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Die Erfindung bezieht sich auf einen
monoklonalen Antikörper
(mAb) gegen den humanen Komplementrezeptor Typ 2 (CR2, CD21) und
ein Hybridom als auch einen Prozess zur Herstellung desselben. Weiters
ist die Erfindung auf eine therapeutische Anwendung desselben bzw.
derselben ausgerichtet.
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Der humane Komplementrezeptor Typ
2 ist ein Membranglykoprotein von 145 kDa, das vorwiegend auf reifen
B Lymphozyten (TF Tedder, LT Clement und MD Cooper. 1984. Expression
of C3d receptors during human B cell differentiation: immunofluorescence
analysis with the HB5 monoclonal antibody. J. Immunol. 133: 678)
und follikulär
dendritischen Zellen (M Reynes, JP Aubert, JH Cohen, J Audouin,
V Tricottet, J Diebold und MD Kazatchkine. 1985. Human follicular
dendritic cells express CR1, CR2, and CR3 complement receptor antigens.
J Immunol. 135: 2687), in einem geringeren Ausmaß auch auf T Lymphozyten des
peripheren Bluts, Thymozyten oder Astrozyten exprimiert wird. Die
Funktion von CR2 wurde am ausführlichsten
für B Lymphozyten
untersucht (siehe Übersichtsartikel:
DT Fearon und RH Carter. 1995. The CD19/CR2/TAPA-1 complex of B
lymphocytes: linking natural to acquired immunity. Annu. Rev. Immunol.
12: 127). CR2 ist der Rezeptor für
spezifische Fragmente des C3, insbesondere C3dg und (mit niedrigerer
Affinität)
iC3b, welche im Rahmen der Komplementaktivierung generiert und kovalent
an Oberflächen,
z. B. von pathogenen Erregern, deponiert werden. Auf B-Zellen bildet
CR2 einen nicht kovalenten Rezeptorkomplex mit dem für B-Zellen
spezifischen CD19 Molekül
und dem auf hämatopoietischen
Zellen breit exprimierten CD81. Eine Koligierung dieses Komplexes
mit dem B Zell Rezeptorkomplex erniedrigt die Aktivierungsschwelle
für B-Zellen
wesentlich. Das Ausmaß dieses
Effekts korreliert exponentiell mit der Anzahl der auf dem spezifischen
Antigen abgelagerten C3dg-Moleküle.
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Es ist von pathophysiologischer Relevanz, dass
die Infektion humaner Zellen mit dem Epstein-Barr Virus (EBV) bekanntermaßen Anlagerung an
CR2 als ersten Schritt benötigt.
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CR2 ist ein Mitglied der Familie
der C3b und/oder C4b bindenden Proteine. Sein extrazellulärer Anteil
wird von 15 oder – als
ein Ergebnis von alternativen Spleissvorgängen – 16 so genannten „short
consensus repeats" (SCRs)
gebildet. Diesen Struktureinheiten von etwa 60 Aminosäuren ist
ein Rahmen von mehreren strikt konservierten Aminosäuren gemeinsam,
insbesondere von vier Zysteinen, welche durch Disulfidbrücken (und
zwar vom ersten zum dritten und vom zweiten zum vierten Zystein)
verbunden sind.
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Zur Charakterisierung der beiden
N-terminalen, bei der Ligandenbindung beteiligten SCRs wurde weitest
gehend der monoklonale Mausantikörper OKB7
verwendet, dessen Fähigkeit,
die von CR2 abhängige
EAC3d Rosettierung von Raji Zellen zu inhibieren (PE Rao, SD Wright,
EF Wstberg und G Goldstein. 1985. OKB7, a monoclonal antibody that
reacts at or near the C3d binding site of human CR2. Cell. Immunol.
93: 549) bzw. die Infektion von B-Zellen mit EBV zu reduzieren (GR
Nemerow, R Wolfert, ME McNaughton und NR Cooper. 1985. Identification and
characterization of the Epstein Barr virus receptor on human B lymphocytes
and its relationship to the C3d complement receptor (CR2). J. Virol.
55: 347), bereits früh
gezeigt wurden. OKB7 wurde auch verwendet, um die Epitopabhängigkeit
von Effekten von CR2-spezifischen mAbs auf die Proliferation von B-Zellen
zu zeigen. Diese Eigenschaft von OKB7, im Gegensatz zu anderen,
nicht blockierenden Antikörpern
wie HB5 (TF Tedder, LT Clement und MD Cooper. 1984. Expression of
C3d receptors during human B cell differentiation: immunofluorescence
analysis with the HB5 monoclonal antibody. J. Immunol. 133: 678)
ist jedoch nicht konsistent definiert.
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Obwohl mAb OKB7 in unseren Händen die von
CR2 abhängige
EAC3d Rosettierung von CR2-exprimierenden Zellen zu > 95% inhibierte, war er
dennoch ineffektiv zur Blockade der CR2-abhängigen Komplementaktivierung
auf Raji-Zellen. Es ist daher eine Aufgabe der Erfindung, effektivere
mAbs herzustellen. Weitere Aufgaben sind die Herstellung der entsprechenden
Hybridome und therapeutischen Anwendungen. Als erfolgreich für die Verfolgung
dieser Ziele stellten sich die Verwendung eines rekombinant über Baculoviren
exprimierten, löslichen,
nach SCR4 trunkierten CR2 Moleküls
als Immunogen sowie die Messung der Inhibition bzw. Reversion der Bindung
von FITC-markierten, C3d- beschichteten Agarosemikrokügelchen
an CR2 als Suchtest heraus.
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Ein anderer monoklonaler Antikörper ist
von W. PRODINGER et al. beschrieben: "Characterization of C3dg binding to
a recess formed between SCR 1 and SCR 2 of complement receptor type
two". April 1998.
Mol. Immunol. Band 35, Nummer 6/7, Seite 392. Es wird berichtet,
dass dieser Antikörper
fähig ist,
Fragmente des C3 von CR2 in vitro zu entfernen, aber es wird nicht über solche
Fähigkeiten
bei höheren,
insbesondere bei typischerweise in vivo herrschenden Temperaturen
berichtet.
