JPH07500483A

JPH07500483A - 組換え体抗コクシジアワクチン

Info

Publication number: JPH07500483A
Application number: JP3507298A
Authority: JP
Inventors: ハーウッド，デヴィッド・イー; ハーンビィー，グレンダ
Original assignee: ブリティッシュ・テクノロジー・グループ・ユーエスエイ・インコーポレーテッド
Priority date: 1991-03-14
Filing date: 1991-03-26
Publication date: 1995-01-19
Also published as: AU654481B2; DE69121423T2; US5387414A; ES2090324T3; CA2106093A1; EP0575317B1; AU7586691A; ATE141328T1; DK0575317T3; WO1992016627A1; DE69121423D1; US5635181A; EP0575317A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】１６、上記細胞力吠腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）細胞である、請求項１１記載の形質転換細胞。

１７　上記ＤＮＡ分子を発現させて免疫原性ペプチドを形成させる条件下で請求項７記載の形質転換細胞を生育させることからなる、免疫原性ペプチドの製造方法。

１８、上記組換え体ＤＮＡ分子を発現させて免疫原性ペプチドを形成させる条件下で請求項８記載の形質転換細胞を生育させることからなる、免疫原性ペプチドの製造方法。

１９、ＡＴＣＣ寄託番号第６８５３７号として寄託させている組換え体細菌プラスミド中の唯一のｐＢＲ３２２由来のＥｃｏ［Ｉ部位に挿入されたＤＮＡ配列を発現させて免疫原性ペプチドを形成させる条件下で請求項９記載の形質転換細胞を生育させることからなる、免疫原性ペプチドの製造方法。

２０、上記組換え体ＤＮＡ分子を発現させて免疫原性ペプチドを形成させる条件下で請求項１０記載の形質転換細胞を生育させることからなる、免疫原性ペプチドの製造方法。

２１、上記ＤＮＡ分子を発現させて免疫原性ペプチドを形成させる条件下で請求項１１記載の形質転換細胞を生育させることからなる、免疫原性ペプチドの製造方法。

２２、ＡＴＣＣ寄託番号第６８４５０号として寄託させている組換え体バク刊オファージの唯一のラムダｇｔｌ＋由来のＥｃｏＲＴ部位に挿入されたＤＮＡ配列を発現させて免疫原性ペプチドを形成させる条件下で請求項１２記載の形質転換細胞を生育させることからなる、免疫原性ペプチドの製造方法。

２３、上記生育培地がら上記免疫原性ペプチドを単離することをさらに含む、請求項１７記載の免疫原性ペプチドの製造方法。

２４、上記生育培地から上記免疫原性ペプチドを単離することをさらに含む、請求項１８記載の免疫原性ペプチドの製造方法。

２５　上記生育培地から上記免疫原性ペプチドを単離することをさらに含む、請求項１つ記載の免疫原性ペプチドの製造方法。

２６　上記生育培地から上記免疫原性ペプチドを単離することをさらに含む、請求項２０記載の免疫原性ペプチドの製造方法。

２７、上記生育培地から上記免疫原性ペプチドを単離することをさらに含む、請求項２１記載の免疫原性ペプチドの製造方法。

２８、上記生育培地から１北免疫原性ペプチドを単離することをさらに含む、請求項２２記載の免疫原性ペプチドの製造方法。

２つ、請求項１記載のイントロンを含まないＤＮＡ分子によりコートされているペプチドであって、配列番号１のアミノ酸配列を有する上記ペプチドに特異的に免疫反応するモノクローナル抗体。

３０、請求項２記載のＤＮＡ分子によりコードされているペプチドに特異的に免疫反応するモノクローナル抗体であって、上記ペプチドがＡＴＣＣ寄託番号第６８５３７号として寄託されている組換え体細菌プラスミド中の唯一のｐＢＲ３２２由来のＥｃｏＲＩ部位に挿入されたＤＮＡ配列によりコードされているペプチドに相当する、上記モノクローナル抗体。

３１　請求項３記載の組換え体細菌プラスミド中の唯一のｐＢＲ３２２由来のＥｃ　ｏ　ＲＩ部位に挿入されたＤＮＡ配列によりコードされているペプチドに特異的に免疫反応するモノクローナル抗体。

３２　請求項４記載のＤＮＡ分子によりコードされているペプチドに特異的に免疫反応するモノクローナル抗体であって、上記ペプチドがＡＴＣＣ１託番号第６８４５０号として寄託されている組換え体バクテリオファージ中の唯一のラムダｇｔｌｌ由来のＥｃｏＲ１部位に挿入されたＤＮＡ配列によりコードされているペプチドに相当する、上記モノクローナル抗体。

３３、請求項５記載のＤＮＡ配列によりコードされているペプチドに特異的に免疫反応するモノクローナル抗体。

３４、請求項６記載の組換え体バクテリオファージ中の唯一のラムダｇｔｌＩ由来のＥｃｏＲ１部位に挿入されたＤＮＡ配列によりコードされているペプチドに特異的に免疫反応するモノクローナル抗体。

３５、請求項２つ記載の抗体に特異的に免疫反応する、実質的に精製されたペプチド。

３６　請求項３０記載の抗体に特異的に免疫反応する、実質的に精製されたペプチド。

３７、請求項３１記載の抗体に特異的に免疫反応する、実質的に精製されたペプチド。

３８、請求項３２記載の抗体に特異的に免疫反応する、実質的に精製されたペプチド。

３９　請求項３３記載の抗体に特異的に免疫反応する、実質的に精製されたペプチド。

４０　請求項３４記載の抗体に特異的に免疫反応する、実質的に精製されたペプチド。

４１、請求項２つ記載の抗体に特異的に免疫反応する免疫原性ペプチドからなるワクチン組成物であって、上記ワクチン組成物がＥｉｍｅｒｉａ細胞表面蛋白質以外のＥｉｍｅｒｉａ蛋白質を実質的に含まない、上記組成物。

４２、請求項３０記載の抗体に特異的に免疫反応する免疫原生ペプチドからなるワクチン組成物であって、上記ワクチン組成物がＥｉｍｅｒｉａ細胞表面蛋白質以外のＥｉｍｅｒｉａ蛋白質を実質的に含まない、上記組成物６４３、請求項３１記載の抗体に特異的に免疫反応する免疫原生ペプチドからなるワクチン組成物であって、上記ワクチン組成物がＥｉｍｅｒｉａ細胞表面蛋白質以外のＥｉｍｅｒｉａ蛋白質を実質的に含まない、上記組成物。

４４　請求１３２記載の抗体に特異的に免疫反応する免疫原生ペプチドからなるワクチン組成物であって、上記ワクチン組成物がＥｉｍｅｒｉａ細胞表面蛋白質以外のＥｉｍｅｒｉａ蛋白質を実質的に含まない、上記組成物。

４５　請求項３３記載の抗体に特異的に免疫反応する免疫原生ペプチドからなるワクチン組成物であって、上記ワクチン組成物がＥｉｍｅｒｉａ細胞表面蛋白質以外のＥｉｍｅｒｉａ蛋白質を実質的に含まない、上記組成物。

４６、請求項３４記載の抗体に特異的に免疫反応する免疫原生ペプチドからなるワクチン組成物であって、上記ワクチン組成物がＥｉｍｅｒｉａ細胞表面蛋白質以外のＥｉｍｅｒｉａ蛋白質を実質的に含まない、上記組成物。

４７、免疫原生ペプチドを主要成分として含むワクチン組成物であって、上記ペプチドは配列番号１のアミノ酸であって、かつ、Ｅｉｍｅｒｉａ種に感染したニワトリの血清中の抗体に特異的に免疫反応する、上記組成物。

４８、請求項２記載のＤＮＡ分子によりコードされている免疫原生ペプチドを含むワクチン組成物であって、上記ペプチドがＡＴＣＣ寄託番号第６８５３７号として寄託されている組換え体細菌プラスミド中の唯一のｐＢＲ３２２由来のＥｃｏＲ１部位に挿入されたＤＮＡ配列によりコードされているペプチドに相当する、上記組成物。

４つ、請求項３記載の組換え体細菌プラスミド中の唯一のｐＢＲ３２２由来のＥＣｏ　Ｒ１部位に挿入されたＤＮＡ配列によりコードされている免疫原生ペプチドを含むワクチン組成物。

５０、請求項４記載のＤＮＡ分子によりコードされている免疫原生ペプチドを含むワクチン組成物であって、上記ペプチドがＡＴＣＣ寄託番号第６８４５０号として寄託されている組換え体バクテリオファージ中の唯一のラムダｇｔｌｌ由来のＥｃｏＲＩ部位に挿入されたＤＮＡ配列によりコードされているペプチドに相当する、上記組成物。

５１、請求項５記載のＤＮＡ配列によりコードされている免疫原生ペプチドを含むワクチン組成物。

５２　請求項６記載の組換え体バクテリオファージ中の唯一のラムダｇｔ１１由来のＥ　ｃ　ｏ　Ｒ１部位に挿入されたＤＮＡ配列によりコードされている免疫原生ペプチドを含むワクチン組成物。

５３　請求項４７記載のワクチン組成物を有効量ニワトリに投与することからなる、コクシジウム症に対するニワトリへの接種法。

５４　請求項４８記載のワクチン組成物を有効量ニワトリに投与することからなる、コクシジウム症に対するニワトリへの接種法。

５５、請求項４つ記載のワクチン組成物を有効量ニワトリに投与することからなる、コクシジウム症に対するニワトリへの接種法。

５６、請求項５０記載のワクチン組成物を有効量ニワトリに投与することからなる、コクシジウム症に対するニワトリへの接種法。

５７　請求項５１記載のワクチン組成物を有効量ニワトリに投与することからなる、コクシジウム症に対するニワトリへの接種法。

５８、請求項５２記載のワクチン組成物を有効量ニワトリに投与することからなる、コクシジウム症に対するニワトリへの接種法。

５９　上記ワクチン組成物を注射によりニワトリに投与する、請求項５３記載の接種法。

６０　上記ワクチン組成物を注射によりニワトリに投与する、請求項５４記載の接種法。

６１　上記ワクチン組成物を注射によりニワトリに投与する、請求項５５記載の接種法。

６２、上記ワクチン組成物を注射によりニワトリに投与する、請求項５６記載の接種法。

６３、上記ワクチン組成物を注射によりニワトリに投与する、請求項５７記載の接種法。

６４、上記ワクチン組成物を注射によりニワトリに投与する、請求項５８記載の接種法。

浄書（内容に変更なし）明細書組換え体技コクシジアワクチン元型り分野本発明は、組換えペプチド抗原から成る抗コクシジアワクチンに関するものである。

一期の背景コクシジウム症（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｓｉｓ）は広範囲にみられる病気であり、家禽類産業に対して重大な経済的損害を与える。胎内への侵入による感染はアメリカ属（Ｅｉｍｅｒｉａ）の単独または複数の種によるものである。これらの寄生虫は鳥類の消化管に侵入し、体重増加の減退、腸および盲腸の障害、色素脱失、栄養変換の低下をもたらす。この病気が与える家禽類産業の経済的損害は年間３億ドルにのぼると計算されている（Ｈ，Ｄ、ダンフォース、ＰＣオーゲスティン（Ｄａｎｆｏｒｔｈ、Ｈ，Ｄ、＆　Ａｕｇｕｓｔｉｎｅ、Ｐ、Ｃ，）、１９８５年、［ハイブリドーマ抗体と組換えＤＮＡ技術を用いた原虫類ワクチンの開発Ｊアビアン・ディシーズ（Ａｖｉａｎ　Ｄｉｓｅａｓｅ）誌３０巻：　３７−４２）、今日コクシジアの不活化および殺虫の薬剤によりこの病気に対処することで、さらに年間１Ｇ！ドルの生産コストの上昇が家禽類産業において生じている。

