JPH06121688A - マラリア抗原ｈｒｐｉｉおよびｓｅｒｐの部分配列を含む防御的熱帯熱マラリア原虫ハイブリッドタンパク質、その製造および使用 - Google Patents
マラリア抗原ｈｒｐｉｉおよびｓｅｒｐの部分配列を含む防御的熱帯熱マラリア原虫ハイブリッドタンパク質、その製造および使用Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 マラリアに有効なワクチンのためのタンパク
質を提供する。 【構成】 マラリア抗原ＨＲＰＩＩおよびＳＥＲＰの部
分配列を含むハイブリッドタンパク質。ＨＲＰＩＩ配列
はサルのモデルで防御的であることが既に証明されてい
るが、本発明では１８９個のアミノ酸のＣ−末端領域が
用いられる。ＳＥＲＰは防御的タンパク質バンドに対す
る抗血清を用いて同定され、用いる部分配列（アミノ酸
６３１〜８９２または６３０〜７６４）は少なくとも２
種類のＴ−細胞エピトープを含む。好ましい態様では、
他の熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum）タンパク質、
例えばメロゾイト表面抗原Ｉ（ＭＳＡＩ或いは「１９５
ｋｄ抗原」）の別のＴ−細胞エピトープ含有領域である
アミノ酸１００〜３００が組み込まれている。総てのハ
イブリッド成分に共通な特性は、それらが高度に保存さ
れたペプチド配列を表わすということである。マラリア
の感染に対する防御は、上記のハイブリッドタンパク質
での免疫化によって生じる。
質を提供する。 【構成】 マラリア抗原ＨＲＰＩＩおよびＳＥＲＰの部
分配列を含むハイブリッドタンパク質。ＨＲＰＩＩ配列
はサルのモデルで防御的であることが既に証明されてい
るが、本発明では１８９個のアミノ酸のＣ−末端領域が
用いられる。ＳＥＲＰは防御的タンパク質バンドに対す
る抗血清を用いて同定され、用いる部分配列（アミノ酸
６３１〜８９２または６３０〜７６４）は少なくとも２
種類のＴ−細胞エピトープを含む。好ましい態様では、
他の熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum）タンパク質、
例えばメロゾイト表面抗原Ｉ（ＭＳＡＩ或いは「１９５
ｋｄ抗原」）の別のＴ−細胞エピトープ含有領域である
アミノ酸１００〜３００が組み込まれている。総てのハ
イブリッド成分に共通な特性は、それらが高度に保存さ
れたペプチド配列を表わすということである。マラリア
の感染に対する防御は、上記のハイブリッドタンパク質
での免疫化によって生じる。
Description
【０００１】本発明はマラリア抗原ＨＲＰＩＩおよびＳ
ＥＲＰの部分配列を含むハイブリッドタンパク質に関す
る。ＨＲＰＩＩ配列はサルのモデルで防御的であること
が既に証明されており（ＥＰ−Ａ２−０ ３１５ ０８
５号明細書）、１８９個のアミノ酸のＣ−末端領域が前
の防御実験におけるのと同じ方法で本発明に用いられ
た。ＳＥＲＰは防御的タンパク質バンドに対する抗血清
を用いて同定され（ＥＰ−Ａ１−０ ２８３８８２号明
細書）、用いた部分配列（アミノ酸（ＡＡ）６３１〜８
９２または６３０〜７６４）は少なくとも２種類のＴ−
細胞エピトープ（ルシルホン(Roussilhon)ら、(1990),
Immunol. Letters, 25, 149-154 ）を含む。好ましい態
様では、他の熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum) タン
パク質、例えばメロゾイト(merozoite) 表面抗原Ｉ（Ｍ
ＳＡＩ或いは「１９５ｋｄ抗原」）の別のＴ−細胞エピ
トープ含有領域であるアミノ酸１００〜３００が組み込
まれている（クリサンティ(Crisanti)ら、(1988), Scie
nce, 240, 324-326 ）。総てのハイブリッド成分に共通
な特性は、それらが高度に保存されたペプチド配列を表
わすということである。マラリアの感染に対する防御
は、前記のハイブリッドタンパク質で免疫感作すること
によって生じる。
ＥＲＰの部分配列を含むハイブリッドタンパク質に関す
る。ＨＲＰＩＩ配列はサルのモデルで防御的であること
が既に証明されており（ＥＰ−Ａ２−０ ３１５ ０８
５号明細書）、１８９個のアミノ酸のＣ−末端領域が前
の防御実験におけるのと同じ方法で本発明に用いられ
た。ＳＥＲＰは防御的タンパク質バンドに対する抗血清
を用いて同定され（ＥＰ−Ａ１−０ ２８３８８２号明
細書）、用いた部分配列（アミノ酸（ＡＡ）６３１〜８
９２または６３０〜７６４）は少なくとも２種類のＴ−
細胞エピトープ（ルシルホン(Roussilhon)ら、(1990),
Immunol. Letters, 25, 149-154 ）を含む。好ましい態
様では、他の熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum) タン
パク質、例えばメロゾイト(merozoite) 表面抗原Ｉ（Ｍ
ＳＡＩ或いは「１９５ｋｄ抗原」）の別のＴ−細胞エピ
トープ含有領域であるアミノ酸１００〜３００が組み込
まれている（クリサンティ(Crisanti)ら、(1988), Scie
nce, 240, 324-326 ）。総てのハイブリッド成分に共通
な特性は、それらが高度に保存されたペプチド配列を表
わすということである。マラリアの感染に対する防御
は、前記のハイブリッドタンパク質で免疫感作すること
によって生じる。
【０００２】最も広く蔓延している熱帯病の一つとして
のマラリアの重大性を考慮すれば、有効なワクチンの提
供が極めて重要である。ワクチンはプラスモディウム
(Plasmodia; P.)のスポロゾイト(sporozoites) 、メロ
ゾイト(merozoites)または生殖母体(gametocytes) に向
けることができ、この場合には熱帯マラリア原虫の血液
中における無性段階（メロゾイト）の抗原が選択され
た。
のマラリアの重大性を考慮すれば、有効なワクチンの提
供が極めて重要である。ワクチンはプラスモディウム
(Plasmodia; P.)のスポロゾイト(sporozoites) 、メロ
ゾイト(merozoites)または生殖母体(gametocytes) に向
けることができ、この場合には熱帯マラリア原虫の血液
中における無性段階（メロゾイト）の抗原が選択され
た。
【０００３】ＳＥＲＰのヌクレオチドおよびタンパク質
配列は欧州特許出願第ＥＰ−Ａ１−０ ２８３ ８８２
号明細書に「１４０ｋｄタンパク質」に対するものとし
て記載されている。ＨＲＰＩＩは欧州特許出願第ＥＰ−
Ａ２−０ ３１５ ０８５号明細書に記載されており、
核酸配列およびそれによってコードされるタンパク質
