DE60316106T2

DE60316106T2 - Gemeinsamer lymphatischer endothel- und gefässendothel-rezeptor-1 (clever-1) und seine verwendung

Info

Publication number: DE60316106T2
Application number: DE60316106T
Authority: DE
Inventors: Sirpa Jalkanen; Heikki Irjala; Marko Salmi
Original assignee: Faron Pharmaceuticals Oy
Current assignee: Faron Pharmaceuticals Oy
Priority date: 2002-01-09
Filing date: 2003-01-08
Publication date: 2008-05-29
Anticipated expiration: 2023-01-09
Also published as: AU2003201168A1; JP2005523247A; AU2003201168A8; US7354577B2; US7910097B2; US20080267958A1; ATE372348T1; EP1463760A2; WO2003057130A2; ES2289293T3; WO2003057130A3; DE60316106D1; EP1463760B1; CA2468888C; US20050069888A1; JP4387797B2; CA2468888A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der Zelladhäsionsproteine. Speziell liegt die Erfindung auf dem Gebiet von CLEVER-1, einem neuen Protein, das den Einstrom von Leukozyten und malignen Zellen in das lymphatische System und auch den Abfluss derselben aus den Lymphknoten erleichtert bzw. ermöglicht.
Hintergrundinformation
Leukozyten sind die wichtigsten zellulären Komponenten von entzündlichen Reaktionen und Immunantworten. Leukozyten umfassen Lymphozyten, natürliche Killerzellen (NK), Monozyten, dendritische Zellen und Granulozyten (Neutrophile, Eosinophile und Basophile). Siehe Harrison's Principles of Internal Medicine, Fauci, A.S. et al. Hrsg. (14. Aufl., 1998). Lymphozyten setzen sich aus B-Zellen und T-Zellen zusammen. B-Zellen bilden die humorale Immunität und sind die Vorläufer von Plasmazellen. T-Zellen bilden die zellvermittelte Immunität. Monozyten differenzieren sich in den Geweben weiter zu Makrophagen. An entzündeten Stellen können sich Monozyten des Blutes an entzündete Endothelien anlagern. Makrophagen erkennen und internalisieren ein breites Spektrum an exogenen Stoffen wie zum Beispiel Bakterien. Weiters spielen Granulozyten eine kritische Rolle bei Entzündungen. Sie werden benötigt um Infektionen mit extrazellulären Bakterien zu bereinigen. Die Immunantwort hat eine wichtige Funktion bei Wachstum, Differenzierung und Mobilisierung von Granulozyten.
Kontinuierliche Zirkulation von Lymphozyten zwischen Blut und lymphoiden Geweben bildet eine Basis für die Funktion des Immunsystems. Diese Zirkulation ermöglicht jedoch unbeabsichtigterweise auch zumindest 2 medizinische Zustände: Entzündung und Metastase.
Lymphozyten dringen durch Bindung an Zellen des Endothels in Gefäßen in die lymphoiden Gewebe ein. Die Anlagerung bzw. Anheftung von Lymphozyten an endotheliale Zellen wird durch komplementäre, an der Oberfläche beider Zelltypen exprimierte Moleküle vermittelt. Die Anhaftungsmoleküle und Mechanismen des Eintritts von Lymphozyten in Gewebe aus dem Blut wurden gründlich charakterisiert. Mechanismen, welche den Austritt von Lymphozyten aus den nicht-lymphoiden und lymphoiden Geweben via Lymphbahnen kontrollieren blieben jedoch unbekannt.
Der Großteil der Lymphozyten extravasiert über spezialisierte Gefäße, die so genannten „High Endothelial Venules" (HEV), in die Lymphknoten. Der Rest der ankommenden Lymphozyten gelangt zusammen mit Antigenen und anderen Typen hämatopoetischer Zellen, wie zum Beispiel dendritischen Zellen, Makrophagen und Granulozyten, über afferente Lymphbahnen in die Lymphknoten. Allerdings sind nur Lymphozyten dazu fähig, die Knoten über das efferente lymphatische System wieder zu verlassen. Hierfür durchdringen sie zuerst das sinusoidale Endothel und treten sodann in die efferenten Lymphgefäße ein. Für die Aufrechterhaltung der Homöostase in den Lymphknoten müssen die Zahlen ankommender und abwandernder Lymphozyten genau ausbalanciert sein. Die molekularen Mechanismen, die in den Austritt von Lymphozyten involviert sind, sind unbekannt.
Zusätzlich zur wesentlichen Bedeutung bei normaler Lymphozytenrezirkulation regulieren Lymphgefäße auch das Verteilen von metastasierenden Zellen in ca. 50% der Krebsarten, welche diesen Gefäßtyp für die Verbreitung verwenden. Lymphknoten sind oft die ersten Organe, welche Metastasen entwickeln, besonders im Falle von Karzinomen. Das Design des lymphatischen Systems macht es malignen Tumoren relativ einfach, darin einzudringen (Sleeman, J.P., Recent Results Cancer Res. 157: 55–81 (2000)). Infolgedessen haben Stoffe, welche den Ein- und Austritt maligner Tumorzellen in und aus Lymphbahnen verhindern, enormes therapeutisches Potential.
KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Mit dem Erkennen der Erfordernis, die Lymphozytenrezirkulation zu kontrollieren, initiierten die Erfinder eine Untersuchung der Proteine der efferenten Lymphgefäße. Diese Untersuchungen gipfelten in der Entdeckung eines neuen Proteins, des gemeinsamen Lymphendothel- und Gefäßendothelrezeptors-1 („Common Lymphatic Endothelial and Vascular Endothelial Receptor-1”) (CLEVER-1), einem Bindungsprotein, das die Adhäsion von Lymphozyten (und malignen Tumorzellen) an das Endothel sowohl in der systemischen Vaskulatur als auch in den Lymphgefäßen vermittelt. Die Erfinder entdeckten, dass durch das Blockieren der Wechselwirkung von CLEVER-1 und seinem Lymphozytensubstrat der Fachmann zum ersten Mal simultan die Lymphozytenrezirkuation und die Lymphozytenmigration und Zustände mit Bezug dazu, wie Entzündung, an der Stelle des Lymphozyteneinstroms in und des -abflusses aus den Geweben kontrollieren kann. Die Erfinder entdeckten auch, dass CLEVER-1 auch die Bindung anderer Typen von Leukozyten, wie Monozyten und Granulozyten, an HEV-artige Gefäße vermittelt. Weiterhin kann der Fachmann durch Blockieren der Wechselwirkung von CLEVER-1 und malignen Tumorzellen auch zum ersten Mal die Metastase kontrollieren, indem verhindert wird, dass maligne Zellen, die an CLEVER-1 binden, durch die Lymphgefäße aufgenommen werden, und indem somit die Ausbreitung der Malignität in die Lymphknoten verhindert wird.
