DE69833686T2

DE69833686T2 - Konstitutive expression von nicht-infektiöser hiv-ähnlicher teilchen

Info

Publication number: DE69833686T2
Application number: DE69833686T
Authority: DE
Inventors: Benjamin Thronhill ROVINSKI; Fei-Long North York YAO; Xian Shi Etobicoke CAO
Original assignee: Sanofi Pasteur Ltd
Current assignee: Sanofi Pasteur Ltd
Priority date: 1997-12-16
Filing date: 1998-12-14
Publication date: 2006-11-30
Anticipated expiration: 2018-12-15
Also published as: JP2004509601A; EP1038001B8; WO1999031250A2; AU749174B2; DK1038001T3; ATE318909T1; PT1038001E; AU1657799A; CA2312943C; CA2312943A1; ES2262250T3; US6121021A; EP1038001B1; US6572863B1; WO1999031250A3; BR9813626A; EP1038001A2; DE69833686D1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft die Expression von nicht-infektiösen, nicht-replizierenden immunogenen HIV-ähnlichen Teilchen und insbesondere genetische Modifikationen, welche erforderlich sind, um eine langfristige konstitutive Expression solcher Teilchen bei einem hohen Spiegel zu erhalten.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Humanes Immundefizienzvirus ist ein humanes Retrovirus und ist das ätiologische Agens von erworbenem Immundefizienzsyndrom [AIDS]. Es wird geschätzt, dass bis Mitte 1996 mehr als 18 Millionen Menschen mit HIV infiziert worden sind (Ref. 1 – verschiedene Literaturbezugsstellen werden in Klammern angegeben, um den Stand der Technik, zu welcher diese Erfindung angehört, vollständiger zu beschreiben. Eine vollständige bibliografische Information für jede Zitierung wird am Ende der Beschreibung, unmittelbar vorangehend zu den Patentansprüchen, gefunden).
Da die HIV-1-Epidemie sich anhaltend weltweit ausbreitet, bleibt der Bedarf nach einem effektiven Impfstoff dringend bestehen. Bestrebungen, einen solchen Impfstoff zu entwickeln, sind von drei Hauptfaktoren behindert worden: (a) Der außerordentlichen Fähigkeit des Virus, zu mutieren; (b) Unfähigkeit der meisten bekannten Spezifitäten von Anti-HIV-Antikörpern, konsistent HIV-Primärisolate zu neutralisieren; und (c) Fehlen des Verständnisses der Korrelate von schutzgebender Immunität gegen eine HIV-Infektion. Im Hinblick auf die komplexe Biologie von HIV-Wirt-Wechselwirkungen kann der erfolgreichste Weg in der Entwicklung von mehrwertigen HIV-Immunogenen bestehen, welche hinsichtlich HIV-Isolaten in spezifischen geografischen Örtlichkeiten maßgeschneidert sind.
CD8-CTL, welche HIV-infizierte Zellen abtöten, und Antikörper, welche HIV-Primärisolate weitgehend neutralisieren, könnten schützende Anti-HIV-Immunantworten in nicht-infizierten Individuen sein, welche anschließend an HIV exponiert werden (Ref. 2).
Die Definition eines erfolgreichen präventiven HIV-Immunogens ist widersprüchlich. Schutzgebende Anti-HIV-Immunantworten können eine HIV-Infektion vollständig verhindern, können eine nur vorübergehende Infektion zulassen, was zur Entfernung bzw. Klärung von Virus führt, oder können lediglich das Ausmaß der HIV-Infektion einschränken, wobei sie jedoch dadurch die Entwicklung von AIDS verhindern. Ein Vorschlag ist, dass eine Klärung von HIV gelegentlich sowohl nach maternal-fötaler HIV-Übertragung (Ref. 3) als auch sexueller Übertragung von HIV (Ref. 4) stattfindet. Wenn folglich schützende Anti-HIV-Immunantworten durch ein Immunogen in einer HIV-uninfizierten Person induziert werden könnten, könnte ein Schutz über die frühe Beendigung von HIV-Infektion erreicht werden.
Es ist gezeigt worden, dass Anti-rekombinantes(r)-gp120-Hüll-Antikörper, die in Tieren oder in menschlichen Freiwilligen erzeugt wurden, HIV neutralisieren, welches in Laboratoriumsangepassten T-Zelllinien herangezogen wurde, aber nicht Primärisolate des Virus, welches in mononuklearen Zellen von peripherem Blut herangezogen wurde. Diese Beobachtung führt zu bedeutenden Fragen über die Rollen von verschiedenen Spezifitäten von neutralisierenden Antikörpern beim Schutz gegen HIV. Die prädominanten Typen von neutralisierenden Anti-HIV-Antikörpern, welche gegen gp120 herangezogen wurden, sind Antikörper gegen die dritte variable (V3) Region von gp120, sowie Antikörper gegen die konformationsmäßig determinierte CD4-Bindungsstelle, zentriert um die vierte konstante (C4) Region von gp120. Obwohl Laboratoriums-angepasste Varianten pathogen sind und AIDS im Menschen nach Laboratoriumsunfällen verursacht haben (Ref. 5), ist die Relevanz dieser Varianten in vivo in gesellschaftlich erworbenen Infektionen unbekannt. Serumkonzentrationen von Antikörpern gegen die V3-gp120-Region und von Antikörpern, welche laboratoriumsangepasste HIV-Stämme neutralisieren, schützen Individuen nicht vor der Entwicklung von AIDS (Ref. 6), noch scheinen Anti-V3-Antikörper schützend gegen maternal-fötale HIV-Übertragung zu sein (Ref. 7).
Somit werden für die Induktion von neutralisierenden Antikörpern durch HIV-Immunogene, um eine HIV-Infektion zu verhindern, wahrscheinlich HIV-Immunogene benötigt, welche in der Lage sind, Anti-HIV-Antikörper zu induzieren, welche sowohl laboratoriumsangepasste HIV-Isolate als auch in mononuklearen Zellen des peripheren Bluts herangezogene HIV-Primärisolate neutralisieren (Ref. 8).
Es gibt aussagefähige Beweise, dass die Hüll-Oligomere von HIV-Primärisolaten geeignete Immunogene zur Induktion von neutralisierenden Anti-HIV-Antikörpern gegen primäre HIV-Isolate, welche in mononuklearen Zellen des peripheren Blutes herangezogen wurden, sein können. Zukünftige Untersuchungen werden sich erwartungsgemäß auf die Hülle von primären HIV-Isolaten als dem Ziel von neutralisierenden Antikörpern konzentrieren. Wenn HIV-Hüllen-Oligomere erfolgreich beim Induzieren von Antikörpern sind, welche primäre HIV-Isolate neutralisieren, kann die neutralisierende Antikörper-Spezifität variantenspezifisch sein, und, wenn dem der Fall ist, müsste noch der Punkt der HIV-Variabilität beachtet werden.
Mehrere Kandidaten-Impfstoffe, welche auf unterschiedlichen Konzepten basieren, befinden sich in verschiedenen Stadien der HIV-Impfstoffentwicklungs-Planung. Von Kandidatenimpfstoffen, welche auf dem Konzept rekombinanter Hüllen-Untereinheiten basieren und in Säugerzellen hergestellt werden, wurde gezeigt, dass sie Schimpansen vor HIV-1-Infektion schützen und dass sie bei Menschen sicher und einigermaßen immunogen sind, wobei neutralisierende Antikörper induziert werden. Eine zweite Generation von Kandidatenimpfstoffen, welche auf lebenden Vektoren basieren, welche die Hülle und andere HIV-1-Gene exprimieren, und welche in der Lage sind, CTLs zu induzieren, steht am Beginn der Auswertung in Versuchen am Menschen. Neuere Generationen von Kandidatenimpfstoffen, welche nun größtenteils in Tierexperimenten erforscht werden, verwenden Kombinationen von rekombinanten Untereinheitproteinen oder Lebendvektor-Impfstoffen mit anderen Immunogenen, wie synthetischen Peptiden oder Pseudovirionen, oder basieren auf neuartigeren Vorgehensweisen, einschließlich Nukleinsäure-Immunisierung und möglicherweise inaktivierten Gesamt-Impfstoffen oder lebenden attenuierten Impfstoffen.
