ES2262250T3

ES2262250T3 - Expresion constitutiva de particulas no infecciosas del tipo del vih.

Info

Publication number: ES2262250T3
Application number: ES98960976T
Authority: ES
Inventors: Benjamin Rovinski; Fei-Long Yao; Shi Xian Cao
Original assignee: Sanofi Pasteur Ltd
Current assignee: Sanofi Pasteur Ltd
Priority date: 1997-12-16
Filing date: 1998-12-14
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2018-12-14
Also published as: EP1038001B8; AU749174B2; DE69833686T2; US6572863B1; WO1999031250A3; CA2312943C; DE69833686D1; EP1038001B1; CA2312943A1; PT1038001E; EP1038001A2; JP2004509601A; AU1657799A; US6121021A; ATE318909T1; BR9813626A; DK1038001T3; WO1999031250A2

Abstract

Una molécula de ácido nucleico, que comprende un genoma modificado del VIH desprovisto de repeticiones terminales largas y en donde las secuencias vrp y tat están funcionalmente incapacitadas, y un promotor constitutivo operativamente conectado a dicho genoma modificado del VIH para expresión constitutiva de dicho genoma modificado para producir partículas inmunogénicas del tipo del VIH, no infecciosas, no replicantes, en donde el genoma del VIH se modifica adicionalmente para efectuar la reducción en el empaquetamiento del ARN dependiente de gag del producto génico gag.

Description

Expresión constitutiva de partículas no infecciosas del tipo del VIH.

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con la expresión de partículas inmunogénicas no infecciosas y no replicantes del tipo del VIH y, en particular, con las modificaciones genéticas requeridas para obtener una expresión constitutiva de alto nivel a largo plazo de tales partículas.

Antecedentes de la invención

El virus de inmunodeficiencia humana es un retrovirus humano y es el agente etiológico del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Se estima que más de 18 millones de personas han sido infectados con el VIH para mediados de 1996 (ref. 1 - se menciona diferentes referencias entre paréntesis que describen más completamente el estado del arte a la cual pertenece esta invención. La información bibliográfica completa de cada citación se encuentra al final de la descripción, inmediatamente antes de las reivindicaciones.

Ya que el HIV epidémico tipo 1 continua esparciéndose por todo el mundo, se necesita en forma urgente una vacuna efectiva. Los esfuerzos por desarrollar tal vacuna se han visto entorpecidos por tres factores principales: (a) la extraordinaria capacidad del virus para mutar; (b) la incapacidad de la mayoría de las especificidades conocidas de los anticuerpos anti-VIH para neutralizar consistentemente a los aislados primarios del VIH; y (c) la falta de de comprensión de las correlaciones de inmunidad protectora para la infección del VIH. En vista de la compleja biología de las interacciones huésped-VIH, la vía más fructífera puede ser el desarrollo de inmunógenos multivalentes de VIH confeccionados para los aislados del VIH en ubicaciones geográficas específicas.

CD8 CTL que mata células infectadas con VIH y los anticuerpos que neutralizan ampliamente a los aislados primarios del VIH pueden ser respuestas protectoras inmunes anti-VIH en individuos infectados que se exponen posteriormente al VIH (ref. 2).

La definición de un inmunógeno exitoso para prevenir al VIH es controversial. Las respuestas protectoras inmunes anti-VIH pueden prevenir completamente la infección por el VIH, pueden permitir solamente una infección transitoria, conduciendo al despeje del virus, o puede limitar simplemente el grado de infección del VIH, pero previniendo así el desarrollo del SIDA. Una sugerencia es que ocasionalmente ocurre el despeje del VIH después tanto de la transmisión del VIH al feto maternal (ref. 3) como de la transmisión sexual del VIH (ref. 4). Consecuentemente, si las respuestas protectoras inmunes anti-VIH pueden ser inducidas por medio de un inmunógeno en una persona infectada con el VIH, puede logarse la protección a través de una terminación temprana de la infección con VIH.

Se ha mostrado que los anticuerpos anti-recombinantes (r) gp120 de la envoltura elevados en animales o en voluntarios humanos neutralizan el crecimiento del VIH en líneas de células T adaptadas en el laboratorio pero no crecieron aislados primarios del virus en células mononucleares de sangre periférica. Esta observación hace surgir importantes preguntas acerca del papel de diferentes especificidades de los anticuerpos de neutralización en la protección contra el VIH. Los tipos predominantes de anticuerpos de neutralización anti-VIH que surgieron contra gp120 son anticuerpos contra la tercera región variable (V3) de gp120, así como anticuerpos contra el sitio de enlazamiento CD4 determinado conformacionalmente centrado alrededor de la cuarta región constante (C4) de gp120. Aunque las variantes adaptadas en el laboratorio son patógenas y han causado SIDA en hombres después de accidentes en el laboratorio (ref. 5), la relevancia de estas variantes in vivo en infecciones adquiridas en la comunidad es desconocida. Las concentraciones en suero de los anticuerpos contra la región V3 de la gp120 y de los anticuerpos que neutralizan a las cepas de VIH adaptadas en el laboratorio no protegen a los individuos del desarrollo del SIDA (ref. 6), ni lo hacen los anticuerpos anti-V3 que parecen protectores contra la transmisión del VIH al feto maternal (ref. 7).

Así, para la inducción por medio de los inmunógenos del VIH de los anticuerpos de neutralización para prevenir la infección del VIH, se necesitan probablemente los inmunógenos del VIH que son capaces de inducir anticuerpos anti-VIH que neutralizan tanto a los aislados adaptados en el laboratorio del VIH y a los aislados primarios del VIH que crecieron en células mononucleares de sangre periférica (ref. 8).

Existe una evidencia de que los oligómeros de la envoltura de los aislados primarios del VIH pueden ser inmunógenos apropiados para la inducción de los anticuerpos para neutralización anti-VIH contra los aislados primarios del VIH que crecieron en células mononucleares de sangre periférica. Se espera que estudios adicionales se enfoquen sobre la envoltura de los aislados primarios del VIH como el objetivo de los anticuerpos para neutralización. Si los oligómeros de la envoltura del VIH son exitosos en inducir anticuerpos que neutralicen a los aislados primarios del VIH, la especificidad del anticuerpo de neutralización puede ser una variante específica y, si es así, la fuente de variabilidad del VIH necesitaría aún ser dirigida.