Die Veröffentlichung von Hideki Adachi et al., „FEEL-1, a novel scavenger receptor with in vitro bacteria-binding and angio-modulating activities", J. Biol. Chem. Bd. 277, Nr. 37, September 2002, offenbart ein Polypeptid mit einer Sequenz, die CLEVER-1 mit Ausnahme weniger Mutationen entspricht.
Die Genbank-Datenbank, 26. November 1999, Datenbank-Eingangsnr. HSA275213, offenbart die Aminosäure- und Nukleotidsequenzen von Stabilin-1. Die Aminosäuresequenz unterscheidet sich von derjenigen von CLEVER-1 hinsichtlich zweier Aminosäuren. Es wird keine therapeutische Funktion der Sequenzen offenbart.
Gemäß einem Aspekt betrifft diese Erfindung ein Verfahren zum In-vitro-Diagnostizieren von Entzündungserkrankungen bei einem Patienten, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Exponieren einer Blut- oder Gewebeprobe von dem Patienten gegenüber einem gemeinsamen Lymphendothel- und Gefäßendothel-Glycoprotein (CLEVER-1) in vitro, wobei das Glycoprotein ein Molekulargewicht von 270 bis 300 kD in einer SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen hat und durch einen monoklonalen Antikörper, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus (i) monoklonaler Antikörper 3–266 (DSM ACC 2519); und (ii) monoklonaler Antikörper 3–372 (DSM ACC 2590), erkennbar ist, für eine Zeitdauer und unter Bedingungen, die ausreichend sind, um das Binden von Leukozyten, falls in der Probe vorhanden, zu ermöglichen, und
(b) Detektieren von Leukozyten, die an das Glycoprotein in der Blut- oder Gewebeprobe gebunden sind.

Gemäß einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum In-vitro-Detektieren maligner Zellen bei einem Patienten, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Exponieren einer Blut- oder Gewebeprobe von einem Patienten gegenüber dem Glycoprotein, wie oben definiert, in vitro für eine Zeitdauer und unter Bedingungen, die ausreichend sind, um das Binden der malignen Zellen, falls in der Probe vorhanden, zu ermöglichen, und
(b) Detektieren, ob irgendwelche malignen Zellen in der Blut- oder Gewebeprobe an das Glycoprotein gebunden haben.

Gemäß einem dritten Aspekt betrifft diese Erfindung ein Verfahren zum Entfernen von malignen Zellen aus einer Probe, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Exponieren der malignen Zellen gegenüber dem Glycoprotein, wie oben definiert, in vitro für eine Zeitdauer und unter Bedingungen, die ausreichend sind, um die Bindung maligner Zellen, falls in der Probe vorhanden, zu ermöglichen, und
(b) Abtrennen des Glycoproteins und der malignen Zellen, die daran haften, aus der Pro be.

Gemäß einem vierten Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines Mittels, das die Glycoprotein-vermittelte Leukozytenbindung inhibiert, wobei das Glycoprotein wie oben definiert ist, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die in einem Verfahren zum Behandeln von Entzündung bei einem Patienten, der dessen bedarf, zweckmäßig ist, wobei das inhibierende Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:

(a) Antikörpern oder Fragmenten davon, erzeugt gegen das Glycoprotein; und
(b) dem Glycoprotein oder Fragmenten davon in löslicher Form.

Gemäß einem fünften Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines Mittels, das die Bindung maligner Zellen, vermittelt durch das Glycoprotein, wie oben definiert, inhibiert, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die in einem Verfahren zum Verhindern von Metastase bei einem Patienten, der dessen bedarf, zweckmäßig ist, wobei das inhibierende Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:

Gemäß einem sechsten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum In-vitro-Diagnostizieren von Entzündungserkrankungen bei einem Patienten, wobei das Verfahren das Exponieren einer Blut- oder Gewebeprobe von dem Patienten gegenüber einem Antikörper umfasst, der entweder

– monoklonaler Antikörper 3–266 (DSM ACC 2519); oder
– monoklonaler Antikörper 3–372 (DSM ACC 2590)

ist
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1a–1i. Indirekte Immunoperoxidasefärbung, welche zeigt, dass die monoklonalen Antikörper 3–266 und 3–372 das Endothel sowohl in afferenten und efferenten Lymphbahnen als auch in HEV erkennen. 1a–1c stammen von Haut, 1d–1i aus einem Lymphknoten. 1a, 1d und 1g zeigen die Färbung mit dem monoklonalen Antikörper 3–266, 1b, 1e und 1h zeigen die Färbung mit dem monoklonalen Antikörper 3–372 und 1c, 1f und 1i zeigen die Färbung mit einem negativen Kontrollantikörper, 3G6. In 1a, 1b und 1c weisen die Pfeile auf das Epithel und Pfeilspitzen auf afferente Lymphbahnen. In 1d und 1e weisen die Pfeile auf Lymphgefäße (lymphatische Sinusoide, die zum efferenten lymphatischen System gehören) im Lymphknoten. In 1g und 1h zeigen die Pfeile auf HEV.
2. Die monoklonalen Antikörper 3–266 und 3–372 erkennen ein Molekül von ungefähr 270–300 kDa. Moleküle aus Lymphknoten-Lysaten wurden mit Hilfe von SDS-PAGE aufgetrennt, auf Nitrocellulose-Faktoren geblottet und mit monoklonalen Antikörpern 3–266 und 3–372 bzw. negativem Kontrollantikörper 3G6 getestet.
3A und 3B. CLEVER-1 spielt eine Rolle bei der Bindung von Lymphozyten an Zellen des Endothels sowohl in HEV als auch in Lymphbahnen. Ein Bindungsexperiment wurde durchgeführt um die Bindung von Lymphozyten an HEV (3A) und lymphatisches Endothel (3B) zu messen. Die Schnitte wurden mit monoklonalen Antikörpern 3–266 oder 3–372 oder negativen Kontrollantikörpern anti-HLA ABC oder 3G6 („neg co") präinkubiert und danach wurden die Schnitte mit normalen Lymphozyten überschichtet. Die Resultate von drei bis vier unabhängigen Inhibierungsexperimenten werden als mittlere Prozentzahlen der maximalen Bindung ± Standardfehler des Mittelwertes ("SEM") dargestellt.
