DE69936464T2

DE69936464T2 - Gp120-mutanten und deren biologische verwendungen

Info

Publication number: DE69936464T2
Application number: DE69936464T
Authority: DE
Inventors: Francisco Veas; Martine Cerutti
Original assignee: Institut de Recherche pour le Developpement IRD
Current assignee: Institut de Recherche pour le Developpement IRD
Priority date: 1998-11-27
Filing date: 1999-11-29
Publication date: 2008-03-13
Anticipated expiration: 2019-11-30
Also published as: FR2786488B1; FR2786488A1; WO2000032786A1; CA2352603A1; DE69936464D1; CA2352603C; US7078038B1; EP1159427B1; ATE366258T1; EP1159427A1; JP4489299B2; JP2002542146A

Description

Die Erfindung betrifft Mutanten von gp120 und deren Verwendungen.
Es ist bekannt, dass in die Wechselwirkungen zwischen dem CD4 der Zielzellen und dem gp120 von HIV konservierte gp120-Bereiche, insbesondere ein Tryptophan (W) in Position 427 gemäß der Aminosäurennummerierung von Kwong et al. (Referenz (1) in der bibliographischen Liste am Ende der Anmeldung), involviert sind.
In dem Artikel von Misse et al (2), von dem bestimmte Mitverfasser Miterfinder der vorliegenden Anmeldung sind, wurde gezeigt, dass eine stabile Struktur, eine so genannte konservierte gp120-Struktur, welche in der Zone C1, und zwar der amphipathischen Helix α1, enthalten ist, in die Wechselwirkungen mit dem CD4-Rezeptor involviert ist. Darüber hinaus hat die Konstruktion von gp120 ohne -Helix α1 gezeigt, dass eine Wechselwirkung mit der Zielzelle, insbesondere mit dem CXCR4-Rezeptor, einem Chemokinrezeptor auf den Lymphozyten, weiterhin möglich bleibt.
Durch Induzieren von spezifischen punktuellen Mutationen in den konservierten Strukturen von gp120, insbesondere der -Helix α2, haben die Erfinder die durch diese Strukturen bei den Wechselwirkungen mit den Zielzellen gespielte essentielle Rolle, sei es eine direkte oder indirekte, ermitteln können. Denn die durch eine eingebrachte Mutation hervorgerufene trans-Konformation dieser Strukturen ermöglichte es, wie in den Beispielen veranschaulicht, Bereiche, die normalerweise versteckt sind und die in diese Wechselwirkungen involviert sind, zu demaskieren und auf diese Weise Moleküle zur Verfügung zu stellen, die in der Lage sind, als Impftarget zu dienen.
Die Erfindung betrifft daher Mutanten von gp120, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie in der Helix α2 von gp120 eine Mutation eines Tryptophanrests in Position 338 zu einem Serinrest tragen.
Diese Mutation befindet sich in einem Bereich von gp120, welcher der Wechselwirkungskavität mit CD4 entspricht.
Diese einzige Mutation vermag es ein gänzliches Ausbleiben der Zellverschmelzung zu induzieren, wenn man CD4⁺-Zielzellen in die Gegenwart von CXR4' und Zellen, die das W338S mutierte gp120 exprimieren, bringt.
Der Virus, der durch eine Hülle ergänzt ist, welche die Mutation W338S auf dem Niveau von gp120 trägt, ist nicht mehr in der Lage die Zellen zu infizieren (siehe 1).
Da W, wie bereits erläutert, einen Teil der konservierten Struktur α2 darstellt, befindet sich diese Aminosäure folglich in der zweiten Tasche, welche aromatische Reste und hydrophobe Reste enthält.
Diese Mutation weist daraufhin, dass diese Struktur in die Wechselwirkung mit den Co-Rezeptoren, beispielsweise CXCR4, angesichts von biologischen Ergebnissen, involviert ist.
Die Erfindung betrifft insbesondere die Mutanten von gp120, welche – neben der Mutation W338S – eine Mutation in der Helix α1 von gp120 von Tryptophanresten an den Positionen 96 und 112 zu Serinresten tragen.
Eine derartige Mutation induziert ein gänzliches Ausbleiben der Zellverschmelzung. Die im Folgenden im Beispielabschnitt erläuterten Zellverschmelzungstest zeigen folglich, dass die Substitution von W112S die Bildung von Synzytien zwischen HeLa-Tat-Zellen (die ein diese Mutation enthaltendes gp160 exprimieren) und HeLa P4-Zellen aufhebt. Darüber hinaus ist ein Virus, der diese Mutation ent hält, unfähig menschlische Lymphozyten zu infizieren. Eine Substitution dieses W (aromatischer bizyklischer Rest) durch einen aromatischen (monozyklischen) Rest verringert diese Funktionen, unterdrückt diese jedoch nicht.
Darüber hinaus ist bei derartigen Mutanten die Wiedererkennung durch Antikörper, welche für die von Cordonnier et al (3) definierte CD4-Bindungsstelle spezifisch sind, stark verringert.
Diese Ergebnisse zeigen folglich, die von der konservierten Struktur der Helix α1 für die Bindung an CD4 gespielte Hauptrolle.
Zusätzlich zu der Mutation in Position 112, können derartige Mutanten ebenfalls eine Mutation von F in Position 383 zu Alanin und gegebenenfalls des Tryptophans in Position 427, welches durch ein Glyzin ersetzt wird, und/oder des Tryptophans in Position 479, welches durch eine nicht-aromatische Aminosäure ersetzt wird, und zwar Serin, aufweisen.
Die in (1) veröffentlichten kristallographischen Daten haben es einerseits ermöglicht die Position der Helix α1 von gp120 in dieser dreidimensionalen Struktur und andererseits der Tryptophanreste zu visualisieren.