Es gibt jedoch einen deutlichen Bedarf nach immunogenen Präparaten, welche Antigene oder Antigen-Fragmente aus primären oder klinischen HIV-Isolaten beinhalten. Diese Präparate werden nützlich als Impfstoffkandidaten, als Antigene in diagnostischen Assays und Kits und für die Erzeugung von immunologischen Reagenzien zur Diagnose von HIV und sonstigen retroviralen Erkrankungen und Infektionen sein.
Einzelne immunogene Präparate des Stands der Technik schließen nicht-infektiöse, nicht-replizierende HIV-ähnliche Teilchen ein. Die PCT-Anmeldungen WO 93/20220, veröffentlicht am 14. Oktober 1993, und WO 91/05860, veröffentlicht am 2. Mai 1990 (Whitehead Institute for Biomedical Research), lehren Konstrukte, welche HIV-Genome umfassen, die eine Veränderung in einer Nukleotidsequenz aufweisen, welche kritisch für die genomische RNA-Packung ist, sowie die Herstellung von nicht-infektiösen immunogenen HIV-Teilchen, welche durch Expression dieser Konstrukte in Säugerzellen erzeugt werden.
Die PCT-Anmeldung WO 91/07425, welche am 30. Mai 1991 veröffentlicht wurde (Oncogen Limited Partnership), lehrt nicht-replizierende retrovirale Teilchen, die durch Coexpression von reifen retroviralen Kern- und Hüll-Strukturproteinen hergestellt werden, so dass sich die exprimierten retroviralen Proteine zu knospenden retroviralen Teilchen zusammenfügen. Ein besonderes nicht-replizierendes HIV-1-ähnliches Teilchen wurde durch Co-Infizieren von Säugerwirtszellen mit einem rekombinanten Vaccinia-Virus, welches die gag- und Protease-Gene von HIV-1 trug, und einem rekombinanten Vaccinia-Virus, welches das HIV-1-env-Gen trug, hergestellt.
In der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 91/05864 (Connaught Laboratories Limited) und den entsprechenden erteilten U.S.-Patenten Nr. 5 439 809 und 5 571 712 werden besondere nicht-infektiöse, nicht-replizierende retrovirus-ähnliche Teilchen beschrieben, enthaltend wenigstens gag-, pol- und env-Proteine in ihrer natürlichen Konformation und codiert von einem modifizierten retroviralen Genom, welches hinsichtlich langer terminaler Wiederholungseinheiten defizient ist und gag-, pol- und env-Gene in ihrer natürlichen genomischen Anordnung enthält.
In der WO 96/06177 (Connaught Laboratories Limited) werden weitere Mutationen an dem HIV-Genom der Konstrukte der U.S.-Patente Nr. 5 439 809 und 5 571 712 beschrieben, um die gag-abhängige RNA-Packung des HIV-1-Genoms zu verringern, Reverse-Transkriptase-Aktivität des pol-Genprodukts zu eliminieren, Integrase-Aktivität des pol-Genprodukts zu eliminieren und RNAse-Aktivität des pol-Genprodukts zu eliminieren, und zwar durch genetische Manipulierung der gag- und pol-Gene.
In den bevorzugten Vektoren, welche in den zuvor erwähnten U.S.-Patenten Nr. 5 439 809 und 5 571 712 beschrieben werden, wird ein Metallothionein-Promotor verwendet, welcher die Zugabe eines Induktors erfordert, damit eine Expression bewirkt werden kann. Die Verwendung solcher Promotoren für eine Produktion im kommerziellen Maßstab von solchen HIV-ähnlichen Teilchen ist unpraktisch in Hinsicht auf die Kosten der eingesetzten Schwermetalle und den toxischen Effekt solcher Schwermetalle auf die Expressionszellen.
Die WO 98/17815 (Oxford Biomedica (UK) Limited) ist gemäß Artikel 54(3) EPC in Hinsicht auf alle aufgeführten unterzeichnenden Staaten, außer Zypern, zitierbar. WO 98/17815 beschreibt retrovirale Vektoren zur Herstellung von lentivirus-basierenden Vektorpartikeln, welche fähig zum Infizieren und Transduzieren von Zielzellen sind. Im Falle von HIV werden ein oder mehrere Neben-Gene, z. B. vpr, vif, tat und nef, außer Funktion gesetzt oder entfernt.
Es ist deshalb wünschenswert, einen konstitutiven Promotor für die Expression der HIV-ähnlichen Teilchen zu verwenden. Es wurde jedoch festgestellt, dass die Substitution eines konstitutiven Promotors zu Zelltoxizität führt, was die nützliche Zeitdauer der Induktion der HIV-ähnlichen Teilchen einschränkt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist nun überraschenderweise festgestellt worden, dass es durch Bewirken einer spezifischen genetischen Modifikation an dem HIV-Genom, wie sie hierin dargestellt wird, möglich ist, eine langfristige konstitutive Expression von nicht-infektiösen, nicht-replizierenden immunogenen HIV-ähnlichen Teilchen zu bewirken, ohne jeglichen toxischen Effekt auf die Säugerzellen zu verursachen, welche die Teilchen exprimieren.
Gemäß eines Aspekts der vorliegenden Erfindung wird ein Nukleinsäuremolekül vorgesehen, umfassend ein modifiziertes HIV-Genom, dem lange terminale Wiederholungseinheiten fehlen und in dem vpr- und tat-Sequenzen funktionell unterdrückt sind, und einen konstitutiven Promotor, der operativ mit dem modifizierten HIV-Genom verknüpft ist zur konstitutiven Expression des modifizierten Genoms zur Erzeugung von nicht-infektiösen, nicht-replizierenden und immunogenen HIV-ähnlichen Teilchen, wobei das HIV-Genom weiterhin modifiziert ist, um eine Reduktion der gag-abhängigen RNA-Packung des gag-Genprodukts zu bewirken. Eine solche Reduktion in der gag-abhängigen RNA-Packung des gag-Genprodukts kann durch Ersetzen von Cys 392 und Cys 395 des gag-Genprodukts des HIV-1-LAI-Isolats, oder der entsprechenden Aminosäuren eines anderen Isolats, durch Serin bewirkt werden.
Die vpr- und tat-Sequenzen können funktionell unterdrückt werden durch die Insertion von Stop-Codons darin, welche die Expression der jeweiligen codierten Genprodukte verhindern.
Das HIV-Genom kann weiterhin modifiziert werden durch Ersetzen des Signalpeptids von gp120 durch eine die gp120-Expression verstärkende Sequenz, spezifisch die das Signalpeptid codierende Sequenz von Glycoprotein D (gD) des Herpes Simplex Virus (HSV).
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung codiert das env-Gen in dem Nukleinsäuremolekül ein env-Genprodukt aus einem primären HIV-1-Isolat.
Zusätzlich oder alternativ dazu kann das HIV-Genom des Nukleinsäuremoleküls ferner modifiziert werden, um Reverse-Transkriptase-Aktivität, Integrase-Aktivität und RNAse-Aktivität im Wesentlichen zu eliminieren. In dieser Hinsicht kann ein BalI-BalI-Teil des pol- Gens zwischen den Nukleotiden 2655 und 4507 des LAI-Isolats von HIV-1 oder der entsprechende Teil des pol-Gens eines anderen HIV-1-Isolats deletiert werden.
