JPH06121688A - マラリア抗原hrpiiおよびserpの部分配列を含む防御的熱帯熱マラリア原虫ハイブリッドタンパク質、その製造および使用 - Google Patents

マラリア抗原hrpiiおよびserpの部分配列を含む防御的熱帯熱マラリア原虫ハイブリッドタンパク質、その製造および使用

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JPH06121688A
JPH06121688A JP3356233A JP35623391A JPH06121688A JP H06121688 A JPH06121688 A JP H06121688A JP 3356233 A JP3356233 A JP 3356233A JP 35623391 A JP35623391 A JP 35623391A JP H06121688 A JPH06121688 A JP H06121688A
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hybrid protein
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Bernhard Knapp
ベルンハルト、ナップ
Erika Hundt
エリカ、フント
Burkhard Enders
ブルクハルト、エンデルス
Hans Kuepper
ハンス、キュッパー
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 マラリアに有効なワクチンのためのタンパク
質を提供する。 【構成】 マラリア抗原HRPIIおよびSERPの部
分配列を含むハイブリッドタンパク質。HRPII配列
はサルのモデルで防御的であることが既に証明されてい
るが、本発明では189個のアミノ酸のC−末端領域が
用いられる。SERPは防御的タンパク質バンドに対す
る抗血清を用いて同定され、用いる部分配列(アミノ酸
631〜892または630〜764)は少なくとも2
種類のT−細胞エピトープを含む。好ましい態様では、
他の熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)タンパク質、
例えばメロゾイト表面抗原I(MSAI或いは「195
kd抗原」)の別のT−細胞エピトープ含有領域である
アミノ酸100〜300が組み込まれている。総てのハ
イブリッド成分に共通な特性は、それらが高度に保存さ
れたペプチド配列を表わすということである。マラリア
の感染に対する防御は、上記のハイブリッドタンパク質
での免疫化によって生じる。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】本発明はマラリア抗原HRPIIおよびS
ERPの部分配列を含むハイブリッドタンパク質に関す
る。HRPII配列はサルのモデルで防御的であること
が既に証明されており(EP−A2−0 315 08
5号明細書)、189個のアミノ酸のC−末端領域が前
の防御実験におけるのと同じ方法で本発明に用いられ
た。SERPは防御的タンパク質バンドに対する抗血清
を用いて同定され(EP−A1−0 283882号明
細書)、用いた部分配列(アミノ酸(AA)631〜8
92または630〜764)は少なくとも2種類のT−
細胞エピトープ(ルシルホン(Roussilhon)ら、(1990),
Immunol. Letters, 25, 149-154 )を含む。好ましい態
様では、他の熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum) タン
パク質、例えばメロゾイト(merozoite) 表面抗原I(M
SAI或いは「195kd抗原」)の別のT−細胞エピ
トープ含有領域であるアミノ酸100〜300が組み込
まれている(クリサンティ(Crisanti)ら、(1988), Scie
nce, 240, 324-326 )。総てのハイブリッド成分に共通
な特性は、それらが高度に保存されたペプチド配列を表
わすということである。マラリアの感染に対する防御
は、前記のハイブリッドタンパク質で免疫感作すること
によって生じる。
【0002】最も広く蔓延している熱帯病の一つとして
のマラリアの重大性を考慮すれば、有効なワクチンの提
供が極めて重要である。ワクチンはプラスモディウム
(Plasmodia; P.)のスポロゾイト(sporozoites) 、メロ
ゾイト(merozoites)または生殖母体(gametocytes) に向
けることができ、この場合には熱帯マラリア原虫の血液
中における無性段階(メロゾイト)の抗原が選択され
た。
【0003】SERPのヌクレオチドおよびタンパク質
配列は欧州特許出願第EP−A1−0 283 882
号明細書に「140kdタンパク質」に対するものとし
て記載されている。HRPIIは欧州特許出願第EP−
A2−0 315 085号明細書に記載されており、
核酸配列およびそれによってコードされるタンパク質
は、その表2に含まれている。最後に、MSA Iの部
分配列は欧州特許出願第EP−A1−0 254 86