Diferentes vacunas candidatas, basadas en diferentes conceptos se encuentran en diferentes etapas en la línea de desarrollo de la vacuna para el VIH. Las vacunas candidatas basadas en el concepto de la envoltura de la subunidad recombinante y producidas en células de mamíferos han mostrado que protegen a los chimpancés de la infección por VIH tipo 1 y que son seguras y razonablemente inmunogénicas en humanos, induciendo anticuerpos de neutralización. Una segunda generación de vacunas candidatas, que se basan en vectores vivos que expresan a los genes de la envoltura y a otros genes del VIH tipo 1, y que son capaces de inducir a los CTL, empiezan a ser evaluados en ensayos con humanos. Las generaciones más nuevas de vacunas candidatas que están siendo exploradas principalmente en experimentos con animales están utilizando combinaciones de subunidades de proteínas recombinantes o vacunas con vectores vivos con otros inmunógenos, tales como péptidos sintéticos o pseudoviriones, o se basan en aproximaciones más nuevas, que
incluyen inmunización con ácido nucleico y quizás vacunas completamente inactivadas o vacunas vivas atenuadas.

Sin embargo, existe una clara necesidad por preparaciones inmunogénicas que incorporan antígenos o fragmentos de antígenos de aislados primarios o clínicos del VIH. Estas preparaciones serán útiles como candidatos para vacunas, como antígenos en ensayos de diagnóstico y en kits, y para la generación de reactivos inmunológicos para el diagnóstico del VIH y de otras enfermedades retrovirales e infecciones.

Las preparaciones imunogénicas particulares del arte previo incluyen partículas no infecciosas, no replicantes del tipo del VIH. Las solicitudes PCT WO 93/20220 publicada el 14 de octubre de 1993 y WO 91/05860 publicada el 2 de mayo de 1990 (Whitehead Institute for Biomedical Research), enseñan construcciones que comprenden genomas de VIH que tienen una alteración en una secuencia de nucleótidos que es crítica para el empaquetamiento del ARN genómico, y la producción de partículas no infecciosas de VIH inmunogénico producidas por expresión de estas construcciones en células de mamífero.

La solicitud PCT WO 91/07425 publicada el 30 de mayo de 1991 (Oncogen Limited Partnership) enseña partículas retrovirales no replicantes producidas por la coexpresión del núcleo retroviral maduro y las proteínas estructurales de la envoltura de tal manera que las proteínas retrovirales expresadas se ensamblan dentro de partículas retrovirales en formación. Una partícula particular de la clase VIH de tipo 1 no replicante fue elaborada por medio de la coinfección de células de huésped mamífero con un virus para vacuna recombinante que porta a los genes gag y proteasa del VIH tipo 1 y un virus para vacuna recombinante que porta al gen env del VIH tipo 1.

En la solicitud PCT publicada WO 91/05864 (Connaught Laboratories Limited) y las correspondientes patentes estadounidenses concedidas Nos. 5.439.809 y 5.571.712, se describen partículas particulares del tipo retrovirus no replicante no infeccioso que contienen al menos proteínas gag, pot y env en sus conformaciones naturales y codificadas por medio de un genoma retroviral modificado deficiente en repeticiones terminales largas y que contienen genes gag, pol y env en sus arreglos genómicos naturales.

En WO 96/06177 (Connaught Laboratories Limited) se describen además mutaciones para el genoma del VIH de las construcciones de las patentes estadounidenses Nos. 5.439.809 y 5.571.712 para reducir el empaquetamiento del ARN dependiente de gag del genoma del VIH tipo 1, para eliminar la actividad de la transcriptasa inversa del producto del gen pol, para eliminar la actividad de la integrasa del producto del gen pol y para eliminar la actividad de la ARNasa del producto del gen pol, a través de la manipulación genética de los genes gag y pol.

En los vectores preferidos descritos en las patentes estadounidenses anteriormente mencionadas Nos. 5.439.809 y 5.571.712, se emplea un promotor de la metalotioneina, que requiere de la adición de un inductor para que se lleve a cabo la expresión. El uso de tales promotores para producción a escala comercial de tales partículas del tipo del VIH es impráctico, en vista de los costos de los metales pesados y del efecto tóxico de tales metales pesados sobre las células de expresión.

WO 98/17815 (Oxford Biomedica (Reino Unido) Limited) es citable bajo el Art 54(3) de la EPC con respecto a todos los estados contratantes designados diferentes a Chipre. WO 98/17815 describe los vectores retrovirales para la producción de las partículas del vector basado en lentivirus capaces de infectar y transducir células objetivo. En el caso del VIH, uno o más genes auxiliares, por ejemplo vpr, vif, tat y nef se inhabilitan o se renueven.

Es deseable, por lo tanto, emplear un promotor constitutivo para la expresión de las partículas del tipo VIH. Sin embargo, se ha encontrado que la sustitución de un promotor constitutivo, resulta en toxicidad celular, limitando el período útil de inducción de las partículas del tipo del VIH.

Resumen de la invención

Se ha encontrado sorprendentemente ahora que, efectuando modificaciones genéticas específicas al genoma del VIH, como se expone aquí, es posible efectuar una expresión constitutiva a largo plazo de partículas inmunogénicas del tipo del VIH, no infecciosas, no replicantes sin causar ningún efecto tóxico sobre las células de mamífero que expresan las partículas.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se provee una molécula de ácido nucleico, que comprende un genoma modificado del VIH desprovisto de repeticiones terminales largas y en donde las secuencias vrp y tat están funcionalmente incapacitadas, y un promotor constitutivo operativamente conectado al genoma modificado del VIH para expresión constitutiva del genoma modificado para producir partículas inmunogénicas del tipo del VIH, no infecciosas, no replicantes, en donde el genoma del VIH se modifica adicionalmente para efectuar la reducción en el empaquetamiento del ARN dependiente de gag del producto génico gag. Tal reducción en el empaquetamiento del ARN dependiente de gag del producto del gen gag puede efectuarse reemplazando Cys 392 y Cys 395 del producto del gen gag del aislado LAI del VIH tipo 1, o los aminoácidos correspondientes de otro aislado, por serina.

Las secuencias vrp y tat pueden ser funcionalmente incapacitadas por medio de la inserción allí de codones de detención para prevenir la expresión de los respectivos productos génicos codificados.

El genoma del HIV puede ser modificado además por medio del reemplazo del péptido señal de gap20 por una secuencia que mejora la expresión de gap120, específicamente el péptido señal que codifica la secuencia de glicoproteína D (gD) del virus del herpes simple (HSV).

En una modalidad preferida de la invención, el gen env en la molécula de ácido nucleico codifica a un producto del gen env de un aislado primario del VIH tipo 1.

Adicional o alternativamente, el genoma del VIH de una molécula de ácido nucleico puede ser modificada además para eliminar sustancialmente la actividad de la transcriptasa inversa, la actividad de la integrasa y la actividad de la ARNasa. En este sentido, una porción Ball-Ball del gen pol puede ser suprimida entre los nucleótidos 2655 y 4507 del aislado LAI del VIH tipo 1 o la porción correspondiente del gen pol de otro aislado del VIH tipo 1.

