PT2044950E

PT2044950E - Cassetes de imunização adn de vif atenuadas para vacinas genéticas

Info

Publication number: PT2044950E
Application number: PT08075892T
Authority: PT
Inventors: Velpandi Ayyavoo; Thanadavarayan Nagashunmugam; David B Weiner
Original assignee: Univ Pennsylvania
Priority date: 1997-09-18
Filing date: 1998-09-18
Publication date: 2012-09-18
Also published as: US8183352B2; JP2001516566A; AU752725B2; WO1999013896A1; EP2044950A3; ES2389519T3; JP4749481B2; US7151172B1; EP2044950A2; CA2304125A1; EP1015009A4; US20070106062A1; JP4418101B2; DK2044950T3; EP2044950B1; EP1015009A1; AU9319098A; JP2010001290A

Description

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DESCRIÇÃO

"CASSETES DE IMUNIZAÇÃO DE ADN DE VIF ATENUADAS PARA VACINAS GENÉTICAS"

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção refere-se à preparação e utilização de cassetes de imunização de vif de VIH atenuadas, não funcionais, como vacinas genéticas para genes patogénicos. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A vacinação e imunização referem-se geralmente à introdução de um agente não virulento, contra o qual o sistema imunológico de um indivíduo pode iniciar uma resposta imunitária, que irá então estar disponível para a defesa contra o desafio por um patogéneo. 0 sistema imunológico identifica composições e agentes "estranhos" invasores, primariamente através da identificação de proteínas e outras moléculas grandes que não estão normalmente presentes no indivíduo. A proteína estranha representa um alvo contra o qual a resposta imunitária é feita. 0 sistema imunológico pode fornecer vários meios para a eliminação de alvos que são identificados como estranhos. Estes meios incluem respostas humorais e celulares que participam no reconhecimento e eliminação de antigénios. Resumidamente, a resposta humoral envolve as células B que produzem anticorpos que se ligam especificamente aos antigénios. Existem dois braços da resposta imunológica celular. 0 primeiro envolve as células T auxiliares que produzem citocinas, e suscitam a participação de células imunológicas adicionais na resposta imunitária. 0 segundo envolve as células T assassinas (killer), também conhecidas como linfócitos T citotóxicos (CTLs), que são células capazes de reconhecer antigénios e atacar o antigénio, incluindo a célula ou partícula que está conectada. 2 A vacinação tem sido singularmente responsável por conferir protecção imunológica contra vários patogéneos humanos. Até agora têm sido empregues várias estratégias na busca de vacinas seguras e eficazes para imunizar indivíduos contra agentes infecciosos patogénicos, tais como vírus, bactérias e organismos eucarióticos infecciosos. Cada estratégia visa conseguir o objectivo de proteger o indivíduo contra a infecção por um patogéneo, por administração ao indivíduo de uma proteína alvo associada com o patogéneo, gue pode provocar uma resposta imunitária. Assim, guando o indivíduo é desafiado por um patogéneo infeccioso, o sistema imunológico do indivíduo pode reconhecer a proteína e montar uma defesa eficaz contra a infecção. Existem várias estratégias de vacinas para a apresentação de proteínas de patogéneos, que incluem apresentar a proteína como parte de um agente não infeccioso ou menos infeccioso, ou como uma composição de proteína discreta.

Uma estratégia para a imunização contra a infecção utiliza vacinas mortas ou inactivadas, para apresentar as proteínas de patogéneos ao sistema imunológico de um indivíduo. Em tais vacinas, o patogéneo ou é morto ou de outro modo inactivado, utilizando meios tais como por exemplo, calor ou produtos químicos. A administração de um patogéneo morto ou inactivado a um indivíduo, apresenta o patogéneo ao sistema imunitário do indivíduo numa forma não infecciosa, e assim o indivíduo pode montar uma resposta imunológica contra este. Vacinas de patogéneos mortos ou inactivados garantem protecção gerando directamente células T auxiliares e respostas imunes humorais contra os imunogéneos patogénicos. Uma vez que o patogéneo está morto ou de outro modo inactivado, há pouco risco de infecção.

Um outro método de vacinação contra patogéneos é o de proporcionar uma vacina atenuada. As vacinas atenuadas são essencialmente vacinas vivas que exibem uma infecciosidade 3 reduzida. As vacinas atenuadas são muitas vezes produzidas por passagem de várias gerações do patogéneo através de um hospedeiro permissivo, até que os agentes descendentes já não sejam virulentos. Ao utilizar uma vacina atenuada, pode ser empregue um agente que exibe infecciosidade limitada para induzir uma resposta imunitária contra o patogéneo. Através da manutenção de um certo nível de infecciosidade, a vacina atenuada produz uma infecção de baixo nível, e provoca uma resposta imunitária mais forte do que vacinas mortas ou inactivadas. Por exemplo, vacinas vivas atenuadas, tais como vacinas do vírus da poliomielite e da varíola, estimulam células T auxiliares, células T citotóxicas, e imunidade humoral protectora durante a sua infecção não patogénica do hospedeiro.

Outro meio de imunização contra patogéneos é proporcionado por vacinas recombinantes. Existem dois tipos de vacinas recombinantes: um deles é um patogéneo em que genes específicos são eliminados de modo a tornar o agente resultante não virulento. Essencialmente este tipo de vacina recombinante é atenuado pela concepção, e requer a administração de um agente infeccioso activo, não virulento, que ao se estabelecer num hospedeiro produz ou faz com que sejam produzidos antigénios, utilizados para provocar a resposta imunitária. 0 segundo tipo de vacina recombinante emprega vectores infecciosos, não virulentos, nos quais é inserido material genético que codifica antigénios alvo. Este tipo de vacina recombinante, de forma semelhante, requer a administração de um agente infeccioso activo, não virulento, que ao se estabelecer num hospedeiro, produz ou faz com que seja produzido o antigénio utilizado para desencadear a resposta imunitária. Tais vacinas empregam essencialmente agentes infecciosos, não virulentos, para apresentar antigénios de patogéneos, que podem então servir como alvos para uma resposta imunitária anti-patogéneo. Por exemplo, o desenvolvimento 4 de vaccinia como um sistema de expressão para a vacinação, tem teoricamente simplificado a segurança e o desenvolvimento de estratégias de vacinação infecciosas, com amplas respostas imunitárias das células T.

Outro método de imunização contra a infecção utiliza vacinas de subunidade. As vacinas de subunidade são geralmente constituídas por uma ou mais proteínas isoladas derivadas do patogéneo. Estas proteínas actuam como antigénios alvo contra os quais pode ser armada uma resposta imunitária por um indivíduo. As proteínas escolhidas para a vacina de subunidade são exibidas pelo patogéneo, de modo que após a infecção de um indivíduo pelo patogéneo, o sistema imunitário do indivíduo reconhece o patogéneo e desencadeia uma defesa contra este. Porque as vacinas de subunidade não são agentes infecciosos inteiros, são incapazes de se tornarem infecciosas. Assim, não representam qualquer risco de infecciosidade virulenta indesejável, que está associada com outros tipos de vacinas. Tem sido reportado que as vacinas recombinantes de subunidade, tal como a vacina do antigénio de superfície da hepatite B (HBsAg), estimulam uma resposta imunitária protectora de células T auxiliares e humoral mais específica contra um antigénio único. No entanto, a utilização desta tecnologia para estimular um quadro de protecção contra diversos patogéneos continua por ser confirmada. A construção de vacinas eficazes é complicada por vários factores que incluem a patobiologia do patogéneo, e as especificidades da resposta imunitária do hospedeiro. Recentemente, tornou-se disponível uma nova ferramenta para a compreensão da componente imunitária nestas interacções, sob a forma de imunização genética ou vacinação ADN. Tang, et al., Nature, 1992, 356, 152, Fynan, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1993, 90, 11478, Ulmer, et al., Science, 1993, 259, 1745, e Wang, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 5 USA, 1993, 90, 4156. A capacidade desta abordagem demonstrou produzir grandes respostas imunitárias contra os produtos estruturais e enzimáticos dos genes do VIH-1, e delineou uma estratégia para o desenvolvimento de uma possível vacina profilática para o VIH-1. Esta estratégia utilizou cassetes de expressão de genes múltiplos codificando gag/pol // rev, assim como env/rev, e genes de imunogéneos acessórios. Estudos demonstraram claramente que roedores e primatas podem ser imunizados com sucesso com os genes estruturais e de envelope do VIH-1. Wang, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1993, 90, 4156 e Wang, et al., DNA Cell Biol., 1993, 12, 799. É necessária uma estratégia genética para a construção de cassetes de expressão de imunogénio de um gene patogénico que possa ser largamente aplicada, a fim de utilizar imunogénios de ADN contra uma variedade de patogéneos.

Os genomas lentivirais de primatas contêm genes que codificam novas proteínas reguladoras e acessórios, bem como proteínas com funções estruturais e enzimáticas. Os genes reguladores tat e rev, e os genes acessórios nef, vif, vpr, vpu e vpx, são bem conservados em muitos lentivírus, incluindo VIH e VIS. A natureza bem conservada destes genes, implica que os seus produtos de proteína desempenham um papel crítico na patogénese virai in vivo. As experiências iniciais in vitro pareceram demonstrar que tat e rev eram essenciais para a replicação virai, ao passo que os genes acessórios foram considerados não essenciais. Cullen, et al., Cell, 1989, 58, 423 e Desrosiers, AIDS Res. Human Retroviruses, 1992, 8, 411. No entanto, análises adicionais revelaram que defeitos no gene acessório, resultam em disfunção grave ou atraso na replicação virai in vitro (Gabudza, et al., J. Virol., 1992, 66, 6489 e Gibbs, et al., AIDS Res. Human Retroviruses, 1994, 10, 343) e in vivo (Aldrovandi, et al., J. Virol., 1996, 70, 1505). Têm sido relatados genes acessórios nativos deficientes in 6 vivo, e podem ser um produto final de uma resposta imunitária eficaz do hospedeiro. Os genes acessórios são por isso presentemente considerados como determinantes da virulência do virus. Trono, Cell, 1995, 82, 189. Contêm poucos "pontos quentes", e podem ser menos susceptiveis a mutações que conduzem à produção de variantes de "escape" do virus, realçando a sua importância no ciclo de vida virai. Além disso, os produtos de proteína destes genes são imunogénicos in vivo. Como grupo, representam vinte por cento dos alvos imunitários anti-virais possíveis. Ameisen, et al., Int. Conf. AIDS, 1989, 5, 533 e Lamhamedi-Cherradi, et al., AIDS, 1992, 6, 1249. A sua imunogenicidade e baixa mutagenicidade funcional, combinam-se para tornar os genes acessórios elementos atractivos na concepção de futuras terapias imunitárias anti-virais. No entanto, a produção de imunogénios de genes acessórios, coloca complicações imunológicas e patogénicas específicas para a concepção de uma vacina virai, devido ao papel dos produtos de proteínas dos genes acessórios como determinantes da virulência do vírus. Uma potencial vacina genética com base num gene acessório, teria de ser acessível à resposta imunitária do hospedeiro contra os produtos do gene acessório virai nativo, sem aumentar a replicação virai. Por conseguinte, um objectivo importante é a concepção de uma vacina genética anti-VIH segura e eficaz, que inclua o gene acessório vif (factor de infecciosidade do virião) como parte de um imunogénio genético multi-componente. 0 gene vif codifica uma proteína virai tardia (vif) de 23 kDa de um transcripto de 5 kb, dependente de rev, cortado isoladamente. Arya et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA, 1986, 83, 2209, Garrett, et al., J. Virol., 1991, 65, 1653, Schwartz, et al., Virol., 1991, 183, 677, e Sodroski, et al., Science, 1986, 231, 1549. Vif é altamente conservado entre os isolados do VIH-1, e está presente noutros lentivírus, tais como o vírus da imunodeficiência 7 felina (VIF), vírus da imunodeficiência bovina (VIB), vírus Visna, VIH-2 e VIS. Myers, et al., Human Retrovir. AIDS, 1991 e Shackett, et al., Virol., 1994, 204, 860 . Análises anteriores de variação genética de vif in vivo, mostraram que a maioria das sequências vif são quadros de leitura intactos, e a presença de vif intacto não tem uma correlação com o estado da doença. Sova, et al., J. Virol., 1995, 69, 2557 e Wieland et al., Virol., 1994, 203, 43. No entanto, análises sequenciais de uma região contendo genes vif, vpr, vpu, tat e rev de um progressor a longo prazo infectado pelo VIH-1, revelou a presença de mutações de inactivação em 64% dos clones. Michael, et al., J. Virol., 1995, 69, 4228. Sujeitos infectados pelo VIH-1 mostraram transportar anticorpos que reconhecem a proteína vif recombinante (Kan et al., Science, 1986, 231, 1553, Schwander, et al., J. Med Virol., 1992, 36, 142, e Wieland et al., AIDS Res. Human Retrovir., 1991, 7, 861), sugerindo que a proteína é expressa, e é imunogénica durante a infecção natural (Volsky, et al., Curr. Topics Micro. Immunol., 1995, 193, 157). AEGiS-AIDS Weekly: cobertura da conferência: genes acessórios melhoram a vacina Apollon de ADN de VIH, 23 de Junho de 199 7, divulga que uma vacina de ADN nú que codifica versões atenuadas de genes acessórios do VIH-1, tais incluindo respostas humorais e celulares suscitadas por vif em estudos com animais.

Devido à capacidade de vif de activar a replicação virai em trans, foi utilizada na presente invenção uma concepção de uma vacina genética atenuada, semelhante às utilizadas na produção de vacinas derivadas de componentes tóxicos, virais, bacterianos ou parasitários. Foi analisada a variação de sequência e potencial imunogénico presente em genes vif derivados de sujeitos infectados pelo VIH-1. Foram seleccionadas variantes genéticas prototípicas, e foi estudada em animais a capacidade desses clones para induzir respostas imunitárias humorais e celulares. Foram também funcionalmente caracterizadas as variantes genéticas vif seleccionadas através de ensaios de transcomplementação, utilizando células infectadas com um clone de VIH-1 deficiente em vif. Estão demonstrados na indução de respostas imunitárias capazes de destruir o patogéneo nativo, clones vif atenuados, não funcionais,.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção proporciona uma proteína vif isolada, atenuada, não funcional, compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5. A invenção também proporciona uma molécula de ácido nucleico isolada, compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica a proteína vif atenuada, não funcional, da invenção. A invenção também proporciona uma composição farmacêutica, compreendendo uma proteína da invenção num transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável. A invenção também proporciona uma composição farmacêutica, compreendendo uma molécula de ácido nucleico da invenção num transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável. A invenção também proporciona um vector de expressão recombinante, compreendendo uma molécula de ácido nucleico da invenção. A invenção também proporciona uma célula hospedeira, compreendendo um vector de expressão recombinante, compreendendo uma molécula de ácido nucleico da invenção. A invenção também proporciona um anticorpo purificado, dirigido especificamente contra a proteína vif atenuada, não funcional, da invenção. A invenção também proporciona uma molécula de ácido nucleico da invenção para uso na imunização de um mamífero contra um vírus, através da administração da molécula de ácido nucleico a células do mamífero referido, em que a 9 molécula de ácido nucleico referida é expressa em tais células. A invenção também proporciona um plasmideo, compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica para uma proteína vif isolada, atenuada, não funcional, da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A figura 1 mostra uma comparação das sequências de aminoácidos deduzidas de vif derivadas de mães transmissoras e não transmissoras com clones moleculares do VIH-1 bem caracterizados PNL43, SF-2 e Zr6. T-#, clones do sujeito transmissor, N-#, clones do sujeito não transmissor, —, identidade com a sequência de consenso (Con, SEQ ID NO: 1), . ., representa lacuna, *, um codão de paragem. A figura 2 mostra um 10% de SDS-PAGE de imunoprecipitados. Expressão de clones vif do VIH-1 derivados de mães transmissoras e não transmissoras. Foram utilizados plasmídeos de expressão para Vif para transcrição/tradução acoplada in vitro, de acordo com as instruções do fabricante (Promega). A imunoprecipitação das proteínas traduzidas in vitro foi realizada com anti-soro vif, tal como aqui descrito. A designação dos clones vif é indicada no topo. Os números dos clones designados com T-** e N-** são derivados das mães transmissoras e não transmissoras, respectivamente. pCVif é o plasmideo de expressão de vif do VIH-1sf2·

As figuras 3A e 3B mostram os resultados de um ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) de respostas do anticorpo anti-vif em ratinhos, após imunização com um constructo de ADN expressando vif. O soro de ratinho foi diluído em tampão de bloqueio a uma diluição de 1:500, e testado como aqui descrito. Na figura 3A, os ratinhos foram imunizados com 50 μρ de ADN. Na figura 3B, os ratinhos foram imunizados com 100 μρ de ADN por injecção. 10 A Figura 4 mostra os resultados de um ensaio de libertação de crómio, em que a lise de alvos murinos (p815) que expressam a proteína vif por esplenócitos de ratinhos imunizados com constructos de expressão de vif. As células p815 (1 x 105/ml) foram infectadas com vaccinia expressando vif (VV:gag), e incubadas durante 16 horas para expressar a proteína Vif. As células alvo foram marcadas com 51Cr durante 1-2 horas, e usadas para incubar os esplenócitos estimulados durante 6 horas. Foi calculada a lise específica (%) de acordo com a fórmula aqui descrita.