2号明細書に抗原31−1または195kd抗原の部分
タンパク質の名前で記載されている(同書、図1を参照
されたい)。
【0004】意外なことには、本発明によるハイブリッ
ドタンパク質は単一のタンパク質のそれぞれの防御作用
よりも強力な防御作用を有することが明らかになった
(図1〜4)。本発明によるハイブリッドタンパク質の
例としては、図5に模式的に表わされている2種類の構
造の発現生成物を用いた: 1. MS2/SERP/HRPII(SERP AA
631〜892を含む)および 2. SERP/MSA I/HRPII(MSA I
AA140〜254およびSERP AA630〜7
64を含む)。この場合の融合タンパク質は、少なくと
も2種類のT−細胞エピトープを含む。このようなビ
−、トリ−またはオリゴパルタイトハイブリッド構造体
の更に好ましい精製法を、マラリアワクチンのいくつか
の極めて活性な成分は単一の精製法でしか得ることがで
きないので、本発明によるハイブリッドタンパク質の使
用での相乗的防御効果の外に考えるべきである。更に、
多成分ワクチンは、このワクチンが病原体の変異によっ
て不活性になる危険を低減する。
【0005】
【実施例】本発明を下記の例で更に説明するが、示され
ている構造体MS2/SERP/HRPIIおよびSE
RP/MSA I/HRPIIは例示のためのものであ
り、本発明を制限するものではない。最後に、本発明は
特許請求の範囲に記載されている。
【0006】例 例1: 出発プラスミドの説明 下記のプラスミドをハイブリッド抗原MS2/SERP
/HRPIIおよびSERP/MSA I/HRPII
を構成するために用いた。 pUC−SERP: ベクターpUC18は完全なSE
RP遺伝子を有する5.6kbのゲノムXbaIフラグ
メントを含む(EP−A1−0 283 882号明細
書:ビー・クナップ(B. Knapp)ら (1989) Mol. Bioche
m. Parasitol.,32, 73-84 )。 pUC−HRPII: ベクターpUC18はHRPI
Iタンパク質のC−末端部分をコードする600bpフ
ラグメントを含む(EP−A2−0 315085号明
細書:ビー・クナップ(B. Knapp)ら、(1988) Behring I
nst. Mitt.,82, 349-359 )。 pEX−31−11rd: ベクターpEX31bは反
復配列の欠失を有する抗原MSA IのN−末端部分を
コードする600bpのフラグメントを含む(EP−A
1−0 254 862号明細書)。 pEX31: λファージのPLプロモーターのコント
ロール下にてMS2バクテリオファージのポリメラーゼ
の99の−末端アミノ酸を発現し、これに外来タンパク
質を融合させることができる発現ベクター(ケイ・スト
レベル(K. Strebel)ら、(1986) J. Virol., 57, 983-99
1 )。 pTRC99: tacプロモーターのコントロール下
にて、融合なしに外来タンパク質を発現することができ
る発現ベクター(イー・アマン(E. Amann)ら、(1988) G
ene, 69, 301-315)。
【0007】例2: ハイブリッド抗原MS2/SERP/HRPIIの構築 プラスミドpUC−SERPを制限酵素EcoRIおよ
びPstIで消化し、通常の方法(ジェイ・サムブルッ
ク(J. Sambrook) ら、(1989) Molecular Cloning: A La
boratory Manual, 2版、コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)
、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、
アメリカ合衆国)によってSERP遺伝子の787bp
フラグメントを単離することができた。このDNAフラ
グメントをベクターpEX31bのEcoRIおよびP
stI制限部位間に連結した。POP 2136細胞
(ストラタジーン(Stratagene)社より入手)であってそ
のクロモゾームにCI537遺伝子を有するものを形質
転換し、報告された方法(ビー・クナップ(B. Knapp)
ら、1988, 上記)による熱誘導の後に、単一コロニーを
MS2−ポリメラーゼ融合タンパク質として寄生虫特異
性DNA配列の発現について試験した。pEX31bベ
クターに組み込まれたDNAフラグメントを有する単一
コロニーはSERP抗原のアミノ酸631-892 を含む40
kD MS2−ポリメラーゼ融合タンパク質を発現す
る。この領域はアミノ酸位置640および700の間に
2種類のT−細胞エピトープ(シー・ルシルホン(C. Ro
ussilhon) ら、(1990), 上記)とアミノ酸位置745〜
787からの領域であってシステインプロテイナーゼの
コンセンサス配列と相同のもの(ヒギンス(Higgins)
ら、(1989), Nature, 340, 604)を含んでいる。
【0008】第二段階において、5′末端にPstI部
位および3′末端にHindIII部位(部分消化)ま
たはPstI部位(完全消化)を有する600bpのD
NAフラグメントを単離するために、挿入されたDNA
に関して5′および3′末端にPstI部位を有するプ