El promotor constitutivo empleado aquí puede ser el promotor inmediato temprano de citomegalovirus humano o cualquier otro promotor constitutivo conveniente de expresión de las partículas inmunogénicas del tipo del VIH, no infeccioso, no replicante en células de mamífero. Puede proveerse una secuencia que mejore la expresión entre el promotor y los genomas modificados. Tal secuencia para mejorar la expresión puede ser la secuencia del Intrón A del citomegalovirus humano.

Para los propósitos de la expresión de las partículas del tipo del VI, la molécula de ácido nucleico proveída aquí puede ser incorporada en un vector de expresión, que puede ser una que tenga las características para identificación del plásmido pCMVgDtat^{-}vpt^{-}, como se describe en detalle más adelante.

La presente invención, en otro aspecto de la misma, provee un método de obtener una partícula inmunogénica del tipo del VIH, no infecciosa, no replicante, que comprende la incorporación dentro de un vector de expresión de una molécula de ácido nucleico que comprende un genoma modificado de VIH como se define aquí más adelante introduciendo el vector de expresión dentro de células de mamífero, y expresar constitutivamente a la molécula de ácido nucleico en las células para producir en forma estable partículas inmunogénicas del tipo del VIH, no infecciosas, no replicantes.

La molécula incorporada de ácido nucleico dentro del vector de expresión puede tener los diferentes rasgos discutidos anteriormente con respecto al aspecto de la molécula del ácido nucleico de la invención. Además de la expresión constitutiva, la expresión de la molécula de ácido nucleico, puede ser mejorada también por medio del empleo de agentes químicos que mejoran al promotor específico empleado. Preferiblemente el vector de expresión es uno que tiene las características para identificación del plásmido pCMVgDtat^{-}vpt^{-}.

Tal método permite que las partículas del tipo del VIH se produzcan por un largo plazo sin ningún efecto tóxico adverso sobre las células de los mamíferos. Como se observa más adelante, los solicitantes han mantenido la expresión constitutiva a través de más de 50 pasadas de las células. La presente invención se extiende a las partículas inmunogénicas del tipo del VIH, no infecciosas, no replicantes que carecen de Tat y de Vpr y que pueden producirse por el aspecto del método de la invención así como las composiciones inmunogénicas que comprenden a la misma y los métodos de inmunización que utilizan tales composiciones.

Las partículas inmunogénicas del tipo del VIH, no infecciosas, no replicantes producidas de acuerdo al procedimiento de la invención, pueden ser empleadas en composiciones inmunogénicas, como se describe en las patentes estadounidenses anteriormente mencionadas Nos. 5.439.809 y 5.571.712 y en la WO 96/06177, para inducir una respuesta inmune en un huésped.

Las ventajas de la presente invención incluyen la capacidad para efectuar la producción a largo plazo de partículas inmunogénicas del tipo del VIH, no infecciosas, no replicantes, proveyendo así un sistema de expresión para tales partículas que es más útil en la producción comercial de las partículas del tipo del VIH que los sistemas previamente considerados.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra el mapa genético del plásmido de expresión p83-19 que contiene una forma modificada del SacKl-Xhol de 8,3 kb (nucleótidos 678 a 8944) del genoma LAI del VIH. El fragmento carece de los elementos LTR y del sitio de enlazamiento del iniciador y se inserta dentro de un vector de expresión que contiene al promotor de la metalotioneina (MT) y el sitio de poliadenilación del virus SV40. El gen gag se modifica para eliminar las secuencias de empaquetamiento del ARN por medio del reemplazo de los codones que codifican a los dos residuos de cisteína (Cys 392 y Cys 395) en la primera caja Cys-His por medio de los codones que codifican a la serina. El gen pol ha sido modificado por medio de la supresión de una porción para remover sustancialmente a la transcriptasa inversa y las actividades de la integrasa de la misma. Un oligonucleótido ha sido insertado dentro del gen pol suprimido para introducir tres codones de detención en tres diferentes marcos de lectura para evitar que las secuencias restantes de integrasa sean traducidas. El gen env es un gen híbrido que comprende a la secuencia de codificación gp120 del aislado MN del VIH tipo 1 y a la secuencia de codificación gp41 del aislado LAI.

La Figura 2A muestra al plásmido de expresión pCMVgDtat^{-}vpr^{-} mientras que la Figura 2B muestra el mapa genético del segmento pCMV-pA del plásmido de expresión. El plásmido de expresión pCMVgDtat^{-}vpr^{-} se deriva del plásmido p83-19 (Figura 1) y contiene al promotor del citomegalovirus (CMV) humano y al elemento mejorador así como a las secuencias del Intrón A del CMV en el lugar del promotor MT. Las secuencias de codificación para las proteínas reguladoras Tat y Vpr fueron modificadas para prevenir la síntesis de ambas proteínas tras la expresión. El fragmento del péptido señal de gp120 del VIH tipo 1 fue reemplazado por el fragmento del péptido señal de la glicoproteína D (gD) del Virus del Herpes Simple (HSV). Además, se insertó en forma colineal al gen de resistencia G418 dentro del plásmido y se colocó bajo la regulación del promotor SV40 y de las secuencias de poliadenilación.

La Figura 3, que comprende los paneles A, B y C, muestra los análisis de la transferencia de Western de las partículas del tipo virus del VIH expresadas a partir de una línea celular Vero que contiene al vector de expresión pCMVgDtat^{-}vpr^{-} (clon Vero-356) que fue establecido después de la transfección estable de las células Vero. El análisis de las transferencias de Western muestra la producción estable continuada de partículas del tipo del VIH con un número creciente de pasadas, paneles A (pasadas 14 a 18) y B (pasadas 46 a 51), y la sobreregulación de la producción de partículas después de la inducción con butirato de sodio (NaBu) solamente o NaBu más dexametasona (Dexam), panel C.

Descripción general de la invención

La presente invención permite que la expresión constitutiva de largo plazo de las partículas inmunogénicas del tipo del VIH, no infecciosas, no replicantes se logre a través de manipulación genética del genoma del VIH tipo 1. Como se describió anteriormente, la presente invención utiliza un promotor constitutivo que se acopla a un genoma modificado de VIH que carece de las LTR.

El genoma del VIH se modifica para incapacitar a vpr y tat para prevenir su expresión. Tal incapacitación puede logarse por medio de la inserción de codones de detención, incluidos los codones de detención múltiples, para prevenir la traducción de los genes y por lo tanto prevenir la formación de Vpr y Tat. Incapacitando a estos genes y previniendo su expresión, cualquier efecto tóxico de estos productos génicos sobre las células de mamíferos se elimina y por tanto puede lograrse una producción a largo plazo de partículas tipo VIH.