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Diese und andere Aufgaben werden
gelöst durch
einen in Anspruch 1 definierten monoklonalen Antikörper. Der
Ausdruck „entfernt
in substanzieller Weise" bedeutet
dabei, dass C3-Fragmente (z. B. polymeres C3dg) von voll beladenen
CR2-Molekülen einer
Zelle zumindest im Ausmaß von
70%, vorzugsweise von 90% entfernt werden. Solch ein Antikörper hat,
wie unten stehend diskutiert, günstige
Eigenschaften. Es ist essenziell, dass der mAb (genannt FE8) entsprechend
dieser Erfindung nicht nur fähig ist,
die Bindung von C3dg an CR2 zu blockieren, sondern auch, C3d in
substanzieller Weise von CR2 zu entfernen. Weder war dies beim Stand
der Technik mAb OKB7 der Fall, noch wurde ein solches Potential im
EP 358 130 (Götze) bekannt
gegeben.
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Ein Verfahren, um solche Antikörper (oder Hybridome,
die solche Antikörper
produzieren) zu erhalten, ist durch folgende Schritte charakterisiert:
- a. Herstellen eines CR2 Moleküls, das
zumindest die „short
consensus repeats" SCR1
und 2, bevorzugt die SCRs 1 bis 4v on CR2 umfasst.
- b. Immunisierung von Nagetieren, insbesondere von Mäusen, mit
einer Lösung
dieses Moleküls,
welche in bevorzugter Weise in PBS bei pH 8,5 bereitet wird.
- c. Fusion der Milzzellen dieser Nagetiere mit einer Myelomzelllinie
und Kultur dieser fusionierten Zellen, vorzugsweise in HAT (Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin) Medium.
- d. Herstellung von Trägerpartikeln,
Beschichtung derer mit einem an CR2 bindenden C3-Fragment, vorzugsweise
mit C3d, und Markierung dieser Trägerpartikel mit Farbstoffen,
vorzugsweise Fluoresceinisothiocyanat (FITC).
- e. Selektion von Hybridom-Klonen nach ihrer Antikörperproduktion
durch Testung ihrer Zellkulturüberstände, vorzugsweise
mit Fluoreszenz-aktiviertem Zellsortieren, auf die Fähigkeit,
besagte Trägerpartikel von
CR2 zu entfernen, nachdem sie an CR2 gebunden hatten.
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Die Schritte a) bis c) sind im Wesentlichen Stand
der Technik. Es ist jedoch neu, SCRs 1 bis 4 zu verwenden. Die Technik
von Schritt d) ist im Wesentlichen bekannt von einer früheren Publikation
(nämlich:
WM Prodinger, C Larcher, MG Schwendinger und MP Dierich. 1996. Ligation
of the functional domain of complement receptor type 2 (CR2, CD21)
is relevant for complex formation in T cell lines. J. Immunol. 156:
2580), wurde aber nie im gegenständlichen
Kontext angewandt. Schritt e) führt
zu (Antikörper
produzierenden) Hybridom-Klonen mit der erwünschten Spezifität.
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Entsprechend eines bevorzugten Ausführungsbeispiels
dieser Erfindung, können
monoklonale Antikörper
mit der Spezifität
von FE8 durch Verwendung einer löslichen,
rekombinanten, in Spodoptera frugiperda Insektenzellen (Sf9 Zellen)
exprimierten Form von CR2, die die SCRs 1 bis 4 beinhaltet (und
rsCR2.1-4 genannt wird), erhalten werden. Demgemäß kann rsCR2.1-4 für die subkutane
Immunisierung von Mäusen
in einer Dosierung von 10 g in 50 μl mit Natriumphosphat gepufferter
Salzlösung (PBS),
gemischt zu gleichen Teilen mit komplettem Freund'schen Adjuvans, verwendet
werden. Wiederholungs-Immunisierungen werden mit derselben Menge
von rsCR2.1-4 und inkomplettem Freund'schen Adjuvans nach Standardverfahren
vorgenommen, und schlussendlich werden 100 μg rsCR2.1-4 in PBS intraperitoneal
injiziert.
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Drei Tage danach werden die immunisierten Tiere
getötet
und wird die Fusion deren Milzzellen mit der Myelomzelllinie P3X63Ag8.653
nach den von Köhler
und Milstein erstmals beschriebenen und später von Galfre und Mitarbeitern
modifizierten Standardverfahren durchgeführt.
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Im Weiteren ist der nächste Schritt
die Kultur von Hybridom-Klonen unter selektiven Bedingungen in HAT
Medium und das Screening von Hybridomkulturüberständen auf die Fähigkeit,
C3dg von CR2 zu entfernen. Zu diesem Zweck werden Agarosekügelchen
von m hergestellt, mit mehreren C3dg Molekülen beladen und mit einem Fluoreszentfarbstoff,
z. B. Fluoresceinisothiocyanat (FITC), markiert um C3dg-FITC-Kügelchen
zu erhalten, wie im Wesentlichen von W. M. Prodinger und Mitarbeitern
(J. Immunol., 1996, 156: 2580–2584)
beschrieben. Das Screening auf monoklonale Antikörper, welche C3dg aus der Bindung
an CR2 entfernen, wird mittel Bestimmung der Adhärenz einer optimalen Menge
dieser C3dg-FITC-Kügelchen
an eine Million Raji B-lymphoblastoide Zellen in einem Kulturvolumen
von 60 l bei Raumtemperatur oder darüber durchgeführt. Hybridomzellen,
welche einen Antikörper
produzieren, der bei einer Konzentration von 10 g/ml in der Lage ist
die Adhärenz
besagter Kügelchen
auf Hintergrundwerte zu reduzieren, können für weitere Subklonierungen und
die Erzeugung von monoklonalem Immunglobulin mittels Standardmethoden
ausgewählt
werden.
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Solche Hybridomzellen wurden zum
Beispiel bei ECAAC (European Collection of Cell Cultures, Salisbury,
Wiltshire, SP40SG, UK) unter der Zugriffsnummer 98072910 am 29.
Juli 1998 deponiert.
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Insbesondere im Hinblick auf die
pathophysiologische Relevanz ist es wünschenswert, einen mAb zur
Verfügung
zu haben, der in der Lage ist, ein an die aminoterminalen „short
consesus repeats" SCRs
1 und 2 von CR2 gebundenes C3-Fragment (C3dg)
von diesem CR2-Molekül
zu dissoziieren.
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Die dissoziierenden oder entfernenden
Eigenschaften sind vorzugsweise bei niedrigen mAb-Konzentrationen
bei 0,3 μg/ml
vorhanden.
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Ein anderer Aspekt der Erfindung
ist ein mAb gegen humanen Komplementrezeptor Typ 2 (CR2), wobei
der mAb ein diskontinuierliches Epitop an den aminoterminalen „short
consensus repeats" SCRs
1 und 2 erkennt. Vorzugsweise reagiert der mAb am intensivsten mit
einem zwischen besagten SCR 1 und SCR 2 lokalisierten CR2 Epitop,
wobei das zwischen SCR 1 und SCR 2 lokalisierte CR2 Epitop die Aminosäuresequenz
EYFNKYSS (bezeichnet im Einzelbuchstaben-Code) hat.