Der hierin verwendete konstitutive Promotor kann der humane "immediate early"-Cytomegalovirus-Promotor oder jedweder andere zweckdienliche konstitutive Promotor zur Expression der nicht-infektiösen, nicht-replizierenden immunogenen HIV-ähnlichen Teilchen in Säugerzellen sein. Eine die Expression verstärkende Sequenz kann zwischen dem Promotor und den modizifierenden Genomen vorgesehen werden. Eine derartige die Expression verstärkende Sequenz kann die menschliche Cytomegalovirus-Intron-A-Sequenz sein.
Für die Zwecke der Expression der HIV-ähnlichen Teilchen kann das hierin vorgesehene Nukleinsäuremolekül in einen Expressionsvektor eingebaut werden, welcher ein solcher sein kann, der die Identifizierungseigenschaften des Plasmids pCMVgDtat^-vpr^- aufweist, wie nachstehend ausführlich beschrieben wird.
Die vorliegende Erfindung sieht, in einem anderen Aspekt davon, ein Verfahren zum Erhalten eines nicht-infektiösen, nicht-replizierenden, immunogenen HIV-ähnlichen Teilchens vor, welches das Einbringen eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend ein modifiziertes HIV-Genom, wie hierin zuvor definiert, in einen Expressionsvektor, das Einführen des Expressionsvektors in Säugerzellen, und das konstitutive Exprimieren des Nukleinsäuremoleküls in den Zellen, um nicht-infektiöse, nicht-replizierende immunogene HIV-ähnliche Teilchen stabil zu produzieren, umfasst.
Das in den Expressionsvektor eingebaute Nukleinsäuremolekül kann die verschiedenen Merkmale aufweisen, welche oben in Hinsicht auf den Nukleinsäuremolekül-Aspekt der Erfindung erörtert wurden. Zusätzlich zu konstitutiver Expression kann die Expression des Nukleinsäuremoleküls auch verstärkt werden durch Verwendung von chemischen Mitteln, welche den verwendeten spezifischen Promotor verstärken. Der Expressionsvektor ist vorzugsweise ein solcher, welcher die Identifizierungseigenschaften des Plasmids pCMVgDtat^-vpr^- aufweist.
Ein solches Verfahren gestattet, dass die HIV-ähnlichen Teilchen über eine lange Zeitdauer ohne jedweden nachteiligen toxischen Effekt gegenüber den Säugerzellen hergestellt werden. Wie nachstehend ersichtlich, haben die Anmelder der vorliegenden Erfindung eine konstitutive Expression über mehr als 50 Passagen der Zellen aufrechterhalten. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auf die nicht-infektiösen, nicht-replizierenden immunogenen HIV-ähnlichen Teilchen, denen Tat und Vpr fehlen, und die durch den Verfahrensaspekt der Erfindung produzierbar sind, sowie auf immunogene Zusammensetzungen, welche selbige umfassen, und Verfahren zur Immnunisierung unter Verwendung derartiger Zusammensetzungen.
Die nicht-infektiösen, nicht-replizierenden immunogenen HIV-ähnlichen Teilchen, welche gemäß der Vorgehensweise der Erfindung hergestellt werden, können in immunogenen Zusammensetzungen, wie beschrieben in den zuvor erwähnten U.S.-Patenten Nr. 5 439 809 und 5 571 712 und der WO 96/06177, zum Induzieren einer Immunantwort in einem Wirt verwendet werden.
Vorteile der vorliegenden Erfindung schließen die Fähigkeit zum Bewirken einer langfristigen Produktion von nicht-infektiösen, nicht-replizierenden immunogenen HIV-ähnlichen Teilchen ein, wodurch ein Expressionssystem für solche Teilchen bereitgestellt wird, welches nützlicher in der kommerziellen Produktion der HIV-ähnlichen Teilchen ist als die vorausgehend in Betracht gezogenen Systeme.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1 zeigt die genetische Karte des Expressionsplasmids p83-19, welches eine modifizierte Form des 8,3 kb großen SacI-XhoI (Nukleotide 678 bis 8944) aus dem LAI-HIV-Genom enthält. Dem Fragment fehlen LTR-Elemente und Primerbindungsstelle, und es ist in einen Expressionsvektor inseriert, welcher den Metallothionein(MT)-Promotor und die SV40-Virus-Polyadenylierungsstelle enthält. Das gag-Gen ist modifiziert, um die RNA-Packungs-Sequenzen durch Ersetzen der Codons, welche die zwei Cysteinreste (Cys 392 und Cys 395) in der ersten Cys-His-Box codieren, durch Serin codierende Codons zu eliminieren. Das pol-Gen ist modifiziert worden durch Deletion eines Teils zum wesentlichen Entfernen der Reverse-Transkriptase- und Integrase-Aktivitäten davon. Ein Oligonukleotid ist innerhalb des deletierten pol-Gens inseriert worden, um drei Stop-Codons in drei unterschiedlichen Leserastern einzuführen, um zu verhindern, dass die verbleibenden Sequenzen von Integrase translatiert werden. Das env-Gen ist ein Hybrid-Gen, welches die gp 120 codierende Sequenz des HIV-1-Isolats MN und die gp41 codierende Sequenz des Isolats LAI umfasst.
Die 2A zeigt das Expressionsplasmid pCMVgDtat^-vpr^-, während die 2B die genetische Karte des pCMV-pA-Segments des Expressionsplasmids zeigt. Das Expressionsplasmid pCMVgDtat^-vpr^- ist abgeleitet aus dem Plasmid p83-19 (1) und enthält das Promotor- und Enhancer-Element des humanen Cytomegalovirus (CMV) sowie CMV-Intron-A-Sequenzen anstelle des MT-Promotors. Die codierenden Sequenzen für die regulatorischen Proteine Tat und Vpr wurden modifiziert, um die Synthese von beiden Proteinen bei der Expression zu verhindern. Das Signalpeptid-Fragment von HIV-1-gp120 wurde durch das Signalpeptid-Fragment des Glycoproteins D (gD) von Herpes Simplex Virus (HSV) ersetzt. Darüber hinaus wurde das G418-Resistenz-Gen co-linear in das Plasmid inseriert und unter die Regulierung der SV40-Promotor- und Polyadenylierungssequenzen gebracht.
Die 3, welche die Tafeln A, B und C umfasst, zeigt eine Western-Blot-Analyse von HIV-Virus-ähnlichen Teilchen, welche exprimiert wurden aus einer Vero-Zelllinie, enthaltend den Expressionsvektor pCMVgDtat^-vpr^- (Klon Vero-356), welche nach einer stabilen Transfektion von Vero-Zellen etabliert wurde. Die Western-Blot-Analyse zeigt die kontinuierliche stabile Produktion von HIV-ähnlichen Teilchen bei zunehmender Passage-Anzahl, Tafeln A (Passagen 14 bis 18) und B (Passagen 46 bis 51), und die Aufwärtsregulierung der Teilchenproduktion im Anschluss an Induktion mit Natriumbutyrat (NaBu) allein oder NaBU plus Dexamethason (Dexam), Tafel C.
ALLGEMEINE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ermöglicht die langfristige konstitutive Expression von nichtinfektiösen, nicht-replizierenden HIV-ähnlichen Teilchen, welche durch genetische Manipulation des HIV-1-Genoms erzielt wird. Wie oben beschrieben, verwendet die vorliegende Erfindung einen konstitutiven Promotor, der an ein modifiziertes HIV-Genom ohne LTRs gekoppelt ist.