As figuras 5A, 5B, 5C e 5D mostram os resultados de um ensaio de libertação de crómio, em que a lise de células HeLa CD4+/Dd infectadas com VIH-1 clínico isolado de esplenócitos de ratinhos imunizados com a cassete de expressão vif. As células HeLa CD4+/Dd (106) foram infectadas com células livres do isolado clínico do VIH-1, seguido por uma incubação de uma semana para permitir que as células infectassem e expressassem proteínas virais. Uma semana após a infecção, as células alvo foram marcadas com 51Cr durante 1-2 horas, e usadas para incubar os esplenócitos estimulados durante 6 horas. Foi calculada a lise específica (%) de acordo com a fórmula aqui descrita. A figura 6 mostra os resultados de um ensaio de proliferação, mostrando activação e resposta proliferativa das células T ao Vif recombinante. O Vif recombinante (10 μρ/ml) foi plaqueado em cada poço para estimular a proliferação de células T. A lectina PHA (10 μρ/ιηΐ) foi usada como um controlo positivo do estimulador policlonal. O índice de estimulação foi calculado como o nível de radioactividade detectada das células estimuladas com a proteína específica, dividido pelo nível detectado das células nos meios. As faixas la e lb são de ratinhos imunizados com 50 e 100 μρ de pCVif, as faixas 2a e 2b são de ratinhos imunizados com 50 e 100 μρ do clone T-35, as faixas 2a e 2b são de ratinhos imunizados com 50 e 100 μρ 11 do clone N-15.

As figuras 7A-7F mostram as sequências de aminoácidos das proteínas vif atenuadas, não funcionais, preferidas, da presente invenção.

As figuras 8A-8E mostram as sequências de nucleotídeos das proteínas vif atenuadas, não funcionais, preferidas, da presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Um dos principais objectivos da investigação do SIDA é o desenvolvimento de uma vacina contra o vírus VIH-1. Uma vacina eficaz deve suscitar uma resposta humoral forte junto com uma resposta CTL eficiente e ampla. Esta tarefa é complicada devido à heterogeneidade genética do vírus VIH-1. A transcriptase reversa (RT) do VIH-1 é propensa a erro e carece da capacidade de correcção de leitura, o que resulta numa taxa de mutação de 10“4 por ciclo, por genoma. Dougherty et al., J. Virol., 62, 2817. A variação de sequência do genoma do VIH-1 tem sido observada em vírus isolados de diferentes indivíduos, bem como em vírus isolado de uma única pessoa, em pontos de tempo diferentes. Fisher, et al., Nature, 1988, 334, 444 e Meyerhans, et al., Cell, 1989, 58, 901. Com base numa grande quantidade de dados de análise de sequências, é evidente que os genes estruturais env, gag e pol são o alvo principal para mutações que levam a vírus com variantes de escape em pacientes, por alteração da neutralização do anticorpo e/ou epítopos de CTL. Pircher, et al., Nature, 1990, 346, 629, Reitz, et al., Cell, 1988, 54, 57, e Wolfs, et al., Virol., 1991, 185, 195. Apesar disso, experiências anteriores indicaram que os genes estruturais e enzimáticos do VIH-1, podem ser usados com sucesso como vacinas com base em ácido nucleico em diferentes modelos animais (Wang, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1993, 90, 4156, e Wang, et al., AIDS, 1995, 9 (Suppl A) S159), e começaram estudos profilácticos bem como terapêuticos para vacinas de ADN. A presente 12 invenção é dirigida para o desenvolvimento de vif, um gene acessório do VIH-1, como uma cassete de imunogénio. Quando usado em conjunto com outros genes do VIH-1 pode ser induzida uma ampla resposta imunitária contra todos os componentes virais, mimetizando assim muitos aspectos das respostas imunitárias induzidas por uma vacina viva atenuada.

Na presente invenção, observou-se a indução de respostas imunitárias humorais e celulares específicas de vif em ratinhos, correlacionadas directamente com a concentração de ADN injectado e do número de impulsos. Foram observados resultados semelhantes em ensaios de proliferação de células T e de CTL, o gue demonstra que os genes vif são imunogénicos in vivo. 0 Vif é conhecido por se apresentar em forma solúvel e associado a membrana. Gonçalves, et al., J. Virol., 1994, 68, 704. Embora os anticorpos anti-vif e as respostas de CTL específicas de vif tenham sido mostrados em pacientes VIH-1 positivos, ainda não foram definidos epítopos envolvidos na apresentação de vif ao sistema imunológico. Lamhamedi-Cherradi, et al. , AIDS, 1992, 6, 1249. Não é claro nestes estudos, como vif se torna exposto ao sistema imunitário humoral. A diferente resposta imunitária observada nos clones da presente invenção, sugere que as mutações em T-35, N-15 e pCVif podem estar associadas com alterações no anticorpo/respostas CTL. É significativo notar que algumas das mutações pontuais presentes em todos os clones derivados de T ou N, indicam que estas mutações podem ser responsáveis pela diferença na complementação e/ou respostas imunitárias observadas. Análises mutacionais adicionais de vif ajudam a resolver responder as regiões envolvidas na complementação. Locais propostos de actividade de vif incluem, a síntese de ADN virai, síntese e transporte de gpl20, e processamento de gag. Borman, et al., J. Virol., 1995, 69, 2058, Sakai, 13 et al., J. Virol., 1993, 67, 1663, e Von Schwedler, et al., J. Virol., 1993, 67, 4945. Experiências de transcomplementação com pró-virus VIH-1 deficiente em vif, e linhas celulares VIH-1 do tipo selvagem expressando vif, indicam que vif actua numa fase tardia na replicação/maturação do vírus, e que a transcomplementação de vif ocorre ao longo de estirpes de VIH-1. Blanc et al., Virol., 1993, 193, 186 e Hevey, et al., Virus Res., 1994, 33, 269. Experiências anteriores demonstraram que os soros do sujeito não transmissor (Nl) contêm um título elevado de anticorpo contra a proteína do envelope e vírus não replicante, enquanto que os soros do paciente transmissor (TI) contêm títulos muito baixos de anticorpos contra as proteínas do envelope e vírus altamente replicante. Velpandi, et al., DNA Cell Biol., 1996, 15, 571. Estes resultados correlacionam-se com os resultados de transcomplementação observados na presente invenção. A presente invenção refere-se a moléculas de ácidos nucleicos isoladas, compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína vif atenuada, não funcional. Tal como aqui utilizado, o termo "proteína vif atenuada, não funcional" pretende referir-se a proteínas vif que não têm, ou têm reduzida, função de infecciosidade de virião em comparação com o vif tipo selvagem. Em algumas realizações da invenção, as moléculas de ácido nucleico codificam uma proteína vif atenuada, não funcional, em que a sequência de nucleotídeos compreende deleções, adições, uma(s) mutação(ões) pontual (is), substituições múltiplas, ou introdução de um codão de paragem para originar uma proteína encurtada. Em realizações preferidas da invenção, as moléculas de ácido nucleico isoladas da invenção codificam uma proteína vif, compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5. Noutras realizações preferidas da invenção, as moléculas de ácido nucleico isoladas codificam uma proteína vif, e compreendem uma sequência de 14 nucleotídeos da SEQ ID NO: 28.

As moléculas de ácido nucleico da invenção podem ser obtidas de pacientes infectados com o virus da imunodeficiência humana, tal como descrito em seguida nos exemplos. Alternativamente, as moléculas de ácido nucleico da invenção podem ser preparadas utilizando a sequência de nucleotídeos vif do tipo selvagem. 0 plasmídeo de expressão de vif, pCVif, contém o gene vif do clone molecular do VIH-1 bem caracterizado, pHXB2, sob o controlo do promotor precoce imediato do citomegalovírus (CMV), dentro do plasmídeo, pRc/CMV (Invitrogen, San Diego, CA), como descrito em Nagashunmugam, et al., DNA Cell Biol., 1996, 15, 353. Esta molécula de ácido nucleico pode ser usada para preparar moléculas de ácido nucleico adicionais, que codificam proteínas vif atenuadas, não funcionais.

Podem ser usados um número de métodos para conceber mutações específicas em moléculas de ácido nucleico do tipo selvagem, para produzir moléculas de ácido nucleico que codificam proteínas vif atenuadas, não funcionais. Por exemplo, a mutagénese mediada por oligonucleotídeos é comummente usada para adicionar, eliminar ou substituir nucleotídeos num segmento de ADN, cuja sequência é conhecida. Tais métodos são ensinados em por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual, Segunda Ed. Cold Spring Harbor Press (1989), páginas 15.51 a 15.73. Resumidamente, o protocolo de mutagénese mediada por oligonucleotídeos envolve as seguintes etapas: 1) clonagem de um fragmento de ADN adequado, tal como a sequência de nucleotídeos de vif do plasmídeo de expressão pCVif, num vector de bacteriófago M13, 2) preparação de ADN de cadeia simples do bacteriófago M13 recombinante, 3) concepção e síntese de oligonucleotídeos mutagénicos, 4) hibridação dos oligonucleotídeos mutagénicos ao ADN alvo, 5) extensão do oligonucleotídeo hibridado com polimerase de ADN, 6) transfecção de bactérias susceptíveis, 7) triagem 15 de placas de bacteriófago para os portadores da mutação desejada, 8) preparação de ADN de cadeia simples do bacteriófago recombinante mutado, 9) confirmação por seguenciação de que o ADN mutado do bacteriófago M13 transporta a mutação desejada e nenhuma outra mutação, 10) recuperação do fragmento de ADN mutado da forma replicativa de cadeia dupla do bacteriófago M13 recombinante, e 11) substituição do fragmento mutado pelo segmento correspondente de ADN do tipo selvagem no vector de expressão desejado. A concepção e síntese dos oligonucleotídeos mutagénicos, que são adaptados para a mutação desejada na molécula de ácido nucleico que codifica vif, é descrita em detalhe em por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual, Segunda Ed. Cold Spring Harbor Press (1989), páginas 15.54 a 15.56. Por exemplo, para substituir, adicionar ou eliminar um único nucleotídeo na sequência de nucleotídeos vif do tipo selvagem, são preparados oligonucleotídeos de cerca de 17-19 nucleotídeos de comprimento, que transportam o nucleotídeo mal emparelhado no centro, ou em uma das duas posições de nucleotídeos imediatamente 3' do centro. Para substituir, adicionar, ou eliminar, dois ou mais nucleotídeos contíguos na sequência de nucleotídeos vif do tipo selvagem, são preparados oligonucleotídeos de cerca de 25 ou mais nucleotídeos de comprimento. Estes oligonucleotídeos compreendem cerca de 12 a 15 nucleotídeos perfeitamente emparelhados, em qualquer um dos lados da região central desemparelhada, que contém os nucleotídeos adicionados ou substituídos, ou representa a porção do ADN do tipo selvagem que está desemparelhada. Usando a estratégia descrita anteriormente, um perito na tecnologia pode preparar moléculas de ácidos nucleicos possuindo deleções, adições, substituições, ou codões de paragem prematuros, que codificam proteínas vif atenuadas, não funcionais. Os 16 procedimentos de mutagénese mediada por oligonucleotídeos, são amplamente conhecidos dos peritos na tecnologia.

Alternativamente, as moléculas de ácido nucleico da invenção podem ser preparadas usando sintetizadores de ADN, através de uma metodologia padrão de ADN. Um perito na tecnologia compreende prontamente que o código genético é degenerado, e portanto, poderia preparar numerosas sequências de ADN que codificam para a mesma proteina. Além disso, um perito na tecnologia compreende facilmente que os aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos, de modo que são feitas substituições conservativas. Por conseguinte, um perito na tecnologia pode preparar moléculas de ácido nucleico da invenção que codificam proteínas vif atenuadas, não funcionais.

Moléculas de ácidos nucleicos preferidas da invenção codificam proteínas vif atenuadas, não funcionais, possuindo as sequências de aminoácidos (a.a.) e de nucleotídeos (nt.) (representadas por números específicos de SEQ ID SEQ) na tabela 1. As sequências específicas de aminoácidos são apresentadas na figura 1 e figuras 7A-7F. As sequências específicas de nucleotídeos são mostradas nas figuras 8A-8E.

Tabela 1

Proteína Vif SEQ ID NO: Proteína Vif SEQ ID NO: 3. ♦ 3. · nt. a. a. nt. N13 4 27 T3 14 37 N15 5 28 T 4 15 38 NI 7 6 29 T35 16 39 N22 7 30 T37 17 40 N23 8 31 T38 18 41 N24 9 32 T39 19 42 N26 10 33 T40 20 43 N27 11 34 T42 21 44 N29 12 35 T43 22 45 N3 0 13 36 T44 23 46 17 A presente invenção também se refere a vectores ou vectores de expressão recombinantes que compreendem uma sequência de nucleotideos, que codifica uma proteína vif atenuada, não funcional. Tal como aqui utilizado, o termo "vector de expressão recombinante" pretende referir-se a um plasmídeo, fago, partícula virai ou outro vector, que quando introduzido num hospedeiro apropriado, contém os elementos genéticos necessários para dirigir a expressão da sequência de codificação que codifica uma proteína vif atenuada, não funcional. Em algumas realizações da invenção, o vector ou vector de expressão recombinante codifica uma proteína vif atenuada, não funcional, em que a sequência de nucleotídeos compreende deleções, adições, mutação(ões) pontual(is), substituições múltiplas, ou a introdução de um codão de paragem para originar uma proteína encurtada. Em realizações preferidas da invenção, os vectores ou vectores de expressão recombinantes da invenção, codificam uma proteína vif compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5. Noutras realizações preferidas da invenção, os vectores ou vectores de expressão recombinantes da invenção, compreendem uma molécula de ácido nucleico que codifica para uma proteína vif, que compreende uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 28.

Alguém com conhecimentos correntes na tecnologia pode isolar a molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína vif atenuada, não funcional, e inseri-la num vector de expressão, utilizando técnicas convencionais e materiais de partida facilmente disponíveis. A sequência de codificação está operativamente ligada às sequências reguladoras necessárias. Os vectores de expressão são bem conhecidos e prontamente disponíveis. Exemplos de vectores de expressão incluem plasmídeos, fagos, vectores virais e outras moléculas de ácidos nucleicos, ou moléculas de ácido nucleico contendo veículos úteis para transformar células 18 hospedeiras, e facilitar a expressão de sequências de codificação. Os vectores de expressão recombinantes da invenção são úteis para a transformação de hospedeiros, que expressam uma proteína vif atenuada, não funcional. A presente invenção também se refere a uma célula hospedeira que compreende o vector de expressão recombinante, que inclui uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína vif atenuada, não funcional. Em algumas realizações da invenção, a célula hospedeira compreende o vector ou o vector de expressão recombinante, que codifica uma proteína vif atenuada, não funcional, em que a sequência de nucleotídeos compreende deleções, adições, mutação(ões) pontual(is), substituições múltiplas, ou a introdução de um codão de paragem para originar uma proteína encurtada. Em realizações preferidas da invenção, as células hospedeiras compreendem vectores ou vectores de expressão recombinantes, que codificam uma proteína vif compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5. Noutras realizações preferidas da invenção, a célula hospedeira compreende vectores que compreendem uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 28. Células hospedeiras para utilização em sistemas de expressão recombinante bem conhecidos para a produção de proteínas, são bem conhecidas e prontamente disponíveis. 0 sistema procariótico mais utilizado continua a ser E. coli, embora outros sistemas como B. subtilis e Pseudomonas também são úteis. As sequências de controlo adequadas para sistemas procarióticos incluem tanto promotores constitutivos como induzíveis, incluindo o promotor lac, o promotor trp, promotores híbridos tais como o promotor tac, o promotor lambda do fago Pl. Em geral, as proteínas estranhas podem ser produzidas nestes hospedeiros, quer como proteínas de fusão ou maduras. Quando as sequências desejadas são produzidas como proteínas maduras, a sequência produzida pode ser precedida 19 por uma metionina, que não é necessariamente eficazmente removida. Consequentemente, os péptidos e proteínas aqui reivindicados podem ser precedidos por uma Met de terminal N, quando produzidos em bactérias. Além disso, os constructos podem ser feitos, em que a sequência codificante para o péptido é precedida por um péptido de sinal operacional, o que resulta na secreção da proteína. Quando produzida desta maneira nos hospedeiros procarióticos, a sequência de sinal é removida durante a secreção. Exemplos de células hospedeiras procarióticas incluem, células de bactérias tais como E. coli e células de levedura, tais como S. cerevisiae.

Uma grande variedade de hospedeiros eucarióticos estão também agora disponíveis, para a produção de proteínas estranhas recombinantes. Como nas bactérias, os hospedeiros eucarióticos podem ser transformados com sistemas de expressão que produzem a proteína desejada directamente, mas mais frequentemente são fornecidas sequências de sinal para efectuar a secreção da proteína. Os sistemas eucarióticos têm a vantagem adicional de serem capazes de processar intrões, que podem ocorrer nas sequências genómicas que codificam para proteínas de organismos superiores. Os sistemas eucarióticos também proporcionam uma variedade de mecanismos de processamento que resultam em por exemplo, glicosilação, amidação do terminal carboxi, oxidação ou derivatização de certos resíduos de aminoácidos, controlo conformacional, e assim por diante. Os sistemas eucarióticos comummente utilizados incluem, mas não estão limitadas a, leveduras, células de fungos, células de insectos, células de mamíferos, células de aves e células de plantas superiores. Em realizações preferidas da invenção são usadas como células hospedeiras, células de insecto tais como S. frugiperda, células de cultura de tecido de mamífero não humano, células de ovário de hamster Chinês (CHO) e células de cultura de tecido humano tais 20 como as células HeLa. Estão disponíveis promotores adequados que são compatíveis e operacionais para utilizar em cada um destes tipos de hospedeiros, bem como o são as sequências de terminação e potenciadores, como por exemplo o promotor poliedro de baculovírus. Tal como referido anteriormente, os promotores podem ser tanto constitutivos como induzíveis. Por exemplo, em sistemas de mamífero, o promotor metalotioneno de ratinho pode ser induzido pela adição de iões de metais pesados.

