JP4204607B2

JP4204607B2 - 緑膿菌のリポタンパク質ｉ

Info

Publication number: JP4204607B2
Application number: JP2006196285A
Authority: JP
Inventors: ドウヘネミヒャエル，; フォン，シュペヒトウルリッヒ，; ドムダイホルスト，
Original assignee: カイロンベーリングゲーエムベーハーアンドカンパニー
Priority date: 1988-09-01
Filing date: 2006-07-18
Publication date: 2009-01-07
Anticipated expiration: 2024-01-07
Also published as: FI894062A; JP2000152794A; CA1341020C; AU4098489A; EP0357024A3; AU625740B2; JPH02163088A; JP2005060405A; KR900004935A; PT91599A; DK431489D0; DK431489A; EP0357024A2; JP2006328077A; PT91599B; DE3829616A1; US5550223A; JP3468242B2; DE3829616C2; FI894062A0

Description

緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）は、広く分布しており、ヒトの医学分野で「厄介な微生物」とみなされている。その主な標的は、衰弱した患者で、抗生物質療法が頻繁に用いられるが、辛うじてコントロールされるのみである。特に、集中治療室の患者、対麻痺（ｐａｒａｐｌｅｇｉａ）の患者、火傷を負ったヒト、または消防夫または製鋼職工のような火傷の危険性の高い人々で、特に危険である。これら全ての場合において、能動免疫による感染防御が期待される。リポタンパク質（ＯＭＰＩ）（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＩ）は、ポリンＦ（ｐｏｒｉｎＦ（ＯＭＰＦ））のように、緑膿菌の外膜の主要成分であり、このために、同様にワクチンの成分として適している可能性がある。

本発明は、血清型６、ＡＴＣＣ３３３５４の緑膿菌からの外膜タンパク質Ｉ（ＯＭＰＩ）の遺伝子の完全な特徴付けに基づいている。それから得られたＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は表１に示された通りである。表中、アミノ酸の３文字コードを対応する塩基トリプレットの下に示し、シグナルペプチドはアミノ酸１〜１９である。

この目的のために、外膜のタンパク質を緑膿菌から得て、これから古典的な方法にてモノクローナル抗体を得た。

ゲノムＤＮＡを菌株から単離精製して、ラムダＥＭＢＬ３遺伝子バンクを既述（Ａ．−Ｍ．Ｆｒｉｓｃｈａｕｆら：Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７０（１９８３）８２７−８４２、Ｍ．Ｄｕｃｈｅｎｅら：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ１．１７０（１９８８）１５５−１６２）のようにして作出した。この遺伝子バンクをプレーティングして、得られたプラークからの材料をニトロセルロース膜に移した。緑膿菌のリポタンパク質Ｉに特異的なモノクローナル抗体を少量のリポタンパク質Ｉを発現したプラークを検出するために用いた。すなわち、抗体−抗原反応をアルカリホスファターゼとカップリングした第二抗体と適当な呈色反応とを用いることによって可視化した。リポタンパク質Ｉをコードする遺伝子は、１５ｋｂの大きさで陽性のλファージに含まれているＤＮＡ断片上に位置させて、次いで、６２６ｂｐの大きさのＴａｑＩ断片に配置させた。ＤＮＡの両鎖をＳａｎｇｅｒ（Ｓａｎｇｅｒら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４（１９７７）５４６３−５４６７）の方法によって完全に配列決定した。対応するアミノ酸配列をこのようにして得たＤＮＡ配列から推知した。成熟タンパク質のＮ末端を、成熟タンパク質が同様にシステイン残基で始まる、対応する大腸菌タンパク質と比較して推知した。このシステイン残基は、緑膿菌におけるように同じ配列集合Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ（Ｋ．ＮａｋａｍｕｒａおよびＭ．Ｉｎｏｕｙｅ：Ｃｅｌｌ１８（１９７９）１１０９−１１１７）に位置している。遺伝子の単離によって、ここで、リポタンパク質Ｉおよびこのタンパク質の免疫原性を有する部分配列をワクチンの調製に用いるに必要な量および純度で得ることが可能になる。

このように、本発明は、表１に示されたアミノ酸配列を有するリポタンパク質Ｉ（ＯＭＰＩ）、それをコードするＤＮＡ（そのタンパク質コード鎖は表に示されている）、リポタンパク質Ｉの免疫原性部分配列、リポタンパク質Ｉおよびこのタンパク質の免疫原性部分配列を用いて得られたポリクローナルおよびモノクローナル抗体ならびに対応する血清、さらにはそのような抗体または対応するヌクレオチド配列を含む診断補助物およびそれ
らの診断補助物を用いる診断方法、さらに、リポタンパク質Ｉまたは免疫原性部分タンパク質の調製のための遺伝子操作法、に関する。