ラスミドpUC−HRPIIを制限酵素HindIII
で消化した後、酵素PstI(0.05単位、10分
間、37℃)を用いて部分消化条件下でインキュベーシ
ョンした。このDNAフラグメントを、787bpSE
RPフラグメントを有するプラスミドpEX31bのP
stIおよびHindIII部位の間に連結した。この
場合には、連結されたHRPIIフラグメントの読取り
枠は挿入されたSERPフラグメントのものと一致す
る。POP2136細胞の形質転換の後、個々のクロー
ンを、アンピシリン100μg/mlを加えたLB培地
で28℃で培養し、それぞれのクローンのプラスミドD
NAを既知の方法(ジェイ・サムブルック(J. Sambroo
k) ら、上記)による制限酵素消化によって分析した。
必要なDNAフラグメントを挿入したクローンを、記載
された方法(ビー・クナップ(B. Knapp)ら、1988)によ
って刺激して発現させ、SDSポリアクリルアミドゲル
電気泳動によって分析した。この場合には、タンパク質
はクーマジーブルーで染色するかまたはニトロセルロー
スに移してSERP(ビー・クナップ(B. Knapp)ら、19
89, 上記)およびHRPII(ビー・クナップ(B. Knap
p)ら、1988, 上記)の組換え部分配列に対する抗体でこ
れらを試験した。アミノ酸配列に由来する62kDの大
きさとは対照的に、融合タンパク質の分子量は75kD
である。この原因は既に記載されているHRPII部分
の異常移動挙動である(ビー・クナップ(B. Knapp)ら、
1988, 上記)。融合タンパク質は3種類の異なるタンパ
ク質の部分、すなわちMS2−ポリメラーゼの99アミ
ノ酸(AA1〜99)、SERPの262アミノ酸(A
A100〜361)およびHRPIIの189アミノ酸
(AA364〜552)を含む。アミノ酸位置362お
よび363は、クローニング手順に由来するリンカー領
域によってコードされる。このハイブリッド遺伝子はH
RPIIフラグメントのTAAコドンをその自然停止コ
ドンとして用いる。このハイブリッド遺伝子によってコ
ードされるタンパク質はウェスターンブロット分析にお
いてSERPおよびHRPIIに特異的な抗血清で分析
する。これによって、ハイブリッドタンパク質が両方の
マラリアタンパク質の抗原決定群を含むことが確かめら
れる。
【0009】ハイブリッドタンパク質を、記載された方
法(ビー・クナップ(B. Knapp)ら、1988, 上記)によっ
て尿素濃度を段階的に増加することによる誘導された細
菌培養液5リットルから部分的に精製した。この場合に
は、ハイブリッドタンパク質は7M尿素に溶解し、2M
尿素、すなわちタンパク質を溶液状に保持する最低尿素
濃度に対して透析することができた。ウサギをこの部分
的に精製したハイブリッドタンパク質で免疫化した。こ
のハイブリッドタンパク質に対する抗体は、熱帯熱マラ
リア原虫(P. falciparum) シゾントタンパク質を用いた
ウェスターンブロット分析によって示されたようにSE
RPおよびHRPIIとほぼ同程度に反応する。
【0010】例3 ハイブリッド抗原SERP/MSA I/HRPIIの
構築 オリゴヌクレオチドp1(5′−CGTCCCATGG
AATTCTTACAAATTATTGAAGAT−
3′、5′末端のNcoI制限部位、SERP遺伝子の
塩基2641〜2667に相補的)およびp2(5′−
TCCTTCGCTATTCACATAATTACCA
TAACCAACAATATTAACTGCATG−
3′、SERP遺伝子の塩基2993〜3045に相補
的)およびpUC−SERPプラスミドDNA10ng
をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に用いた。PCRは
Gen AmpTMキット(パーキン・エルマー・セタス
(Perkin Elmer Cetus)を用いる標準的方法によって行っ
た。これにより、SERP抗原の135アミノ酸(AA
630〜764)をコードする約400bpのフラグメ
ント、すなわちSERP抗原の2種類のT−細胞エピト
ープを含む領域を生じた(シー・ルシルホン(C. Roussi
lhon) ら、1990, 上記)。
【0011】pEX−31−1lrdプラスミドDNA
10ngを、PCRによって、オリゴヌクレオチドp3
(5′−GGTAATTATGTGAATAGCGAA
GGAGAACTCTTTGATTTAACCAATC
ATATG−3′;ヌクレオチド1〜18はSERP遺
伝子の塩基3022〜3045に相補的であり、ヌクレ
オチド19〜45はMSA Iの部分配列31−1lr
dの塩基226〜252に相補的である)およびp4
(5′−GGGGTCGACGGATCCGGTACC
AAGCTTACTTCCTTCAATTAATTCA
TTTATATTTGC−3′、5′末端にSalI、
BamHI、KpnIおよびHindIII制限部位を
有するMSA Iの部分配列3l−1lrdの塩基53
8〜567に相補的)を組み合わせて増幅した。これか
ら生じる360bpフラグメントは、MSA I抗原の
115アミノ酸(AA 140〜254)をコードす
る。この領域は異なる熱帯熱マラリア原虫 (P. falcipa