Em algumas realizações, por exemplo, alguém com conhecimentos correntes na tecnologia pode, utilizando técnicas bem conhecidas, inserir moléculas de ADN num vector de expressão disponível comercialmente, para utilização em sistemas de expressão bem conhecidos. Por exemplo, o plasmídeo pSE420 disponível comercialmente (Invitrogen, São Diego, CA) pode ser utilizado para a produção de uma proteína vif atenuada, não funcional, em E. coli. O plasmídeo pYES2 disponível comercialmente (Invitrogen, São Diego, CA) pode por exemplo ser utilizado para produção, em estirpes de levedura de S. cerevisiae. O sistema de expressão de baculovírus completo MAXBAC™ disponível comercialmente (Invitrogen, São Diego, CA) pode por exemplo ser utilizado para produção em células de insecto. O plasmídeo pcDNA 1 ou pcDNA3 disponível comercialmente (Invitrogen, São Diego, CA) pode por exemplo ser utilizado para produção em células de mamífero, tais como células de ovário de hamster Chinês. Alguém com conhecimentos correntes na tecnologia pode utilizar estes vectores de expressão e sistemas comerciais ou outros, para produzir uma proteína vif atenuada, não funcional, por meio de técnicas de rotina e materiais de partida facilmente disponíveis. Veja-se por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual, Segunda Ed. Cold Spring Harbor Press (1989).

Alguém com conhecimentos correntes na tecnologia pode 21 utilizar outros vectores de expressão e sistemas disponíveis comercialmente, ou produzir vectores utilizando métodos bem conhecidos e materiais de partida facilmente disponíveis. Os sistemas de expressão contendo as sequências de controlo necessárias, tais como promotores e sinais de poliadenilação, e de preferência potenciadores, estão facilmente disponíveis e são conhecidos na tecnologia, para uma variedade de hospedeiros. Veja-se por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual, Segunda Ed. Cold Spring Harbor Press (1989) .

Exemplos de constructos genéticos incluem a sequência codificante da proteína vif atenuada, não funcional, ligada operativamente a um promotor que é funcional na linha celular para a qual os constructos são transfectados. Exemplos de promotores constitutivos incluem promotores do citomegalovírus ou SV40. Exemplos de promotores induzíveis incluem o vírus da leucemia mamária de rato ou promotores metalotioneína. Aqueles com conhecimentos correntes na tecnologia, podem facilmente produzir constructos genéticos úteis para a transfecção de células com ADN que codifica uma proteína vif atenuada, não funcional, a partir de materiais iniciais facilmente disponíveis. Tais constructos de genes são úteis para a produção de uma proteína vif atenuada, não funcional.

As moléculas de ácido nucleico que codificam uma proteína vif atenuada, não funcional, podem ser entregues às células utilizando qualquer um de uma variedade de componentes de entrega, tais como vectores de expressão virai recombinantes, ou outros meios de entrega adequados, de modo a afectar a sua introdução e expressão em células hospedeiras compatíveis. Em geral, os vectores virais podem ser vírus de ADN, tais como adenovírus recombinante e vírus vaccinia recombinante, ou vírus de ARN tais como retrovírus recombinante. Outros vectores recombinantes incluem procariótas recombinantes, que podem infectar células e 22 expressar genes recombinantes. Além de vectores recombinantes, são também contemplados outros componentes de entrega, tais como o encapsulamento em lipossomas, a transfecção mediada por transferrina e outros meios mediados por receptor. A invenção destina-se a incluir essas outras formas de vectores de expressão e outros meios de entrega adequados, que servem funções equivalentes, e que se tornam conhecidos na tecnologia subsequentemente em anexo.

Numa realização preferida da presente invenção, o ADN é entregue a células hospedeiras competentes através de um adenovirus. Um perito na tecnologia entenderia facilmente esta técnica de entrega de ADN a uma célula hospedeira por esses meios. Embora a invenção inclua de preferência adenovirus, a invenção destina-se a incluir qualquer vírus que sirva funções equivalentes.

Numa outra realização preferida da presente invenção, o ARN é entregue a células hospedeiras competentes através de um retrovírus. Um perito na tecnologia entenderia facilmente esta técnica de entrega de ARN a uma célula hospedeira por esses meios. Qualquer retrovírus que sirva para expressar a proteína codificada pelo ARN, destina-se a ser incluído na presente invenção.

Numa outra realização preferida da presente invenção, o ácido nucleico é entregue através de meios do receptor de folato. A sequência de ácido nucleico a ser entregue a uma célula hospedeira é ligada a polilisina, e o complexo é entregue à célula de tumor por meios do receptor de folato. A patente US 5.108.921 emitida a 28 de Abril de 1992 a Low et al., descreve tais componentes de entrega. A presente invenção também se refere a proteínas vif atenuadas, não funcionais, purificadas. As proteínas vif da invenção têm deleções, adições, mutação(ões) pontual(is), substituições múltiplas, ou a introdução de codões de paragem para originar péptidos que são atenuados e não 23 funcionais, em comparação com a proteina vif do tipo selvagem. Em realizações preferidas da invenção, as proteínas vif atenuadas, não funcionais, da invenção compreendem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5. Noutras realizações preferidas da invenção, as proteínas vif atenuadas, não funcionais, da invenção consistem de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5. As proteínas vif da invenção podem ser preparadas por meios de rotina, utilizando materiais de partida facilmente disponíveis, como descrito anteriormente.

As indicações para a construção de sistemas de expressão adequados para hospedeiros desejados, são conhecidas dos peritos na tecnologia, e estão descritas anteriormente. Para a produção recombinante da proteína, o ADN que a codifica é adequadamente ligado ao vector de expressão escolhido, e em seguida utilizado para transformar o hospedeiro compatível, que é então cultivado e mantido sob condições em que ocorre a expressão do gene estranho. As proteínas da presente invenção assim produzidas, são recuperadas da cultura, quer lisando as células ou a partir do meio de cultura, conforme apropriado e conhecido dos peritos na tecnologia. Alguém com conhecimentos correntes na tecnologia pode, utilizando técnicas bem conhecidas, isolar uma proteína vif atenuada, não funcional, que é produzida utilizando tais sistemas de expressão. Métodos de purificação de uma proteína vif atenuada, não funcional, de fontes naturais utilizando anticorpos que se ligam especificamente a uma proteína vif atenuada, não funcional, podem ser igualmente aplicados à purificação de uma proteína vif atenuada, não funcional, produzida por metodologia de ADN recombinante.

Além de produzir estas proteínas através de técnicas recombinantes, podem também ser empregues sintetizadores automatizados de aminoácidos para produzir a proteína vpr. Deve ainda notar-se que se as proteínas aqui são feitas sinteticamente, pode também ser feita a substituição por aminoácidos que não são codificados pelo gene. Resíduos alternativos incluem por exemplo, os aminoácidos ω com fórmula H2N (CH2) nCOOH, em que n é 2-6. Estes são aminoácidos neutros, não polares, como são a sarcosina (Sar), t-butilalanina (t-BuAla), t-butilglicina (t-BuGly), isoleucina N-metilo (N-Melle) e norleucina (Nleu). A fenilglicina, por exemplo, pode ser substituída por Trp, Tyr ou Phe, um aminoácido aromático neutro, a citrulina (Cit) e o sulfóxido de metionina (MSO) são polares mas neutros, a alanina ciclohexilo (Cha) é neutra e não polar, o ácido cisteico (Cya) é acídico e a ornitina (Orn) é básica. A conformação que confere propriedades dos resíduos de prolina pode ser obtida, se um ou mais destes é substituído por hidroxiprolina (Hyp).

As composições farmacêuticas de acordo com a invenção compreendem um transportador farmaceuticamente aceitável, em combinação com uma proteína vif atenuada, não funcional, ou com uma molécula de ácido nucleico da invenção que codifica a mesma. Em realizações preferidas da invenção a composição farmacêutica compreende um vector de expressão recombinante, que codifica uma proteína vif compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5.

Noutras realizações preferidas da invenção, a composição farmacêutica compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína vif, que compreende uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 28. As formulações farmacêuticas são bem conhecidas, e as composições farmacêuticas compreendendo os compostos da invenção podem ser formuladas rotineiramente por alguém com conhecimentos correntes na tecnologia. Transportadores farmacêuticos apropriados estão descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, um texto de referência padrão neste campo. A presente invenção também se relaciona com uma 25 composição farmacêutica injectável, que compreende um transportador farmaceuticamente aceitável e um composto da presente invenção. 0 composto da invenção é de preferência estéril, e combinado com um transportador farmacêutico estéril. Em algumas realizações, por exemplo, os compostos da invenção podem ser formulados como uma solução, suspensão, emulsão, ou pó liofilizado, em associação com um veiculo farmaceuticamente aceitável. Exemplos de tais veículos são água, solução salina, solução de Ringer, solução de dextrose, albumina de soro humano a 5%. Podem também ser usados lipossomas e veículos não aquosos, tais como óleos fixos. 0 veículo ou pó liofilizado pode conter aditivos que mantêm a isotonicidade (por exemplo, cloreto de sódio, manitol), e a estabilidade química (por exemplo, tampões e conservantes). A formulação é esterilizada por técnicas vulgarmente utilizadas.

Uma composição injectável pode compreender um composto da invenção num agente de diluição tal como por exemplo, água estéril, electrólitos/dextrose, óleos gordos de origem vegetal, ésteres gordos, ou polióis, tais como propileno glicol e polietileno glicol. 0 injectável tem de ser estéril e isento de pirogénios.

As formulações para administração tópica podem incluir adesivos transdérmicos, unguentos, loções, cremes, géis, gotas, supositórios, sprays, líquidos e pós. Podem ser necessários ou desejáveis, transportadores farmacêuticos convencionais, bases aquosas, em pó, ou oleosas, espessantes e semelhantes. As composições para administração oral incluem pós ou grânulos, suspensões ou soluções em água ou meios não aquosos, cápsulas, saquetas ou comprimidos. Podem ser desejáveis espessantes, agentes aromatizantes, diluentes, emulsionantes, auxiliares de dispersão ou aglutinantes. As composições para administração parentérica, intratecal ou intraventricular podem incluir soluções aquosas estéreis, que também podem 26 conter tampões, diluentes e outros aditivos adequados.

As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas por qualquer meio, que permita que o agente activo alcance o local de acção do agente no corpo de um mamífero. As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas de várias maneiras, dependendo de se é desejado tratamento local ou sistémico, e da área a ser tratada. A administração pode ser tópica (incluindo oftálmica, vaginal, rectal, nasal, transdérmica), oral ou parentérica. A administração parentérica inclui injecção intravenosa, subcutânea, intraperitoneal ou intramuscular, administração pulmonar, por exemplo, por inalação ou insuflação, ou administração por via intratecal ou intraventricular. A dosagem varia dependendo de factores conhecidos tais como, as características farmacodinâmicas do agente particular e seu modo e via de administração, a saúde, idade, e peso do receptor, a natureza e extensão dos sintomas, o tipo de tratamento concomitante, a frequência do tratamento, e o efeito desejado. A formulação de composições terapêuticas e a sua administração subsequente, é acreditada estar dentro dos conhecimentos dos peritos na tecnologia.

De acordo com a invenção, a composição farmacêutica que compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína vif da invenção, pode ser administrada directamente no indivíduo, ou entregue ex vivo em células removidas do indivíduo que são reimplantadas após a administração. Por qualquer via, o material genético é introduzido nas células que estão presentes no corpo do indivíduo. Vias de administração preferidas incluem injecção intramuscular, intraperitoneal, intradérmica e subcutânea. Alternativamente, a composição farmacêutica pode ser introduzida por vários meios nas células que são removidas do indivíduo. Tais meios incluem por exemplo, 27 transfecção, electroporação e bombardeamento de microprojécteis. Depois de a molécula de ácido nucleico ser absorvida pelas células, estas são reimplantadas no indivíduo.

As composições farmacêuticas de acordo com este aspecto da presente invenção, compreendem cerca de 0,1 a cerca de 1000 microgramas de ADN. Em algumas realizações preferidas, as composições farmacêuticas contêm cerca de 1 a cerca de 500 microgramas de ADN. Em algumas realizações preferidas, as composições farmacêuticas contêm cerca de 25 a cerca de 250 microgramas de ADN. Mais preferencialmente, as composições farmacêuticas contêm cerca de 100 microgramas de ADN.

As composições farmacêuticas de acordo com este aspecto da presente invenção, são formuladas de acordo com o modo de administração a ser utilizado. Alguém com conhecimentos correntes na tecnologia, pode facilmente formular uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína vif da invenção. Nos casos em que a injecção intramuscular é o modo de administração escolhido, é usada uma formulação isotónica. Geralmente, os aditivos para a isotonicidade podem incluir, cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol e lactose. Podem ser utilizadas soluções isotónicas, tais como solução salina tamponada com fosfato.

Os estabilizadores incluem gelatina e albumina.

Estão a ser desenvolvidos como uma nova geração de vacinas, agentes farmacêuticos baseados em ADN. A terapêutica de ADN são tipicamente plasmídeos que contêm uma ou mais vacinas de ADN, são tipicamente plasmídeos que contêm um ou mais genes de um patogéneo específico ou célula indesejável. Uma vez injectada, a sequência codificante da vacina de ADN é expressa no paciente ou vacinado como produtos de proteína, e é induzida uma resposta imunitária contra o produto de proteína. São descritos exemplos de protocolos para a entrega de ADN que podem ser adaptados para uso com a 28 presente invenção na patente US N° 5.593.972 emitida a 14 de Janeiro de 1997 a Weiner, patente US N° 5.589.466 emitida a 14 de Dezembro de 1996 a Felgner et al., patente US N° 4.945.050 emitida a 31 de Julho de 1990 a Sanford et al., patente US N° 5.036.006 emitida a 30 de Julho de 1991 a Sanford et al., publicação PCT número de série WO 90/11092, publicação PCT número de série WO 93/17706, publicação PCT número de série WO 93/23552, e publicação PCT número de série WO 94/16737.

Em realizações preferidas da invenção, as composições farmacêuticas que compreendem moléculas de ácido nucleico, compreendendo uma sequência de nucleotideos que codifica uma proteína vif atenuada, não funcional, são administradas a um mamífero pelos métodos descritos anteriormente, a fim de induzir uma resposta imunitária humoral e/ou celular à proteína vif. Noutras realizações da invenção, as composições farmacêuticas da invenção podem ser co-administradas com compostos adicionais. Tais compostos adicionais incluem por exemplo, diferentes proteínas virais ou moléculas de ácidos nucleicos, que codificam uma proteína virai diferente. As diferentes proteínas virais incluem por exemplo, gag, pol, env, vpr, vpu e tat, e semelhantes. Tais respostas imunitárias provocadas são protectoras contra VIH ou vírus animais relacionados. A presente invenção é também dirigida a anticorpos dirigidos contra uma proteína vif atenuada, não funcional. Tal como aqui utilizado, o termo "anticorpo" destina-se a referir anticorpos completos, intactos, e fragmentos Fab e fragmentos F(ab)2 daí. Anticorpos completos, intactos, incluem anticorpos monoclonais tais como anticorpos monoclonais de murino, anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados. Em algumas realizações, os anticorpos ligam-se especificamente a um epítopo de vif ou de vif atenuada, não funcional. Os anticorpos que se ligam a um epítopo são úteis para isolar e purificar essa proteína, tanto a partir 29 de fontes naturais ou de sistemas de expressão recombinantes, utilizando técnicas bem conhecidas tais como cromatografia de afinidade. Tais anticorpos são úteis para detectar a presença desta proteína numa amostra, e para determinar se as células expressam a proteína.

Os hibridomas que produzem anticorpos que se ligam à proteína vif, e os próprios anticorpos, são úteis para o isolamento e purificação de vif e de vif atenuada, não funcional, e complexos de proteínas que incluem vif ou vif atenuada, não funcional. Além disso, os anticorpos podem ser inibidores específicos da actividade de vif. Os anticorpos que se ligam especif icamente a vif, ou vif atenuada, não funcional, podem ser utilizados para purificar a proteína a partir de fontes naturais, utilizando técnicas bem conhecidas e materiais de partida facilmente disponíveis. Tais anticorpos podem também ser usados para purificar a proteína, a partir de material presente quando se produz a proteína por metodologia de ADN recombinante. A produção de anticorpos e as estruturas de proteínas de anticorpos completos, intactos, fragmentos Fab e fragmentos F(ab)2, e a organização das sequências genéticas que codificam tais moléculas são bem conhecidas, e estão descritas por exemplo em Harlow, E. e D. Lane (1988)

Antibodies: A Laboratory manual, Cold Spring Harbor

Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. Resumidamente, por exemplo, é injectada em ratinhos vif ou vif atenuada, não funcional, ou um seu fragmento imunogénico. 0 baço do ratinho é removido, as células do baço são isoladas e fundidas com células de ratinho imortalizadas. As células híbridas, ou hibridomas, são cultivadas, e são seleccionadas as células que segregam anticorpos. Os anticorpos são analisados, e se se verificar que se ligam especificamente a vif ou vif atenuada, não funcional, o hibridoma que os produz é cultivado para produzir um 30 fornecimento contínuo de anticorpos. A presente invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos, que não se destinam a ser de qualquer forma limitativos.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Pacientes

Foram utilizados na presente invenção vírus de uma mãe transmissora VIH-1 positiva (Tl), e uma mãe não transmissora VIH-1 positiva (Nl). Linfócitos de sangue periférico (PBL) obtidos durante o terceiro trimestre do sujeito, foram fornecidos pelo estudo de coorte materno-infantil, ramo de epidemiologia virai, NCI (Rockville, MD). Foi realizado um exame de seguimento aos sujeitos e aos seus descendentes, a fim de determinar o estado da transmissão.