4A und 4B. CLEVER-1 ist in die Bindung von Tumorzellen an Zellen des Endothels in HEV und Lymphbahnen involviert. Ein Bindungsexperiment wurde durchgeführt, um die Bindung verschiedener Tumorzelllinien an HEV (4A) und lymphatisches Endothel (4B) zu bestimmen. Die Schnitte wurden mit 3–372 oder negativem Kontrollantikörper (anti-HLA ABC) präinkubiert und darauf folgend wurden die Schnitte mit unterschiedlichen Tumorzellen überschichtet: Nu, NA, IBW4, KCA und CRL 1648. Die Ergebnisse von 3–4 unabhängigen Inhibierungsexperimenten werden als mittlere Prozentzahlen der maximalen Bindung ± SEM dargestellt.
5. CLEVER-1 wird in HEV-ähnlichen Gefäßen an Orten von Entzündungen in Verbindung mit Infiltration inflammatorischer Zellen induziert (5a–5c, Synovium; 5d–5f, Haut). 5a. Fibrotischer Typ entzündeten Synoviums ohne merkliche Infiltrationen inflammatorischer Zellen. Nur die afferenten Lymphbahnen exprimierten CLEVER-1 (Pfeile). 5b. CLEVER-1 in einem HEV-ähnlichen Gefäß inmitten starker Lymphozyten-Infiltration war hochreguliert (markiert durch gestrichelte Linie). 5c. Färbung mit einem negativen Kontrollantikörper (3G6). 5d. In normaler Haut exprimierten afferente Lymphbahnen CLEVER-1 (Pfeile), aber in entzündeter Haut exprimierten auch HEV-ähnliche Gefäße (gestrichelte Linie) CLEVER-1 (5e). Negative Kontrollfärbung (5f). Pfeilspitzen zeigen auf Epidermis (5d–5f).
6 CLEVER-1 vermittelt eine Bindung von Monozyten und Granulozyten an HEV-ähnliche Gefäße an entzündeten Stellen. Die Beteiligung von CLEVER-1 an der Bindung von Monozyten und Granulozyten an entzündete synoviale Gefäße und der Bindung von Granulozyten an Tonsillen wurde mit Hilfe eines Stamper-Woodruff-Typ von Bindungsexperiment getestet. 3–372 und 3–266 (als Pool), nicht jedoch der Klasse angepasste Kontrollantikörper (3G6) inhibierten die Bindung von Granulozyten und Monozyten an HEV-ähnliche Gefäße in den getesteten Organen signifikant. Die Resultate von vier unabhängigen Experimenten sind als durchschnittliche Prozentzahlen der maximalen Bindung (=100% in der Präsenz des Kontrollantikörpers) ± SEM dargestellt.
7. Molekulare Charakterisierung von CLEVER-1. (a) Die Antikörper 3–266 und 3-372 erkennen ein 270–300 kDa großes Molekül im Immunoblotting. 3G6 ist ein negativer Kontrollantikörper. (b) In Gelen, welche für bessere Auflösung 48 Stunden lang laufen gelassen wurden, werden zumindest drei verschiedene Isoformen von CLEVER-1 entdeckt und enzymatische Verdauung mit Neuraminidase und O-Glykane enthüllen die Sialoglycoprotein-Natur von CLEVER-1. (c) Der relative Anteil der einzelnen Isoformen unterscheidet sich in Tonsillen, Lymphknoten und Synovium. (d) Eine alternative Spleißvariante ohne das Exon 27 findet sich in 1. Lunge, 2. Gehirn, 3. Plazenta, 4. Herz, 5. Leber, 6. Skelettmuskel, 7. Niere, 8. Pankreas, 9. Milz, 10. Thymus, 11. Prostata, 12. Hoden, 13. Eierstock, 14. Dünndarm, 15. Dickdarm, 16. Lymphknoten. Wasser als Negativkontrolle (Bahn 17). Die obere Bande symbolisiert die Standardform und die untere Bande ist die Spleißvariante von CLEVER-1.
8. CLEVER-1 wird in vivo an der Oberfläche von Endothelien exprimiert und die Inhibierung seiner Funktion blockiert den Übergang von Lymphozyten. Intravenös verabreichter 3–372 Antikörper (a) nicht jedoch ein Subtyp-angepasster negativer Kontrollantikörper (b) fand sich nach 5 min. Zirkulation an der Oberfläche von HEV in Lymphknoten. HEV ist durch Pfeile in (a) markiert. (c) Anti-CLEVER-1-Antikörper-Therapie inhibiert deutlich die Größenzunahme von Lymphknoten, welche die Pfoten drainieren. (Ein Lymphknoten eines 3–372 behandelten Kaninchens wurde nicht gefunden). (d) Lymphatische Sinusoide von 3–372 behandelten Tieren enthielten weniger Lymphozyten als jene von mit Kontrollantikörpern behandelten Kaninchen (e).
9. Die Nucleotidsequenz (7879 Nucleotide) von CLEVER-1. Grau hinterlegt sind das Translationsstart-Codon, das Translationsstopp-Codon, die zwei RGDs, das mögliche Polyadenylierungssignal und die vier Nucleotide 1131, 2767, 6629 und 6969, die sich vom Genbank Eintrag AJ 2752213 (Stabilin-1) unterscheiden. Unterstrichen sind die Nucleotide, die den alternativ gespleißten Exons entsprechen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Der Begriff „verbessern" bezeichnet die Verminderung eines Effektes. Einen Zustand oder eine Krankheit zu verbessern, bedeutet die Verminderung der Symptome des Zustandes oder der Krankheit.
Der Begriff „modulieren" bedeutet kontrollieren in vorhersagbarer Art und Weise, entweder durch Steigerung oder Reduktion des Zielparameters, je nachdem wie im Kontext angezeigt.
Der Begriff „effektive Dosis" bezieht sich auf die Menge des angeführten Stoffes bzw. Mittels, die ausreicht um den erwünschten Effekt zu erzielen.
Die Bezeichnung „entzündlicher Zustand" bezieht sich auf einen physiologischen oder pathologischen Zustand, welcher von einer entzündlichen Reaktion in einem Individuum begleitet wird. Diese beinhaltet unter anderem eine unerwünschte Anhäufung von Leukozyten an einer oder mehreren Stellen in dem Individuum. Der entzündliche Zustand kann hyperakut, akut, subakut oder chronisch sein. Weiters kann er lokal auf die entzündete Wunde begrenzt oder diffus über das gesamte Individuum verteilt sein.