さらに、本発明は、ヒトモノクローナル抗体を用いる受動免疫の道を開く。本発明は、したがって、本発明によって得られる抗原の、対応するモノクローナル抗体を生産するリンパ細胞の誘導およびそのような抗体の産生についてのリンパ細胞の試験のための、使用にも関する。

調製操作、精製、免疫および血清および抗体の獲得は、公知の方法で行うことができる。例えば、Ｍ．Ｅ．Ｇｉｌｌｅｌａｎｄら：ＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙ４４（１９８４）４９−５４、Ｒ．Ｅ．Ｗ．Ｈａｎｃｏｃｋら：Ｊ．ＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓ１４９（１９８４）２２０−２２６、Ｓ．Ｓａｗａｄａら：Ｊ．ＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓ１５０（１９８４）５７０−５７６）を参照されたい。

本発明は、以下に詳述される通りである。特に記載がない限り、パーセントは重量パーセントを表す。

例１
リポタンパク質Ｉの調製
リポタンパク質ＩをＩｎｏｕｙｅら（Ｊ．ｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１２７（１９７６）５５５−５６３）の方法に従って得る。

例２
リポタンパク質Ｉに対するモノクローナル抗体の調製
精製したリポタンパク質ＩをフロインドのアジュバントまたはＡｌ（ＯＨ）₃とともに
Ｂａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注射する。溶解した抗原を６週間後のブースターに用いる。抗体価をＥＬＩＳＡによって１週間後に決定する。免疫応答が適当でない場合には、さらなる注射を行う。１０μｇの溶解抗原を、細胞融合の３日前にマウスの静注ブースターに用いる。標準法（Ｇ．ＫｏｅｈｌｅｒおよびＣ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ：Ｎａｔｕｒｅ２５６（１９７５）４９５−４９７）を用いて脾臓細胞をＮＳ１細胞と融合させる。ＨＡＴ培地における選択の後、単一コロニーをマイクロウェルで増殖させて、それらの培養上清を、リポタンパク質Ｉに対する抗体について順次ＥＬＩＳＡで試験する。陽性のコロニーをサブクローニングする。抗体を培養上清からおよびＢａｌｂ／ｃマウスの誘導した腹水から得て、従来の生化学的方法によって精製して特徴付けを行った。

例３
リポタンパク質ＩＤＮＡの調製および特徴付け
緑膿菌からの遺伝子バンクの作出：
遺伝子バンクの作出については報告（Ｍ．Ｄｕｃｈｅｎｅら：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０（１９８８）１５５−１６２）があり、これに従って行った。リポタンパク質Ｉ配列のための遺伝子バンクのスクリーニング：
組換えファージを５００ｐｆｕ（ｐｌａｑｕｅｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔｓ、プラーク形成単位）の密度でＮＭ５３９細菌ローンにプレーティングして一晩培養した。ファージプラークをさらに３７℃で６時間培養して、それからニトロセルロース膜に移す。陽性のプラークをそれらのリポタンパク質Ｉの含有量によって同定する。すなわち、フィルターをまずモノクローナル抗体６Ａ４とともにインキュベートして、次いで、陽性の抗体−抗原反応を第二の抗体およびアルカリホスファターゼによる酵素呈色反応を用いて同定する。

リポタンパク質Ｉ遺伝子およびそれに隣接する領域の配列分析：
単離したファージの一つを大量培養（１リットル）して、ＤＮＡをそれから調製した（Ｍａｎｉａｔｉｓら：ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、ＣｏｌｄｓｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９８２）。後者を制限酵素ＳａｌＩで切断して、得られる制限断片をショットガン法にてｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒら：Ｇｅｎｅ２（１９７７）９５−１１３）に、次いでｐＵＣ１９（Ｖａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら：Ｇｅｎｅ３３（１９８５）１０３−１１９）にサブクローニングする。この場合、形質転換された大腸菌細胞中で、陽性の形質転換体が抗体反応によって認識されるほど充分な量のリポタンパク質Ｉ（ＯＭＰＩ）が同様に発現される。タンパク質を発現する最小のサブクローンは、クローンｐＩＴａｑである。プラスミドＤＮＡをこのクローンから単離して、ＥｘｏIIIおよびＥｘｏＶIIで消化（Ｖａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら：上記を
参照されたい）の後、ＣｈｅｎおよびＳｅｅｂｕｒｇ（ＤＮＡ４（１９８５）１６５−１７０）の方法で配列決定する。クローンは６２６ｂｐの大きさでリポタンパク質Ｉ（ＯＭＰＩ）をコードする完全な配列を含むＴａｑＩ挿入物を有している。この配列は、表１に示される通りである。

