JP2001516566A - 遺伝子ワクチンのための弱毒化vifDNA免疫化カセット - Google Patents
遺伝子ワクチンのための弱毒化vifDNA免疫化カセットInfo
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Abstract
Description
種の権利を持っている。 技術分野 本発明は病原性遺伝子のための遺伝子ワクチンとしての弱毒化、非機能性HI
V vif免疫化カセットの製造および使用に関している。 背景技術 ワクチン接種および免疫化とは一般的に、個体の免疫系に免疫応答を起こすこ
とができ、病原体の攻撃に対しての防御に利用できるであろう非毒性作用剤の導
入を意味している。免疫系は主として個体中に通常は存在しないタンパク質およ
び他の大きな分子を同定することにより侵襲している”外来”組成物および作用
剤を同定する。外来タンパク質とは、それに対して免疫応答が起こる標的を意味
している。
る。これらの手段には抗原認識および除去に関与する体液性および細胞性応答が
含まれる。手短に言えば、体液性応答には、抗原へ特異的に結合する抗体を産生
するB細胞が関係している。細胞性免疫応答には二つの武器がある。第一は、サ
イトカインを産生して免疫応答への別の免疫細胞の関与を惹起するヘルパーT細
胞が関係している。第二は、抗原を認識でき、および抗原(抗原が結合されてい
る細胞または粒子を含んで)を攻撃できる、細胞毒性Tリンパ球(CTL)とし
ても知られているキラーT細胞が関係している。
してきた。ウイルス、細菌および感染性真核生物体のような感染性病原性作用因
子に対して個体を免疫化するための安全で有効なワクチンの研究において、今ま
でいくつかの戦略が用いられてきた。各々の戦略は、免疫応答を惹起できる、病
原体に関連する標的タンパク質を個体に投与することにより、病原体感染に対し
て個体を保護する目的を達成することをめざしている。従って、個体が感染性病
原体で攻撃された場合、個体の免疫系は該タンパク質を認識でき、感染に対する
有効な防御を準備できる。病原性タンパク質を提供するいくつかのワクチン戦略
が存在し、それには非感染性またはより低い感染性作用剤の一部として、または
非顕在性タンパク質組成物としてタンパク質を提供することが含まれる。
使用して、個体の免疫系に病原性タンパク質を存在させる。そのようなワクチン
においては、病原体は例えば、加熱または化学物質の様な手段を用いて殺されて
いるかまたはさもなくば不活性化されている。個体内への殺されたまたは不活性
化された病原体の投与は、非感染性型で個体の免疫系へ病原体を存在させ、それ
により個体はそれに対する免疫応答を準備できる。殺されたまたは不活性化され
た病原体ワクチンは、病原体免疫原に対するTヘルパーおよび体液性免疫応答を
直接的に発生させることにより保護を行う。病原体は殺されているかさもなくば
不活性化されているため、感染の恐れはほとんどない。
ある。弱毒化ワクチンは本質的には弱められた感染性を示す生きているワクチン
である。弱毒化ワクチンはその子孫がもはや有害でなくなるまで許容宿主で病原
体をいくつかの世代にわたって経過させることによりしばしば製造される。弱毒
化ワクチンを用いると、限られた感染性を示す作用因子が病原体に対する免疫応
答を惹起するのに用いられるであろう。あるレベルの感染性を維持することによ
り、弱毒化ワクチンは低レベルの感染を引き起こし、死菌または不活性化ワクチ
ンよりも強い免疫応答を惹起することができる。例えば、ポリオウイルスおよび
痘瘡ワクチンのような生きている弱毒化ワクチンは、宿主の非病原性的感染の間
に保護的Tヘルパー、T細胞毒性および体液性免疫性を刺激する。
えワクチンには二つの型がある:一つは生じる作用因子を無毒にするために特定
の遺伝子が欠損されている病原体である。本質的には、この型の組換えワクチン
は設計により弱毒化されており、活性で無毒な感染性作用因子の投与を必要とし
、それは宿主中で確立されると免疫応答を惹起するために使用される抗原を産生
するようになる。組換えワクチンの第二の型は、標的抗原をコードする遺伝子材
料が挿入されている感染性非毒性ベクターを用いている。この型の組換えワクチ
ンは同様に活性で無毒な感染性作用因子の投与を必要とし、それは宿主中で確立
されると免疫応答を惹起するために使用される抗原を産生するようになる。その
ようなワクチンは本質的に感染性で無毒な作用因子を用いて病原体抗原を提供し
、それはその後、抗病原体免疫応答のための標的として働くことができる。例え
ば、ワクチン接種のための発現系としてのワクチン開発は、より広いT細胞免疫
応答を持つ感染性ワクチン接種戦略の安全性および開発を理論的に単純化した。
ットワクチンは一般的に病原体に由来する一つまたはそれ以上の単離されたタン
パク質から成っている。これらのタンパク質は個体により免疫応答が準備される
であろう標的抗原として作用する。病原体により個体が感染された場合、個体免
疫系が病原体を認識しおよびそれに対する防御を準備するように、サブユニット
ワクチンのために選択されたタンパク質は病原体により呈示される。サブユニッ
トワクチンは全感染作用因子ではないので、感染性になることはできない。従っ
て、それらは他の型のワクチンに付随する望ましくない有害な感染性の危険を持
っていない。肝炎B表面抗原ワクチン(HBsAg)のような組換えサブユニッ
トワクチンは単一の抗原に対してより特異的な保護的Tヘルパーおよび体液性免
疫応答を刺激することが報告されている。しかしながら、多様な病原体に対する
広範囲の保護を刺激するためのこの技術の使用は確認されなければならない。
含むいくつかの因子のため複雑化されている。最近、これらの相互作用における
免疫成分を理解するための新規の道具が遺伝子免疫化またはDNAワクチン接種
の形で利用可能になってきた。Tang,ef al.Nature,1992
,356,152;Fynan,et al.,Proc.Natl.Acad
.Sci.USA,1993,90,11478;Ulmer,et al.,
Science,1993,259,1745;およびWang,et al,
Proc.Natl.Acad Sci.USA,1993,90,4156。
この方法の能力はHIV−1の構造的および酵素的遺伝子産物に対する広範囲な
免疫応答を産生することにより示されており、HIV−1のための可能な予防的
ワクチン開発のための方法が概説されている。この方法はgag/pol/re
vならびにenv/revをコードしている多遺伝子発現カセットおよび遺伝子
およびアクセサリー遺伝子免疫原を利用している。研究は齧歯類および霊長類で
はHIV−1構造およびエンベロープ遺伝子によりうまく免疫化できることを示
している。Wang,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.
USA,1993,90,4156およびWang,et al.,DNA C
ell Biol.,1993,12,799。種々の病原体に対するDNA免
疫原を使用するために広範囲に応用できる病原性遺伝子からの免疫原発現カセッ
ト構築のための遺伝子的戦略が必要とされている。
よび酵素的機能を持つタンパク質をコードしている。調節遺伝子tatおよびr
ev、および補助遺伝子nef、vif、vpr、vpuおよびvpxはHIV
およびSIVを含む多くのレンチウイルスでよく保存されている。これらの遺伝
子がよく保存されていることは、これらのタンパク質産物がインビボにおけるウ
イルス発病の中心的役割を果たしていることを暗示している。最初のインビトロ
実験はtatおよびrevはウイルス複製に必須であるが、一方、補助遺伝子は
必須ではないと考えられたことを示しているようである。Cullen,et
al.,Cell,1989,58,423およびDesrosiers,AI
DS Res.Human Retroviruses,1992,8,411
。しかしながら、さらなる分析により補助遺伝子内の欠陥はインビトロ(Gab udza,et al.,J.Virol.,1992,66,6489および
Gibbs,et al.,AIDS Res.Human Retrovir
uses,1994,10,343)およびインビボ(Aldrovandi,
et al.,J.Virol,1996,70,1505)におけるウイルス
複製の高度の障害または遅延を生じさせることを明らかにした。負の欠陥補助遺
伝子がインビトロで報告されており、有効な宿主免疫応答の最終生成物であるよ
うである。それ故、補助遺伝子は現在の所、ウイルス毒性の決定基であると考え
られている。Trono,Cell,1995,82,189。それらは二三の
”ホットスポット”を含んでおり、および”逸脱”ウイルス変異体の生成を導く
突然変異に対する感受性が多分低いので、ウイルス生活環における重要性が強調
されている。加えて、これらの遺伝子のタンパク質産物はインビボで免疫原性で
ある。群として、それらは可能な抗ウイルス免疫標的の20パーセントである。
Ameisen,et al.,Int.Conf:AIDS,1989,5,
533およびLamharnedi−Cherradi,et al.,AID
S,1992,6,1249。それらの免疫原性および低い機能的変異原性を合
わせると、補助遺伝子は将来の抗ウイルス免疫治療の設計における魅力的な要素
である。しかしながら、ウイルス毒性決定基としての補助遺伝子タンパク質産物
の役割のため、補助遺伝子免疫原の生成はウイルスワクチン設計に特異的免疫学
的および病理学的複雑化を生じさせる。有力なアクセサリー遺伝子に基づいた遺
伝子ワクチンは、ウイルス複製を促進させることなく天然のウイルス補助遺伝子
産物に対する宿主免疫応答に受け入れ可能である必要がある。従って、主たるゴ
ールは、多成分遺伝子免疫原の一部としてvif(ビリオン感染性因子)補助遺
伝子を含む、安全で有効な遺伝子抗HIVワクチンを設計することである。
Da後期ウイルスタンパク質(vif)をコードしている。Arya,et a
l.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1986,83,22
09;Garrett,et al.,J.Virol.,1991,65,1
653;Schwartz,et al.,Virol.,1991,183,
677;およびSodroski,et al.,Science,1986,
231,1549。vifは単離されたHIV−1間で高度に保存されており、
ネコ免疫不全ウイルス(FIV)、ウシ免疫不全ウイルス(BIV)、ビスナウ
イルス、HIV−2およびSIVのような他のレンチウイルスにも存在している
。Myers,ef al.,Human Retrovir.AIDS,19
91およびShackett,et al.,Virol.,1994,204
,860。インビボvif遺伝子変異の初期の分析は、ほとんどのvif配列は
無傷の読み枠であり、無傷のvifの存在は疾病状態とは相関しないことを示し
た。Sova,et al.,J.Virol.,1995,69,2557お
よびWieland,et al.,Virol.,1994,203,43。
しかしながら、HIV−1感染長期経過者からのvif、vpr、vpu、ta
tおよびrev遺伝子を含んでいる領域の配列分析はクローンの64%における
不活性化突然変異の存在を明らかにした。Michael,et al.,J.