Der Begriff „Medikament" bzw. „Wirkstoff" bezeichnet jedweden pharmazeutische(n/s) oder physiologische(n/s) Wirkstoff bzw. Mittel, Mischung, bioaktive Verbindung oder Kombinationen davon, die für Diagnose, Heilung, Linderung, Behandlung oder Vorbeugung einer Krankheit bzw. andere medizinische Anwendungen verwendet werden können. Es ist beabsichtigt, die Bezeichnung „Medikament" allgemein zu interpretieren und nicht in Bezug auf chemische Zusammensetzung bzw. biologische Aktivität einzuschränken.
Der Begriff „im Wesentlichen frei von Kontaminanten" bezieht sich auf eine Substanz, welche frei von unerwünschten oder unnötigen Stoffen ist, die während der in vitro oder in vivo Synthese des erwünschten Stoffes präsent waren.
Der Begriff „Behandlung" oder „behandeln" bezieht sich auf die Verabreichung eines Stoffes an ein Individuum mit dem Ziel, eine unerwünschte Störung zu verhüten, zu verhindern, zu verbessern oder zu heilen. Eine derartige Behandlung muss die Störung, z.B. Entzündung, nicht notwendigerweise vollständig heilen; es genügt, dass eine derartige Behandlung die Störung so weit verbessert, dass es für das behandelte Individuum vorteilhaft ist. Weiters kann eine derartige Behandlung in Verbindung mit alternativen, traditionellen Behandlungen verwendet werden, zum Beispiel mit alternativen Behandlungsmethoden mit dem Ziel, den entzündlichen Zustand zu reduzieren, welche dem Fachmann bekannt sind und sinnvoll erscheinen.
Mit „Blutgefäßsystem" ist das gesamte vaskuläre Netzwerk an Blutgefäßen im Körper eines Tieres oder Menschen gemeint.
Mit „lymphatischem System" wird der spezialisierte Teil des Kreislaufsystems bezeichnet, der sich aus Lymphflüssigkeit, Lymphbahnen bzw. Lymphgefäßen und Lymphknoten zusammensetzt. Die Lymphknoten finden sich entlang der Lymphflüssigkeit-sammelnden Gefäße und in isolierten Knötchen aus lymphatischen Gewebestücken in der Wand des Verdauungstraktes. Zusätzlich existieren spezialisierte lymphatische Organe wie zum Beispiel Tonsillen, Thymus und Milz. B-Lymphozyten starten ihre finalen Reifungsschritte in den germinalen Zentren der kortikalen Knötchen in den Lymphknoten. Reifende Lymphozyten werden sodann, während sie reifen, in die dichter gepackten äußeren Bereiche gedrängt, bevor sie in die efferenten Lymphbahnen freigesetzt werden. Die Lymphknoten, die sich am Grund des Mundes befinden, werden als submentale oder submaxillare Lymphknoten bezeichnet. Die oberflächlichen zervikalen Lymphknoten befinden sich im Genick. Die oberflächlichen kubitalen oder supratrochlearen Lymphknoten sind genau über der Beuge im Ellbogen lokalisiert. Die axillären Lymphknoten sind tief in der Achselhöhle („within the underarm") und dem oberen Brustbereich angesammelt. Inguinale Lymphknoten finden sich in der Leiste. Mit „Lymphbahnen" sind die Gefäße gemeint, die die Lymphflüssigkeit zum Blut zurücktransportieren. Lymphflüssigkeit ist die klare Flüssigkeit, die in den Lymphbahnen fließt. Lymphflüssigkeit entsteht aus Plasma, das aus Blut, das in den Kapillaren fließt, in das Interstitium filtriert wird. Obwohl der Großteil dieses Plasmas von Zellen oder dem Blut aufgenommen und absorbiert wird, wird ein kleiner Teil nicht absorbiert. Die Lymphgefäße dienen als Ableitungen, um diesen Überschuss an Flüssigkeit aufzufangen und wieder an das venöse Blut abzugeben, kurz bevor es das Herz erreicht. Die Lymphknoten dienen als Filter, die die Lymphflüssigkeit von verschiedenen Lymphbahnen sammeln und die Lymphflüssigkeit durch Sinuse genannte Räume vor dem Drainieren bzw. Ableiten in ein einzelnes efferentes Ableitungs- bzw. Drainiergefäß „perkolieren".
Mit „afferenten Lymphbahnen" sind Gefäße gemeint, durch welche Antigene in die Lymphknoten eindringen. Lymphozyten können die Lymphknoten entweder über afferente Lymphgefäße oder über die „High Endothelial Venules” (HEV) betreten.
Mit „High Endothelial Venules" (HEV (im Deutschen selten als hochendotheliale Venole bezeichnet)) sind spezialisierte kortikale postkapillare Venolen gemeint, deren Endothel einfach kubisch bis säulenartig an Stelle von einfach schuppenartig ist. HEVs finden sich haupt sächlich im Parakortex der Lymphknoten. Lymphozyten durchqueren die HEV und „wandern" so mittels eines Vorganges in den Lymphknoten, der Diapedese genannt wird. Dabei heften sich Lymphozyten an der luminalen Oberfläche der HEV an und drücken dann in den Raum zwischen zwei oder mehr HEV-Zellen.
Mit „efferenten Lymphgefäßen" werden jene Gefäße bezeichnet, durch die die Lymphknötchen (-knoten) entleert werden.
Mit „Lymphozytenrezirkulation" wird die kontinuierliche Bewegung von Lymphozyten durch das Kreislauf- und Lymphsystem bezeichnet. Lymphozyten verlassen den Lymphknoten und werden zuerst über die Lymphflüssigkeit in das venöse System abgegeben, das in das Herz abfließt.
Die Lymphozyten zirkulieren dann im Blutstrom durch den Körper. Die meisten der Lymphozyten werden wieder zur Milz oder anderen Lymphknoten zurückgebracht. Circa 10% wandern in nicht-lymphoide Organe; Lymphozyten, die noch nie aktiviert wurden, können nicht-lymphoide Organe nicht betreten.
