５′側をコードしていない（５′non coding）配
列を含んでいるためであるが、発現は観察されなかっ
た。この蛋白質の生産を最も効果的にするために、種々
の発現培地が試験された。より好適な培地はリットル
（±10％）当りKH2PO4 6.0g,K2HPO4 4.0g,（NH4）2SO4
5.0g,MgSO4−7H2O 3.5g,酵母抽出物21.0g,バクトトリプ
トン（Bacto Tryptone）3.5g,LB625アンチフォーム（An
tifoam）1.0ml,グルコース25g,チアミン−HCl 70mg,ビ
タミン溶液〔GIBCO MEM（100X）ビタミン溶液〕2.5ml及
び微量元素1.0ml、を含有していることが明らかとなっ
た。Union Carbideの製品であるLB625アンチフォームは
37.8℃で625セイボルトユニバーサルセコンド（Saybolt
Universal Seconds）の粘度を有するエチレンとポリプ
ロピレンオキサイドの線状ポリマーである。
発酵ブロス１リットル当りのビタミンはＤ−Caパント
テン酸塩、塩化コリン、葉酸、ニコチンアミド、ピリド
キサール−HCl及び付加的なチアミン−HClのそれぞれ0.
25mg;i−イノシトール0.50mg;及びリボフラビン0.025mg
を含有していた。ブロスリッター当りの微量元素は、Fe
Cl3−6H2Oを2.7mg,ZnSO4−7H2OとCuSO4−5H2Oのそれぞ
れを0.8mg;CoCl2−6H2OとNa2MoO4−2H2Oのそれぞれを0.
7mg;H3BO3を0.2.mg;そしてMnSO4−H2Oを0.5mg含有して
いた。
ファージλm2−４によって発現された免疫反応性（im
munoreactive）蛋白質の性質は、許容（30℃）及び非許
容（42℃）温度での差別的な生育によって、Y1090細胞
の感染から分離されたライソジェン（lysogen）中にお
いてまず、研究された。このライソジェンによって合成
された蛋白質のウェスタン・ブロット分析のために、50
mlの培養物（culture）はLB培地〔Maniatis等、上記、6
9ページ〕中、30℃でO.D.（550mμ）が0.5になるまで生
育させられ、ファージの複製を誘発するために42℃に変
えられた。42℃で15分後、IPTGを10mMになるように加
え、培養を37℃で30分間継続した。細胞は４℃で遠心分
離によって集められ、そしてLaemmliの試料緩衝液（0.1
25Mトリス、pH6.8,1％（w/v）SDS,1.4M β−メルカプト
エタノール、0.01％ブロモフェノールブルー（W/V）、2
0％（v/v）グリセロール）中、５分間煮沸することによ
って分離させられた。
培養物の1.0mlの同等物が12.5％SDS−ポリアクリルア
ミドゲル中で電気泳動法によって分析され、電気泳動法
的にニトロセルロース移行させられそして、λm2−４フ
ァージを確認する３つのモノクローナル抗体（7D1,7D4
及び20C6）のプールを上記したようにしてプローブ（pr
obe）させた。ウェスタンブロットの発展は、誘導した
ライソジェン（第10図、パネルＢ、レーン２）中に存在
する150kdサイズよりも大きい融合蛋白質を明らかにし
た。β−ガラクトシダーゼに特異的な抗体もまたこの高
分子量の蛋白質と反応し、そして約114kdの蛋白質；す
なわち、β−ガラクトシダーゼのみの期待されるサイズ
（第10図、パネルＡ、レーン２）である、に反応を示し
た。
ファージλm2−4 DNAはEcoR Iで消化され、1.7kb DNA
分子が生成した。この分子は、プラスミドpEV−VRF1、
２及び３〔Crowl等、上記〕を含有するEcoR I−線状化
プラスミドプール中にサブクローン化され、そして、上
記したようにして、プラスミドPRK248cItsを含む大腸菌
菌株MC1061中に形質転換させられた。形質転換体は、λ
m2−４ライソジェン中、融合蛋白と反応することが示さ
れた３つのモノクローナル抗体のプールを使用して、温
度誘発での免疫反応性の蛋白質の発現に対して、選抜さ
せられた。免疫反応性の組換え蛋白質は更に、大腸菌溶
解物（lysates）のウェスタンブロット分析により、３
つのモノクローナル抗体の１つ、すなわち7D4をそのプ
ールから用いて特徴づけられた。陽性のコロニーのそれ
ぞれがSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析によ
って決定されるように、望みの1.7kb挿入物を有するプ
ラスミドDNAを含有していること、及び誘発に基づく約6
5kdの蛋白質の合成を命令していることがわかった。
この65kd蛋白質の発現は生育培地及び誘発のためのプ
ロトコール中、変化に対して比較的非感受性であること
がわかった。この蛋白質は、細胞ペレットの音波粉砕の
あとで表面部（supernatant）中で定量的に回収され
た。
1.7kbの挿入物を含む発現プラスミドは、組換え蛋白
質（recombinant protein）の後の生産に使用された。
そして、第11図に図式的に示されている。このプラスミ
ドは、λcI857（Arber等、in Cold Spring Harbor Mono
graph,Lambda II,1983、Hendrix等,Eds.,Cold Spring
Harbor Laboratories,Cold Spring Harbor,p450、によ
って示されているようにλファージライソジェンの発生
に対する標準方法を用いることによって調製される）に
対し溶原性（lysogenic）であるMC1061宿主細胞中で、3
0℃でプラスミド中のPLプロモーターの抑制状態を維持
するために増殖させられた。
同様な方法を用いて、約1.1kbを有する胞子分裂する
（sporulate）接合子嚢（oocyst）のcDNAの断片によっ
て、コードされた28kd蛋白質の発現が行なわれた。この
蛋白質はモノクローナル抗体8A2に特異的に接合する。
約1.2kbの胞子分裂する接合子嚢のcDNAによってコード
された45kd蛋白質の発現も又実施された。この蛋白質は
モノクローナル抗体7B2に特異的に結合する。
5. DNA配列分析 一般的に、標準の一晩の培養物の1mlからのプラスミ
ドDNAの小規模の分離はBirnboim等〔Nucleic Acids Res
earch ７:1513（1979）〕の操作を用いて行なわれた。
この操作は分析目的のために細菌のコロニーからの小量
のDNAの分離を考慮に入れている。プラスミドDNAのより
多量のものは、塩化セシウム遠心分離によって、標準プ
ロトコールの後に１培養物を用いて調製される。〔Ma
niatis等、上記、93ページ〕。
胞子分裂する接合子嚢ライブラリーからのcDNAsのDNA
配列は、スミス等、Cell 16:753（1979）及びWallace
等、Gene 16:21（1981）によって、２重らせんプラスミ
ドDNAが修正されたとおりに、Maxam等、Methods in Enz
ymology 65:499（1980）、の化学的開裂法によって、ま
たSanger等、Proc.Natl,Acad,Sai.USA 74:5463（197
7）、の鎖−終結方法によって決定された。鎖終結のた
めのプロトコールにおいて、７−デアザ−dGTP〔Barr
等、BioTechniques ４:428（1986）〕は、Ｇ−Ｃの圧縮
加工物（compression artifacts）を除去するために、d
GTPで置換させられた。
配列分析を容易にするため、λS1−７からの1.1kb Ec
oR IはプラスミドpEV3−SEQ（第12図）に移された。こ
のプラスミドはpEV−rvf3のEcoR I部位に隣接するポリ
リンカーを有している。このポリリンカーは、エキソヌ
クレアーゼIIIで一方向の削除を生じさせるためにBamH
IとKpn I部位でプラスミドを線状化するために使われた
〔Henikoff、Gene 28:351（1984）〕。ポリリンカー中
のXba I部位は、Maxam−Gilbertの削除の配列比に適す
る３′−末端のラベル化のために使用される。そして、
プライマーCGGTCGACTCGAGCCAはサンガーの配列化のため
に用いられた。このプライマーは、Maniatis等、上記、
122ページ、によって述べられているように、〔γ32P〕
ATP（ICN）とポリヌクレオチドキナーゼを用いてその
５′末端を32Pでラベルされた。