は、その表２に含まれている。最後に、ＭＳＡ Ｉの部
分配列は欧州特許出願第ＥＰ−Ａ１−０ ２５４ ８６
２号明細書に抗原３１−１または１９５ｋｄ抗原の部分
タンパク質の名前で記載されている（同書、図１を参照
されたい）。
配列は欧州特許出願第ＥＰ−Ａ１−０ ２８３ ８８２
号明細書に「１４０ｋｄタンパク質」に対するものとし
て記載されている。ＨＲＰＩＩは欧州特許出願第ＥＰ−
Ａ２−０ ３１５ ０８５号明細書に記載されており、
核酸配列およびそれによってコードされるタンパク質
は、その表２に含まれている。最後に、ＭＳＡ Ｉの部
分配列は欧州特許出願第ＥＰ−Ａ１−０ ２５４ ８６
２号明細書に抗原３１−１または１９５ｋｄ抗原の部分
タンパク質の名前で記載されている（同書、図１を参照
されたい）。
【０００４】意外なことには、本発明によるハイブリッ
ドタンパク質は単一のタンパク質のそれぞれの防御作用
よりも強力な防御作用を有することが明らかになった
（図１〜４）。本発明によるハイブリッドタンパク質の
例としては、図５に模式的に表わされている２種類の構
造の発現生成物を用いた： １． ＭＳ２／ＳＥＲＰ／ＨＲＰＩＩ（ＳＥＲＰ ＡＡ
６３１〜８９２を含む）および ２． ＳＥＲＰ／ＭＳＡ Ｉ／ＨＲＰＩＩ（ＭＳＡ Ｉ
ＡＡ１４０〜２５４およびＳＥＲＰ ＡＡ６３０〜７
６４を含む）。この場合の融合タンパク質は、少なくと
も２種類のＴ−細胞エピトープを含む。このようなビ
−、トリ−またはオリゴパルタイトハイブリッド構造体
の更に好ましい精製法を、マラリアワクチンのいくつか
の極めて活性な成分は単一の精製法でしか得ることがで
きないので、本発明によるハイブリッドタンパク質の使
用での相乗的防御効果の外に考えるべきである。更に、
多成分ワクチンは、このワクチンが病原体の変異によっ
て不活性になる危険を低減する。
ドタンパク質は単一のタンパク質のそれぞれの防御作用
よりも強力な防御作用を有することが明らかになった
（図１〜４）。本発明によるハイブリッドタンパク質の
例としては、図５に模式的に表わされている２種類の構
造の発現生成物を用いた： １． ＭＳ２／ＳＥＲＰ／ＨＲＰＩＩ（ＳＥＲＰ ＡＡ
６３１〜８９２を含む）および ２． ＳＥＲＰ／ＭＳＡ Ｉ／ＨＲＰＩＩ（ＭＳＡ Ｉ
ＡＡ１４０〜２５４およびＳＥＲＰ ＡＡ６３０〜７
６４を含む）。この場合の融合タンパク質は、少なくと
も２種類のＴ−細胞エピトープを含む。このようなビ
−、トリ−またはオリゴパルタイトハイブリッド構造体
の更に好ましい精製法を、マラリアワクチンのいくつか
の極めて活性な成分は単一の精製法でしか得ることがで
きないので、本発明によるハイブリッドタンパク質の使
用での相乗的防御効果の外に考えるべきである。更に、
多成分ワクチンは、このワクチンが病原体の変異によっ
て不活性になる危険を低減する。
【０００５】
【実施例】本発明を下記の例で更に説明するが、示され
ている構造体ＭＳ２／ＳＥＲＰ／ＨＲＰＩＩおよびＳＥ
ＲＰ／ＭＳＡ Ｉ／ＨＲＰＩＩは例示のためのものであ
り、本発明を制限するものではない。最後に、本発明は
特許請求の範囲に記載されている。
ている構造体ＭＳ２／ＳＥＲＰ／ＨＲＰＩＩおよびＳＥ
ＲＰ／ＭＳＡ Ｉ／ＨＲＰＩＩは例示のためのものであ
り、本発明を制限するものではない。最後に、本発明は
特許請求の範囲に記載されている。
【０００６】例 例１： 出発プラスミドの説明 下記のプラスミドをハイブリッド抗原ＭＳ２／ＳＥＲＰ
／ＨＲＰＩＩおよびＳＥＲＰ／ＭＳＡ Ｉ／ＨＲＰＩＩ
を構成するために用いた。 ｐＵＣ−ＳＥＲＰ： ベクターｐＵＣ１８は完全なＳＥ
ＲＰ遺伝子を有する５．６ｋｂのゲノムＸｂａＩフラグ
メントを含む（ＥＰ−Ａ１−０ ２８３ ８８２号明細
書：ビー・クナップ(B. Knapp)ら (1989) Mol. Bioche
m. Parasitol.，32, 73-84 ）。 ｐＵＣ−ＨＲＰＩＩ： ベクターｐＵＣ１８はＨＲＰＩ
Ｉタンパク質のＣ−末端部分をコードする６００ｂｐフ
ラグメントを含む（ＥＰ−Ａ２−０ ３１５０８５号明
細書：ビー・クナップ(B. Knapp)ら、(1988) Behring I
nst. Mitt.，82, 349-359 ）。 ｐＥＸ−３１−１１ｒｄ： ベクターｐＥＸ３１ｂは反
復配列の欠失を有する抗原ＭＳＡ ＩのＮ−末端部分を
コードする６００ｂｐのフラグメントを含む（ＥＰ−Ａ
１−０ ２５４ ８６２号明細書）。 ｐＥＸ３１： λファージのＰＬプロモーターのコント
ロール下にてＭＳ２バクテリオファージのポリメラーゼ
の９９の−末端アミノ酸を発現し、これに外来タンパク
質を融合させることができる発現ベクター（ケイ・スト
レベル(K. Strebel)ら、(1986) J. Virol., 57, 983-99
1 ）。 ｐＴＲＣ９９： ｔａｃプロモーターのコントロール下
にて、融合なしに外来タンパク質を発現することができ
る発現ベクター（イー・アマン(E. Amann)ら、(1988) G
ene, 69, 301-315）。
／ＨＲＰＩＩおよびＳＥＲＰ／ＭＳＡ Ｉ／ＨＲＰＩＩ
を構成するために用いた。 ｐＵＣ−ＳＥＲＰ： ベクターｐＵＣ１８は完全なＳＥ
ＲＰ遺伝子を有する５．６ｋｂのゲノムＸｂａＩフラグ
メントを含む（ＥＰ−Ａ１−０ ２８３ ８８２号明細
書：ビー・クナップ(B. Knapp)ら (1989) Mol. Bioche
m. Parasitol.，32, 73-84 ）。 ｐＵＣ−ＨＲＰＩＩ： ベクターｐＵＣ１８はＨＲＰＩ
Ｉタンパク質のＣ−末端部分をコードする６００ｂｐフ
ラグメントを含む（ＥＰ−Ａ２−０ ３１５０８５号明
細書：ビー・クナップ(B. Knapp)ら、(1988) Behring I
nst. Mitt.，82, 349-359 ）。 ｐＥＸ−３１−１１ｒｄ： ベクターｐＥＸ３１ｂは反
復配列の欠失を有する抗原ＭＳＡ ＩのＮ−末端部分を
コードする６００ｂｐのフラグメントを含む（ＥＰ−Ａ
１−０ ２５４ ８６２号明細書）。 ｐＥＸ３１： λファージのＰＬプロモーターのコント
ロール下にてＭＳ２バクテリオファージのポリメラーゼ
の９９の−末端アミノ酸を発現し、これに外来タンパク
質を融合させることができる発現ベクター（ケイ・スト
レベル(K. Strebel)ら、(1986) J. Virol., 57, 983-99
1 ）。 ｐＴＲＣ９９： ｔａｃプロモーターのコントロール下
にて、融合なしに外来タンパク質を発現することができ
る発現ベクター（イー・アマン(E. Amann)ら、(1988) G
ene, 69, 301-315）。
【０００７】例２： ハイブリッド抗原ＭＳ２／ＳＥＲＰ／ＨＲＰＩＩの構築 プラスミドｐＵＣ−ＳＥＲＰを制限酵素ＥｃｏＲＩおよ