Virol,1995,69,4228。HIV−1感染患者は組換えvifタ
ンパク質を認識する抗体を持っていることが示されており(Kan,et al
.,Science,1986,231,1553;Schwander,et
al.,J.Med.Virol.,1992,36,142;およびWie
land,et al.,AlDS Res.Human Retrovir.
,1991,7,861)、該タンパク質が発現され、天然の感染の間に免疫原
性であることを示唆している(Volsky,et al.,Curr.Top
ics Micro.Immunol.,1995,193,157)。
菌または寄生虫成分から誘導されたワクチンの製造に利用されている設計と類似
の弱毒化遺伝子ワクチン設計が本発明で用いられた。HIV−1感染患者に由来
するvif遺伝子中に潜在的に存在する配列変異および免疫原性が分析された。
プロトタイプ遺伝子変異が選択され、体液性および細胞性免疫応答を誘導するク
ローンの能力が動物で研究された。選択されたvif遺伝子変異はまた、vif
欠損HIV−1クローンで感染された細胞を利用するトランス相補性アッセイに
より機能的に特徴付けられた。弱毒化、非機能性vifクローンは天然の病原体
を破壊できる免疫応答を誘導することが示される。 発明の要約 本発明は精製され、弱毒化された非機能性vifタンパク質に関している。
番号:7、配列ID番号:8、配列ID番号:9、配列ID番号:10、配列I
D番号:11、配列ID番号:12、配列ID番号:13、配列ID番号:14
、配列ID番号:15、配列ID番号:16、配列ID番号:17、配列ID番
号:18、配列ID番号:19、配列ID番号:20,配列ID番号:21、配
列ID番号:22および配列ID番号:23から成る群より選択されるアミノ酸
配列を含むvifタンパク質に関している。
ド配列を含んでいる単離された核酸分子に関している。 本発明は配列ID番号:4、配列ID番号:5、配列ID番号:6、配列ID
番号:7、配列ID番号:8、配列ID番号:9、配列ID番号:10、配列I
D番号:11、配列ID番号:12、配列ID番号:13、配列ID番号:14
、配列ID番号:15、配列ID番号:16、配列ID番号:17、配列ID番
号:18、配列ID番号:19、配列ID番号:20,配列ID番号:21、配
列ID番号:22および配列ID番号:23から成る群より選択されるアミノ酸
配列を含むvifタンパク質をコードしている核酸分子に関している。
列ID番号:30、配列ID番号:31、配列ID番号:32、配列ID番号:
33、配列ID番号:34、配列ID番号:35、配列ID番号:36、配列I
D番号:37、配列ID番号:38、配列ID番号:39、配列ID番号:40
、配列ID番号:41、配列ID番号:42、配列ID番号:43,配列ID番
号:44、配列ID番号:45および配列ID番号:46から成る群より選択さ
れるヌクレオチド配列を含むvifタンパク質をコードしている核酸分子に関し
ている。
vifタンパク質をコードしている核酸分子を含んでいる医薬組成物に関してい
る。
ド配列を含んでいる核酸分子を含む組換え発現ベクターに関している。 本発明は弱毒化された非機能性vifタンパク質をコードしている核酸分子を
含んでいる組換え発現ベクターを含む宿主細胞に関している。
関している。 本発明は哺乳類に弱毒化された非機能性vifタンパク質をコードしているヌ
クレオチド配列を含む核酸分子を該哺乳類の細胞に投与することをから成る、ウ
イルスに対して哺乳類を免疫化する方法に関しており、ここで該核酸分子は該細
胞中で発現される。 発明の詳細な説明 AIDS研究の一つの主要なゴールはHIV−1ウイルスに対するワクチンを
開発することである。有効なワクチンは強い体液性応答に加えて、有効で広範囲
のCTL応答を惹起しなければならない。このことはHIV−1ウイルスの遺伝
子異質性のため面倒なことである。HIV−1逆転写酵素(RT)は間違いを起
こしがちであり、および校正する能力が欠如しており、ゲノム当たり、サイクル
当たりで10-4の突然変異率を示している。Dougherty,et al.
,J.Virol.,62,2817。HIV−1ゲノム配列変異が、異なった
個体から単離されたウイルス並びに異なった時間点で単一の個体から単離された
ウイルスで観察されている。Fisher,et al.,Nature,19
88,334,444およびMeyerhans,et al.,Cell,1
989,58,901。多数の配列分析データに基づくと、中和抗体および/ま
たはCTLエピトープを変化させることにより患者における逸脱変異体ウイルス
を導く突然変異の主たる標的は構造遺伝子env、gagおよびpolであるこ
とは明らかである。Pircher,et al.,Nature,1990,
346,629;Reitz,et al.,Cell,1988,54,57
;およびWolfs,et al.,Virol.,1991,185,195
。このことにもかかわらず、初期の実験はHIV−1の構造および酵素遺伝子は
異なった動物モデルにおける核酸に基づいたワクチンとして成功裡に使用できる
ことを示しており(Wang,et al.,Proc.Natl.Acad.
Sci.USA,1993,90,4156;およびWang,et al.,
,AIDS,1995,9(Suppl A),S159)、DNAワクチンの
ための予防的並びに治療的研究が開始された。本発明は免疫原カセットとしての
vif(HIV−1補助遺伝子)の開発に関している。他のHIV−1遺伝子と
併せて使用した場合、すべてのウイルス成分に対する広範囲な免疫応答が誘導さ
れ、生きている弱毒化ワクチンにより誘導される免疫応答の多くの様相を模倣し
ている。
相関して、マウスにおけるvif特異的体液性および細胞性免疫応答の誘導が観
察されている。類似の結果がT細胞およびCTLアッセイで観察されており、v
if遺伝子はインビボにおいて免疫原性であることを示している。vifは可溶
性および膜結合形の両方で存在することが知られている。Goncalves,
et al.,J.Virol.,1994,68,704。抗vif抗体およ
びvif特異的CTL応答がHIV−1陽性患者で示されているが、免疫系への
vifの提示に関与するエピトープは未だに決定されていない。Lamhame
di−Cherradi,et al.,AIDS,1992,6,1249。
これらの研究ではどのようにしてvifが体液性免疫系に暴露されるようになる
のかは不明瞭である。本発明のクローンにおいて観察された異なった免疫応答は
、T−35、N−15およびpCVifでの突然変異は抗体/CTL応答の変化
に関連するであろうことを示唆している。すべてのTまたはN誘導クローンに存
在する点突然変異のいくつかは、これらの突然変異が観察された相補性および/
または免疫応答の相違に関係することを示していることに注目するのは重要であ
る。vifのさらなる突然変異分析は相補性に関連する領域の答えを解明するこ
とを助けている。vif活性の提案された部位にはウイルスDNA合成、gp1
20合成および輸送およびgagプロセッシングが含まれている。Borman
,et al.,J.Virol.,1995,69,2058;Sakai,
et al.,J.Virol.,1993,67,1663;およびVon
Schwedler,et al.,J.Virol.,1993,67,49
45。vif欠損HIV−1プロウイルスおよび野生型HIV−1vif発現細
胞株のトランス相補性実験は、vifがウイルス複製/成熟の後期段階で作用し
ていることおよびvifトランス相補性がHIV−1株を通して起こっているこ
とを示している。Blanc,et al.,Virol.,1993,l93
,186およびHevey,et al.,Virus Res.,1994,
33,269。初期の実験は非伝播患者(NI)からの血清はエンベロープタン
パク質および非複製ウイルスに対する高い抗体力価を含んでいるが、一方、伝播
患者(TI)からの血清はエンベロープタンパク質および高度に複製しているウ
イルスに対して非常に低い抗体力価を含んでいることを示している。Velpa
ndi,et al.,DNA Cell Biol.,1996,15,57
1。これらの結果は本発明で観察されたトランス相補性の結果と相関している。
ド配列を含んでいる単離された核酸分子に関している。本明細書で使用される場
合、用語”弱毒化された非機能性vifタンパク質”とは野生型vifと比較し
てビリオン感染機能がないかまたは弱められているvifタンパク質を示してい
ることを意味している。本発明のいくつかの実施態様において、核酸分子は弱毒
化された非機能性vifタンパク質をコードしており、ここでヌクレオチド配列
は欠失、付加、点突然変異、多置換またはより短いタンパク質にするための停止
コドンの導入を含んでいる。本発明の好適な態様において、本発明の単離された
核酸分子は配列ID番号:4、配列ID番号:5、配列ID番号:6、配列ID
番号:7、配列ID番号:8、配列ID番号:9、配列ID番号:10、配列I
D番号:11、配列ID番号:12、配列ID番号:13、配列ID番号:14
、配列ID番号:15、配列ID番号:16、配列ID番号:17、配列ID番
号:18、配列ID番号:19、配列ID番号:20,配列ID番号:21、配
列ID番号:22および配列ID番号:23から成る群より選択されるアミノ酸
配列を含むvifタンパク質をコードしている。本発明の別の好適な態様におい
て、単離された核酸分子はvifタンパク質をコードしており、配列ID番号:
27、配列ID番号:28、配列ID番号:29、配列ID番号:30、配列I
D番号:31、配列ID番号:32、配列ID番号:33、配列ID番号:34
、配列ID番号:35、配列ID番号:36、配列ID番号:37、配列ID番
号:38、配列ID番号:39、配列ID番号:40、配列ID番号:41、配
列ID番号:42、配列ID番号:43,配列ID番号:44、配列ID番号:
45および配列ID番号:46から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含
んでいる。
患者から得られるであろう。もしくは、本発明の核酸分子は野生型vifヌクレ
オチド配列を使用して調製されるであろう。vif発現プラスミドpCVifは
、Nagashunmugam,et al.,DNA Cell Biol.