第13図は、Maxam−Gilbert配列化のために使用する、
1.1kb EcoR I分子中の制限部位を示している。0.9kb分
子中のEcoR I部位の位置もまた示されている。それは、
これらもまた使われるからである。エキソヌクレアーゼ
IIIで作られた削除の末端の点もまた示されている。こ
れらは、Maxam Gilbert法によるpEV3−SEQポリリンカー
中のXba I部位からのか、又はSanger法による、プライ
マーの伸長（第12図）を用いて、配列化された。完全な
cDNAの両方のスタンド（stands）は、これらの方法の１
又は両方によって、配列化された。DNA中の高いＧ−Ｃ
含有量のために、Maxam−Gilbert反応は通常、８％と15
％のポリアクリルアミド−尿素ゲルで分画させられた。
プライマーの伸長は、ポリ（Ａ）+RNAの1.5.μｇを、
５′−末端をラベルした合成オリゴヌクレオチドプライ
マー、GAGGTCTGCCATTTTGC、の2pmolesとともに、42℃で
60分間、Tris−HCl 50mM,pH8.0,MgSO4 8mM,NaCl 0.1M,
ジチオトレイトール2mM,それぞれのデオキシヌクレオチ
ドトリリン酸（dNTP、Pharmacia Fine Chemicals）の2m
M、RNasin（Promega Biotec,Madison,WI）20単位及びAM
V逆転酵素（Pharmacia,Piscataway,NJ,FPL Cpure）20単
位、中でインキュベートすることによって行なわれた。
生産物は、配列分析のために用いられる８％アクリルア
ミド−尿素ゲル中で、分子サイズマーカーとして32P−
ラベル化のHpaI I消化PBR322 DNAを用いて、分析され
た。
配列分析のために、最初の生産物はゲルから溶出さ
せ、Maxam等、上記、の化学的開裂法によって分析され
た。または、ddNTPsが伸長反応において、使用された。
〔Tolan等、J.Biol,Chem,259:1127（1984）,Graves等、
J.Biol,Chem,261:11409（1986）〕。反応は８％ポリア
クリルアミド−尿素ゲル中で分析された。
1.1kb cDNA分子のヌクレオチド配列は第14図に示され
ている。0.9kb分子の配列は、塩基188から塩基1082ま
で、この、より大きい分子内で伸長する。このヌクレオ
チド配列の開放読み枠（openreading frame）分析から
予測されるアミノ酸配列は、第15図に示される。第15図
に示される予測されるアミノ酸配列の正確さは、次のよ
うにして確認された。
第15図の残基41−54と145−164に対応するアミノ酸配
列を有する、合成ポリペプチドが調製された。これらの
ポリペプチドの両方に対して集められた（raised）ウサ
ギ抗血清が、全スポロゾイト蛋白質と0.9kb cDNAを発現
する大腸菌のリゼートの両方のウェスタンブロット分析
において使用された。そのポリペプチドの両方に対する
抗体が、ウェスタンブロットの両者において蛋白質に結
合した。
同様な方法を用いて、ファージλm2−４中に65kdの蛋
白質をコードする1.7kb挿入物のヌクレオチド配列が、
第16図に示される結果を用いて決定された。このDNA配
列によってコードされた蛋白質の予測されたアミノ酸配
列が第17図に示されている。この配列は、下記のように
して、発現された65kb蛋白質のトリプシン消化によって
製造されたポリペプチドに対して行なわれたアミノ酸配
列分析によって確認された。これらのペプチドの幾つか
に対応する全部のアミノ酸配列中の領域が第17図でアン
ダーラインされている。
奇妙ながら、1.7kb分子に対する、DNA配列開放読み枠
は、約33,349タルトンの蛋白質をコードしていることが
期待されそうである。然し、このDNA断片からの発現生
産物は、約65kdの明らかな分子量によってSDSゲル中を
移動する。予測されたものを観察された蛋白質サイズの
間の、この相違の理由はわかっていない。この蛋白質
は、ここでは「65kd」蛋白質と呼ぶ。
同じような態様で、モノクローナル抗体8A2によって
認識された28kd蛋白質をコードするcDNA分子のヌクレオ
チドと予測されたアミノ酸の配列が、第18及び19図にお
いて、それぞれ示される結果によって決定された。
同じように、1.2kb 7B2 cDNAのヌクレオチドと予測さ
れたアミノ酸の配列が決定された。連続する開放読み枠
が見つかり、スポロゾイトから免疫沈降によって分離さ
れた蛋白質が200kdよりも大きかったことから、プロー
ブとして、1.2kb cDNAを用い、そのライブラリーは、よ
り大きいcDNAsに対してふるい分けられた。
このようにして第20図及び21図にそれぞれ示されるヌ
クレオチドと予測されるアミノ酸の配列とを有してい
る。3.2kb cDNAが得られた。
6. 65kd蛋白質の精製と特性記述 6.1 蛋白質の精製 pEV/2−４発現プラスミドを有する大腸菌MC1061（pRK
248cIts）の高細胞濃度発酵が、10発酵槽で、1.5×Ｍ
−９培地中において、許容される温度で約４時間の生育
の後、上記したようにして、温度誘発の標準プロトコー
ルを用いて、行なわれた。細胞塊は誘発の後５時間収穫
され、細胞ペースト500gをもたらした。
大腸菌細胞ペースト50gがTris−HCl 10mM,EDTA 5mM,p
H8.0の500ml中に均一に懸濁させられ２時間２−８℃で
撹拌させられた。
懸濁液は、ガウリン（Gaulin）ホモゲナイザー（APV
Gaulin,Everett,Massachusetts,U.S.A）を7,000psiで２
〜３回通過させた。細胞リゼートは、ソルバル（Sorval
l）RC−５遠心分離機で１時間24,000×ｇで遠心分離し
た。そして、そのペレットは捨てた。固形の硫安が上清
液（最終濃度80％）になるよう加えられた。これは、４
℃に２時間保たれ、24,000×ｇで１時間遠心分離させら
れた。そのペレットは20mMリン酸カリウム,pH6.8,中に
溶解させられた。遠心分離後、上清液は20mMリン酸カリ
ウム,pH6.8,に対して透析させられた。
ファーマシアグラスカラム（5cm直径×10cm長さ）
は、Ｐ−DE200 （200オングストローム、40−60μｍ、
弱アニオン交換、Separation Industries、Metuchen,N
J）シリカ支持体で詰められた。ゲルは20mMリン酸カリ,
pH6.8,で平衡にさせられた。試料が加えられ（10ml/mi
n）、平衡緩衝液で洗浄させられ、0.4M NaCl,pH6.8,を
含有する20mMリン酸カリで溶出させられた。カラム分画
は、65kd蛋白質を検出するために抗体7D4を用いてウェ
スタンブロットによって分析された。
免疫アフィニティカラムが、65kd蛋白質を更に精製す
るために使用された。このカラムのための吸収剤は、モ
ノクローナル抗体7D4をNuGel P−ポリアルデヒド （50
0オングストローム、40−60μｍ、Separation Industri
es,Metuchen,New Jersey,U.S.A.）シリカ支持体上に固
定化することによって調製された。固定化の操作は次の
工程を含む：ポリアルデヒド支持体10gが懸濁化され、
0.1Mリン酸カリ,0.1M NaCl,pH6.8で洗浄され、8mg/mlの
蛋白質濃度に対してモノクローナル抗体20mlを含むエレ
ンマイヤーフラスコに定量的に移した。ソディウムシア
ノーブロハイドライド（Sodium cyanoborohydride）（4
mg）がその後懸濁液に添加された。混合液は４℃で、16
時間ゆっくり振られた。ゲルは濾過され0.1Mリン酸カリ
ウム,0.1M NaCl,pH6.8,で洗浄された。プールされた濾
過物は、結合していない抗体が調査された。結合密度
（Binding density）は支持体の8mg/gであった。結合し
ていない活性化部位は、そのゲルを1Mエタノールアミ
ン、pH7.5の20ml中に懸濁させることによって封鎖され
た。ソディウムシアノボロハイドライド（Sodium cyano
borohydride）（4mg）が懸濁液に加えられ、それは４℃
で16時間撹拌された。ゲルは集められ、冷却カップリン
グ緩衝液で徹底的に洗浄された。
免疫アフィニティクロマトグラフを行なうために、カ
ラム（1mc×10cm）は固定化した7D4抗体で詰められ、0.