„Wanderung" von Lymphozyten bezieht sich auf die Bewegung von Lymphozyten zu spezifischen Orten. Außerhalb der Lymphknoten erlaubt die Wanderung von zirkulierenden Lymphozyten die Ansammlung von Lymphozyten an entzündeten Stellen. Aktivierte Effektor-Lymphozyten tendieren dazu, zu entzündeten Stellen zu wandern, was zu einem starken Zufluss von Lymphozyten zu entzündeten Stellen führt. In den entzündeten Bereichen binden Lymphozyten an Zellen des Endothels, das die Blutgefäße auskleidet. Diese Anhaftung lokalisiert die Lymphozyten an der entzündeten Stelle und ermöglicht eine nachfolgende Auswanderung der Zellen in die umgebenden Gewebe (Austritt).
Identifikation und Reinigung von CLEVER-1
Die Basis der Erfindung ist die Entdeckung eines neuen Moleküls im Blutgefäßsystem und in den afferenten und efferenten Lymphgefäßen. Dieses Protein wird hiermit als „Common Lymphatic Endothelial and Vascular Endothelial Receptor-1" (Gemeinsamer Lymphendothel- und Gefäßendothelrezeptor-1) bezeichnet. Es wurde herausgefunden, dass sowohl Leukozyten, wie Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten, als auch maligne Zellen dieses Protein spezifisch binden. Weiters wurde entdeckt, dass dieses Protein als Rezeptor fungiert, der den Eintritt von gebundenen Leukozyten und malignen Zellen durch die Wände des Blutgefäßsystems in die Lymphknoten und aus den Lymphknoten erleichtert.
Auf der Suche nach einem Protein, das eine Rolle bei dem Ausfluss von Lymphozyten aus Lymphgefäßen spielt, identifizierten die Erfinder zuerst Zellwanderungs-assoziierte lympha tische Strukturen aus isolierten efferenten Lymphgefäßen menschlicher Lymphknoten. Diese Strukturen wurden zur Produktion monoklonaler Antikörper verwendet. Hybridomas wurden an gefrorenen Schnitten menschlicher Lymphknoten mittels Immunoperoxidasefarbung getestet.
Zwei der Hybridomas produzierten Antikörper (als 3–266 und 3–372 bezeichnet), die eindeutig lymphatisches Endothel bzw. Lymphendothel sowohl in afferenten als auch in efferenten Lymphgefäßen und vaskuläres Endothel bzw. Gefäßendothel in HEV färbten, während andere Strukturen ungefärbt blieben. Dies stimmt mit dem erwarteten Muster eines Antikörpers überein, der Strukturen, assoziiert mit der Wanderung von Lymphozyten, erkennt. Zellkulturen von 3–266 (DSM ACC2519) und Zellkulturen von 3–372 (DSM ACC2590) wurden beide unter den Bedingungen des Budapester Vertrages über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren am 21. August 2001 bei DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, hinterlegt.
In Immunoblotting-Experimenten zur Bestimmung des Molekulargewichtes erkannten beide Antikörper ein Molekül derselben Größe mit ungefähr 270–300 kDa. Auf Grund dessen und eines identischen Färbungsmusters wurde angenommen, dass diese Antikörper dasselbe Antigen erkennen. Dieses Antigen wurde als „Common Lymphatic Endothelial and Vascular Endothelial Receptor-1" bzw. gemeinsamer Lymphendothel- und Gefäßendothelrezeptor-1 (CLEVER-1) bezeichnet.
CLEVER-1 wurde aus CLEVER-1 enthaltenden Lymphknotenpräparaten mittels Affinitätschromatographie mit dem Antikörper 3–372 aufgereinigt. Das Eluat wurde SDS-PAGE-Analyse und Silberfärbung unterzogen. Die spezifische Bande wurde ausgeschnitten, reduziert, alkyliert und mit Trypsin verdaut.
Nach der Spaltung mit Trypsin erbrachten Analysen mittels Massenspektrometrie 27 Peptide. Einundzwanzig (77%) davon hatten identische Sequenzen mit Stabilin. Diese Sequenzen deckten gemeinsam 268 Aminosäuren (10% der 2570 Aminosäuren von Stabilin-1) ab und erstreckten sich über Aminosäuren zwischen 53 und 2301 (Tabelle 1). Die Peptiddaten lassen vermuten, dass CLEVER-1 auf struktureller Ebene einige Homologie mit Stabilin-1 hat. In der Literatur können keine Informationen bezüglich der Funktion von Stabilin-1 gefunden werden.
Peptidanalyse von CLEVER-1 zeigt keine signifikante Homologie mit den bekannten mit der Endothel-Targetierung assoziierten Molekülen, wie zum Beispiel ICAM-1 (Intracellular Adhesion Molecule bzw. interzelluläres Adhäsionsmolekül), ICAM-2, oder VAP-1 (Vascular Adhesion Protein bzw. vaskuläres Adhäsionsprotein).
CLEVER-1 hat einige strukturelle Motive, die in anderen Molekülen mit Anhaftungsfunktionen assoziiert sind. Diese inkludieren eine Proteoglycan-Link-Homologieregion, die in CD44 wichtig für die Bindung von Hyaluronan ist. Weiters enthält es zwei RGD-Motive, von denen bekannt ist, dass sie in bestimmten Molekülen, wie zum Beispiel Fibronectin, als Integrinliganden dienen. Zusätzlich besitzt CLEVER-1 sieben fibrilläre Domänen, die auch in einigen anderen Molekülen wie Priostin, Fasciclin, transforming growth factor-β bzw. transformierender Wachstumsfaktor-β-induziertes Gen und big-h3 vorkommen, und in allen diesen Fällen ist dies für die Anhaftungsfunktion dieser Moleküle notwendig. Interessanterweise finden sich auch 22 Wiederholungen des epidermalen Wachstumsfaktors in CLEVER-1. Diese strukturelle Domäne ist auch in allen Mitgliedern der Selectin-Familie vorhanden. Die Lektin-Domänen von Selektinen sind von äußerster Wichtigkeit für die vorübergehende Interaktion mit ihren Sialomucin-Liganden. Ungeachtet dessen wurde berichtet, dass EGF-Wiederholungen zusammen mit Lektindomänen funktionell an der Bindung zwischen Leukozyten und Endothel beteiligt sind. Basierend auf der strukturellen Komplexität von CLEVER-1 könnte es sich herausstellen, dass es mehrere Liganden besitzt und multifunktionell ist.