Diese Daten haben die Ergebnisse der bereits erläuterten biologischen Experimente bestätigt.
Insbesondere befindet sich W 112 in der hydrophoben Tasche, welche als Wechselwirkungstasche von gp120 mit CD4 beschrieben wird; diese Tasche wird durch einen „Cluster" aus aromatischen Resten gebildet, der mit einem anderen aromatischen Rest dem F43 von CD4 interagiert. Darüber hinaus kristallisiert sich durch diese Studien heraus, dass die Tryptophanreste eine strategische Position in dieser Tasche besitzen. Folglich wird jede Mutation eines von ihnen diese „Kavität" destabilisieren und jede Bindung mit dem F43 von CD4 verhindern.
Dadurch, dass die erfindungsgemäßen Mutanten es ermöglichen die Rolle der konservierten Strukturen zu untersuchen, schaffen die erfindungsgemäßen Mutanten eine neue Art und Weise sich mit den Wechselwirkungen zwischen infektiösen Substanzen und Zielzellen auseinander zu setzen. Ein besseres Verständnis der Funktionalität der unterschiedlichen, konservierten Strukturen, welche in die Wechselwirkungen zwischen pathogenen Substanzen und Zielzellen involvierten sind, ermöglicht nämlich die Entwicklung von therapeutischen oder immunisierenden Molekülen gegen HIV.
Die Erfindung macht sich die Identifizierung dieser Wechselwirkungstaschen zu nutzen und zielt auf Verbindungen ab, die geeignet sind CD4 nachzuahmen und die folglich inhibierende Eigenschaften hinsichtlich gp120 aufweisen.
Sie betrifft ebenfalls extrazelluläre Schleifen von Co-Rezeptoren nachahmende Peptide, die in der Lage sind in den genannten hydrophoben Taschen unterzukommen.
Die Erfindung betrifft ebenfalls Peptide, die in der Lage sind die bereits erläuterten konstanten Bereiche von gp120 nachzuahmen und geeignet sind Kandidaten wie Impfstoffe darzustellen. Die Erfindung stellt daher Modelle zum Entwerfen derartiger Kandidaten zur Verfügung.
Darüber hinaus ist es, durch das Vornehmen von Mutationen auf der ersten Kavität möglich Transformationen von gp120 zu induzieren, welche eine bessere Exposition der zweiten Kavität, und infolgedessen von gp120 in der Eigenschaft als Antigen ermöglichen Vorteilhafterweise erhält man dadurch eine auf diese konstanten, gewöhnlicherweise versteckten Bereiche angepasste Immunantwort.
Durch derartige Transformationen ist es ebenfalls möglich Dissoziationen zwischen gp120 und gp41 zu induzieren. Wie in den im Folgenden gezeigten Beispielen bewiesen wird, wird keine Verschmelzung beobachtet, wenn man Viren verwendet, die durch ein gp160, welches eine Mutation auf dem Niveau von gp120 trägt, er gänzt sind, während das für die Verschmelzung verantwortliche Glycoprotein gp41 ist. Die Mutation auf gp120 stellt folglich ein Ziel zum Verhindern der Verschmelzung des Virus dar. Folglich werden Schlüssel-Epitope zum Verhindern einer HIV-Infektion zur Verfügung gestellt.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden in den folgenden Beispielen aufgezeigt, wobei auf die 1 bis 8 verwiesen wird, von denen
1 die Ergebnisse der Infektivitätstests der Pseudoviren HIV-1, die durch eine Hülle ergänzt sind, welche die erfindungsgemäßen Mutationen auf dem Niveau von gp120 trägt,
2 die Kristallstruktur von gp120,
3 die Ergebnisse der Test der biologischen Aktivität von rgp120 mit einem polyklonalen Kanninchen-Anti-gp120-Antikörper,
4 die Reaktivität von rgp120 mit AcM CG10,
5 die Reaktivität von rgp120, welches auf CD4 mit AcM CG10 komplexiert ist,
6 die Reaktivität von rgp120 mit AcM 4.8d,
7 die Reaktivität von rgp120, welches auf CD4 mit AcM 4.8d komplexiert ist, bzw.
8 die Reaktivität von rgp120 mit AcM 17b,
veranschaulichen.
Beispiel: Gewinnung und Studium der Mutanten von gp120.
Diese Mutanten von gp120 wurden in mehreren biologischen Systemen getestet.
(i) die Zellverschmelzung (auf der Oberfläche der Zellen mutierte Hüllen), (ii) die viralen Infektionen (durch mutiertes gp120 ergänzte Pseudoviren), (iii) Topologieanalyse dieser mutierten gp120 durch unterschiedliche monoklonale Antikörper, welche unterschiedliche Epitope von gp120 in den „CD4-Bindungsstellen" erkennen, und (iv) Analyse von gp120 über kristallographische Daten.
Diese Experimente wurden unter Verwendung der folgenden Materialien und Verfahren durchgeführt.
Plasmide, Antikörper und Pseudoviren
Das pHXB2ENV-Plasmid (Kode für die Hülle gp160 von HIV-IIIE), das pCMVrev-Plasmid (Kode für das Rev-Protein unter Kontrolle des CMV-Promotors), und der monoklonale Antikörper 902 (welcher gegen die Schleife V3 von gp120 gerichtet ist), wurden vom NIH AIDS Research and Reference Reagent Program (EU) erhalten. Der Pseudovirus pNL4-3env-GFP wurde vom Dana-Farber Cancer Institute, Boston, EU, geliefert. Dieses Plasmid enthält das Genom von HIV-1 NL4-3, das aus dem Env-Gen gelöscht wurde, sowie eine Substitution des Nef-Gens durch das Gen, welches das Protein GFP (Green Fluorescent Protein) kodiert.
Gezielte Mutagenese in der Helix α1 von gp120