現在市販されている抗コクシジア蘂剤に対して耐性を獲得しつつあることから、免疫学的技術によるこの寄生虫に対するワクチンの開発が、様々なグループで研究されている。

コクシジア寄生虫の細胞表面の特定の領域にはっきりとした抗原特性があることが示されている（ダンフォース等、１９８５＞。サブユニット法が、様々な抗原に対するある程度の免疫あるいは完全な免疫を誘導するのに有効な方法であると示されたことから、アイメリアの抗原性領域を分子レヘルで操作することで宿主の免疫反応を高める手法が、抗コクシジアワクチンの作製方法として検討されてきた。

アイメリア属の細胞表面蛋白質をそのまま単離して、ワクチンの効力を特定し検討できるだけの十分量を得ようとする場合、材料の供給に困難をきたすことは避けられない。そこでこの抗原蛋白質をコードする遺伝子をバイオテクノロジーの手法により単離し、組換え抗原蛋白質を宿主となる細菌や酵母細胞で大量に生産させる系が利用されている。組換え抗コクシジアワクチンについては現在多くのグループで研究されている。これらのワクチンの多くについて、腸障害または胞子原虫嚢胞体の排泄を抑える作用を持つことが、実験的な研究で示されている。

これらの研究者がそれぞれの蛋白質を合成した際には同じ組換え技術と方法を用いたが、各ワクチンが異なるものであることは、異なる組換え抗原のアミノ酸配列をもとに統計的確立を計算すれば示すことができる。

ダンフォース等（１９８５）が発表したのは、アイメリア属の特定の種の感染によるコクシジウム症をある程度防ぐような組換え体コクシジア蛋白質である。

この記事ではこの蛋白質がコクシジアの他の種に対しても交差して作用し感染を防ぐかについては述べられていない。

キム（Ｋｉｍ）等（１９８９、インフェクションアンドイミュニティ（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）誌、５７巻、２４３４−４０頁）の報告はアイメリア　アセルブリナ（Ｅｉｍｅｒｉａ　ａｃｅｒｖｕ　Ｉ　１ｎａ）の分裂小体のクローン化された９２５０表面抗原に関してである。クローン化された抗原をもつ大腸菌形質転換体を接種することで、ある程度感染を防ぐことができた。

多ローン化された抗原遺伝子は、最初プラスミドを保持していた大腸菌がもはや生育しなくなっても、腸内菌相で維持されていた。

ミラー（Ｍｉ　Ｉ　ｌ　ｅ　ｒ）　（１９８９、インフェクションアンドイミュニティ誌、５７巻、２０１４−２０頁）はアイメリア・テネラ（Ｅｉｍｅｎｒｉａ　ｔｅｎｅｌｌａ）の蛋白質について発表している。この蛋白質はアイメリア・アセルブリナ（Ｅｉｍｅｒｉａ　ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ＞の分裂小体に対する抗体を用いて　−同定された。このクローン化された蛋白質の遺伝子を持った大腸菌組換え体が生育していると、感染はある程度抑えられる。

クラーク（Ｃ１ａｒｋｅ）等（１９８９、モレキュラーアンドバイオケミカルパラザイトロジ−（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ）誌、２２巻、７９−８７頁）はアイメリア・テネラのかなりの数の抗原をコードするＤＮＡ配列を、免疫血清を用いて遺伝子ライブラリーを直接スクリーニングすることで単離したと報告している。これらの抗原が感染を抑えるかどうかに関しては、何も報告されていない。

メルク社（Ｍｅｒｃｋ　＆　Ｃｏ）によるオーストラリア特許出願（ＡＵ−Ａ２８５４２／８９）はアイメリア・テネラの組換え蛋白質抗原について公表している。またこうした抗原の少なくとも一つの配列を公表している。

ソルベーアンドシー社（Ｓｏｌｖａｙ　ａｎｄ　Ｃ１ｅ）によるオーストラリア特許出１ＩＩ（ＡＵ−Ａ６５８６９／８６）はアイメリア　テネラ、アイメリア・ネカトリクス（Ｅｉｍｅｒｉａ　ｎｅｃａｔｒｉｘ）、アイメリア・マキシマ（Ｅｉｍｅｒｉａ　ｍａｘｉｍａ）に対する免疫を付与するクローン化された抗原について発表している。この抗原はジスルフィド結合により結ばれた２本のポリペプチドから成り、それぞれのペプチドは１７，０００．８，０００の分子量を持つ。

ジェネックス社（Ｇｅｎｅｘ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の国際特許出願（国際公開番号９０１０　Ｏ４０３）はトリコクシジアから発見された抗原蛋白質をコードする遺伝子のクローン化について公表している。公表されたのはコクシジアに対する抗体と免疫反応を起こす７種の異なる配列である。

アクゾＮ、Ｖ、（Ａｋｚｏ　Ｎ、Ｖ、）による欧州特許第０３４９０７１号は家禽類の免疫に用いることができるアイメリア属のポリペプチドについて公表している。このペプチドのクローンはアイメリア・アセルブリナ、アイメリア・テネラから単離された。

Ｆ　ホフマン　ラ・ロッヘＡＧ（Ｆ、Ｈｏｆｆｍａｎ−１ａ　ＲｏｃｈｅＡＧ）による欧州特許第０３４４８０８号はコクシジウム症を防ぐのに用いることができるクローン化された抗原について公表し、抗原の配列も記している。

メルク社による欧州特許第０３２４６４８号ではアイメリア・テネラのＡ、Ｃ，Ｆ、Ｈの各抗原グループをコードする遺伝子のクローン化が公表されている。

鬼明Ｑ慝票コクシジウム症に対するワクチンの開発が本発明の目的である。このワクチンは新規のエピトープから成るペプチド免疫原を含む。

この抗原の単純で効率的な生産法を開発することも、本発明の目的である。

鶏のコクシジウム症を防止するための方法の開発もまた、本発明の目的として加えられる６本発明が規定するワクチン合成物は、ラムダｇｔ１１バクテリオファージ上の単一のＥｃｏＲ１部位に挿入されたＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ寄託番号第６８４５０号に寄託）、あるいは組換え細菌プラスミドｐ　ＢＲ３２２上の単一のＥｃｏＲＩ部位に挿入されたＤＮＡ配列（ＡＴＣＣＷ託番号第６８５３７号に寄託）に一致する組換えＤＮＡを発現させて産生じた免疫原性ペプチド、もしくはこれらの配列にコードされたエピトープを含むペプチドからなる。

本発明はまた望みのエピトープを含むペプチド免疫原を産生ずる方法、すなわちラムダｇｔ１１組換えバクテリオファージ上の単一のＥＣｏＲＩ部位に挿入されたＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ寄託番号第６８４５０号に寄託）、あるいは組換え細菌プラスミドｐＢＲ３２２上の単一のＥｃｏＲＩ部位に挿入されたＤＮＡ配列（ＡＴＣＣ寄託番号第６８５３７号に寄託）とアミノ酸配列が一致するペプチドをコードしたＤＮＡ配列に関して、これを含むＤＮＡ分子を用いて宿主菌を形質転換し、これが発現するよう形質転換細胞を生育させることも規定する。

本発明はさらにアイメリア属の寄生虫種が感染した鶏が産生ずる抗体と特異的に免疫反応を起こす新規のペプチドをコードするような、イントロンのないＤＮＡ配列の開発を規定する。このペプチドは配列番号１として記載したアミノ酸配列を含む。

本発明は上記に加え、鶏に本発明のワクチンを投与することにより、鶏にコクシジウム症に対するワクチン接種を行う方法も規定する。

アイメリア・マキシマのメツセンジャーＲＮＡがら免疫原蛋白質をコードするｃＤＮ＾ＤＮＡ配列、クローン化した。この免疫原蛋白質は、鳥類のワクチン接種に用いるとコクシジアの殺虫および／あるいは不活化の効果を与える抗原決定基を単数または複数持つ、このワクチンは在来のワクチンに比べ、アイメリア属の複数の寄生虫種に対してより高い効力と交差反応性を持つ。

羽井用」μ１朋ここに示す発明の実施に用いられるのは、特に示さない限り、当該分野の技術の範囲内でよく用いられる分子生物学、微生物学、取換えＤＮＡ手法である。こうした技術については文献で十分に説明されている。たとえばサムプルツク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）等の［モレキュラークローニング・実験室マニュアル」（１９８９）、ｒＤＮＡクローニング：実施のアプローチ」Ｉ、■巻（Ｄ、Ｎ。

グローバー（Ｄ、Ｎ、Ｇｌｏｖｅｒ）ｌｉ、１９８５）、「オリゴヌクレオチドの合成、（Ｍ、Ｊ、ガイド（Ｍ、Ｊ、Ｇａ１ｔ）綱、１９８４）、「核酸ハイブリダイゼーショｎ」　（Ｂ、Ｄ、ハメス、Ｓ、Ｊ　ヒギンス（Ｂ、Ｄ、Ｈａｍｅｓ　＆　Ｓ。

Ｊ、Ｈｉｇｇｉｎｓ）ＩＩ、１９８５）、「転写と翻訳Ｊ（Ｂ、Ｄ、　ハメス、Ｓ、Ｊ。

ヒギンス編、１９８４）、「動物細胞培養、（Ｒ，１，フレシュニー（Ｒ，Ｉ　。

Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）綱、１９８６１ｒ固定した細胞と酵素Ｊ（ＩＲＬ出版、１９８６）、Ｂ、パーパル（Ｂ、Ｐｅｒｂａｌ）の［モレキュラークローニングのための実践的ガイドＪ　（１９８４＞を参照されたい。

定−菩ここに示す発明の記述において以下の術語を用いるが、その陛下に述べる定義に従う。

「組換えＤＮＡＪは２つ以上の生物種から得られたＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子である。

あるＤＮＡ配列が他のＤＮＡ配列と「一致する」のは、この二つの配列が同一のアミノ酸配列をコードする場合である。

あるアミノ酸配列が他のアミノ酸配列と「一致する」のは、前者の配列のアミノ酸の位置の少なくとも７５％を、後者の配列と同一のアミノ酸残基が占めている場合である。望ましいのはアミノ酸の存在位置の９０％が同一である場合で、もっとも望ましいのはアミノ酸の存在位置の９５％が同一である場合である。また２つのアミノ酸配列間の相違が保存された置換だけであるならば、この２つの配列は互いに一致するとみなす。

「保存されたアミノ酸置換」とは、ある配列のアミノ酸残基が同じ性質の他の残基で置換されること、すなわち結果として生じるペプチドの二次構造、三次構造がほとんど同一であるような置換である６互いに保存された置換とされるアミノ酸の組み合せは、当該分野に一般に従事する者にはよく知られている。