1％トライトン（Triton）Ｘ−100を含有する冷却リン酸
緩衝化含塩物（buffered saline）（PBS）で平衡化され
た。65kd蛋白質を含有するNuGel P−DE 200 カラムか
らの分画物のプールは、0.1％トライトン（Triton）Ｘ
−100を含有するPBSで２倍（２×）に希釈され、10ml/m
inの流速でカラムに加えられた。加えた後、ゲルは結合
していない物質を除くためにPBSで洗浄された。吸着し
た免疫反応性（immunoreactive）物質は、0.3M酢酸,0.1
M NaCl,pH2.7,の緩衝液で溶出させられた。蛋白質はそ
の後YM10膜（Amicon,Div.W.R.Grace ＆Co.Danvers,Mass
achusetts,U.S.A.）を使用するアミコンスチルセル
（Amicon Stircell）装置で濃縮された。
蛋白質の純度は、Laemmliによって述べられている〔N
ature 227:680（1970）〕ように、SDSポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法によって決定された。ゲルはクマシー
（Coomassie）ブルーで着色させられた。又、ウェスタ
ンブロット分析は、7D4モノクローナル抗体をヤギ抗−
マウス西洋ワサビパーオキシダーゼコンジュゲート（Co
njugate）とともに用い、実施された。結果は第22図に
示されている。レーン２、３、４及び５は２つの調製物
からの精製蛋白質を含有している。レーン１及び６はそ
の図面の左及び右に示された分子量を有する分子量マー
カー蛋白質の混合物を含んでいる。蛋白質の10マイクロ
グラムがそれぞれのレーンに流された。
第22図において、精製された蛋白質が、SDSゲル中を
約65kdの明らかな分子量を有する主要なバンドとして、
より高いまたより低い移動度を有する小さいバンドと共
に移動していくということがわかる。
6.2 等電点の決定 精製した65kd蛋白質の10マイクログラムは、LKB Inst
ruments,Gaithersburg,Maryland,U.S.A.から得られる予
め形成された等電的集中化（isoelectric focusing）ゲ
ル中で等電集中化（focusing）を受けた。既知の等電点
を有する標準蛋白質の混合物が同時に通過させられた。
ゲルは、3.5−9.5のpH勾配で製品説明に従って50mA,1,5
00Vで約２時間の間通過させられた。
電気的集中化（electrofocusing）の完了の後、その
ゲルは蛋白質のバンドの検出のためクマシー（Coomassi
e）ブルー染色液で着色された。精製された蛋白質の等
電点は、標準蛋白質の位置との関係でpH勾配内でのバン
ドの位置を測定することによって決定される。このよう
にして決定されたその蛋白質の等電点は4.6であった。
6.3 アミノ酸組成分析 アミノ酸組成分析は、Pan等、蛋白質微小特定記述の
方法において（in Methods of Protein Microcharacter
ization）1986,Shively,ed.,The Humana Press,pp.105
−119,によって記述されているように、フルオレスアミ
ン（fluorescamine）との次のカラム反応を用いて行な
われた。65kd蛋白質の３μｇを含む試料は、４％チオグ
リコール酸を含む、6N HCl中で、20〜24時間、真空中で
加水分解させられた、そして加水分解物の10％が分析の
ために使用された。システイン値は過蟻酸（performic
acid）酸化の後で決定された。結果は第３表に示されて
いる。
6.4 Ｎ−及びＣ−末端配列分析 蛋白質の200ピコモル（アミノ酸組成分析によって決
定されたとおりに）は、Hewick等、J.Biol.Chem.256:79
90（1981），の方法と、応用バイオシステムモデル470A
シークエンサー（Applied Biosystems,Inc.,Foster Cit
y,California,U.S.A.）を用いてＮ−末端分析を受け
た。このようにして決定されたＮ−末端配列はＭ−Ｎ−
Ｋ−Ｎ−Ｓ−？−Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｆ−？−Ｓ−Ｍ−Ｑ−Ｅ
−Ｓ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−であった。疑問符によって指示され
た位置でのアミノ酸残基の正体は、PTH−Cysの収量が少
なかったため不確実である。そして、システイン残基は
ジスルフィド結合に含まれる〔Hewick等、J.Biol.Chem.
256:7990（1981）〕。
Ｃ末端分析は、Hayashi,Methods in Enzymology47:84
（1977），によって述べられているように、時間コース
（time course）カルボキシペプチダーゼＹ消化によっ
て、65kd蛋白質の1200ピコモルに対して行なわれた。カ
ルボキシペプチダーゼＹ（Boehringer Mannheim,Indian
apolis,IN）は、0.05M酢酸ナトリウム緩衝液、pH5.9中
0.8μg/350μの濃度で使用された。そして、試料分画
（aliquots）が分析のため、0,2,5,10,20及び30分後に
採取された。試料分画（aliquots）は一層進む反応を停
止させるためHClで酸性化され、その後前記のようにし
てアミノ酸分析を受ける。この分析は、Ｃ−末端でのア
ミノ酸配列は多分（Met,Trp）−Ala−Serであることを
示していた。トリプトファンはメチオニンと共に、同時
に増加することが観察された。しかし、Trpは、それが
フルオレスアミンと低い反応性を有するので、フルオレ
スアミン（fluorescamine）分析器で定量することは困
難である。それ故、TrpとMetの相対位置はこの分析によ
る確実性によって決定はできない。
6.5 トリプシンペプチド分析 65kd蛋白質をコードするcDNAのヌクレオチド配列から
予測されるアミノ酸配列を一部分確証するため、幾らか
の蛋白質がトリプシン（Cooper Biomedical,Philadelph
ia,Pennsylvania,U.S.A.）で消化された。そして、生成
したペプチドは下記のようにして配列が決められた。
トリプシン消化物は、0.2M重炭酸アンモニウム（ammo
nium bicarbonate）,pH8、中の蛋白質148μｇに対し
て、1:30（重量又はモルベース）の酵素対基質比を用い
て、37℃で一夜行なった。このようにして生成したペプ
チドは、0.1％（基準）トリフルオロ酢酸中増加するア
セトニトリルの０から55％の勾配によって、Altex ultr
asphere 250×4.6mm C−18カラム（Beckman Instrument
s,Fullerton,CA）を使用する、水HPLCシステム（a Wate
rs HPLC system）において分離させられた。HPLC分離の
前に、消化物はペプチド中のジスルフィド結合をいずれ
も破壊するために、37℃で30分、β−メルカプトエタノ
ールで還元させられた。カラム流出液は実験室データ制
御検出器（Laboratory Data Control,Rivera Beach,Flo
rida,U.S.A.）を使用し215mμで監視された。HPLCカラ
ムは、第23A図に示されるように、８つの主要ピークに
分解した。
それぞれのピークは、ペプチドの量と組成の両方を決
定するために、上記したようにアミノ酸分析によってま
ず第１に分析された。その後、HPLCカラムからのペプチ
ドのピークの殆んどは、応用バイオシステムモデル470A
ガス相シークエンサー（Applied Biosystems Model 470
A gas phase sequencer）を使用し、自動化エドマン分
解によって配列が決められた。フェニルチオヒダントイ
ン（PTH）アミノ酸誘導体は、Hawke等、〔Anal,Bioche
m. 120:302（1982）〕、によって述べられているAltex
ultrasphere C−18カラムを使用する、水HPLCシステム
（a Waters HPLC system）で、または、応用バイオシス
テムモデル（Applied Biosystems Model）120A、オンラ
インPTHアミノ酸分析機において、確認された。
これらのペプチドの幾つかのアミノ酸配列は、第17図
の下線を入れた領域に示されている。これらのペプチド
のそれぞれの数（HPLCピーク数に対応する）は、対応す
る配列のそばに丸で囲んで示してある。ペプチド配列中
の残基の幾つかの正体（identity）の不確実さは、ペプ
チドのアミノ酸組成分析が予想配列の対応位置に表示さ
れたアミノ酸がペプチド中に存在するということを示し
てはいるけれども、それらの位置に疑問符によって表示
されている。ペプチド残基の幾つかの正体（identity）
の不確実さは、フルオレスアミン（fluorescamine）と
のトリプトファンの低反応性のためであった。
完全な65kd蛋白質のＮ−末端に対応している、ペプチ
ド６は、発現プラスミド中にヌクレオチドによってコー
ドされているＮ−末端に４残基を含有している。ペプチ
ド８の分析は、ペプチド３のアミノ酸配列に類似してい
るが、しかし4C−末端残基を欠いているアミノ酸配列を
明示しており、それは多分不完全なトリプシン消化の結
果であるということを示唆している。ペプチド５は、こ
のペプチドのアミノ酸組成分析がペプチド６と同様であ
るが、Ｎ−末端の最初の３アミノ酸が足りないというこ
とを、それが示しているために、配列が決められていな
い。
前記したように、しかし前のメルカプトエタノール還
元は行なわないで実施されたトリプシン消化物のHPLC分
析は、ピーク４、７及び８が存在しない（第23B図）溶
出のプロフィール（輪郭）を明示した。この観察は、シ
スティン−含有ペプチドが還元されていない蛋白質にお
いて多分ジスルフィド結合形成に巻き込まれ（involv
e）ているということを示唆している。
7.家禽の免疫化（Poultry immunization） 7.1 65kd抗原の使用 精製した組み換え（recombinant）65kd蛋白質の投与
がアイメリアテネラ（Eimeria tenella）胞子分裂する
接合子嚢（sporulated oocysts）によるチャレンジに対
して鶏（ohickens）を保護できるかどうかを決定するた
めに、一連の免疫にする実験が行なわれた。これらの実
験において、１日〜３週の年令のレグホン鶏（Leghorn
chickens）（Avian Services,Frenchtown,New Jersey,
U.S.A.）が清潔な室に置かれ、そして、チャレンジの時
期まで他の鳥類と接触していない看護人（attendants）
によって世話をされた。鳥類は、それらが３又は４週の
年令になるまで電気的に加熱された、ひな保育箱（broo
der）のかご中に置かれた。その後、成長させる鳥かご
（grow−out cages）に移された。薬を混入されていな
いブロイラーのスターター飼料及び水が実験全体にわた
って随意に供給された。接合子嚢（oocysts）のチャレ
ンジの時点で、鳥は実験の終りまで置かれる他の建物に
移された。動物の治療状況は、免疫にする前は一週間に
少なくとも３回、そして免疫の後は毎日を標準として検
査される。鳥は、色々な試験グループに任意に割り当て
る前に、３〜４週の年令で翼のバンドによって個々のも
のが確認された。
前記したように、免疫アフィニティクロマトグラフィ
ーによって精製された65kd蛋白質の色々のロットが免疫
原として使用された。免疫原のこれらのロットは、Unit
ed States Pharmacopeia,21st Revision,1985,United S
tates Pharmacopeial,Convention,Inc.,Rockville,Md.,
pp.1165−1167,において述べられているようにして決定
され定義された活性については、蛋白質のμｇ当り約0.