Um die in der helicalen α1 Struktur von gp120 vorliegenden Reste W zu untersuchen, wurde der NdeI-HincII-Bereich des gp120 kodierenden Gens rekonstruiert. Hierfür hat man ein Oligonukleotid verwendet, in welches zwei von der Helix α1 (2) umgebene Restriktionsstellen (HpaI et HindIII) eingeführt wurden. Die Helix α1 von gp120 besitzt zwei Tryptophanreste (W96 et W112) (4). Die Stellen HpaI und HindIII haben es ermöglicht, für jedes Konstrukt ein HPaI-HindIII Fragment des Wildtyps gegen ein mutiertes HpaI-HindIII-Fragment auszutauschen. Die Mutationen wurden entweder gleichzeitig an beiden W oder an einem Tryptophan vorgenommen. Die gezielte Mutagenese wurde durch das Verfahren mit überlappenden, zwischen der HpaI- und HindIII-Stelle des Plasmids pBS eingeschlossenen Oligonukleotiden durchgeführt. Die folgende Tabelle 1 gibt nur die Oligonukleotide an, welche die gewünschte Mutation enthalten. Tabelle 1

Mutanten	Oligonukleotide
96W/S	⁵AAC GTC ACA GAA AAT TTT AAC ATG AGT AAA AAT G³
112W/S	⁵GAT ATA ATC AGT TTA TCT GAT CAA AGC³
96W	⁵AAC GTG ACA GAA AAT TTT AAC ATG TGG AAA AAT G³
112W	⁵GAT ATA ATC AGT TTA TGG GAT CAA AGC³