びＰｓｔＩで消化し、通常の方法（ジェイ・サムブルッ
ク(J. Sambrook) ら、(1989) Molecular Cloning: A La
boratory Manual, ２版、コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)
、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、
アメリカ合衆国）によってＳＥＲＰ遺伝子の７８７ｂｐ
フラグメントを単離することができた。このＤＮＡフラ
グメントをベクターｐＥＸ３１ｂのＥｃｏＲＩおよびＰ
ｓｔＩ制限部位間に連結した。ＰＯＰ ２１３６細胞
（ストラタジーン(Stratagene)社より入手）であってそ
のクロモゾームにＣＩ５３７遺伝子を有するものを形質
転換し、報告された方法（ビー・クナップ(B. Knapp)
ら、1988, 上記）による熱誘導の後に、単一コロニーを
ＭＳ２−ポリメラーゼ融合タンパク質として寄生虫特異
性ＤＮＡ配列の発現について試験した。ｐＥＸ３１ｂベ
クターに組み込まれたＤＮＡフラグメントを有する単一
コロニーはＳＥＲＰ抗原のアミノ酸631-892 を含む４０
ｋＤ ＭＳ２−ポリメラーゼ融合タンパク質を発現す
る。この領域はアミノ酸位置６４０および７００の間に
２種類のＴ−細胞エピトープ（シー・ルシルホン(C. Ro
ussilhon) ら、(1990), 上記）とアミノ酸位置７４５〜
７８７からの領域であってシステインプロテイナーゼの
コンセンサス配列と相同のもの（ヒギンス(Higgins)
ら、(1989), Nature, 340, 604）を含んでいる。
びＰｓｔＩで消化し、通常の方法（ジェイ・サムブルッ
ク(J. Sambrook) ら、(1989) Molecular Cloning: A La
boratory Manual, ２版、コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)
、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、
アメリカ合衆国）によってＳＥＲＰ遺伝子の７８７ｂｐ
フラグメントを単離することができた。このＤＮＡフラ
グメントをベクターｐＥＸ３１ｂのＥｃｏＲＩおよびＰ
ｓｔＩ制限部位間に連結した。ＰＯＰ ２１３６細胞
（ストラタジーン(Stratagene)社より入手）であってそ
のクロモゾームにＣＩ５３７遺伝子を有するものを形質
転換し、報告された方法（ビー・クナップ(B. Knapp)
ら、1988, 上記）による熱誘導の後に、単一コロニーを
ＭＳ２−ポリメラーゼ融合タンパク質として寄生虫特異
性ＤＮＡ配列の発現について試験した。ｐＥＸ３１ｂベ
クターに組み込まれたＤＮＡフラグメントを有する単一
コロニーはＳＥＲＰ抗原のアミノ酸631-892 を含む４０
ｋＤ ＭＳ２−ポリメラーゼ融合タンパク質を発現す
る。この領域はアミノ酸位置６４０および７００の間に
２種類のＴ−細胞エピトープ（シー・ルシルホン(C. Ro
ussilhon) ら、(1990), 上記）とアミノ酸位置７４５〜
７８７からの領域であってシステインプロテイナーゼの
コンセンサス配列と相同のもの（ヒギンス(Higgins)
ら、(1989), Nature, 340, 604）を含んでいる。
【０００８】第二段階において、５′末端にＰｓｔＩ部
位および３′末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位（部分消化）ま
たはＰｓｔＩ部位（完全消化）を有する６００ｂｐのＤ
ＮＡフラグメントを単離するために、挿入されたＤＮＡ
に関して５′および３′末端にＰｓｔＩ部位を有するプ
ラスミドｐＵＣ−ＨＲＰＩＩを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ
で消化した後、酵素ＰｓｔＩ（０．０５単位、１０分
間、３７℃）を用いて部分消化条件下でインキュベーシ
ョンした。このＤＮＡフラグメントを、７８７ｂｐＳＥ
ＲＰフラグメントを有するプラスミドｐＥＸ３１ｂのＰ
ｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位の間に連結した。この
場合には、連結されたＨＲＰＩＩフラグメントの読取り
枠は挿入されたＳＥＲＰフラグメントのものと一致す
る。ＰＯＰ２１３６細胞の形質転換の後、個々のクロー
ンを、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを加えたＬＢ培地
で２８℃で培養し、それぞれのクローンのプラスミドＤ
ＮＡを既知の方法（ジェイ・サムブルック(J. Sambroo
k) ら、上記）による制限酵素消化によって分析した。
必要なＤＮＡフラグメントを挿入したクローンを、記載
された方法（ビー・クナップ(B. Knapp)ら、1988）によ
って刺激して発現させ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動によって分析した。この場合には、タンパク質
はクーマジーブルーで染色するかまたはニトロセルロー
スに移してＳＥＲＰ（ビー・クナップ(B. Knapp)ら、19
89, 上記）およびＨＲＰＩＩ（ビー・クナップ(B. Knap
p)ら、1988, 上記）の組換え部分配列に対する抗体でこ
れらを試験した。アミノ酸配列に由来する６２ｋＤの大
きさとは対照的に、融合タンパク質の分子量は７５ｋＤ
である。この原因は既に記載されているＨＲＰＩＩ部分
の異常移動挙動である（ビー・クナップ(B. Knapp)ら、
1988, 上記）。融合タンパク質は３種類の異なるタンパ
ク質の部分、すなわちＭＳ２−ポリメラーゼの９９アミ
ノ酸（ＡＡ１〜９９）、ＳＥＲＰの２６２アミノ酸（Ａ
Ａ１００〜３６１）およびＨＲＰＩＩの１８９アミノ酸
（ＡＡ３６４〜５５２）を含む。アミノ酸位置３６２お
よび３６３は、クローニング手順に由来するリンカー領
域によってコードされる。このハイブリッド遺伝子はＨ
ＲＰＩＩフラグメントのＴＡＡコドンをその自然停止コ
ドンとして用いる。このハイブリッド遺伝子によってコ
ードされるタンパク質はウェスターンブロット分析にお
いてＳＥＲＰおよびＨＲＰＩＩに特異的な抗血清で分析
する。これによって、ハイブリッドタンパク質が両方の
マラリアタンパク質の抗原決定群を含むことが確かめら
れる。
位および３′末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位（部分消化）ま
たはＰｓｔＩ部位（完全消化）を有する６００ｂｐのＤ
ＮＡフラグメントを単離するために、挿入されたＤＮＡ