rum )株に高度に保存され、2種類のT−細胞エピトー
プ(クリサンティ(Crisanti)ら、1988, 上記)を有す
る。
【0012】それぞれの場合に、第一および第二のPC
RからのDNAフラグメント150ngを、ホルトム(H
ortom)らの方法(Gene, 77, 61-68, 1989 )によりオリ
ゴヌクレオチドp1およびp4と組み合わせた第三のP
CRに供した。増幅した760bpのフラグメントを制
限酵素NcoIおよびSalIで消化し、標準的方法
(ジェイ・サムブルック(J. Sambrook) ら、1989, 上
記)を用いてベクターpTRC99のNcoIおよびS
alI部位の間に挿入した。これによって、SERPお
よびMSA I抗原の部分をコードするハイブリッド遺
伝子のpTRCベクターへのクローニングが生じた。こ
の場合に、出発コドンはSERP抗原の部分であり、す
なわちこの構造物は非マラリア特異的配列へのN−末端
融合を持たない。全体としては、融合遺伝子は少なくと
も4種類のT−細胞エピトープをコードする。
【0013】このハイブリッド遺伝子が実際に発現され
るかどうかを調べるために、構築したプラスミドをコン
ピテントDH5α大腸菌細胞に形質転換し、アマン(Ama
nn)ら、(1988, 上記)によって記載された方法によっ
てイソプロピルチオガラクトシド(IPTG)によって
誘導した。誘導された細胞を遠心分離によって回収し、
タンパク質パターンをSDS PAGEによって分析し
た。タンパク質をクーマシーブルーで染色するかまたは
ニトロセルロースに移して、これをSERPおよびMS
A I抗原に対する抗体とインキュベーションした。タ
ンパク質パターンは、誘導の後には、28kDのタンパ
ク質が高収率で発現されることを示している。このタン
パク質はSERPの135アミノ酸とMSA I抗原の
115アミノ酸とから成るハイブリッドタンパク質であ
る。これは、SERPおよびMSA I抗原に対する抗
血清によるウェスターンブロットにおいて陽性反応を示
す。pTRCベクターとハイブリッド遺伝子とから成る
プラスミド構築物をプラスミドpTCと呼んだ。
【0014】他の熱帯熱マラリア原虫抗原の制限フラグ
メントにおいて、それらの読み取り枠とは無関係にクロ
ーニングすることができるようにするため、pTCベク
ターのポリリンカーをベクターpTRC99A、Bおよ
びCのポリリンカー(アマン(Amann) ら、1988, 上記)
に代えた。このために、ベクターpTCをHindII
Iで消化した後、HindIII制限部位を既知の方法
(ジェイ・サムブルック(J. Sambrook) ら、1989, 上
記)によってT4DNAポリメラーゼを用いて、ヌクレ
オチドで3′末端を充填した。次に、このベクターをS
caIで消化して、ゲル電気泳動によってベクターDN
Aから分離される830bpフラグメントを得た。ベク
ターDNAをゲルから溶出させた。同時に、ベクターp
TRC99A、BおよびCをNcoIで消化した後、
5′突出末端をT4DNAポリメラーゼで充填した。こ
れら3種類のベクターのScaIによる制限により、そ
れぞれの場合にゲル電気泳動によってベクターDNAか
ら分離される890bpフラグメントを得た。このベク
ターpTRC99A、B及びCの890bpのNcoI
−ScaIフラグメントをpTCベクター残基にクロー
ニングした。これによって、3種類の異なる読み取り枠
にpTRCベクターのポリリンカーを有するプラスミド
pTC1、pTC2およびpTC3を生じた。
【0015】pUC−HRPIIプラスミドDNAを、
制限エンドヌクレアーゼBamHIおよびHindII
Iで消化した。これによって、ゲル電気泳動によって精
製される610bpのDNAフラグメントが得られた。
同時に、ベクターpTC2を同じ制限酵素で処理して、
脱ホスホリル化した。HRPII特異性DNAフラグメ
ントを、記載された方法(ジェイ・サムブルック(J. Sa
mbrook) ら、1989,上記)によってpTC2ベクターに
連結した。DH5α細胞の形質転換の後、個々のコロニ
ーを100μg/mlアンピシリンを含むLB寒天プレ
ート上で37℃で培養した。これらのコロニーの幾つか
からのプラスミドDNAを単離して、BamHIおよび
HindIIIで制限して、HRPIIフラグメントの
挿入について検討した。陽性のコロニーを37℃で一晩
振盪した後、1mM IPTGで2時間誘導した。遠心
分離によって細菌懸濁物を回収した後、SDS PAG
Eによってタンパク質パターンを分析した。この場合
に、タンパク質を直接コマシーブルーで染色し、または
それらをニトロセルロースに移して、SERP、MSA
IおよびHRPIIに対する抗体で試験した。細菌
は、ウェスターンブロットでこれらの3種類のマラリア
タンパク質SERP、MSA IおよびHRPIIに対
する抗血清と反応する62kDの追加のタンパク質バン
ドを発現する。このハイブリッド抗原は3部分からな
り、SERPの135アミノ酸、MSA I抗原の11
5アミノ酸およびHRPII抗原の189アミノ酸を有
する。位置251〜265におけるアミノ酸はリンカー
領域によってコードされる。