例４
リポタンパク質Ｉの発現：
リポタンパク質遺伝子の緑膿菌における転写を導くプロモーターは大腸菌のコンセンサスプロモーターときわめて似ていることから、タンパク質は、今日までに研究されたリポタンパク質Ｉ転写単位の完全な配列を含む全てのプラスミドで発現される。

リポタンパク質Ｉは、プラスミドｐＩＴａｑで形質転換された大腸菌の培養から上記したＩｎｏｕｙｅらの方法によってそれを単離して得られる。

例５
抗血清の調製：
アレルギー、糖尿病、免疫不全症、貧血または皮膚病の病歴を持たない健康成人を、異質組織で（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｌｙ）発現させたリポタンパク質Ｉ、またはその部分配列物、で免疫する。接種は、第１日目、８日目および１５日目に行う。最後の接種から３週間の後に、ボランティア被験者から採血して、Ｂ型肝炎表面抗原およびＨＩＶ抗原について試験した。陰性反応を示す供与血漿のみをプールして、管理された無菌条件下で分画して包装する。
（表１）
緑膿菌からのリポタンパク質Ｉの配列
コード領域は３文字コードでアミノ酸残基が示されている。シグナルペプチドはアミノ酸１〜１９である。

1 20 40
ATG AAC AAC GTT CTG AAA TTC TCT GCT CTG GCT CTG GCT GCT GTT
Met Asn Asn Val Leu Lys Phe Ser Ala Leu Ala Leu Ala Ala Val
60 80
CTG GCC ACC GGT TGC AGC AGC CAC TCC AAA GAA ACC GAA GCT CGT
Leu Ala Thr Gly Cys Ser Ser His Ser Lys Glu Thr G1u Ala Arg
100 120
CTG ACC GCT ACC GAA GAC GCA GCT GCT CGT GCT CAG GCT CGC GCT
Leu Thr Ala Thr Glu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Gln Ala Arg Ala
140 160 180
GAC GAA GCC TAT CGC AAG GCT GAC GAA GCT CTG GGC GCT GCT CAG
Asp Glu Ala Tyr Arg Lys Ala Asp Glu Ala Leu Gly Ala Ala Gln
200 220
AAA GCT CAG CAG ACC GCT GAC GAG GCT AAC GAG CGT GCC CTG CGC
Lys Ala Gln Gln Thr Ala Asp Glu Ala Asn Glu Arg Ala Leu Arg
240
ATG CTG GAA AAA GCC AGC CGC AAG TAA TAG
Met Leu Glu Lys Ala Ser Arg Lys * *

Claims

緑膿菌の外膜タンパク質（リポタンパク質）Ｉの調製のための方法であって、該方法は、
以下
ATG AAC AAC GTT CTG AAA TTC TCT GCT CTG GCT CTG GCT GCT GTT
CTG GCC ACC GGT TGC AGC AGC CAC TCC AAA GAA ACC GAA GCT CGT
CTG ACC GCT ACC GAA GAC GCA GCT GCT CGT GCT CAG GCT CGC GCT
GAC GAA GCC TAT CGC AAG GCT GAC GAA GCT CTG GGC GCT GCT CAG
AAA GCT CAG CAG ACC GCT GAC GAG GCT AAC GAG CGT GCC CTG CGC
ATG CTG GAA AAA GCC AGC CGC AAG TAA TAG
に示す核酸配列の全部を、原核生物細胞または真核生物細胞において発現を生じさせる工程を包含する、
方法。
緑膿菌を検出するための組成物であって、該組成物は、
（ａ）以下：
ATG AAC AAC GTT CTG AAA TTC TCT GCT CTG GCT CTG GCT GCT GTT
CTG GCC ACC GGT TGC AGC AGC CAC TCC AAA GAA ACC GAA GCT CGT
CTG ACC GCT ACC GAA GAC GCA GCT GCT CGT GCT CAG GCT CGC GCT
GAC GAA GCC TAT CGC AAG GCT GAC GAA GCT CTG GGC GCT GCT CAG
AAA GCT CAG CAG ACC GCT GAC GAG GCT AAC GAG CGT GCC CTG CGC
ATG CTG GAA AAAGCC AGC CGC AAG TAA TAG
のヌクレオチド配列からなる核酸を含む、組成物。