Das HIV-Genom wird modifiziert, um vpr und tat zu unterdrücken, um deren Expression zu verhindern. Eine derartige Unterdrückung kann erzielt werden durch Insertion von Stop-Codons, einschließlich mehrerer Stop-Codons, um die Translation der Gene zu verhindern und dadurch die Bildung von Vpr und Tat zu verhindern. Durch Unterdrücken dieser Gene und Verhinderung ihrer Expression wird jedweder toxische Effekt dieser Genprodukte auf die Säugerzellen eliminiert, und daher kann eine langfristige Produktion der HIV-ähnlichen Teilchen erzielt werden.
Darüber hinaus wird es bevorzugt, die Sequenz, die das endogene gp120-Signalpeptid codiert, mit einem Signalpeptid, welches die Expression des gp120 verstärkt, zum Beispiel dem Signalpeptid von Glycoprotein D des Herpes Simples Virus, zu ersetzen.
Ein hierin verwendbarer Expressionsvektor kann hergestellt werden durch genetische Modifikation des Plasmids p83-19, welches in 1 gezeigt wird. Dieses Plasmid, dessen Herstellung in der WO 96/06177 beschrieben wird, codiert ein HIV-ähnliches Teilchen, welches hinsichtlich einer Vielzahl von Elementen defizient ist, die für Infektionsvermögen und/oder Replikation von HIV erforderlich aber für die Produktion von virusähnlichen Teilchen verzichtbar sind. Das Plasmid p83-19 ist aus dem Plasmid pMTHIVBRU abgeleitet, welches in dem zuvor erwähnten U.S.-Patent Nr. 5 439 809 und 5 571 712 beschrieben wurde. Das HIV-ähnliche Teilchen enthält das env-Genprodukt, welches im Wesentlichen die Hülle des HIV-1-Isolats MN ist. Das HIV-ähnliche Teilchen kann andere env-Genprodukte enthalten, insbesondere diejenigen von klinischen Isolaten aus mit HIV-1 infizierten Patienten, wie ein primäres HIV-1-Isolat aus den Subtypen A, B, C, D, E und O, einschließlich dem spezifischen Isolat Bx08. Die env-Genprodukte können auch eine Chimäre von dem gp120-Protein aus einer Quelle und dem gp41 von einer anderen Quelle sein, wie MN/LAI-, Bx08/LAI- und Subtypen/LAI-Chimären.
In dem Plasmid p83-19 umfasst das HIV-Genom das SacI-XhoI-Restriktionsfragment des HIV-1-LAI-Isolats, und beinhaltet die Nukleotide 678 bis 8944 und ist hinsichtlich der Primerbindungsstelle defizient. Das gag-Gen ist modifziert worden, um zwei Cysteinreste (CyS³⁹² und CyS³⁹⁵) in dem gag-Genprodukt mit Serin zu ersetzen, so dass die RNA-Packung inhibiert wird. Darüber hinaus ist das pol-Gen modifiziert worden, um eine großen Teil des pol-Gens zu deletieren, so dass die Reverse-Transkriptase- und Integrase-Aktivitäten des pol-Genprodukts entfernt werden, wobei eine Oligonukleotidsequenz GTATAAGTGAGTAGCGGCCGCAC (SEQ ID NR.: 7) innerhalb der Leseraster inseriert wird, um Stop-Codons einzubringen, um zu verhindern, dass die restlichen Sequenzen von Integrase translatiert werden.
Das Plasmid p83-19 wird modifiziert, um das Plasmid pCMVgDtat^-vpr^- vorzusehen, welches ein Plasmid von 14531 bp Länge ist, und dessen genetische Elemente und Eigenschaften in den 2A und 2B gezeigt sind. Der in p83-19 vorhandene humane Metallothionein (MT)-Promotor wird durch das humane "immediate early"-Cytomegalovirus(CMV)-Promotor- und -Enhancer-Element ersetzt. Das Signalpeptid von gp120 wird ersetzt durch eine Sequenz, die das Signalpeptid-Fragment von Glycoprotein D (gD) des Herpes Simplex Virus (HSV) codiert. Diese Ersetzung wird durch ortsgerichtete Mutagenese, wie in Beispiel 2 nachstehend beschrieben wird, unter Verwendung von spezifischen Primern bewirkt.
Die Expression des Tat-Proteins wird verhindert durch Inserieren von Stop-Codons an einer passenden Stelle im tat-Gen, wobei spezifisch zwei Stop-Codons (Nukleotide TAATAG) verwendet werden, welche die Nukleotide TGGAAG (Nukleotide 5896 bis 5901) von HIV-1_LAI ersetzen. Eine derartige Mutation wird durch ortsgerichtete Mutagenese, wie nachstehend beschrieben in Beispiel 2, unter Verwendung eines spezifischen Primers durchgeführt.
Die Expression von Vpr-Protein wird verhindert durch Inserieren von Stop-Codons an einer passenden Stelle im vpr-Gen, spezifisch unter Verwendung eines Stop-Codons (Nukleotid TAG) an zwei unterschiedlichen Orten innerhalb der Vpr codierenden Sequenz, wobei das erste Stop-Codon die HIV-1_LAI-Nukleotide 5625 bis 5627 ersetzt, und das zweite Stop-Codon die Nukleotide 5631 bis 5633 ersetzt. Eine solche Mutation wird durch ortsgerichtete Mutagenese, wie beschrieben im nachstehenden Beispiel 2, unter Verwendung eines spezifischen Primers bewirkt.
Ein Gen, welches Resistenz gegen G418 vermittelt, wird co-linear in das Plasmid inseriert und unter die Steuerung von SV40-Promtotor- und Polyadenylisierungs-Sequenzen gebracht. Der letztendliche Plasmid-Aufbau wird in 2A gezeigt.
Das Plasmid pCMVgDtat^-vpr^- kann in Affennieren-Vero-Zellen oder andere Säugerzellen durch jedwedes zweckdienliche Vorgehen zur Expression von nicht-infektiösen, nicht-replizierenden immunogenen HIV-ähnlichen Teilchen davon stabil transfiziert werden. G418-Resistenz-Zelllinien werden kloniert und hinsichtlich der Produktion der Teilchen im Kulturüberstand durch Messung der Menge an teilchenassoziiertem Gag-p24-Protein unter Verwendung eines geeigneten Antikörpers gescreent. Ein derartiges Screening-Vorgehen wird in den zuvor erwähnten U.S.-Patenten Nr. 5 439 809 und 5 571 712 beschrieben.
Zelllinien, welche die HIV-ähnlichen Teilchen sezernieren, stellen festgestelltermaßen stabil HIV-1-ähnliche Teilchen her und setzen die Herstellung derartiger HIV-ähnlicher Teilchen mit wachsender Passageanzahl fort, wie aus der Western-Blot-Analyse von 3 ersehen werden kann. HIV-1-ähnliche Teilchen können isoliert und durch Western-Blot unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern, die für p24 (Gag) und gp120 (Env) spezifisch sind, analysiert werden.
Die Expressionsspiegel des HIV-ähnlichen Teilchens können durch Induktion unter Verwendung von Natriumbutyrat mit oder ohne Dexamethason erhöht werden, wie aus dem Beispiel 3 und 3, Tafel C, ersichtlich ist.
Da die genetischen Modifikationen, welche an dem HIV-Genom vorgenommen worden sind, keine Modifikation an immunogenen Komponenten des HIV-ähnlichen Teilchens beinhalten, wird die Immunogenität der Teilchen, wie gezeigt in den U.S.-Patenten Nr. 5 571 712 und 5 439 809 und in WO 96/06177, nicht beeinträchtigt.
Die hierin bereitgestellten nicht-infektiösen, nicht-replizierenden, immunogenen HIV-ähnlichen Teilchen können auf viele Weisen verwendet werden, wie nachstehend ausführlicher beschrieben wird. Die genetischen Modifikationen, welche hier vorgenommen worden sind, ermöglichen, dass derartige HIV-ähnliche Teilchen in einem kommerziellen Maßstab aus stabil transformierten Zelllinien, welche die Teilchen in signifikanten Mengen exprimieren, hergestellt werden können, was im Gegensatz zu Expressionssystemen des Stands der Technik steht.