Exemplo 2: Isolamento do VIH-1

Foram co-cultivados linfócitos primários infectados, com linfócitos de dadores normais estimulados com PHA, durante 2 semanas. A produção do vírus foi monitorizada por: 1) medição dos níveis intracelulares de transcriptase reversa (RT) do VIH-1 (Velpandi, et al., J. Virol. Meth., 1990, 29, 291) e 2) medição da quantidade de antigénio p24 do VIH-1 libertado para o meio, utilizando um kit de antigénio p24 (Coulter Corporation) usado de acordo com as orientações do fabricante.

Exemplo 3: Preparação do ADN e amplificação por PCR

Foi preparado ADN de peso molecular elevado (genómico) a partir de PBLs infectadas, e amplificado por meio da tecnologia de PCR tal como descrito em Velpandi, et al., J. Viol. Meth., 1990, 29, 291. Resumidamente, a mistura de PCR continha 5 a 10 μρ de ADN genómico, KC1 50 mM, MgCl2 2,5 mM, Tris/HCl 10 mM (pH 8,0), dNTPs 800 μΜ, 2,5 unidades de polimerase Taq, 20 pmol de iniciadores oligonucleotídeos e água duplamente desionizada (dd^O) , num volume final de 100 μΐ. As temperaturas de reacção e os tempos de ciclos 31 foram: 94 °C-desnaturação (1 minuto), 55 °C-emparelhamento (1,5 minutos) e 72 °C-extensão (2 minutos) . 0 ciclo foi repetido 35 vezes. As sequências dos iniciadores são as seguintes: Vif(+) 5'-GAAAGCTTATGGAAAACAGATGGCAG-3' (5046- 5065) (SEQ ID NO: 2), e Vif(-) 5'-GCAAAGCTTTCATTGTATGGCTC-3' (5609-5626) (SEQ ID NO: 3). Os iniciadores foram marcados com um local de restrição HindIII (em negrito) para fins de clonagem.

Exemplo 4: Clonagem e sequenciação O produto amplificado por PCR foi utilizado para a clonagem, como descrito em Velpandi, et al., DNA Cell Biol., 1996, 15, 571. O ADN plasmidico positivo para o gene vif foi purificado por mini preparações (Qiagen, CA) , e quantificado por espectrofotometria na preparação para a sequenciação da inserção. Foram realizadas reacções de sequenciação utilizando um sequenciador automatizado ABT e reacções Dye Desoxi (Applied Biosystems, Foster City, CA). Exemplo 5: Análise da sequência

Foram construídos alinhamentos de sequência usando o pacote de software Genetics Computer Group Sequence

Analysis, adquirido através do sistema VAX da Unidade de Informática da Escola Médica da Universidade da

Pensilvânia. Foram realizadas comparações de homologia de sequências de aminoácidos por programas de alinhamento de sequências.

Exemplo 6: Construção do pró-virus deficiente em Vif

Foi usado ADN pró-viral de VIH-1, pZr6, para construir um mutante de deleção vif, como descrito em Nagashunmugam, et al., DNA Cell Biol., 1996, 15, 353. O clone pró-viral

resultante, p911, contém uma deleção de 80 aminoácidos no gene vif, que não afecta o quadro de leitura 3'. Resumidamente, o ADN pró-viral do VIH-1 pZr6 foi derivado de linfócitos primários de sangue infectados com VIHzr6, como descrito em Srinivasan, et al., Gene, 1987, 52, 71-82. Foi introduzida uma deleção em pZr6 para preparar p911. O 32 mutante foi construído de modo a não interferir com o gene pol a montante, ou com o gene vpr a jusante. 0 plasmídeo pZr6 contém dois locais Ndel no gene vif nas posições de nucleotídeos 476 e 716. Srinivasan, et al., Gene, 1987, 52, 71-82. 0 fragmento Ndel (477-716) foi eliminado do pZr6 e as extremidades foram re-ligadas para construir p911, um mutante no quadro de leitura que tem 80 aminoácidos eliminados na região central da proteína vif.

Exemplo 7: Construção dos vectores de expressão Vif O plasmídeo de expressão de vif, pCVif, contém o gene vif do bem caracterizado clone molecular do VIH-1, pHXB2, sob o controlo do promotor precoce imediato do citomegalovírus (CMV), no interior do plasmídeo pRc/CMV (Invitrogen, São Diego, CA), como descrito em Nagashunmugam, et al., DNA Cell Biol., 1996, 15, 353. Os genes vif das amostras maternas foram clonados no vector de expressão de Invitrogen, pCDNA3, sob o controlo do promotor do CMV. Os quadros de leitura vif foram verificados através de análise de sequência, utilizando o iniciador direito, T7, e o iniciador reverso, SP6. Resumidamente, para a construção de um vector de expressão de vif (pCVif), foi clonado um fragmento de 1,1 kb de Eco RI-Eco Rl de pHxB2 (coordenadas de mapa 4.647-5.742, Ratner, et al., Nature, 1985, 313, 277-284), sob o controlo do promotor precoce imediato do citomegalovírus, no plasmídeo pCDNA3 obtido de Invitrogen. Este fragmento também contém sequências flanqueadoras de partes dos genes pol e vpr, que não são transcripcionalmente activas, como mostrado num constructo semelhante em Blanc, et al., (Virology, 1993, 193, 186-192) .

Exemplo 8: Tradução in vitro de Vif

Foram realizadas transcrição e tradução in vitro em 1 μq do constructo de expressão de ADN de vif, utilizando a polimerase de ARN T7, de acordo com as instruções do fabricante (Promega, Madison, WI). Foram combinados cinco 33 (5) μΐ dos produtos de reacção da traduçao in vitro com 500 μΐ de tampao do ensaio de radioimunoprecipitaçao, e imunoprecipitados com o anti-soro anti-vif de coelho, como descrito. Mahalingam, et al., Virol., 1995, 214, 647. Exemplo 9: Células

Foram cultivadas células Rabdomiosarcoma (RD), obtidas da Colecção Americana de Culturas Tipo (ATCC), numa monocamada a 37 °C em 5% de CO2, em meio Dulbecco modified Eagle suplementado com 10% de soro bovino fetal, 1% de penicilina, 1% de estreptomicina e 1% de L-glutamina. Linhas de células linfociticas obtidas de ATCC foram mantidas como culturas em suspensão em meio RPMI 1640, suplementado com 10% de soro bovino fetal, penicilina (100 U/ml) e L-glutamina (540 μg/ml), a 37 °C com 5% de CO2, PBLs estimulados com fitohemaglutinina (10 μ/ml) foram mantidas em meio RPMI 1640, contendo 10% de factor de crescimento de células T.

Exemplo 10: Imunização de ratinhos com os constructos Vif

Para as experiências de imunização em ratinhos, foram usados 3 constructos vif diferentes. Os clones vif seleccionados foram T-35 (do transmissor), N-15 (do não transmissor) e pCVif (gene vif do VIH-1SF_2) · Foi utilizado o vector de ADN pCDNA3 como controlo negativo. A fim de aumentar a absorção de ADN, injectaram-se os músculos quadriceps de ratinhos BALB/c com 100 μΐ de bupivacaina a 0,25%, 48 horas antes da injecção de ADN. Foram injectados cinquenta (50) ou 100 μρ de cada plasmideo de expressão de vif, num volume final de 100 μΐ em cada um de 4 ratinhos. Os animais receberam reforços três vezes com intervalos de duas semanas.

Exemplo 11: Ligação ELISA do soro de ratinho à proteína rvif

Realizou-se ELISA em soro de ratinho, tal como descrito em Wang, et al., AIDS, 1995, 9 (Suppl A), S15-9.

Resumidamente, placas de ELISA foram revestidas com a 34 proteína vif recombinante (rvif) na concentração de 100 ng/poço para os ensaios de ligação. Os soros de ratinho foram diluídos (1:100 e 1:500) em tampão de bloqueio, marcados com IgG anti-ratinho conjugada com peroxidase de rábano (HRP), e detectados pelo substrato TMBlue. A ligação não específica e a ligação dos soros pré-sangramento foram subtraídas da ligação específica dos soros de animais injectados de ADN.

Exemplo 12: Ensaio CTL usando vaccinia expressando vif

Os ratinhos injectados com ADN foram sacrificados 7 semanas após a primeira imunização, e os seus baços foram removidos para os ensaios de CTL e proliferação de células T, tal como descrito em Wang, et al., DNA Cell Biol., 1993, 12, 799. Resumidamente, foram utilizadas como células alvo, células P815 infectadas com vaccinia expressando vif (VV:gag fornecida gentilmente pelo Programa de Referência e Reagente de SIDA do NIH). Foram adicionados dez (10) μϋί de Na2Cr04 (51Cr, 534 mCi/mg, Dupont Co. ) a 1 x 106/ml de células alvo, que foram subsequentemente incubadas durante 2 horas à temperatura ambiente. As células foram então lavadas 3 vezes com meio isento de soro, e diluídas até um volume de 1 x 105 células/ml em RPMI 1640/soro de vitelo a 10%. As células efectoras do baço foram lavadas uma vez, ressuspendidas, e diluídas até uma concentração de 1 x 107 células/ml de meio RPMI. Foram feitas diluições seriadas 1:2 a partir desta solução stock de células (5 x 106, 2,5 x 106 e 1,25 x 106 células/ml). Foram aliquotados cem (100) μΐ destas soluções de células efectoras para uma placa de microtitulação de fundo plano de 96 poços. Foram adicionados cem (100 ) μΐ da solução de células alvo a cada poço. As razões resultantes de efector para células alvo foram 100:1, 50:1, 25:1 e 12,5:1. A fim de determinar a libertação espontânea ou máxima de crómio, respectivamente, as células alvo foram misturadas com 100 μΐ de meio por si só ou 1% de Triton-X. As células efectoras e alvo foram 35 então incubadas a 37 °C numa incubadora de C02 a 5% durante 5 horas. Foi removida de cada poço uma aliquota de 100 μΐ de sobrenadante, e a quantidade de libertação de 51Cr foi medida num contador qama. A fórmula para o cálculo da libertação especifica de CTL está abaixo: 100 x [(libertação experimental-libertação espontânea)/libertação máxima-libertação espontânea)]. Nota: a libertação máxima foi determinada por lise de células alvo em 1% de Triton X-100.

Exemplo 13: Ensaio CTL usando isolados clinicos do VIH-1

Foram infectadas células HeLaCD4+ expressando MHC-I de ratinho, com isolados clinicos do VIH-1, e usadas como células alvo no ensaio de CTL. O ensaio de CTL foi efectuado como descrito em Chada et al., J. Virol., 1993, 67, 3409.

Exemplo 14: Ensaio de proliferação de célula T

Os ensaios foram realizados em triplicado. Os esplenócitos foram isolados como discutido anteriormente, ressuspendidos em RPMI 1640, e diluídos para uma concentração de 3,3 x 106 células/ml. Foi imediatamente adicionada uma aliquota de 150 μΐ a cada poço de uma placa de microtitulação de fundo plano de 96 poços. Foram adicionados cinquenta (50) μΐ de proteína ou peptídeo a cada poço, para concentrações finais de 10,0, 1,0 ou 0,1 mg/ml. As células foram incubadas a 37 °C numa incubadora de C02 a 5% durante 3 dias. Foi adicionado um (1) μCi de timidina tritiada a cada poço, e as células foram incubadas durante a noite sob as mesmas condições. As células foram recolhidas utilizando o colector de células automatizado (Tomtec, Orange, CT) , e a quantidade de timidina tritiada incorporada foi medida num contador beta. A fim de assegurar que as células eram saudáveis, foram utilizados 5 mg/ml de PHA como um estimulador não específico numa amostra de controlo positiva.

Exemplo 15: Transcomplementação de ADN pró-viral deficiente 36 em vif com genes vif de amostras maternas

As células RD (1 x 106) foram co-transfectadas com 10 μς de um clone pró-viral deficiente em vif, p911, e 10 μρ de pCVif, ou plasmideo de expressão de vif dos sujeitos transmissores ou não transmissores, usando lipofectina da Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN). As células co-transf ectadas foram lavadas depois de uma incubação de 8 horas, e ressuspendidas em meio DMEM. O sobrenadante da cultura foi recolhido após uma incubação de 72 horas, centrifugado para remover os detritos celulares, passado através de um filtro de 0,45 μιη, e testado para produção de p24 (Coulter Corporation). Infectaram-se PBMCs (1 x 107) com uma quantidade de vírus equivalente a 100 ng de antigénio p24. As células inoculadas com vírus foram incubadas durante 4-6 horas a 37 °C e CO2 a 5%, lavadas 3 vezes com PBS, e ressuspendidas em 10 ml de RPMI 1640 fresco. Foi recolhida a cada 3 dias uma alíquota do sobrenadante da cultura a fim de quantificar a produção de vírus, através da medição da quantidade de antigénio p24 libertado para o meio.

Exemplo 16: Caracterização de vírus isolados de pacientes

As mães VIH-1 positivas transmissoras e não transmissoras incluídas na presente invenção, foram seleccionadas de um estudo coorte de SIDA. A mãe e a mãe não transmissora são referidas como TI e Nl, respectivamente. O estado clínico dos sujeitos, e as cinéticas de replicação dos seus isolados virais são apresentados na tabela 2. Foram utilizados linfócitos não cultivados de cada sujeito de modo a obter sequências do tipo selvagem, não modificadas por condições de selecção in vitro. Em ensaios de co-cultura de PBMC, as amostras virais de TI replicaram muito bem em doadores PBLs normais, enquanto que as amostras virais de Nl não replicaram nem em linfócitos primários nem macrófagos. 37

Tabela 2

Sujeito Estádio clínico PCR Co-cultura de vírus em PBMC Infecção em linhas celulares CD4 + Transmissor Assintomático + + + + + + + + + Não transmissor Assintomático + + — —

Exemplo 17: Variação de sequência do gene Vif in vivo A fim de investigar a variabilidade genética do gene vif nestes sujeitos, foram sequenciados dez clones de cada sujeito, e alinhados por computador por grau de homologia. As sequências de nucleotideos foram então traduzidas em sequências de proteinas. Foram utilizadas na comparação final sequências de aminoácidos deduzidas, uma vez que nem todas as possibilidades de sequências de nucleotideos resultaram em alterações da sequência de aminoácidos. As sequências de aminoácidos alinhadas destes pacientes são apresentadas na figura 1. Os números de clones com as denominações 'Τ' e 'Ν', representam variantes isoladas de mães transmissoras e não transmissoras, respectivamente. 0 alinhamento de sequências revelou que cada sujeito tinha um conjunto de sequências único e altamente conservado, dentro do seu conjunto de vírus. A maioria das alterações de nucleotideos foram mutações pontuais que geralmente resultavam em substituições, versus duplicações ou inserções, dentro da sequência da proteína. Três clones codificavam proteínas atenuadas. 0 clone T-42 teve uma deleção de 5 aminoácidos na extremidade 3' , devido a um codão de paragem prematuro. 0 clone N-13 teve dois codões de paragem (posições 31 e 41), e o clone T-4 teve um único codão de paragem (posição 77), cada um dos quais foi introduzido dentro de um conjunto de três nucleotideos, mantendo o quadro de leitura intacto a 3' da mutação. 0 38 facto de que a maior parte (17 de 20) dos clones codificam sequências de comprimento completo, sugere que existem poucos genes vif deficientes presentes nos conjuntos virais destes pacientes. É interessante notar que a maioria das mutações pontuais de vif estão presentes na porção 5' do gene, em vez de na região 3'. Foram encontradas diferenças significativas entre os clones nas posições 20, 27, 31, 36, 37, 45, 60, 74, 127, 136, 140 e 150. A fim de determinar a natureza e a variação da sequência do gene vif in vivo, nós clonámos e analisámos variantes de vif presentes em PBMCs não cultivadas de sujeitos VIH-1 positivos. A análise de 20 sequências vif diferentes de dois sujeitos (10 de cada sujeito), revelou que vif é altamente conservado (aproximadamente 90%) dentro de um determinado paciente num determinado ponto do tempo. Embora, Wieland, et al. , (Virol., 1994, 203, 43) tenha relatado que a porção 3' do gene vif é altamente variável, os resultados da presente invenção indicam que a porção 5' (aa 20-85) é mais variável, e a porção 3' é bem conservada. Em apoio dos resultados aqui apresentados, experiências de mutagénese anteriores mostraram que o terminal C de vif (aa 171 a 192) é essencial para a associação estável de vif com membranas. Gonçalves, et al., J. Virol., 1994, 68, 704. Entre as 20 sequências analisadas, apenas dois clones tinham codões de paragem prematuros, o que indica que 90% dos genes vif isolados estavam intactos in vivo. Este resultado, juntamente com dados previamente publicados, sugere que um gene vif completo é essencial para a replicação virai in vivo. Gabudza, et al., J. Virol., 1992, 66, 6489, e Sova et al., J. Virol., 1995, 69, 2557.