Es wurde entdeckt, dass CLEVER-1 in den Prozess der Lymphozytenrezirkulation involviert ist. CLEVER-1 findet sich am Endothel des Blutgefäßsystems, speziell an den HEV, und auch am Endothel von sowohl afferenten als auch efferenten Lymphgefäßen. CLEVER-1 ist ein Proteinadhäsionsmolekül und speziell ein Zelladhäsionsmolekül (CAM), das die Bindung bzw. Adhäsion von Lymphozyten und malignen Tumorzellen an CLEVER-1 im Blutgefäßsystem und Lymphsystem vermittelt. Diese Stellen sind als Kontrollstellen der Lymphozytenwanderung von außerordentlicher Bedeutung
CLEVER-1 ist das erste Molekül, das identifiziert wurde, welches den Austritt von Lymphozyten und malignen Zellen aus Lymphknoten unterstützt. Zusätzlich ist CLEVER-1 das erste identifizierte Molekül, das sowohl Ein- als auch Austritt von Lymphozyten und Tumorzellen in die und aus den Lymphknoten reguliert. Außerdem wurde entdeckt, dass CLEVER-1 die Bindung anderer Leukozyten, wie Monozyten und Granulozyten, an HEV-ähnliche Gefäße vermittelt.
Mit „CLEVER-1-vermittelter Zellbindung" wird die spezifische Assoziation von CLEVER-1 mit entweder einem Leukozyten, wie Lymphozyt, Monozyt oder Granulozyt, oder mit CLEVER-1-bindenden malignen Zellen bezeichnet. CLEVER-1-vermittelte Zellbindung kann mit CLEVER-1 in löslicher oder partikulärer Form (zum Beispiel, wenn CLEVER-1 in einer Membran-assoziierten Form vorliegt) erfolgen.
CLEVER-1-vermittelte Bindung von Leukozyten
Laut der Erfindung kann die Bindung von Leukozyten, wie Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten an das Endothel (genauer gesagt an eine oder mehrere endotheliale Zelle(n)) im Blutgefäßsystem, speziell den HEV, und an das Endothel in afferenten und efferenten Lymphgefäßen blockiert werden, indem die Bindung des CLEVER-1 der endothelialen Zelle und eines Leukozyten blockiert wird.
Im Blutgefäßsystem führt die Hemmung oder Verhinderung der Endothelzellen-CLEVER-1-vermittelten Bindung von Lymphozyten, speziell aktivierter Lymphozyten, zur Hemmung oder Verhinderung der Akkumulation selbiger an diesen Stellen. Hierdurch kann die Entzündung an diesen Stellen verhindert oder geschwächt werden. Auf diese Weise liefert die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Entzündung durch die Verabreichung eines Stoffes, der die CLEVER-1-vermittelte Bindung von endothelialen Zellen an Lymphozyten hindert oder unterbindet.
In den afferenten Lymphgefäßen führt eine Hemmung oder Verhinderung der Bindung von Lymphozyten an Endothelzellen-CLEVER-1 zu einer Hemmung oder Verhinderung des Eintritts dieser Lymphozyten in die afferenten Lymphgefäße und weiters in die Lymphknoten. Hierdurch liefert die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Entzündung durch die Verabreichung eines Stoffes, der die CLEVER-1 vermittelte Bindung von endothelialen Zellen an Lymphozyten in den afferenten Lymphgefäßen und speziell bei den HEV in Lymphknoten oder HEV-ähnlichen Venolen an entzündeten Stellen hindert oder unterbindet. Die Erfindung liefert weiters ein Verfahren, um die Wanderung von Lymphozyten in die Lymphknoten zu erschweren. Dies wird erreicht, indem ein Stoff verabreicht wird, der afferent lymphatische CLEVER-1-vermittelte endotheliale Zellbindung, speziell HEV-Bindung, an Lymphozyten und andere Leukozyten erschwert oder verhindert.
In den efferenten Lymphbahnen führt die Be- oder Verhinderung der Bindung von Lymphozyten an CLEVER-1 endothelialer Zellen zu einer Verhinderung des Austritts von Lymphozyten aus dem Lymphknoten und des Eintritts in das Blut. Hierdurch liefert die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Entzündung durch die Verabreichung eines Stoffes, der die CLEVER-1-vermittelte Bindung von endothelialen Zellen an den Lymphozyten in den efferenten Lymphgefäßen erschwert oder verhindert. Die Erfindung liefert weiters ein Verfahren, um die Wanderung von Lymphozyten aus den Lymphknoten zu erschweren oder zu verhindern. Dies wird erreicht, indem ein Stoff verabreicht wird, der efferent lymphatische CLEVER-1 vermittelte Bindung endothelialer Zellen an Lymphozyten erschwert oder verhindert.
Folglich bietet die Bindung von CLEVER-1 mit Lymphozyten einen einzigartigen, dreiseitigen Ansatz zur Behandlung von Krankheiten oder Zuständen, welche durch eine unerwünschte Akkumulation oder Wanderung von Lymphozyten charakterisiert sind. Mit demselben Mittel kann der Fachmann auf sowohl den Eintritt von Lymphozyten in die Lymphknoten, den Austritt von Lymphozyten aus den Lymphknoten als auch die Bindung von Lymphozyten an das Blutgefäßsystem abzielen.
Die Entdeckung von CLEVER-1 und seiner Funktion resultiert folglich in einem neuen Verfahren zur Kontrolle der Migration von Lymphozyten durch die Inhibierung von CLEVER-1-vermittelter Bindung an derartige Zellen. Demzufolge ermöglicht die gegenwärtige Erfindung ein Verfahren zur Inhibierung von unerwünschter CLEVER-1-vermittelter Lymphozytenwanderung. Dadurch wird eine Blockade von schädlicher oder anderweitig unerwünschter Lymphozytenwanderung ermöglicht, indem die Assoziation von CLEVER-1 mit Lymphozyten verhindert wird. Auf ähnliche Art und Weise bietet die Erfindung ein Verfahren zur Inhibierung von unerwünschter CLEVER-1-vermittelter Bindung anderer Leukozyten, indem die Assoziation von CLEVER-1 und Leukozyten verhindert wird.
Die gegenwärtige Erfindung liefert außerdem ein Verfahren zur Stimulation von CLEVER-1-Bindungen, um zum Beispiel in Wirten mit geschwächtem Immunsystem die Wanderung von Lymphozyten, die Bindung anderer Leukozyten und die Funktion der Immunabwehr zu unterstützen.
CLEVER-1 vermittelte Bindung von Zellen an maligne Zellen
Da Krebszellen häufig von malignen Tumoren wegbrechen und in die Lymphgefäße eindringen, wandern Krebszellen in die Lymphknoten und setzen sich dort fest. Gemäß der Erfindung kann die Fähigkeit einer malignen Tumorzelle, sich in einem Lymphknoten festzusetzen, durch Behinderung oder Unterbindung von CLEVER-1-Bindung solcher Zellen behindert oder unterbunden werden.