【0016】例4: aotusモデルでの防御実験 a. 個々の成分HRPIIおよび31−1lrd(用
いられるMSA I領域を含むフラグメント) 9匹のaotus モンキー(体重1000〜1500g、ベ
ーリングヴェルケ・アーゲー(Behringwerke AG) によっ
て飼育された雄および雌性動物)を無作為化して、3匹
ずつの3群(群A、B、C)に分割した。群Aにおける
総ての3匹の動物を、MS2/HRPII融合タンパク
質(PBSに溶解したもの)を100μgずつ3週間の
間隔で3回皮下に免疫化した。アジュバントとしては、
50%Al(OH)+45%レシチン+5%サポニン
の抗原との10%混合物を用いた。群Bにおける3匹の
動物を、同じ計画でMSA Iのアミノ酸26〜66お
よび106〜258を含むMS2融合タンパク質で免疫
した。感染コントロール群(群C)における3匹の動物
には、前記の計画と同様の方法で、それぞれ抗原成分な
しのPBS+アジュバントの1回注射を行った。
【0017】b. 個々の成分SERP 8匹のaotus モンキー(体重1000〜1500g、ベ
ーリングヴェルケ・アーゲー(Behringwerke AG) によっ
て飼育された雄および雌性動物)を無作為化して、4匹
ずつの2群(群D、E)に分割した。群Dの総ての4匹
の動物を、SERP領域のAA68〜184およびAA
631〜892のMS2両者とも融合タンパク質として
発現されたものの組み合わせ(融合タンパク質および投
与量当たり100μg、PBS/3M尿素に溶解したも
の)で3週間の間隔で皮下に3回免疫化した。アジュバ
ントとしては、50%Al(OH)+45%レシチン
+5%サポニンの抗原との10%混合物を用いた。感染
コントロール群(群E)における4匹の動物には、前記
の計画と同様の方法で、それぞれ抗原成分なしの溶媒+
アジュバントの1回注射を行った。
【0018】c. MS2/SERP/HRPIIハイ
ブリッドタンパク質 4匹のaotus モンキー(体重1000〜1500g、ベ
ーリングヴェルケ・アーゲー(Behringwerke AG) によっ
て飼育された雄および雌性動物)を無作為化して、2匹
ずつの2群(群F、G)に分割した。群Fの2匹の動物
を、それぞれの場合に、ハイブリッドタンパク質(PB
S/3M尿素に溶解したもの)100μgで3週間の間
隔で皮下に3回免疫化した。アジュバントとしては、ポ
リ−α−オレフィンの抗原との10%混合物を用いた。
感染コントロール群(群G)における2匹の動物には、
前記の計画と同様の方法で、それぞれ抗原成分なしのP
BS/3M尿素+アジュバントの1回注射を行った。
【0019】d. MS2/SERP/HRPIIおよ
びSERP/MSA I/HRPIIハイブリッドタン
パク質 9匹のaotus モンキー(体重1000〜1500g、ベ
ーリングヴェルケ・アーゲー(Behringwerke AG) によっ
て飼育された雄および雌性動物)を無作為化して、3匹
ずつの3群(群H、I、K)に分割した。群Hにおける
総ての3匹の動物を、それぞれの場合に、MS2/SE
RP/HRPII融合タンパク質(PBS/3M尿素に
溶解したもの)を100μgで3週間の間隔で3回皮下
に免疫化した。アジュバントとしては、ポリ−α−オレ
フィンの抗原の10%混合物を用いた。群Iにおける3
匹の動物を、同じ計画でSERP/MSA I/HRP
IIハイブリッドタンパク質を用いて免疫化した。感染
コントロール群(群K)における3匹の動物には、前記
の計画と同様の方法で、それぞれ抗原成分なしのPBS
/3M尿素+アジュバントの1回注射を行った。群A〜
Kにおける総ての動物を、最後の免疫感作から1週間後
に脾臓切除し、約1週間後に、半ビボ(ex viv
o)(P. falciparum palo alto)で寄生された赤血球5
×10(A〜G)または2×10(H〜K)の感染
負荷量を行った。
【図面の簡単な説明】
【図1】aotus モデルでの防御実験(例4)において、
個々の成分HRPII(群A)およびMSA I(群
B);コントロール=群Cでの免疫感作の結果を示す説
明図。
【図2】aotus モデルでの防御実験(例4)において、
個々の成分SERP(群D);コントロール=群Eでの
免疫感作の結果を示す説明図。
【図3】aotus モデルでの防御実験(例4)において、
MS2/SERP/HRPIIハイブリッドタンパク質
(群F);コントロール=群Gでの免疫感作の結果を示
す説明図。
【図4】aotus モデルでの防御実験(例4)において、
ハイブリッドタンパク質MS2/SERP/HRPII
(群H)およびSERP/MSA I/HRPII(群
I);コントロール=群Kでの免疫感作の結果を示す説
明図。
【図5】1)はMS2、SERPおよびHRPII(プ
ラスミドpEX SERP/HRPII)の構築物であ
って、2アミノ酸のリンカーがSERPとHRPIIと
の間に組み込まれているものを図式的に表わし、2)は
プラスミドpTC2 HRPIIを図式的に対応させて