Además, se prefiere reemplazar la secuencia que codifica al péptido señal endógeno gp120 con un péptido señal que posibilita la expresión del gp120, por ejemplo, al péptido señal de la glicoproteína D del Virus del Herpes Simple.

Un vector de expresión útil aquí puede prepararse por medio de la modificación genética del plásmido p83-19, mostrado en la Figura 1. Este plásmido, cuya preparación se describe en WO 96/06177, codifica a una partícula tipo VIH deficiente en una pluralidad de elementos requeridos para la infectividad y/o la replicación del VIH pero dispensable para la producción de partículas tipo virus. El plásmido p83-19 se deriva del plásmido pMTHIVBRU descrito en la patente estadounidense anteriormente mencionada No. 5.439.809 y en la 5.571.712. La partícula tipo VIH contiene al producto génico env que es sustancialmente la envoltura del aislado MN del VIH tipo 1. La partícula tipo VIH puede contener otros productos génicos env, particularmente aquellos de los aislados clínicos de los pacientes infectados con VIH tipo 1, tales como un aislado primario del VIH tipo 1 de las ramas A, B, C, D, E y O que incluyen al aislado específico Bx08. Los productos génicos env también pueden ser una quimera de la proteína gp120 de una fuente y la gp41 de otra fuente, tal como M/N/LAI, Bx08/LAI y las ramas/quimeras LAI.

En el plásmido p83-19, el genoma del VIH comprende al fragmento de restricción SacI-Xhol del aislado LAI del VIH tipo 1 y abarca a los nucleótidos 678 a 8944 y es deficiente en el sitio de enlazamiento del iniciador. El gen gag ha sido modificado para reemplazar dos residuos de cisteína (Cys^{392} y Cys^{395}) en el producto génico gag con serina, para inhibir el empaquetamiento del ARN. Además, el gen pol ha sido modificado para suprimir una gran porción del gen pol para remover a la transcriptasa inversa y las actividades de la integrasa del producto génico pol con una secuencia de nucleótidos GTATAAGTGAGTAGCGGCCGCAC (SEQ ID NO: 7) que se inserta dentro de los marcos de lectura para introducir codones de detención para prevenir que las secuencias restantes de la integrasa sean traducidas.

El plásmido p83-19 se modifica para proveer al plásmido pCMVgDtat^{-}vpr^{-}, un plásmido de 14531 pb de longitud y a los elementos génicos y cuyas características se muestran en las Figuras 2A y 2B. El promotor de metalotioneina (MT) humana presente en p83-19 se reemplaza por el promotor del citomegalovirus (CMV) humano temprano inmediato t el elemento mejorador. El péptido señal de gp120 se reemplaza por una secuencia que codifica al fragmento del péptido señal de glicoproteína D (gD) del Virus del Herpes Simple (HSV). Este reemplazo se logra por medio de mutagénesis dirigida al sitio, como se describe en el Ejemplo 2 más adelante, utilizando iniciadores específicos.

La expresión de la proteína Tat se previene por medio de la inserción de codones de detención en un sitio apropiado en el gen tat, empleando específicamente dos codones de detención (nucleótidos TAATAG) reemplazando a los nucleótidos TGGAAG (nucleótidos 5896 a 5901) de VIH-1_{LAI}. Tal mutación se efectúa por medio de mutagénesis dirigida al sitio, como se describe en el Ejemplo 2 más abajo, utilizando un iniciador específico.

La expresión de la proteína Vpr se previene por medio de la inserción de los codones de detención en un sitio apropiado en el gen vpr, empleando específicamente un codón de detención (nucleótido TAG) en dos loci diferentes dentro de la secuencia de codificación Vpr, con el primer codón de detención reemplazando a los nucleótidos 5625 a 5627 del VIH-1_{LAI} y el segundo codón de detención reemplazando a los nucleótidos 5631 a 5633. Tal mutación se efectúa por medio de mutagénesis dirigida al sitio, como se describe en el Ejemplo 2 más abajo, utilizando un iniciador específico.

Un gen que confiere resistencia a G418 se inserta colinealmente dentro del plásmido y se coloca bajo la regulación del promotor SV40 y las secuencias de poliadenilación. El montaje final del plásmido se muestra en la Figura 2A.

El plásmido pCMVgDtat^{-}vpr^{-} puede transfectarse en forma estable dentro de células Vero de riñón de mono u otras células de mamífero por medio de cualquier procedimiento conveniente para la expresión allí dentro de las partículas inmunogénicas del tipo del VIH, no infecciosas, no replicantes. Las líneas celulares resistentes G418 se clonan y se muestrean para la producción de las partículas en el sobrenadante del cultivo por medio de la medición de la cantidad de proteína Gag p24 asociada ala partícula, utilizando un anticuerpo adecuado. Tal procedimiento de muestreo es descrita en las patentes estadounidenses anteriormente mencionadas Nos. 5.439.809 y 5.571.712.

Se encontró que las líneas celulares que secretan a las partículas tipo VIH producen en forma estable partículas del tipo VIH-1 y para que continúen produciendo tales partículas tipo VIH con un incremento en el número de pasadas, como puede observarse a partir de los análisis de las transferencias de Western de la Figura 3. Las partículas tipo VIH-1 pueden aislarse y analizarse por medio de transferencias de Western utilizando anticuerpos monoclonales específicos para p24 (Gag) y gp120 (Env).

Los niveles de expresión de la partícula tipo VIH-1 pueden incrementarse por medio de inducción utilizando butirato de sodio con o sin dexametasona, como se observa en el Ejemplo 3 y en la Figura 3, panel C.

Ya que las modificaciones genéticas que han sido hechas al genoma del VIH no involucran modificación de los componentes inmunogénicos de la partícula tipo VIH, la inmunogenicidad de las partículas no se perjudica, como se muestra en las patentes estadounidenses Nos. 5.571.712 y 5.439.809 y en WO 96/06177.

Las partículas inmunogénicas del tipo del VIH, no infecciosas, no replicantes proveídas aquí pueden ser utilizadas en una variedad de formas, como se describe con más detalle más adelante. Las modificaciones genéticas que han sido hechas aquí permiten que tales partículas tipo VIH sean producidas a escala comercial a partir de líneas celulares transformadas en forma estable que expresan a las partículas en cantidades significativas, en contraste con sistemas de expresión del arte previo.

Preparación y Uso de la Vacuna

Un posible uso de las partículas inmunogénicas del tipo del VIH, no infecciosas, no replicantes producidas por medio de la presente invención es como la base de una vacuna potencial contra enfermedades retrovirales que incluyen SIDA y condiciones relacionadas con el SIDA.