ペプチドがある抗体と「特異的に免疫反応する」とは、この抗体の抗原結合部位にペプチドが結合する場合である。

「免疫原性ペプチド」とは、動物に注射投与した結果、このペプチドに特異的に免疫反応する抗体産生能をこの動物で向上させるペプチドである。

「交差反応ペプチド」とは抗体上の同一の抗原結合部位を競合するペプチドである。あるペプチドが抗体と結合すると一方のペプチドが結合できない場合、この２つのペプチドは交差反応しているといえる。

本発明において「はぼ精製されたペプチド」とは、実質的にコクシジアの他のペプチドを含まないものを指す、もっとも単純には、本発明のコクシジア蛋白質を組換え宿主細胞で発現させることで、こうしたペプチドを得られる。またこれとは別に本発明の抗体を用いれば、本発明のコクシジア蛋白質を免疫親和性により精製することができる。

旦ＮΔ配列ここに示す発明はコクシジウム症に対するワクチンに関するものである。このワクチンには免疫原組換えペプチドが含まれ、これまで知られていないエピトープがこのペプチド中に存在する。このエピトープはアイメリア属の多くの生物種のエピトープと交差反応する６本発明では組換えペプチドをコードするＤＮＡ配列を持った形質転換細胞も提供する。

ワクチンの免疫原ペプチドをコードするｃＤＮＡ配列を得る際には、まずアイメリア属コクシジアの分裂小体からメツセンジャーＲＮＡを単離した。メツセンジャーＲＮＡを逆転写酵素の鋳型としてｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩにより消化し、プラスミドベクターｐＢＲ３２２にショットガン法でクローン化した。コンピテント状態にある大腸菌細胞ＨＢＩＯＩをこのクローニングベクターにより形質転換した。また同時にＥｃｏＲｒにより消化したｃＤＮＡをラムダｇｔｌ＋バクテリオファージ上のＥｃｏＲＩ部位にライゲーションし、大腸菌Ｙ１０８８およびＹ１０９０をこのベクターで形質転換した。形質転換体のコロニーを選択培地上に播き、アイメリアの胞子原虫嚢胞体を感染させたトリから調製したポリクローナル抗血清を用いて、目的のｃＤＮＡ配列を含むコロニーを単離した。陽性のクローンについては増殖させ、組換え蛋白質の有無についてウェスタンプロット解析により検定した。ｐＢＲ３２２ライブラリーから単離された１（ＩＩ！の陽性クローンに含まれていたｃＤＮＡがコードする組換えペプチドは、これまで知られていないエピトープであることがわかった。この配列はｒＰＶｌ−８９と命名され、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）にＡＴＣＣ寄託番号第６８５３７号として寄託された。同様のクローンはラムダｇｔｌ＋ライブラリーからも単離され、ｒＢＰｌ−２と命名され、ＡＴＣＣ寄託番号第６８４５０号として寄託された０本発明の抗原ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、寄託されたクローンをＥｃｏＲＩ消化することにより単離することができる。

本発明のＤＮＡ配列を含むクローンの単離は、当該分野に一般的に従事する者がよく知られた方法により行うことが可能である。たとえばアイメリアＤＮＡ配列のライブラリーを任意のベクターに横築しくたとえばサムプルツク等を参照）、・ｒＢＰｌ−２、ｒＰＶｌ　８９から単離したｃＤＮＡ配列をプローブとしてハイブリダイズさせることによりクローンを選択することができる。また配列番号１をコードする縮重した一連のＤＮＡプローブを作製し、このプローブとのハイブリダイゼーションによってライブラリーからクローンを選択することもできる。

選択したクローンから単離したＤＮＡは発現ベクターにサブクローン化し、このベクターで形質転換した細胞が発現する蛋白質については、後で述べる方法により調製された本発明の組換え蛋白質に対する抗体との免疫反応性、アイメリアで感染させたトリの血清との免疫反応性を前述のように検定するのが望ましい、ここに記した内容の程度を考えれば、こうしたサブクローニングは当該分野の一般的な従事者がその技術で容易に行うことができるものといえる。免疫反応性の組換えペプチドを発現するクローンは、以下に示すようにワクチンの調製に用いることができる。本発明のＤＮＡ配列のアミノ酸コーディング領域は、寄託されたベクターのコーディング領域より長くしたり短くすることができる。ただしこの場合には、このＤＮＡ配列により発現される組換えペプチド中に少なくとも１つのエピトープが残されて、寄託された菌株が産生するアイメリアのペプチドと特異的に免疫反応を起こす抗体に対してこのエピトープが交差反応しなければならない、ｒＢＰｌ−２、ｒＰＶｌ−８９の全配列または部分配列と一致するＤＮＡ配列を持ったクローンの選択、調製は、当該分野に一般に従事する者のなせるところであり、その際にはよく用いる分子生物学の手法とともに、本明細書に示された情報と、自由選択であるがＡＴＣＣ寄託番号第６８４５０号またはＡＴＣＣ寄託番号第６８５３７号として寄託された形質転換細胞を併用すればよい。

徂携え俸員皇ヌｒＢＰｌ−２、ｒＰＶｌ−８９によりコードされる組換えアイメリア蛋白質は陽性形質転換体コロニーの細菌ｅｕｔａから単離し、硫酸アンモニウム分画とイオン交換クロマトグラフィーにより精製した１組換えアイメリア蛋白質の分子量がおよそ４５−６５キロダルトンであることを、ドデシル硫酸ナトリウムを用いたポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により決定した０本発明の組換え蛋白質のアミノ末端のアミノ酸配列は、配列番号１として記載した配列と一致する。このアミノ末端の配列は他の既知のアイメリア蛋白質のいかなる配列とも異なっており、本発明で寄託されたクローンに挿入されているＤＮＡ配列は、これまで当該分野で知られていないペプチドをコードしていることが示された。

精製した組換え蛋白質を特定の病原を持たない鳥類に投与し、後にこの鳥類にアイメリア属の様々な寄生虫種の感染を試みた１組換え蛋白質を用いたこのワクチン接種は、アイメリア属の広範な種にわたって感染を防止した。この組換え蛋白質は、たとえばアイメリア・テネラ（Ｅ、ｔｅｎｅ　Ｉ　Ｉａ）　、アイメリア・ミティス（Ｅ、ｍ１ｔｉｓ）、アイメリア・マキシマ、アイメリア・プルネッテイ（Ｅ、ｂｒｕｎｅｔｔｉ）、アイメリア・アセルブリナ、アイメリア・プレコックス（Ｅ、ｐｒａｅｃｏｘ）のそれぞれに特異的な免疫反応を示す抗体全てと反応する。従って本発明のペプチドは、アイメリア属の多くの種にみられる表面蛋白質と広範な交差反応性を持つ新規の抗原である。この性質はこれまでに得られたペプチド抗原が概して１つの種のみと反応するだけであるのとは対照的である。

本発明の組換え蛋白質に一致するポリペプチドは、発現ベクターに前述のアイメリアのライブラリーから選択したクローンのＤＮＡをのせて、これを用いて細胞を形質転換し、この形質転換体から得ることができる６適当な発現ベクターと宿主細胞の系は当該分野に一般に従事する者にはよく知られており、またたとえばサムプルツク等の書（１９８９）に記されている。ペプチドの調製は、形質転換した細胞をクロー化したＤＮＡが発現する条件下で増殖させることにより可能である。らちろん発現されるペプチドは、これが交差反応する限りにおいてはｒＢＰ−１ペプチドやｒＰＶｌ−８９ペプチドよりも長くても短くても構わない。

選択した発現ベクターに応じて、ペプチドを融合蛋白質として、あるいは分泌されたり細胞内部に保持される成熟蛋白質として、また封入蛋白質として発現させることが可能である。目的のペプチドの培養液からの回収はよく知られた方法による。すなわち遠心分離、濾過、抽出および同種の操作であり、細胞の破壊を伴ったり伴わなかったりする。いずれにせよペプチドがどのように発現されているかによって決まる。目的とするペプチドの粗抽出水層や懸濁液中での濃度を高めるには、当該分野に一般に従事する者にはよく知られた蛋白質抽出法による。適当な方法を実施例に示した。

え蛋　に　異　な抗本発明の組換えペプチドに特異的に反応する抗体は、当該分野に従事する者には容易に理解できる様々な方法（たとえばサムプルツク等を参照）に従って調製できる。コクシジウム症にかかった鶏の血清を抗体の材料とすることが可能である。たとえばＡＴＣＣ寄託番号第６８４５０号として同定されるラムダｇｔｌｌバクテリオファージ上の、単一のＥＣｏＲｌ部位から回収されたＤＮＡ配列を用いて形質転換した細胞を利用して、血清から選択的に結合するものを抽出することにより、抗体を精製することがてきる。あるいはまた上で述べた方法で得られた組換え蛋白質を動物に抗原として注射投与することにより、ポリクローナル抗体を産生させることもできる。この結果生じた抗血清を直接使用したり、既に述べた方法で精製して使用することが可能である。

さらに別の方法としては、蛋白質と特異的に免疫反応を起こすモノクローナル抗体を、よく知られた手法（たとえばコーラ−、ミルスタイン（Ｋｏｈｌｅｒ＆　Ｍｉ　ｌ５ｔｅｉｎ）、１９７６、ヨーロピアンジャーナルオブイミュノロジ（Ｅｕｒ、ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ　１．）誌６巻：６１１頁を参照）で調製することが考えられる。この場合には本発明のペプチドを抗原として用いたり、抗体の選択に用いたり、またはこの両者に用いることになる。様々な方法を用いて本発明の組換え蛋白質に特異的に免疫反応を起こす抗体を調製することが可能であり、こうした方法は当該分野に一般に従事する者には容易なものである。

組換え抗コクシジアワクチン組換えペプチドを含むワクチン組成物は、当該分野に一般に従事する者によく知られた標準的な方法により調製できる。この一つを具体的に示せば、本発明で開発されたＤＮＡ配列を発現する組換え系で免疫原ペプチドを生産し、これを単離することが考えられる。たとえば目的の外来遺伝子を持つ細菌細胞を大容量の培養装置で培養し、遠心分離により集菌し細胞を高圧下でホモジナイズすることなどにより破壊する。生じた細胞粗抽出物を適当な希釈’？ｌｉ（実施例で用いられているようなもの）に再懸濁し、濾過することで抗原の水層懸濁物を得る。組換え蛋白質は粗調製の状態でも投与することが可能である。たとえば０．１Ｍリン酸ｖ１１！ｉ液（ｐＨ７，４＞で５０−５００μｓ／ｍｌに希釈し、滅菌された０、２２ミクロンのフィルターを通して投与すればよい。

だが蛋白質の粗調製液は投与する前に、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、または他の抽出手法を用いた調製により、組換え蛋白質の濃度を高めておくことが望ましい、さらに必要であればカラムクロマトグラフィーやゲル電気泳動などを含めたクロマトグラフィー精製や濃縮の操作を行う。