3から約50エンドトキシン単位の範囲にある細菌のエン
ドトキシン活性を含有していた。その蛋白質は使用前に
0.02M K2HPO4緩衝液、pH6.8に溶解させられ、そして必
要とするときに同じ緩衝液で希釈させられた。
ウシ血清アルブミン（BSA,Pentex）が対照として使用
された。使用された免疫原にピロゲン活性が存在してい
たために、このような活性の凡そ等量が、この活性のた
めかもしれないどんな非特異的な影響も明らかにする
（account for）ために、全てのBSAコントロールに対し
て加えられた。このピロゲン活性は、大腸菌を高周波音
分解により崩壊することにより、そしてその後0.45μミ
リ細孔（Millipore）フィルターを通して、その物質を
濾過することにより調製された非形質転換大腸菌リゼー
トの形態でBSAに添加された。
コントロールBSAの希釈試料又はアイメリア（Eimeri
a）抗原はアジュバントの等量と合せられ投与の前に18
ゲージ針を備え付けた、ガラスシリンジで完全に混合さ
れた。Freundの完全なアジュバントと不完全なアジュバ
ントとは、それぞれ最初でかつ補助注射（booster）の
免疫化に使用された。両方のアジュバントは、GIBCO,Gr
and Island,New York,U.S.A.,から入手された。
最初の免疫は、鳥が４週年令のとき、首の基部で体の
背部に皮下で行なわれた。幾らかの鳥は６週の年令で、
補助注射（booster）の免疫も受けた。注射された物質
の量は約0.4〜2.4mlの範囲であった。より多い量では、
投薬量（dose）は２回の注射に分割された。最後のワク
チン注射の後２〜３週間、鳥は経口的に与えられた、E,
tenellaの25,000又は50,000の胞子分裂した接合子嚢por
ulated oocyst）でチャレンジされた。感染の後の７日
で、生き残った鳥は犠牲にされ、死体解剖され、そして
全部の病変に対して採点された。実験中に死んだ全ての
鳥もまた死体解剖された。診断がなされ、腸の病変は０
＝正常、１＝わずかに病変（infestation）、２＝適度
の病変（infestation）、３＝猛烈な病変及び４＝死、
のように採点された。得られた表示は、鳥のグループご
とに対し感染の平均程度としてまとめられた。鳥は又感
染の時点と感染後７日目に重量が測られた。幾つかの鳥
はBSA又はコシジアル（coccidial）抗原でワクチン注射
されていないが、感染又は非感染のワクチン注射されて
いないコントロールとして取り扱かわれた。
２つの実験の結果を第４表に示す。
a.IUC,Antigen,BSA,UUCは、各々、（のう胞体を）感染
させた免疫していない対照区、精製された分子量65キロ
ダルトンのタンパク、ウシ血清アルブミン、感染させて
おらず免疫してもいない対照区、を示す。
b.実験１においては、最初のワクチン接種をしてから３
週間後のヒナドリに胞子形成されたE.tenellaののう胞
体50,000個を投与した。また、追加のワクチン接種を行
ったヒナドリについては、該（２回目の）接種を行って
から２週間後に25,000個ののう胞体を投与した。実験２
では、のう胞体投与の時期は実験１と同様であるが、一
次接種したヒナドリ、追加接種をも行ったヒナドリとも
に25,000個ののう胞体を投与した。各実験において感染
させた非免疫対照区を設け、同じ生育段階において、即
ち屠殺の７日前に、胞子形成されたのう胞体を各々一定
数ずつ投与した。結果は、text記載のように、０−４の
得点に基づいている。
c.数値は、ヒナドリの球虫（のう胞体）感染時の体重
と、感染時より７日後の体重の差を示す。
d.この区では当初、ヒナドリを９個体用いたが、１週間
後２個体が死亡した。
e.IUCと比較してＰ≦0.05 第４表のデータは、分子量65,000のタンパクで免疫し
ておくと、IUC区と比較して一般に病変の度合が減少し
たことを示している。実験１においては、追加のワクチ
ン接種がなされた２つの処理区（表中のｅ）のヒナドリ
には、統計上有意な発病度の減少がみられた。他の区で
は、これほど大きな発病度の減少はなかったが、それに
もかかわらず、ワクチン接種されたヒナドリにおいて
は、概して体重は増加した。
三度目のワクチン接種が、抵抗力をさらに高めるのか
否か明らかにするため、実験が行われた。（即ち、）ヒ
ナドリ８個体からなる各（処理）区について、ワクチン
接種なしで感染させた、または感染させない対照区を設
けたり、もしくはBSAやメロゾイト（分裂小体）のタン
パクを、３週令及び５週令、または3,5,7週の各段階に
おいて接種したりした。最初の２回のワクチン注射には
フロイントの完全アジュバントを用いて行った。３回目
を行うときは、フロイントの不完全アジュバントを用い
た。接種は前記したように皮下（注射）で行われた。
最終接種から２週間後、ヒナドリ各々にE.tenellaの
胞子形成されたのう胞体25,000が投与された。各ヒナド
リの体重を、のう胞体投与時とその１週間後、即ち屠殺
して病変度スコアをはかる時点で測定した。結果を第５
表に示す。
a.IUC,Antigen,BSA,UUCは、各々、（のう胞体を）感染
させた免疫していない対照区、精製された65キロダルト
ンのタンパク、ウシ血清アルブミン、感染させておらず
免疫もしてもいない対照区、を示す。
b.最後のワクチン接種から２週間後、E.tenellaの胞子
形成されたのう胞体25,000をヒナドリに投与した。対照
区のヒナドリは２回免疫用、３回免疫用のものは感染さ
せた時点でそれぞれ７週令、９週令であった。結果は、
テキスト記載のように、０−４までのスコアに基づいて
いる。
c.数値は、ヒナドリの感染時の体重と、感染時より７日
後の体重の差を示す。
第５表のデータは、３回のワクチン接種により、抵抗
力は増強されなかったことを示す。cecal病変度の減少
によって示されるように、IUC区もしくはBSA接種区と比
較して、抗原投与区のヒナドリにはより強い抵抗力が与
えられた。
皮下注射以外の投与経路を採用することで、さらによ
い結果が得られるものか否か明らかにするため、分子量
65キロダルトンのタンパク注射の２回分の量を２週間間
隔で、３週令のレグホン種ヒナドリ８個体ずつに対し、
皮内、皮下、筋肉内、経口、肛門という各々の経路で３
回投与した。最終抗原投与から２週間後、E.tenellaの
胞子形成されたのう胞体25,000を各区のヒナドリに経口
で投与した。さらに１週間の後、各ヒナドリを屠殺し、
病変度のスコアを測定した。
皮下注射は前述と同様に行った。筋肉内注射は左腿部
外側の深部に行った。皮下注射は右翼前方部に行われ
た。経口投与は長さ5cm、18ゲージのボールチップ型の
針を用いて行い、注射物を のう部に蓄積させた。肛門部からの投与には5cm、18ゲ
ージのオリーブチップ型を針を用いて、排出腔の開いた
状態で針を最大限に挿入して行った。経口投与、もしく
は肛門投与後は、各々ヒナドリを数分間、立たせておく
か逆さにしておくかした。これは、接種物が体外に放出
されてしまうのを防ぐためであった。
皮下注射に際しては、投与物の形態は上述と同様、
（即ち、）１次注射にはフロイントの完全アジュバント
を、追加注射にはフロイントの不完全アジュバントを用
いた。他の投与経路の場合の投与形態は、規定量のタン
パクを含む0.02M pH6.8のリン酸水素二カリウム緩衝溶
液とした。結果を第６表に示す。
a.IUC,Antigen,BSA,UUCは、各々、（のう胞体を）感染
させた免疫していない対照区、精製された分子量65キロ
ダルトンのタンパク、ウシ血清アルブミン、感染させて
おらず免疫もしていない対照区、を示す。SC,IM,A,O,ID
は、各々、投与経路として皮下、筋肉内、肛門、経口、
皮膚内を示す。
b.ワクチン接種区のヒナドリについては、最終接種から
２週間後、IUCについては、屠殺の７日前に各々25,000
のE.tenellaの胞子形成されたのう胞体を投与した。こ
れらIUC対照区のヒナドリは、感染時（のう胞体投与
時）９週令であった。結果は、テキスト記載のように、
０−４の得点に基づくものである。
c.数値は、ヒナドリの球虫感染時の体重と、感染時から
７日後の体重の差を示す。
d.IUCと比較してＰ＜0.05 第６表の結果は、抗原５μｇを経口投与したヒナドリ
及び同25μｇを皮下投与したヒナドリの病変度のスコア
が最も少ないことを示している。これらの結果は統計上
有意であった。その他の投与経路をとった場合でも、ま
た、上記と異なる投与量でも、cecal病変度の減少が見
られ、抵抗力が生じる傾向にあることが示唆された。し
かし、これら（試験区の）値とIUC区の値との間には、
有意な差はみられなかった。
上述の実験において、抗原（ワクチン）投与量と、そ
れに対する反応に一次的な相関関係がみられなかった
が、これは、65キロダルトンの抗原中の微量の夾雑物質
及び／または発熱物質含有量の差違に起因するものであ
るか、あるいは他の要因によるものであろう。
7.2 ワクシニアベクターによるワクチン注射 本発明において、ヒナドリをE.tenella由来の抗原で
免疫する、より効果的な免疫方法を開発するため、モノ
クローナル抗体6A5（14図）により認識される分子量20,
000のタンパクをコードする1.1kbのcDNA、及び、モノク
ローナル抗体8A2（18図）によって認識される分子量28,
000のタンパクをコードしている1.1kbのcDNAを種痘ウイ
ルス内でクローン化して、ヒナドリに対するワクチン接
種に用いた。詳細は以下に述べた通りである。
7.2.1 ベクターの調製 すべての組み換え体は、Mackettらによって述べられ
ている〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:7415（1982）〕よ
うな、ウイルスのチミジンキナーゼ（TK）部位での相同
的遺伝子組み換えに基づくものであった。該TK部位は、
種痘ウイルス由来の（遺伝子であって）Hind IIIによる
Ｊ断片上に位置づけられており、また、その断片の塩基
配列が一部明らかにされている〔Weir et al.,J.Virol.