,1996,15,353(本明細書において援用される)に記載されているよ
うな主鎖プラスミドpRc/CMV(Invitrogen,San Dieg
o,CA)内のサイトメガロウイルス(CMV)即時早期プロモーターの調節下
にあるよく特徴付けられたHIV−1分子クローンからのvif遺伝子、pHX
B2、を含んでいる。この核酸分子は弱毒化された非機能性vifタンパク質を
コードしている追加の核酸分子を製造するために使用されるであろう。
毒化された非機能性vifタンパク質をコードしている核酸分子が製造される。
例えば、オリゴヌクレオチド仲介突然変異誘発は通常、その配列が既知であるD
NAセグメント中の付加、欠失または置換に使用される。そのような方法は、例
えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning
a Laboratory Manual,第二版,Cold Spring
Harbor Press(1989),ページ15.51から15.73(
本明細書において援用される)から知ることができる。手短に言えば、オリゴヌ
クレオチド仲介突然変異誘発のためのプロトコールは以下の工程を含んでいる:
1)バクテリオファージM13ベクター内への、cPVif発現プラスミドから
のvifヌクレオチド配列のような適当なDNA断片のクローニング;2)組換
えバクテリオファージM13からの一本鎖DNAの調製;3)突然変異誘発オリ
ゴヌクレオチドの設計および合成;4)標的DNAへの突然変異誘発オリゴヌク
レオチドのハイブリダイゼーション:5)DNAポリメラーゼによるハイブリダ
イズしたオリゴヌクレオチドの伸張;6)感受性細菌のトランスフェクション;
7)所望の突然変異を運んでいるバクテリオファージプラークのスクリーニング
;8)突然変異した組換えバクテリオファージからの一本鎖DNAの調製;9)
突然変異した組換えバクテリオファージM13DNAが所望の突然変異を運んで
おり、他の突然変異を持っていないことを配列決定により確認;10)組換えバ
クテリオファージM13からの二本鎖複製可能形からの突然変異したDNA断片
の回収;および11)突然変異した断片と所望の発現ベクター中の野生型DNA
の対応するセグメントの置換。
異誘発オリゴヌクレオチドの設計および合成は例えば、Sambrook et
al.,Molecular Cloning a Laboratory
Manual,第二版,Cold Spring Harbor Press(
1989),ページ15.54から15.56(本明細書において援用される)
に詳述されている。例えば、野生型vifヌクレオチド配列内で一つのヌクレオ
チドを置換、付加または欠失させるには、中央にまたは中央のすぐ3’側の二つ
のヌクレオチド位の一つに不適正を持つ約17−19ヌクレオチド長のオリゴヌ
クレオチドが製造される。野生型vifヌクレオチド配列内で二つまたはそれ以
上の連続したヌクレオチドを置換、付加または欠失させるには、25またはそれ
以上のヌクレオチド長を持つオリゴヌクレオチドが製造される。これらのオリゴ
ヌクレオチドは、付加されたまたは置換されたヌクレオチドを含んでいる中心ル
ープ外領域の両側に約12から15の完全一致ヌクレオチドを含んでいるか、ま
たはループ外である野生型DNAの一部を意味している。上記のような方法を用
い、当業者は弱毒化された非機能性vifタンパク質をコードし、欠失、付加、
置換または未熟な停止コドンを持っている核酸分子を製造できる。オリゴヌクレ
オチド仲介突然変異誘発法は当業者には広く知られている。
製造できる。当業者は、遺伝子コードは縮重されているので同一のタンパク質を
コードしている多数のDNA配列が製造できることを容易に理解しているであろ
う。加えて、当業者はアミノ酸は保存的置換ができるように他のアミノ酸に置換
できることを容易に理解しているであろう。従って、当業者は弱毒化された非機
能性vifタンパク質をコードしている本発明の核酸分子を製造できる。
分子は表1のアミノ酸(a.a)およびヌクレオチド配列(n.t.)(特定の
配列ID番号により示されている)を持っている。特別のアミノ酸配列は図1お
よび図7A−7Fに示されている。特別のヌクレオチド配列は図8A−8Eに示
されている。
オチド配列を含むベクターまたは組換え発現ベクターにも関している。本明細書
で使用される場合、”組換え発現ベクター”とは、適当な宿主に導入された場合
、弱毒化された非機能性vifタンパク質をコードしているコード配列の発現を
指示するのに必要な遺伝子要素を含んでいる。本発明のいくつかの態様において
、ベクターまたは組換え発現ベクターは弱毒化された非機能性vifタンパク質
をコードしており、ここでヌクレオチド配列は欠失、付加、点突然変異、多置換
またはより短いタンパク質にするための停止コドンの導入を含んでいる。本発明
の好適な態様において、本発明のベクターまたは組換え発現ベクターは、配列I
D番号:4、配列ID番号:5、配列ID番号:6、配列ID番号:7、配列I
D番号:8、配列ID番号:9、配列ID番号:10、配列ID番号:11、配
列ID番号:12、配列ID番号:13、配列ID番号:14、配列ID番号:
15、配列ID番号:16、配列ID番号:17、配列ID番号:18、配列I
D番号:19、配列ID番号:20,配列ID番号:21、配列ID番号:22
および配列ID番号:23から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むvif
タンパク質をコードしている。本発明の別の好適な態様において、本発明のベク
ターまたは組換え発現ベクターは、配列ID番号:27、配列ID番号:28、
配列ID番号:29、配列ID番号:30、配列ID番号:31、配列ID番号
:32、配列ID番号:33、配列ID番号:34、配列ID番号:35、配列
ID番号:36、配列ID番号:37、配列ID番号:38、配列ID番号:3
9、配列ID番号:40、配列ID番号:41、配列ID番号:42、配列ID
番号:43,配列ID番号:44、配列ID番号:45および配列ID番号:4
6から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含むvifタンパク質をコード
している核酸分子を含んでいる。
機能性vifタンパク質をコードしている核酸分子を単離でき、発現ベクター内
へ挿入できる。コード配列は必要な調節配列へ作動可能なように連結される。発
現ベクターはよく知られており容易に入手可能である。発現ベクターの例にはプ
ラスミド、ファージ、ウイルスベクターおよび他の核酸分子または宿主細胞を形
質転換し、コード配列の発現を容易にするために有用な媒介体を含んでいる核酸
分子が含まれる。本発明の組換え発現ベクターは弱毒化された非機能性vifタ
ンパク質を発現する宿主を形質転換するために有用である。
オチド配列を含む組換え発現ベクターを含んでいる宿主細胞にも関している。本
発明のいくつかの態様において、宿主細胞は弱毒化された非機能性vifタンパ
ク質をコードしているベクターまたは組換え発現ベクターを含んでおり、ここで
ヌクレオチド配列は欠失、付加、点突然変異、多置換またはより短いタンパク質
にするための停止コドンの導入を含んでいる。本発明の好適な態様において、宿
主細胞は配列ID番号:4、配列ID番号:5、配列ID番号:6、配列ID番
号:7、配列ID番号:8、配列ID番号:9、配列ID番号:10、配列ID
番号:11、配列ID番号:12、配列ID番号:13、配列ID番号:14、
配列ID番号:15、配列ID番号:16、配列ID番号:17、配列ID番号
:18、配列ID番号:19、配列ID番号:20,配列ID番号:21、配列
ID番号:22および配列ID番号:23から成る群より選択されるアミノ酸配
列を含んでいるvifタンパク質をコードしているベクターまたは組換え発現ベ
クターを含んでいる。本発明の別の好適な態様において、該宿主細胞は配列ID
番号:27、配列ID番号:28、配列ID番号:29、配列ID番号:30、
配列ID番号:31、配列ID番号:32、配列ID番号:33、配列ID番号
:34、配列ID番号:35、配列ID番号:36、配列ID番号:37、配列
ID番号:38、配列ID番号:39、配列ID番号:40、配列ID番号:4
1、配列ID番号:42、配列ID番号:43,配列ID番号:44、配列ID
番号:45および配列ID番号:46から成る群より選択されるヌクレオチド配
列を含むベクターを含んでいる。タンパク質生産のために既知の組換え発現系で
使用する宿主細胞はよく知られており、容易に入手可能である。
ドモナスもまた有用である。原核生物系に適した調節配列はlacプロモーター
、trpプロモーター、tacプロモーターのようなハイブリッドプロモーター
、ラムダファージP1プロモーターを含む構成性および誘導可能プロモーターの
両方が含まれる。一般に、異種タンパク質は融合または成熟タンパク質としてこ
れらの宿主中で産生されるであろう。所望の配列が成熟タンパク質として産生さ
れた場合、産生された配列にはメチオニンが前に付いているであろうが、それは
取り除く必要はない。従って、本明細書で請求されるペプチドおよびタンパク質
は細菌中で製造された場合、N−末端Metが先立っているであろう。さらに、
タンパク質の分泌を生じさせる作動可能なシグナルペプチドがペプチドのコード
配列に先立っている構築物が作製されるであろう。この様式で原核生物宿主にお
いて産生される場合、シグナル配列は分泌により除去される。原核生物宿主細胞
には大腸菌のような細菌細胞およびS.セレビジエのような酵母細胞が含まれる
。
ある。細菌におけるように、真核生物宿主は所望のタンパク質を産生する発現系
で直接的に形質転換されるが、より普通にタンパク質の分泌を達成するためにシ
グナル配列が提供される。真核生物系は、より高等な生物体のタンパク質をコー
ドしているゲノム配列中に見いだされるであろうイントロンを処理することがで
きるという更なる利点を持っている。真核生物系はまた、例えば、グリコシル化
、カルボキシ末端アミド化、ある種のアミノ酸残基の酸化または誘導体化、コン
ホメーション調節などを生じる種々のプロセッシング機構も提供する。通常使用
される真核生物系には酵母、真菌細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞、鳥類細胞および
高等植物の細胞が含まれるが、これらに制限されるわけではない。本発明の好適
な態様において、S.フルギペルダのような昆虫細胞、非ヒト哺乳類組織培養細
胞チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、およびヒーラー細胞のようなヒ
ト組織培養細胞が宿主細胞として使用される。適したプロモーターは入手可能で
あり、それらは宿主型の各々ならびに終止配列およびエンハンサーと一致してお
りおよび作動可能である、例えば、バキュウロウイルスポリへドロンプロモータ
ー。前記のように、プロモーターは構成的でも誘導可能でもよい。例えば哺乳類
系において、マウスメタロチオネインプロモーターは重金属イオンの添加により
誘導できる。