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FE8 erkennt ein diskontinuierliches
Epitop. Um die Aminosäurereste,
die Teil des Epitops sind, zu definieren, wurde eine Bank mit 126
jeweils mit fünf
Resten überlappenden
Hexapeptiden, die aufeinander folgend die Sequenz von SCR 1 bis
SCR 2 (das sind 131 Aminosäuren)
abdecken, synthetisiert und mit der Peptid-Abtast-Technik auf Bindung an FE8 ausgetestet.
Mehrere Peptidspots wurden eindeutig erkannt. Die Peptide 63 und
64 (EYFNKY und YFNKYS) reagierten am intensivsten. Zusammen mit dem
schwächer
gefärbten
Peptid 65 (FNKYSS) stellen sie die acht Aminosäuren zwischen dem vierten Zystein
von SCR 2 und dem ersten Zystein von SCR 2 dar und damit die gesamte Übergangsregion
zwischen den SCRs 1 und 2. Der Einschluss von einem der beiden benachbarten
Zysteine (C62 bzw. C71) in Hexapeptide verhinderte die Bindung des
Antikörpers.
Das dritte intensiv gefärbte
Fleck wurde bei Peptid 16 (YYSTPI) beobachtet, das direkt auf die Sequenz
8-PILNGRIS-15 folgt, die von anderen als wichtig für die Bindung
von OKB7 bzw. iC3b beschrieben wurde. Die Peptide 8 und 9, die letztere Sequenz überspannen,
wurden nicht gefärbt,
das Peptid 11 (NGRISY) reagierte schwach. Eine schwache Reaktion
wurde auch mit den Peptiden 87, 88 und 105 beobachtet. Dem Peptid
105 folgen in der CR2 Sequenz direkt die Sequenz der Peptide 100 und
111, die deutlicher reagierten.
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Die mAb im Sinne der Erfindung gehören vorzugsweise
der Maus-Immunglobulinsubklasse IgG1,κ an.
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Abgesehen von den oben ausgeführten Eigenschaften
ist der mAb gemäß der Endung
in der Lage, die Infektion von (humanen) CR2 exprimierenden Zellen
mit dem Epstein-Barr Virus (EBV), vorzugsweise bei einer Konzentration
von 0,1 μg/ml (und
bei 8 × 105 tonsillären
B-Zellen) komplett zu blockieren.
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Die monoklonalen Antikörper gemäß der Erfindung
haben außerdem
therapeutische Anwendungsmöglichkeiten:
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Übersicht
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Das menschliche Immunsystem hat zwei
Effektormechanismen, die fein miteinander versponnen sind: (A) das
spezifische Immunsystem mit B und T Lymphozyten, den Zellen, die
die für
Antigen spezifischen Antikörper
und Killerzellen hervorbringen und (B) das angeborene (oder unspezifische)
Immunsystem, das lösliche
Effektormoleküle
wie die des Komplementsystems oder Interferone oder Lysozym umfasst,
ebenso wie die für
Antigen unspezifischen Phagozyten und natürlichen Killerzellen. Im Allgemeinen werden
körperfremde
Substanzen von beiden Ästen des
Immunsystems erkannt, als solche markiert, zerstört und an erneuter Schädigung des
Körpers
gehindert. Antigene des Körpers
selbst („Selbst") werden jedoch unter
normalen Bedingungen nicht vom Immunsystem attackiert, sondern induzieren
immunologische Toleranz.
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Das Komplementsystem ist das wichtigste humorale,
d. h. auf Plasmaproteinen basierende System der angeborenen Immunität. Komplement
beeinflusst sowohl die (unspezifische) Phagozytenaktivität als auch
die Bildung spezifischer Antikörper.
Das zentrale Protein des Komplementsystems ist das C3. Wenn C3 aktiviert
wird, z. B. durch Pathogene, wird es zu biologisch aktivem C3b.
C3b bildet eine kovalente Bindung mit einem der nächst gelegenen
Proteine, z. B. Oberflächenproteinen
des Pathogens, aus. Durch Kontakt mit anderen Plasmaproteinen wird C3b
zu C3dg, später
zu C3d inaktiviert, welches als ein Überbleibsel der abgelaufenen
Komplement-Aktivierung körperfremde
Partikel quasi als „fremd" markiert. Als solches
interagiert C3dg oder C3d dann spezifisch mit CR2 auf Zellen des
Immunsystems.
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Das CR2 Protein ist im extrazellulären Teil gegliedert
in „short
consensus repeats" (SCRs),
von denen nur SCRs 1 und 2 wichtig für die Bindung von C3dg sind.
Derselbe Teil des CR2 beinhaltet die Bindungsstelle für das Epstein-Barr
Virus, ein weltweit vorkommendes Herpesvirus.
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CR2 findet sich insbesondere auf
B Lymphozyten (B-Zellen), die die spezifische Antikörperantwort
bewirken, und auf follikulär-dendritischen
Zellen (FDC). Die Interaktion von C3dg mit CR2 auf B-Zellen induziert
eine schnellere Zellvermehrung und eine weitere Spezialisierung
in Richtung Antikörperproduktion.
CR2 auf FDC ist in erster Linie ein Molekül zum Festhalten C3dg-beschichteter
Antigene an der Zelloberfläche,
aber durch CR2 selbst übertragene
Effekte auf die FDC wurden bisher nicht beschrieben.
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Zellen beider Zelltypen interagieren über C3dg-beschichtetes
Antigen auch miteinander. Diese Interaktion ist kritisch für die Affinität und Langlebigkeit
der Antikörperantwort
gegen ein Antigen. Die Bindung von B-Zellen an FDC via C3dg-beschichtetes Antigen,
das auf der FDC-Oberfläche
festgehalten wird, erlaubt den B-Zellen
ein verbessertes Antikörpermolekül zu generieren
und parallel dazu Gedächtniszellen
zu bilden, die die Antikörperproduktion
für Jahre
aufrecht erhalten.
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Bei bestimmten Autoimmunkrankheiten
(z. B. Myasthenia gravis oder Thrombozytopenie) finden abnorme Immunreaktionen
statt, ausgelöst
durch die Produktion von Antikörpern
gegen körpereigenes Gewebe.