表わす説明図。 aa=アミノ酸。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12P 21/02 C 8214−4B G01N 33/53 D 8310−2J 33/569 A 9015−2J //(C12P 21/02 C12R 1:19) (72)発明者 ブルクハルト、エンデルス ドイツ連邦共和国マールブルク、オーベレ ル、アイヒウェーク、12 (72)発明者 ハンス、キュッパー ドイツ連邦共和国マールブルク、バンコプ フシュトラーセ、12

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】SERPの少なくとも2種類のT−細胞エ
    ピトープおよびHRPIIの部分配列を有する、熱帯熱
    マラリア原虫由来のハイブリッドタンパク質。
  2. 【請求項2】SERPの領域AA630〜AA892お
    よびHRPIIの189C−末端AAを含む、請求項1
    に記載のハイブリッドタンパク質。
  3. 【請求項3】少なくとも2種類のT−細胞エピトープを
    有するMSAI部分が更に組み込まれている、請求項1
    に記載のハイブリッドタンパク質。
  4. 【請求項4】好適な発現系においてハイブリッドタンパ
    ク質をコードする配列を発現させ、生成する発現生成物
    を単離することを特徴とする、請求項1、2または3に
    記載のハイブリッドタンパク質の製造法。
  5. 【請求項5】ワクチンとしての請求項1、2または3に
    記載のハイブリッドタンパク質。
  6. 【請求項6】請求項1、2または3に記載のハイブリッ
    ドタンパク質および好適なアジュバントを含むワクチ
    ン。
JP3356233A 1990-12-24 1991-12-24 マラリア抗原hrpiiおよびserpの部分配列を含む防御的熱帯熱マラリア原虫ハイブリッドタンパク質、その製造および使用 Pending JPH06121688A (ja)

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DE4041836A DE4041836A1 (de) 1990-12-24 1990-12-24 Protektive plasmodium falciparum hybridproteine, die teilsequenzen der malaria-antigene hrpii und serp enthalten, ihre herstellung und verwendung
DE4041836.7 1990-12-24

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JPH06121688A true JPH06121688A (ja) 1994-05-06

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EP (1) EP0492500B1 (ja)
JP (1) JPH06121688A (ja)
KR (1) KR920012116A (ja)
AT (1) ATE136586T1 (ja)
AU (1) AU660437B2 (ja)
CA (1) CA2057761A1 (ja)
DE (2) DE4041836A1 (ja)
DK (1) DK0492500T3 (ja)
ES (1) ES2085947T3 (ja)
GR (1) GR3019825T3 (ja)
IE (1) IE80429B1 (ja)
PT (1) PT99923B (ja)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5928902A (en) * 1992-02-27 1999-07-27 Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) Hybrid protein between CS from plasmodium and HBsAg
US6254869B1 (en) * 1996-03-27 2001-07-03 The Regents Of The University Of California Cryptopain vaccines, antibodies, proteins, peptides, DNA and RNA for prophylaxis, treatment and diagnosis and for detection of cryptosporidium species
OA11520A (en) 1997-10-20 2004-02-09 Genzyme Transgenics Corp Novel modified MSP-1 nucleic acid sequences and methods for increasing mRNA levels and protein expression in cell systems.
BRPI0203949B8 (pt) * 2001-01-24 2021-05-25 Univ Osaka Res Found For Microbial Diseases polipeptídeo se36, processo para purificação do polipeptídeo se36, vacina para malária, agente de diagnóstico para malária e fragmento de dna sintético