Impfstoffherstellung und -Anwendung
Eine mögliche Anwendung der nicht-infektiösen, nicht-replizierenden, immunogenen HIV-ähnlichen Teilchen, welche von der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, besteht im Dienen als Basis eines potenziellen Impfstoffs gegen retrovirale Erkrankungen, einschließlich AIDS und mit AIDS zusammenhängenden Zuständen.
Immunogene Zusammensetzungen, welche zum Verwenden als Impfstoffe geeignet sind, können aus den nichtinfektiösen retrovirus-ähnlichen Teilchen hergestellt werden. Die immunogene Zusammensetzung ruft eine Immunantwort hervor, welche Antikörper erzeugt, die antiviral sind. Sollte das geimpfte Subjekt von einem Retrovirus, wie HIV, herausgefordert werden, binden die Antikörper an das Virus und inaktivieren es dadurch. Die immunogene Zusammensetzung kann auch cytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) hervorrufen, welche in der Lage sind, viral infizierte Zellen zu lysieren.
Impfstoffe können als injizierbare Präparate, als flüssige Lösungen oder Emulsionen hergestellt werden. Die nicht-infektiösen HIV-ähnlichen Teilchen können mit pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten gemischt werden, welche mit den Retrovirus-ähnlichen Teilchen kompatibel sind. Exzipienten können Wasser, Kochsalzlösung, Dextrose, Glycerol, Ethanol und Kombinationen davon einschließen. Der Impfstoff kann fernerhin Hilfssubstanzen, wie Benetzungs- oder Emulgierungsmittel, pH-Puffermittel oder Adjuvantien zur Steigerung der Effektivität der Impfstoffe enthalten. Verfahren zur Erzielung eines Adjuvans-Effekt für den Impfstoff schließen die Verwendung von Mitteln, wie Aluminiumhydroxid oder -phosphat (Alum), welche üblicherweise als 0,05- bis 0,1-prozentige Lösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung verwendet werden, und anderen Adjuvantien, einschließlich QS21 und unvollständigem Freund'schem Adjuvans, ein. Die Impfstoffe können parenteral, durch Injektion subkutan oder intramuskulär verabreicht werden. Alternativ dazu können die gemäß der vorliegenden Erfindung gebildeten immunogenen Zusammensetzungen in einer Weise formuliert und zugeführt werden, um eine Immunantwort an Schleimhautoberflächen hervorzurufen. Somit kann die immunogene Zusammensetzung an Schleimhautoberflächen bei spielsweise auf den nasalen oder oralen (intragastrischen) Wegen verabreicht werden. Alternativ dazu können andere Verabreichungsweisen, einschließlich Suppositorien und oraler Formulierungen, wünschenswert sein. Für Suppositorien können Bindemittel und Träger beispielsweise Polyalkalenglycole oder Triglyceride einschließen. Orale Formulierungen können normalerweise verwendete Träger, wie pharmazeutische Güteklassen von Saccharin, Cellulose und Magnesiumcarbonat, einschließen. Diese Zusammensetzungen nehmen die Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Formulierungen mit verzögerter Freisetzung oder Pulvern ein, und enthalten 10 bis 95 % an Retrovirus-ähnlichen Teilchen der Erfindung.
Die Impfstoffe werden in einer Weise verabreicht, welche kompatibel mit der Dosierungsformulierung ist und in einer derartigen Menge, wie sie therapeutisch effektiv, schutzgebend und immunogen ist. Die zu verabreichende Quantität hängt von dem zu behandelnden Subjekt ab, einschließlich zum Beispiel dem Vermögen des Immunsystems des Individuums, Antikörper zu synthetisieren und eine zellvermittelte Immunantwort hervorzubringen. Die genauen Mengen an Wirkstoff, welche zur Verabreichung erforderlich sind, hängen von der Beurteilung des behandelnden Arztes ab. Allerdings sind geeignete Dosierungsbereiche vom Fachmann auf dem Gebiet ohne weiteres bestimmbar und können in der Größenordnung von Mikrogramm der HIV-ähnlichen Teilchen liegen. Geeignete Schemen zur anfänglichen Verabreichung und Booster-Dosierungen sind ebenfalls variabel, können aber eine anfängliche Verabreichung, gefolgt von nachfolgenden Verabreichungen, einschließen. Ein Beispiel eines Immunisierungs-Ablaufschemas besteht in wenigstens einer primären Immunisierung mit einem HIV-ähnlichen Teilchen, hergestellt gemäß der vorliegenden Erfindung, gefolgt von wenigstens einer sekundären Immunisierung mit einem synthetischen Tandem T-B-Peptid, enthaltend ein HIV-T-Zell-Epitop und ein HIV-B-Zell-Epitop, wie beschrieben im Europäischen Patent Nr. 0 470 980 oder der WO 94/29339 und dem entsprechenden U.S.-Patent Nr. 5 639 854. Die Dosierung des Impfstoffs kann auch von dem Verabreichungsweg abhängen und wird des Weiteren gemäß der Größe des Wirtes variieren.
Gemäß der Erfindung hergestellte Moleküle finden weiterhin Anwendung in der Behandlung (prophylaktisch oder kurativ) von AIDS und verwandten Zuständen, durch Wirkung entweder zur Verdrängung der Bindung des HIV-Virus an menschliche oder tierische Zellen oder durch Störung der dreidimensionalen Organisation des Virus.
Immunoassays
Die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellten HIV-ähnlichen Teilchen sind nützlich als Immunogene, als Antigene in Immunoassays, einschließlich 'Enzyme- Linked-Immunosorbent'-Assays (ELISA), RIAs und anderen nicht-enzymverknüpften Antikörper-Bindungsassays, oder Vorgehensweisen, welche im Fachgebiet bekannt sind für das Screening von anti-retroviralen Verbindungen, für die Detektion von anti-retroviralen (zum Beispiel HIV) HIV-Antikörpern und retroviralem Antigen (zum Beispiel HIV). In ELISA-Assays werden Retrovirus-ähnliche Teilchen auf einer gewählten Oberfläche immobilisiert, zum Beispiel einer Oberfläche, die zum Binden von Proteinen in der Lage ist, wie den Vertiefungen einer Polystyrol-Mikrotiterplatte. Nach Waschen zum Entfernen von unvollständig adsorbierten Retrovirus-ähnlichen Teilchen, kann ein nicht-spezifisches Protein, wie eine Lösung von Rinderserumalbumin (BSA) oder Casein, welches bekanntermaßen antigenisch neutral in Bezug auf die Testprobe ist, an die gewählte Oberfläche gebunden werden. Dies gestattet die Blockierung von nicht-spezifischen Adsorptionsstellen auf der immobilisierenden Oberfläche und verringert somit den Hintergrund, der durch nichtspezifische Bindungen von Antiseren auf die Oberfläche verursacht wird.
Die immobilisierende Oberfläche wird dann mit einer Probe, wie zu testenden klinischen oder biologischen Materialien, in einer Weise kontaktiert, welche für eine Immunkomplex(Antigen/Antikörper)-Bildung förderlich ist. Dies kann das Verdünnen der Probe mit Verdünnungsmitteln, wie Lösungen von BSA, Rindergammaglobulin (BGG) und/oder phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)/Tween, einschließen. Die Probe wird dann etwa 2 bis 4 Stunden lang bei Temperaturen wie von der Größenordnung von etwa 25° bis etwa 37°C inkubieren gelassen. Im Anschluss an die Inkubation wird die mit den Proben kontaktierte Oberfläche gewaschen, um nicht-immunkomplexiertes Material zu entfernen. Das Waschvorgehen kann das Waschen mit einer Lösung, wie PBS/Tween oder einem Boratpuffer, einschließen.