コクシジウム症にかかった鶏の血清から調製した抗体から成る親和性カラムを用いて、精製するのがもっとも望ましい、調製系の温度、ｐＨ１酸素飽和、栄養要求性などの諸条件は、用いる装置と細胞の種類により変化するが、最適な条件は普段の実験から自ずと決定される。この方法を用いれば、治療効果の評価および実際の治療に必要な組換え蛋白質を大量に作製することができる１組換えへプチド抗原の調製および投与の方法については、ここに参考文献として掲げた欧州特許第０３４４８０８号にも示されている。

本発明のワクチンは鶏（Ｇａｌｌｕｓ　ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）をコクシジウム症の感染から守るのに使用することができる。ワクチンの投与はよく知られた方法で行うことができる。たとえばワクチン水溶液に補助薬を加えたものまたは加えないものを、筋肉注射あるいは皮下注射、腹膜注射により投与すればよい。

他に考えられる方法としては、ワクチンを「生ワクチン」として投与する、すなわちペプチド免疫原をコードするＤＮＡ配列を伝染性上皮腫ウィルスや改変したウィルスなどのウィルスゲノム上に挿入し、これを防疫する鶏の集団に感染させることが挙げられる。こうした「生の」ワクチンの調製と投与についてはここに参考文献として揚げた国際特許出ＩＩＩ（ＰＣＴ／ＵＳ８９１０２９１８＞に記されている〈特に６頁を参照）。もう一つの「生ワクチン」法は、正常な腸内細菌相を望みのペプチド抗原をコードするＤＮＡで形質転換し、目的とする集団に投与する方法である。これについてはここに参考文献として揚げた欧州特許第０３２４６４８号に記されている。

本発明は、細胞が生きている、「破壊されている」を問わず、アイメリア細胞全体からのワクチン合成物の作製を意図するものではない。なぜならそうしたワクチンは、アイメリア細胞の細胞抽出残存物による鳥類の感染の危険性を伴うものだからである。本発明のワクチンはアイメリア蛋白質と交差反応する一種または複数の免疫原ペプチドを含むものであり、しかも他のアイメリア蛋白質をほとんど含まれていない。免疫により産生される抗体はアイメリア細胞の表面に存在する蛋白質とまず容易に反応すると考えられるから、このワクチンはアイメリアの細胞表面蛋白質と交差反応するペプチドからなり、アイメリアのすべての非表面局在性蛋白質がほとんど除かれている、と表現するのが適切であろう。

また本発明は１穫以上の免疫原を含んだワクチンの作製を意図している。このようなワクチンは２種以上の異なるペプチドを含み、これらのペプチドがそれぞれアイメリア属の生物種の細胞表面にある異なる蛋白質のエピトープと交差反応することになろう、こうした異なるペプチドのそれぞれが、アイメリア属の少なくとも二つの異なる寄生虫種の表面蛋白質それぞれと交差反応することが望ましい。もっとも望ましいのは、免疫原ペプチドのうち少なくとも一つが、ｒＢＰｌ− ２上の組換えＤＮＡ配列によりコードされるペプチドと交差反応する場合である。なぜならこのペプチドはアイメリア属の多数の異なる生物種に存在する表面蛋白質と交差反応すると考えられるからである。

以下に示す実施例は本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を制限するものではなく、本発明の範囲は請求の範囲によってのみ限定される。

実施例１−抗血清の調製特に病原体を有さない各鳥に約５０．０００−７５．０００の胞子形成したＥ。

ｍａｘｉｍａの接合子＊（ｏｏｃｙｓｔ）を経口で与えた。投与１４日後、冬鳥から５ｃｃの全血を上腕静脈穿刺（ｂｒａｃｈｉａｌ　ｖｅｎａｐｕｎｃｔｕｒｅ）により採集したにの唾液を集め、３７℃で３０〜４５分間インキュベートし。

４℃で６０分間冷却し、つぎに３０００ｒｐｍで１ｏ分間遠心して免疫反応性が高い抗血清を得た。血清中の脂質は、血清と等量の脂質除去溶液（ＬｉｐｉｄＣｌｅａｒｉｎｇ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｆｕｌ　１ｅｒｔｏｎ、ＣＡ）を加えて１０秒間ポルテックスして除去した。この溶液をつぎに３０００ｒｐｍで２分間遠心して脂質が除去された上層をアスピレーシヨンて回収し、結合パンファーと１：１に希釈した。つぎに抗体を組換え体プロティンＡキット（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｆｕ　ｌ　１ｅｒｔｏｎ、ＣＡ）を用いて業者のプロトコールに従って精製した。希釈した血清を組換え体プロティンＡカラムにのせて溶出させ、つぎに１０ｍ１の結合パンファーで洗浄した。

このプロティンＡカラムをつぎにバッファー交換管につないで５ｍｌの溶出液をカラムに加え、０．５ｍｌから１ｍｌのフラクションを回収した。さらに交換バッファー（０，１Ｍ生理食塩水）をカラム装置に通し、抗体を完全に溶出させた。

抗体を含むフラクションは２８０ｎｍでの吸光度から同定した。適当なフラクションを集めてキットに３まれる試料濃縮カラムで濃縮した。このステップにおける典型的な濃度は０．２−２．０ｍｇ／ｍＩの範囲内にあった。

、腸閉の　原に詩　的な抗体の除去大腸菌と反応する抗体はＳａｍｂｒｏｏｋ　（１９８９）らの方法により吸収した。形質転換をしていない大腸菌Ｙ’１０９０株のコロニーを１０ｍ１の滅菌したＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩培養した。翌日、細菌細胞を遠心により回収し、５００μｍの滅菌蒸留水に懸濁した。この細胞をドライアイスと３７℃の水を用いて凍結融解を４〜５サイクル行い破壊した。これを氷水につけて超音波処理（３０秒ｏｎ、３０秒ｏｆｆ）を４〜５回行った。この５００μＩの粗溶菌液を１０００μｍの抗体に加えて室温で４時間インキュベートした。インキュベーション後、抗体溶液を１０．０００ｒｐｍで１０分間遠心した。この上清を今後の使用のために４’Ｃで保存した。

実施例２−抗コクシシア接合　（ｏｏｃｖｓｔ）の　疹原の調製接合子嚢の回収の為にＳＰＦ鳥を、若干の修正を含むＮｏｒｔｏｎ（１９８９）らの方法によりバッテリ育雛器にいれて飼った。第−日月に、鳥に適当な投与量の適当なＥｉｍｅｒｉａ種（効力の高い投与としてはＥ、ｔｅｎｅ　ｌ　ｌａ、Ｅｍｉｔ　ｉｓ、Ｅ、ａｃｅｒｖｕｒｉｎａ、Ｅ、ｍａｘｉｍａ、Ｅ、ｐｒａｅｃｏｘ、Ｅ、ｂｒｕｎｅｔｔｉの混合物、核酸の抽出のためにはＥ、ｍａｘｉｍａ＞を６羽あたりＬｏｇの飼料に混ぜて与えた。第４〜６日月に鳥の音便を２％ニクロム酸カリウムが入ったステンレススチールの鍋に回収した０回収後、音便を低速のプロペラ式ホジナイザーで撹はんし流し込むことがてきるスラリーを形成させた。これをつぎに二重にした寒冷しや（ｃｈｅｅｓｅ　ｃｌｏｔｈ）で瀘した。

この濾液を１６００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清を捨て、ペレットを２．２Ｍのショ糖に懸濁して再び遠心した。浮遊層をサイホンで吸って除きこれを保存した。残りのペレットを再懸濁して再び遠心した。このときの浮遊層をサイホンで吸い、保存してあった浮遊層に加えた。これを水で希釈（接合子嚢三に対して水道水上の割合）して、３０００ｒｐｍで１０分間遠心した。接合子嚢のペレットをｌＯＯｍＩの水に再懸濁し、ＭｃＭａｓｔｅｒのチャンバースライド（○ｌｙｍｐｉｃ　Ｅｑｕｉｎｅ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ｌ５ｓａｑｕａｈ、ＷＡ）を用いて定量した。つぎに、１００ｍ１の懸濁液は、ＡｍｅｒｉｃａＶローチーター（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ　５ｕｐｐｌｙ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ。

Ｍｉａｍｉ、ＦＬ）で１４０ｒｐｍ、６４−７２時間エアレーションをして激しく撹はんして胞子形成させた。

工旦ＮΔＱ抽里及び積数ＲＮＡはＳａｍｂｒｏｏｋらの方法（１９８９）を用いて抽出および精製を行った。胞子形成させたＥ、ｍａｘｉｍａの接合子嚢を遠心により回収し、冷生理食塩水で２回洗浄し、それがら２００μＩｃｒ）ＲＮＡ抽出バッファー（０，１４ＭＮａＣｌ　、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８，６＞。

０．５％Ｎｏｎ１ｄｅｔ−４０，１ｍＭジチオスレイトール、２０ｍＭ　ｖａｎａｄｙｌ　ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ混合物）に軽くポルテックスをして懸濁した。接合子嚢を酸で洗浄したガラスピーズと共に３分間間欠的にポルテックスをしてバラバラに拡散させ、続いて凍結溶解を繰り返して細胞質を放出させた。

細胞の破片はミクロ遠心チューブで５０００ｒｐｍ、２〜３分間遠心して除いた。

この上清に２００μｍのタンパク質分解酵素バッファー（０，３Ｍ　Ｔｒｉｓ− ＨＣｌ、ｐＨ８，０，０，３Ｍ　ＮａＣｌ、２％５ＤＳ）　と７０−ｒ＋−ゼＫ（最終濃度５０μｇ／ｍｌ　）を加えた。このチューブを穏やかにポルテックスをして中身を混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。タンパク質を等量のフェノール−クロロフォルムで抽出し、５０００ｇで１０分間遠心して水相を回収した。

この水相を新しいミクロ遠心チューブに移し、４００μｌの冷インプロパツールを加え、よく混合して氷水上で３０分間インキュベートした。ＲＮＡを１５．。

００ｒｐｍで１０分間遠心して回収した。上清をアスピレータ−で吸い出し、ペレットを１ｍｌのエタノールで洗浄して再遠心した。ペレットをチューブの菱をあけたまま室温でエタノールがすべて蒸発するまで乾燥させた。このペレットを１０ｍＭのＭｇＣｌ２．０．１ｍＭジチオスレイトール及び２μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ　ｆｒｅｅ　ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　ＤＮａｓｅを含む２００Ａ１＋の５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０＞に溶解した。３７ ℃で６０分間インキュベートした後、ＥＤＴＡとＳＤＳをそれぞれ最終濃度１０ｍＭ及び０．２％になるように加えた。この溶液を等量のフェノール−クロロフォルムで一度抽出した６水相を１５．ＯＯＯｒｐｍで５分間遠心して分離し、新しいチューブに移して０．１容積の３Ｍ酢酸ナトリウム（最終濃度０．３Ｍ）と２５容積の冷エタノールを加えて氷水上で３０分間固いた。ＲＮＡを再び１５．０００ｒｐｍで５分間遠心して回収し、蓋をあけたまま空気中でエタノールが蒸発するまで乾燥させた。ペレットを２００μｍのＴＥ　（ｐ）１７．６）に溶解して５００μｍのエタノールを加え、つぎにさらに精製するまで一７０’Ｃで保存した。