に関して５′および３′末端にＰｓｔＩ部位を有するプ
ラスミドｐＵＣ−ＨＲＰＩＩを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ
で消化した後、酵素ＰｓｔＩ（０．０５単位、１０分
間、３７℃）を用いて部分消化条件下でインキュベーシ
ョンした。このＤＮＡフラグメントを、７８７ｂｐＳＥ
ＲＰフラグメントを有するプラスミドｐＥＸ３１ｂのＰ
ｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位の間に連結した。この
場合には、連結されたＨＲＰＩＩフラグメントの読取り
枠は挿入されたＳＥＲＰフラグメントのものと一致す
る。ＰＯＰ２１３６細胞の形質転換の後、個々のクロー
ンを、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを加えたＬＢ培地
で２８℃で培養し、それぞれのクローンのプラスミドＤ
ＮＡを既知の方法（ジェイ・サムブルック(J. Sambroo
k) ら、上記）による制限酵素消化によって分析した。
必要なＤＮＡフラグメントを挿入したクローンを、記載
された方法（ビー・クナップ(B. Knapp)ら、1988）によ
って刺激して発現させ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動によって分析した。この場合には、タンパク質
はクーマジーブルーで染色するかまたはニトロセルロー
スに移してＳＥＲＰ（ビー・クナップ(B. Knapp)ら、19
89, 上記）およびＨＲＰＩＩ（ビー・クナップ(B. Knap
p)ら、1988, 上記）の組換え部分配列に対する抗体でこ
れらを試験した。アミノ酸配列に由来する６２ｋＤの大
きさとは対照的に、融合タンパク質の分子量は７５ｋＤ
である。この原因は既に記載されているＨＲＰＩＩ部分
の異常移動挙動である（ビー・クナップ(B. Knapp)ら、
1988, 上記）。融合タンパク質は３種類の異なるタンパ
ク質の部分、すなわちＭＳ２−ポリメラーゼの９９アミ
ノ酸（ＡＡ１〜９９）、ＳＥＲＰの２６２アミノ酸（Ａ
Ａ１００〜３６１）およびＨＲＰＩＩの１８９アミノ酸
（ＡＡ３６４〜５５２）を含む。アミノ酸位置３６２お
よび３６３は、クローニング手順に由来するリンカー領
域によってコードされる。このハイブリッド遺伝子はＨ
ＲＰＩＩフラグメントのＴＡＡコドンをその自然停止コ
ドンとして用いる。このハイブリッド遺伝子によってコ
ードされるタンパク質はウェスターンブロット分析にお
いてＳＥＲＰおよびＨＲＰＩＩに特異的な抗血清で分析
する。これによって、ハイブリッドタンパク質が両方の
マラリアタンパク質の抗原決定群を含むことが確かめら
れる。
【０００９】ハイブリッドタンパク質を、記載された方
法（ビー・クナップ(B. Knapp)ら、1988, 上記）によっ
て尿素濃度を段階的に増加することによる誘導された細
菌培養液５リットルから部分的に精製した。この場合に
は、ハイブリッドタンパク質は７Ｍ尿素に溶解し、２Ｍ
尿素、すなわちタンパク質を溶液状に保持する最低尿素
濃度に対して透析することができた。ウサギをこの部分
的に精製したハイブリッドタンパク質で免疫化した。こ
のハイブリッドタンパク質に対する抗体は、熱帯熱マラ
リア原虫(P. falciparum) シゾントタンパク質を用いた
ウェスターンブロット分析によって示されたようにＳＥ
ＲＰおよびＨＲＰＩＩとほぼ同程度に反応する。
法（ビー・クナップ(B. Knapp)ら、1988, 上記）によっ
て尿素濃度を段階的に増加することによる誘導された細
菌培養液５リットルから部分的に精製した。この場合に
は、ハイブリッドタンパク質は７Ｍ尿素に溶解し、２Ｍ
尿素、すなわちタンパク質を溶液状に保持する最低尿素
濃度に対して透析することができた。ウサギをこの部分
的に精製したハイブリッドタンパク質で免疫化した。こ
のハイブリッドタンパク質に対する抗体は、熱帯熱マラ
リア原虫(P. falciparum) シゾントタンパク質を用いた
ウェスターンブロット分析によって示されたようにＳＥ
ＲＰおよびＨＲＰＩＩとほぼ同程度に反応する。
【００１０】例３ ハイブリッド抗原ＳＥＲＰ／ＭＳＡ Ｉ／ＨＲＰＩＩの
構築 オリゴヌクレオチドｐ１（５′−ＣＧＴＣＣＣＡＴＧＧ
ＡＡＴＴＣＴＴＡＣＡＡＡＴＴＡＴＴＧＡＡＧＡＴ−
３′、５′末端のＮｃｏＩ制限部位、ＳＥＲＰ遺伝子の
塩基２６４１〜２６６７に相補的）およびｐ２（５′−
ＴＣＣＴＴＣＧＣＴＡＴＴＣＡＣＡＴＡＡＴＴＡＣＣＡ
ＴＡＡＣＣＡＡＣＡＡＴＡＴＴＡＡＣＴＧＣＡＴＧ−
３′、ＳＥＲＰ遺伝子の塩基２９９３〜３０４５に相補
的）およびｐＵＣ−ＳＥＲＰプラスミドＤＮＡ１０ｎｇ
をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に用いた。ＰＣＲは
Ｇｅｎ ＡｍｐTMキット（パーキン・エルマー・セタス
(Perkin Elmer Cetus)を用いる標準的方法によって行っ
た。これにより、ＳＥＲＰ抗原の１３５アミノ酸（ＡＡ
６３０〜７６４）をコードする約４００ｂｐのフラグメ
ント、すなわちＳＥＲＰ抗原の２種類のＴ−細胞エピト
ープを含む領域を生じた（シー・ルシルホン(C. Roussi
lhon) ら、1990, 上記）。
構築 オリゴヌクレオチドｐ１（５′−ＣＧＴＣＣＣＡＴＧＧ
ＡＡＴＴＣＴＴＡＣＡＡＡＴＴＡＴＴＧＡＡＧＡＴ−
３′、５′末端のＮｃｏＩ制限部位、ＳＥＲＰ遺伝子の
塩基２６４１〜２６６７に相補的）およびｐ２（５′−
ＴＣＣＴＴＣＧＣＴＡＴＴＣＡＣＡＴＡＡＴＴＡＣＣＡ
ＴＡＡＣＣＡＡＣＡＡＴＡＴＴＡＡＣＴＧＣＡＴＧ−
３′、ＳＥＲＰ遺伝子の塩基２９９３〜３０４５に相補
的）およびｐＵＣ−ＳＥＲＰプラスミドＤＮＡ１０ｎｇ
をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に用いた。ＰＣＲは
Ｇｅｎ ＡｍｐTMキット（パーキン・エルマー・セタス
(Perkin Elmer Cetus)を用いる標準的方法によって行っ
た。これにより、ＳＥＲＰ抗原の１３５アミノ酸（ＡＡ
６３０〜７６４）をコードする約４００ｂｐのフラグメ
ント、すなわちＳＥＲＰ抗原の２種類のＴ−細胞エピト
ープを含む領域を生じた（シー・ルシルホン(C. Roussi
lhon) ら、1990, 上記）。
【００１１】ｐＥＸ−３１−１ｌｒｄプラスミドＤＮＡ
１０ｎｇを、ＰＣＲによって、オリゴヌクレオチドｐ３
（５′−ＧＧＴＡＡＴＴＡＴＧＴＧＡＡＴＡＧＣＧＡＡ
ＧＧＡＧＡＡＣＴＣＴＴＴＧＡＴＴＴＡＡＣＣＡＡＴＣ
ＡＴＡＴＧ−３′；ヌクレオチド１〜１８はＳＥＲＰ遺
伝子の塩基３０２２〜３０４５に相補的であり、ヌクレ