46:530（1983）〕。
ベクター調製のため、種痘ウイルスのHind IIIによっ
てできるＪ断片を、pUC8（第24図ａ）でサブクローン化
した。この構造物質をHpa IIで切断した。得られた断片
を大腸菌のDNAポリメラーゼのクレノウフラグメント
（クレノウ）で処理し、Hind IIIで再び分解して、ウイ
ルスのTK遺伝子をもつ断片をlow meltingアガロースゲ
ルから分離した。分離した断片を、pUC8ベクター（第24
図ｂ）のHind III認識部位と鈍角をなす端部（S1処理に
よる）のEcoR I認識部位に連結した。次に、Hind IIIに
より分解されたDNAをクレノウ処理し、ベクターフラグ
メントを再連結することによって、Hind III認識部位を
除去した。種痘ウイルスプロモーター（7.5Kプロモータ
ーといわれている）を挿入するため、該ベクターをCla
I及びEcoR Iで切断した。
V.V.由来の7.5Kプロモーターは、そのウイルスDNAのS
al Iにより得られる遺伝子フラグメントの中でも最小の
ものの１つの上に位置している〔Venkatesan et al.,Ce
ll 25:805（1981）〕。該フラグメントをM13mp8（第24
図ａ左）に組み込んでクローン化した。クローンは、転
写方向がM13mp8（第24図ａ左）のEcoR I認識部位に向か
うように選択した。このDNAをSca I,Sma Iで切断し、Bg
l IIの認識するリンカーを加えて再連結した（第24図
ｂ）。ウイルスプロモーター断片を含むEcoR I−Acc I
による断片を、M13構造物質から単離して、上記のpUC8
−TK断片に連結し、ベクターpUC8−TK−7.5K＊を得た。
この新ベクターをさらにBgl II及びEcoR Iで分解した。
多様なクローニング部位をもつベクターを開発するた
め、上記の構造物に適当なポリリンカーを挿入した。こ
の目的のために、M13tgl31（Amersham）（第24図ｄ）中
のポリリンカーが選ばれた。該ファージDNAをBgl II及
びEcoR Iに分解することによりポリリンカーフラグメン
トを単離し、前記pUC8−TK−7.5K＊に挿入して、最終的
にV.V.内での外来抗原の遺伝子組み換えのための基本と
なるベクター、即ちpUC8−TK−7.5Kがつくられた。
モノクローナル抗体8A2と結合する28キロダルトンの
タンパクをコードする遺伝子のEcoR Iによってできるフ
ラグメントには、該タンパクのＮ末端部分をコードする
塩基配列は含まれていない。本来の返還開始コドンが失
われている。
この欠失部位を補うため、２つの異なる構造を作製
し、発現を試験した。まず、第１の構造として、形式上
の開始コドンは、前記基本ベクターpUC8−TK−7.5K（第
24図ｃ）中のポリリンカーを一部削除することにより得
られた。（即ち、）該ベクターをEcoR V及びSma Iで分
解し、ポリリンカーの一部を除去してから（第24図
ｄ）、連結させた。この操作によって、Sph Iの認識部
位上に含まれるATGコドンは、EcoR I断片上ののう胞体
由来のタンパクコード領域を但しく読みとれる位置に設
けられた。（また、）この操作がうまくいったことは、
新しくできたポリリンカーの遺伝子断片の塩基配列を調
べることによっても確認された。こうしてできた塩基配
列によりコードされるタンパクの予想アミノ酸一次構造
を第25図Ａに示す。
開始コドンのみでなく、欠失しているリーダー部位を
も補うため、EcoR Iによる遺伝子断片をマラリア抗原の
リーダー部位の後のcorrect reading frame内につけ
た。リーダー部位単離のために採用されたマラリア抗原
は、Ro−33（Certa et al.,EMBO J.６:4137（1987）〕
として記載されているような190ミロダルトンのタンパ
クであった。しかし、球虫類由来のリーダー部位のよう
な、他のリーダー部位を同じ目的に利用することはでき
なかったということを記しておかねばならない。
リーダー部位を含むDNA断片を単離するため、Ro−33
DNAを（まず）Dra Iで分解した。（次に、）Pvu II及び
Hind IIIの認識部位をもっている断片を分離し、さら
に、Hind IIIで分解した。本発明独自のベクターpUC8−
TK−7.5K（第24図ｃ）をSal Iで切断し、クレノウフラ
グメントと共に処理してからHind IIIで分解した。次い
で、このベクターフラグメント内に、Dra I−Hind III
による断片から単離したマラリア抗原のリーダー部位を
クローン化した。こうしてできた構造物を、P.falcipar
um由来の190kdタンパクと、モノクローナル抗体8A2によ
って認識されEcoR Iによる遺伝子断片によりコードされ
ているE.tenellaの抗原との融合タンパクを発現するた
めに用いた。該融合タンパクの、予想されるＮ末端一次
配列を第25図Ｂに示す。
（上述のように、）28kダルトンのタンパクをコード
する。EcoR Iにより得られた断片を、基本ベクター（第
24図ｃ）内のポリリンカー上のEcoR Iによる認識部位に
組み込んでクローン化した。また、該断片を正しい向き
に組み込んだ構造物を増殖させ、種痘ウイルスの遺伝子
組み換えに用いた。
該（EcoR Iによる）フラグメントを翻訳するための翻
訳開始部位を基本ベクター内に組み込んだやり方から、
組み換えにV.V.より発現するタンパクのＮ末端一次構造
には、異なる２種類のものがあることが予想された。
（第25図）考えられる第１の一次構造においては（第25
図Ａ）、オリジナルの配列に３個のアミノ酸（Met,Arg,
Trp）が付加されただけのものだが、予想されるもう１
つの一次構造においては、190kdのマラリア抗原のリー
ダー配列由来の、全部で47個のアミノ酸が、モノクロー
ナル抗体8A2（第25図Ｂ）により認識されるポリペプチ
ドのＮ末端に付加している。該リーダー配列部位がもつ
解裂部位のプロセッシングによって、そのうちの19のア
ミノ酸が除かれ、Ｎ末端からVal,Thr,Hisで始まる成熟
タンパクとなる。
EcoR Iによって切り出された、モノクローナル抗体6A
5により認識される20kダルトンの方のタンパクをコード
する遺伝子断片は、完全な塩基配列を含んでいる。該フ
ラグメントは、補足的な操作なしで、上述のようにして
V.V.ベクターのEcoR I認識部位に組み込まれてクローン
化された。
球虫由来の抗原をコードする上記遺伝子の組み換えに
よる一株のWR V.V.の調製は、組み換えウイルスの選別
のための２つの過程を通してなされた。
まず、サルCV1細胞を、培地Ｉ〔Eagle's Minimal Ess
ential Medium（MEM）、５％ウシ胎児血清（FCS;Amime
d）、ペニシリン／ストレプトマイシン（各々100units/
ml、100μg/ml）、2mMグルタミンGibco〕中、8cm2培養
プレートで80〜90％に集密的になるまで培養した。培地
を除去し、0.1プラーク形成単位（pfu）／細胞濃度の、
温度感受性の種痘ウイルス株tsN7〔Drillen et al.,Vir
ology 131:385（1983）〕を含むウイルス懸濁液で置き
かえた。プレートを室温下で１時間おいてから、培地2m
lを加え、33℃（このウイルスの生育許容範囲）で２時
間、CO2インキュベーター内で培養した〔Kieny et al.,
Nature 312:163（1984）〕。
上記培養が終了する１時間半前に、DNAを含むリン酸
カルシウム沈澱物を調製した。これは、HeBS緩衝液〔28
0mM NaCl,1.5mMリン酸水素ナトリウム、50mM HEPES〕、
200ngの精製WR V.V.のDNA、及び球虫由来の抗原をコー
ドする遺伝子を含むプラスミドDNA 200ngを含み、全体
量を0.55mlとした。DNAは各々１μのTE緩衝液（10mM
トリス−塩酸,pH7.5,1mM EDTA）に加え、これにゆるや
かにゆすりながら、0.55mlの250mM塩化カルシウムを滴
加した。この混合液は、室温で20分間放置した。
２時間の培養終了後、プレートの培地を吸引し、上記
のDNA含有カルシウム沈澱物0.25mlにおきかえて、室温
下に１時間放置した。この後、培地Ｉを各々2mlずつ加
えて、39.5℃、CO2濃度５％のインキュベーターで２時
間培養した。（Kieny et al.,supra）。この温度下で
は、tsN7ウイルスは複製され得ず、少なくともts7部位
で組み換えが起こったウイルスが選別される。リン酸カ
ルシウムは、結果的には細胞の生育を阻害するので、２
時間の培養後、培地を除去し、細胞を各回1mlのPBSでゆ
るやかにゆすりながら３回洗浄した。３回目の洗浄用PB
Sを吸引した後、培地Ｉを2mlずつ各プレートに加え、CO
2インキュベーター内で39.5℃の下２日間培養を続け
た。
２日間の培養後、培養プレートを、培地及び細胞ごと
−30℃で短時間処理し、さらに解凍した。プレート底部
にまだ付着している細胞をはがし、この懸濁液を前述の
ような超音波処理した。このホモジェネートを第２の選
別段階に供した。
本段階では、8cm2プレート内でほぼ集密的に近い生育