この核酸粗抽出液からｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムを用いて精製した。カラムは２ｍｌのオリゴ（ｄＴ）セルロースのスラリーとローディングバッフｙ−（２０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ、ｐＨ７，４，０，ＩＭ　ＮａＣｌ　、１ｍＭ、ＥＤＴＡ、０．１％５ＤＳ）を混合し、０５インチのグラスウールパツキンがついた５ｍｌ注射管に入れて作製した。このスラリーをつぎに、３ｍｌの０．１’ＭＮａＯＨ１５ｍＭ　ＥＤＴＡで洗浄したにのカラムを蒸留水で、溶出液のｐｉ（が８より低くなるまで洗浄し、最終的に５ｍｌの平衡バッファー（４０ｍＭＴｒ　ｉｓ、ｐＨ７，４，ＩＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１％５ＤＳ）で平衡化し夕。溶解したＲＮＡを６５°Ｃで５分間加熱し、６５℃にあらがしめ加熱したローディングバッフｙ−（４０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ、ｐＨ７，４，１Ｍ　ＮａＣｌ。

１ｍＭ、ＥＤＴＡ、０．１％５ＤＳ）と混合し、２分間おいて冷ました。この試料をつぎに、オリゴ（ｄＴ）カラムにのせた。溶出液を回収し、６５℃で加熱し、２分装置いて冷ました。この溶出液を再びカラムにのせて、５ｍｌのローディングバッフｙ　−（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ７，４，Ｏ，１Ｍ　ＮａＣ１，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１％５ＤＳ）を流した。このときのポリＡを持たないＲＮＡを含む溶出液は捨てた。つぎに溶出バッフ７　（１，５ｍｌの１０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７，４，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０５％５ＤＳ）をカラムに加え、１０滴ずつ＜７）７ラクシヨンを回収した。ＲＮＡを含むフラクションは２μｍの各カラム試料をエチジウムブロマイドを含むアガロースプレート上にスポットし、２０分後短波長の紫外線を当てて同定した。適当な試料フラクションは陽性フラクションをすべて集め、１／１０容積の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６，０）と２．５容積のエタノールを加えて精製、濃縮した。この溶液をつぎに３０分間ドライアイス上でインキュベートして１０．０００ｒｐｍで１ｏ分間遠心した。このときのペレットを８０％のエタノールで洗浄し、真空下で１５分間乾燥させ、オートクレーブ滅菌した水で約１μｇ／μｍの濃度に溶解した。このｍＲＮＡをｃＤＮＡ合成に使用するまで一７０℃で保存した。

ｃＤＮＡ合成ｃＤＮＡはｃＤＮＡ合成システム（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて業者のプロトコールにより合成した。ジエチルピロ炭酸（ＤＥＰＣ）処理した滅菌チューブに、１０μｍの反応バッファー（２５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ８，３゜３７５ｍＭ　ＫＣＩ、１５ｍＭ　ＭｇＣｌ２５０ｍＭジチオスレイトール＞、　２．５μ＋の１０ｍＭ　ｄ’ＮＴＰ（各５００μｍｏｌのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ。

ｄＴＴＰ）、’３ｔ１１のオ！Ｊゴ（ｄＴ）、１０μｌのｍＲＮＡ、２０μＩのＤＥＰｃ処理水および２．５μｌのＭ−ＭＬＶ逆転写酵素を加え３７℃で１時間インキュベートし、それから氷水につけたにの反応液に２８８．２５μｍのＤＥＰＣ処理水を加え、１．ＯｍＭｄＮＴＰ混合物、４０μｌのセカンドストランドバッフｙ−＜１８８ｍＭ　Ｔｒｉｓ−）１ｃＩ、ｐＨ８，３，９０６ｍＭ　ＫＣＩ、１００ｍ、Ｍ硫酸アンモニウム、４６ｍＭ　ＭｇＣＬ　、３７．５ｍＭジチオスレイトール、１．５ｍＭ　ＮＡＤ）、Ｌｏμｆの大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１．１．７５ｔｔｌ　ＲＮａｓｅＨ，１，２５μｍ大腸菌ＤＮＡライゲースを加えた。このミクロ遠心チューブを穏やかにポルテックスで撹はんし、つぎに１６ ℃で２時間インキニーベートした。インキューベーション後、反応液を氷水につけて置いてがらフェノール／クロロフォルムで抽出し酢酸アンモニウムエタノールで沈澱させた。このｃＤＮＡをつぎにＥｃｏＲＩで軽く消化させて粘着末端をえるために、１μｍの１゜バッフｙ−（０，５Ｍ　ＮａＣｌ、ＬＭ　Ｔｒｔｓ、ｐＨ７，４，０，１Ｍ　ＭｇＣｌ２）、１．ｔｚｌのｃＤＮＡ　（０，５μｇ）、ｌμｌのＥｃｏＲＩ及び７μｍの蒸留水を混合し、３７℃で２０〜３０分間インキュベートした。

ラムダ　ｔｌｌアームとのライゲーション及びパッケージングあらかじめＥｃｏＲＩで消化し、脱燐酸化をした１μｇの市販されているラムダｇｔｌｌＤＮＡ（Ｌａｍｄａ　ｇｔｌｌ　引ｏｎｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ。

Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）と０．２μｇのｃＤＮＡを５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５＞、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ□、１０ｍＭ　ＤＴＴ、および１．５ｍＭ　ＡＴＰ含む１０μｍの反応液中で業者のプロトコールにしたがって混合した。

１ユニツトのＴ４　ＤＮＡライゲースを加え、反応液を４℃で一晩インキユベートした。

つぎに、ライゲーションしたＤＮＡのパッケージングを行うためにラムダ溶原ＤＮＡパッケージング抽出液を加えて２０℃で２時間インキュベートし、それから０．５ｍ　ｌのファージ希釈Ｍ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７，５，１００ｍＭ　ＮａＣ１，１０ｍＭ　ＭｇＣＬ、０．０１％ｇｅｌａｔｉｎ）と２０ μｌのクロロフォルムを加えて１０分間おいた。パッケージされたファージは４ ℃で保存した。

爬囚２ツユニーティング滅菌した５００ｍ１フラスコの中で、２ｍｌのマルトース（２０％ｗ　／　ｖ　）を含む滅菌したＬｕｒｉａ　Ｂｅｒｔａｎｉ培地（１００ｍｌ）に、ブレーティングする大腸菌Ｙ２Ｏ２Ｓ株の新鮮なコロニーを接種し、−晩培養した。この細胞を２５００ｇで１０分間遠心して滅菌したチューブ内に回収した６上清をデカントしてペレ・ｌトを２５ｍ１の滅菌した１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４に懸濁した。

前記のｉｎ　ｖｉｔｒｏパッケージング反応液を低（１０μｍのファージと９０ μｌのファージ希釈バッファー）中（５０μｍのファージと５０μｌのファージ希釈バッファー）高（７５μｌのファージと２５μｍのファージ希釈バッファー）の度合いに希釈して各々を別々に２００μｍのＹ１０８８細胞と共に３７℃で３０分間インキュベートした。この細胞とファージをつぎに３ｍｌの融解したトップアガーに加え、撹はんしてからＬＢ／アンピシリンプレート上に注いだ、トップアガーが固まった後プレートを逆さに置いて４２℃で一晩培養した。翌朝、組換え体ファージを透明なプラークから選択し、滅菌しな１４ゲージの大針を突き刺してアガーから取り出した６取り出したものを１００μｌの水と１滴のクロロフォルムに懸だくし、軽くポルテックスをして室温で３０分間、時々ポルテックスをしながらインキュベートした。つぎに、放出されたファージを２００μｌのＹ１０９０細胞に加え、３７℃で３０分間インキュベートした。ｙ１０９０／ファージ混合物を１０ｍＭ　ＭｇＣｌ７，９μｌの１０ｍＭ　ＩＰＴＧおよび９ μｍの１０％Ｘ−Ｇａ１を含む３ｍｌの融解したトップアガーに加え、アンピシリン（５ｃＩｇ／ｍ　ｌ　＞を含むＬＢブし一トにまいた。トップアガーを１５分間固まらせた後、逆さに置いて４２℃で一晩培養した１組換え体は透明あるいは白いプラークで確かめられた。

プレートしたライブラリーからの陽性クローンの選隔性クローンの選択と同定はＤａｖｉｓら（１９８６）およびＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９＞の方法により行った。アガープレートの蓋をとり滅菌した表面上でアガーを下にしてプレートを３０分間空気中で乾燥させた。ニトロセルロースフィルターをアガーに載せて再び蓋をした。このフィルターをそのまま約１６時装置いた６その後フィルターを先が平らなピンセットで穏やかに取り出し室温で３０分間乾燥させた。このフィルターをつぎに、クロロフォルムの蒸気に１０〜１５分間さらし、再び３０分間乾燥させた。このフィルターをＴＢＳＴ　（０，００５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む、Ｔｒｉｓを緩衝剤とした生理食塩水）で１０分間、２回洗浄したにのフィルターをつぎにブロッキング溶液（３％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミンフラクションＶ、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，５゜０．１５Ｍ　ＮａＣｌ　）中で室温で１時間穏やかに撹はんしながらインキュベートした。フィルターを浸している１０ｍ１のブロッキング溶液に実施例１で精製した抗−球菌抗体１００ μｍを加えさらに１時間インキュベーションを続けた。つぎにフィルターをＴＢＳＴで４回、５分づつ洗浄した。このフィルターをアルカリフォスファターゼを結合した抗−チキンＩｇＧ（１０ｍｌブロッキング溶液中１０ＪｉｌのＩｇＧを含む）を含むブロッキング溶液中で室温で１時間インキュベートした。つぎにＴｒｉｓＩ衝剤を含む生理食塩水で１回、５分間洗浄して、きれいな濾紙の上において空気中で乾燥させた０発色液は、発色液の保存液（０゜ＬＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ９，５，Ｏ，ＬＭ　ＮａＣｌ、５０ｍＭ　ＭｇＣｌ２＞に４０μｍのニトロブルーテトラゾリウム（ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ　ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｒｎ）と３０ μｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル燐酸（５−ｂｒｏ’ｍｏ−４− ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ＮＢＴ）を加えて調整した。フィルターをこの溶液に浸し、遮光して３０分間置き、ＴＢＳでを合成した組換え体プラークは、ニトロセルロース膜上の紫色に発色した点によって確かめられた。

１匹セ二相膨Ｊ１イミュノブロツテイングによるスクリーニングにおいて発色した。透明なプラークを以降の解析の為に選択した６オリジナルプレート上で相当する位置を確かめて１選択したプラークから滅菌した針を用いてアスピレーションにより試料を取り出した。この試料を前記の通りに懸だくし、１滴のクロロフォルムで溶菌させ、大腸菌Ｙ１０９０の培養液を感染させるのに使用した。以降の細胞系は実験ナンバーとプラークナンバーによって指名した。選択したコロニーをアンピシリンを含むしＢ培地で増幅した。この粗製ライブラリーを作製する過程で、感染細胞はＬＢ液体培地と４０％グリセロール（１：１）中、−２０℃で保存した。

別法として、ｃＤＮＡはｐＢＲ３２２のようなプラスミドに連結することでａｍｐやｔｅｔなとの選択マーカーとリンクさせ、それから前記の通りにラムダｇｔｌｌアームに結合させ得るが、このときファージのパッケージング容量を越えないように注意する必要がある。