Las composiciones inmunogénicas, adecuadas para ser utilizadas como vacunas pueden ser preparadas a partir de las partículas inmunogénicas del tipo del VIH, no infecciosas, no replicantes. Las composiciones inmunogénicas producen una respuesta inmune que produce anticuerpos que son antivirales. En caso de que el individuo vacunado sea desafiado por un retrovirus, tal como el VIH, los anticuerpos se unen al virus y por lo tanto lo inactivan. La composición inmunogénica puede producir también linfocitos T citotóxicos (CTL) que son capaces de lisar a las células infectadas por el virus.

Las vacunas pueden prepararse como inyectables, como soluciones líquidas o como emulsiones. Las partículas no infecciosas del tipo del VIH pueden mezclarse con excipientes farmacéuticamente aceptables que son compatibles con partículas tipo retrovirus. Los excipientes pueden incluir agua, suero fisiológico, dextrosa, glicerol, etanol, y combinaciones de los mismos. La vacuna puede contener además sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsificantes, agentes amortiguadores de pH, o adyuvantes para mejorar la efectividad de las vacunas. Los métodos para lograr un efecto adyuvante para la vacuna incluyen el uso de agentes, tales como hidróxido de aluminio o fosfato (alúmina), comúnmente utilizada como una solución entre el 0,05 y el 0,1 por ciento en suero fisiológico amortiguado con fosfato y otros adyuvantes, incluidos QS21 y el adyuvante incompleto de Freund. Las vacunas pueden administrarse parenteralmente, por medio de inyección subcutánea o intramuscular. Alternativamente, las composiciones inmunogénicas formadas de acuerdo a la presente invención, pueden formularse y suministrarse en una forma que evoquen una respuesta inmune en superficies mucosas. Por lo tanto, la composición inmunogénica puede administrarse a las superficies mucosas, por ejemplo, por medio de las vías nasal u oral (intragástrica), Alternativamente, pueden ser deseables otras formas de administración que incluyen supositorios y formulaciones orales. Los supositorios, aglutinantes y vehículos pueden incluir, por ejemplo, polialcalén glicoles o triglicéridos. Las formulaciones orales pueden incluir normalmente el empleo de incipientes, tales como grados farmacéuticos de sacarina, celulosa y carbonato de magnesio. Estas composiciones toman la forma de soluciones, suspensiones, tabletas, piedras, cápsulas, formulaciones de liberación continuada o polvos y contienen de 10 a 95% de las partículas tipo retrovirus de la invención.

Las vacunas se administran en una forma compatible con la formulación de la dosis, y en tales cantidades que sean terapéuticamente efectivas, protectoras e inmunogénicas. La cantidad a ser administrada depende del individuo que va a ser tratado, incluida, por ejemplo, la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar anticuerpos, y para producir una respuesta inmune mediada por la célula. Las cantidades precisas del ingrediente activo requeridas para ser administradas dependen del juicio del médico. Sin embargo, los rangos adecuados de las dosis las puede determinar fácilmente alguien entrenado en la técnica y pueden ser del orden de microgramos de las partículas del tipo del VIH. Los regímenes adecuados para la administración inicial y las dosis de refuerzo también son variables, pero pueden incluir una administración inicial seguida por administraciones posteriores. Un ejemplo de un plan de inmunización es al menos de una inmunización primaria con una partícula tipo VIH, producidas de acuerdo a la presente invención, seguido al menos por una inmunización secundaria con un tándem sintético del péptido T-B que contiene al epítopo de la célula T del VIH y a un epítopo de la célula B del VIH como se describe en la patente europea No. 0 470 980 o la WO 94/29339 y que corresponde a la patente estadounidense No. 5.639.854. La dosis de la vacuna puede depender también de la ruta de administración y variará también de acuerdo al tamaño del huésped.

Las moléculas producidas de acuerdo con la invención pueden encontrar uso además el tratamiento (profiláctico o curativo) del SIDA y de condiciones relacionadas, actuando ya sea para desplazar el enlazamiento del virus VIH a células humanas o de animales o por medio de la perturbación de la organización tridimensional del virus.

Inmunoensayos

Las partículas tipo VIH producidas por medio del método de la presente invención son útiles como inmunógenos, como antígenos en inmunoensayos incluidos los ensayos con sustancias inmunoabsorbentes unidas a enzimas (ELISA), los RIA y otros ensayos de enlazamiento de anticuerpos no unidos a enzimas, o como procedimientos conocidos en el estado de la técnica para muestrear compuestos anti-retrovirales, para detección de anticuerpos anti-retrovirales del VIH y de antígenos retrovirales (por ejemplo, VIH). En los ensayos ELISA, las partículas tipo retrovirus se inmovilizan sobre una superficie seleccionada, por ejemplo una superficie capaz de enlazar proteínas, tales como los pozos de la placa de microtitulación en poliestireno. Después de lavar para remover las partículas tipo retrovirus adsorbidas en forma incompleta, puede enlazarse a la superficie seleccionada una proteína no específica, tal como una solución de albúmina de suero bovino (BSA) o caseína, que se sabe que son antigénicamente neutras con relación a la muestra del ensayo. Esto permite bloquear los sitios de adsorción no específicos sobre la superficie de inmovilización y por lo tanto disminuye el fondo causado por los enlazamientos no específicos de antisuero sobre la superficie.

La superficie de inmovilización se pone en contacto luego con una muestra, tal como los materiales clínicos o biológicos que van a ser analizados en forma conducente a la formación del complejo (antígeno/anticuerpo) inmune. Esto puede incluir la dilución de la muestra con diluyentes, tales como soluciones de BSA, gama globulina de bovino (BGG) y/o solución fisiológica amortiguada con fosfato (PBS)/Tween. A la muestra se le permite entonces incubación aproximadamente 2 a 4 horas, a temperaturas tales que estén en el orden aproximadamente de 25º a 37°C. Después de la incubación, la superficie en contacto con la muestra se lava para remover el material no inmunocomplejado. El procedimiento de lavado puede incluir el lavado con una solución, tal como PBS/Tween, o un amortiguador de borato.

Después de la formación de inmunocomplejos específicos entre la muestra del ensayo y las partículas enlazadas tipo retrovirus, y un lavado posterior, puede determinarse la ocurrencia, y la cantidad par, en la formación de inmunocomplejo, sometiendo al inmunocomplejo a un segundo anticuerpo que tiene especificidad por el primer anticuerpo. Si la muestra del ensayo es de origen humano, el segundo anticuerpo es un anticuerpo que tiene especificidad por las inmunoglobulinas humanas y en general las IgG. Para proveer medios de detección, el segundo anticuerpo puede tener una actividad asociada, tal como una actividad enzimática que generará, por ejemplo, un desarrollo de color por incubación con un sustrato cromogénico apropiado. La cuantificación puede lograrse entonces por medio de la medición del grado de color generado utilizando, por ejemplo, un espectrofotómetro para el espectro visible.