Der Begriff „Tumor" bezieht sich auf ein Neoplasma, eine Gewebsmasse, die charakteristisch für eine Neoplasie ist. Neoplasie wird durch folgende Punkte von anderen Formen von Gewebewachstum unterschieden: Erstens, durch die Bildung einer Gewebemasse, eines Neoplasmas oder Tumors. Zweitens, Neoplasie wird als irreversibler Prozess betrachtet. Drittens, neoplastisches Gewebe tendiert dazu, seinem Ursprungsgewebe morphologisch zu ähneln. Viertens, neoplastisches Gewebe tendiert dazu, seinem Ursprungsgewebe funktionell zu ähneln. Fünftens, Neoplasmen wachsen und funktionieren einigermaßen unabhängig von den homöostatischen Mechanismen, welche normale/s Gewebewachstum und -funktion kontrollieren.
Ein Neoplasma kann gut- oder bösartig sein. Ein gutartiges Neoplasma besteht aus einer distinkten Gewebsmasse, die fortgesetzt wächst. Ein gutartiges Neoplasma wird bei seinem Wachstum angrenzendes Gewebe einfach beiseite drängen.
Die definierenden Eigenschaften eines bösartigen Neoplasmas, einer Malignität, sind Invasion und Metastasen, also die Verbreitung des Neoplasmas zu einer entfernten Stelle. Ein malignes Neoplasma wachst eher in das angrenzende Gewebe hinein, als es zur Seite zu schieben. Die Begriffe „malignes Neoplasma", „maligner Tumor" und „Krebs" sind Synonyme.
Krebszellen dringen typischerweise in dünnwandige Gefäße, wie zum Beispiel kleine Venen, Venolen, Kapillaren und Lymphgefäße, ein. Krebszellen reisen über die Lymphgeäße in die Lymphknoten und über die Blutbahn in andere Organe und Strukturen, wo sie sich nachfolgend ablagern und wachsen. Dieser Vorgang wird als „Metastasierung" bezeichnet. Die Lymphknoten zum Beispiel sind häufige Stellen, an denen Metastasierung vorkommt.
Krebszellen können auch durch Ausstreuen verbreitet werden, indem sie beispielsweise in die Peritonealflüssigkeit abgetrennt werden. Von der Flüssigkeit werden sie dann zu einem entfernten Ort an der peritonealen Oberfläche getragen, wo sie sich ansiedeln und neue Krebsherde bilden können.
Die meisten Neoplasmen gehören zu einem von vier Typen: epithelial, nicht-epithelial, Blastoma und Teratoma. Bösartige epitheliale Neoplasmen werden als Karzinome bezeichnet. Ein Adenokarzinom ist ein Karzinom, bei dem Drüsen-ähnliche Strukturen vorkommen. Karzinome können papillär oder cystisch sein. Gutartige epitheliale Neoplasmen sind üblicherweise Adenome, Polypen oder Papillome.
Auch nicht-epitheliale Tumore können gut- oder bösartig sein. Sie werden meist mit einem Präfix, das den histologischen Typ beschreibt, und einem Suffix bezeichnet. Das Suffix -om bedeutet normalerweise gutartig, während das Suffix-sarkom meist bösartig bedeutet. Jedoch haben einige bösartige Neoplasmen traditionelle Namen, die auf -om enden: zum Beispiel Melanom, Hepatom und Lymphom.
Lymphome sind bösartige Neoplasmen, die aus Zellen lymphoiden Ursprungs entstehen. Blastome und Teratome bestehen aus mehr als einem Gewebetyp. Bösartige Teratome werden oft als Teratokarzinome bezeichnet.
Eine „Leukämie" ist ein Tumor von weißen Blutzellen im Knochenmark und Blut. Ein „Lymphom" ist ein Tumor weißer Blutzellen, der in Lymphknoten und Geweben lokalisiert ist.
Die CLEVER-1-Bindung maligner Zellen an das Endothel im Blutgefäßsystem, speziell an die HEV, und das Endothel in den afferenten und efferenten Lymphgefäßen kann gehemmt oder unterbunden werden. Dies kann gemäß der Erfindung erreicht werden, indem die CLEVER-1-vermittelte Bindung maligner Zellen an das Endothel gehemmt oder verhindert wird. Auf diese Art bietet die Erfindung ein Verfahren, Krebs zu behandeln; im Besonderen ein Verfahren zur Verhinderung von Metastasierung. Erzielt wird dies durch die Verabreichung eines Stoffes, der die CLEVER-1-vermittelte Bindung maligner Zellen an Endothelien hemmt oder unterbindet.
Gemäß der Erfindung führt die Hemmung oder Verhinderung CLEVER-1 vermittelter Bindung von Zellen im Blutgefäßsystem zur Hemmung oder Verhinderung der Etablierung von CLEVER-1-bindenden malignen Zellen an diesen Stellen und somit zur Verringerung oder Verhinderung der Metastasierung derartiger maligner Zellen. Auf diese Art bietet die Erfindung ein Verfahren, Krebs zu behandeln; im Besonderen ein Verfahren zur Verhinderung der Metastasierung von CLEVER-1-bindenden malignen Zellen. Erzielt wird dies durch die Verabreichung eines Stoffes, der die CLEVER-1-vermittelte Bindung endothelialer Zellen an CLEVER-1-bindende Tumorzellen im Blutgefäßsystem hemmt oder unterbindet. Die Erfindung bietet auch ein Verfahren, Metastasierung zu verhindern, indem ein Stoff verabreicht wird, der die CLEVER-1-vermittelte Bindung endothelialer Zellen an maligne Zellen im Blutgefäßsystem hemmt oder verhindert.