Im Anschluss an die Bildung von spezifischen Immunkomplexen zwischen der Testprobe und den gebundenen Retrovirus-ähnlichen Teilchen und anschließendem Waschen können das Auftreten und sogar die Menge der Immunkomplex-Bildung bestimmt werden durch Unterziehen des Immunkomplexes an einen zweiten Antikörper mit Spezifität für den ersten Antikörper. Wenn die Testprobe von menschlichem Ursprung ist, ist der zweite Antikörper ein Antikörper mit Spezifität für menschliche Immunglobuline und im Allgemeinen IgG. Um Nachweismittel vorzusehen, kann der zweite Antikörper eine assoziiierte Aktivität aufweisen, wie eine enzymatische Aktivität, welche beispielsweise eine Farbentwicklung nach Inkubieren mit einem geeigneten chromogenen Substrat hervorbringen wird. Eine Quantifizierung kann dann durch Messen des Ausmaßes der Farberzeugung zum Beispiel unter Anwendung eines Spektrophotometers für sichtbare Spektren erreicht werden.
In einer diagnostischen Ausführungsform, in der es wünschenswert ist, Antikörper zu identifizieren, welche eine Vielzahl von HIV-Isolaten erkennen, wird eine Vielzahl von antigenisch verschiedenen HIV-ähnlichen Teilchen der vorliegenden Erfindung auf die gewählte Oberfläche immobilisiert. Wenn die Anti-HIV-Antikörper Epitope erkennen, welche unter verschiedenen HIV-Isolaten hochkonserviert sind (zum Beispiel ein B-Zell-Epitop aus gag oder gp41), kann alternativ dazu ein einzelnes oder eine begrenzte Anzahl an Retrovirusähnlichen Teilchen immobilisiert werden. In einer weiteren diagnostischen Ausführungsform, worin es wünschenswert ist, Antikörper spezifisch zu identifizieren, welche ein einzelnes HIV-Isolat (zum Beispiel LAI, MN, SF2 oder HXB2) erkennen, kann ein einzelnes besonderes HIV-ähnliches Teilchen der vorliegenden Erfindung immobilisiert werden. Diese weitere diagnostische Ausführungsform besitzt besondere Nützlichkeit auf den Gebieten der Medizin, klinischen Versuchen, Gerichts- und Forensik-Wissenschaft, wo es ausschlaggebend sein kann, das besondere HIV-Isolat zu bestimmen, welches für die Erzeugung einer Immunantwort, einschließlich einer Antikörperantwort, verantwortlich war.
In einer weiteren diagnostischen Ausführungsform kann es wünschenswert sein, immunologisch distinkte Retroviren spezifisch zu identifizieren, beispielsweise HIV-Isolate, welche unterschiedlichen Subtypen angehören. Immunologisch distinkte HIV-Isolate können zum Beispiel LAI, MN, SF2, HXB2 oder ein primäres HIV-1-Isolat einschließen. In dieser diagnostischen Ausführungsform ist ein jeweiliges HIV-ähnliches Teilchen der vorliegenden Erfindung nützlich zum Erzeugen von Antikörpern, einschließlich monoklonalen Antikörpern, welche ein solches immunologisch distinktes HIV-Isolat spezifisch erkennen.
Es versteht sich, dass eine Mischung von immunologisch distinkten HIV-ähnlichen Teilchen entweder als ein Immunogen zum Beispiel in einem Impfstoff oder als ein diagnostisches Agens verwendet werden kann. Es kann Umstände geben, bei welchen eine Mischung von HIV-ähnlichen Teilchen verwendet wird, um Kreuz-Isolat-Schutz und/oder -Diagnose vorzusehen. In diesem Fall wird die Mischung von Immunogenen üblicherweise als ein "Cocktail"-Präparat bezeichnet.
Die vorliegende Erfindung sieht in vorteilhafterweise HIV-ähnliche Teilchen vor, welche gag- und env-Genprodukte im Wesentlichen in ihren natürlichen Konformationen umfassen. Solche Retrovirusteilchen werden somit von konformationalen Anti-HIV-Antikörpern (wie Anti-env-Antikörpern) erkannt, welche das HIV-Antigen in einer denaturierten Form oder ein synthetisches Peptid, welches einem solchen HIV-Antigen entspricht, nicht erkennen können. Die HIV-ähnlichen Teilchen sind deshalb besonders nützlich als Antigene und als Immunogene in der Erzeugung von anti-retroviralen Antikörpern (einschließlich monoklonalen Antikörpern) in diagnostischen Ausführungsformen.
Andere Verwendungen
Moleküle, welche an die HIV-ähnlichen Teilchen binden, insbesondere Antikörper, Antikörperverwandte Moleküle und Strukturanaloga davon, sind ebenfalls von möglichen Nutzen als Mittel in der Behandlung und Diagnose von AIDS und verwandten Zuständen.
Varianten von Antikörpern (einschließlich Varianten der Antigen-Bindungsstelle), wie chimäre Antikörper, humanisierte Antikörper, furnierte Antikörper und technisch konstruierte Antikörper, welche für die Retrovirus-ähnlichen Teilchen spezifisch sind, sind innerhalb des Umfangs der Erfindung eingeschlossen.
Antikörper und andere Moleküle, welche an die HIV-ähnlichen Teilchen binden, können für therapeutische (prophylaktische und kurative) und diagnostische Zwecke in einer Anzahl von verschiedenen Weisen verwendet werden, einschließlich den Folgenden:
zur passiven Immunisierung durch geeignete Verabreichung von Antikörpern, möglicherweise humanisierten Antikörpern, an HIV-infizierte Patienten,
zum Aktivieren des Komplements oder zum Vermitteln von Antikörper-abhängiger zellulärer Cytotoxizität (ADCC) durch Verwendung von Antikörpern einer geeigneten Unterklasse oder eines geeigneten Isotyps (möglicherweise erhalten durch passendes Antikörper-Konstruieren), um in der Lage zu sein, die gewünschte Funktion auszuführen,
für die zielgerichtete Zuführung von Toxinen oder anderen Mitteln, zum Beispiel durch Verwendung von Immununtoxinen, welche Konjugate von Antikörper und einem cytotoxischen Rest umfassen, für eine direkte oder indirekte Bindung an zelloberflächen-exponierte HIV-Proteine von HIV-infizierten Zellen (zum Beispiel gp120),
für die zielgerichtete Zuführung von hochimmunogenen Materialien an die Oberfläche von HIV-infizierten Zellen, was zu einer möglichen Beseitigung solcher Zellen entweder durch das humorale oder zelluläre Immunsystem des Wirtes führt,
für eine Detektion von HIV unter Anwendung einer Vielzahl von Immunoassay-Techniken.
Somit sind in noch einer weiteren diagnostischen Ausführungsform der Erfindung, die immunogenen Zusammensetzungen (einzeln oder als Mischungen, einschließlich Cocktail-Präparationen) brauchbar für die Erzeugung von HIV-Antigen-spezifischen Antikörpern (einschließlich monoklonalen Antikörpern), welche verwendet werden können, um HIV oder Antigene zu detektieren oder HIV in Proben, einschließlich biologischen Proben, zu neutralisieren.
In einer alternativen diagnostischen Ausführungsform können die HIV-ähnlichen Teilchen verwendet werden, um HIV-spezifische T-Zellen in biologischen Proben zum Beispiel aus HIV-infizierten Individuen für die Diagnose oder Therapie spezifisch zu stimulieren.