As 20 sequências de proteína vif deduzidas destes clones, apresentavam uma conservação de 75% (25% de variação) ao longo do comprimento (192 aa) inteiro. Em particular, dois domínios antigénicos, aa 87-94 (IEWRKKRY) (SEQ ID NO: 24) e aa 172-178 (DRWNKPQ) (SEQ ID NO: 25), 39 reconhecidos por soros VIH-1 positivos (Wieland et al., AIDS Res. Human Retrovir., 1991, 7, 861), são bem conservados em todos os 20 clones. A natureza bem conservada destas duas regiões, pode ser responsável pelas propriedades antigénicas cruzadas exibidas por estes clones. Além disso, uma sequência que é conservada em 34/38 lentivirus vif, SLQYLA (144-149) (SEQ ID NO: 26) (Oberste, et al., Virus Genes, 1992, 6, 95), é também conservada em cada um dos 20 clones vif sequenciados na presente invenção. Em estudos anteriores, a análise de alinhamentos por computador mostrou que os aminoácidos 21 a 30, 103 a 115 e 142 a 150 de vif, são altamente conservados entre o VIH-1, VIH-2 e VIS. Myers, et al., Human Retrovir. AIDS, 1988. No entanto, os clones analisados na presente invenção, foram geralmente sequências conservadas dentro de aa 103-115 e aa 142-150, mas não dentro de aa 21-30. A proteína Vif tem sido caracterizada como uma protease de cisteína, com Cys 114 marcando o seu sítio activo, e His 48 considerado ser importante para a actividade. Guy et al., J. Virol., 1991, 65, 1325. Nas sequências da presente invenção, foram bem conservadas Cys 114, bem como Cys 133 (a única outra cisteína em vif) e His 48. A análise da árvore filogenética (dados não apresentados) encontrou 3 grandes famílias dentro dos 20 clones dos pacientes. Noventa (90%) por cento dos clones derivados de N formaram uma família, e 80% dos clones derivados de T formaram uma família, enquanto os clones restantes, N-30, T-3 e 1-38, exibiram uma maior diversidade e formaram um grupo separado (dados não apresentados). Quando foi realizada a comparação de distância, a variação intra-pacientes entre os clones transmissores foi de 12%, em comparação com uma variação de 10% entre os clones não transmissores. Foi também avaliada a similaridade entre as variantes dos clones dos sujeitos, e os clones moleculares laboratoriais estabelecidos, HIVSF-2f HIVNL43 e HIVzr6. Os 40 isolados de sujeitos partilhavam um maior grau de homologia com outros clones dentro do seu grupo de estado transmissor, do que com qualquer um dos isolados virais mantidos no laboratório. Com base na sua variação de sequência, foram seleccionados 4 clones de cada paciente para experiências preliminares de tradução/imunização (ver abaixo). A análise da árvore filogenética também mostrou que, apesar da variação intra-pacientes, os clones dos sujeitos transmissores e não transmissores agruparam-se separadamente. A transcrição/tradução in vitro de 8 constructos (quatro de cada sujeito) resultou na expressão de uma proteína de 23 KDa, excepto no caso do clone N-13 que tem um codão de paragem prematuro. Isto sugere que as várias mutações presentes nestes constructos de vif, não afectou a cinética de expressão e estabilidade da proteína. Exemplo 18: Expressão de clones de Vif

Foi realizada transcrição/tradução in vitro em 5 clones de cada grupo, a fim de avaliar os seus níveis de expressão de vif. Os resultados são apresentados na fig. 2. Os produtos das reacções de tradução in vitro foram imunoprecipitados com anti-soro de vif, e submetidos a electroforese em gel. Foram usados pró-vírus pCVif (vif de comprimento total da estirpe SF2 de VIH -1) e p911 (mutante de vif) como um controlo positivo e negativo, respectivamente. A tradução in vitro com pCVif e cada um dos plasmídeos de expressão de vif de comprimento total produziu uma proteína de 23 kDa, enquanto que dos clones p911 e N-13 não resultou um produto de proteína de 23 kDa de tamanho, provavelmente devido à presença de codões de paragem prematuros. Foram seleccionados para posterior avaliação dois (2) clones de cada grupo de sujeitos, com base em características serológicas semelhantes (dados não apresentados). Os clones seleccionados de pacientes, como representantes de cada grupo, foram T-35 (de transmissor) e 41 N-15 (de não transmissor) . Cada um destes clones contém mutações características do seu grupo particular, e representam o maior nível de diversidade dentro destes grupos. É interessante notar gue mutações no clone N-15 estão dispersas ao longo do comprimento total do gene, enquanto que mutações no clone T-35 estão agrupadas no extremo 5' do gene.

Exemplo 19: Indução de respostas humorais in vitro

Foram aparentes respostas imunitárias específicas anti-vif em soros recolhidos de ratinhos imunizados com T-35, N-15, e os plasmídeos de expressão pCVif, mas não nos soros de ratinhos imunizados pelo vector pcDNA3 sozinho. A indução de resposta imunitária correlacionou-se com a concentração da injecção de ADN, assim como o número e intervalo de tempo entre reforços. Os soros de 4 ratinhos injectados com 50 ou 100 μρ de ADN de vif, tinham reactividade específica para a proteína vif, quando medido por ELISA (fig. 3) . A indução da resposta humoral foi

dependente da dose e tempo. A injecção de 50 μρ de ADN induziu uma resposta imunitária detectável por ELISA, 15 dias após a primeira injecção. Esta resposta aumentou após reforços subsequentes, atingindo um nível máximo 45 dias após 2 reforços (painel A) . A injecção com 100 μρ de ADN induziu uma resposta que atingiu um nível máximo, apenas 28 dias após um reforço único (painel B). Além disso, a resposta de anticorpos pode ser elevada, 219 dias após as três injecções com um reforço único de ADN (dados não apresentados). 0 nível da resposta de anticorpos variou entre clones vif. Mais importante ainda, o clone não transmissor, N-15, induziu uma resposta serológica maior do que o clone transmissor, 1-38, ou pCVif. Isto sugere que o vif do não transmissor é capaz de induzir uma resposta dependente de células T-B mais eficaz, do que o vif do transmissor, nesta estirpe de ratinhos. 42

Exemplo 20: Indução de respostas celulares in vivo utilizando vaccinia expressando Vif

Quatro ratinhos, cada um imunizado com um dos contructos de vif, receberam um reforço adicional 15 dias após a primeira injecção. Dois ratinhos foram subsequentemente sacrificados, e os seus esplenócitos foram utilizados num ensaio citotóxico de células T (CTL). Foram usadas como células alvo, células p815 infectadas com vaccinia expressando vif. Foi medida a lise não especifica de esplenócitos de ratinhos imunizados com ADN de vif e ingénuos, utilizando como células alvo, células p815 infectadas com vaccinia não expressando vif. A lise alvo especifica é apresentada na fig. 4. O nivel de actividade CTL especifica variou entre os constructos de vif. Os esplenócitos de ratinhos imunizados com o clone pCVif exibiram 45% de lise, a uma razão efector : alvo de 100:1. Os clones T-35 e N-15 exibiram 17 e 12% de lise, respectivamente, na mesma razão. Estes resultados demonstram claramente que a imunização com ADN de vif induz respostas de CTL especificas. As diferenças nos níveis de actividade de CTL induzida pela inoculação do gene vif entre os clones dos vários pacientes, podem ser devidas a mutações dentro dos epitopos CTL expressos pelos alvos da vacina, ou a diferenças na capacidade de resposta imunitária neste haplotipo.

Exemplo 21: Avaliação de respostas celulares in vivo utilizando alvos humanos infectados com vim isolado clinico de VIH-1

A fim de avaliar a capacidade dos clones vif para induzir a lise de alvos infectados viralmente, utilizámos como alvos no ensaio de CTL células HeLa CD4/Dd infectáveis com VIH-1, que expressam tanto o receptor CD4 como o elemento de restrição da classe I de murídeo H-2Dd. Estas células foram infectadas durante 7 dias com um isolado de VIH-1 derivado de um paciente com SIDA sintomático. A 43 figura 5 (A-D) representa os resultados do ensaio de CTL.

Os esplenócitos obtidos de ratinhos injectados com cada um dos constructos de ADN exibiram lise específica de vif. Os clones 1-35, N-15 e pCVif apresentaram-se com 27, 26 e 24% de lise, respectivamente, a uma razão efector : alvo de 50:1. Todos os três clones exibiram 20% de lise a uma razão de 25:1. Isto demonstra que uma resposta imunitária celular contra isolados de VIH-1 nativos, pode ser gerada por meio de vacinação genética com vectores de expressão de vif. Exemplo 22: Indução de proliferação de células T especifica de antigénio

Foram também estudadas, em animais imunizados com ADN, as respostas específicas de proliferação de células T contra a proteína vif do VIH-1. Os linfócitos de ratinhos imunizados com vif demonstraram uma resposta proliferativa significativa contra a proteína rvif. A figura 6 ilustra o índice de proliferação de diferentes contructos de vif versus as concentrações de injecção de ADN. Os resultados mostram que a resposta celular de Th (auxiliares) dependente de MHC de classe II é dependente da dose. Para cada constructo, o índice de estimulação é quase duas vezes maior em ratinhos injectados com 100 μρ de ADN de vif, do que em ratinhos injectados com 50 μρ de ADN de vif. A comparação dos três constructos diferentes de vif também indica que, para cada concentração de injecção, o clone T-35 induz um índice de estimulação maior do que tanto N-15 como pCVif.

Exemplo 23: Transcomplementação de pró-vírus VIH-1 Vif com plasmídeos de expressão de Vif

Como esperado, a transfecção transiente de células RD com ADN pró-viral VIH-1 (vif-) e plasmídeos de expressão de vif, não revelaram quaisquer diferenças na produção de vírus entre derivados de T, derivados de N ou plasmídeos controlo (dados não apresentados). Quaisquer diferenças na função vif seriam demonstradas ao nível da nova infecção. 44

No entanto, quando foi utilizado virus resgatado para infectar linfócitos primários, foi observada uma diferença significativa na patogénese do virus entre derivados de T e N e plasmideos controlo (tabela 3) . 0 clone pró-viral vif negativo (p911) sozinho não foi capaz de infectar PBLs primárias como virus livre de célula. Quando foi utilizado virus transcomplementado (p911 + pCVif) para infectar as PBLs, a infecciosidade foi cinco vezes menor do que a do virus do tipo selvagem. Em contraste, cada um dos clones derivados de T testados foram capazes de resgatar o mutante (vif-) (aproximadamente 100% de controlo positivo de virus). No entanto, nenhum dos clones derivados de N foram capazes de infectar eficientemente PBLs como virus livre de células. Portanto, N-15 e clones derivados de N semelhantes, foram capazes de induzir respostas imunitárias anti-VIH em ratinhos, na ausência de funcionalidade.

Tabela 3

Amostras ADN usado para derivar vírus para infecção Quantidade de p24 libertada (ng/ml) Clone proviral pZrô 101.846 Mutante Vif p911 60 Mutante Vif + pCVif p911 + pCVif 22.679 Mutante Vif + p911 + Tl-40 21.896 clones do p911 + Tl-37 17.230 transmissor p911 + Tl-35 19.470 p911 + 11-38 81.570 Mutante Vif + p911 + Nl-13 520 clones do não p911 + Nl-15 530 transmissor p911 + Nl-17 1.090 p911 + Nl-27 1.277 p911 + Nl-30 715 45 Células RD foram transf ectadas com 10 μρ de pZr6, mutante vif p911, p911 e plasmídeos de expressão de vif de amostras de pacientes diferentes. Foram preparados conjuntos de vírus de sobrenadante colhido 72 horas após a transfecção. O vírus equivalente a 100 ng de antigénio p24 foi subsequentemente utilizado para infectar 10 x 106 PBMCs. A infecção foi monitorizada pela produção de antigénio p24.

Exemplo 24: Observações

Clones derivados de N foram atenuados na sua capacidade para transcomplementar o pró-vírus VIH-1 deficiente em vif. Um dos clones analisados, N-15, era também imunologicamente funcional, e capaz de gerar uma resposta imunitária contra o vírus VIH-1 do tipo selvagem. Um clone não funcional, mas no entanto imunogénico, tal como N-l da presente invenção, poderia ser um componente eficaz de uma vacina genética dirigida contra o VIH-1. Foi mostrado na presente invenção, que vif sozinho pode gerar uma resposta eficaz contra o vírus VIH-1 nativo in vitro. Tais imunogénios poderiam ser úteis num contexto terapêutico, para atingir a resposta imunitária contra vírus nativos expressando vif. Embora seja provável que as variantes de escape possam ocorrer, vírus expressando vif deficientes devido a esta selecção, podem agora exibir cinética de crescimento atenuada in vivo. De uma maneira semelhante, uma vacina profiláctica que inclui vif, poderia servir tanto para limitar o escape virai, como contribuir para reduzir a carga virai durante os eventos de infecção precoces.

LISTA DE SEQUÊNCIA <110> Ayyavoo, Velpandi Nagashunmugam, Thandavarayan Weiner, David B.

Universidade da Pensilvânia 46

<12 0> CASSETES DE IMUNIZAÇÃO ADN VIF ATENUADAS PARA VACINAS GENÉTICAS <130> UPAP-0 2 63 <140> INCLUSO <141> 1998-09-18 <16 0 > 46 <170> Patentln Ver. 2.0

<210> 1 <211> 190 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: nova sequência <40 0> 1 47

Met Gin Asn Arg Trp Gin Vai Met Ile Vai Trp Gin Vai Asp Arg Mct I S 10 15

Arg Ile Arg Thr Trp Asn Ser Leu Vai Lys His His Met Tyr Vai Ser 20 25 30

Lys Lys Ala Aig Trp Phe Tyr Arg His Hts Tyr Glu Ser Pro His Pro 35 40 4S

Lys Vat Ser Ser Glu Vai His Ile Pro Leu Gly Asp Ala Arg Leu Glu 50 55 60

Thr Thr Thr Tyr Trp Gly Leu His Gly Glu Arg Asp Trp His Leu Gly 65 70 75 80

Gin Gly Vai Ser Ile Glu Trp Arg Lys Arg Arg Tyr Ser Thr Gin Vai 85 90 95

Asp Pro Asp Leu Ala Asp Gin Leu ile His Leu Tyr Tyr Phe Asp Cys 100 105 110

Phe Ser Glu Ser Ala líe Arg Lys Ala Ile Leu Gly Tyr Arg Vai Ser 115 120 125

Pro Arg Cys Glu Tyr Gin Ala Gly His Asn Lys Vai Gly Ser Leu Gin 130 135 140

Tyr Leu Ala Leu Ala Ala Leu Ile Thr Pro Lys Lys Ile Lys Pro Pro 145 150 155 160

Leu Pro Ser Vai Arg Lys Lai Thr Glu Âsp Arg Trp Asn Lys Pro Gin 165 170 175

Lys Thr Lys Gly His Arg Gly Ser His Thr Met Asn Gly His 180 185 190

<210> 2 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> 48 48 sequência <223> Descrição da sequência artificial: nova <400> 2 gaaagcttat ggaaaacaga tggcag 26

<210> 3 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> sequência <223> Descrição da sequência artificial: nova <400> 3 gcaaagcttt cattgtatgg ctc 23

<210> 4 <211> 190 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> sequência <223> Descrição da sequência artificial: nova <400> 4 49

Met Glu Asn Arg Trp Gin Vai Ile lie Vai Trp Gin Vai Asp Arg Met 1 5 10 15

Arg He Arg Thr Trp Asn Ser Leu Vai Lys Tyr Hís Met Tyr Ser Lys 20 25 30

Lys Ala Arg Glu Trp Phe Tyr Hís His Tyr Gin Ser Pro Hís Pro Lys 35 40 45

Vai Ser Ser Glu Vai Hís Be Pro Leu Glu Asp Ala Arg Leu Glu Ile 50 55 60

Thr Ser Phe Trp Gly Leu His Thr Gly Glu Arg Asp Trp His Leu Gly 65 70 75 S0

Gin Gly Vai Ser He Gíu Trp Arg Lys Arg Arg Tyr Ser Thr His Vai 85 90 95

Asp Pro Asp Leu Ala Asp Gin Leu ile His Leu Tyr Tyr Phe Asp Cys 100 105 Π0

Phe Ser Glu Ser Ala Ile Arg Lys Ala Ile Leu Gly His Arg Vai Ser 115 120 125

Pro Arg Cys Glu Tyr Arg Ala Gly His Ser Lys Vai Gly Ser Leu Gin 130 135 140

Tyr Leu Ala Ile Ala Ala Leu Ile Thr Pio Lys Lys Ile Lys Pro Pro 145 . 150 155 160

Leu Ala Ser Vai Arg Lys Leu Thr Glu Asp Arg Trp Asn Lys Pro Gín 165 170 175

Lys Thr Lys Gly His Arg Gly Ser His Thr Met Asn Gly Hís 180 185 190

<210> 5 <211> 192 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: nova sequência <400> 5 50

Met Glu Asn Arg Trp Gin Vai Met He Vai Trp Gin Vai Asp Arg Met 1 5 10 15

Arg He Arg Thr Trp Asn Ser Leu Vai Lys Tyr His Met Tyr Arg Ser 20 25 30

Lys Lys Ala Arg Glu Trp Phe Tyr Arg His His Tyr Gin Ser Pro His 35 40 45

Pro Arg Vai Ser Ser Glu Vai His lie Pro Leu Glu Asp Ala Arg Leu 50 55 60

Glu He Thr Thr Tyr Tip Gly Leu His Thr Gly Glu Arg Asp Trp His 65 70 75 80

Leu Gly Gin Gly Vai Ser He Glu Trp Arg Lys Arg Arg Tyr Ser Thr 85 90 95

Gin Vai Asp Pro Asp Leu Ala Asp Gin Leu He His Leu Tyr Tyr Phe 100 105 no

Asp Cys Phe Ser Glu Ser Ala Ile Arg Lys Ala He Leu Gly His Arg 115 120 125

Vai Ser Pro Arg Cys Giu Tyr Arg Ala Gly His Ser Lys Vai Gly Ser 130 135 140

Leu Gin Tyr Leu Ala He Ala Ala Leu He Thr Pro Lys Lys He Lys 145 150 155 160

Pro Pro Leu Pro Ser Vai Arg Lys Leu Thr Glu Asp Arg Tip Asn Lys 165 170 175

Pro Gin Lys Thr Lys Gly His Arg Gly Ser His Thr Met Asn Gly His 180 185 190

<210> 6 <211> 192 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: nova sequência 51 <400> 6

Met Glu Asn Arg Τηρ Gin Vai Met lie Vai Trp Gin Vai Asp Arg Met 15 10 15

Arg lie Arg Thr Trp Asn Ser Leu Vai Lys Tyr His Met Tyr Arg Ser 20 25 30

Lys Lys Ala Aig Giu Trp Pbe Tyr Arg His His Tyr Gin Ser Pm His 35 40 45

Pro Lys Vai Ser Ser Ghi Vai His Ile Pro Leu Glu Asp Ala Arg Leu 50 55 60

Glu Thr Thr Thr Tyr Trp Gly Leu His Thr G3y Glu Arg Asp Trp His 65 70 75 80

Leu Gly Gin Gly Vai Ser Ile Glu Trp Arg Lys Arg Arg Tyr Ser Thr 85 90 95 .