知られた発現系で使用するため、市販品として入手可能な発現ベクター内へDN
A分子を挿入することができる。例えば、市販品として入手可能なプラスミドp
SE420(Invitrogen,San Diego,CA)が大腸菌にお
ける弱毒化された非機能性vifタンパク質の生産に使用される。例えば、市販
品として入手可能なプラスミドpYES2(Invitrogen,San D
iego,CA)は酵母のS.セレビジエ株においての生産に使用される。例え
ば、市販品として入手可能なMAXBACTM完全バキュウロウイルス発現系(I
nvitrogen,San Diego,CA)は昆虫細胞においての生産に
使用される。例えば、市販品として入手可能なpcDNA IまたはpcDNA
3(Invitrogen,San Diego,CA)はチャイニーズハムス
ター卵巣細胞のような哺乳類細胞においての生産に使用される。当業者はルーチ
ン技術および容易に入手可能な出発材料を用い、弱毒化された非機能性vifタ
ンパク質を生産するためにこれらの市販の発現ベクターおよび系またはその他を
使用できる。例えば、Sambrook et al.,Molecular
Cloning a Laboratory Manual,第二版,Cold
Spring Harbor Press(1989)(本明細書において援
用される)を参照されたい。
し、よく知られた方法および容易に入手可能な出発材料を使用してベクターを製
造してもよい。プロモーターおよびポリアデニル化シグナル、および好適にはエ
ンハンサーのような必須の調節配列を含んでいる発現系は容易に入手可能であり
、種々の宿主について本分野では知られている。例えば、Sambrook e
t al.,Molecular Cloning a Laboratory
Manual,第二版,Cold Spring Harbor Press
(1989)を参照されたい。
るプロモーターへ作動可能に連結された弱毒化された非機能性vifタンパク質
コード配列が含まれている。構成的プロモーターの例にはサイトメガロウイルス
またはSV40からのプロモーターが含まれる。誘導可能プロモーターの例には
マウス乳房白血病ウイルスまたはメタロチオネインプロモーターが含まれる。当
業者は容易に入手可能な出発材料から、弱毒化された非機能性vifタンパク質
をコードしているDNAによる細胞のトランスフェクションに有用な遺伝子構築
物を容易に製造できる。そのような遺伝子構築物は弱毒化された非機能性vif
タンパク質の製造に有用である。
ウイルス発現ベクターまたは他の適した送達手段のような種々の送達要素の一つ
を用いて、適合宿主細胞でのそれらの導入および発現に影響するように細胞内へ
送達される。一般に、ウイルスベクターは組換えアデノウイルスおよび組換えワ
クシニアウイルスのようなDNAウイルス、または組換えレトロウイルスのよう
なRNAウイルスであろう。他の組換えベクターには細胞に感染でき、組換え遺
伝子を発現できる組換え原核生物が含まれる。組換えベクターに加えて、リポソ
ームでのカプセル化、トランスフェリン仲介トランスフェクションおよび他のレ
セプター仲介手段のような他の送達手段も企図される。本発明は、等価な機能で
働くおよびこれに関して続いて本分野で知られるようになる、発現ベクターのそ
のような他の形および他の適した送達手段を含んでいるつもりである。
胞へ送達される。当業者はそのような手段により宿主細胞へDNAを送達するこ
の技術を容易に理解するであろう。本発明では好適にはアデノウイルスが含まれ
ているが、本発明は等価な機能で働く任意のウイルスを含んでいるつもりである
。
性宿主細胞へ送達される。当業者はそのような手段により宿主細胞へRNAを送
達するこの技術を容易に理解するであろう。RNAによりコードされているタン
パク質を発現させるのに働く任意のレトロウイルスが本発明に含まれていること
が意図されている。
。宿主細胞へ送達されるべき核酸配列はポリリジンへ結合され、複合体は葉酸レ
セプター法により腫瘍細胞へ送達される。1992年4月28日に公開された米
国特許第5,108,921号(本明細書において援用される)はそのような送
達構成要素を記載している。
る。本発明のvifタンパク質は野生型vifタンパク質と比較して弱毒化され
およ非機能的であるペプチドを生産するために欠失、付加、点突然変異、多置換
または停止コドン導入を含んでいる。本発明の好適な態様において、本発明の弱
毒化された非機能性vifタンパク質は配列ID番号:4、配列ID番号:5、
配列ID番号:6、配列ID番号:7、配列ID番号:8、配列ID番号:9、
配列ID番号:10、配列ID番号:11、配列ID番号:12、配列ID番号
:13、配列ID番号:14、配列ID番号:15、配列ID番号:16、配列
ID番号:17、配列ID番号:18、配列ID番号:19、配列ID番号:2
0,配列ID番号:21、配列ID番号:22および配列ID番号:23のみか
ら成る群より選択されるアミノ酸配列を含んでいる。本発明の別の好適な態様に
おいて、本発明の弱毒化された非機能性vifタンパク質は配列ID番号:4、
配列ID番号:5、配列ID番号:6、配列ID番号:7、配列ID番号:8、
配列ID番号:9、配列ID番号:10、配列ID番号:11、配列ID番号:
12、配列ID番号:13、配列ID番号:14、配列ID番号:15、配列I
D番号:16、配列ID番号:17、配列ID番号:18、配列ID番号:19
、配列ID番号:20,配列ID番号:21、配列ID番号:22および配列I
D番号:23から成る群より選択されるアミノ酸配列を含んでいる。本発明のv
ifタンパク質は前記のように、容易に入手可能な出発材料を使用したルーチン
法により製造されるであろう。
れている。タンパク質の組換え生産のためには、それをコードしているDNAは
適切に選択された発現ベクター内へ結合されており、適合宿主を形質転換するた
めに使用され、続いて異種遺伝子の発現が起こる条件下で培養および維持する。
そのようにして産生された本発明のタンパク質は、当業者に理解されおよび知ら
れているように細胞を溶解することによりまたは培養培地から回収される。当業
者は、よく知られた技術を使用して、そのような発現系を用いて生成された弱毒
化された非機能性vifタンパク質を単離できる。弱毒化された非機能性vif
タンパク質に特異的に結合する抗体を用いた天然の供給源から弱毒化された非機
能性vifタンパク質を精製する方法は、組換えDNA方法論により生成された
弱毒化された非機能性vifタンパク質の精製に等しく応用できるであろう。
合成機もまたvprタンパク質を製造するために使用されるであろう。もし本明
細書のタンパク質が合成的に作製されるならば、遺伝子によりコードされていな
いアミノ酸による置換もまた行われることにさらに注目されたい。代替残基には
、例えば、式H2N(CH2)nCOOH(式中、nは2−6である)のωアミノ 酸が含まれる。サルコシン(Sar)、t−ブチルアラニン(t−BuAla)
、t−ブチルグリシン(t−BuGly)、N−メチルイソロイシン(N−Me
Ile)およびノルロイシン(Nlue)のような中性、非極性アミノ酸が存在
している。例えば、フェニルグリシンはTrp、TyrまたはPheと置換でき
る、芳香族中性アミノ酸;シトルリン(Cit)およびメチオニンスルホキシド
(MSO)は極性であるが中性であり、シクロヘキシルアラニン(Cha)は中
性および非極性であり、システイン酸(Cya)は酸性であり、およびオルニチ
ン(Orn)は塩基性である。もしこれらの一つまたはそれ以上がヒドロキシプ
ロリン(Hyp)で置換されているならば、コンホメーション授与プロリン残基
特性が得られるであろう。
それをコードしている本発明の核酸分子と組み合わされた医薬として受容可能な
担体を含んでいる。本発明の好適な態様において、医薬組成物は配列ID番号:
4、配列ID番号:5、配列ID番号:6、配列ID番号:7、配列ID番号:
8、配列ID番号:9、配列ID番号:10、配列ID番号:11、配列ID番
号:12、配列ID番号:13、配列ID番号:14、配列ID番号:15、配
列ID番号:16、配列ID番号:17、配列ID番号:18、配列ID番号:
19、配列ID番号:20,配列ID番号:21、配列ID番号:22および配
列ID番号:23から成る群より選択されるアミノ酸配列を含んでいるvifタ
ンパク質をコードしている組換え発現ベクターを含んでいる。
D番号:28、配列ID番号:29、配列ID番号:30、配列ID番号:31
、配列ID番号:32、配列ID番号:33、配列ID番号:34、配列ID番
号:35、配列ID番号:36、配列ID番号:37、配列ID番号:38、配
列ID番号:39、配列ID番号:40、配列ID番号:41、配列ID番号:
42、配列ID番号:43,配列ID番号:44、配列ID番号:45および配
列ID番号:46から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含むvifタン
パク質をコードしている核酸配列を含んでいる。医薬処方はよく知られており、
本発明の化合物を含んでいる医薬組成物は当業者により日常的に処方されるであ
ろう。適した医薬担体はRemington’s Pharmaceutica
l Science,A.Osol(この分野での標準参考本、本明細書におい
て全文が援用される)に記載されている。
能な医薬組成物にも関している。本発明の化合物は好適に滅菌され、滅菌医薬担
体と混合される。いくつかの態様において、例えば、本発明の化合物は医薬とし
て受容可能な賦形剤とともに溶液、懸濁液、乳剤または凍結乾燥粉末として処方
できる。そのような賦形剤の例は水、塩溶液、リンガー液、デキストロース溶液
および5%ヒト血清アルブミンである。リポソームおよび固定油のような非水賦
形剤もまた使用されるであろう。賦形剤または凍結乾燥粉末はその等張性(例え
ば、塩化ナトリウム、マンニトール)および化学的安定性(例えば、緩衝液およ
び保存剤)を維持する添加物を含んでいる。処方は通常使用される技術により滅
菌される。
脂肪油、脂肪エステル、またはプロピレングリコールおよびポリエチレングリコ
ールのようなポリオールのような希釈剤中に本発明の化合物を含んでいる。注射
可能物は無菌で発熱性物質なしでなければならない。
、座薬、スプレー、液剤および散剤が含まれる。通常の医薬担体、水性、粉体ま
たは油性基剤、増粘剤などが必要であるかまたは望ましいであろう。経口投与の
ための組成物には散剤または顆粒剤、水性または非水媒質の懸濁剤または液剤、
カプセル、サシェまたは錠剤が含まれる。増粘剤、芳香剤、希釈剤、乳化剤、分
散剤または結合剤が望ましい。非経口、鞘内または脳室内投与のための組成物に
は、緩衝剤、希釈剤および他の適した添加物を含んでいるであろう無菌水性溶液
が含まれる。
を可能にする任意の手段により投与される。本発明の医薬組成物は局所または全
身的処置が望ましいか、および処置されるべき領域に依存して多くの方法で投与
される。投与は局所(眼、膣、直腸、鼻孔内、経皮を含む)、経口または非経口
であろう。非経口投与には点滴静注、皮下、腹腔内または筋肉内注射、肺投与(
例えば、吸入または吹送による)または鞘内または脳室内投与投与が含まれる。