En una modalidad diagnóstica en donde es deseable identificar anticuerpos que reconocen a una pluralidad de aislados de VIH, se inmovilizan una pluralidad de partículas tipo VIH antigénicamente distintas de la presente invención sobre la superficie seleccionada. Alternativamente, cuando los anticuerpos anti-VIH reconocen a los epítopos que están altamente conservados entre diferentes aislados de VIH (por ejemplo, un epítopo de célula B de gag o gp41), pueden inmovilizarse un número único o un número limitado de partículas tipo retrovirus. En una modalidad adicional de diagnóstico en donde es deseable identificar anticuerpos en forma específica que reconocen a un aislado único de VIH (por ejemplo, LAI, MN, SF2 o HXB2), una partícula única tipo VIH particular de la presente invención puede ser inmovilizada. Esta modalidad adicional de diagnóstico tiene una utilidad particular en los campos de la medicina, ensayos clínicos, jurisprudencia y ciencia forense en donde puede ser crítica para determinar al aislado particular del VIH que fue responsable por la generación de una respuesta inmune incluye una respuesta a un anticuerpo.

En una modalidad adicional de diagnóstico, puede ser deseable identificar específicamente a diferentes retrovirus, por ejemplo, aislados de VIH que pertenecen a diferentes ramas. Los aislados inmunológicamente diferentes de VIH pueden incluir, por ejemplo, LAI, MN, SF2 o HXB2 o un aislado primario de VIH tipo 1. En esta modalidad diagnóstica, una partícula particular tipo VIH de la presente invención es útil para generar anticuerpos que incluyen anticuerpos monoclonales que específicamente reconocen a tal aislado inmunológicamente distinto de VIH.

Se entiende que una mezcla de partículas tipo VIH inmunológicamente distintas pueden ser utilizadas ya sea como un inmunógeno en, por ejemplo, una vacuna o como un agente de diagnóstico. Pueden existir circunstancias en donde una mezcla de partículas tipo VIH son utilizadas para proveer una protección cruzada de aislados y/o para diagnóstico. En este caso, se hace comúnmente referencia a la mezcla de inmunógenos como a una preparación "cóctel".

La presente invención provee convenientemente partículas tipo VIH y comprenden productos génicos gag y env sustancialmente en sus conformaciones nativas. Tales partículas de retrovirus serán reconocidas así por los anticuerpos conformacionales anti-VIH (tal como anticuerpos anti-env) que pueden no reconocer al antígeno del VIH en forma desnaturalizada o a un péptido sintético correspondiente acta al antígeno del VIH. Las partículas tipo VIH son, por lo tanto, particularmente útiles como antígenos y como inmunógenos en la generación de anticuerpos anti-retrovirales (incluidos los anticuerpos monoclonales) en las modalidades de diagnóstico.

Otros Usos

Las moléculas que se enlazan a las partículas tipo VIH, particularmente anticuerpos, a las moléculas relacionadas con anticuerpos y a los análogos estructurales de las mismas, también son de uso posible como agentes en el tratamiento y diagnóstico de SIDA y condiciones relacionadas.

Las variantes de los anticuerpos (incluidas las variantes del sitio de enlazamiento el antígeno), tal como los anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos revestidos, y anticuerpos modificados por ingeniería genética que son específicos para las partículas tipo retrovirus, están incluidos dentro del alcance de la invención.

Los anticuerpos y otras moléculas que se enlazan a las partículas tipo VIH pueden ser utilizadas para propósitos terapéuticos (profilácticos y curativos) y para propósitos diagnósticos en diferentes formas, incluidas las siguientes:

Para inmunización pasiva por medio de la administración adecuada de anticuerpos, posiblemente anticuerpos humanizados, a pacientes infectados con VIH.

Para la activación del complemento o para mediar la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) por medio del uso de anticuerpos de la subclase apropiada o el isotipo (posiblemente obtenido por medio de ingeniería genética del anticuerpo apropiado) que sean capaces de llevar a cabo la función deseada.

Para el suministro dirigido de toxinas o de otros agentes, por ejemplo, por medio del uso de inmunotoxinas que comprenden conjugados de anticuerpo y una fracción citotóxica, para enlazarlos directa o indirectamente a las proteínas expuestas del VIH de la superficie celular de las células infectadas por VIH (por ejemplo, gp120).

Para el suministro dirigido de materiales altamente inmunogénicos a la superficie de las células infectadas con VIH, conduciendo a la posible ablación de tales células ya sea por medio del sistema inmune celular o el sistema humoral del huésped.

Para la detección de VIH, utilizando una variedad de técnicas de inmunoensayo.

Por lo tanto, en aún una modalidad adicional de diagnóstico de la invención, las composiciones inmunogénicas (individualmente, o como mezclas que incluyen preparaciones cóctel) son útiles para la generación de anticuerpos específicos para el antígeno del VIH (incluidos los anticuerpos monoclonales) que pueden ser utilizados para detectar VIH o antígenos, o neutralizar al VIH en muestras que incluyen muestras biológicas.

En una modalidad alternativa de diagnóstico, las partículas tipo VIH pueden ser utilizadas para estimular específicamente a células T específicas para el VIH en muestras biológicas de, por ejemplo, individuos infectados con VIH, para diagnóstico o terapia.

Depósitos Biológicos

Ciertos plásmidos que codifican partículas tipo VIH y son empleados en aspectos de la presente invención que son descritos y referidos aquí, han sido depositados en la American Type Culture Collection (ATCC) localizada en el 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, Estados Unidos, de conformidad con el Tratado de Budapest y antes de la presentación de esta solicitud. Las muestras de los plásmidos depositados estarán disponibles al público después de la concesión de la patente con base en esta solicitud de patente en los Estados Unidos y todas las restricciones puestas para el acceso al depósito serán retiradas. Los depósitos serán reemplazados si el depositario no está en capacidad de dispensar muestras viables, ya que la modalidad depositada está destinada únicamente como ilustración de la invención. Cualquier plásmido equivalente o similar que codifique partículas tipo VIH equivalentes o similares a las que se describen en esta solicitud están dentro del alcance de esta invención.