Für die
genannten Krankheiten sind dies die Strukturen, die die Weiterleitung
der Nervenimpulse auf die Muskulatur bewerkstelligen, bzw. die Blutplättchen,
die zur Blutungsstillung wichtig sind. Diese Krankheiten werden
mit immunsuppressiven Mitteln verschiedener chemischer Zusammensetzungen
und Wirkweise behandelt, denen allen schwere Nebenwirkungen gemein
sind. Daher könnte
die Beeinflussung des pathologischen Prozesses im lymphatischen
System, der die Autoantikörperproduktion auslöst, einen
zielgerichteteren Behandlungsansatz darstellen.
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In diesem Zusammenhang ist es günstig, dass
der monoklonale Antikörper
FE8 die Ablagerung von C3dg-beschichteten Antigenen auf FDC, das
Festhalten von Antigen und dessen Präsentation durch FDC beeinflusst.
Dies wird durch die Tatsache unterstrichen, dass pathogene Autoantikörper (wie sie
in den oben genannten Krankheiten vorkommen) vorwiegend von hoher
Affinität
und vom IgG-Isotyp sind. Das bedeutet, dass sie von B-Zellen abstammen,
die mit FDC interagiert haben um eine „Verbesserung" ihres Antikörper-Produktes
vorzunehmen. Daher könnte
der monoklonale Antikörper
FE8 für
die Therapie von mit Autoantikörpern
assoziierten Krankheiten hilfreich sein.
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Durch Arbeitsunfälle wie das unbeabsichtigte
parenterale Einbringen von komplettem Freund'schem Adjuvans (CFA) kann eine Immunreaktion
gegen körpereigenes
Gewebe in einem gesunden Individuum ausgelöst werden. Die Entzündung an
der CFA-geschädigten
Stelle verursacht Gewebszerstörung
und Komplementaktivierung. Die Bildung von C3dg, entweder als lösliches
C3dg oder als an deformiertem körpereigenem
Gewebe gebundenes C3dg kann entscheidend für die in Gang gesetzte Autoimmunreaktion
sein. Basierend auf den Experimenten mit genetisch veränderten
Mäusen
kann man sich zwei Wirkmechanismen vorstellen: einerseits könnte C3dg
es ermöglichen,
dass ansonsten inhibierte, Autoantikörper produzierende B-Zellen ihre
Hemmschwelle überwinden,
andererseits könnte C3dg-markierte Gewebereste
autoimmunogen werden und B-Zellen stimulieren. In beiden Fällen würde der
Effekt über
CR2 vermittelt werden, und die Verhinderung oder Inhibierung dessen
Interaktion mit C3dg könnte
als therapeutische Intervention gesehen werden.
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Wie erwähnt kommt CR2 in direkten Kontakt mit
dem Epstein-Barr Virus (EBV) das CR2 als Eintrittspforte für B-Zellen
benutzt. EBV etabliert eine lebenslang persistierende Infektion. Über 90 Prozent der
Erwachsenen sind mit EBV infiziert, meist ohne eine sich manifestierende
Erkrankung durch zu machen. Nach Primärinfektion entwickeln manche
Menschen eine selbst limitierte, gutartige Erkrankung, die infektiöse Mononukleose.
Trotzdem kann EBV auch zur Entstehung von malignen oder benignen
Tumoren beitragen. Es ist beim Burkitt-Lymphom involviert, einem
Non-Hodgkin Lymphom hoher Malignität, das vor allem Kinder in
tropischen Gebieten befällt.
Außerdem
scheint EBV eine Rolle bei der Entstehung des Nasopharynxkarzinoms
zu spielen, eines lymphoepithelialen Tumors, der häufig in
China beobachtet wird. EBV kann bei durch die HIV-Infektion Immunsupprimierten
auch B-Zell Lymphome hervorrufen. Alle diese proliferativen Erkrankungen
sind schwierig zu behandeln und erfordern meist eine schwer wiegende
Zytostatikatherapie und/oder Bestrahlung. EBV kann weiters Komplikationen
in Patienten, die sich einer Organ- oder einer Knochenmarkstransplantation
unterzogen haben, hervorrufen. Unter Umständen, in denen eine intensive
Immunsuppression erforderlich ist, z. B. um eine Abstoßungsreaktion
zu stoppen, kann EBV das potenziell lebensbedrohliche B lymphoproliferative
Syndrom induzieren. Diese Krankheit kann entweder selbst limitierend
sein oder sehr schwierig zu behandeln. Ein teilweiser Erfolg wurde
mit einer Kombination monoklonaler Antikörper gegen CR2 und CD24 erzielt,
obwohl der anti-CR2 Antikörper
nicht in der Lage war, die EBV-Bindung an CR2 zu blockieren.
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Es ist vorstellbar, dass diese Erkrankung
erfolgreicher durch die Verwendung eines monoklonalen Antikörpers behandelt
wird, der auch die Bindung von EBV an Zellen blockiert. Außerdem könnten FE8 oder
ein humanisiertes Nachfolgeprodukt (das die Mausprotein-Eigenschaften
verloren hätte)
zur Prophylaxe bei Individuen, die dem Risiko einer solchen Erkrankung
ausgesetzt sind, eingesetzt werden.
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Im Allgemeinen sollte darauf hingewiesen werden,
dass für
den Zweck dieser Erfindung „monoklonaler
Antikörper" bedeutet: der monoklonale
Antikörper
selbst, aber auch das CR2-bindende Fragment desselben oder ein rekombinantes
Konstrukt, das die variablen Domänen
(Fv) des monoklonalen Antikörpers
umfasst, entweder allein oder in Kombination mit anderen Aminosäurensequenzen,
bevorzugt solche von anderen Immunglobulinmolekülen.
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C3dg-beschichtete, von FDC präsentierte Antigene
müssen
nicht ausschließlich
Abbauprodukte von pathogenen Erregern sein: auch kleine Erreger,
z. B. Viren, können
mit Komplement überzogen werden.
Sie werden dadurch nicht zerstört,
sondern als infektiöse
Partikel auf der FDC Oberfläche
festgehalten. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass mit Komplement beschichtetes
HIV an den FDC von Lymphknoten festgehalten wird. Insbesondere geschieht dies
in sehr frühen
Stadien der Infektion: In Experimenten an Affen, die mit SIV (SIV
ist das dem HIV entsprechende, Affen befallende Virus) inokuliert wurden,
findet sich das verabreichte Virus bald gebunden an den FDC von
Lymphknoten. Nachdem FDC – im
Gegensatz zu anderen Antigen präsentierenden
Zellen – festgehaltenes
Antigen nicht abbauen, sondern unverändert präsentieren, behält an FDC
festgehaltenes HIV über
lange Zeit seine Infektiosität.