健康状態および体重;徴候の性質および程度、同時に行っている処置、処置の頻
度および望まれる結果の様な既知の因子に依存して変化する。治療組成物の処方
およびその後の投与は当業者の範囲内であると思われる。
でいる医薬組成物は個体内へ直接投与されるか、または生体外で個体の取り除か
れた細胞へ送達され、それは投与後に再移植される。どちらの経路にせよ、遺伝
子材料が個体の体内に存在する細胞内へ導入される。好適な投与経路には筋肉内
、腹腔内、皮内および皮下注射が含まれる。もしくは、医薬組成物は個体から取
り除かれた細胞内へ種々の手段により導入されるであろう。そのような手段には
、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーションおよび微小弾丸衝撃
法が含まれる。核酸分子が細胞により取り込まれた後、それらは個体内へ再移植
される。
ムのDNAを含んでいる。いくつかの好適な態様において、医薬組成物は約1か
ら約500マイクログラムのDNAを含んでいる。いくつかの好適な態様におい
て、医薬組成物は約25から約250マイクログラムのDNAを含んでいる。最
も好適には、医薬組成物は約100マイクログラムのDNAを含んでいる。
方される。当業者は本発明のvifタンパク質をコードしている核酸分子を容易
に処方できる。投与様式に筋肉内注射が選択された場合、等張処方が使用される
。一般に、等張性のための添加物には塩化ナトリウム、デキストロース、マンニ
トール、ソルビトールおよびラクトースを含ませることができる。リン酸緩衝液
のような等張溶液を使用してもよい。安定化剤にはゼラチンおよびアルブミンが
含まれる。
剤は典型的には、特定の病原体または望まれない細胞からの一つまたはそれ以上
の遺伝子を含む一つまたはそれ以上のDNAワクチンを含んでいるプラスミドで
ある。注射されると、DNAワクチンのコード配列が患者またはワクチン接種者
でタンパク質産物として発現され、タンパク質産物に対する免疫応答が誘導され
る。本発明での使用に適用できるDNA送達のためのプロトコールの例はWei
nerにより1997年1月14日に公開された米国特許第5,593,972
号、Felgnerらにより1996年12月14日に公開された米国特許第5
,589,466号、Sanfordらにより1990年7月31日に公開され
た米国特許第4,945,050号、Sanfordらにより1991年7月3
0日に公開された米国特許第5,036,006号、PCT出願番号WO90/
11092、PCT出願番号WO93/17706、PCT出願番号WO93/
23552およびPCT出願番号WO94/16737(これらは)各々本明細
書において援用される)に記載されている。
ドしているヌクレオチド配列を含んでいる核酸分子を含む医薬組成物が、vif
タンパク質への体液性および/または細胞性免疫応答を誘導するために前記の方
法により哺乳類へ投与される。本発明の別の態様において、本発明の医薬組成物
は追加の化合物と同時投与できる。そのような追加の化合物には、例えば、異な
ったウイルスタンパク質または異なったウイルスタンパク質をコードしている異
なった核酸分子が含まれる。異なったウイルスタンパク質には、例えば、gag
、pol、env、vpr、vpuおよびtatなどが含まれる。そのような惹
起免疫応答はHIVまたは関連する動物ウイルスに対して保護的である。
している。本明細書で使用される場合、用語”抗体”とは完全で無傷な抗体およ
びそれらのFabおよびF(ab)2断片を意味している。完全で無傷な抗体に はマウスモノクローナル抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体のようなモノクロー
ナル抗体が含まれる。いくつかの態様において、該抗体はvifまたは弱毒化さ
れた非機能性vifのエピトープへ特異的に結合する。エピトープに結合した抗
体は、アフィニティークロマトグラフィーのようなよく知られた技術を用いる、
天然の供給源または組換え発現系の両方からのタンパク質の単離および精製に有
用である。そのような抗体は、試料中のそのようなタンパク質の存在の検出およ
び細胞がそのタンパク質を発現しているかどうかの決定に有用である。
身は、vifおよび弱毒化された非機能性vifおよびvifまたは弱毒化され
た非機能性vifを含むタンパク質複合体の単離および精製に有用である。加え
て、抗体はvif活性の特異的阻害剤であろう。vifまたは弱毒化された非機
能性vifに特異的に結合する抗体はよく知られた技術および容易に利用可能な
出発材料を用いて、天然起源のタンパク質を精製するために使用される。そのよ
うな抗体はまた、組換えDNA方法論によりタンパク質を製造した場合に存在す
る材料からタンパク質を精製するためにも使用される。
知られており、例えば、Harlow,E.andD.Lane(1988)A
NTIBODIES:A Laboratory Manual,Cold S
pring Harbor Laboratory,Cold Spring
Harbor,NY(本明細書において援用される)に記載されている。手短に
言えば、例えば、vifまたは弱毒化された非機能性vifまたはそれらの免疫
原性断片をマウスに注射する。マウスの脾臓を取り除き、脾臓細胞を単離し、不
死化マウス細胞と融合させる。ハイブリッド細胞(またはハイブリドーマ)を培
養し、抗体を分泌する細胞を選択する。抗体を分析し、もしvifまたは弱毒化
された非機能性vifに特異的に結合することが観察されたら、それらを産生す
るハイブリドーマを培養し、抗体の持続的供給を行う。
限的であることは意図されていない。本出願で引用されたすべての参考文献は全
文が援用される。 実施例 実施例1:患者 一人のHIV−1陽性伝播母親(T1)および一人のHIV−1陽性非伝播母
親(N1)からのウイルスが本発明で使用された。患者の3番目の3半期の間に
得られた末梢血リンパ球(PBL)はMother Infant Cohor
t Study,Viral Epidemiology Branch,NC
I(Rockville,MD)により提供された。伝播状態を決定するため、
患者およびその子についての追跡試験が実施された。 実施例2:HIV−1単離 感染一次リンパ球は、PHA刺激正常供与者リンパ球と2週間一緒に培養され
た。ウイルス産生は1)細胞内HIV−1逆転写酵素(RT)のレベルを測定す
ることにより(Velpandi,et al.,J.Virol.Meth.
,1990,29,291;本明細書において援用される)および2)p24抗
原キット(Coulter Corporation;使用説明書に従って使用
された)を用いて培地内に放出されたHIV−1 p24抗原量を測定すること
によりモニターした。 実施例3:DNA調製およびPCR増幅 高分子量(ゲノム)DNAは感染PBLから調製され、Velpandi,e
t al.,J.Virol.Meth.,1990,29,291(本明細書
において援用される)に記載されているようなPCR技術により増幅された。手
短に言えば、PCR混合物は5から10μgのゲノムDNA、50mM KCl
、2.5mM MgCl2、10mMトリス/HCl(pH8.0)、800μ M dNTPs、2.5単位Taqポリメラーゼ、20pmolオリゴヌクレオ
チドプライマーおよび二重脱イオン水(ddH2O)(最終容量を100μlと する)を含んでいる。反応温度およびサイクル時間は以下のようである:94℃
−変性(1分)、55℃−アニーリング(1.5分)および72℃−伸張(2分
)。サイクルは35回繰り返された。プライマー配列は以下のようである:Vi
f(+)5’−GAAAGCTTATGGAAAACAGATGGCAG−3’
(5046−5065)(配列ID番号:2);およびVif(−)5’−GC
AAAGCTTTCATTGTATGGCTC−3’(5609−5626)(
配列ID番号:3)。クローニング目的のためプライマーはHindIII制限
部位(ボールド体)が設けられた。 実施例4:クローニングおよび配列決定 PCR増幅生成物はVelpandi,et al.,DNA Cell B
iol.,1996,15,571(本明細書において援用される)に記載され
ているようにクローニングに使用された。vif遺伝子について陽性なプラスミ
ドDNAは少量調製(Qiagen,CA)により精製され、挿入物の配列決定
の準備として分光学的に定量された。配列決定反応はABT自動化シークエンサ
ーおよびDye Deoxy反応(Applied Biosystems,F
oster City,CA)を用いて実施された。 実施例5:配列分析 配列アラインメントはペンシルバニア大学VAXシステムのMedical
School Computer Facilityを通して得たGeneti
cs Computer Group Sequence Analysisソ
フトウェアーパッケージを用いて構築された。アミノ酸のホモロジー比較は配列
アラインメントプログラムにより実施された。 実施例6:vif欠損プロウイルスの構築 HIV−1プロウイルスDNA、pZr6がNagashunmugam,e
t al.,DNA Cell Biol.,1996,15,353(本明細
書において援用される)に記載されているようなvif欠損突然変異体の構築に
使用された。得られたプロウイルスクローン、p911は、3’読み枠に影響し
ないvif遺伝子中の80アミノ酸欠損を含んでいた。手短に言えば、HIV−
1プロウイルスDNA pZr6はSrinivasan,et al.,Ge
ne,1987,52,71−82(本明細書において全文が援用される)に記
載されているようにHIVZr6に感染した一次血液リンパ球から誘導された。p 911を調製するためにpZr6内へ欠損が導入された。突然変異は上流pol
遺伝子または下流vpr遺伝子を妨害しないように構築された。プラスミドpZ
r6はvif遺伝子のヌクレオチド位476および716に二つのNdeI部位
を含んでいる。Srinivasan,et al.,Gene,1987,5
2,71−82。NdeI断片(477−716)がpZr6から欠損され、末
端は再結合されてp911(vifタンパク質の中心領域に欠損した80アミノ
酸を持つ読み枠内突然変異体)が構築された。 実施例7:vif発現ベクターの構築 vif発現プラスミド、pCVifは、Nagashunmugarn,et
al.,DNA Cell Biol.,1996,15,353(本明細書
において援用される)に記載されているように、主鎖プラスミドpRc/CMV
(Invitrogen,San Diego,CA)内に、サイトメガロウイ
ルス(CMV)即時早期プロモーターの制御下にある、よく特徴付けられたHI
V−1分子クローン、pHXB2からのvif遺伝子を含んでいる。母親の試料
からのvif遺伝子はInvitrogen発現ベクター、pCDNA3内へク
ローン化され、CMVプロモーターの制御下にある。vif読み枠は順プライマ
ーT7、および逆プライマーSP6を使用する配列分析により確認された。手短
に言えば、vif発現ベクター(pCVif)を構築するため、pHxB2から