Resumen del Depósito

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Plásmido	Designación ATCC	Fecha del Depósito
pMTHIVBRU	75852	Agosto 14, 1994
pCMVgDtat^{-}vpr^{-}	209446	Noviembre 11, 1997

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Ejemplos

Lo revelado anteriormente generalmente describe a la presente invención. Puede lograrse una comprensión más completa haciendo referencia a los siguientes Ejemplos específicos. Estos Ejemplos se describen únicamente para propósitos de ilustración y no pretenden limitar el alcance de la invención. Aunque se han utilizado términos específicos aquí, tales términos tienen por objeto un sentido descriptivo y no para propósitos de generar limitaciones. Los métodos inmunológicos y de ADN recombinante no pueden ser descritos explícitamente en este descubrimiento pero se encuentran también dentro del alcance de aquellos entrenados en la técnica.

Ejemplo 1

Este Ejemplo describe la construcción del plásmido p83-19.

El plásmido p83-19 fue construido como se describe en WO 96/06177 a partir de pMTHIVBRU (ATCC 75852) como se muestra en la Figura 3 de la misma. pMTHIVBRU se describe en las patentes estadounidenses anteriormente mencionadas Nos. 5.439.809 y 5.571.712. El plásmido p83-19 contiene un gen de envoltura híbrida que ha sido modificado por ingeniería genética por medio del reemplazo del ADN que codifica la mayor parte de gp20_{LAI} con el ADN conjugado que codifica a gp120_{MN}. Este resultado se logró por medio del reemplazo de un fragmento de ADN de KpaI/BglII (nucleótidos 6379 a 7668) de VIH-1_{LAI} con un fragmento de ADN de KpnlI/BglII (nucleótidos 6358 a 7641) de VIH-1_{MN}. El mapa genético para el plásmido p83-19 se muestra en la Figura 1.

Ejemplo 2

Este Ejemplo describe la construcción del plásmido pCMVgDtat^{-}vpr^{-}.

El plásmido pCMVgDtat^{-}vpr^{-} fue construido a partir del plásmido p83-19, (Ejemplo 1). El promotor de metalotioneina humana de p83-19 fue reemplazado con el promotor del citomegalovirus (CMV) humano y el elemento mejorador así como las secuencias del Intrón A del CMV. Las secuencias del CMV que fueron utilizadas corresponden al fragmento de ADN de SspI-PstI (nucleótidos 460 a 2087) descrito en la ref. 9. El fragmento de péptido señal de gp120 del VIH tipo 1 fue reemplazado por el fragmento de péptido señal de la glicoproteína D (gD) del Virus del Herpes Simple (HSV). Esto se logró por medio de mutagénesis ayudada por el montaje del gen (GAAM), como se describió previamente (ref. 10).

Se sintetizaron tres oligonucleótidos: un iniciador secuencia arriba que tiene la secuencia 5'- TATGACGACAAAC
AAAATCACGGCCCCCAACCTGGCGGCAGTCCCCCCCATTGCCACTGTCTTCTGCTCTTTCTATTA-3' (SEQ
ID NO: 1), en la cual al menos 27 nucleótidos son complementarios a los nucleótidos 6230 a 6256 del VIH-1_{LAI}, (toda la numeración del nucleótido está de acuerdo a la ref. 11 y a la Base de Datos del VIH de Los Alamos, 1988); un iniciador secuencia abajo tiene la secuencia 5'-CCCATAATAGACTGTGACCCACAATTTTTCTGTGAGAGAGGC
ATCCGCCAAGGCA TATTTGCCGCGGACCCCATGGAGGCCCAC-3' (SEQ ID NO: 2), en la cual los primeros 33 nucleótidos son complementarios a los nucleótidos 6347 a 6379 del VIH-1_{LAI}; un oligonucleótido puente tiene la secuencia 5'-TTGTTTGTCGTCATAGTGGGCCTCCATGGG-3' (SEQ ID NO: 3), en la cual los primeros 15 oligonucleótidos son complementarios a los 15 nucleótidos del extremo 5' del oligonucleótido secuencia arriba mientras que los últimos 15 nucleótidos son complementarios a los 15 nucleótidos del extremo 3' del iniciador secuencia abajo.

La expresión de la mayor parte de la proteína Tat se previno por medio de la inserción de dos codones de detención (nucleótidos TAATAG) que reemplazaron a los nucleótidos TGGAAG (nucleótidos 5896 a 5901) del VIH-1_{LAI}. Esta mutación fue generada por medio de mutagénesis dirigida al sitio utilizando al siguiente nucleótido: 5'-GACTTCCTGGATGCTATTAGGGCTCTAGT CTAG-3' (SEQ ID NO: 4). La expresión de la mayor parte de la proteína Vpr se previno por medio de la inserción de un codón de detención (nucleótidos TAG) en dos diferentes loci dentro de las secuencias de codificación de Vpr. El primer codón de detención reemplazó a los nucleótidos 5625 a 5627 del VIH-1_{LAI} mientras que el segundo codón de detención reemplazó a los nucleótidos 5631 a 5633. Estas mutaciones fueron insertadas por medio de mutagénesis dirigida al sitio utilizando al siguiente oligonucleótido: 5'-AAGACCAAGGGCCATAGAGGTAGCC ACACAATGAA-3' (SEQ ID NO: 5). Finalmente, el gen que confiere resistencia a G418 fue insertado colinealmente dentro del mismo plásmido y reemplazado bajo la regulación del promotor SV40 y las secuencias de poliadenilación. Un mapa del plásmido resultante pCMVgDtat^{-}vpr^{-} se muestra en la Figura 2A mientras que los detalles de las modificaciones genómicas se muestran en la Figura 2B.

Ejemplo 3

Este Ejemplo ilustra la expresión constitutiva de las partículas tipo VIH-1 de un clon de célula Vero establecido después de la transfección estable con el plásmido pCMVgDtat^{-}vpr^{-}.

El plásmido pCMVgDtat^{-}vpr^{-} preparado como se describe en el Ejemplo 2, fue transfectado en forma estable dentro de las células Vero de riñón de mono por medio del procedimiento de transfinidad con fosfato de calcio (BRL). Aproximadamente 400 líneas celulares G418R fueron clonadas y muestreadas para la producción de partículas tipo VIH-1 por medio de la medición de la cantidad de proteína Gag p24 asociada a la partícula en los sobrenadantes del cultivo, como se describe en las patentes estadounidenses Nos. 5.439.809 y 5.571.712. Se identificó una línea celular que secreta alrededor de 50 ng/ml de p24 (clon Vero-356) y se encontró que produce en forma estable partículas tipo VIH-1 con el incremento en el número de pasadas, como se ilustra en la Figura 3, paneles A y B. Las partículas tipo VIH-1 fueron aisladas por medio de ultracentrifugación, y las partículas precipitadas se analizaron por medio de las Transferencias de Western como se describe en WO 96/06177 utilizando anticuerpos monoclonales específicos para p24 (anti-p24) y gp120 (Mab 50.1) (Figura 3, paneles A y B). El análisis de las transferencias de Western muestra la producción continua de partículas tipo VIH después de cincuenta pasadas, en considerable contraste con los resultados previamente logrados.