Gin Vai Asp Pro Asp Leu Ala Asp Gin Leu Ile His Leu Tyr Tyr Phe 100 _ 105 110

Asp Cys Phe Ser Glu Ser Ala Ile Arg Lys Ala He Leu Gly Hís Arg 115 120 125

Vai Ser Pro Arg Cys Glu Tyr Arg Ala Gly His Ser Lys Vai Gly Ser 130 135 140

Leu Gin Tyr Leu Ala Ile Ala Ala Leu Ile Thr Pro Lys Lys Ile Lys 145 150 155 160

Pro Pro Leu Pro Ser Vai Arg Lys Leu Thr Glu Asp Arg Trp Asn Lys 165 170 175

Pro Gin Lys Thr Lys Gly His Arg Gly Ser His Thr Met Asn Gly His 180 185 190

<210> 7 <211> 192 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 52 <223> Descrição da sequência artificial: nova sequência <400> 7

Met Glu Asn Arg Trp Gin Va! Met fle Vai Trp Gin Vai Asp Arg Met 15 10 15

Arg lie Arg Thr Trp Asn Ser Leu Vai Thr Tyr His Met Tyr Arg Ser 20 25 30

Gin Lys Ala Arg Glu Trp Phe Asn Arg His His Tyr His Ser Pro His 35 40 45

Pro Lys Vai Ser Ser Glu Vai His He Pro Leu Glu Asp Ala Arg Leu 50 55 60

Ala He Pro Thr Phe Trp Gly Leu His Thr Gly Glu Arg Asp Trp His 65 70 75 80

Leu Gly Gin Gly Vai Ser He Glu Trp Arg Lys Arg Arg Tyr Ser Thr 85 '90 95

Gin Vai Asp Pro Asp Leu Ala Asp Gin Leu lie His Leu Tyr Tyr Phe 100 105 110

Asp Cys Phe Ser Glu Ser Ala He Arg Lys Ala Ile Leu Gly His Arg 115 120 12S

Vai Ser Pro Arg Cys Glu Tyr Arg Ala Gly His Ser Lys Vai Gly Ser 130 135 140

Leu Gin Tyr Leu Àla De Ala Ala Leu De Thr Pro Lys Lys He Lys 145 150 155 160

Pro Pro Leu Pro Ser Vai Arg Lys Leu Thr Glu Asp Arg Trp Asn Lys 165 170 175

Pro Gin Lys Thr Lys Gly His Arg Gly Ser His Thr Met Asn Gly His 180 185 190

<210> 8 <211> 192 <212> PRT <213> Sequência artificial 53 <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: nova sequência <400> 8

Met Giu Asn Arg Trp Gin Vai Met 11 e Vai Trp Gin Vai Asp Arg Met 15 10 15

Arg Ile Arg Tlir Trp Asn Ser Leu Vai Lys Tyr His Met Tyr Arg Ser 20 25 30

Lys Lys Ala Arg Glu Trp Phe Tyr Arg His Hís Tyr Gin Ser Pro His 35 40 45

Pro Lys Vai Ser Ser Glu Vai His Ile Pro Leu Glu Asp Ala Arg Leu 50 55 60

Glu Ile Tlir Thr Tyr Trp Gly Leu His Thr Giy Glu Arg Asp Trp His 65 70 75 80

Leu Giy Gin Giy Vai Ser Ile Glu Trp Arg Lys Arg Arg Tyr Ser Thr 85 90 95

His Vai Asp Pro Asp Leu Ala Asp His Leu Ile His Leu Cys Tyr Phe 100 105 110

Asp Cys Leu Ser Glu Ser Ala lie Arg Lys Ala Ile Leu Gly His Arg 115 120 125

Vai Ser Pro Arg Cys Glu Tyr Arg Ala Giy His Ser Lys Vai Gly Ser 130 135 140

Leu Gin Tyr Leu Ala Ile Ala Ala Leu Ile Thr Pro Lys Lys Ile Lys 145 150 155 160

Pro Pro Leu Pro Ser Vai Arg Lys Leu Thr Glu Asp Arg Trp Asn Lys 165 170 175

Pro Gin Lys Thr Lys Gly His Aig Gly Ser His Thr Met Asn Gly His 180 185 190

<210> 9 <211> 192 <212> PRT 54 <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: nova sequência <400> 9

Met GIu Asn Arg Trp Gin Vai Met lie Vai Trp Gin Vai Asp Arg Met 35 10 15

Arg lie Arg Thr Trp Asn Ser Leu Vai Lys Tyr His Met Tyr Arg Ser 20 25 30

Lys Lys Ala Arg Glu Trp Phe Tyr Arg His His Tyr Gin Ser Pro His 35 40 45

Pro Lys Vai Ser Ser Glu Vai His He Pro Leu Glu Asp Ala Arg Leu 50 55 50

Vai Ile Thr Thr Tyr Trp Gly Leu His Thr Gly Glu Arg Asp Trp His 65 70 75 80

Leu Gly Gin Gly Vai Ser Ile Glu Trp Arg Lys Arg Arg Tyr Ser Thr 85 90 95

His Vai Asp Pro Asp Leu Ala Asp Gin Leu Ile His Leu Tyr Tyr Phe 100 105 ' 110

Asp Cys Phe Ser Glu Ser Ala He Arg Lys Ala Ile Leu Gly His Arg 115 120 125

Vaí Ser Pro Arg Cys Glu Tyr Arg Ala Gly His Ser Lys Vai Gly Ser 130 135 140

Leu Gin Tyr Leu Ala Ile Ala Ala Leu He Thr Pro Lys Lys Ile Lys 145 150 155 160

Pro Pro Leu Ala Ser Vai Arg Lys Leu Thr Glu Asp Arg Trp Asn Lys 165 170 175

Pro Gin Lys Thr Lys Gly His Arg Gly Ser His Thr Met Asn Gly His 180 185 190

<210> 10 <211> 192 <212> PRT <213> Sequência artificial 55 <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: nova sequência <40 0> 10

Met Glu Asn Arg Trp Gin Vai Met Ile Vai Trp Gin Vai Asp Arg Met 1 S IO 15

Arg lie Arg Thr Trp Asn Ser Leu Vai Lys Tyr His Met Tyr Arg Ser 20 25 30

Lys Lys Ala Arg Glu Trp Phe Tyr Arg Hís His Tyr Gin Ser Pro His 35 40 45

Pro Lys Vai Ser Ser Glu Vai His Ile Pro Leu Glu Asp Ala Arg Leu 50 55 60

Vai Ile Thr Thr Tyr Trp Gly Leu His Thr Gly Glu Arg Asp Trp His 65 70 75 80

Leu Gly Gin GJy Vai Ser Ile Glu Trp Arg Lys Arg Arg Tyr Ser Thr 85 „ 90 95

Gin Vai Asp Pro Asp Leu Ala Asp Hís Leu Ile His Leu Tyr Tyr Phe 100 105 110

Asp Cys Phe Ser Glu Ser Ala Ile Arg Lys Ala Ile Leu Gly His Arg 115 120 125

Vai Ser Pro Arg Cys Glu Tyr Arg Ala Gly His Ser Lys Vai Gly Ser 130 135 140

Leu Gin Tyr Leu Ala lie Ala Ala Leu Ile Thr Pro Lys Lys Ile Lys 145 150 155 160

Pro Pro Leu Ala Ser Vai Arg Lys Leu Thr Glu Asp Arg Trp Asn Lys 165 170 175

Pro Gin Lys Thr Lys Gly His Arg Gly Ser Hís Thr Met Asn Gly His 180 185 190

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Met Glu Asn Arg Trp Gin Vai Met Ile Vai Trp Gin Vai Asp Aig Met 1 5 10 15

Arg Ile Arg Thr Trp Asn Ser Leu Vai Lys Tyr His Met Tyr Arg Ser 20 25 30

Lys Lys Ala Arg Glu Tip Phe Tyr Arg His His Tyr Gin Ser Pro Hís 35 40 45

Pro Lys Vai Ser Ser Gíu Vai His Ile Pro Leu Glu Asp Ala Arg Leu 50 55 60

Vai Ile Thr Thr Phe Trp Gly Leu His Thr Gly Glu Arg Asp Trp His 65 70 75 80

Leu Gly Gin Gly Vai Ser Ile Glu Trp Arg Lys Arg Arg Tyr Ser Thr 85 90 95

His Vai Asp Pro Asp Leu Ala Asp Gin Leu Ile His Leu Tyr Tyr Phe 100 " ' 105 110

Asp Cys Phe Ser Glu Ser Ala Ile Arg Lys Ala Ile Leu Gly His Arg 1 IS 120 125

Vai Ser Pro Arg Cys Glu Tyr Arg Ala Gly Hís Ser Lys Vai Gly Ser 130 135 140

Leu Gin Tyr Leu Ala Ile Ala Ala Leu Ile Thr Pro Lys Lys lie Lys 145 150 155 160

Pro Pro Leu Pro Ser Vai Arg Lys Leu Thr Glu Asp Arg Trp Asn Lys 165 170 175

Pro Gin Lys Thr Lys Gly His Arg Gly Ser Hís Thr Met Asn Gly Hís 180 185 190 <210> 12 <211> 192 57

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Met Glu Asn Arg Trp Gin Vai Met He Vai Trp Gin Vai Asp Ârg Met 1 5 10 15

Arg Ile Arg Thr Trp Asn Ser Leu Vai Lys Tyr His Met Tyr Arg Ser 20 25 30

Lys Lys Ala Arg Glu Trp Phe Asn Arg Hís His Tyr Hís Arg Pr© His 35 40 45

Pro Lys Vai Ser Ser Glu Vai His Ile Pro Leu Glu Asp Ala Arg Leu 50 55 60

Glu He Thr Thr Phe Trp Gly Leu Hís Thr Gly Glu Arg Asp Trp His 65 70 75 80

Leu Gly Gín Gly Vai Ser Ile Glu Trp Arg Lys Arg Arg Tyr Ser Thr 85 90 95

Gin Vai Asp Pro Asp Leu Ala Asp Gin Leu Ile Hís Leu Tyr Tyr Phe 100 105 110

Asp Cys Phe Ser Gíu Ser Ala Ile Arg Lys Ala Ile Leu Gly His Arg 115 120 125

Vaí Ser Pro Arg Cys Glu Tyr Arg Ala Gly His Ser Lys Vai Gly Ser 130 135 140

Leu Gin Tyr Leu Ala líe Ala Ala Leu Ile Thr Pro Lys Lys Ile Lys 145 150 155 160

Pro Pro Leu Pro Ser Vai Arg Lys Leu Thr Glu Asp Arg Trp Asn Lys 165 170 175

Pro Gin Lys Thr Lys Gly His Arg Gly Ser His Thr Met Asn Gly His 180 185 190 58

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Met Glu Asn Arg Trp Gin Vaf Met Ilc Vai Trp Gin Vai Asp Arg Met 1 5 10 15

Arg lie Arg Thr Trp Asn Ser Leu Vai Lys Tyr His Met Tyr Arg Ser 20 25 30

Gin Lys Glu Arg Glu Trp Phe Asn Arg His His Tyr His Ser Pro His 35 40 ' 45

Pro Glu Gin Ser Ser Thr Ala His lie Pro Leu Vai Asp Gly Arg Leu 50 55 60

Glu Lys lie Ala Vai Trp Ser Leu Asp Thr Gly Glu Gly Vai Trp His 65 70 75 80

Arg Gly His Arg Vai Ser Ile Glu Trp Arg Lys Arg Arg Tyr Ser Thr 85 90 95

Gin Vai Asp Pro Asp Leu Vai Asp Gin Leu He His Leu Tyr Tyr Phe 100 _ 105 110

Asp Cys Phe Ser Glu Ser Ala lie Arg Lys Ala Ile Leu Gly His Arg 115 120 125

Vai Ser Pro Arg Cys Glu Tyr Arg Ala Gly His Ser Lys Vai Gly Ser 130 135 140

Leu Gin Tyr Leu Ala He Ala Ala Leu lie Thr Pro Lys Lys Ile Lys 145 - 150 155 160

Pro Pro Leu Pro Ser Vai Arg Lys Leu Thr Glu Asp Arg Trp Asn Lys 165 170 175

Pro Gin Lys Thr Lys Gly Hts Arg Gly Ser His Thr Met Asn Gly His 180 185 190 59

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Met Glu Asn Arg Trp Gin Vai Met He Vai Τηρ Gin Vai Asp Arg Met 15 10 15

Arg He Arg Thr Trp Asn Ser Leu Vai Lys His His Met Tyr Va! Ser 20 25 30

Lys Lys Ala Lys Lys Trp Phe Tyr Arg His His Tyr Glu Ser Pr© His 35 40 45

Pro Lys Vai Ser Ser Thr Ala His Ite Pro Leu Gly Asp Gly Arg Leu 50 55 60

Glu Lys Thr Ala Vai Trp Ser Leu Gin Ala Gly Asp Gly Vai Trp His 65 70 75 80

Arg Gly His Pro Vai Ser He Glu Trp Arg Lys Arg Arg Tyr Ser Thr 85 9 0 95

Glu Vai Asp Pro Asp Leu Vai Asp Gin Leu He His Leu Tyr Tyr Phe 100 105 110

Asp Cys Phe Ser Glu Ser Ala Ile Arg Lys Ala Ile Leu Gly Tyr Arg 115 120 125

Vai Ser Pro Arg Cys Glu Tyr Gin Ala Gly His Asn Lys Vai Gly Ser 130 135 140

Leu GSn Tyr Leu Àía Leu Ala Ala Leu He Thr Pro Lys Lys lie Lys Í45 150 155 160

Pro Pro Leu Pro Ser Vai Arg Lys Leu Thr Glu Asp Arg Trp Asn Lys 165 170 175

Pro Gin Lys Thr Lys Gly His Arg Gly Ser His Thr Met Asn Gly His 180 185 190

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Met Glu Asn Arg Trp Gin Vai Met Ile Vai Trp Gin Vai Asp Arg Met 1 5 10 15

Arg Ile Arg Ala Trp Asn Ser Leu Vai Lys His His Met Tyr Vai Ser 20 25 30

Lys Lys Ala Arg Thr Trp Phe Ser Arg His His Tyr Giy Ser Pro His 35 40 45

Pro Lys Vai Cys Ser Glu Vai His Ile Pro Leu Gly Asp Ala Arg Leu 50 55 60

Vai Ile Thr Thr Tyr Trp Ser Leu His Ala Gly Glu Asp Trp His Vai 6S 70 75 80

Gly Gin Arg Vai Ser Ile Glu Trp Arg Lys Arg Arg Tyr Ser Thr Gin 85 90 95

Vai Asp Pro Asp Leu Ala Asp Gin Leu líe His Leu Tyr Tyr Phe Asp 100 105 110

Cys Phe Ser Glu Ser Ala Ile Arg Lys Ala Ile Leu Gly Tyr Arg Vai 115 120 125

Ser Pro Arg Cys Glu Tyr Gin Ala Gly His Asn Lys Vai Gly Ser Leu 130 135 140

Gin Tyr Leu Ala Lai Ala Ala Leu Ile Thr Pro Lys Lys Ile Lys Pro 145 150 155 160

PrÔ Leu Pro Ser Vai Arg Lys Leu Thr Glu Asp Arg Trp Asn Lys Pro 165 170 175

Gin Lys Thr Lys Gly His Arg Gly Ser His Thr Met Asn Gly His 180 185 190

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Met Glu Asn Arg Trp Gin Vai Met Ile Vai Trp Gin Vai Asp Arg Met I 5 30 35