オチド１９〜４５はＭＳＡ Ｉの部分配列３１−１ｌｒ
ｄの塩基２２６〜２５２に相補的である）およびｐ４
（５′−ＧＧＧＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＧＧＴＡＣＣ
ＡＡＧＣＴＴＡＣＴＴＣＣＴＴＣＡＡＴＴＡＡＴＴＣＡ
ＴＴＴＡＴＡＴＴＴＧＣ−３′、５′末端にＳａｌＩ、
ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を
有するＭＳＡ Ｉの部分配列３ｌ−１ｌｒｄの塩基５３
８〜５６７に相補的）を組み合わせて増幅した。これか
ら生じる３６０ｂｐフラグメントは、ＭＳＡ Ｉ抗原の
１１５アミノ酸（ＡＡ １４０〜２５４）をコードす
る。この領域は異なる熱帯熱マラリア原虫 (P. falcipa
rum ）株に高度に保存され、２種類のＴ−細胞エピトー
プ（クリサンティ(Crisanti)ら、1988, 上記）を有す
る。
１０ｎｇを、ＰＣＲによって、オリゴヌクレオチドｐ３
（５′−ＧＧＴＡＡＴＴＡＴＧＴＧＡＡＴＡＧＣＧＡＡ
ＧＧＡＧＡＡＣＴＣＴＴＴＧＡＴＴＴＡＡＣＣＡＡＴＣ
ＡＴＡＴＧ−３′；ヌクレオチド１〜１８はＳＥＲＰ遺
伝子の塩基３０２２〜３０４５に相補的であり、ヌクレ
オチド１９〜４５はＭＳＡ Ｉの部分配列３１−１ｌｒ
ｄの塩基２２６〜２５２に相補的である）およびｐ４
（５′−ＧＧＧＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＧＧＴＡＣＣ
ＡＡＧＣＴＴＡＣＴＴＣＣＴＴＣＡＡＴＴＡＡＴＴＣＡ
ＴＴＴＡＴＡＴＴＴＧＣ−３′、５′末端にＳａｌＩ、
ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を
有するＭＳＡ Ｉの部分配列３ｌ−１ｌｒｄの塩基５３
８〜５６７に相補的）を組み合わせて増幅した。これか
ら生じる３６０ｂｐフラグメントは、ＭＳＡ Ｉ抗原の
１１５アミノ酸（ＡＡ １４０〜２５４）をコードす
る。この領域は異なる熱帯熱マラリア原虫 (P. falcipa
rum ）株に高度に保存され、２種類のＴ−細胞エピトー
プ（クリサンティ(Crisanti)ら、1988, 上記）を有す
る。
【００１２】それぞれの場合に、第一および第二のＰＣ
ＲからのＤＮＡフラグメント１５０ｎｇを、ホルトム(H
ortom)らの方法（Gene, 77, 61-68, 1989 ）によりオリ
ゴヌクレオチドｐ１およびｐ４と組み合わせた第三のＰ
ＣＲに供した。増幅した７６０ｂｐのフラグメントを制
限酵素ＮｃｏＩおよびＳａｌＩで消化し、標準的方法
（ジェイ・サムブルック(J. Sambrook) ら、1989, 上
記）を用いてベクターｐＴＲＣ９９のＮｃｏＩおよびＳ
ａｌＩ部位の間に挿入した。これによって、ＳＥＲＰお
よびＭＳＡ Ｉ抗原の部分をコードするハイブリッド遺
伝子のｐＴＲＣベクターへのクローニングが生じた。こ
の場合に、出発コドンはＳＥＲＰ抗原の部分であり、す
なわちこの構造物は非マラリア特異的配列へのＮ−末端
融合を持たない。全体としては、融合遺伝子は少なくと
も４種類のＴ−細胞エピトープをコードする。
ＲからのＤＮＡフラグメント１５０ｎｇを、ホルトム(H
ortom)らの方法（Gene, 77, 61-68, 1989 ）によりオリ
ゴヌクレオチドｐ１およびｐ４と組み合わせた第三のＰ
ＣＲに供した。増幅した７６０ｂｐのフラグメントを制
限酵素ＮｃｏＩおよびＳａｌＩで消化し、標準的方法
（ジェイ・サムブルック(J. Sambrook) ら、1989, 上
記）を用いてベクターｐＴＲＣ９９のＮｃｏＩおよびＳ
ａｌＩ部位の間に挿入した。これによって、ＳＥＲＰお
よびＭＳＡ Ｉ抗原の部分をコードするハイブリッド遺
伝子のｐＴＲＣベクターへのクローニングが生じた。こ
の場合に、出発コドンはＳＥＲＰ抗原の部分であり、す
なわちこの構造物は非マラリア特異的配列へのＮ−末端
融合を持たない。全体としては、融合遺伝子は少なくと
も４種類のＴ−細胞エピトープをコードする。
【００１３】このハイブリッド遺伝子が実際に発現され
るかどうかを調べるために、構築したプラスミドをコン
ピテントＤＨ５α大腸菌細胞に形質転換し、アマン(Ama
nn）ら、（1988, 上記）によって記載された方法によっ
てイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）によって
誘導した。誘導された細胞を遠心分離によって回収し、
タンパク質パターンをＳＤＳ ＰＡＧＥによって分析し
た。タンパク質をクーマシーブルーで染色するかまたは
ニトロセルロースに移して、これをＳＥＲＰおよびＭＳ
Ａ Ｉ抗原に対する抗体とインキュベーションした。タ
ンパク質パターンは、誘導の後には、２８ｋＤのタンパ
ク質が高収率で発現されることを示している。このタン
パク質はＳＥＲＰの１３５アミノ酸とＭＳＡ Ｉ抗原の
１１５アミノ酸とから成るハイブリッドタンパク質であ
る。これは、ＳＥＲＰおよびＭＳＡ Ｉ抗原に対する抗
血清によるウェスターンブロットにおいて陽性反応を示
す。ｐＴＲＣベクターとハイブリッド遺伝子とから成る
プラスミド構築物をプラスミドｐＴＣと呼んだ。
るかどうかを調べるために、構築したプラスミドをコン
ピテントＤＨ５α大腸菌細胞に形質転換し、アマン(Ama
nn）ら、（1988, 上記）によって記載された方法によっ
てイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）によって
誘導した。誘導された細胞を遠心分離によって回収し、
タンパク質パターンをＳＤＳ ＰＡＧＥによって分析し
た。タンパク質をクーマシーブルーで染色するかまたは
ニトロセルロースに移して、これをＳＥＲＰおよびＭＳ
Ａ Ｉ抗原に対する抗体とインキュベーションした。タ
ンパク質パターンは、誘導の後には、２８ｋＤのタンパ
ク質が高収率で発現されることを示している。このタン
パク質はＳＥＲＰの１３５アミノ酸とＭＳＡ Ｉ抗原の
１１５アミノ酸とから成るハイブリッドタンパク質であ
る。これは、ＳＥＲＰおよびＭＳＡ Ｉ抗原に対する抗
血清によるウェスターンブロットにおいて陽性反応を示
す。ｐＴＲＣベクターとハイブリッド遺伝子とから成る
プラスミド構築物をプラスミドｐＴＣと呼んだ。
【００１４】他の熱帯熱マラリア原虫抗原の制限フラグ
メントにおいて、それらの読み取り枠とは無関係にクロ
ーニングすることができるようにするため、ｐＴＣベク
ターのポリリンカーをベクターｐＴＲＣ９９Ａ、Ｂおよ
びＣのポリリンカー（アマン(Amann) ら、1988, 上記）
に代えた。このために、ベクターｐＴＣをＨｉｎｄＩＩ