をしているヒト143B TK細胞（ATCC CRL 8303）から培地
を除去して、そのままか、もしくは、PBSで1:5または1:
30（v/v）に希釈した上記ホモジェネート0.2mlでおきか
えた。TK-細胞のウイルス感染を、室温下に１時間進め
た。
前記培養後、0.1mg/mlのブロモデオキシウリジン（Bu
dR,Sigman Chemical Co.）を含む半個体培地II〔培地Ｉ
に非必須アミノ酸（Gibco;注文番号043−1140）、必須
ビタミン（Gibco;注文番号042−1120）、１％アガロー
スを加えたもの〕2mlを細胞に加え、プレートを37℃下
で16−24時間、CO2インキュベーター内で培養した。こ
れに0.2％の中性赤を含む上記半個体培地IIに重層し、
さらに16−24時間培養した。すると明瞭に目視確認でき
る無色のプラークが現れるから、このプラーク領域をパ
スツールピペットで吸引する（プラーク精製）ことによ
って、クローン性のウイルスが生じた。このようにして
生じせしめたウイルスは、上記CV1細胞を宿主として培
養し、143B TK- cell上で第2,第３段階のプラーク精製
に供された。このようなプラーク精製過程を経たウイル
スを上記のように培養し、精製した。
組み換えウイルスにより球虫抗原が発現されるか否か
調べるために、組み換えウイルスに感染した細胞を、卓
上遠心機（Hettich Mikrorapid K,100％３分間,20℃）
で遠心し、ペレットをPBSで２回洗浄してから再び遠沈
し、PBSに再懸濁した。該懸濁液を、顕微鏡用ガラスプ
レート（Flow）にのせ、乾燥させた。また、もう１つの
方法として、CV1細胞を顕微鏡用スライド（Miles Lab−
Tek4808）上で直接生育させ、ウイルスを感染させて１
〜２日間培養することもできた。その後、無培地下、PB
Sで細胞を洗浄し、室温で乾燥させた。さらに、細胞を
固定するため、スライドを−30℃アセトン中に最低１時
間沈めた後、室温で乾燥させた。
抗球虫抗原マウスモノクローナル抗体をPBSで希釈し
て、これを細胞が均等に液で覆われるようにスライド上
にのせた。このスライドを湿潤チャンバー中に37℃で１
時間おき、続いてPBSで数回洗浄した。スライドを乾か
さずに、PBSで希釈した２次抗体（FITC標識抗マウスヤ
ギIgG,Nordic）をスライド上にのせ、これを37℃で湿潤
チャンバーに入れて１時間おき、抗体を反応させた。PB
Sで数回スライドを洗浄してから乾燥させた。こうして
できたスライドの上から20％グリセリン（v/v）溶液を
２〜３滴ピペットで落とし、その上にカバーガラス（Me
nzel 24×60）を上にのせた。顕微鏡下でこの試料の蛍
光を、紫外線照射下でモニタリングした。（Zeiss ICM
405,F10 or Planapo 63 objective） WRウイルスは、ほとんどあらゆる種の細胞中で増殖で
き、増殖はプラーク形成により確認できる。しかし、多
くの場合、ウイルスを多量に調製するには、ヒナドリ胎
児の線維芽細胞（CEF細胞）を用いた。
CEF細胞を得るために、発生後11日のヒナドリ胎児を
卵中から分離し、四股を除いて小片に切断し、0.25％ト
リプシン溶液（Difco）中に室温下で２時間再懸濁し
た。これを１容の培地Ｉで希釈し、cell sieve（Bellc
o,150mesh）で濾過してから細胞を沈降させた（Hermie
卓上遠心機,5分間,2,000rpm,室温）。細胞のペレットを
当初の1/4の培地Ｉに懸濁し、このCEF細胞懸濁液を培養
プレートに注入した。培養開始時の細胞濃度にもよる
が、培養物は１〜２日生育させ、直接もしくは１−２の
過程を経た後、ウイルス感染用に供した。このような培
養細胞の確立のための要領は、Frehney,Culture of Ani
mal Cells,Alan R.Liss Varlag,New York 1983,Chaptre
11,p.99にみることができる。
ウイルス感染のため、175cm2培養フラスコ（Falcon 3
028）中で生育する80％〜90％集密性のCEF細胞から培地
を除去し、ウイルスを含むPBS溶液（0.1pfu/cell,0.01m
l/cm2）中で１時間、室温下で培養した（20℃）（PBS/D
ulbecco,Amimed）。次いで培地Ｉを添加（0.2ml/cm2）
し、37℃で２〜３日、約80％の細胞が溶菌するまで培養
した。こうしてできた保存溶液は、ウイルスの精製を行
うまで、直接細胞及び培地とともに、当初の培養フラス
コ中で−30℃下で保存した。
続いての（ウイルスの）精製工程は、宿主菌に特異的
な成分をもたないウイルス調製液を獲得するために用い
られた。−30℃で保存していたウイルス感染後の培養細
胞を解凍し、フラスコ表面に付着している残存細胞を、
振とうしたりゆすったりして遊離させた。細胞及びウイ
ルスを共に遠沈し、培地から分離した。細胞及びウイル
ス粒子のペレットをPBS（ペレットの体積×10−20倍）
中に再懸濁し、上記と同様にして再遠沈させた。こうし
てできたペレットを、10倍量のRSB緩衝液（10mMトリス
−塩酸,pH8.0,10mM KCl,1mM MgCl2）に再懸濁した。
無傷の細胞を溶菌させ、該細胞の膜よりウイルスを放
出させるために、上記懸濁液を超音波処理した（60ワッ
トにて10秒×２回，室温下,Labsonic 1510 with 4mm pr
obe）。次に、この混合溶液をSorval GSAローターで10
℃下、3,000rpmで３分間遠心分離した。このようにし
て、核や巨大な細胞の残骸が除去されたウイルス懸濁液
を調製した。上清は注意深く除き、ペレットをRSB緩衝
液に再懸濁した後、超音波処理及び遠心分離を上記と同
様に繰り返した。
２回目の遠心画分の上清を最初の上清と合わせて、10
mlの35％ショ糖溶液の上に重層し（Fluka,in 10mMトリ
ス−HCl,pH8.0）Kontron TST 28.38/17ローター（Beckm
an SW 27 analog）にて、10℃下で90分間、14,000回転
で遠心分離した。上清をデカンテーションし、ウイルス
粒子のペレットを10mlの10mM Tris−HCl pH8.0の緩衝液
に再び溶かし、超音波処理により攪拌して（上述のよう
に、室温で10分間×２回）、以降の精製のため、ステッ
プグラジェントにかけた。
ステップグラジェントはpH8.0,10mM Tris−HCl中に各
々以下の濃度、すなわち20％、25％、30％、35％、40％
のショ糖を含む溶液を各5mlずつより構成した。これをK
ontron TST 28.38/17型ローターで35分間、10℃下、14,
000で遠心分離した。ウイルス粒子を含む数本のバンド
が30％〜40％ショ糖濃度の域にみられた。グラジェント
中のこの部分を採取し（10ml）、PBS（20ml）で希釈し
た後、ウイルス粒子を沈降させた（Kontron rotor,90分
間、14,000rpm、10℃）。こうして得られたペレット
は、大部分ウイルス粒子よりなるものであった（OD測定
とプラークアッセイにより判断。以下参照）。このペレ
ットをPBSに溶かして、ウイルス濃度が平均１〜５×109
pfu/mlとなるようにした。このウイルスのstockは、直
接そのまま、もしくはPBSで希釈して用いた。
ウイルスstock中のウイルス濃度及び純度を測るため
２つの方法を用いた。ウイルス粒子の絶対濃度は、分光
光度計で該stockのODを測定することによって簡便に得
られた。ここで、10D/260nmは、約1.2×1010粒子/mlの
濃度に等しい〔Jokli,Virology 18:9（1962）〕。ま
た、ウイルス濃度は、60のウイルスのうち１粒子のみ感
染能力があると仮定して細胞上のウイルスの力価を測定
する（プラークアッセイ）ことによっても得られた。
培養細胞におけるウイルス濃度を測定するため、CEF
細胞を培地Ｉ中で8cm2プラスチックプレート（Falcon）
上で生育させた。細胞が80〜90％の集密性をもつに至っ
た時点で培地を除去し、PBSで希釈したウイルス溶液0.2
mlでおきかえ、室温で１時間放置した。ウイルスのstoc
k solutionは10倍毎に希釈した。室温下で培養した後、
2mlの半固体培地（培地Ｉ＋１％アガロース）を各プレ
ートに添加し、CO2インキュベーター内で16〜24時間培
養した。次いで、0.2％のneutral red（Fluka72210）を
含む半固体培地Ｉを生細胞染色のために重層し、さらに
16−24時間培養した。染色されないプラークを顕微鏡下
でカウントした。
7.2.2 ヒナドリの免疫 モノクローナル抗体8A2や6A5と特異的に結合するE.te
nella由来のタンパクをコードする遺伝子をもつ種痘ウ
イルスベクターが、病原性のあるE.tenella中のある株
（T2−750/7,T7−766/1,もしくはT6−771）の胞子形成
されたのう胞体の投与に対し、（ワクチンとしてはたら
くことで）ヒナドリに抵抗力を与えることができるかど
うかを明らかにするため、以下のような試験を行った。
すべての試験はthe hatchery E.Wuthrich,Belp,Switz