Das bedeutet, dass FDC als ein Reservoir von infektiösem HIV
in lymphatischen Organen fungieren können, in denen HIV ständig den
T-Zellen, seinen primären
Zielzellen, zugänglich
ist.
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Es wird gezeigt, dass der monoklonale
Antikörper
FE8 eine Ablösung
von mit Komplement beschichtetem HIV von CR2-positiven Raji B-Zellen, wie
sie gewöhnlich
verwendet werden, effektiv bewerkstelligt. Das zeigt, dass das Virus
durch Beeinflussung von CR2 abgelöst werden kann. Weiters wurde
gezeigt, dass der monoklonale Antikörper FE8 die Bindung von C3dg
tragenden Partikeln an FDC blockiert (und gebundene Partikel ablöst). Dies
wäre hilfreich
in der Behandlung der HIV-Infektion, zumal die Menge von HIV in
der Nähe
der T-Zellen, der Zielzellen von HIV, vermindert würde. Eine
Reduktion von an FDC festgehaltenem könnte bereits unmittelbar nach
Virusexposition, z. B. nach einer Nadelstichverletzung mit HIV-hältigem Blut,
oder in späteren Stadien
der HIV-Infektion
wirksam sein. Dem neuen Zugang entsprechend könnte der monoklonale Antikörper FE8
oder seine Derivate auch mit anderen, etablierten Formen der Behandlung,
zum Beispiel Hemmern von viralen Enzymen, wie sie bei der hochwirksamen
antiretroviralen Therapie verwendet werden, kombiniert werden.
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Daher ist gemäß der Erfindung vorgesehen einen
mAb, insbesondere mit den oben genannten Eigenschaften, für die Herstellung
eines Heilmittels zur Behandlung oder Prävention von folgenden Zuständen zu
verwenden:
Immunstörungen,
insbesondere solche, die mit der Anwesenheit von Autoantikörpern einhergehen,
Immunantworten
gegen körpereigenes
Gewebe, die nach einer Exposition gegen Substanzen, die die Bildung
von Autoantikörpern
beginnen,
zur Unterdrückung/Verhinderung
von Immunantworten gegen körpereigenes
Gewebe nach einer Exposition gegen Substanzen, die die Bildung von
Autoantikörpern
induzieren,
proliferative Störungen mit Bezug zu EBV (insbesondere
das B lymphoproliferative Syndrom oder B-Zell Tumoren, die bei Zuständen unterdrückter Immunität, zum Beispiel
HIV-Infektion oder Transplantation, auftreten),
Infektionskrankheiten,
bei denen C3dg-beschichtete infektiöse Erreger, vorzugsweise HIV,
durch CR2 exprimierende Zellen festgehalten werden, akute Infektion
mit EBV,
chronische Infektion mit EBV,
maligne Zellproliferationen
von CR2 exprimierenden Zellen mit oder ohne Beteiligung von EBV,
und/oder
Schutz vor Erstinfektion mit EBV.
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Der monoklonale Antikörper FE8,
der mit SCR 1 und SCR 2 von CR2 reagiert, ist in der Lage Antigene,
Partikel und pathogene Erreger, die mehrere Kopien von C3dg tragen,
von CR2 zu entfernen. Weiters blockiert der monoklonale Antikörper FE8,
indem er mit den SCRs 1 und 2 von CR2 reagiert, das Andocken von
EBV und inhibiert so die Infektion CR2 exprimierender Zellen mit
dem Virus.
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Die Erfindung wird nun an Hand ausgewählter Ausführungsbeispiele
beschrieben:
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Ausführungsbeispiel 1:
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Der monoklonale Antikörper FE8
bindet spezifisch an ein Epitop, das innerhalb der „short
consensus repeats" 1
bis 4 des Komplementrezeptors Typ 2 (CR2) lokalisiert ist.
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Um die Spezifität von FE8 für CR2 aufzuzeigen, wurden 100
ng eines rekombinanten Proteins, das die ersten 4 „short
consensus repeats" von
CR2 umfasst, an einzelne Näpfe
einer 96-Napf Mikrotiterplatte (Maxisorp®, NUNC, Kopenhagen, Dänemark) absorbiert.
Dies wurde durch Inkubation in 50 μl eines Puffers mit 100 mM Natriumhydrogenkarbonat (pH
9,6) bei 25°C über 1 Stunde
bewerkstelligt. Die Herstellung des rsCR2.1-4 genannten rekombinanten
Proteins ist ausführlich
beschrieben unter W. M. Prodinger et al.: "Expression in insect cells of the functional
domain of CD21 (complement receptor type two) as a truncated soluble
molecule using a baculovirus vector" (Immunopharmacology 38: 141–149, 1997).
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Als Kontrolle für rsCR2.1-4 wurde Komplementfaktor
H (FH), ein strukturverwandtes Protein, identisch behandelt. Nach
Blockierung der unspezifischen Bindungsstellen in jedem Napf mit
100 μl Blockierungspuffer
(1% Rinderserumalbumin in Salzlösung)
für 30
Minuten bei 25°C
wurden entweder 50 μl FE8
oder 50 μl
Kontrollantikörper
VIG8, jeweils in einer Konzentration von 10 μg/ml Blockierungspuffer, für 2 Stunden
bei 25°C
zugegeben. VIG8 ist gegen FH gerichtet. Alle Näpfe wurden drei Mal mit Salzlösung mit
0,05% Tween20® gewaschen.
Gebundene Antikörpermoleküle wurden
indirekt mit Peroxidase-markiertem, polyklonalem, gegen Maus-Immunglobulin gerichtetem
Kaninchenantikörper
(erworben von DAKO, Glostrup, Dänemark
und verwendet in der angegebenen optimalen Konzentration) detektiert.
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Fünfzig
Mikroliter dieses Konjugats wurden für 1 Stunde bei 25°C in jeden
Napf zugegeben. Nach Waschschritten wie oben angegeben wurde 2,2'-Azinobis-(3-ethylbenthiazolinsulfonsäure) in
einer Konzentration von 15 mg/mL eines 0,01 M Kaliumphosphatpuffers
(pH 6,0), der 0,025% N2O2 enthielt,
als Substrat eingesetzt. Fünfzig
Mikroliter dieser Substratlösung
wurden für
20 Minuten in jeden Napf zugegeben, danach wurde die optische Dichte bei
405 nm mit einem Mikrotiterplattenphotometer gemessen. Die Mittelwerte
von zwei Experimenten (± Standardabweichung)
sind angegeben.