Ｉで消化した後、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を既知の方法
（ジェイ・サムブルック(J. Sambrook) ら、1989, 上
記）によってＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ヌクレ
オチドで３′末端を充填した。次に、このベクターをＳ
ｃａＩで消化して、ゲル電気泳動によってベクターＤＮ
Ａから分離される８３０ｂｐフラグメントを得た。ベク
ターＤＮＡをゲルから溶出させた。同時に、ベクターｐ
ＴＲＣ９９Ａ、ＢおよびＣをＮｃｏＩで消化した後、
５′突出末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで充填した。こ
れら３種類のベクターのＳｃａＩによる制限により、そ
れぞれの場合にゲル電気泳動によってベクターＤＮＡか
ら分離される８９０ｂｐフラグメントを得た。このベク
ターｐＴＲＣ９９Ａ、Ｂ及びＣの８９０ｂｐのＮｃｏＩ
−ＳｃａＩフラグメントをｐＴＣベクター残基にクロー
ニングした。これによって、３種類の異なる読み取り枠
にｐＴＲＣベクターのポリリンカーを有するプラスミド
ｐＴＣ１、ｐＴＣ２およびｐＴＣ３を生じた。
メントにおいて、それらの読み取り枠とは無関係にクロ
ーニングすることができるようにするため、ｐＴＣベク
ターのポリリンカーをベクターｐＴＲＣ９９Ａ、Ｂおよ
びＣのポリリンカー（アマン(Amann) ら、1988, 上記）
に代えた。このために、ベクターｐＴＣをＨｉｎｄＩＩ
Ｉで消化した後、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を既知の方法
（ジェイ・サムブルック(J. Sambrook) ら、1989, 上
記）によってＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ヌクレ
オチドで３′末端を充填した。次に、このベクターをＳ
ｃａＩで消化して、ゲル電気泳動によってベクターＤＮ
Ａから分離される８３０ｂｐフラグメントを得た。ベク
ターＤＮＡをゲルから溶出させた。同時に、ベクターｐ
ＴＲＣ９９Ａ、ＢおよびＣをＮｃｏＩで消化した後、
５′突出末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで充填した。こ
れら３種類のベクターのＳｃａＩによる制限により、そ
れぞれの場合にゲル電気泳動によってベクターＤＮＡか
ら分離される８９０ｂｐフラグメントを得た。このベク
ターｐＴＲＣ９９Ａ、Ｂ及びＣの８９０ｂｐのＮｃｏＩ
−ＳｃａＩフラグメントをｐＴＣベクター残基にクロー
ニングした。これによって、３種類の異なる読み取り枠
にｐＴＲＣベクターのポリリンカーを有するプラスミド
ｐＴＣ１、ｐＴＣ２およびｐＴＣ３を生じた。
【００１５】ｐＵＣ−ＨＲＰＩＩプラスミドＤＮＡを、
制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩ
Ｉで消化した。これによって、ゲル電気泳動によって精
製される６１０ｂｐのＤＮＡフラグメントが得られた。
同時に、ベクターｐＴＣ２を同じ制限酵素で処理して、
脱ホスホリル化した。ＨＲＰＩＩ特異性ＤＮＡフラグメ
ントを、記載された方法（ジェイ・サムブルック(J. Sa
mbrook) ら、1989，上記）によってｐＴＣ２ベクターに
連結した。ＤＨ５α細胞の形質転換の後、個々のコロニ
ーを１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天プレ
ート上で３７℃で培養した。これらのコロニーの幾つか
からのプラスミドＤＮＡを単離して、ＢａｍＨＩおよび
ＨｉｎｄＩＩＩで制限して、ＨＲＰＩＩフラグメントの
挿入について検討した。陽性のコロニーを３７℃で一晩
振盪した後、１ｍＭ ＩＰＴＧで２時間誘導した。遠心
分離によって細菌懸濁物を回収した後、ＳＤＳ ＰＡＧ
Ｅによってタンパク質パターンを分析した。この場合
に、タンパク質を直接コマシーブルーで染色し、または
それらをニトロセルロースに移して、ＳＥＲＰ、ＭＳＡ
ＩおよびＨＲＰＩＩに対する抗体で試験した。細菌
は、ウェスターンブロットでこれらの３種類のマラリア
タンパク質ＳＥＲＰ、ＭＳＡ ＩおよびＨＲＰＩＩに対
する抗血清と反応する６２ｋＤの追加のタンパク質バン
ドを発現する。このハイブリッド抗原は３部分からな
り、ＳＥＲＰの１３５アミノ酸、ＭＳＡ Ｉ抗原の１１
５アミノ酸およびＨＲＰＩＩ抗原の１８９アミノ酸を有
する。位置２５１〜２６５におけるアミノ酸はリンカー
領域によってコードされる。
制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩ
Ｉで消化した。これによって、ゲル電気泳動によって精
製される６１０ｂｐのＤＮＡフラグメントが得られた。
同時に、ベクターｐＴＣ２を同じ制限酵素で処理して、
脱ホスホリル化した。ＨＲＰＩＩ特異性ＤＮＡフラグメ
ントを、記載された方法（ジェイ・サムブルック(J. Sa
mbrook) ら、1989，上記）によってｐＴＣ２ベクターに
連結した。ＤＨ５α細胞の形質転換の後、個々のコロニ
ーを１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天プレ
ート上で３７℃で培養した。これらのコロニーの幾つか
からのプラスミドＤＮＡを単離して、ＢａｍＨＩおよび
ＨｉｎｄＩＩＩで制限して、ＨＲＰＩＩフラグメントの
挿入について検討した。陽性のコロニーを３７℃で一晩
振盪した後、１ｍＭ ＩＰＴＧで２時間誘導した。遠心
分離によって細菌懸濁物を回収した後、ＳＤＳ ＰＡＧ
Ｅによってタンパク質パターンを分析した。この場合
に、タンパク質を直接コマシーブルーで染色し、または
それらをニトロセルロースに移して、ＳＥＲＰ、ＭＳＡ
ＩおよびＨＲＰＩＩに対する抗体で試験した。細菌
は、ウェスターンブロットでこれらの３種類のマラリア
タンパク質ＳＥＲＰ、ＭＳＡ ＩおよびＨＲＰＩＩに対
する抗血清と反応する６２ｋＤの追加のタンパク質バン
ドを発現する。このハイブリッド抗原は３部分からな
り、ＳＥＲＰの１３５アミノ酸、ＭＳＡ Ｉ抗原の１１
５アミノ酸およびＨＲＰＩＩ抗原の１８９アミノ酸を有
する。位置２５１〜２６５におけるアミノ酸はリンカー
領域によってコードされる。
【００１６】例４： aotusモデルでの防御実験 ａ． 個々の成分ＨＲＰＩＩおよび３１−１ｌｒｄ（用
いられるＭＳＡ Ｉ領域を含むフラグメント） ９匹のaotus モンキー（体重１０００〜１５００ｇ、ベ
ーリングヴェルケ・アーゲー(Behringwerke AG) によっ
て飼育された雄および雌性動物）を無作為化して、３匹