のEcoRI−EcoRI 1.1kb断片(地図座標5,647−5,742
;Ratner,et al.,Nature,1985,313,277−2
84、本明細書において全文が援用される)はサイトメガロウイルス即時早期プ
ロモーターの制御下でInvitrogenから得られたプラスミドpCDNA
3内へクローン化された。この断片はまたpolおよびvpr遺伝子の一部から
の隣接配列も含んでいるが、Blancら(Virology,1993,19
3,186−192)により類似の構築物で示されたように、転写的に活性では
ない。 実施例8:vifのインビトロ翻訳 1μgのvif発現構築物に対するインビトロ転写および翻訳がT7RNAポ
リメラーゼを製造元(Promega,Madison,WI)の説明書に従っ
て使用することにより実施された。5μlのインビトロ翻訳反応生成物を500
μlのラジオイムノ沈殿アッセイ緩衝液と混合し、説明されているように(Ma
halingam,et al.,Virol.,1995,214,647)
ウサギ抗vif抗血清で免疫沈殿された。 実施例9:細胞 American Type Culture Collection(AT
CC)から得られた横紋筋肉腫(RD)細胞は、10%ウシ胎児血清、1%ペニ
シリン、1%ストレプトマイシンおよび1%L−グルタミンを補給したダルベッ
コ改良イーグル培地中、37℃、5%CO2雰囲気下にて単層で増殖させた。A TCCから得られたリンパ球様細胞株は10%ウシ胎児血清、ペニシリン(10
0U/ml)、およびL−グルタミン(540μg/ml)を補給したRPMI
1640培地中、37℃、5%CO2雰囲気下にて懸濁培養物として維持された 。フィトヘマグルチニン刺激(10)μg/ml)PBLは10%T細胞増殖因
子を含むRPMI1640培地中で維持された。 実施例10:vif構築物によるマウスの免疫化 マウスでの免疫化実験のためには、3つの異なったvif構築物が使用された
。選択されたvifクローンはT−35(伝播者から)、N−15(非伝播者か
ら)およびpCVif(HIV−1SF-2のvif遺伝子)であった。pCDNA
3ベクターDNAは陰性対照として使用された。DNA取り込みを促進させるた
め、DNA注射の48時間前、BALB/cマウスの大腿四頭筋に100μlの
0.25%ブピバカインが注射された。4匹の各々に100μlの最終容量で、
50または100μgの各々のvif発現プラスミドが注射された。動物は2週
間間隔で3回追加免役した。 実施例11:rvifタンパク質へのマウス血清のELISA結合 マウス血清に対するELISAはWang,et al.,AIDS,199
5,9(Suppl A),S159に説明されているように実施された。手短
に言えば、ELISAプレートは結合アッセイのため、100ng/ウェルの濃
度で組換えvif(rvif)タンパク質で被覆された。マウス血清はブロッキ
ング緩衝液で希釈し(1:100および1:500)、西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ(HRP)に結合された抗マウスIgGでタグを付け、TMBlue基質で
検出した。非特異的結合および出血前血清結合はDNA注射動物血清の特異的結
合から差し引かれた。 実施例12:ワクシニア発現vifを用いるCTLアッセイ DNA注射マウスは最初の免疫化の7週後に殺し、Wang,et al.,
DNA Cell Biol.,1993,12,799に説明されているよう
なCTLおよびT細胞増殖アッセイのために脾臓を除去した。手短に言えば、v
if発現ワクシニア(VV:gag NIH AIDS Reagent an
d Reference Programにより親切にも提供された)で感染さ
せたP815細胞が標的細胞として使用された。1x106/mlの標的細胞に 10μCiのNa2CrO4(5lCr,534mCi/mg,Dupont Co
.)を加え、その後室温で2時間インキュベートした。細胞を無血清培地で3回
洗浄し、1x105細胞/mlの容量までRPMI1640/10% ウシ血清で
希釈した。エフェクター脾臓細胞は1回洗浄し、再懸濁して1x107細胞/m lRPMI培地の濃度まで希釈した。この貯蔵細胞溶液から1:2の連続希釈液
が作製された(5x106、2.5x106および1.25x106細胞/ml) 。これらのエフェクター細胞溶液の100μlを96ウェルマイクロタイター平
底プレート内へ加えた。各々のウェルに100μlの標的細胞溶液を加えた。生
じるエフェクター−標的細胞比は100:1、50:1、25:1および12.
5:1であった。自発的および最大クロム放出を決定するため、標的細胞は各々
100μlの培地のみまたは1%トリトン−Xと混合された。エフェクターおよ
び標的細胞は5%CO2インキュベーター中、37℃で5時間インキュベートさ れた。各々のウェルから上清液100μlを採り、ガンマカウンターで放出され
た5lCr量が測定された。特異的CTL放出計算のための式は以下のようである
:100x[(実験での放出−自発的放出)/最大放出−自発的放出]。注:最
大放出は1%トリトンX−100中での標的細胞の溶解により決定された。 実施例13:臨床HIV−1単離物を用いたCTLアッセイ マウスMHC−Iを発現しているヒーラーCD4+細胞をHIV−1臨床単離
物で感染させ、CTLアッセイにおける標的細胞として使用した。CTLアッセ
イはChada,et al.,J.Virol.,1993,67,3409
に説明されているように実施された。 実施例14:T細胞増殖アッセイ アッセイは3重に実施された。脾臓細胞は前記のように単離され、RPMI1
640に懸濁して3.3x10細胞/mlの濃度まで希釈した。150μlを9
6ウェルマイクロタイター平底プレートの各々のウェルにすぐに加えた。50μ
lのタンパク質またはペプチドを、10.0、1.0または0.1mg/mlの
最終濃度になるように各々のウェルへ加えた。細胞は5%CO2インキュベータ ー中、37℃で3日間インキュベートされた。1μCiのトリチウム化チミジン
を各々のウェルへ加え、細胞は同一条件下で一夜インキュベートした。細胞を自
動細胞ハーベスター(Tomtec,Orange,CT)で採取し、取り込ま
れたトリチウム化チミジン量をベータカウンターで測定した。細胞が健康である
ことを確認するため、陽性対照試料中、5mg/mlのPHAを非特異的刺激剤
として使用した。 実施例15:vif欠損プロウイルスDNAと母親試料からのvif遺伝子のト
ランス相補性 Boehringer Mannheim(Indianapolis,IN
)からのリポフェクチンを用いて、RD細胞(1x106)を10μgのvif 欠損プロウイルスクローン(p911)および10μgのpCVifまたは伝播
または非伝播被験者からのvif発現プラスミドで共トランスフェクトした。共
トランスフェクトされた細胞は8時間インキュベート後に洗浄し、DMEM培地
に再懸濁した。培養上清液を72時間インキュベート後に集め、遠心分離して細
胞破片を除去し、0.45μmフィルターを通過させ、p24生成をアッセイし
た(Coulter Corporation)。PBMC(1x107)を1 00ngのp24抗原と等しいウイルス量で感染させた。ウイルスが接種された
細胞は37℃および5%CO2で4−6時間インキュベートし、PBSで3回洗 浄して10mlの新鮮なRPMI1640に再懸濁した。培地中へのp24抗原
放出量を測定することによりウイルス産生を定量するために、培養上清液の一部
を3日毎に集めた。 実施例16:患者から単離されたウイルスの特徴付け 本発明で取り扱われたHIV−1陽性伝播または非伝播母親はAIDSコホー
ト研究から選択された。母親および非伝播母親は各々T1およびN1で示されて
いる。被験者の臨床状態および単離されたウイルスの複製動力学は表2に示され
ている。インビトロ選択条件により修飾されていない野生型配列を得るために各
々の被験者からの非培養リンパ球が使用された。PBMC共培養アッセイにおい
て、T1ウイルス試料は正常供与者PBLで非常によく複製した;一方、N1ウ
イルス試料は一次リンパ球またはマクロファージの両方で複製しなかった。
らの10のクローンが配列決定され、相同性の程度に従ってコンピューターで並
べられた。続いてヌクレオチド配列はタンパク質配列に翻訳された。すべてのヌ
クレオチド配列変化がアミノ酸配列変化を生じるわけではないので、演繹された
アミノ酸配列が最終比較で使用された。これらの患者からのアミノ酸配列を並べ
たものが図1に示されている。呼称”T”および”N”を持つクローン番号は各
々伝播および非伝播母親から単離された変異体を意味している。配列アラインメ
ントは各々の被験者はそのウイルスプール内に独特および高度に保存された配列
の組を持っていることを明らかにした。ヌクレオチド変化のほとんどは、一般的
にタンパク質配列内の置換(重複または挿入に対して)を生じる点突然変異であ
った。3つのクローンが弱毒化タンパク質をコードしていた。クロ−ンT−42
は未熟な停止コドンにより、3’末端に5アミノ酸欠損を持っていた。クローン
N−13は2つの停止コドン(31および41位)を持ち、およびT−4は単一
の停止コドン(77位)を持っていた;それらの各々は3つのヌクレオチドの組
内に導入されており、読み枠は無傷なまま突然変異の3’に保っている。クロー
ンの大多数(20の内17)は完全長配列をコードしているという事実は、これ
らの患者のウイルスプール内には欠損vif遺伝子はわずかしか存在しないこと
を示唆している。vif点突然変異のほとんどは3’領域というよりも遺伝子の
5’位に存在していることは注目に値する。20、27、31、36、37、4
5、60、74、127、136、140および150位で著しい相違がクロー
ン間で観察された。
−1陽性被験者からの非培養PBMC中に存在するvif配列をクローン化し、
分析した。2人の被験者からの20の異なったvif配列(各々の被験者から1
0)の分析は、vifは特定の患者内では与えられた時間点で高度に保存されて
いる(約90%)ことを明らかにした。Wielandらは(Virol.,1
994,203,43)vif遺伝子の3’部分は高度に変異性であると報告し
ているけれども、本発明の結果は5’部分(aa20−85)がより変異的であ
り、および3’部分はよく保存されていることを示している。本明細書の結果を
支持して、従来の突然変異誘発実験はvifのC末端(aa171から192)
は膜とvifの安定な会合に必須であることが示されている。Goncalve
s,et al.,J.Virol.,1994,66,704。我々が分析し
た20の配列の中で、2つのクローンのみが未熟な停止コドンを持っていたこと
は、単離されたvif遺伝子の90%はインビボで無傷であることを示している
。この結果ならびに以前に公表されたデータは完全なvif遺伝子がインビボで
のウイルス複製に必須であることを示唆している。Gabudza,et al
.,J.Virol.,1992,66,6489;およびSova,et a
l,J.Virol.,1995,69,2557。
2aa)で75%の保存(25%変異)を示した。特に、HIV−1陽性血清に