Zell-Zell-Verschmelzung
Die Expressionsvektoren, welche die unterschiedlichen Hüllen gp160 (pHXB2ENV, 500ng) enthalten, wurden co-transfiziert mit 500 ng von pCMV-rev in HeLa-Tat-Zellen. Das verwendete Transfektionsverfahren war die in (2) beschriebene Lipofektion (Lipofectamin, GIBCO).
pCMV-rev ist notwendig um die Expression des in dem pHXB2-ENV-Plasmid vorliegenden ENV-Gens zu aktivieren. Die transfizierten Zellen wurden anschließend, wie in (2) beschrieben in eine Co-Kultur mit HeLaP4-Zellen (CD4-LTR LacZ) eingebracht.
Expression von mutiertem gp120 auf der Zelloberfläche
Die verwendete Transfektionstechnik war die gleiche wie die im Fall der Zell-Zell-Verschmelzung verwendete.
Vierundzwanzig Stunden vor der Co-Transfektion wurden die HeLa-Tat-Zellen in mit Glasplättchen (12 mm Durchmesser) abgedeckten Mulden mit einem Durchmesser von 3,5 cm eingebracht. Die Zellen wurden 48 Stunden nach der Co-Transfektion mit Acm 902 (welches gegen die Schleife V3 von gp120 gerichtet ist) mit einer Konzentration von 10 μg/ml inkubiert. Diese Inkubation wurde in Ge genwart von 0,1% Natriumazid (NaN₃) und in PBS-Puffer durchgeführt. Nach 2 Waschvorgängen mit PBS 0,3% BSA/0,1 NaN₃ wurden die Zellen anschließend mit einem Texas-red-(DNA-Sonde)-markierten Mäuse-anti-IgG-Antikörper inkubiert. Nach 3 extensiven Waschvorgängen wurden die Zellen während 2 Minuten mit einer Ethanol-Aceton-(1:2)-Mischung fixiert. Nach dem Anbringen der Glasplättchen auf Streifen mit Mowiol, wurden die Zellen mittels konfokaler Mikroskopie untersucht.
Dosierung von p24 durch ELFA (Enzyme linked fluorescent assay)
Die Dosierung von p24 wurde mit einem automatischen VIDAS VIH DUO System (BioMérieux) durchgeführt. Dieser Test beruht auf einer gleichzeitigen Detektion der p24-Antigenämie und von anti-HIV-1- und anti-HIV-2-Antikörpern. Das Prinzip des Tests assoziiert zwei immuno-enzymatische Reaktionen mit einer Fluoreszenzdetektion. Dieser Test ist mit einem Einwegkegel ausgestattet, der sowohl als Festphase als auch als Pipetiersystem dient. Im unteren Teil des Kegels sind drei Synthesepeptide (gp41, gp36 und ein spezifisches Peptid des O-Typs) angebracht, die an mit alkalischer Phosphatase markierten Acm von Mäuse-anti-human-IgG konjugiert sind. Im oberen Teil des Kegels sind Acm-anti-p24 angebracht. Während der Durchführung des Tests, wird ein biotinylierter Kanninchen-anti-p24-Antikörper vom (konjugiert an alkalische Streptavidin-Phosphatase) gleichzeitig mit der Probe zugegeben. Das Substrat 4-Methyl-Ombelliferyl-Phosphat ermöglicht es die Fluoreszenz zu messen, welche proportional zu der in der Probe vorliegenden Menge an Ac anti-HIV und/oder Ag p24 ist. Die Reaktion tritt in 90 Minuten auf und die Fluoreszenz wird mit einem spezifischen Lesegerät für den VIDAS-Test (Wellenlänge 450 nm) ausgelesen.
Infektionen von menschlichen Lymphozyten mit durch Komplementation erhaltenen, mutierte Pseudoviren
Die 293-Zellen wurden mit 10 μg des Pseudovirus pNL4-3 GFP, 2 μg des pHXB2-Plasmids ENV (unterschiedliche Mutationen im SU gp120 enthaltend oder nicht enthaltend) und 1,5 μg des CMV-rev-Plasmids transfiziert. Hierfür wurde das Calciumphosphat-Transfektionsverfahren verwendet. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurden die Überstände der Zellen entnommen, gefiltert und bei –80 °C bis zur Verwendung konserviert. Eine p24-Messung wurde anschließend an diesen unterschiedlichen Überständen durchgeführt. Menschliche Lymphozyten, welche vorab 3 Tage lang mit 10 μg/ml PHA (Phytohemaglutinin), 50 U von IL-2 in einem RPMI-1640-10% FCS-Nährmedium (fötales Kälberserum) stimuliert wurden, wurden mit den unterschiedlichen Überständen der transfizierten 293-Zellen (welche eine identische p24-Konzentration enthalten) inkubiert.
Die infektiöse Kapazität der unterschiedlichen Überstände wurde mit Fluoreszenzmikroskopie (Expression des GFP-Proteins in den Lymphozyten) visualisiert und über die p24-Dosierung (periodisch alle 3 Tage fortgesetzt) in den Überständen der infizierten Lymphozytenkulturen bestimmt.
Strukturanalysen
Die Struktur des aus dem gp120-Kern, den zwei ersten CD4-Domainen und dem Fab-Fragment des neutralisierenden Antikörpers 17b gebildeten Komplexes wurde kürzlich durch Röntgen-Kristallographie (1) bestimmt. Diese Struktur wurde in der Proteindatenbank (pdb) unter dem Zugriffskode "Igc1" hinterlegt. Die Strukturkoordinaten dieses Komplexes wurden mit Insight I Software (MSI für molekulare Simulationen) auf der graphischen Station O₂ (Silicon Grafic O₂) analysiert. Die Visualisierung und die Modellierung der gp120- und CD4-Domainen erfolgte unter Verwendung des Programms Discover (MSI) unter einer Insigth II-Umgebung.
Ergebnisse
Fusiogene Kapazitäten der gp160-Hülle