ラムダｇｔｌｌライブラリー、ｐＢＲ３２２ライブラリー、Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで増幅させたｐＴＲＰ５６ライブラリーから独立したクローンを分離した。バクテリオファージラムダのライブラリーから得られ、ｒＢＰｌ−２と呼ばれるクローンはＡＴＣＣ６８４５０として寄託した。ｒｐＶｌ−８９と呼ばれるｐＢＲ３２２のライブラリーから分離したクローンはＡＴＴＣＣ６８５３７として寄託した。

クローン化したｃＤＮＡは３つのＥｃｏＲ１部位を持ち、長さは約４−７キロベースであった。この発明の好ましい態様では、Ｅｉｍｅｒｉａから分離した全長の配列にコードされる抗原性ペプチドが意図（ｃｏｎｔｅｍｐｌａｔｅ）されているが、ｒＢＰｌ−２の１つあるいは２つのＥＣ０ＲＩ断片などの部分的な配列によってコードされる抗原性ペプチドをも意図（ｃｏｎｔｅｍｐｌａｔｅ）する。特に、ｒＢＰｌ−２の配列の中央にある２キロベースのＥｃｏＲＩ断片をふくむＤＮＡ配列は意図（ｃｏｎｔｅｍｐｌａｔｅ）されている。

ＡＴＣＣ組　え休日　の特：８６１００μｍの組換え体大腸閉／ｒＢＰｌ　２細胞をアンピシリン５０μｇ／ｍ１を含む５００ｍ１の新鮮なＬｕｒｉａ　Ｂｅｒｔａｎｉ培地で３７℃で一晩培養した。翌朝、細胞を遠心して回収し、２００ｍ１の滅菌した５％スキンミルク（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂａｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔ、ｒｏｉｔ、Ｍｌ）と０，２５％バクトベプトン’（ｂａｃｔｏｐｅｐｔｏｎｅ）（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、Ｍｌ）凍結乾燥懸たく培地に懸たくして凍結乾燥した（Ｅｎｇｌｅｒ、１９９０）、この培養物をＡｍｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌ　１ｅｃｔｉｏｎ、１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒ、。

Ｒｏｃｋｖ口１　ｅ、ＭＤ　２０８５２．ＩＪＳＡに寄託し１９９０年１０月２６日に有効（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）となった、指定された寄託ナノバーはＡＴＣＣアクセスナンバー（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ、）６８４５０である。大腸菌ＨＢ１０］、／ｒＰＶ１−８９細胞も同様に培養し１９９１年３月１日に寄託した。この寄託はＡＴＣＣアクセスナンバー（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ、）６８５３７と指定された。

実施例３・組換疋体タンパク質の単離組換え体タンパク質は、若干の修正を加えたベラカー（Ｂｅｃｋｅｒ）ら、（１９９０）の方法により分離した。組換え体大腸閉Ｙ１０９０／ｒＢＰ１−２細胞をアンピシリン（５０Ｍｇ／μｍ）とＬｕｒｉａ　Ｂｅｒｔ、ａｎｉ培地を含む密栓して滅菌した１０１００Ｏエレンマイヤーフラスコ中で３７℃で一晩培養した。細菌細胞を遠心してベレットを０．１７４ｍｇ／ｍｌのフェニルメチルスルフオンルフルオライド（ＰＭＳＦ）を加えた５〜１０ｍ１のＺバッファー＜０．１２Ｍ　Ｎａ＝ＨＰＯ４，０，４Ｍ　ＮミＨＰＯ４，０，０１Ｍ　ＫＣＩ、１ｍＭ　ＭｇＳＯ４゜および０．３％（Ｖ／Ｖ）２−メルカプトエタノール、ｐＨ７０）に懸たくした。

等量の酸−洗浄したガラスピーズをチューブに加えた。細胞を３０秒間、高速でボルテックスして、過熱を防ぐために３０秒間氷水につけた。この操作を全部で６サイクル行った。ガラスピーズがチューブの底に沈むのを待ち、液体をアスピレーシコンで取りだし、きれいな容器に移した。溶菌液を、Ｖｉｂｒａ−Ｃｅ　ｌ　Ｉ超音波破砕１ｔ（Ｓｏｎｉｃｓ　ａｎｄ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａしｅｄ、Ｄａｎｂｕｒｙ、ＣＴ）を用いて氷水上で５０Ｗで３０秒間超音波処理をして、３０秒間体止し、これを２回繰り返した６次にこれを５０００ｒｐｍで５分間遠心してベレットを捨てた。上清を、マグネチ・ンクスターラー上で氷につけた、きれいな２５０ｍ１のガラスビーカー中の１００ｍ１の２１＜・ソファ−に加えた。溶液にさらに１７．４ｍｇのＰＭＳＦを加えてゆべりと撹はんした１組換え体タンパク質をつぎに、硫酸アンモニウムを最終濃度が７０％飽和となるように加えて沈澱させた。溶菌液と１ｍ酸アンモニウムを氷上で１ −２時間撹はんした。沈澱物を遠心して回収し、少量の０．１Ｍ燐酸ナトリウムノく・ソファ−１ｐＨ７４に懸たくした。このステップにおける典型的なタンノザ質濃度は１３ｉｏ−Ｒａｄ　ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｍ１ｃｒｏ−ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）を用いて決定したところ５００−７００μｇ／ｍｌであった。

同様の操作がｒＰＶｌ−８９で形質転換をした細胞からの組換え体タンパク質を得るのに用し）られｔｉする。

抗原特異性を持つフラクションを、標準的なイオン交換ある１）はゲルクロマトグラフィーの方法を用いて得た。このフラクションはＥ、Ｍａｘｉｍａを投与したチキン血清との免疫反応性を前記の方法により同定した。ｒＢＰｌ−２とｒＰＶｌ−８９にコードされる組換え体タンパク質は異なるチキンの血清に対して同じ免疫反応を示した。

絶倒４：組　え　タンパク　の組換え体タンパク質の分子量を５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（１，１〜２３％の指数的（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ）グラジェントゲル、６％濃縮ゲル、陽極ノく・ンファー；　１．２Ｍ　ａｍｍｅｄｉｏｌ　５ｕｌｆａｔｅ、ｐＨ９，５；陰極バ・・ノファー゛０．７５Ｍ　ａｍｍｅｄｉｏｌ、０．７５Ｍ　ｇｌｙｃｉｎｅ、ｐＨ９，５，０，５％ドデシル硫酸ナトリウム；泳動条件；５０■で１５分間、１００■で６時間）で決定した。ｒＰＶｌ−８９で形質転換した細胞の抽出液のゲルには、形質転換しない宿主株の抽出液のゲルにはない、４５〜６５ｋＤのバンドを含んでいた。

ｒＢＰｌ−２で形質転換した細胞の粗抽出液にも、同様の約１４０ｋＤの融合タンパク質を示すバンドがあった二融合タンパク質中のベータガラクトシダーゼ遺伝子にコードされる部分の分子量を差引くとＥｉｍｅｒｉａのペプチドの分子量は約５０〜６５ｋＤと算出される。このタンパク質はＺバッファー（前記）中、４℃で６０日間、非常に安定であったが、０．１ＭＮａＣ１に対する透析において有意な反応性を失った（約１００％）。

各タンパク質の濃度は、高速液体クロマトグラフィー（条件ニジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）カラム；バッファー１　：　２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８，５，バッファー２：　２０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ、ｐｉ−１７，０，０，３Ｍ　ＮａＣ１；リニアグラジェント：０−１００％バッファー２．３０分間：流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ２８０ｎｍ、０．５　ＡＵＦＳ）において、全タンパク質の濃度から算出した。メジャーな細菌タンパク質は通常流出時間２．５−３．５分の間に溶出した６組換え体の融合タンパク質は流出時間１４．４と１６．８分の二つのピークとなって溶出した。組換え体の２つのピークは典型的にｒＢＰｌ−２のタンパク質試料では全タンパク質濃度の約２４％、ｒＰＶｌ−８９のタンパク質試料では約ｌＯ％に相当した。ｐＢＲ３２２ベクターを用いたｒＰＶｌ−１２で形質転換した細胞からの粗製タンパク質フラクションでは組換え体タンパク質は全体の約５％に相当した。

実施例５・組　え体タンパク　のアミノ酸　１発現ベクターｒＰＶ１−８９から発現したペプチドは融合タンパク質ではないので、アミン末端に大腸菌の配列ではな（Ｅｉｍｅｒｉａの配列をコードする。

ｒＰＶｌ−８９ペプチドは、大腸菌細胞をｒＰＶｌ−８９で形質転換して実施例１で部分的に精製した抗血清と反応する形質転換体を選び、得られた。選択した形質転換体を培養して粗製タンパク質抽出液を５ＤＳ−ＰＡＧＥで分画した。形質転換体の抽出液に見られ、形質転換しない宿主の抽出液に見られないバンドをゲルから切り出してタンパク質を電気的に溶出させ、精製した組換え体タンパク質を調製した６組換え体タンパク質のアミン末端のアミノ酸配列はＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄモデル４７７Ａプロティンシーケンサ−を用いて決定した。アミノ酸配列解析の結果を表１に示し、決定されたアミノ酸配列は配列番号１に提供する。

表　１．Ｎ末端配列サイクル　アミノ酸残基　回収率（ピコモル）Ｉ　ＸＸ２　Ｅ　Ｇｌｕ　１．７７３　Ｑ　Ｇｌｎ　３．２５４　Ｅ　Ｇｌｕ　２．７３５　Ｔ　Ｔｈｒ　０．４２６　Ｓ　Ｓｅｒ　１．１２７　Ａ　Ａｌａ　１．．７６８　Ｔ　Ｔｈｒ　Ｏ，５６９Ｅ　Ｇｌｕ　２．９５１０　Ｖ　Ｖａｌ　Ｏ，１９１１Ｘ　Ｘ　− １２Ｔ　Ｔｈｒ　Ｏ，５９１３Ｐ　Ｐｒｏ　Ｏ，７３１４Ｓ　Ｓｅｒ　Ｏ，８３１５Ｙ　Ｔｙｒ　Ｏ，３７１６Ｋ　Ｌｙｓ　Ｏ，１７１７Ｍ　Ｍｅｔ　０．２２１８　Ｔ　Ｔｈｒ　Ｏ，４５１つ　Ｘ　Ｘ　− ２０Ｓ　Ｓｅｒ　Ｏ，５７表１に開示された配列は大腸菌のベータガラクトシダーセには現れない。この配列を、抗球菌ワクチン調製物を報告した櫟々な著者により開示されたタンパク質配列の最初の２０アミノ酸と比較した（表２）。この比較において最高のホモロジーは２０アミノ酸中３アミノ酸であった。したがって本発明のペプチドはＥｉｍｅｒｉａ　ＤＮＡのクローンから分離されたタンパク質のなかでユニークなものである。