より認識される(Wieland,et al.,AIDS Res.Huma
n Retrovir.,1991,7,861)2つの抗原的ドメイン、aa
87−94(IEWRKKRY)(配列ID番号:24)およびaa172−1
78(DRWNKPQ)(配列ID番号:25)は20すべてのクローンでよく
保存されている。これら2つの領域のよく保存された性質は、これらのクローン
により示される交差抗原性特性に関係しているであろう。加えて、34/38レ
ンチウイルスvifで保存されている配列、SLQYLA(144−149)(
配列ID番号:26)(Oberste,et al.,Virus Gene
s,1992,6,95)もまた本発明で配列決定された20のvifクローン
の各々で保存されている。従来の研究において、コンピューターアラインメント
分析は、vifのアミノ酸21から30、103から115および142から1
50はHIV−1、HIV−2およびSIV間で高度に保存されていることが示
されている。Myers,et al.,Human Retrovir.AI
DS,1988。しかしながら、本発明で分析されたクローンは一般的にaa1
03−115およびaa142−150内は保存された配列であったが,aa2
1−30はそうではなかった。vifタンパク質は、Cys114が活性部位で
あり、およびHis48が活性に重要であると考えられているシステインプロテ
アーゼとして特徴付けられている。Guy,el al.,J.Virol.,
1991,65,1325。本発明の配列において、Cys114ならびにCy
s133(vifにおける唯一の別のシスチン)およびHis48はよく保存さ
れていた。
主ファミリーを観察した。N由来クローンの90%がファミリーを形成し、およ
びT由来クローンの80%がファミリーを形成するが、一方、残りのクローンN
−30、T−3およびT−38はよりたくさんの多様性を示し、別の群を形成す
る(データは示されていない)。距離比較が行われた場合、伝播クローン間の患
者内変異は12%であったのに対し、非伝播クローン間は10%の変異であった
。被験者の変異体クローンの類似性、および確立された実験室分子クローンHI
VSF-2、HIVNL43およびHIVZr6もまた評価された。被験者単離物は、実験 室維持ウイルス単離物よりもそれらの伝播状態群内の他のクローンとより高い程
度の相同性を共有していた。それらの配列変異体に基づき、各々の患者から4つ
のクローンが予備的翻訳/免疫化実験に選択された(下記参照)。
からのクローンは別々に群れをなしていることも示している。8構築物の(各々
の被験者から4)インビトロ転写/翻訳は、未熟な停止コドンを持つN−13の
場合を除いて、23KDaタンパク質の発現を生じた。このことはこれらのvi
f構築物中に存在する種々の突然変異は発現動力学およびタンパク質の安定性に
は影響しないことを示唆している。 実施例18:vifクローンの発現 vif発現レベルを評価するために、各々の群からの5クローンに対してイン
ビトロ転写/翻訳が実施された。結果は図2に示されている。インビトロ翻訳反
応の生成物はvif抗血清で免疫沈降され、ゲル電気泳動にかけられた。pCV
if(HIV−1株SF2からの完全長vif)およびp911(vif突然変
異体)プロウイルスは各々陽性および陰性対照として使用された。pCVifお
よび完全長vif発現プラスミドによるインビトロ翻訳は23KDaタンパク質
を生成する;一方、クローンp911およびN−13は多分未熟な停止コドンの
存在により、23kDaサイズのタンパク質生成物を生じない。各々の被験者群
からの2つのクローンが、類似の血清学的特性に基づいて(データは示されてい
ない)さらなる評価のため選択された。各々の群を代表するように選択された患
者クローンはT−35(伝播)およびN−15(非伝播)であった。これらのク
ローンの各々はその特定の群に特徴的な突然変異を持っており、これらの群内の
最も高いレベルの多様性を示す。クローンN−15内の突然変異は完全長遺伝子
を通して分散しているが、一方、クローンT−35内の突然変異は遺伝子の5’
末端に群をなしていることは注目に値する。 実施例19:インビボでの体液性応答の誘導 特異的抗vif免疫応答はT−35、N−15およびpCVif発現プラスミ
ドで免役したマウスから集められた血清では明らかであったが、pcDNA3ベ
クター単独で免疫されたマウスからの血清ではそうではなかった。免疫応答の誘
導はDNA注射濃度ならびに追加免疫間の回数および時間間隔に相関していた。
ELISAで測定した場合、50かまたは100μgのvif DNAが注射さ
れた4匹のマウスからの血清はvifタンパク質への特異的反応性を持っていた
(図3)。体液性応答誘導は容量−および時間依存性であった。50μgのDN
A注射は一回目の注射の15日後にELISAで検出可能な免疫応答を誘導した
。この応答は続いての追加免疫後に増加し、2回の追加免疫45日後に最高レベ
ルに到達した(パネルA)。100μgのDNA注射は、一回の注射わずか28
日後に最高レベルに到達した(パネルB)。加えて、抗体応答はDNAの1回の
追加免疫を行う3回の注射219日後でも上昇できる(データは示されていない
)。抗体応答のレベルはvifクローン間で変化した。最も重要なことは、非伝
播クローンN−15は伝播クローンT−38またはpCVifよりも高い血清学
的応答を誘導する。このことは非伝播vifは、マウスのこの株において、伝播
vifよりもより有効なB−Tヘルパー依存性応答を誘導できることを示唆して
いる。 実施例20:ワクシニア発現vifを用いるインビボでの、細胞性応答の誘導 vif構築物の一つで各々免役した4匹のマウスに1回目の注射15日後にさ
らなる追加免疫が与えられた。2匹のマウスがその後に殺され、その脾臓細胞は
細胞毒性T細胞(CTL)アッセイに使用された。vif発現ワクシニアで感染
させたp815細胞が標的細胞として使用された。vifDNA免疫化および自
然のマウスからの脾臓細胞による非特異的溶解は、標的細胞として非vif発現
ワクシニアで感染させたp815細胞を使用して測定された。特異的標的溶解は
図4に示されている。特異的CTL活性のレベルはvif構築物間で変化した。
クローンpCVifで免疫したマウスからの脾臓細胞は、100:1のエフェク
ター:標的比で45%の溶解を示した。クローンT−35およびN−15は同一
の比で各々17および12%を示した。これらの結果は、vifDNA免疫化は
特異的CTL応答を誘導していることを明らかに示している。vif遺伝子接種
により誘導されたCTL活性レベルにおける種々の患者クローン間の相違は、ワ
クチン標的により発現されたCTLエピトープ内の突然変異またはハロタイプの
免疫応答性の相違によるものであろう。 実施例21:臨床HIV−1単離物で感染させたヒト標的を用いるインビトロで
の細胞性応答の評価 ウイルス感染標的の溶解を誘導するvifクローンの能力を評価するため、C
TLアッセイの標的として、CD4レセプターおよびマウスクラスIH−2Dd 制限要素の両方を発現するHIV−1感染可能ヒーラーCD4/Dd細胞が使用 された。これらの細胞は7日間、症候性AIDSの患者から誘導されたHIV−
1単離物で感染させた。図5(A−D)はCTLアッセイの結果を示している。
vif特異的溶解を示す各々のDNA構築物を注射したマウスから脾臓細胞が得
られた。クローンT−35、N−15およびpCVifは50:1のエフェクタ
ー:標的比で各々27、26および24%溶解を示した。25:1の比では3つ
すべてのクローンが20%溶解を示した。このことは、天然のHIV−1に対す
る細胞性免疫応答はvif発現ベクターによる遺伝子ワクチン接種により発生で
きることを示している。 実施例22:抗原特異的T細胞増殖の誘導 HIV−1 vifタンパク質に対する特異的T細胞増殖応答もまたDNA免
疫動物で研究された。vif免疫マウスからのリンパ球はvifタンパク質に対
して著しい増殖応答を示した。図6は異なったvif構築物の増殖指数に対する
DNA注射濃度を示している。結果はMHCクラスII依存性Th(ヘルパー) 細胞応答は用量依存性であることを示している。各々の構築物について、刺激指
数は50μgのvifDNAを注射したマウスより100μgのvifDNAを
注射したマウスの方がほとんど2倍高かった。3つの異なったvif構築物の比
較もまた、各々の注射濃度で、クローンT−35はN−15またはpCVifよ
りも高い刺激指数を誘導することを示している。 実施例23:vif発現プラスミドによるHIV−1vifプロウイルスのトラ
ンス相補性 予期されるように、HIV−1(vif−)プロウイルスDNAおよびvif
発現プラスミドによるRD細胞の過渡的トランスフェクションは、T−誘導、N
−誘導または対照プラスミド間のウイルス産生の相違をよく調べられない(デー
タは示されていない)。vif機能の相違は新しい感染のレベルで示されるであ
ろう。しかしながら、レスキューウイルスが一次リンパ球を感染させるのに使用
された場合、T−、N−誘導または対照プラスミド間に、ウイルス病因論に著し
い相違が観察された(表3)。vif陰性プロウイルスクローン(p911)単
独では無細胞ウイルスのように一次PBLに感染することができなかった。トラ
ンス相補性ウイルス(p911+pCVif)がPBLを感染させるのに使用さ
れた場合、感染力は野生型ウイルスの5分の1であった。対照的に、試験された
T−誘導クローンの各々は(vif−)突然変異を助けることができた(約10
0%陽性ウイルス対照)。しかしながら、N−誘導クローンのどれも無細胞ウイ
ルスのようにPBLに効果的に感染できなかった。従って、N−15および類似
のN−誘導クローンは機能性が欠如したまま、マウスにおいて抗HIV−1免疫
応答を誘導できた。
なった患者試料からのvif発現プラスミドでトランスフェクトされた。ウイル
スプールはトランスフェクション72時間後に集められた上清から調製された。
100ngのp24抗原と等しい量のウイルスが10x106PBMCを感染さ せるのに使用された。感染はp24抗原産生によりモニターされた。 実施例24:観察 N−誘導クローンは、vif欠損HIV−1プロウイルスをトランス相補する
その能力が弱められた。分析された一つのクローン,N−15、もまた免疫学的
に機能性であり、野生型HIV−1ウイルスに対する免疫応答を発生することが
できる。本発明のN−15のような非機能性であるがしかし免疫原性のクローン
はHIV−1に対する遺伝子ワクチンの有効な成分であり得る。本発明において
、vif単独でインビトロにおいて天然のHIV−1に対して有効な応答を発生
できる。そのような免疫原は、天然のvif発現ウイルスに対する免疫応答を標
的とする治療セッティングに有用であろう。逸脱変異体が生じることはありそう
なことであるが、この選択のために欠損vifを発現しているウイルスはインビ
ボで弱められた増殖動力学を示すであろう。同様の様式で、vifを含む予防的
ワクチンは、ウイルス逸脱を制限するために、および感染の初期の間にウイルス
セットポイントを下げることに寄与するように働くことができるであろう。