ずつの３群（群Ａ、Ｂ、Ｃ）に分割した。群Ａにおける
総ての３匹の動物を、ＭＳ２／ＨＲＰＩＩ融合タンパク
質（ＰＢＳに溶解したもの）を１００μｇずつ３週間の
間隔で３回皮下に免疫化した。アジュバントとしては、
５０％Ａｌ（ＯＨ）３＋４５％レシチン＋５％サポニン
の抗原との１０％混合物を用いた。群Ｂにおける３匹の
動物を、同じ計画でＭＳＡ Ｉのアミノ酸２６〜６６お
よび１０６〜２５８を含むＭＳ２融合タンパク質で免疫
した。感染コントロール群（群Ｃ）における３匹の動物
には、前記の計画と同様の方法で、それぞれ抗原成分な
しのＰＢＳ＋アジュバントの１回注射を行った。
いられるＭＳＡ Ｉ領域を含むフラグメント） ９匹のaotus モンキー（体重１０００〜１５００ｇ、ベ
ーリングヴェルケ・アーゲー(Behringwerke AG) によっ
て飼育された雄および雌性動物）を無作為化して、３匹
ずつの３群（群Ａ、Ｂ、Ｃ）に分割した。群Ａにおける
総ての３匹の動物を、ＭＳ２／ＨＲＰＩＩ融合タンパク
質（ＰＢＳに溶解したもの）を１００μｇずつ３週間の
間隔で３回皮下に免疫化した。アジュバントとしては、
５０％Ａｌ（ＯＨ）３＋４５％レシチン＋５％サポニン
の抗原との１０％混合物を用いた。群Ｂにおける３匹の
動物を、同じ計画でＭＳＡ Ｉのアミノ酸２６〜６６お
よび１０６〜２５８を含むＭＳ２融合タンパク質で免疫
した。感染コントロール群（群Ｃ）における３匹の動物
には、前記の計画と同様の方法で、それぞれ抗原成分な
しのＰＢＳ＋アジュバントの１回注射を行った。
【００１７】ｂ． 個々の成分ＳＥＲＰ ８匹のaotus モンキー（体重１０００〜１５００ｇ、ベ
ーリングヴェルケ・アーゲー(Behringwerke AG) によっ
て飼育された雄および雌性動物）を無作為化して、４匹
ずつの２群（群Ｄ、Ｅ）に分割した。群Ｄの総ての４匹
の動物を、ＳＥＲＰ領域のＡＡ６８〜１８４およびＡＡ
６３１〜８９２のＭＳ２両者とも融合タンパク質として
発現されたものの組み合わせ（融合タンパク質および投
与量当たり１００μｇ、ＰＢＳ／３Ｍ尿素に溶解したも
の）で３週間の間隔で皮下に３回免疫化した。アジュバ
ントとしては、５０％Ａｌ（ＯＨ）３＋４５％レシチン
＋５％サポニンの抗原との１０％混合物を用いた。感染
コントロール群（群Ｅ）における４匹の動物には、前記
の計画と同様の方法で、それぞれ抗原成分なしの溶媒＋
アジュバントの１回注射を行った。
ーリングヴェルケ・アーゲー(Behringwerke AG) によっ
て飼育された雄および雌性動物）を無作為化して、４匹
ずつの２群（群Ｄ、Ｅ）に分割した。群Ｄの総ての４匹
の動物を、ＳＥＲＰ領域のＡＡ６８〜１８４およびＡＡ
６３１〜８９２のＭＳ２両者とも融合タンパク質として
発現されたものの組み合わせ（融合タンパク質および投
与量当たり１００μｇ、ＰＢＳ／３Ｍ尿素に溶解したも
の）で３週間の間隔で皮下に３回免疫化した。アジュバ
ントとしては、５０％Ａｌ（ＯＨ）３＋４５％レシチン
＋５％サポニンの抗原との１０％混合物を用いた。感染
コントロール群（群Ｅ）における４匹の動物には、前記
の計画と同様の方法で、それぞれ抗原成分なしの溶媒＋
アジュバントの１回注射を行った。
【００１８】ｃ． ＭＳ２／ＳＥＲＰ／ＨＲＰＩＩハイ
ブリッドタンパク質 ４匹のaotus モンキー（体重１０００〜１５００ｇ、ベ
ーリングヴェルケ・アーゲー(Behringwerke AG) によっ
て飼育された雄および雌性動物）を無作為化して、２匹
ずつの２群（群Ｆ、Ｇ）に分割した。群Ｆの２匹の動物
を、それぞれの場合に、ハイブリッドタンパク質（ＰＢ
Ｓ／３Ｍ尿素に溶解したもの）１００μｇで３週間の間
隔で皮下に３回免疫化した。アジュバントとしては、ポ
リ−α−オレフィンの抗原との１０％混合物を用いた。
感染コントロール群（群Ｇ）における２匹の動物には、
前記の計画と同様の方法で、それぞれ抗原成分なしのＰ
ＢＳ／３Ｍ尿素＋アジュバントの１回注射を行った。
ブリッドタンパク質 ４匹のaotus モンキー（体重１０００〜１５００ｇ、ベ
ーリングヴェルケ・アーゲー(Behringwerke AG) によっ
て飼育された雄および雌性動物）を無作為化して、２匹
ずつの２群（群Ｆ、Ｇ）に分割した。群Ｆの２匹の動物
を、それぞれの場合に、ハイブリッドタンパク質（ＰＢ
Ｓ／３Ｍ尿素に溶解したもの）１００μｇで３週間の間
隔で皮下に３回免疫化した。アジュバントとしては、ポ
リ−α−オレフィンの抗原との１０％混合物を用いた。
感染コントロール群（群Ｇ）における２匹の動物には、
前記の計画と同様の方法で、それぞれ抗原成分なしのＰ
ＢＳ／３Ｍ尿素＋アジュバントの１回注射を行った。
【００１９】ｄ． ＭＳ２／ＳＥＲＰ／ＨＲＰＩＩおよ
びＳＥＲＰ／ＭＳＡ Ｉ／ＨＲＰＩＩハイブリッドタン
パク質 ９匹のaotus モンキー（体重１０００〜１５００ｇ、ベ
ーリングヴェルケ・アーゲー(Behringwerke AG) によっ
て飼育された雄および雌性動物）を無作為化して、３匹
ずつの３群（群Ｈ、Ｉ、Ｋ）に分割した。群Ｈにおける
総ての３匹の動物を、それぞれの場合に、ＭＳ２／ＳＥ
ＲＰ／ＨＲＰＩＩ融合タンパク質（ＰＢＳ／３Ｍ尿素に
溶解したもの）を１００μｇで３週間の間隔で３回皮下
に免疫化した。アジュバントとしては、ポリ−α−オレ
フィンの抗原の１０％混合物を用いた。群Ｉにおける３
匹の動物を、同じ計画でＳＥＲＰ／ＭＳＡ Ｉ／ＨＲＰ
ＩＩハイブリッドタンパク質を用いて免疫化した。感染
コントロール群（群Ｋ）における３匹の動物には、前記
の計画と同様の方法で、それぞれ抗原成分なしのＰＢＳ
／３Ｍ尿素＋アジュバントの１回注射を行った。群Ａ〜
Ｋにおける総ての動物を、最後の免疫感作から１週間後
に脾臓切除し、約１週間後に、半ビボ（ｅｘ ｖｉｖ
ｏ）（P. falciparum palo alto)で寄生された赤血球５
×１０６（Ａ〜Ｇ）または２×１０６（Ｈ〜Ｋ）の感染
負荷量を行った。
びＳＥＲＰ／ＭＳＡ Ｉ／ＨＲＰＩＩハイブリッドタン
パク質 ９匹のaotus モンキー（体重１０００〜１５００ｇ、ベ
ーリングヴェルケ・アーゲー(Behringwerke AG) によっ
て飼育された雄および雌性動物）を無作為化して、３匹
ずつの３群（群Ｈ、Ｉ、Ｋ）に分割した。群Ｈにおける
総ての３匹の動物を、それぞれの場合に、ＭＳ２／ＳＥ
ＲＰ／ＨＲＰＩＩ融合タンパク質（ＰＢＳ／３Ｍ尿素に
溶解したもの）を１００μｇで３週間の間隔で３回皮下
に免疫化した。アジュバントとしては、ポリ−α−オレ
フィンの抗原の１０％混合物を用いた。群Ｉにおける３
匹の動物を、同じ計画でＳＥＲＰ／ＭＳＡ Ｉ／ＨＲＰ
ＩＩハイブリッドタンパク質を用いて免疫化した。感染
コントロール群（群Ｋ）における３匹の動物には、前記