Los niveles en la producción de partículas se incrementaron tres veces por medio de la inducción del clon Vero-356 con butirato de sodio 5 mM (NaBu), y cinco a ocho veces por medio de la inducción de la línea celular con una mezcla de NaBu 5 mM y 400 ng/ml de dexametasona (Dexam) (Figura 3, panel C).

Referencias

1. World Health Organization, 1996. Wkly Epidemiol. Rec. 48:361.

2. Haynes B.F., Pantaleo G., Fauci A.S. 1996. Science 271:324-328.

3. Bryson Y.T., Pang S., Wei L.S. y colaboradores, 1995. N. Engl. J. Med. 332:833-834.

4. Rowland-Jones s., Sutton J., Ariyosh K., y colaboradores, 1995. Nat. Med. 1:59-64.

5. Pincus S., Messer K.G., Nara T.L., y colaboradores, 1994. J. Clin. Invest. 93:2508-2513.

6. Hogervorst E., Jurrians S., de Wolf F., y colaboradores, 1995. J. Infect. Dis. 171:811-821.

7. Markham R.B., Coberly J., Ruff A.J., y colaboradores, 1994. Lancet 343:1364.

8. Moore J.P. 1995. Nature 376:115.

9. Chapman, B.S. y colaboradores, 1991. Nucleic Acids Res. 19:3979-3986.

10. Yao F-L., Klein M.H., Loosmore S., Rovinski B. 1995. Bio Techniques 18:372-376.

11. Wain-Hobson S., Sonigo P., Danos O., Cole S., Alizon M. 1985. Cell 40:9-17.

<160> 7

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<170> PatenIn ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 78

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido

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tatgacgaca aacaaaatca cggccccaa cctggcggca gtccccccca ttgccactgt

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60

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cttctgctct ttctatta

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<210> 2

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: oligonucleótido

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cccataatag actgtgaccc acaatttttc tgtgagagag gcatccgcca aggcatattt

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gccgcggacc ccatggaggc ccac

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ttgtttgtcg tcatagtggg cctccatggg

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gacttcctgg atgctattag ggcttagtc tag

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aagaccaagg gccatagagg tagccacaca atgaa

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gtataagtga gtagcggccg cac

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Claims

1. Una molécula de ácido nucleico, que comprende un genoma modificado del VIH desprovisto de repeticiones terminales largas y en donde las secuencias vrp y tat están funcionalmente incapacitadas, y un promotor constitutivo operativamente conectado a dicho genoma modificado del VIH para expresión constitutiva de dicho genoma modificado para producir partículas inmunogénicas del tipo del VIH, no infecciosas, no replicantes, en donde el genoma del VIH se modifica adicionalmente para efectuar la reducción en el empaquetamiento del ARN dependiente de gag del producto génico gag.

2. Una molécula de ácido nucleico como la reivindicada en la reivindicación 1, en donde dichas secuencias vpr y tat están funcionalmente incapacitadas por medio de la inserción allí de los codones de detención para prevenir la expresión de los respectivos productos génicos codificados.

3. Una molécula de ácido nucleico como la reivindicada en la reivindicación 1 ó 2, en donde el genoma del VIH se modifica además por medio del reemplazo de la secuencia que codifica al péptido señal de gp120 por medio de la secuencia que codifica al péptido señal de la glicoproteína D del virus del herpes simple.

4. Una molécula de ácido nucleico como la reivindicada en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el gen env codifica a un producto génico env de un aislado primario del VIH tipo 1.

5. Una molécula de ácido nucleico como la reivindicada en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha reducción en el empaquetamiento del ARN dependiente de gag del producto génico de gag se efectúa por medio del reemplazo de Cys 392 y de Cys 395 del producto génico de gag del aislado LAI del VIH tipo 1, o los correspondientes aminoácidos de otro aislado del VIH, por serina.

6. Una molécula de ácido nucleico como la reivindicada en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho genoma del VIH se modifica además para eliminar la actividad de la transcriptasa inversa, la actividad de la integrasa y la actividad de la ARNasa.

7. Una molécula de ácido nucleico como la reivindicada en la reivindicación 6, en donde una porción Ball-Ball del gen pol se suprime entre los nucleótidos 2655 y 4507 del aislado LAI del VIH tipo 1, o la porción correspondiente del gen pol de otro aislado del VIH tipo 1.

8. Una molécula de ácido nucleico como la reivindicada en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el promotor constitutivo es el promotor citomegalovirus humano inmediato temprano.

9. Una molécula de ácido nucleico como la reivindicada en la reivindicación 8, en donde se provee una secuencia que mejora la expresión entre dicho promotor y dicho genoma modificado.

10. Una molécula de ácido nucleico como la reivindicada en la reivindicación 9, en donde dicha secuencia que mejora la expresión es la secuencia del Intrón A de citomegalovirus humano.

11. Un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico reivindicada en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

12. Un vector de expresión como el reivindicado en la reivindicación 11, que tiene las características de identificación del plásmido pCMVgDtat^{-}vpr^{-} como se muestra en la Figura 2A tal como se depósito bajo el Número de Depósito ATCC 209446.

13. Un método para obtener una partícula inmunogénica tipo VIH, no infecciosa, no replicante, que com-
prende:

: introducir un vector de expresión de la reivindicación 11 o la reivindicación 12 en células de mamífero, y expresar constitutivamente la molécula de ácido nucleico en dicho vector de expresión en dichas células para producir en forma estable partículas inmunogénicas tipo VIH no infecciosas y no repli- cantes.

14. Un método como el reivindicado en la reivindicación 13, en donde la expresión de la molécula de ácido nucleico también es inducida.

15. Una partícula inmunogénica tipo VIH no infecciosa y no replicante que carece de Tat y de Vpr y producida por medio del método reivindicado en la reivindicación 13 o en la reivindicación 14.

16. Una composición inmunogénica que comprende una partícula inmunogénica tipo VIH no infecciosa y no replicante de la reivindicación 15 y un vehículo fisiológicamente aceptable de la misma.

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17. Una partícula inmunogénica tipo VIH no infecciosa y no replicante de la reivindicación 15 para ser usada como un medicamento.

18. La partícula inmunogénica tipo VIH no infecciosa y no replicante de la reivindicación 15 para ser usada en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad retroviral, preferiblemente por inmunización.