Arg He Arg Ala Trp Asn Ser Leu Vai Lys His His Thr Tyr Phe Ser 20 25 30

Lys Lys Ala Lys Lys Trp Phe Tyr Arg Hís His Tyr Gíu Ser Pro His 35 40 45

Pro Asn Vai Ser Ser Glu Vai His He Pro Leu Gly Asp Ala Arg Leu 50 55 60

Vai Thr Thr Pro Tyr Trp Gly Leu His Gly Gly Glu Arg Asp Trp Tyr 65 70 75 80

Leu Ala Gin Gly Vai Ser Ile Glu Trp Arg Lys Arg Arg Tyr Ser Thr 85 90 95 -

Gin Vai Asp Pro Asp Leu Ala Asp Gin Leu Ile Hís Leu Tyr Tyr Phe 100 105 ' 110

Asp Cys Phe Ser Glu Ser Aia Ile Arg Lys Ala Ile Leu Gly Tyr Arg 115 120 125

Va! Ser Pro Arg Cys Glu Tyr Gin Ala Gly Hís Asn Lys Vai Gly Ser 130 135 140

Leu Gin Tyr Leu Ala Leu Ala Ala Leu Ile Thr Pro Lys Lys Ile Lys 145 150 155 160 . Pro Pro Leu Pro Ser Va! Arg Lys Leu Thr Glu Asp Arg Trp Asn Lys 165 170 175

Pro Gin Lys Thr Lys Gly His Arg Gly Ser His Thr Met Asn Gly Hís ISO 185 190 <210> 17 <211> 192 63

<212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: nova sequência <40 0> 17

Met Glu Asa Arg Trp Glu Vai Met ile Vai Trp Glu Vai Asp Arg Met Ϊ 5 10 15

Arg Ile Arg Ala Trp Asn Ser Leu Vâf Lys His His Met Tyr Vai Ser 20 25 3Q

Lys Lys Aía Lys Lys Trp Phe Tyr Arg His His Tyr Glu Ser Pro His 35 40 45

Pro Lys Vai Ser Ser Glu Vaí Hts 11« Pro Leu Gly Asp Aía Arg Leu 50 55 60

Vai Ile Thr Thr Tyr Tip Gly Leu His Ala Gly Glu Arg Asp Trp His 65 70 75 80

Leu Gly Gin Gly Vai Ser lie Glu Trp Arg Lys Arg Arg Tyr Ser Thr 85 _ 90 95

Gin Vaí Asp Pro Asp Leu Ala Asp Gin Leu Ile Hts Leu Tyr Tyr Phe 100 105 HO

Asp Cys Phe Ser Glu Sei Ala Ile Arg Lys Ala lis Leu Gly Tyr Arg 115 120 125

Vai Ser Pro Arg Cys Glu Tyr Gin Aía Gly His Asn Lys Vai Gly Ser 130 135 140

Leu Gin Tyr Leu Ala Leu Ala Ala Leu Ile Thr Pro Lys Lys lie Lys 145 150 J55 160

Pro Pro Leu Pro Ser Vai Arg Lys Leu Thr Glu Asp Arg Trp Asn Lys 165 170 175

Pro Gin Lys Thr Lys Gly Hts Arg Gly Ser His Thr Met Asn Gly His ISO 185 190 64 64 <210> 18 <211> 192 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência <40 0> 17 nova sequência

Met Giu Asn Arg Trp Gin Vai Met lie Vai Trp Gin Vai Asp Arg Met 1 5 10 15

Arg Ile Arg Ala Trp Asa Ser Leu Vai Lys His His Met Tyr Vai Ser 20 25 30

Lys Asn Ala Lys Lys Tip Phe Tyr Arg His His Tyr Asp Ser Pro His 35 40 45

Pro Vai Gin Ser Ser Thr Ala His Ile Pro Leu Gly Asp Gly Arg Leu 50 55 60

Gin Lys He Ala Phe Trp Ser Leu Asp Ala Gly Giu Arg Asp Trp His 65 70 ___ 75 80

Leu Gly Gin Gly Vai Ser Ile Giu Trp Arg Lys Arg Arg Tyr Ser Thr 85 90 95

Gin Vai Asp Pro Asp Leu Ala Asp Gin Leu Ile His Leu Tyr Tyr Phe 100 - - 105 110

Asp Cys Phe Ser Glu Ser Ala lie Arg Lys Ala Ile Leu Gly Tyr Arg 115 120 125

Vai Ser Pro Arg Cys Glu Tyr Gin Ala Gly His Asn Lys Vai Gly Ser 130 135 140

Leu Gin Tyr Leu Áia Leu Ala Ala Leu Ile Thr Pro Lys Lys líe Lys 145 150 155 160

Pro Pro Leu Pro Ser Vai Arg Lys Leu Thr Glu Asp Arg Trp Asn Lys 165 170 175

Pro Gín Lys Thr Lys Gly His Arg Gly Arg His Thr Met Asn Gly His 180 185 190 65

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Met Glu Asn Arg Trp Gin Vai Met !ic Vat Trp Gin Vai Asp Arg Met 15 10 15

Arg Ite Arg Ala Trp Asn Ser Leu Vai Lys His His MetTyr Va! Ser 20 25 30

Lys Lys Ala Lys Lys Trp Phe Tyr Arg His His Tyr Asp Ser Pro His 35 40 45

Pro Lys Vai Ser Ser Glu Va! His lie Pro Leu Gly Asp Ala Arg Leu 50 55 60

Glu Thr Thr Thr Tyr Trp Gly Leu His Ala Gly Glu Arg Asp Trp His 65 70 75 80

Leu Gly Gin Gly Vai Ser lie Glu Trp Arg Lys Arg Arg Tyr Ser Thr 85 90 95

His Vai Asp Pro Asp Leu Ala Asp Gin Leu l!e His Leu Tyr Tyr Phe 100 105 110

Asp Cys Phe Ser Glu Ser Ala Ile Arg Lys Ala lie Leu Gly Tyr Arg 115 120 125'

Vai Ser Pro Arg Cys Glu Tyr Gin Ala Gly His Asn Lys Va! Gly Ser 130 135 140

Leu Gin Tyr Leu Ala Leu Ala Ala Leu lie Thr Pro Lys Lys Ile Lys 145 150 155 160

Pro Pro Leu Pro Ser Vai Arg Lys Leu Thr Glu Asp Arg Trp Asn Lys 165 170 175

Pro Gin Lys Thr Lys Gly His Arg Gly Ser His Thr Met Asn Gly His 180 185 190 66

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Meí Glu Asn Arg Trp Gin Vaí Met Ile Vai Tip Gin Vai Asp Arg Met I 5 10 15

Thr Ile Arg Ala Trp Asn Ser Leu Vai Lys His His Met Tyr Vai Ser 20 25 30

Lys Lys Ala Lys Lys Trp Phe Tyr Arg His His Tyr Glu Ser Pro His 35 40 45

Pro Lys Vai Ser Ser Glu Vai His Ile Pro Leu Giy Asp Ala Arg Leu 50 55 60

Vai Ile Thr Thr Tyr Trp Gly Leu His Ala Giy Glu Arg Asp Trp His 65 70 75 80

Leu Gly Gin Gly Vai Ser Ile Glu Trp Arg Lys Arg Arg Tyr Ser Thr 85 90 95

Gin Vai Asp Pro Asp Leu Ala Asp Gin Leu Thr His Leu Tyr Tyr Phe 100 105 110

Asp Cys Phe Ser Glu Ser Ala Ile Arg Lys Ala Ile Leu Gly Tyr Arg 115 120 125

Vai Ser Pro Arg Cys Glu Tyr Gin Ala Gly His Asn Lys Vai Giy Ser 130 135 140

Leu Gin Tyr Leu Ala Lai Ala Ala Leu Ile Thr Pro Lys Lys lie Lys 145 150 155 160

Pro Pro Leu Pro Ser Vai Arg Lys Leu Thr Glu Asp Arg Trp Asn Lys 165 170 175

Pro Gin Lys Thr Lys Gly His Arg Gly Ser His Thr Met Asn Gly His 180 185 190 <210> 21 <211> 188 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: nova sequência 68 <400> 21

Met Glu As» Arg Trp Gin Vai Met lie Vai Tfp Gin Vai Asp Arg Met 1 5 10 15

Arg lie Arg Ala Trp Asn Ser Leu Vai Lys His Hís Met Tyr Vai Ser 20 25 30

Lys Lys Ala Lys Lys Trp Phe Asn Arg His Hís Tyr Asp Arg Pro His 35 40 45

Pro Lys Vai Ser Ser Glu Vai His He Pro Leu Giy Asp Ala Arg Leu 50 55 60

Glu He Thr Thr Phe Trp Gly Leu His Ala Gly Glu Arg Asp Trp His 65 70 75 80

Leu Gly Gin Arg Vai Ser Ile GJu Trp Arg Lys Arg Arg Tyr Ser Thr 85 90 95

Gin Vai Asp Pro Asp Leu Ala Asp Gin Leu Thr His Leu Tyr Tyr Phe 100 105 110

Asp Cys Phe Ser Glu Ser Ala Ile Arg Lys Ala Ue Leu Gly Tyr Arg 115 120 125

Vai Ser Pro Arg Cys Glu Tyr Gin Ala Gly Hís Asn Lys Vai Gly Ser 130 135 140

Leu Gin Tyr Leu Ala Leu Ala Ala Leu He Thr Pro Lys Lys He Lys 145 ISO 155 160

Pro Pro Leu Pro Ser Vat Arg Lys Leu Thr Glu Asp Arg Trp Asn Lys 165 370 175

Pro Gin Lys Thr Lys Gly Thr Glu Gly Ala Ile Gin 180 185

<210> 22 <211> 192 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 69 <223> Descrição da sequência artificial: nova sequência <400> 22

Met Giu Asn Afg Tip Gtn Vai Met Ile Vai Tip Gin Vai Asp Arg Met 1 5 30 15

Arg Ile Arg Ala Trp Asn Ser Leu Vai Lys His His Met Phe Vai Ser 20 25 30

Lys Lys Ala Lys Lys Trp Phe Tyr Arg His His Tyr Giu Ser Pro His 35 40 45

Pro Lys Vai Ser Ser Glu Vai His Ile Pro Leu G!y Asp Alá Arg Leu 50 55 60

Glu Ile Thr Thr Phe Trp Gly Leu His Ala Gly Glu Arg Asp Trp His 65 70 75 80

Leu Gly Gin Gly Vai Ser Ile Giu Trp Arg Lys Arg Arg Tyr Ser Thr 85 90 95 Gín Vai Asp Pro Asp Leu Ata Asp Gin Leu He His Leu Tyr Tyr Phe 100 105 110

Gly Cys Phe Ser Glu Ser Ala He Arg Lys Ata Ile Leu Gly Tyr Arg 115 120 125

Vat Ser Pro Arg Cys Giu Tyr Gin Ala Giy His Asn Lys Vai Giy Ser 130 135 140

Leu GSn Tyr Leu Gly Leu Aia Ala Leu lie Thr Pro Lys Lys Ile Lys 145 150 155 160

Pro Pro Leu Pro Ser Vat Arg Lys Leu Thr Glu Asp Arg Tip Asn Lys 165 170 175

Pro Gín Lys Thr Lys Gly His Arg Gly Ser His Thr Met Asn Gly His 180 185 190

<210> 23 <211> 192 <212> PRT <213> Sequência artificial 70 <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: nova sequência <400> 23

Met Glu Asn Arg Tip Gin Vai Mel He Vai Trp Gin Vai Asp Arg Mel

1 5 10 IS

Arg íle Arg Ala Trp Asn Ser Leu Vai Lys His His Met Tyr Vai Ser 20 25 30

Lys Lys Ala Lys Lys Trp Phe Tyr Arg His His Tyr Glu Ser Pro His 35 40 45

Pro Gin Vai Ser Ser Glu Vai His lie Pro Leu Gty Asp Ala Arg Leu 50 55 60

Glu lie Thr Thr Tyr Trp Gly Leu His Ala Gly Glu Arg Asp Trp His 65 70 75 80

Leu Gly Gin Gly Vai Ser He Glu Trp Arg Lys Arg Arg Tyr Ser Thr 85 90 ..... 95

Gin Vai Asp Pro Asp Leu Ala Asp Gín Leu lie His Leu Tyr Tyr Phe 100 105 H0

Asp Cys Phe Ser Gíu Ser Ala lie Arg Lys Ala lie Leu Gly Tyr Arg 115 120 125

Va( Ser Pm Arg Cys Glu Tyr Gín Ala Gly His Asn Lys Vai Gly Ser 130 135 140

Leu Gín Tyr Leu Ala Leu Ala Ala Leu He Thr Pro Lys Lys He Lys 145 150 155 160

Pro Pro Leu Pro Ser Vai Arg Lys Leu Thr Glu Asp Arg Trp Asn Lys 165 170 175

Pro Gin Lys Thr Lys Gly His Arg Gly Ser Hís Thr Met Asn Gly His 180 185 190

<210> 24 <211> 8 <212> PRT 71 <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: nova sequência <40 0> 24 He Glu Trp Arg Lys Lys Arg Tyr 1 5 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: nova sequência <400> 25 Asp Arg Trp Asn Lys Fm Gin 1 5 <210> 26 <211> 6 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: nova sequência <400> 26

Ser Leu Gin Tyr Leu Ala 1 5 72

<210> 27 <211> 579 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: nova sequência <400> 27 atggaaaaca gaíggcaggt gattattgtg tggcaggtag acaggatgag gattagaaca 60 tggaacagtt tagtaaaata ccatatgtat tgatcaaaga aagctaggga atggttttat 120 tgaeatcact atcaaagtcc tcatccaaaa gtaagttcag aagtacacat cccactagag 180 gatgctagat tggaaataac atcattttgg ggtctgcaía caggagaaag agactggcat 240 ttgggtcagg gagtcíccat agaatggagg aaaaggagat atagcacaca cgtcgaccct 300 gatctagcag accaactaat tcatctgtat tattttgatt gtttttcaga atctgctata 360 agaaaagcca tattaggaca cagagttagt cctaggtgíg aatalcgagc aggacatagc 420 aaggt&ggat eactacagta cttggcaata gcagcattaa taacaccaaa aaagataaag 480 ccacctttgg cgagtgtcag gaaactgaca gaggatagat ggaacaagcc ccagaagacc 540 aagggccaca gagggagcca tacaatgaat ggacaçtag 579

<210> 28 <211> 579 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: nova sequência <400> 28 73 atggaaaaca gatggcaggt gatgattgtg tggcaggtag acaggatgag gattagaaca 60 tggaacagtt tagtaaaata ccatatgtat agatcaaaga aagctaggga atggmtat 120 agacatcact atcaaagtcc tcatccaaga gtaagttcag aagtacacat cccactagag 180 gatgctagat tggaaataac aacatattgg ggtctgcata caggagaaag agactggcai 240 ttgggtcagg gagtctccat agaatggagg aaaaggagat atagcacaca agtagaccct 300 gatctagcag accaactaat tcatctgtat tamtgatt gtttttcaga atctgctata 360 agaaaagcca tattaggaca cagagtlagt cctagglgtg aatatcgagc aggacatagc 420 aaggtaggat cactacagta cttggcaata gcagcattaa taacaccaaa aaagataaag 480 ccacctttgc cgagtgtcag gaaactgaca gaggatagat ggaacaagcc ccagaagacc 540 aagggccaca gagggagcca tacaatgaat ggacactag 579

<210> 29 <211> 579 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: nova sequência <400> 29 atggaaaaca gatggcaggt gatgattgtg tggcaggtag acaggatgag gattagaaca 60 tggaacagtt tagtaaaata ccatatgtat agatcaaaga aagctaggga atggttttat 120 agacatcact atcaaagtcc teatceaaaa gtaagttcag aagtacacat cccactagag 180 gatgctagat tggaaataac aacatattgg ggtctgcata caggagaaag agactggcat 240 ttgggtcagg gagtctccat agaatggagg aaaaggagat atagcacaca agtagaccct 300 gatctagcag accaactaat tcatctgtat tattttgatt gtttttcaga atctgctata 360 agaaaagcca tattaggaca cagagttagt cctaggtgtg aatatcgagc aggacatagc 420 aaggtaggat cactacagta cttggcaata gcagcattaa taacaccaaa aaagataaag 480 ccacctttgc cgagtgtcag gaaactgaca gaggatagat ggaacaagcc ccagaagacc 540 aagggccaca gagggagcca tacaatgaat ggacactag 579

<210> 30 <211> 579 <212> ADN <213> Sequência artificial 74 <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: nova sequência <400> 30 atggaaaaca gatggcaggt gatgattgtg tggcaggtag acaggatgag gatlagaaca 60 tggaacagtt íagtaacata ccatatgtat agatcaeaga aagctaggga aíggtttaat 120 agacatcact atcacagtcctcatccaaaa gtaagttçag aagtccacat cccactagag ISO gatgoagat tggcaatacc aacattttgg ggtctgcaía caggagaaag agactggcat 240 ttgggtcagg gagtctccat agaatggagg aaaaggagat atagcacaca agtagaccct 300 gatctagcag accaactaat tcatctgtat tattttgatt gtttttcaga atctgcíaia 360 agaaaagcca tattaggaca eagagttagt cctaggtgtg aatatcgagc aggacatagc 420 aaggtaggat caetacagta cttggcaata gcagcattaa taaeaccaaa aaagataaag 480 ccacctttgc cgagtgtcag gaaactgaca gaggatagat ggaacaagcc ccagaagacc 540 aagggccaca gagggagcca tacaatgaat ggacactag _ $79