Um fusiogene Kapazitäten der unterschiedlichen gp160-Hüllen, welche auf der Oberfläche der HeLa-Tat-transfizierten Zellen exprimiert sind, zu ermitteln, wur den diese Zellen in eine Co-Kultur mit HeLa P4-Zellen (CD4 LTR LacZ) eingebracht. Die erhaltenen Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle 2 gezeigt.

Mutationen von gp120	Prozentsatz der Fusionsfokusse
Wildtyp	100% (etwa 1500 Fusionsfokusse/-mulden)
96W/S und 112W/S	0%
96W/I und 112W/I	0%
96W/S	nicht bestimmt
112W/S	0%
427W/S	0%
338W/S	0%
Kontrolle	0%

Bei der Untersuchung dieser Ergebnisse stellte sich heraus, dass die gleichzeitige Mutationen der beiden Tryptophanreste der Helix α1 (W96 et W112) zu Serin die gp160-Hülle außerstande setzen Syncytien zwischen den Zellen zu induzieren. Das gleiche Phänomen wird bei einer gp160-Hülle beobachtet, welche die punktuelle Mutation 112 W/S und/oder 338 W/S aufweist. Dagegen reduziert die Substitution eines Tryptophanrests (W) durch einen aromatischen Phenylalaninrest (F), mit einer nahen Hydrophobizität, die fusiogenen Kapazitäten der mutierten Hüllen um etwa 50%. Man kann feststellen, dass dieses Phänomen unabhängig von dem Konstrukt, nur beobachtet wird, wenn der Rest W112 und/oder der Rest W338 involviert ist (sind), wodurch die biologische Bedeutung dieses oder dieser Reste im Verhältnis zu der Gruppierung W96 (im Rahmen dieser Experimente) angezeigt wird. Alle diese Ergebnisse wurden mit denen verglichen, welche mit einer gp160-Hülle des Wildtyps erhalten wurden (in der man etwa 1500 Fusionsfokusse beobachtet). Die Negativkontrolle wurde in eine Co-Kultur von nicht transfizierten HeLa-Tat-Zellen mit HeLa P4-Zellen eingebracht (kein Fusionsfokus wurde beobachtet).
Diese Ergebnisse zeigen, dass der Rest W112 und/oder der Rest W338 in die gp120-Zielzellen-Wechselwirkungen involviert ist (sind), welche dem Phänomen der Zellverschmelzung vorangehen.
Expression von gp120-Proteinen auf der Zeltoberfläche
Gp120 wurde durch gegen die Schleife V3 von gp120 gerichtetes Acm 902 detektiert. Letzteres wurde anschließend durch ein an Texas-red gekoppeltes Mäuse-anti-IgG entwickelt. Es stellte sich heraus, dass sowohl das gp120 des Wildtyps als auch das 112W/S-gp120 auf der Oberfläche der Zellen exprimiert werden. Die Inkubation des Antikörpers 902 mit nicht-transfizierten HeLa-Tat-Zellen gibt kein Signal.
Infektiöse Kapazitäten der ergänzten Pseudoviren
1 zeigt die Veränderung der p24-Rate in den Überständen der Lymphozyten (vorab mit 10 μg/ml PHA und 50 U/ml IL2 aktiviert), welche mit

– dem durch gp120 des Wildtyps ergänzten Pseudovirus (Linie -•-)
– dem durch mutiertes gp120 (gp120 112W/S) ergänzten Pseudovirus (Linie -o-)
– dem durch mutiertes gp120 (gp120 338W/S) ergänzten Pseudovirus (Linie -∎-)