WO2003074657A2 (en) * 2002-03-01 2003-09-12 Takara Bio, Inc. Cold shock inducible expression and production of heterologous polypeptides
US8556843B2 (en) * 2008-02-02 2013-10-15 AccelDx Blood purification method and apparatus for the treatment of malaria

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4859465A (en) * 1984-04-20 1989-08-22 The Regents Of The University Of California Vaccine capable of eliciting multivalent antibodies
CA1302805C (en) * 1986-05-15 1992-06-09 Thomas Alan Taylor Liquid film coating of iron-based metals
EP0254862A1 (en) * 1986-06-26 1988-02-03 BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft Vaccines against protozoan parasites
US5130416A (en) * 1986-08-13 1992-07-14 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA clone containing a genomic fragment of PfHRP-II gene from plasmodium falciparum
WO1988002757A1 (en) * 1986-10-17 1988-04-21 Saramane Pty. Ltd.; Hybrid proteins or polypeptides
US4957738A (en) * 1987-01-14 1990-09-18 Patarroyo Manuel E Protein copolymer malaria vaccine
DE3741057A1 (de) * 1987-03-18 1988-09-29 Behringwerke Ag Klonierung von malaria-spezifischen dna-sequenzen:isolierung des gens fuer das 140 kd protein
DE3737238A1 (de) * 1987-11-03 1989-05-18 Behringwerke Ag Rekombinantes histidinreiches protein (37 kd antigen) von plasmodium falciparum, seine herstellung und verwendung
DE3831351A1 (de) * 1987-12-30 1989-07-13 Behringwerke Ag Malaria-spezifische dna-sequenzen, ihre expressionsprodukte und deren verwendung
WO1990001549A2 (en) * 1988-08-12 1990-02-22 Trustees Of Dartmouth College Gene encoding protein antigens of plasmodium falciparum

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DK0492500T3 (da) 1996-08-12
EP0492500A3 (en) 1993-02-10
PT99923A (pt) 1992-12-31
EP0492500B1 (de) 1996-04-10
DE4041836A1 (de) 1992-06-25
AU660437B2 (en) 1995-06-29
GR3019825T3 (en) 1996-08-31
KR920012116A (ko) 1992-07-25
EP0492500A2 (de) 1992-07-01
ES2085947T3 (es) 1996-06-16
US5395614A (en) 1995-03-07
IE80429B1 (en) 1998-07-01
IE914551A1 (en) 1992-07-01
AU8989491A (en) 1992-06-25
ATE136586T1 (de) 1996-04-15
DE59107665D1 (de) 1996-05-15
PT99923B (pt) 1999-06-30
CA2057761A1 (en) 1992-06-25

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