表２５選択した組換え体タンパク質とｒＰＶｌ−８９タンパク質のアミノ末端の配列のホモロジーの比較著　者　アミノ末端あたりの　ホモロジーマッチしたアミノ酸数　％Ｍｉｌｌｅｒ、　１９８９　０／２０　０＾Ｕ−＾２８５４２／８９（Ｍｅｒｃｋ）　３　／　２０　１５ＥＰ　０３２４６４８（Ｈｅｒｅｋ）１　／　２０　５＾Ｕ−＾６５８６９／８６（Ｓｏｌｖａｙ　ａｎｄ　Ｃ１ｅ）　Ｏ／’２０　ＯＮｏ　Ｏ３４９０７１（Ｇｅｎｅｘ）　２　／　２０　１０ＥＰ　０３４９０７１（＾ｋｚｏ）　１／２０　５ＥＰ　Ｏ３４４８０８（１）　（）ｌｏｆｆｓ＋ａｎ）　ｌ　／　２０　５ＥＰ　Ｏ３４４８０８（２）　（Ｈｏｒｆｍａｎ）　１　／　２０　５εＰ　０３４４８０８（３）（）ｌｏｌＴｍａｎ）　２／　２０　１０ＥＰ　Ｏ３４４８０８（４）（Ｈｏｆｆ鮎ｎ）　Ｏ／　２０　０実施＠６・１ｎｖｉｖｏにおける効力の初期試験初期の研究として、少量の試料サイズ（ｎ＝２７）を使用してワクチンの潜在的な毒性と、穏やがな接合子＊（ｏｏｃｙｓＵの投与量（ｔｏ、０００接合子嚢／鳥）において接合子嚢の増殖を阻止し、腸の障害を減少させる組換え体タンパク質の能力を決定した。鳥はＳＰＦ鳥のし・グホン種で、オスメス両方混じっており、生後４週間まで個別に飼育されたものであった。この鳥に任意に２つの処理を施した。ワクチングループは１５０ｕｇの組換え体タンパク質を（＋１１酸生理食塩水とフロントの非完全シュハンドの混合物（５・１）に加え、筋肉内１ケ所に与えた（全１１　ｍ　ｌ　／鳥を注射した）。注射は７日後前の位置と左右逆の位置に繰り返した。その７日後、鳥にＥ、Ｍａｘｉｍａを経口で１１与した（接合子嚢１０゜０００／鳥）。投与７日後に鳥を解剖して腸における傷害を検討した。この実験の結果を表３に示す。

表３初期効力試験の結果グループ　処　理　ｎ　平均重量　平均傷害数　グラムあたり接合子嚢数ａ１　注射しなか　１３　１４３２．９２　３，００　１．９１った対照２　組換え体　１４　１４６７．５０　２．５８　０．６９タンパク質ａ１０６接合子嚢／腸及び盲腸から取り出しな音便実施例７・ｉｎ　ｖｉｖｏにおける効力試験２２回目の試験では、試料サイズをｎ＝３００に拡大し、実際の生産条件をシュミレートした条件で行った。この試験は、コンクリートの床、寝藁を持つ個別の床上檻を持つ営利的な養鶏場で行った。Ｒｏｓｓ　ｘ　Ａｒｂｏｒ　Ａｃｒｅｓブロイラーチキンは生後１日のものをふ化業者から得て（雄雌混合）、６つの檻のうちの一つにランダムに、１フイートあたり１羽に鳥の密度でいれた。すべての鳥は薬物を処方しないブロイラー用試料（プレスターター、スターター、グローワーおよびフィニッシャ−）（ｐｒｅｓｔａｒｔｅｒ、５ｔａｒｔｅｒ、ｇｒ。

Ｗｅｒおよびｆｉｎｉｓｈｅｒ）と無制限の水を与えられた。各々の処理について２つの柵が６つの檻からランダムに指定されて行われた。（表４）ワクチンの接種は表５のスケジュールに従って行った。

表４檻および指定した処理：試験２処　理　檻ナンバー　〇注射しない対照　４，６　５０／檻ベーターガラクトシダーゼ　２．５　５０／檻組換え体タンパク質ｒＢＰ１−２　１，３　５０／檻表５ワクチン接種のスケジュールおよび投与量：試験３処　理　投与量／経由　日対照　− ベーターガラクトシダーゼ　５０μｇ／５ｕｂ−ｑ　１５０ｕｇ／５ｕｂ−ｑ　７５０μｇ／５ｕｂ−ｑ　２１組換え体タンパク質ｒＢＰ１−２　１Ｑμｇ／ｓｕｂ　Ｑ　１５０ｕｇ／５ｕｂ −ｑ　７１００ｕｇ／５ｕｂ−ｑ　２１第２８８目に、各々の処理をした鳥に５０．０００接合子ＩＩ／鳥の混合培養液（Ｅ、ｔｅｎｅ　Ｉ　Ｉａ、Ｅ、ｍ１ｔｉｓ、Ｅ、ａｃｅｒｖｕｌ　ｉｎａ、Ｅ、ｍａｘｉｍａ、Ｅ、ｐｒａｅｃｏｘ、およびＥ、ｂｒｕｎｅｔｔｉ）を砕いた飼料に希釈して投与した（鳥あたり８３．３グラムの飼料）、投与後７日目（第３５日月）に、鳥を安楽死させ、ＪｏｈｎｓｏｎとＲｅ１ｄ　（１９７０）の方法に従って腸に損傷がないか検討した。損傷数、飼料変換率（ｆｅｅｄ　ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）、体重、および音便グラムあたりに含まれた接合子嚢の数を得て、表６に示した。

表６効力試験２の結果対　照　ベーターガラクトシダーゼ　組み換え体ワクチン肝臓の重量　１４０５．７５　（ａ）’　１３３５．０３　（ｂ）　１４１８．３３　（ｔ）（グラム）飼料変換率”　１．６８　１．８７　１．７ｊｌ１球菌による　０　０　０死亡率％損傷数　２．５６３　（ａ）　２．７１１　（ａ）　２．２７９　（ｂ）接合子嚢数’　１．５４１　（ａ）　１．４４８　（ａ）　０．８４７　（ｂ）対照に対する　−６，１０４５，０接合子の阻止率（％）１　括弧内に文字を含む値は０．０５％の確率の範囲内で変動する。

２　平均肝臓重量にあわせた。

３　音便グラムあたりＸＩＯ”接合子嚢実施例８：ｉｎ　ｖｉｖｏにおける効力試験３第３番目の試験では、アーカンサス（Ａｒｋａｎｓａｓ）の土壌がら分離された６株のＥｉｍｅｒｉａ病原株の混合病原へなる決められた投与における、組換え体ワクチンの効力を様々な市販の球菌阻止シャトルプログラム（ｓｈｕｔｔｌｅｐｒｏｇｒａｍ）のものと比較した。生後１日日のブロイラーチキンを７種類の処理の為にランダムに分別し、１種類の処理あたり４つの実験を行い（ｎ＝１６０／実＠）通常の養鶏場の床上檻にいれた１表７に各々の処理を示したニゲループ５のワクチン接種は表８に示すスゲジュールにしたがった。

表７処理の記載　試験３グループ　処　理Ｉ　Ｎ１ｃａｒｂ−Ｃｏｂａｎ２　Ｒｏｂｅｎｚ−Ｃｏｂａｎ３　Ｎ１ｃａｒｂ−ＢｉｏＣｏｘ４　感染、薬剤非処理の対照５ｒＢＰ１−２　組換え体ワクチン１６　Ｎ１ｃａｒｂ−Ｃｏｂａｎ−Ｚｅｏｌｙｔｅ７　Ｎｉｃａｒｂ−Ｃｏｂａｎ −ＭｉｃｒｏＡｉｄｌｒＢＰｌ−２とＲｅｈｙｄｒａｇｅｌ　２０％　（Ｖ／Ｖ）水酸化アルミニウムアジュバント表８組換え体ワクチン投与のスゲジュール：試験３日　投与／経由１　５０Ｉｇ／皮下注射７　５０Ｉｇ／皮下注射２１　５０Ｉｇ／皮下注射第２８日目、に各実験の鳥にＥ、ｔｅｎｅｌ！ａ、Ｅ、ｍ１ｔｉｓ、Ｅ、ａｃｅｒｖｕＩ　ｉｎａ、Ｅ、ｍａｘｉｍａ、Ｅ、ｐｒａｅｃｏｘ、およびＥ、ｂｒｕｎｅｔｔｉの混合物の培養液を９０，０００接合子嚢／鳥濃度で砕いた飼料に混ぜて投与した。投与後７日日（３５日目）に、実験あたり８羽の鳥（３２羽／処理）を解析のために得た。これらの鳥における平均データを表９に示す。

表９抗球菌効力（Ａｎｔｉｃｏｃｃｉｄｉａｌ　ｅｆｆｉｃａｃｙ）Ｅｉｍｅｒｉａ処　理１　平均損傷数　３５日目の　接合子嚢数２　％接合子嚢の減少３肝臓重量ＮＣ２，３４４２，７８９０，２７３９８，３２ＲＣ２，２５０２，９９００，３５６９７，８２ＮＢ　２．０９４　２．９３０　０．２５７　９８．４３Ｉ　ＮＣ２，２２３２，９０６１６，３１６−−−ＶＡＣ２，０６３２，９５５０，４４１９７，３ＯＮＣＺ　２．３１３　２．７５５　０．２９２　９８．２１ＮＣＭ　２．２１９　２．８１８　０．２９０　９８．２２１　省略文字：ＮＣ− Ｎ１ｃａｒｂ、Ｃｏｂａｎ；ＲＣ−Ｒｏｂｅｎｚ。

Ｃｏｂａｎ：ＮＢ−Ｎｉｃａｒｂ、ＢｉｏＣｏｘ；　ｌＮＣ−感染、薬剤非処理対照；ＶＡＣ−ｒＢＰ１−２組換え体ワクチン；ＮＣＺ−Ｎｉｃａｒｂ。

Ｃｏｂａｎ、Ｚｅｏｌｙｔｅ　；ＮＣＭ−Ｎｉｃａｒｂ、Ｃｏｂａｎ、ＭｉｃｏＡｃｉｄ２　腸内内容物ダラムあたりの×１０６接合子嚢３　感染、薬剤非処理対照（ＩＮＣ）に対する値配列表配列番号・１（１）配列の特徴（Ａ）配列の長さ、２０アミノ酸（Ｂ）配列の型・アミノ酸（Ｄ）トポロジー　直鎖状（１１）配列の種類：ペブチト（ｉｉｉ　）ハイボセティカル配列二Ｎ。

（ｖ）フラグメント型、Ｎ末端フラグメント（ｖｌ）起源（Ａ）生物名：Ｅｉｍｅｒｉａ　ｍａｘｉｍａ（癲）直接の起源・（Ｂ）クローン名；ｒＰＶ１　８９（ｘｌ）配列・配列番号Ｘａａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｘａａ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒｌ　５　１０　１５Ｌｙｓ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｘａａ　Ｓｅｒ補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成　５年　９月１４日囚