Im ersten Fall verringert sich die p24-Rate zuerst, um (ab dem zehnten Tag nach der Infektion) beträchtlich anzusteigen, was die Anwesenheit eines neu synthetisierten, durch die virale Infektion erzeugten p24 beweist.
In dem zweiten Fall verringert sich die p24-Rate schrittweise um am zwanzigsten Tag (nach dem in Kontakt bringen) vollständig zu verschwinden. Dank der Mutation 112 W/S von gp120 hat folglich keine Infektion der Zellen stattgefunden. Diese Tatsache wurde durch das Fehlen der Expression des GFP-Proteins in den mit dem 112 W/S und/oder 338 W/S mutierten Virus inkubierten Zellen bestätigt (Visualisierung durch Fluoreszenzmikroskopie).
Das Fehlen einer Infektion der Zellen im letzt genannten Fall kann durch das Fehlen einer Syncytienbildung erklärt werden, welche vorher mit Zellen, die auf ihrer Oberfläche gp120 112 W/S und/oder gp120 338 W/S exprimieren, visualisiert wurde.
Dreidimensionale Analyse und strukturelle Lokalisierung der vorgenommenen Mutationen
Die Kristallstruktur des Komplexes gp120-CD4-17b Fab wurde kürzlich mit einer Auflösung von 2,5 Å bestimmt (3) (2).
Die Koordinaten dieser Struktur wurden mit Hilfe der Software Insight II bestimmt, welche es ermöglicht die Aminosäuren im dreidimensionalen Zusammenhang viel besser aufzulösen als die Vorhersagemodelle, welche ursprünglich unser Vorhaben waren.
Die Analyse der Kristallstruktur des Komplexes gp120-CD4 beweist eine reduzierte Zahl von Resten, welche das Interface zwischen den zwei Proteinen bilden. Die Hauptwechselwirkung zwischen gp120 und CD4 ist in einer hydrophoben Tasche lokalisiert, wobei die Aminosäure W427 von gp120 und der F43-Rest von CD4 (Wyatt et Coll., 1998) involviert sind.
Darüber hinaus ist W112, wie in 3 gezeigt, in dieser an aromatischen Resten reichen Kavität strategisch lokalisiert und interagiert direkt mit F43 von CD4. Der F43-Rest ist in der Mitte dieser Tasche untergebracht und interagiert direkt mit W112. Die Wechselwirkung von W112 mit F43 und W427 ermöglicht es die ganze hydrophobe Tasche zu stabilisieren. Es sei angemerkt, dass W112 und W427 in einem Abstand von kleiner oder gleich 5 Å zueinander angeordnet sind, was anzeigt, dass die beiden Tryptophanreste im Stande sind erheblich miteinander zu interagieren.
Diese Wechselwirkung kann durch Stapelung von aromatischen Ringen zwischen diesen beiden Resten oder durch eine Dipol-Dipol-Bindung zustande kommen. Darüber hinaus können sich diese Abstände in der Realität – unter Berücksichtigung von dynamischen Aspekten der molekularen Wechselwirkungen in vivo – als viel geringer herausstellen.
Die Kristallanalyse ermöglichte es darüber hinaus heraus zu finden, dass W338 der Helix α2 im Stande ist, eine Hauptrolle bei der Stabilität der zweiten Kavität (von insgesamt 2 im Inneren von gp120 inbegriffenen Kavitäten), welche durch hydrophobe und aromatische Reste ausgebildet wird, zu spielen. Unter diesen Bedingungen kann diese Kavität als für die Wechselwirkungen mit gp120 und den Co-Rezeptoren, beispielsweise CXCR4, maßgeblich betrachtet werden.
STRUKTUR:
ELISA-Studie: Bindung von gp120 lediglich auf löslichem CD4
Die 4 bis 8 veranschaulichen die Reaktivitätsergebnisse von rpg120 des Wildtyps, gp120ΔαHX1 et gp120α3 W338S mit AcM CG10 (4), AcM 4.8d (6) und AcM 17b (8): In diese Proben wurde rgp120 in einer Konzentration von 1 μg/ml eingebracht. AcM wurde in den auf der x-Koordinate angegebenen Konzentrationen eingebracht. Die 5 und 7 zeigen die Reaktivitäten dieser rpg120-Komplexe auf CD4 mit AcM CG10 (5) und Acm 4.8d (7): In diesen Proben wurde rpg120 in einer Konzentration von 1 μg/ml eingebracht. Die CD4-Konzentration beträgt 20 μg/ml und AcM wurde in den auf der x-Koordinate angegebenen Konzentrationen eingebracht.
Diese Mutation induziert eine trans-Konformation, die eine bessere Exposition den monoklonalen, gegen die Epitope CD4i (CD4 induziert) gerichteten Antikörper 17b, 4.8d und G10 (4, 5, 6, 7 und 8), wobei die Epitope nach der Bildung von gp120 an CD4 demaskiert sind. Diese trans-Konformation konnte in einem ELISA-System detektiert werden, welches wie folgt durchgeführt wurde:

1. Der Boden der Mulden wurde mit löslichem CD4 (Referenz NIH) oder mit den gegen ein lineares Peptid des C-terminalen Bereichs von gp120 gerichteter Antikörpern Aalto D7324 (welcher ein Ziegen-Antikörper ist) versehen (wobei diese Antikörper die trans-Konformation zum Erwirken des Demaskierens der Epitope CD4i nicht induzieren).
2. Nach der Sättigung mit BSA 3%, wird gp120 mit CD4 oder mit dem Antikörper D7324 bei 37 °C während einer Stunde inkubiert.
3. Nach 2 Waschvorgängen, wird einer der AcM-anti-CD4i (17b oder 4.8d oder CG10) mit dem vorab angebrachten gp120 (des Wildtyps oder der Mutante) während einer Stunde bei 37 °C inkubiert.
4. Die Antikörper CD4i werden mit einem mit Peroxydase (POD) konjugierten anti-IG-Antikörper entwickelt.
5. Die Intensität der Reaktion wird in dem ELISA-Lesegerät nach Abbruch der Reaktion ausgelesen.

Das durch die Kontrollen (Zellen ohne gp120) angezeigte Hintergrundrauschen wird von den Ergebnissen der experimentellen Punkte abgezogen.
Anmerkung: Eine Kontrolle wird mit gp120 gemacht, welches durch einen gegen gp120 gerichteten, polyklonalen Kanninchen-Antikörper detektiert wird (3).
Die mit ELISA durchgeführten Experimente haben es ermöglicht zu bestätigen, dass tatsächlich AcM anti-CD4i 17b und 4.8d besser gp120 des Wildtyps und mutiertes gp120 erkennen, wenn es mit löslichem CD4 assoziiert ist, wodurch das Demaskieren der Epitope ermöglicht wird. Während AcM CG10 überhaupt nicht gp120 des Wildtyps, welches nicht mit CD4 komplexiert ist, erkennt, erkennt dieses AcM mutiertes gp120 ohne dass es mit CD4 komplexiert ist.
Interpretation:
Die Mutation W338S auf gp120 induziert das Demaskieren der Epitope CD4i, insbesondere der durch ACM CG10 erkannten Epitope.
Diese Ergebnisse sind wichtig, da diese Mutation aus diesem Mutanten einen guten Impfkandidaten macht, der die maskierten Epitope bei den infektiösen Viren entlarvt.
FACS-Studien: Gleichzeitige Bindung von gp120 auf mindestens 2 Rezeptoren, die auf der Oberfläche von Zellen der CEM-Lymphozyten-Linie, CD4 und CXCR4 vorliegen.
Um zu überprüfen, dass gp120 sich auf CD4 bzw. CXCR4 anlagert, wurde das folgende Experiment durchgeführt: Die CEM-Zellen wurden zuerst mit gp120 inkubiert, dann mit monoklonalen Antikörpern gegen den Rezeptor CD4 (AcM OKT4a FITC von ORTHO Diagnostic) und gegen den Rezeptor CXCR4 (AcM 12G5 von Pharmingen) und anschließend mit geeigneten Mäuse-anti-IgG-Antikörpern inkubiert.

In Tabelle 3 wird die durchschnittliche Fluoreszenzintensität von auf CEM CD4+/CXCR4+-Zellen angelagertem und durch AcM-anti-CD4 erkanntem gp120 angegeben. Tabelle 3

Antikörper AcM anti-CD4i	Durchschnittliche Fluoreszenzintensität von auf CEM CD4+/CXCR4+-Zellen angelagertem gp120
	ohne gp120	gp120 des Wildtyps	gp120 W338S
4.8d	5,65	76,775	208,78
17b	5,21	70,48	175,575
CG10	5,14	7,15	8,49