の計画と同様の方法で、それぞれ抗原成分なしのＰＢＳ
／３Ｍ尿素＋アジュバントの１回注射を行った。群Ａ〜
Ｋにおける総ての動物を、最後の免疫感作から１週間後
に脾臓切除し、約１週間後に、半ビボ（ｅｘ ｖｉｖ
ｏ）（P. falciparum palo alto)で寄生された赤血球５
×１０６（Ａ〜Ｇ）または２×１０６（Ｈ〜Ｋ）の感染
負荷量を行った。
【図１】aotus モデルでの防御実験（例４）において、
個々の成分ＨＲＰＩＩ（群Ａ）およびＭＳＡ Ｉ（群
Ｂ）；コントロール＝群Ｃでの免疫感作の結果を示す説
明図。
個々の成分ＨＲＰＩＩ（群Ａ）およびＭＳＡ Ｉ（群
Ｂ）；コントロール＝群Ｃでの免疫感作の結果を示す説
明図。
【図２】aotus モデルでの防御実験（例４）において、
個々の成分ＳＥＲＰ（群Ｄ）；コントロール＝群Ｅでの
免疫感作の結果を示す説明図。
個々の成分ＳＥＲＰ（群Ｄ）；コントロール＝群Ｅでの
免疫感作の結果を示す説明図。
【図３】aotus モデルでの防御実験（例４）において、
ＭＳ２／ＳＥＲＰ／ＨＲＰＩＩハイブリッドタンパク質
（群Ｆ）；コントロール＝群Ｇでの免疫感作の結果を示
す説明図。
ＭＳ２／ＳＥＲＰ／ＨＲＰＩＩハイブリッドタンパク質
（群Ｆ）；コントロール＝群Ｇでの免疫感作の結果を示
す説明図。
【図４】aotus モデルでの防御実験（例４）において、
ハイブリッドタンパク質ＭＳ２／ＳＥＲＰ／ＨＲＰＩＩ
（群Ｈ）およびＳＥＲＰ／ＭＳＡ Ｉ／ＨＲＰＩＩ（群
Ｉ）；コントロール＝群Ｋでの免疫感作の結果を示す説
明図。
ハイブリッドタンパク質ＭＳ２／ＳＥＲＰ／ＨＲＰＩＩ
（群Ｈ）およびＳＥＲＰ／ＭＳＡ Ｉ／ＨＲＰＩＩ（群
Ｉ）；コントロール＝群Ｋでの免疫感作の結果を示す説
明図。
【図５】１）はＭＳ２、ＳＥＲＰおよびＨＲＰＩＩ（プ
ラスミドｐＥＸ ＳＥＲＰ／ＨＲＰＩＩ）の構築物であ
って、２アミノ酸のリンカーがＳＥＲＰとＨＲＰＩＩと
の間に組み込まれているものを図式的に表わし、２）は
プラスミドｐＴＣ２ ＨＲＰＩＩを図式的に対応させて
表わす説明図。 ａａ＝アミノ酸。
ラスミドｐＥＸ ＳＥＲＰ／ＨＲＰＩＩ）の構築物であ
って、２アミノ酸のリンカーがＳＥＲＰとＨＲＰＩＩと
の間に組み込まれているものを図式的に表わし、２）は
プラスミドｐＴＣ２ ＨＲＰＩＩを図式的に対応させて
表わす説明図。 ａａ＝アミノ酸。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/569 Ａ 9015−2Ｊ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ブルクハルト、エンデルス ドイツ連邦共和国マールブルク、オーベレ ル、アイヒウェーク、12 (72)発明者 ハンス、キュッパー ドイツ連邦共和国マールブルク、バンコプ フシュトラーセ、12
Claims (6)
- 【請求項１】ＳＥＲＰの少なくとも２種類のＴ−細胞エ
ピトープおよびＨＲＰＩＩの部分配列を有する、熱帯熱
マラリア原虫由来のハイブリッドタンパク質。 - 【請求項２】ＳＥＲＰの領域ＡＡ６３０〜ＡＡ８９２お
よびＨＲＰＩＩの１８９Ｃ−末端ＡＡを含む、請求項１
に記載のハイブリッドタンパク質。 - 【請求項３】少なくとも２種類のＴ−細胞エピトープを
有するＭＳＡＩ部分が更に組み込まれている、請求項１
に記載のハイブリッドタンパク質。 - 【請求項４】好適な発現系においてハイブリッドタンパ
ク質をコードする配列を発現させ、生成する発現生成物
を単離することを特徴とする、請求項１、２または３に
記載のハイブリッドタンパク質の製造法。 - 【請求項５】ワクチンとしての請求項１、２または３に
記載のハイブリッドタンパク質。 - 【請求項６】請求項１、２または３に記載のハイブリッ
ドタンパク質および好適なアジュバントを含むワクチ
ン。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4041836A DE4041836A1 (de) | 1990-12-24 | 1990-12-24 | Protektive plasmodium falciparum hybridproteine, die teilsequenzen der malaria-antigene hrpii und serp enthalten, ihre herstellung und verwendung |
| DE4041836.7 | 1990-12-24 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06121688A true JPH06121688A (ja) | 1994-05-06 |
Family
ID=6421479
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3356233A Pending JPH06121688A (ja) | 1990-12-24 | 1991-12-24 | マラリア抗原ｈｒｐｉｉおよびｓｅｒｐの部分配列を含む防御的熱帯熱マラリア原虫ハイブリッドタンパク質、その製造および使用 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5395614A (ja) |
| EP (1) | EP0492500B1 (ja) |
| JP (1) | JPH06121688A (ja) |
| KR (1) | KR920012116A (ja) |
| AT (1) | ATE136586T1 (ja) |
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| CA (1) | CA2057761A1 (ja) |
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| ES (1) | ES2085947T3 (ja) |
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| PT (1) | PT99923B (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5928902A (en) * | 1992-02-27 | 1999-07-27 | Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) | Hybrid protein between CS from plasmodium and HBsAg |
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