Claims

【特許請求の範囲】

１．Ｅｉｍｅｒｉａ種に感染したニワトリの血清中の抗体と特異的に免疫反応するペプチドをコードする、イントロンを持たないＤＮＡ分子であって、上記ペプチドは配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＥｉｍｅｒｉａ蛋白質の全部または一部である、上記ＤＮＡ分子。
２．ＡＴＣＣ寄託番号第６８５３７号として寄託されている組換え体細菌プラスミド中の唯一のｐＢＲ３２２由来のＥｃｏＲＩ部位に挿入されたＤＮＡ配列によりコードされているペプチドに相当するペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子。
３．ＡＴＣＣ寄託番号第６８５３７号として寄託されている組換え体細菌プラスミド。
４．ＡＴＣＣ寄託番号第６８４５０号として寄託されている組換え体バクテリオファージの唯一のラムダｇｔｌｌ由来のＥｃｏＲＩ部位に挿入されたＤＮＡ配列によりコードされているペプチドに相当するペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子。
５．ＡＴＣＣ寄託番号第６８４５０号として寄託されている組換え体バクテリオファージ中の唯一のラムダｇｔｌｌ由来のＥｃｏＲＩ部位において挿入されたＤＮＡ配列に相当するＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子。
６．ＡＴＣＣ寄託番号第６８４５０号として寄託されている組換え体バクテリオファージ。
７．請求項１に記載のＤＮＡ分子を含む形質転換細胞。
８．請求項２に記載の組換え体ＤＮＡ分子を含む形質転換細胞。
９．請求項３に記載の組換え体プラスミドを含む形質転換細胞。
１０．請求項４に記載の組換え体プラスミドを含む形質転換細胞。
１１．請求項５に記載の組換え体プラスミドを含む形質転換細胞。
１２．請求項６に記載の組換え体プラスミドを含む形質転換細胞。
１３．上記細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏ１ｉ）細胞である、請求項７記載の形質転換細胞。
１４．上記細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である、請求項８記載の形質転換細胞。
１５．上記細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である、請求項１０記載の形質転換細胞。
１６．上記細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である、請求項１１記載の形質転換細胞。
１７．上記ＤＮＡ分子を発現させて免疫原性ペプチドを形成させる条件下で請求項７記載の形質転換細胞を生育させることからなる、免疫原性ペプチドの製造方法。
１８．上記組換え体ＤＮＡ分子を発現させて免疫原性ペプチドを形成させる条件下で請求項８記載の形質転換細胞を生育させることからなる、免疫原性ペプチドの製造方法。
１９．ＡＴＣＣ寄託番号第６８５３７号として寄託させている組換え体細菌プラスミド中の唯一のｐＢＲ３２２由来のＥｃｏＲＩ部位に挿入されたＤＮＡ配列を発現させて免疫原性ペプチドを形成させる条件下で請求項９記載の形質転換細胞を生育させることからなる、免疫原性ペプチドの製造方法。
２０．上記組換え体ＤＮＡ分子を発現させて免疫原性ペプチドを形成させる条件下で請求項１０記載の形質転換細胞を生育させることからなる、免疫原性ペプチドの製造方法。
２１．上記ＤＮＡ分子を発現させて免疫原性ペプチドを形成させる条件下で請求項１１記載の形質転換細胞を生育させることからなる、免疫原性ペプチドの製造方法。
２２．ＡＴＣＣ寄託番号第６８４５０号として寄託させている組換え体バクテリオファージの唯一のラムダｇｔｌｌ由来のＥｃｏＲＩ部位に挿入されたＤＮＡ配列を発現させて免疫原性ペプチドを形成させる条件下で請求項１２記載の形質転換細胞を生育させることからなる、免疫原性ペプチドの製造方法。
２３．上記生育培地から上記免疫原性ペプチドを単離することをさらに含む、請求項１７記載の免疫原性ペプチドの製造方法。
２４．上記生育培地から上記免疫原性ペプチドを単離することをさらに含む、請求項１８記載の免疫原性ペプチドの製造方法。
２５．上記生育培地から上記免疫原性ペプチドを単離することをさらに含む、請求項１９記載の免疫原性ペプチドの製造方法。
２６．上記生育培地から上記免疫原性ペプチドを単離することをさらに含む、請求項２０記載の免疫原性ペプチドの製造方法。
２７．上記生育培地から上記免疫原性ペプチドを単離することをさらに含む、請求項２１記載の免疫原性ペプチドの製造方法。
２８．上記生育培地から上記免疫原性ペプチドを単離することをさらに含む、請求項２２記載の免疫原性ペプチドの製造方法。
２９．請求項１記載のイントロンを含まないＤＮＡ分子によりコードされているペプチドであって、配列番号１のアミノ酸配列を有する上記ペプチドに特異的に免疫反応するモノクローナル抗体。
３０．請求項２記載のＤＮＡ分子によりコードされているペプチドに特異的に免疫反応するモノクローナル抗体であって、上記ペプチドがＡＴＣＣ寄託番号第６８５３７号として寄託されている組換え体細菌プラスミド中の唯一のｐＢＲ３２２由来のＥｃｏＲＩ部位に挿入されたＤＮＡ配列によりコードされているペプチドに相当する、上記モノクローナル抗体。
３１．請求項３記載の組換え体細菌プラスミド中の唯一のｐＢＲ３２２由来のＥｃｏＲＩ部位に挿入されたＤＮＡ配列によりコードされているペプチドに特異的に免疫反応するモノクローナル抗体。
３２．請求項４記載のＤＮＡ分子によりコードされているペプチドに特異的に免疫反応するモノクローナル抗体であって、上記ペプチドがＡＴＣＣ寄託番号第６８４５０号として寄託されている組換え体バクテリオファージ中の唯一のラムダｇｔｌｌ由来のＥｃｏＲＩ部位に挿入されたＤＮＡ配列によりコードされているペプチドに相当する、上記モノクローナル抗体。
３３．請求項５記載のＤＮＡ配列によりコードされているペプチドに特異的に免疫反応するモノクローナル抗体。
３４．請求項６記載の組換え体バクテリオファージ中の唯一のラムダｇｔＩＩ由来のＥｃｏＲＩ部位に挿入されたＤＮＡ配列によりコードされているペプチドに特異的に免疫反応するモノクローナル抗体。
３５．請求項２９記載の抗体に特異的に免疫反応する、実質的に精製されたペプチド。
３６．請求項３０記載の抗体に特異的に免疫反応する、実質的に精製されたペプチド。
３７．請求項３１記載の抗体に特異的に免疫反応する、実質的に精製されたペプチド。
３８．請求項３２記載の抗体に特異的に免疫反応する、実質的に精製されたペプチド。
３９．請求項３３記載の抗体に特異的に免疫反応する、実質的に精製されたペプチド。
４０．請求項３４記載の抗体に特異的に免疫反応する、実質的に精製されたペプチド。
４１．請求項２９記載の抗体に特異的に免疫反応する免疫原性ペプチドからなるワクチン組成物であって、上記ワクチン組成物がＥｉｍｅｒｉａ細胞表面蛋白質以外のＥｉｍｅｒｉａ蛋白質を実質的に含まない、上記組成物。
４２．請求項３０記載の抗体に特異的に免疫反応する免疫原生ペプチドからなるワクチン組成物であって、上記ワクチン組成物がＥｉｍｅｒｉａ細胞表面蛋白質以外のＥｉｍｅｒｉａ蛋白質を実質的に含まない、上記組成物。
４３．請求項３１記載の抗体に特異的に免疫反応する免疫原生ペプチドからなるワクチン組成物であって、上記ワクチン組成物がＥｉｍｅｒｉａ細胞表面蛋白質以外のＥｉｍｅｒｉａ蛋白質を実質的に含まない、上記組成物。
４４．請求項３２記載の抗体に特異的に免疫反応する免疫原生ペプチドからなるワクチン組成物であって、上記ワクチン組成物がＥｉｍｅｒｉａ細胞表面蛋白質以外のＥｉｍｅｒｉａ蛋白質を実質的に含まない、上記組成物。
４５．請求項３３記載の抗体に特異的に免疫反応する免疫原生ペプチドからなるワクチン組成物であって、上記ワクチン組成物がＥｉｍｅｒｉａ細胞表面蛋白質以外のＥｉｍｅｒｉａ蛋白質を実質的に含まない、上記組成物。
４６．請求項３４記載の抗体に特異的に免疫反応する免疫原生ペプチドからなるワクチン組成物であって、上記ワクチン組成物がＥｉｍｅｒｉａ細胞表面蛋白質以外のＥｉｍｅｒｉａ蛋白質を実質的に含まない、上記組成物。
４７．免疫原生ペプチドを主要成分として含むワクチン組成物であって、上記ペプチドは配列番号１のアミノ酸であって、かつ、Ｅｉｍｅｒｉａ種に感染したニワトリの血清中の抗体に特異的に免疫反応する、上記組成物。
４８．請求項２記載のＤＮＡ分子によりコードされている免疫原生ペプチドを含むワクチン組成物であって、上記ペプチドがＡＴＣＣ寄託番号第６８５３７号として寄託されている粗換え体細菌プラスミド中の唯一のｐＢＲ３２２由来のＥｃｏＲＩ部位に挿入されたＤＮＡ配列によりコードされているペプチドに相当する、上記組成物。
４９．請求項３記載の組換え体細菌プラスミド中の唯一のｐＢＲ３２２由来のＥｃｏＲＩ部位に挿入されたＤＮＡ配列によりコードされている免疫原生ペプチドを含むワクチン組成物。
５０．請求項４記載のＤＮＡ分子によりコードされている免疫原生ペプチドを含むワクチン組成物であって、上記ペプチドがＡＴＣＣ寄託番号第６８４５０号として寄託されている組換え体バクテリオファージ中の唯一のラムダｇｔｌｌ由来のＥｃｏＲＩ部位に挿入されたＤＮＡ配列によりコードされているペプチドに相当する、上記組成物。
５１．請求項５記載のＤＮＡ配列によりコードされている免疫原生ペプチドを含むワクチン組成物。
５２．請求項６記載の組換え体バクテリオファージ中の唯一のラムダｇｔｌｌ由来のＥｃｏＲＩ部位に挿入されたＤＮＡ配列によりコードされている免疫原生ペプチドを含むワクチン組成物。
５３．請求項４７記載のワクチン組成物を有効量ニワトリに投与することからなる、コクシジウム症に対するニワトリヘの接種法。
５４．請求項４８記載のワクチン組成物を有効量ニワトリに投与することからなる、コクシジウム症に対するニワトリヘの接種法。
５５．請求項４９記載のワクチン組成物を有効量ニワトリに投与することからなる、コクシジウム症に対するニワトリヘの接種法。
５６．請求項５０記載のワクチン組成物を有効量ニワトリに投与することからなる、コクシジウム症に対するニワトリヘの接種法。
５７．請求項５１記載のワクチン組成物を有効量ニワトリに投与することからなる、コクシジウム症に対するニワトリヘの接種法。
５８．請求項５２記載のワクチン組成物を有効量ニワトリに投与することからなる、コクシジウム症に対するニワトリヘの接種法。
５９．上記ワクチン組成物を注射によりニワトリに投与する、請求項５３記載の接種法。
６０．上記ワクチン組成物を注射によりニワトリに投与する、請求項５４記載の接種法。
６１．上記ワクチン組成物を注射によりニワトリに投与する、請求項５５記載の接種法。
６２．上記ワクチン組成物を注射によりニワトリに投与する、請求項５６記載の接種法。
６３．上記ワクチン組成物を注射によりニワトリに投与する、請求項５７記載の接種法。
６４．上記ワクチン組成物を注射によりニワトリに投与する、請求項５８記載の接種法。