Es konnte keine Markierung, die anzeigt, dass gp120 tatsächlich auf CD4 und auf CXCR4 angelagert wurde, beobachtet werden.
Die in RPMI 10% FCS kultivierten CEM-Zellen wurden mit einem PBS/0,3%/BSA/0,02%Na-Azid-Waschpuffer (WP) gewaschen und in einen FBS/3%/BSA/0,02%Na-Azid-Inkubationspuffer (IP) eingebracht, um diese mit dem gp120 des Wildtyps und der Mutante während einer Stunde bei 37 °C zusammenzubringen.
Die Zellen wurden zweimal mit WP gewaschen und dann in IP mit einem der anti-CD41-Antikörper (17b, 4.8d oder CG10) einer Konzentration von 10 μg/l während einer Stunde bei 25 °C inkubiert. Die Zellen wurden anschließend zweimal mit WP gewaschen, dann während 45 Minuten bei 25 °C im IP mit einem geeigneten anti-IgG-Antikörper, der mit FITC oder PE konjugiert ist, inkubiert. Nach 3 Waschvorgängen mit dem WP, wurden die Zellen in dem IP suspendiert und in ein Flusscytofluorometer (FACSort) gegeben. 10 000 Zellen wurden auf diese Weise eine nach der anderen analysiert.
Die Ergebnisse werden in 5 angegeben. Der Antikörper 17b und 4.8d erkennen das mutierte gp120 gut und das gp120 des Wildtyps sehr schlecht. Dagegen hat AcM CG10 sowohl auf dem gp120 des Wildtyps als auch auf dem mutierten gp120 Zutritt keinen Zutritt mehr zu seiner Erkennungsstelle.
Auslegung
Wenn AcM CG10 keinen Zutritt mehr zu seiner Stelle hat während AcM 17b und 4.8d zu dieser Stelle Zutritt haben, zeigt dies, dass das Epitop von gp120, welches erheblich in die Bindung von gp120 an den Co-Rezeptor CXCR4 involviert ist, dasjenige, welches vorwiegend durch CG10 erkannt wird.
Schlussfolgerung
Die Mutation W338S auf gp120 induziert eine trans-Konformation, welche eine Verschmelzung und Infektion verhindert. Denn diese Mutation verhindert die Verschmelzung, wenn die Hülle auf der Oberfläche der transfizierten Zellen exprimiert wird, und verhindert die Infektion, wenn sich diese Hülle auf dem ergänzten Virus befindet. Darüber hinaus ermöglicht diese trans-Konformation das Demaskieren der maskierten Stellen auf dem gp120 des Wildtyps, im wesentlichen aufgrund der Tatsache, dass das mutierte gp120 durch AcM CG10 erkannt wird, ohne dass dieses gp120 mit CD4 komplexiert ist. Die Tatsache, dass das gleiche AcM CG10 keinen Zutritt mehr zu seinem Epitop mehr hat, wenn dieses Protein mit CD4 oder mit CXCR4 assoziiert ist, und dass der anti-CD4i-Antikörper nicht mit dem CD4 interferiert, impliziert, dass es das durch AcM CG10 auf gp120 erkannte Epitop ist, welches in die Bindung an CXCR4 involviert ist. Eine derartige Mutante stellt einen Kandidaten dar, um Immunisationen zum Schutz gegen eine HIV-Infektion durchzuführen.
BIBLIOGRAFISCHE DATEN

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2. Missé D., Cerruti M., Schmidt I., Jansen A., Devauchelle G., Jansen F. and Véas F. 1998. Dissociation of the CD4 and CXCR4 binding properties of human immunodeficiency virus type 1 gp120 by deletion of the first putative alpha-helical conserved structure. J-Virol 72:7280.
3. Cordonnier A., Montagnier L., and Emmerman M. 1989. Single aminoacid changes in VIH envelope affect viral tropism and receptor binding. Nature 340:571.
4. Hansen J E., Lund O., Nielsen JO., Brunak S, and Hansen JES. 1996. Prediction of the secondary structure of HIV-1 gp 120. Proteins 25:1.

Claims

Mutanten von gp120, dadurch gekennzeichnet, dass sie in der Helix α2 von gp120 eine Mutation eines Tryptophanrests an Position 338 zu einem Serinrest tragen.
Mutanten gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Mutation in der Helix α1 von gp120 von Tryptophanresten an den Positionen 96 und 112 zu Serinresten tragen.
Mutanten gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie darüber hinaus eine Mutation eines F an Position 383 zu Alanin tragen, und gegebenenfalls eine Mutation von Tryptophan an Position 427 zu Glycin, und/oder von Tryptophan an Position 479 zu Serin.
Verwendung von Mutanten gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 als Antigene für die Herstellung von Impfstoffen.