erlandによって提供された。産卵鶏品種のcockerelsを
用いて行った。Day−oldのヒナドリを加温したbattery
−brooder中で一定令まで飼育し、その後様々な試験区
に分けたり、床が針金のケージ中で胞子虫症フリーの状
態で育てたりした。試験全般を通じて、トウモロコシ、
小麦や大豆粉（粗タンパク21.7％）を基本とした業務用
のbroiler−grower飼料を与えた。
最初の試験では、体重が同程度のヒナドリを無作為に
６個体ずつ３グループに分けた。３日後、ヒナドリに組
み換え型もしくは野生型の種痘ウイルスを懸濁液（1010
pfu/ml in PBS）として、各々50μずつ２回、 に注射することによって免疫した。２種類の組み換え型
種痘ウイルスを用いたが、いずれも、モノクローナル抗
体8A2型と特異的に結合するE.tenella由来のタンパクを
コードするDNAを含むものであった。該ウイルスの一方
（37K M3とする）は、190キロダルトンのマラリア抗原
のリーダー遺伝子配列を有しており、もう一方（37K K3
とする）は、該リーダー遺伝子配列を欠いていた。種痘
ウイルスの野生型であるWR株を陰性対照とした。
第１次接種から１週間後、追加接種を に行った。ウイルスは、前回接種したものと同種のもの
を用いた。追加免疫から１週間後（59日令時）、すべて
のヒナドリから血液を2mlずつ採取し、その血清画分
は、特異的な抗体が存在するため、ELISAによって測定
した。簡単に説明すると、マイクロタイタープレート
（NUNCイムノプレートF96）のウェルを、E.tenellaのス
ポロゾイト懸濁液（10,000cells/ml）でコーティング
し、希釈率を増したヒナドリの血清と共に培養した。検
出試薬として、抗ニワトリヤギ免疫グロブリン−西洋ワ
サビペルオキシダーゼconjugate（Kirkegaard and Perr
y Laboratory,Gaithersburg,U.S.A.）を、基質であるテ
トラメチルベンシジンとともに用いた。青色の発色をTi
tertek Multiskan MCC/340 MK IIで、測定波長450nmで
読み取った。抗体価は、バックグラウンドの最低２倍の
ODを与える血清の希釈率の逆数と定義した。
第１次注射より４週間後（73日）、ヒナドリに50,000
の胞子形成されたのう胞体を投与した。投与物は生理食
塩水1mlに懸濁し、目盛付きシリンジについている鈍角
な針で、 のう内に経口的に投与した。80日令時、ヒナドリをすべ
て屠殺し、解剖して、全体の病変度を得点で評価した
（０点＝正常、１点＝軽い病変、２点＝中程度の病変、
３点＝深刻な発病、４点＝胞子虫症により死亡）。ヒナ
ドリの尿は発病cycleの末期２日間以上定量的に集め、
糞便のサンプルにおいて、体外排出された胞子虫の数を
測定した。結果を第７表に示す。
a.ウイルス37 M3株は、190キロダルトンのマラリア抗原
のリーダー遺伝子配列を有していた;37 K3はこれを有し
ていなかった。野生型ウイルスはWR株であった。
b.2匹のヒナドリは、胞子虫投与前に屠殺した。
第７表は、病変度のスコアが減少した点及び胞子虫の
体外排出が減少した点からみると、陰性対照である野生
型ウイルスと比較した場合、28キロダルトンのタンパク
をコードしているDNAを有する２種のウイルスは、どち
らも寄生虫に特異的な抗体生産を誘導し、のう胞体の投
与に対してある程度の抵抗力を与えたことを示してい
る。胞子虫に対する抵抗力という点においては、該２種
のウイルスの効果は同等であるが、マラリア抗原のリー
ダー遺伝子配列を有する方（37 M3株）は、胞子虫の抗
原に対しより高い抗体の力価を生ぜしめた。これは標準
的なウイルスの創造物（37 K3株）に対し、融合した創
造物は優位であることを示している。
第２の試験においては、検体は上記と同様に飼育し、
免疫を行ったが、試験の開始はヒナドリが22日令のとき
であった。100ml PBS中の２×108pfuのウイルスを投与
した。用いたウイルスは、28キロダルトンのタンパクを
コードするDNAを有し、マラリア由来のリーダー配列を
もたないもの（37 K5を示す）もしくはもつもの（37 M1
9を示す）とは異なるものであった。（前記試験と）同
じ野生型のWR株を対照として用いた。一次接種後１週間
後もしくは２週間後、 に同量の追加接種を行った。
57日目（一次接種より５週間後）、すべてのヒナドリ
に50,000の胞子形成されたのう胞体を投与した。１週間
後、ヒナドリを屠殺し、解剖して上記と同様にして得点
で評価を行った。感染時以降の毎回の体重増加や、屠殺
までの最後の２日間の間の胞子虫の排出量も測定した。
結果を第８表に示す。
a.ウイルス37 M19株は190キロダルトンのマラリア抗原
由来のリーダー配列を有していた。37 K5株にはこれが
なかった。野生型のウイルスは、種痘ウイルスWR株であ
った。
第８表は、胞子虫のDNAを有する２種のウイルスは、
野生型の対照ウイルスと比較した場合（ヒナドリ）、体
重の増加や発病の度合いのスコアやのう胞体の排出とい
った点からみると、どちらも病原性を有するのう胞体の
投与に対して、ある程度の抵抗力を生ぜしめることを示
している。どちらのウイルスもほぼ同等の効果を及ぼし
た。第１次接種から１週間後に追加接種を行ったこと
で、幾分体重の増加や胞子虫の排出の減少が起こった
が、発病度のスコアは、どちらの（時期の）追加接種の
場合でも（１次接種から１週間後でも２週間後でも）ほ
ぼ変わらなかった。
第３の試験では、３度のワクチン注射の効果について
検討した。野生株の種痘ウイルス、もしくはモノクロー
ナル6A5に特異的に結合する20キロダルトンのタンパク
をコードするDNAを含むウイルスの３×109pfu/ml濃度の
懸濁液を、50μずつ２本、21日令のヒナドリに接種し
た。28日令時に、すべてのヒナドリの に同様の追加接種を行った。このうち、何個体かのヒナ
ドリには、35日令時にさらにもう１度同様の追加接種を
両翼の に行った。その他のヒナドリは、そのままさらなる追加
接種を行わず、対照区とした。
42日令時、すべてのヒナドリから血液を採取し、前記
のような寄生虫のスポロゾイト段階に特異的な抗体の存
在を、ELISAによって測定した。49日令時（第１接種よ
り４週間後）に、すべてのヒナドリに50,000の胞子形成
されたのう胞体を投与した。それから１週間後、ヒナド
リを屠殺し、解剖して全体の発病度を、前述と同様に得
点で評価した。日々の体重増加を算出するために毎週体
重を記録し、のう胞体の排出量を測定するため、感染サ
イクルの最後の２日間は、糞便を採取した。結果を第９
表に示す。
第９表のデータは、球虫特有の抗原を生産するウイル
スを３回接種すると、スポロゾイトタンパクに特異的な
抗体の力価が増加せしめられることを示している。さら
に、このタイプの組み換えウイルスを用いると、どちら
の処理でも、体重増加促進や発病度のスコアの減少及び
のう胞体の体外排出の減少といった点からみて、のう胞
体感染に対するある程度の抵抗力が与えられた。ワクチ
ン接種していない対照区から得られた結果を比較する
と、野生型の種痘ウイルスをワクチンとして接種しても
抵抗力は生じなかったことがわかる。ゆえに、球虫由来
のDNAをもつウイルスにより与えられる抵抗力は特異的
なものであって、種痘ウイルスそのものにさらされたこ
とに起因する一般的な免疫的刺激によるものではなかっ
た。接種を３回行うと、２回の場合よりいっそう効果的
であった。
当該技術分野における当業者にとっては明らかになる
であろうように、本発明の修正されたものや多少変更さ
れたものが、その思想や範囲から離れることなしに数多
く創造され得る。本文中に記載されている特徴的な具体
的表現は、（実施）例を以て開示されており、本発明も
同添のクレームの表現によってのみ制限を受けるべきも
のである。
なお、本発明は以下の実施態様を包含するものであ
る。すなわち、 （１）請求項１に記載の蛋白質が第15図に示されたアミ
ノ酸配列を有するか、またはその機能的に均等なもので
ある。
（２）請求項１に記載の蛋白質が第17図に示されたアミ
ノ酸配列を有するか、またはその機能的に均等なもので
ある。
（３）請求項１に記載の蛋白質が第19図に示されたアミ
ノ酸配列を有するか、またはその機能的に均等なもので
ある。
（４）請求項１に記載の蛋白質が第21図に示されたアミ
ノ酸配列を有するか、またはその機能的に均等なもので
ある。
（５）請求項２のDNA配列が第14図に示されたヌクレオ
チド配列の全部または一部を含むものである。
（６）請求項２のDNA配列が第16図に示されたヌクレオ
チド配列の全部または一部を含むものである。
（７）請求項２のDNA配列が第18図に示されたヌクレオ
チド配列の全部または一部を含むものである。
（８）請求項２のDNA配列が第20図に示されたヌクレオ
チド配列と全部または一部を含むものである。
（９）請求項３に記載の組換えベクターが適合性の宿主
生物において前記DNA配列の発現を導くことができる。
（10）請求項３に記載の組換えベクターがE.Coliベクタ
ーである。
（11）請求項３に記載の組換えベクターがpEV/2−４で
ある。