<210> 31 <211> 579 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: nova sequência <400> 31 atggaaaaca gatggcaggt gatgattgtg tggcaggtag acaggatgag gattagaaca 60 tggaacagtt tagtaaaata ccatatgtat agatcaaaga aagctaggga atggttttat 120 agacatcact atcaaagtcc tcatccaaaa gtaagttçag aagtccacat cccactagag ISO gatgctagat tggaaataac aacatattgg ggtctgeata caggagaaag agactggcat 240 ttgggtcagg gagtctccat agaatggagg aaaaggagât atagcacaca cgtcgaccct 300 gatctcgcag accacctaat ícateigtgt tattttgatt gtctttcaga atctgctata 360 agaaaagcca tattaggaca cagagttagt cctaggtgtg aatatcgagc aggacatagc 420 aaggtaggat caetacagta cttggcaata gcagcattaa taaeaccaaa aaagataaag 480 ccacctttgc cgagtgtcag gaaactgaca gaggatagat ggaacaagcc ccagaagacc 540 aagggccaca gagggagcca tacaatgaat ggacactag 579

<210> 32 <211> 579 <212> ADN 75 <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: nova sequência <400> 32 atggaaaaca gatggcaggt gatgattgtg tggcaggtag acaggatgag gattagaaca 60 tggaacagtt tagtaaaata ccatatgtat agatcaaaga aagctaggga atggttttat 120 agacatcact atcaaagtcc tcatccaaaa gtaagttGag aagtacacat cccactagag 180 gatgctagat tggtaataac aacatattgg ggíctgcata caggagaaag agactggcat 246 ttgggtcagg gagtctccat agaatggagg aaaaggagat atagcacaca egtagaccct 300 gatctagcag accaactaat tcatctgtal tattttgatt gtttttcaga atctgctata 360 agaaaagcca tattaggaca cagagnagt cctaggtgtg aatatcgagc aggacatagc 420 aaggtaggat cactacagta cttggcaata gcagcattaa taacaccaaa aaagataaag 480 ccacctítgg cgagtgtcag gaaactgaca gaggatagat ggaacaagcc ccagaagacc 540 aagggccaca gagggagcca tacaatgaat ggacactag 579 <210> 33 <211> 579

<212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: nova sequência <400> 33 atggaaaaca gatggcaggt gatgattgtg tggcaggtag acaggatgag gattagaaca 60 tggaacagtt tagtaaaata ccatatgtat agatcaaaga aagctaggga atggttttat 120 agacatcact atcaaagtcc tcatccaaaa gtaagttcag aagtacacat cccactagag 180 gatgctagat tggtaataac aacatattgg ggíctgcata caggagaaag agactggcat 240 ttgggtcagg gagtctccat agaatggagg aaaaggagat atagcacaca agtagaccct 300 gatctagcag accacctaat tcatctgtat tattttgatt gtttttcaga atctgctata 360 agaaaagcca tattaggaca cagagttagt cctaggtgtg aatatcgagc aggacatagc 420 aaggtaggat cactacagta cttggcaata gcagcattaa taacaccaaa aaagataaag 480 ccacctttgg cgagtgtcag gaaactgaca gaggatagat ggaacaagcc ccagaagacc 540 aagggccaca gagggagcca tacaatgaat ggacactag 579 <210> 34 76

<211> 579 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: nova sequência <400> 34 atggaaaaca gatggcaggt gatgattgtg tggcaggtag acaggatgag gattagaaca 60 tggaacagtí tagtaaaata ccataígtai agatcaaaga aagclaggga aíggttttat 120 agacatcact atcaaagtcc tcatccaaaa gtaagttcag aagtacacat cccactagag ISO gatgetagat tggtaataac aacatttlgg ggtctgcata çaggagaaag agactggcat 240 ttgggtcagg gagtctccat agaatggagg aaaaggagaí atagcacaca cgtagacccl 300 gatctagcag accaactaat ícatctgtat tattttgatt gtttttcaga atetgctata 360 agaaaagcca tattaggaca cagagttagt cctaggtgtg aatatcgagc aggacatagc 420 aaggíaggat cactacagta cttggcaata gcagcattaa taacaccaaa aaagataaag 480 ccacctttgc cgagtgtcag gaaaetgaca gaggatagat ggaacaagcc ccagaagacc 540 aagggtcaca gagggageca tacaatgaat ggacactag 579

<210> 35 <211> 579 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: nova sequência <400> 35 77 atggaaaaca gatggcaggt gatgattgtg tggcaggtag acaggatgag gattagaaca 60 tggaacagtt tagtaaaata ccatatgt&t agatcaaaga aagciaggga atggtttaat 120 agacatcact alcaccgtcc tcatccaaaa gtaagttcag aagtccacat eccactagag 180 gatgctagat tggaaataac aacattttgg ggtctgcata caggagaaag agactggcat 240 ttgggtcagg gagtctccat agaatggagg aaaaggagat atagcacaca agtagaccct 300 gatctagcag aceaactaat tcatctgtát tattttgatt gtttttdaga atctgctata 360 agaaaagcca íattaggaca cagagttagt cctaggtgtg aatatcgagc aggacatagc 420 aaggtaggat cactacagta cttggcaata gcagcattaa taacaccaaa aaagataaag 480 ccacctttgc cgagtgtcag gaaactgaca gaggatagat ggaacaagcc ccagaagacc 540 aagggccaca gagggagcca tacaatgaat ggacactag 579

<210> 36 <211> 584 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: nova sequência <400> 36 atggaaaaca gatggcaggt gatgattgtg tggcaggtag acaggatgag gattagaaca 60 tggaacagtt tagtaaaata ccatatgtat tgatcaaaga aaagaaagaa agggaatggt 120 tttatagaca ícactatcac agccçtcatc cagaacaaag ttcaac&gcc cacatcccgc 180 tagtggatgg tagattggaa aaaatagcag tttggaglct ggatacagga gatggcgtct 240 ggcacagggg gcatcgagtc tccatagaat ggaggaaaag gagatatagc acacaagtag 300 accctgatct agtagaccaa ctaattcatc tgeattattt tgattgtttt tcagaatctg 360 ctataagaaa agccatatta ggacacagag ttagtcctag gtgtgaatat cgagcaggac 420 atagcaaggt aggstcacta cagtacttgg caatagcagc attaataaca ccaaaaaaga 480 tââagccacc tttgccgagt gtcaggaaac tgacagagga tagatggaac aagccccaga 540 agaccaaggg ccacagaggg agccatacaa tgaatggaca ctag 584

<210> 37 <211> 579 <212> ADN <213> Sequência artificial 78 <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: nova sequência <400> 37 atggaaaaca gatggcaggt gatgattgtg tggcaôgtag acaggatgag gattagaaca 60 tggaacagtt íagtaaaaca ccaíatgtat gtttcaaaga aagctaagaa atggttttat 120 agacatcact atgaaagecc tcatccaaaa gtaagttcaa eagcccacat cccgctaggg 180 gatggtagat tggagaaaac agcagtttgg agtctgcagg caggagatgg agtctggcac 240 agggggcatc cagtctccat agaatggagg aaaaggagat atagcacaca agtagaccct 300 gatttggtag accaactaat tcatctgtat tattttgatt gtttttcaga atctgctata 360 agaaaagcca tattaggata tagagttagt cctaggtgtg aataccaagc aggacataat 420 aaggtaggat ctctacagta cttggcacta gcagcattaa taacaccaaa gaagataaag 480 ccâcctttgc ctagtgttag gaaactgaca gaggatagat ggaacaagcc ccagaagacc 540 aagggccaca gagggagcca tacaatgaat ggacactag 579

<210> 38 <211> 579 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: nova sequência <400> 38 atggaaaaca gatggcaggt gatgattgtg tggcaagtag acaggatgag gattagagca 60 tggaacagtt tagtaaaaca ccaíatgtat gtttcaaaga aagctaggac atggttttct 120 agacatcact atggaagcce tcatccaaaa gtatgttcag aagtacacat cccactaggg 180 gatgctagat tggtgataac aacatattgg agtctgcatg caggagaatg agactggcat 240 gtgggícaga gagtctccat agaatggagg aaaaggagat atagcacaca agtagaccct 300 gacttggcag accaactaat tcatctgtat tattttgatt gtttttcaga atctgctata 360 agaaaagcca tattaggata tagagttagt cctaggtgtg aataccaagc aggacataat 420 aaggtaggat ctctacagta cttggcacta gcagcattaa tàacaccaaa gaagataaag 480 ccâcctttgc ctagtgtgag gaaactgaca gaggatagat ggaacaagcc ccagaagacc 540 aagggccaca gagggagcca tacaatgaat ggacactag 579 <210> 39 79

<211> 579 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: nova sequência <400> 39 atggaaaaca gatggcaggt gatgattgtg tggcaagtag acaggatgag gattagagca 60 tggaacagtt tagtaaaaca ccatalttat ttttcaaaga aagctaagaa atggttttat 120 agacatcact atgaaagccc tcatccaaac gtaagttcag aagtacacaí cccactaggg 180 gatgctagat tggtgacaac accatattgg ggtctgcatg gaggagaaag agactggtat 240 ctggctcagg gagtctccat agaatggagg aaaaggagat atagcacaca agtagaccct 300 gacctggcag accaactaat tcatctgtat tattttgatt gtttttcaga atctgctata 360 agaaaagcca tattaggata tagagttagt cctaggtgtg aataccaagc aggacataat 420 ccacctttgc ctagtgtgag gaaactgaca gaggatagat ggaacaagcc ccagaagacc S40 aagggccaca gagggagcca tacaatgaat ggacacíag 579

<210> 40 <211> 579 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: nova sequência <400> 40 80 atggaaaaca gatgggaggt gatgattgtg tgggaagtag acaggatgag gattagagca 60 tggaacagtt tagtaaaaca ccaiatgtat gtttcaaaga aagctaagaa atggttttat 129 agacatcact atgaaagecc tcatccaaaa gtaagttcag aagtacacat cccactaggg 180 gatgctagat tggtgataac aacatattgg ggtctgcatg caggagaaag agactggcat 240 ttgggteagg gagtctccatagaatggagg aaaaggagat atagcacaca agtagaccct 300 gacctggcag accaactaat tcatctgtat tattttgatt gtttttcaga atctgctata 360 agaaaagcca íaítaggata tagagttagt cctaggtgtg aataccaagc aggacataat 420-aaggtaggat ctctacagta cttggcacta gcagcattaa taacaccaaa gaagataaag 480 ccacctttgc ctagtgtgag gaaactgaca gaggatagat ggaacaagcc ccagaagacc 540 aagggccaca gagggagcca tacaatgaat ggacaclag 579

<210> 41 <211> 579 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: nova sequência <400> 41 atggaaaaca gatggcaggt gaígattgtg tggcaagtag acaggatgag gattagagca 60 tggaacagtt tagtaaaaca ccatatgtat gtttcaaaga acgctaagaa atggttttat 120 cgacatcact atgacagccc tcatccagtc caaagtíeaa cagcccacat cccgctaggg 180 gatggtagat tgcagaaaat agcattttgg agtctggatg caggagaaag agactggcat 240 ttgggteagg gagtctccat agaatggagg aaaaggagat atagcacaca agtagacect 300 gacctggcag accaactaat tcatctgtat tattttgatt gtttttcaga atctgctata 360 agaaaagcca tattaggata tagagttagt cctaggtgtg aataccaagc aggacataat 420 aaggtaggat ctctacagta cttggeacta gcagcattaa taacaccaaa gaagataaag 480 ccacctttgc ctagtgtgag gaaactgaca gaggatagat ggaacaagcc ccagaagacc 540 aaggSScaca gagggaggca tacaatgaat ggacactag 579

<210> 42 <211> 579 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: nova sequência 81 <400> 42 aiggaaaaca gatggcaggt gatgattgtg tggcaagtag acaggatgag gattagagca 60 . tggaacagtt tagtaaaaca ccatatgtat gtttcaaaga aagctaagaa atggtttíat 120 agacatcact àtgac-agccc tcatccaaaa gtaagttcag aagtacacat cccactaggg 180 gatgctagat tggagataac aacatattgg ggtctgcatg caggagaaag agactggcat 240 ttgggtcagg gagtctccai agaatggagg aaaaggagat aiageaeaca cgtagaccct 300 gacctggcag accaactaat tcatctgtat tattttgatt gtttítcaga atetgetaía 360 agaaaagcca tattaggata tagagttagt cctaggtgtg aaíaccaagc aggacataaí 420 aaggtaggat ctctaeagta cttggcacta gcagcattaataacaccaaa gaagataaag 480 ccacctttgc ctagtgtgag gaaactgaca gaggatagat ggaacaagcc ccagaagacc S40 aagggccaca gagggagcca tacaatgaat ggacactag 579

<210> 43 <211> 579 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: nova sequência <400> 43 atggaaaaea gatggcaggt gatgattgtg tggcaagtag acaggatgac gattagagca 60 tggaacagtt tagtaaaaca ccatatgtat gtttcaaaga aagctaagaa atggttttat 120 agacatcact atgaaagccc tcatccaaaa gtaagttcag aagtacacat cccactaggg 180 gatgctagat tggtgataac aacatattgg ggtctgcatg caggagaaag agactggcat 240 ttgggtcagg gagtctccat agaatggagg aaaaggagat atagcacaca agtagaccct 300 gacttggcag accaactaac tcatctgtat tattttgatt gtttttcaga atctgctata 360 agaaaagcca tattaggata tagagttagt cctaggtgtg aaíaccaagc aggacataat 420 aaggtaggat ctctacagta cttggcacta gcagcattaa taacaccaaa gaagataaag 480 ccacctttgc ctagtgtgag gaaactgaca gaggatagat ggaacaagcc ccagaagacc 540 aagggccaca gagggagcca tacaatgaat ggacactag 579

<210> 44 <211> 578 <212> ADN <213> Sequência artificial 82 <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: nova sequência <400> 44 atggaaaaca gatggcaggt gatgattgtg tggcaagtag acaggatgag gattagagca 60 tggaacagtt tagtaaaaca ccatatgtat gttteaaaga aagciaagaa atggtttaat 120 agacatcact atgàccgccc tcatccaaaa gtaagttcag aagtccacat cccactaggg 180 gatgctagat tggagataac aacattttgg ggtctgcatg caggagaaag agactggcat 240 ttgggtcagc gagtctccat agaatggagg aaaaggagat atagcacaca agtagaccet 300 gacttggcag accaactaac tcatctgtat tattttgatt gtttttcaga atctgctata 360 agaaaagcea tattaggata tagagttagt cctaggtgtg aataccaagc aggacataat 420 aaggtaggat ctcíacagta cttggcacta gcagcattaa taacaccaaa ga&gataaag 480 ccacctttgc ctãgtgigag gáaactgaca gaggatagat ggaacaagcc ccagaagacc 540 aagggcacag agggagccat acaaígaatg gacactag 578

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<212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: nova sequência <400> 46 atggaaaaca gatggeaggt gatgaitgtg tggcaagiag acaggatgag gattagagca 60 tggaacagtt tagtaaaaca ccataigtat gmeaaaga aagctaagaa atggttttat 120 agacatcact afgaaagccc tcatccacaa gtaagttcag aagtacacat cccactaggg ISO gatgctagat íggagataac aacatattgg ggtctgeatg caggagaaag agactggcai 240 ttgggtcagg gagtctccat agaaíggagg aaaaggagat atagcacaca agtagaccct 300 gacctggcag accaacíaaí tcatctgtat tattttgaít gtttttcaga atctgctata 360 agaaaagcca tattaggata tagagttagt cctaggígtg aataccaagc aggacataat 420 aaggíaggat ctctacagta cítggeactâ gcagcattaa laàcaccaaa gaagataaag 480 ccacctttgc ctagtgtgag gaaactgaca gaggatagat ggaacaagcc ccagaagacc 540 aagggccaca gagggagcca tacaatgaat ggacactag 579 84

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • US 5108921 A, Low [0044] • US 5593972 A, Weiner [0058] • US 5589466 A, Felgner [0058] • US 4945050 A, Sanford [0058] • US 5036006 A, Sanford [0058] • WO 9011092 A [0058] • WO 9317706 A [0058] • WO 9323552 A [0058] • WO 9416737 A [0058]

Literatura não relacionada com patentes, citada na descrição

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Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma proteína vif isolada, atenuada, não funcional, compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5.

2. Uma molécula de ácido nucleico isolada, compreendendo uma sequência nucleotidica que codifica a proteína vif atenuada, não funcional, da reivindicação 1.

3. A molécula de ácido nucleico da reivindicação 2, em que a molécula de ácido nucleico referida compreende uma sequência de nucleotideos da SEQ ID NO: 28.

4. Uma composição farmacêutica compreendendo uma proteína da reivindicação 1, num transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável.

5. Uma composição farmacêutica compreendendo uma molécula de ácido nucleico da reivindicação 2, num transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável.

6. Um vector de expressão recombinante compreendendo uma molécula de ácido nucleico da reivindicação 2 ou reivindicação 3.

7. Uma célula hospedeira compreendendo um vector de expressão recombinante, compreendendo uma molécula de ácido nucleico da reivindicação 2 ou reivindicação 3.

8. Um anticorpo purificado dirigido especificamente contra a proteína vif atenuada, não funcional, da reivindicação 1.

9. Uma molécula de ácido nucleico da reivindicação 2 ou reivindicação 3, para uso na imunização de um mamífero 2 contra um vírus, através da administração da molécula de ácido nucleico a células do mamífero referido, em que a molécula de ácido nucleico referida é expressa em tais células.

10. Uma molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 9, em que o vírus referido é seleccionado do grupo consistindo do vírus da imunodeficiência humana, vírus da imunodeficiência felina, vírus da imunodeficiência bovina, vírus Visna e vírus da imunodeficiência símia.

11. Um plasmídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica para uma proteína vif isolada, atenuada, não funcional, da reivindicação 1.