Biologische Hinterlegungen
Bestimmte Plasmide, welche HIV-ähnliche Teilchen codieren und in Aspekten der vorliegenden Erfindung verwendet werden, welche hierin beschrieben sind und auf welche hierin Bezug genommen wird, sind bei der American Type Culture Collection (ATCC), welche sich in 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110 – 2209, USA, befindet, unter Befolgung des Budapester Vertrages und vor der Einreichung dieser Patentanmeldung hinterlegt worden. Proben der hinterlegten Plasmide werden der Öffentlichkeit nach Erteilung eines Patentes, basierend auf dieser US-Patentanmeldung zugänglich gemacht werden, und alle Einschränkungen, welche dem Zugang zu der Hinterlegung gesetzt sind, werden dann aufgehoben. Hinterlegungen werden ersetzt, wenn die Hinterlegungsstelle nicht in der Lage ist, lebensfähige Proben auszuteilen. Die hierin beschriebene und beanspruchte Erfindung ist hinsichtlich des Umfangs nicht durch die hinterlegten Plasmide beschränkt, da die hinterlegte Ausführungsform lediglich als eine Veranschaulichung der Erfindung beabsichtigt ist. Jedwede äquivalenten oder ähnlichen Plasmide, welche ähnliche oder äquivalente HIV-ähnliche Teilchen, wie beschrieben in dieser Patentanmeldung, codieren, liegen innerhalb des Umfangs der Erfindung.
Hinterlegungszusammenfassung
BEISPIELE
Die obenstehende Offenbarung beschreibt die vorliegende Erfindung im Allgemeinen. Ein vollständigeres Verständnis kann durch Bezugnahme auf die folgenden spezifischen Beispiele erhalten werden. Diese Beispiele sind lediglich zu Zwecken der Veranschaulichung beschrieben und mit ihnen wird nicht beabsichtigt, den Umfang der Erfindung zu beschränken. Obwohl spezifische Begriffe hierin verwendet worden sind, sind derartige Begriffe in einem beschreibenden Sinn und nicht zu Zwecken von Einschränkungen beabsichtigt. Immunologische und rekombinante DNA-Verfahren können in dieser Offenbarung nicht explizit beschrieben werden, liegen aber allgemein innerhalb des Kenntnisstandes des Fachmanns auf dem Gebiet.
Beispiel 1:
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion des Plasmids p83-19.
Das Plasmid p83-19 wurde, wie beschrieben in der WO 96/06177, aus pMTHIVBRU (ATCC 75852), wie gezeigt in 3 davon, konstruiert. pMTHIVBRU wird in den zuvor erwähnten U.S.-Patenten Nr. 5 439 809 und 5 571 712 beschrieben. Das Plasmid p83-19 enthält ein Hybrid-Hüllgen, welches konstruiert wurde durch Ersetzen von DNA, codierend den Großteil von gp120_LAI, mit der entsprechenden DNA, die gp120_MN codiert. Dieses Ergebnis wurde durch Ersetzen eines Kpal/BglII-DNA-Fragments (Nukleotide 6379 bis 7668) aus HIV-1_LAI mit dem KpnI/BglII-DNA-Fragment (Nukleotide 6358 bis 7641) aus HIV-1-_MIN bewerkstelligt. Die genetische Karte für das Plasmid p83-19 wird in der 1 gezeigt.
Beispiel 2
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion des Plasmids pCMVgDtat^-vpr^-.
Das Plasmid pCMVgDtat^-vpr^- wurde aus dem Plasmid p83-19 (Beispiel 1) konstruiert. Der humane Metallothionein-Promotor aus p83-19 wurde mit dem humanen Cytomegalovirus(CMV)-Promotor- und Enhancer-Element sowie CMV-Intron-A-Sequenzen ersetzt. Die CMV-Sequenzen, welche verwendet wurden, entsprechen einem SspI-PstI-DNA-Fragment (Nukleotide 460 bis 2087), welches in Ref. 9 beschrieben ist. Das Signalpeptid-Fragment aus HIV-1-gp120 wurde ersetzt durch das Signalpeptid-Fragment des Glycoproteins D (gD) von Herpex Simplex Virus (HSV). Dies wurde durch Gen-Assemblierung-unterstützte Mutagenese (GAAM) bewerkstelligt, wie früher beschrieben (Ref. 10).
Es wurden drei Oligonukleotide synthetisiert: Ein Stromaufwärts-Primer mit der Sequenz 5'-TATGACGACAAACAAAATCACGGCCCCCAACCTGGCGGCAGTCCCCCCCATTGCCACTGTCTTCTGCTCTTTCTATTA-3' (SEQ ID NR.: 1), in welchem die letzten 27 Nukleotide komplementär zu den Nukleotiden 6230 bis 6256 von HIV-1_LAI sind (sämtliche Nukleotidnummerierung erfolgt in Übereinstimmung mit Ref.11 und der HIV-Los Alamos-Datenbank 1988); ein Stromabwärts-Primer mit der Sequenz 5'-CCCATAATAGACTGTGACCCACAATTTTTCTGTGAGAGAGGCATCCGCCAAGGCATATTTGC CGCGGACCCCATGGAGGCCCAC-3' (SEQ ID NR.: 2), in welchem die ersten 33 Nukleotide komplementär zu den Nukleotiden 6347 bis 6379 von HIV-1_LAI sind; ein Verbrückungs-Oligonukleotid mit der Sequenz 5'-TTGTTTGTCGTCATAGTGGGCCTCCATGGG-3' (SEQ ID NR.: 3), in welchem die ersten 15 Oligonukleotide komplementär zu den am 5'-Ende gelegenen 15 Nukleotiden des Stromaufwärts-Oligonukleotides sind, während die letzten 15 Nukleotide komplementär zu den am 3'-Ende befindlichen 15 Nukleotiden des Stromabwärts-Primers sind.
Die Expression des Großteils des Tat-Proteins wurde verhindert durch Inserieren von zwei Stop-Codons (Nukleotide TAATAG), welche die Nukleotide TGGAAG (Nukleotide 5896 bis 5901) von HIV-1_LAI ersetzten. Diese Mutation wurde durch ortsgerichtete Mutagenese unter Verwendung des folgenden Oligonukleotides erzeugt: 5'-GACTTCCTGGATGCTATTAGGGCTCTAGTCTAG-3' (SEQ ID NR.: 4). Die Expression des Großteils des Vpr-Proteins wurde verhindert durch Inserieren eines Stop-Codons (Nukleotide TAG) an zwei verschiedenen Orten innerhalb der Vpr codierenden Sequenzen. Das erste Stop-Codon ersetzte die HIV-1_LAI-Nukleotide 5625 bis 5627, während das zweite Stop-Codon die Nukleotide 5631 bis 5633 ersetzte. Diese Mutationen wurden durch ortsgerichtete Mutagenese unter Verwendung des folgenden Oligonukleotids inseriert: 5'-AAGACCAAGGGCCATAGAGGTAGCCACACAATGAA-3' (SEQ ID NR.: 5). Schließlich wurde das Gen, welches Resistenz gegen G418 vermittelt, co-linear in das gleiche Plasmid inseriert und unter die Regulierung der SV40-Promotor- und Polyadenylierungs-Sequenzen eingesetzt. Eine Karte des resultierenden Plasmids pCMVgDtat^-vpr^- wird in der 2A gezeigt, wohingegen Einzelheiten der genomischen Modifikationen in der 2B gezeigt sind.
Beispiel 3:
Dieses Beispiel veranschaulicht die konstitutive Expression von HIV-1-ähnlichen Teilchen aus einem Vero-Zell-Klon, der nach stabiler Transfektion mit dem Plasmid pCMVgDta^-vpr^- etabliert wurde.