アミノ酸配列とよく特徴付けられたHIV−1分子クローンPNL43、SF−
2およびZr6との比較を示している。T−#、伝播被験者からのクローン;N
−#、非伝播被験者からのクローン;−−、共通配列と一致(Con;配列ID
番号:1);..、ギャップを示している;*、停止コドン。
および非伝播母親から誘導されたHIV−1 vifクローンの発現。vif発
現プラスミドは使用説明書(Promega)に従ってインビトロ転写/翻訳と
連結して使用された。インビトロ翻訳されたタンパク質の免疫沈降は本文で説明
したようにvif抗血清で実施された。vifクローンの呼称は上部に示されて
いる。T−**およびN−**で称されるクローン番号は各々伝播および非伝播
母親に由来している。pCVifはHIV−1SF2のvif発現プラスミドであ る。
スにおける抗vif抗体応答の酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)の結果
を示している。マウス血清はブロッキング緩衝液で1:500に希釈され、本文
に説明したようにアッセイされた。図3Aにおいて、マウスは50μgのDNA
で免疫された。図3Bにおいて、マウスは注射あたり100μgのDNAで免疫
された。
るvifタンパク質を発現しているマウス標的(p815)の溶解によるクロム
放出アッセイの結果を示している。p815細胞(1x105/ml)はvif を発現しているワクシニア(VV:gag)を感染させ、16時間インキュベー
トしてvifタンパク質を発現させた。標的細胞は1−2時間51Crで標識し、
刺激された脾臓細胞と6時間インキュベートするために使用された。特異的溶解
(%)は本文に説明した式に従って計算した。
マウスからの脾臓細胞による、臨床HIV−1単離物で感染させたヒーラーCD
4+/Dd細胞(106)の溶解によるクロム放出アッセイの結果を示している。
ヒーラーCD4+/Dd細胞(106)は無細胞HIV−1臨床単離物で感染させ
、1週間インキュベートして細胞が感染してウイルスタンパク質を発現させるよ
うにした。感染1週間後、標的細胞を1−2時間51Crで標識し、刺激された脾
臓細胞と6時間インキュベートするために使用された。特異的溶解(%)は本文
に説明した式に従って計算した。
ている増殖アッセイの結果を示している。組換えVif(10μg/ml)はT
細胞の増殖を刺激するために各々のウェルに加えられた。レクチンPHA(10
μg/ml)はポリクローナル刺激剤陽性対照として使用された。刺激指数は特
異的タンパク質で刺激された細胞で検出された放射活性のレベルを培地中の細胞
で検出されるレベルで割ることにより計算された。レーン1aおよび1bは50
および100μgのpCVifで免疫されたマウスからのものであり;レーン2
aおよび2bは50および100μgのクローンT−35で免疫されたマウスか
らのものであり;レーン3aおよび3bは50および100μgのクローンN−
15で免疫されたマウスからのものである。
パク質のアミノ酸配列を示している。
パク質のヌクレオチド配列を示している。
Claims (20)
- 【請求項1】 単離され、弱毒化された、非機能性vifタンパク質。
- 【請求項2】 該タンパク質が配列ID番号:4、配列ID番号:5、配列
ID番号:6、配列ID番号:7、配列ID番号:8、配列ID番号:9、配列
ID番号:10、配列ID番号:11、配列ID番号:12、配列ID番号:1
3、配列ID番号:14、配列ID番号:15、配列ID番号:16、配列ID
番号:17、配列ID番号:18、配列ID番号:19、配列ID番号:20,
配列ID番号:21、配列ID番号:22および配列ID番号:23から成る群
より選択されるアミノ酸配列を含む請求項1に記載のタンパク質。 - 【請求項3】 弱毒化された、非機能性vifタンパク質をコードしている
ヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。 - 【請求項4】 該核酸分子が配列ID番号:4、配列ID番号:5、配列I
D番号:6、配列ID番号:7、配列ID番号:8、配列ID番号:9、配列I
D番号:10、配列ID番号:11、配列ID番号:12、配列ID番号:13
、配列ID番号:14、配列ID番号:15、配列ID番号:16、配列ID番
号:17、配列ID番号:18、配列ID番号:19、配列ID番号:20,配
列ID番号:21、配列ID番号:22および配列ID番号:23から成る群よ
り選択されるアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列を含む請求項第3
項に記載の核酸分子。 - 【請求項5】 該核酸分子が配列ID番号:27、配列ID番号:28、配
列ID番号:29、配列ID番号:30、配列ID番号:31、配列ID番号:
32、配列ID番号:33、配列ID番号:34、配列ID番号:35、配列I
D番号:36、配列ID番号:37、配列ID番号:38、配列ID番号:39
、配列ID番号:40、配列ID番号:41、配列ID番号:42、配列ID番
号:43,配列ID番号:44、配列ID番号:45および配列ID番号:46
から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含む請求項第3項に記載の核酸分
子。 - 【請求項6】 医薬として受容可能な担体または希釈剤中に請求項第1項の
タンパク質を含んでいる医薬組成物。 - 【請求項7】 医薬として受容可能な担体または希釈剤中に請求項第3項の
核酸分子を含んでいる医薬組成物。 - 【請求項8】 請求項第3項の核酸分子を含んでいる組換え発現ベクター。
- 【請求項9】 該核酸分子が配列ID番号:4、配列ID番号:5、配列I
D番号:6、配列ID番号:7、配列ID番号:8、配列ID番号:9、配列I
D番号:10、配列ID番号:11、配列ID番号:12、配列ID番号:13
、配列ID番号:14、配列ID番号:15、配列ID番号:16、配列ID番
号:17、配列ID番号:18、配列ID番号:19、配列ID番号:20,配
列ID番号:21、配列ID番号:22および配列ID番号:23から成る群よ
り選択されるアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列を含む請求項第8
項に記載の組換え発現ベクター。 - 【請求項10】 請求項第3項の核酸分子を含んでいる組換え発現ベクター
を含んでいる宿主細胞。 - 【請求項11】 該核酸分子が配列ID番号:4、配列ID番号:5、配列
ID番号:6、配列ID番号:7、配列ID番号:8、配列ID番号:9、配列
ID番号:10、配列ID番号:11、配列ID番号:12、配列ID番号:1
3、配列ID番号:14、配列ID番号:15、配列ID番号:16、配列ID
番号:17、配列ID番号:18、配列ID番号:19、配列ID番号:20,
配列ID番号:21、配列ID番号:22および配列ID番号:23から成る群
より選択されるアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列を含む請求項第
8項に記載の宿主細胞。 - 【請求項12】 弱毒化された、非機能性vifタンパク質に対して方向付
けられた精製抗体。 - 【請求項13】 該タンパク質が配列ID番号:4、配列ID番号:5、配
列ID番号:6、配列ID番号:7、配列ID番号:8、配列ID番号:9、配
列ID番号:10、配列ID番号:11、配列ID番号:12、配列ID番号:
13、配列ID番号:14、配列ID番号:15、配列ID番号:16、配列I
D番号:17、配列ID番号:18、配列ID番号:19、配列ID番号:20
,配列ID番号:21、配列ID番号:22および配列ID番号:23から成る
群より選択されるアミノ酸配列を含む請求項第12項に記載の抗体。 - 【請求項14】 ウイルスに対して哺乳類を免疫する方法であって、該哺乳
類の細胞へ弱毒化された、非機能性vifタンパク質をコードしているヌクレオ
チド配列を含む核酸分子を投与することから成っており、ここで該核酸分子は該
細胞中で発現される。 - 【請求項15】 該核酸分子が配列ID番号:4、配列ID番号:5、配列
ID番号:6、配列ID番号:7、配列ID番号:8、配列ID番号:9、配列
ID番号:10、配列ID番号:11、配列ID番号:12、配列ID番号:1
3、配列ID番号:14、配列ID番号:15、配列ID番号:16、配列ID
番号:17、配列ID番号:18、配列ID番号:19、配列ID番号:20,
配列ID番号:21、配列ID番号:22および配列ID番号:23から成る群
より選択されるアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列を含む請求項第
14項に記載の方法。 - 【請求項16】 該核酸分子が配列ID番号:27、配列ID番号:28、
配列ID番号:29、配列ID番号:30、配列ID番号:31、配列ID番号
:32、配列ID番号:33、配列ID番号:34、配列ID番号:35、配列
ID番号:36、配列ID番号:37、配列ID番号:38、配列ID番号:3
9、配列ID番号:40、配列ID番号:41、配列ID番号:42、配列ID
番号:43,配列ID番号:44、配列ID番号:45および配列ID番号:4
6から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含む請求項第14項に記載の方
法。 - 【請求項17】 該ウイルスがヒト免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイル
ス、ウシ免疫不全ウイルス、ビスナウイルスおよびサル免疫不全ウイルスから成
る群より選択される請求項第14項に記載の方法。 - 【請求項18】 単離され、弱毒化された、非機能性vifタンパク質をコ
ードしているヌクレオチド配列を含むプラスミド。 - 【請求項19】 該タンパク質が配列ID番号:4、配列ID番号:5、配
列ID番号:6、配列ID番号:7、配列ID番号:8、配列ID番号:9、配
列ID番号:10、配列ID番号:11、配列ID番号:12、配列ID番号:
13、配列ID番号:14、配列ID番号:15、配列ID番号:16、配列I
D番号:17、配列ID番号:18、配列ID番号:19、配列ID番号:20
,配列ID番号:21、配列ID番号:22および配列ID番号:23から成る
群より選択されるアミノ酸配列を含む請求項第18項に記載のプラスミド。 - 【請求項20】 該ヌクレオチド配列が配列ID番号:27、配列ID番号
:28、配列ID番号:29、配列ID番号:30、配列ID番号:31、配列
ID番号:32、配列ID番号:33、配列ID番号:34、配列ID番号:3
5、配列ID番号:36、配列ID番号:37、配列ID番号:38、配列ID
番号:39、配列ID番号:40、配列ID番号:41、配列ID番号:42、
配列ID番号:43,配列ID番号:44、配列ID番号:45および配列ID
番号:46から成る群より選択される請求項第18項に記載のプラスミド。
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