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Es wird gezeigt, dass FE8 an rsCR2
bindet, aber nicht an strukturverwandten FH, wohingegen die Kontrolle
VIG8 – wie
erwartet – das
gegenteilige Bindungsverhalten zeigt.
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Ausführungsbeispiel 2:
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Der monoklonale Antikörper FE8
blockiert die Bindung von polymeres C3dg tragenden Partikeln an
CR2 vollständig.
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Um eine stringente Testung der Fähigkeit von
mAb FE8, die Bindung von polymerem C3dg an CR2 zu blockieren, zu
ermöglichen,
wurden Mikrokügelchen,
die mehrere Moleküle
C3dg trugen, hergestellt (hier als „C3d-beads" bezeichnet), wie im Wesentlichen beschrieben
bei W. M. Prodinger et al.: „Ligation
of the functional domain of complement receptor type two (CR2/CD21)
is relevant for complex formation in T-cell lines" (J. Immunol. 156:
2580–2584, 1996).
Stark CR2 exprimierende Raji-Zellen wurden für 20 Minuten bei 25°C mit diesen
C3d-Beads in Gegenwart der angeführten
Konzentrationen von anti-CR2 monoklonalen Antikörpern (d. s. HB5, OKB7, FE8)
inkubiert. Dann wurden die Zellsuspensionen mit Durchflusszytometrie
mit einem FACScan Gerät (Becton-Dickinson,
Hialeah, USA) analysiert. Raji-Zellen mit zumindest einem gebundenen
C3d-Bead zeigten eine hellere Grünfluoreszenz
und konnten dadurch von Zellen ohne C3d-Beads unterschieden werden.
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FE8 reduzierte in einer Konzentration über 50 ng/ml
die Bindung der C3d-Beads, und 200 ng/ml waren ausreichend für die komplette
Aufhebung der Bindung von C3d- Beads.
Keiner der anderen anti-CR2 mAbs war in der Lage einen ähnlichen
Effekt auszulösen.
OKB7, der einzige Antikörper
mit bekannter, partieller Inhibierung der C3dg-Bindung an CR2, reduzierte
die Bindung von C3d-Beads um höchstens
30%.
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Ausführungsbeispiel 3:
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Der monoklonale Antikörper FE8
entfernt monomere und polymere Formen von (bereits an CR2 gebundenem)
C3dg von CR2.
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Die Fähigkeit von FE8, mit bereits
an CR2 gebundenem C3dg zu interferieren, ist einzigartig und von
großer
Bedeutung für
die Verwendung von FE8 hinsichtlich einer Beeinflussung der CR2-mediierten
Verstärkung
der Antikörperproduktion
oder der Immobilisierung von C3dg-beschichtetem Antigen durch CR2
exprimierende Zellen.
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In Ausführungsbeispiel 3.a konnte im Überschuss
angebotenes monomeres C3dg über
20 Minuten bei 25°C
an Raji-Zellen binden. Nach dreimaligem Waschen der Zellen mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS)
zur Entfernung des überschüssigen C3dg
wurden die monoklonalen Antikörper
FE8 bzw. OKB7 in steigenden Konzentrationen für 10 Minuten bei 37°C zu den
Zellen gegeben. Nach neuerlichem Waschen der Zellen mit PBS wurde
die Menge von zellgebundenem monoklonalem Antikörper bzw. von zellgebundenem
C3dg bestimmt. C3dg (durchgezogene Linie) wurde mit FACS-Analyse nach
Färbung
mit FITC-markiertem Kaninchen-Antikörper gegen C3d detektiert,
zellgebundener monoklonalen Antikörper (strichlierte Linie) wurde
mit FACS-Analyse nach Färbung
mit Phycoerythrin-markiertem Ziegenantikörper gegen Maus-Immunglobulin
(Maus-Ig) detektiert.
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FE8 (Vierecke) ist in der Lage, in
Konzentrationen über
200 ng/ml praktisch alles zellgebundene C3dg abzulösen, da
bei diesen Konzentrationen das Fluoreszenzsignal auf Hintergrundwerte
abfällt.
Das zeigt, dass FE8 und C3dg nicht gleichzeitig an ein CR2-Molekül binden
können.
Hingegen können OKB7
und C3dg gleichzeitig an CR2 binden. Das bedeutet, dass OKB7 nicht
in der Lage ist, die Menge an zellgebundenem C3dg in signifikanter
Weise zu reduzieren, obwohl er an CR2 gebunden ist.
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In vivo ist die niedrige Affinität von C3dg
für CR2
(Ka = 27 μM)
hilfreich um zwischen Degradationsprodukten des C3 (die ständig im
Blut entstehen und daher nicht an CR2 exprimierende Zellen binden sollten)
und Partikeln, auf die das Immunsystem reagieren sollte, zu unterscheiden.
Diese Partikeln enthalten bis zu Tausende von C3dg Molekülen und
binden mit hoher Avidität
an CR2 exprimierende Zellen.
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Die einzigartige Fähigkeit
von FE8, solche gebundenen Partikel zu entfernen, ist in Ausführungsbeispiel
3.b dargestellt: Raji-Zellen wurden mit fluorezenzmarkierten, C3dg-beschichteten
Mikroagarosekügelchen
(siehe Ausführungsbeispiel
2), die opsonisiertes Antigen darstellen, für 20 Minuten inkubiert. Danach
wurden monoklonale Antikörper
gegen CR2 in einer Konzentration von 1 μg/ml zugegeben. Die Bindung
der C3d-beads wurde mit Durchflusszytometrie wie oben beschrieben
gemessen.
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Nur FE8 entfernte C3dg-beschichtete
Kügelchen
in quantitativer Weise.
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Ausführungsbeispiel 4:
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Der monoklonale Antikörper FE8
bindet an die in Keimzentren humaner Tonsillenfollikel lokalisierten
follikulär
dendritischen Zellen und inhibiert die Bindung von polymerem C3dg
an diese Zellen.
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Follikulär dendritische Zellen (FDC)
sind Antigen festhaltende Zellen des lymphatischen Gewebes. Sie
exprimieren große
Mengen von CR2, das als Anker dient um C3dg-beschichtete Antigene über lange
Zeit an ihrer Oberfläche
zu immobilisieren. FDC sind große
Zellen mit langen Zellfortsätzen,
die einen engen Kontakt zu benachbarten Zellen ausbilden. Um die
Bindung von C3dg-beschichtetem Antigen an FDC in ihrem zellulären Kontext
zu studieren, wurden Dünnschnitte
(2 M Schichtdicke) von schockgefrorenem humanem Tonsillengewebe
mit Hilfe eines Kryomikrotoms hergestellt. Die Tonsillen stammten
von ansonst gesunden Personen, die sich einer Tonsillektomie unterzogen.