（12）請求項５に記載の形質転換宿主生物が前記組換え
ベクター中に含まれる請求項１に記載の蛋白質をコード
するDNA配列を発現することができる。
（13）請求項６に記載の抗体がモノクローナル抗体であ
る。
（14）前記モノクローナル抗体がATCC番号HB 9707、HB
9708、HB 9709、HB 9710、HB 9711およびHB 9712より成
る群から選ばれるものである。
（15）請求項１に記載の蛋白質がコクシジウム症に対す
る家禽の免疫感作に用いられる。
（16）請求項１に記載の蛋白質がコクシジウム症から家
禽を防御し得るワクチンの調製に用いられる。
（17）請求項１に記載の蛋白質が請求項７に記載の方法
により調製されたものである。
（18）請求項５に記載の形質転換宿主生物が請求項８に
記載の方法により作製されたものである。
【図面の簡単な説明】
第１図は、E.tenellaのスポロゾイト類のELISAの結果を
示すグラフ、 第２図は、E.tenellaのスポロゾイト類から可溶化させ
た蛋白質を用いて行なったウエスタン・ブロット検査の
結果を示す電気泳動のパターン、 第３図は、E.tenellaのスポロゾイト類、モロザイト類
およびE.tenellaのスポロゾイト類から可溶化させた蛋
白質を用いて行ったウエスタン・ブロット検査の結果を
示す電気泳動のパターン、 第４図は、E.tenellaのスポロゾイト類の125I−標識表
面蛋白質類および生スポロゾイト類で免疫化させたマウ
スからの血清による125I−標識スポロゾイト表面蛋白類
の免疫沈澱の結果を示す電気泳動パターン、 第５図は、モノクローナル抗体による125I−標識スポロ
ゾイト表面蛋白質類の免疫沈澱の結果を示す電気泳動パ
ターン、 第６図は、空気乾燥させたE.tenellaのスポロゾイトの
固体調製物類の相対比顕微鏡写真および各種のモノクロ
ーナル抗体類を使用する免疫蛍光検査の染色模様の顕微
鏡写真、なお、第６図は生物の形態を示すものである。 第７図および第８図は、細胞内のスポロゾイト類の抗染
色およびニワトリ腎臓細胞内に発育寄生生物の顕微鏡写
真、 第９図は、抗スポロゾイト抗体類による細胞内のスポロ
ゾイトの発育の中和を示すグラフを示し、 第10図は、65kd−β−ガラクトシダーゼ融合蛋白質試料
または他の試料の電気泳動／ウエスタン・ブロット分析
の結果を示すパターン、 第11図は、プラスミドpEV/2−４の模式的表示図、 第12図は、pEV3−SEQの地図、 第13図は、モノクローナル抗体6A5で認識される蛋白質
をコードするcDNAクローンの制限地図、 第14図は、モノクローナル抗体6A5によって認識される2
0kb蛋白質をコードする1.1kb cDNA分子のヌクレオチド
配列、 第15図は、第14図のヌクレオチド配列から調製した蛋白
質のアミノ酸配列、 第16図は、モノクローナル抗体7D1,7D4および20C6によ
って認識される65kd蛋白質をコードする1.7kb cDNA分子
のヌクレオチド配列、 第17図は、第16図のヌクレオチド配列から推定され、発
現された65kd蛋白質から調製されたトリプシンの蛋白質
類の配列分析により確認された蛋白質のアミノ酸配列、 第18図は、モノクローナル抗体8A2によって認識される2
8kd蛋白質をコードする1.1kd cDNA分子のヌクレオチド
配列、 第19図は、第18図のヌクレオチド配列から推定される蛋
白質のアミノ酸配列、 第20図は、モノクローナル抗体7B2によって認識される
蛋白質をコードする3.2kb cDNA分子のヌクレオチド配
列、 第21図は、第20図のヌクレオチド配列から推定される蛋
白質のアミノ酸配列、 第22図は、免疫アフィニテー精製された65kb蛋白質の電
気泳動分析の結果を示すパターン、 第23図は、65kb蛋白質のβ−メルカプトエタノール還元
および未還元トリプシン消化のHPLC溶出曲線、 第24図は、ワクシニアウイルスへのコクシジア抗体類を
コードする遺伝子の組換えに使用される基本ベクターの
４種の要素の制限地図を示し、更に 第25図は、モノクローナル抗体8A2によって認識された
アイメリア抗原のＮ−末端のアミノ酸配列を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 16/00 Ｃ０７Ｋ 16/00 16/12 16/12 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 21/08 21/08 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 リチャード アントニー シゾナイト アメリカ合衆国 ニュージャージー州 07013 クリフトン，バーンスディル ロード 10 (72)発明者 リチャード アレン クレイマー アメリカ合衆国 ニュージャージー州 07052 ウエスト オレンジ，ノース エッジウッド アベニュー ９ (72)発明者 ピーター トーマス ロメディコ アメリカ合衆国 ニュージャージー州 07043 アッパー モントクレア，クラ ブロード 53 (72)発明者 ステファン ジェイ．マックアンドリュ ー アメリカ合衆国 オハイオ州 45701 アテンス，セカンドストリート 95 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C07K 14/00 - 16/46 C12N 1/00 - 5/28 C12P 21/00 - 21/08 A61P 33/02 A61P 37/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】アイメリア（Eimeria）表面抗原の免疫反
    応性および／または抗原性の決定基を１つ以上有する蛋
    白質であって、該表面抗原が第15図、第17図、第19図も
    しくは第21図に示されたアミノ酸配列のうちの１つを有
    するか、または第15図、第17図、第19図もしくは第21図
    に示されたアミノ酸配列において１もしくは複数のアミ
    ノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有
    し、かつアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
    ンに寄託されて受託番号HB9707からHB9712を指定された
    モノクローナル抗体の１つ以上に特異的に結合すること
    を特徴とする、上記蛋白質。
  2. 【請求項２】以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質をコー
    ドするDNA。 （ａ）第15図、第17図、第19図または第21図に示された
    アミノ酸配列を含んでなる蛋白質 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは複数のア
    ミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を
    有し、かつアイメリア表面抗原の免疫反応性および／ま
    たは抗原性の決定基を１つ以上有する蛋白質
  3. 【請求項３】以下の（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド
    配列を含んでなるDNA。 （ａ）第14図、第16図、第18図または第20図に示された
    ヌクレオチド配列を含んでなるDNA （ｂ）アイメリア表面抗原の免疫反応性および／または
    抗原性の決定基を１つ以上有するポリペプチドをコード
    する、DNA（ａ）の部分DNA配列
  4. 【請求項４】請求項２または３に記載のDNA配列を含有
    する組換えベクター。
  5. 【請求項５】ポックスウイルスベクターである、請求項
    ４に記載の組換えベクター。
  6. 【請求項６】請求項４または５に記載の組換えベクター
    で形質転換された宿主細胞。
  7. 【請求項７】請求項１に記載の蛋白質に対する抗体。
  8. 【請求項８】請求項１に記載の蛋白質の調製方法であっ
    て、 （ａ）該蛋白質をコードするDNA配列を含む請求項４ま
    たは５に記載の組換えベクターで形質転換された宿主細
    胞を、該DNA配列が発現される条件下において培養し、
    そして （ｂ）上記の培養物から該蛋白質を単離する、 ことを含んでなる方法。
  9. 【請求項９】公知の方法を用いて宿主細胞を請求項４ま
    たは５に記載の組換えベクターで形質転換することを含
    んでなる、請求項６に記載の形質転換宿主細胞の作製方
    法。
  10. 【請求項１０】請求項１に記載の蛋白質１種以上および
    生理学的に許容しうる担体を含有する、コクシジウム症
    から家禽を防御するためのワクチン。
  11. 【請求項１１】請求項５に記載の組換えポックスウイル
    スベクターを含有する、コクシジウム症から家禽を防御
    するためのワクチン。
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