Das Plasmid pCMVgDtat^-vpr^-, das wie beschrieben in Beispiel 2 hergestellt wurde, wurde stabil in Affennieren-Vero-Zellen durch das Transfinity(BRL)-Calciumphosphat-Vorgehen transfiziert. Ungefähr 400 stabile G418^R-Zelllinien wurden geklont und hinsichtlich der Produktion von HIV-1-ähnlichen Teilchen durch Messen der Menge an Teilchen-assoziiertem Gag-p24-Protein in den Kulturüberständen gescreent, wie beschrieben in den U.S.-Patenten Nr. 5 439 809 und 5 571 712. Eine Zelllinie, welche etwa 50 ng/ml p24 sezerniert, wurde identifiziert (Klon Vero-356), und erzeugte festgestellermaßen stabil HIV-1-ähnliche Teilchen bei zunehmender Passagezahl, wie veranschaulicht in der 3, Tafeln A und B. HIV-1-ähnliche Teilchen wurden durch Ultrazentrifugation isoliert, und pellettierte Teilchen wurden mittels Western-Blot analysiert, wie beschrieben in WO 96/06177, wobei für p24 (anti-p24) und gp120 (Mab 50.1) spezifische monoklonale Antikörper verwendet wurden (3, Tafeln A und B). Die Western-Blot-Analyse zeigt die fortgesetzte Produktion von HIV-ähnlichen Teilchen nach über 50 Passagen, was in ausgesprochenem Gegensatz zu den früher erzielten Ergebnissen steht.
Die Spiegel der Teilchenproduktion wurden durch Induzieren des Klons Vero-356 mit 5 mM Natriumbutyrat (NaBu) um das Dreifache, und durch Induzieren der Zelllinie mit einer Mischung von 5 mM NaBu und 400 ng/ml Dexamethason (Dexam) um das Fünf- bis Achtfache erhöht (3, Tafel C).
LITERATUR-BEZUGSTELLEN

1. World Health Organization, 1996. Wkly Epidemiol. Rec. 48.361.
2. Haynes B. F., Pantaleo G., Fauci A, S. 1996. Science 271:324-328.
3. Bryson Y.T., Pang S. „ Wei L.S. et al. 1995. N. Engl. J. Med. 332:833-834.
4. Rowland-Jones s., Sutton J., Ariyosh K., et al. 1995. Nat. Med. 1:59-64.
5. Pincus S., Messer K.G., Nara T.L., et al. 1934. J. Clin. Invest. 93:2508-2513.
6. Hogervorst E., Jurrians S., de Wolf F., et al. 1995. J. Infect. Dis. 171:811-821.
7. Markham R.B „ Coberly J., Ruff A.J., et al. 1994. Lancet 343:1364.
8. Moore J.P. 1995. Nature 376:115.
9. Chapman, B.S. et al. 1991. Nucleic Acids Res. 19:3979-3986.
10. Yao F-L., Klein M.H., Loosmore S., Rovinski B. 1995. Bio Techniques 18:372-376.
11. Wain-Hobson S., Sonigo p., Danos o., Cole S., Alizon M. 1985. Cell 40:9-17.

SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Nukleinsäuremolekül, umfassend ein modifiziertes HIV-Genom, dem lange terminale Wiederholungseinheiten fehlen und in dem vpr- und tat-Sequenzen funktional unterdrückt sind, und einen konstitutiven Promoter, der operativ mit dem modifizierten HIV-Genom verknüpft ist zur konstitutiven Expression des modifizierten Genoms zur Erzeugung von nichtinfektiösen, nicht-replizierenden und immunogenen HIV-ähnlichen Teilchen, wobei das HIV-Genom weiterhin modifiziert ist, um eine Reduktion der gag-abhängigen RNA-Packung des gag-Genprodukts zu bewirken.
Nukleinsäure wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei die vpr- und tat-Sequenzen funktional durch Insertion eines Stop-Codons darin unterdrückt werden, was die Expression der jeweilig codierten Genprodukte verhindert.
Nukleinsäuremolekül wie in Anspruch 1 oder 2 beansprucht, wobei das HIV-Genom weiterhin modifiziert ist durch Ersetzen der das Signalpeptid codierenden Sequenz von gp120 durch die das Signalpeptid codierende Sequenz von Glycoprotein D des Herpes Simplex Virus.
Nukleinsäuremolekül wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 beansprucht, wobei das env-Gen ein env-Genprodukt aus einem primären HIV-1-Isolat codiert.
Nukleinsäuremolekül wie in einem der vorstehenden Ansprüche beansprucht, wobei die Reduktion in der gag-abhängigen RNA-Packung des gag-Genprodukts bewirkt wird durch Ersetzen von Cys 392 und Cys 395 des gag-Genprodukts des HIV-1-LAI-Isolats, oder der entsprechenden Aminosäuren eines anderen HIV-Isolats, durch Serin.
Nukleinsäuremolekül wie in einem der vorstehenden Ansprüche beansprucht, wobei das HIV-Genom weiterhin modifiziert ist, um die revers- Transcriptase-Aktivität, Integrase-Aktivität und RNAse-Aktivität zu eliminieren.
Nukleinsäuremolekül wie in Anspruch 6 beansprucht, wobei einBalI-BalI-Teil des pol-Gens zwischen den Nukleotiden 2655 und 4507 des LAI-Isolats des HIV-1 oder ein entsprechender Teil des pol-Gens eines anderen HIV-1 Isolats entfernt ist.
Nukleinsäuremolekül wie in einem der Ansprüche 1 bis 7 beansprucht, wobei der konstitutive Promoter der human immediate early Cytomegalovirus-Promoter ist.
Nukleinsäuremolekül wie in Anspruch 8 beansprucht, wobei eine die Expression verstärkende Sequenz zwischen dem Promoter und dem modifizierten Genom vorgesehen ist.
Nukleinsäuremolekül wie in Anspruch 9 beansprucht, wobei die die Expression verstärkende Sequenz die menschliche Cytomegalovirus-Intron-A-Sequenz ist.
Expressionsvektor, umfassend ein Nukleinsäuremolekül wie in einem der Ansprüche 1 bis 10 beansprucht.
Expressionsvektor wie in Anspruch 11 beansprucht, mit Identifizierungseigenschaften des Plasmids pCMVgDtat^-vpr^- wie in 2A gezeigt, wie hinterlegt unter ATCC Hinterlegungsnr. 209446.
Verfahren zur Herstellung eines nicht-infektiösen, nicht-replizierenden, immunogenen HIV-ähnlichen Teilchens, umfassend: Einführen eines Expressionsvektors nach Anspruch 11 oder Anspruch 12 in Säugerzellen, und konstitutive Expression des Nukleinsäuremoleküls in dem Expressionsvektor in den Zellen, um nicht-infektiöse, nicht-replizierende, immunogene HIV-ähnliche Teilchen zu produzieren.
Verfahren wie in Anspruch 13 beansprucht, wobei die Expression des Nukleinsäuremoleküls auch induziert ist.
Nicht-infektiöses, nicht-replizierendes, immunogenes HIV-ähnliches Teilchen ohne Tat und Vpr und erhalten durch das Verfahren wie im Anspruch 13 oder Anspruch 14 beansprucht.
Immunogene Zusammensetzung, umfassend ein nicht-infektiöses, nicht-replizierendes, immunogenes HIV-ähnliches Teilchen nach Anspruch 15 und ein physiologisch annehmbarer Träger dafür.
Nicht-infektiöses, nicht-replizierendes, immunogenes HIV-ähnliches Teilchen nach Anspruch 15 zur Verwendung als ein Medikament.
Nicht-infektiöses, nicht-replizierendes, immunogenes HIV-ähnliches Teilchen nach Anspruch 15, zur Verwendung in der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von retroviraler Erkrankung, vorzugsweise durch Immunisierung.