Die Dünnschnitte
wurden auf Objektträgern
durch Trocknen bei 25°C
für 2 Stunden
fixiert. Danach wurden die Schnitte tiefgefroren und bei –80°C bis zur
Durchführung
des Experiments gelagert. Nach dem Auftauen und Trocknen bei 25°C wurden
die Schnitte mit RPMI 1640 Zellkulturmedium (BioWhittaker, Verviers,
Belgien) inkubiert, das mit 10% mit Hitze inaktiviertem, fötalem Kälberserum
(FCS; Kibbuz Beth Haemek, Israel) ergänzt worden war um unspezifische
Bindungen zu minimieren. Danach wurden monoklonale Antikörper gegen
CR2 (FE8; oder IIB9, eine nicht blockierende Kontrolle) in 2 g/ml
zugegeben und die Inkubation für 30
Minuten fortgesetzt. Fluoreszenzmarkierte C3dg-beschichtete Agarosemikrokügelchen
(siehe Ausführungsbeispiel
2) wurden für
20 Minuten zugegeben. Nach Waschen wurden die Schnitte mit PBS, das
1% Paraformaldehyd und 0,1% Natriumazid enthielt, fixiert. Gebundene
monoklonale Antikörper
wurden über
Inkubation mit Phycoerythrin-markiertem polyklonalem
Ziege-anti-Maus Antikörper
(DAKO) nachgewiesen.
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Die Schnitte wurden in einem Axiplan
Fluoreszenzmikroskop (Zeiss, Oberkochen, Deutschland) entweder mittels
Anregungslicht („Fluoreszenz") oder Durchlicht
(„Durchlicht
ohne Fluoreszenz")
betrachtet und auf 160T ASA Film (Ektachrome, Kodak) fotografiert.
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Wie im oberen Bild in 4 gezeigt, reagieren beide
mAbs mit CR2 und stellen das FDC-Netzwerk im Keimzentrum dar. Die
Bedingungen wurden so gewählt,
dass B Lymphozyten, die auf diesen Schnitten auch anwesend sind
und CR2 exprimieren, nur schwache Fluoreszenz zeigen, entsprechend
ihrer relativ geringeren CR2 Expression.
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Die Bindung von C3dg-Mikroagarosekügelchen
an denselben Schnitten ist im unteren Bild in 4 dargestellt (gebundene Kügelchen
sind mit schwarzen Punkten markiert. Die Pfeile zeigen auf drei
unmarkiert belassene Kügelchen:
Im Fall von IIB9 kolokalisieren die Kügelchen mit den FDC des Keimzentrums,
was darauf hindeutet, dass sie vorwiegend über CR2 and FDC binden. Wiederum
blockiert FE8 sehr effizient die Bindung der Mikrokügelchen
an FDC.
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Ausführungsbeispiel 5:
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Der monoklonale Antikörper FE8
inhibiert in vitro die Infektion von B Lymphozyten mit dem Epstein-Barr
Virus.
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Das Epstein-Barr Virus (EBV) ist
ein humanes Herpesvirus, das direkt an CR2 bindet und nachfolgend
CR2 exprimierende Zellen infiziert. Die Infektion löst eine
Proliferation und Vermehrung der Zelle aus. Diese Proliferation
EBV-infizierter B Lymphozyten kann über Inkorporation von tritiiertem
(das heißt: radioaktiv
markiertem) Thymidin in die Zelle während der DNS-Verdopplung gemessen
werden.
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In diesem Beispiel wurden ruhende
humane B-Zellen aus Tonsillen (200.000 B-Zellen in jeweils
50 μl pro
Napf einer 96-Napf Zellkulturplatte) mit zehnfachen Verdünnungen
der monoklonalen Antikörper gegen
CR2, nämlich
FE8 bzw. HB5 (Kontrolle), die in jeweils 50 μl mit 10% FCS ergänztem RPMI
1640 (siehe Ausführungsbeispiel
4) zugegeben wurden. Die Zellen wurden für 15 Minuten bei 37°C und 5% CO2 enthaltender Raumatmosphäre inkubiert.
Dann wurden 150 μl
einer EBV in Zellkulturmedium enthaltenden Suspension zugegeben
und weitere 90 Minuten bei 37°C
und 5% CO2 enthaltender Raumatmosphäre inkubiert.
Konditionierter Zellkulturüberstand der
Zelllinie B95-8 diente als Quelle von infektiösem EBV und wurde unverdünnt eingesetzt.
Nach 90 Minuten wurden in jedem Napf 200 μl der Zellkulturflüssigkeit
mit 200 μl
RPMI 1640, welches mit 10% FCS und 0,2 μg/ml Cyclosporin A ergänzt war,
ersetzt. Die Inkubation wurde für
10 Tage fortgesetzt, dann wurden 37 kBq an 3H-Thymidin
in 10 μl
Medium pro Napf für
24 Stunden zugegeben. Danach wurden die Zellkerne auf Glasfiberfiltern
geerntet. Eingebaute Radioaktivität wurde mittels Flüssigszintillationsmessung folgendermaßen detektiert:
die Glasfiberplättchen wurden
in 1 ml Szintillationsflüssigkeit
(Ultima Gold, Packard) gegeben und in einem TriCARB 2200CA Betacounter
(Packard) gemessen. Werte sind Mittelwerte aus Dreifachexperimenten
und werden für
einen repräsentativen
Spender von drei untersuchten Spendern dargestellt. Balken stellen
den Standardfehler des Mittelwertes dar.
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Das Ausführungsbeispiel zeigt, dass
FE8 den 3H-Thymidin Einbau und somit die
Proliferation der B Lymphozyten dosisabhängig reduziert. Die Proliferation
beruhte auf der EBV-Infektion, zumal B-Zellen ohne EBV nicht proliferierten.
Diese zeigten cpm-Werte zwischen 100 und 200, die durch die monoklonalen
Antikörper
FE8 oder HB5 nicht verändert wurden.
Die Gegenwart des Kontrollantikörpers (HB5)
reduzierte die EBV-induzierte Zellvermehrung nicht.
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Ausführungsbeispiel 6:
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Der monoklonale Antikörper FE8
hemmt die Bindung von C3dg-beschichtetem humanem Immundefizienzvirus
(HIV) an CR2 exprimierende Zellen und entfernt C3dg-beschichtetes
HIV von diesen Zellen.
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HIV, ein humanes Retrovirus, das
das erworbene Immunmangelsyndrom (AIDS) auslöst, bindet bekanntlich an Zielzellen
wie Monozyten und T-Helferzellen über Oberflächenmoleküle, die an bestimmte Rezeptoren
(CD4 und Chemokinrezeptoren) der Zielzelle binden können. Im
menschlichen Körper vorliegendes
HIV überzieht
sich mit einer Schicht C3dg in Folge der Komplementaktivierung,
ausgelöst entweder
durch direkte Bindung von Komplement C1q oder durch die Mithilfe
von anti-HIV Antikörpern. Es
ist bekannt, dass C3dg-beschichtetes HIV an CR2 exprimierende B-Lymphozyten binden
kann und diese Zellen in vitro infiziert. Nicht opsonisiertes HIV kann
weder binden noch infizieren.
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Es ist weiters bekannt, dass CR2
exprimierende FDC C3dg-beschichtetes HIV binden ohne mit dem Virus
infiziert zu werden, sondern infektiöses HIV vielmehr über einen
langen Zeitraum auf ihrer Oberfläche
lagern. Nachdem C3dg-beschichtetes, von CR2 exprimierenden Zellen
festgehaltenes HIV dem Immunsystem und der antiretroviralen Therapie entkommt,
ist eine Möglichkeit,
HIV von CR2 exprimierenden Zellen abzuspülen, wichtig während einer HIV
Therapie.
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In dieser Hinsicht wurden Raji Zellen
hier als Modellsystem für
CR2 exprimierende Zellen verwendet.
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HIV des Stammes IIIB wurde durch
Vermehrung eines Inokulums in mit IL-2 (20 U/ml) stimulierten
mononukleären
Zellen des peripheren Blutes von gesunden, HIVnegativen Spendern
hergestellt. Als Maß für die Viruskonzentration
wurden 200 ng/ml des viralen Proteins p24 festgestellt. HIV-IIIB
wurde durch Inkubation für
60 Minuten bei 37°C
mit normalem humanem Serum (1 : 10 verdünnt in mit 10% FCS ergänztem RPMI
1640 Medium, wie in den Ausführungsbeispielen
4 und 5 beschrieben) und DV012, einem polyklonalen anti-gp120 Antikörper vom
Schaf (verdünnt
1 : 100 in mit 10% FCS ergänztem
RPMI 1640), mit Komplement C3-Fragmenten
beschichtet. DV012 bindet an HIV und führt bekanntermaßen über den
klassischen Weg der Komplementaktivierung zur C3dg Ablagerung. Dieser
Weg ist streng abhängig von
der Gegenwart von Kalziumionen und wird durch EDTA gehemmt. In Kontrollen
wurde HIV unter sonst identen Bedingungen mit normalem humanem Serum
und entweder 20 mM Ethylendiamintetraazetat (EDTA) allein oder 20
mM EDTA und DV012 inkubiert.
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Nach der Seruminkubation wurde HIV
mittels Ultrazentrifugation (in einer Beckmann L8-M Ultrazentrifuge
bei 50.000 g in einem SW41Ti Rotor für 60 Minuten bei 4°C) pelletiert
und in 70 μl
mit 10% FCS ergänztem
RPMI 1640 aufgenommen. Die Viruspräparation wurde mit 1 μg/ml p24
zu 1 × 106 Raji Zellen gegeben und für 30 Minuten
bei 4°C
inkubiert um eine Bindung an die Zellen zu ermöglichen (gezeigt als schwarzer
Balken in 6). Experimente
wurden durchgeführt,
in denen FE8 mit 1 g/ml Endkonzentration zu den Raji Zellen entweder
für 1 Minute bei
4°C vor
Viruszugabe (weiße
Balken) oder für
10 Minuten bei 37°C
nach Viruszugabe (graue Balken) zugegeben wurde. Danach wurden die
Zellen drei Mal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen um ungebundenes
Virus zu entfernen. Um die Mengen von zellgebundenem HIV zu bestimmen, wurde
das Zellpellet durch Inkubation mit 200 μl Lysepuffer für 30 Minuten
auf Eis lysiert. Der Lysepuffer bestand aus 50 mM Tris, 300 mM NaCl,
0,5% Triton X-100, 1 mM PMSF und 10 μg/ml Aprotinin bei pH 7,4.
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Der Gehalt des Lysats an Virusprotein
p24, der eine akzeptierte Messgröße für die Zahl
der zellgebundenen Viruspartikeln und dieser proportional ist, wurde
mittels Enzym gekoppeltem Immunadsorptionstest (ELISA), entwickelt
von Franz Steindl, Institut für
angewandte Mikrobiologie, Wien, bestimmt.
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Ein monoklonaler Mausantikörper gegen HIV-1
p24 Antigen wurde an eine ELISA-Platte
(Greiner, Kremsmünster, Österreich)
mit 200 ng pro Napf gebunden. Die lysierten Proben (1 : 1 verdünnt mit 1%
NP-40 in Tris-gepufferter Salzlösung
(pH 7,4) wurden für
1 Stunde bei Raumtemperatur in beschichtete Näpfe gegeben. Gebundenes HIV-1
p24 Antigen wurde mit einem zweiten, biotinylierten monoklonalen
anti-p24 Antikörper,
gefolgt vom Streptavidin-Betagalaktosidase-Konjugat
entdeckt. Die optische Dichte der Farbreaktion mit dem Substrat
Resorufin-β-D-Galaktopyranosid
(Sigma, St. Louis, Missouri, USA) wurde in einem Mikrotiterplattenphotometer
bei 550 nm gemessen.
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Wie in Ausführungsbeispiel 6 zu sehen,
band HIV-IIIB an Raji Zellen, wenn es mit normalem humanem Serum
und DV012 inkubiert worden war. HIV-IIIB, das mit normalem humanem
Serum mit EDTA inkubiert worden war, band nicht, ebenso wenig wie
mit normalem humanem Serum, aber ohne DV012 inkubiertes HIV-IIIB.
Dies impliziert, dass HIV-IIIB an die Zellen durch eine Beschichtung
mit C3-Fragmenten wie
C3dg bindet. War jedoch FE8 vor der Zugabe von C3dg-beschichtetem HIV-IIIB
zu den Raji Zellen anwesend, banden keine Viruspartikel an die Zellen (weiße Balken).
Wurde FE8 zu Zellen zugegeben, die bereits große Mengen von HIV-IIIB an ihrer
Oberfläche
gebunden hatten (graue Blaken), so wurde eine beachtliche Reduktion
von zellgebundenem HIV-IIIB beobachtet.