In den afferenten Lymphgefäßen hat die Hemmung oder Unterdrückung der Bindung von CLEVER-1-bindenden malignen Zellen an Endothelzellen-CLEVER-1 folgende Auswirkungen: Derartige CLEVER-1-bindende maligne Zellen können nur erschwert oder gar nicht in den Lymphknoten eindringen und sich dort etablieren. Dadurch wird die Metastasierung solcher Zellen zum Lymphknoten oder in weiterer Folge anderen Stellen im Körper verringert oder verhindert. In diesem Zusammenhang sollte erwähnt werden, dass eine metastasierende maligne Zelle nicht lange ohne Unterstützung durch eine Matrix überleben kann – ein Zustand, der zum Beispiel im Blut vorkommt. Auf diese Art bietet die Erfindung ein Verfahren, Krebs zu behandeln; im Besonderen ein Verfahren zur Verhinderung der Metastasierung von CLEVER-1-bindenden malignen Zellen. Erzielt wird dies durch die Verabreichung eines Stoffes, der die CLEVER-1-ermittelte Bindung endothelialer Zellen an CLEVER-1-bindende maligne Zellen in den afferenten Lymphbahnen und HEV im Blutgefäßsystem hemmt oder unterbindet. Die Erfindung bietet auch ein Verfahren, Metastasierung zu verhindern, indem ein Stoff verabreicht wird, der die afferent lymphatische CLEVER-1-vermittelte Bindung endothelialer Zellen, im Besonderen HEV-Bindung, an derartige maligne Zellen hemmt oder unterbindet.
In den efferenten Lymphgefäßen hat die Hemmung oder Unterdrückung der Bindung von CLEVER-1-bindenden malignen Zellen an Endothelzellen-CLEVER-1 folgende Auswirkungen: Derartige CLEVER-1-bindende maligne Zellen können nur erschwert oder gar nicht aus dem Lymphknoten auswandern. Dadurch wird die Metastasierung solcher Zellen vom Lymphknoten zu anderen Stellen im Körper verringert oder verhindert. Auf diese Art bietet die Erfindung ein Verfahren, Krebs zu behandeln; im Besonderen ein Verfahren zur Verhinderung der Metastasierung von CLEVER-1-bindenden malignen Zellen. Erzielt wird dies durch die Verabreichung eines Stoffes, der die CLEVER-1-vermittelte Bindung endothelialer Zellen an CLEVER-1-bindende maligne Zellen in den efferenten Lymphbahnen behindert oder unterbindet. Die Erfindung bietet auch ein Verfahren, Metastasierung zu verhindern, indem ein Stoff verabreicht wird, der die efferent lymphatische CLEVER-1-vermittelte Bindung endothelialer Zellen an derartige maligne Zellen hemmt oder unterbindet.
CLEVER-1-Wechselwirkung mit CLEVER-1-bindenden malignen Zellen bietet somit einen einzigartigen, 3-fachen Ansatz zur Hemmung oder Verhinderung von Metastasierung. Dabei kann der Fachmann nicht nur den Ein- und Austritt solcher maligner Zellen aus dem Lymphsystem blockieren, sondern auch die Assoziation derartiger maligner Zellen mit CLEVER-1 im Gefäßendothel.
Stoffe, die CLEVER-1-vermittelte Bindung von Zellen hemmen oder unterbinden
Lösliches CLEVER-1 und Antikörper gegen CLEVER-1 können der Wirtszelle zur Verfügung gestellt werden, um CLEVER-1-vermittelte Bindung von Zellen zu blockieren oder inhibieren. Lösliches CLEVER-1 kann verwendet werden, um die CLEVER-1-Bindungsstellen auf Leukozyten, wie zum Beispiel Lymphozyten, Monozyten oder Granulozyten, oder Tumorzellen zu „bedecken". Dadurch wird die bedeckte Zelle daran gehindert, mit nativem CLEVER-1 an HEV oder afferenten bzw. efferenten Lymphgefäßen zu assoziieren.
CLEVER-1-Antikörper können Patienten verabreicht werden, die diese benötigen, um CLEVER-1 zu bedecken. Durch die Bedeckung von CLEVER-1, der am Endothel des Blutgefäßsystems oder der Lymphgefäße, speziell den afferenten Lymphbahnen, eines derartigen Patienten präsent ist, werden Leukozyten und maligne Zellen an der Bindung an diesen CLEVER-1 im Patient gehindert. CLEVER-1-Antikörper produzierende Zellen können dem Patienten direkt verabreicht werden, um eine Quelle für selbige Antikörper bereitzustellen.
Zusätzlich bietet die gegenwärtige Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung eines Stoffes, der die Bindung von CLEVER-1 an Zellen inhibiert. Dies wird ermöglicht, indem Zellen ein Stoff im Beisein von CLEVER-1 bereitgestellt wird und sodann die Bindung von CLE VER-1 an Zellen, die mit dem Stoff versehen wurden, mit der Bindung von CLEVER-1 ohne diesen Stoff verglichen wird. Gleicherweise bietet die Erfindung auch eine Methode zur Identifizierung eines Stoffes, der die Bindung von CLEVER-1 an Zellen stimuliert. Dies wird ermöglicht, indem Zellen ein Stoff im Beisein von CLEVER-1 bereitgestellt wird und sodann die Bindung von CLEVER-1 an Zellen, die mit dem Stoff versehen wurden, mit der Bindung von CLEVER-1 ohne diesen Stoff verglichen wird.
Die Bezeichnung „Antikörper" wird im weitesten Sinn des Wortes verwendet. Speziell beinhaltet der Begriff einzelne monoklonale Antikörper (inklusive agonistische und antagonistische Antikörper), polyklonale Antikörper, sowie Antikörperfragmente und Einzelkettenantikörper (beispielsweise Fab, F(ab')₂, Fv), solange sie nur die erwünschte biologische Aktivität aufweisen.
Verdauung von Antikörpern mit Papain produziert zwei identische Antigen-bindende Fragmente, die als Fab-Fragmente bezeichnet werden. Diese Fragmente besitzen jeweils eine Antigen-bindende Stelle. Weiters wird ein „Fc"-Fragment gebildet, dessen Name seine Fähigkeit zur leichten Kristallisation reflektiert. Behandlung mit Pepsin führt zu einem F(ab')₂-Fragment, das zwei Antigen-bindende Stellen besitzt und damit immer noch Antigene quervernetzen kann.
Einzelkettiges „Fv" ist das kleinste Antikörperfragment, das noch eine komplette Antigenerkennungsstelle und Antigenbindungsstelle besitzt. Diese Region besteht aus einem Dimer einer variablen Domäne, einer leichten und einer schweren Kette in enger nicht-kovalenter Assoziation. Es ist diese Konfiguration, in der die 3 CDRs jeder variablen Domäne interagieren, um so eine Antigenbindungsstelle an der Oberfläche des V_H-V_L-Dimers zu definieren. Gemeinsam verleihen die sechs CDRs dem Antikörper die Spezifität der Antigenbindung. Jedoch hat schon eine einzelkettige variable Domäne (oder ein halbes Fv, das nur drei für ein Antigen spezifischer CDRs umfasst), die Fähigkeit, ein Antigen zu erkennen und zu binden. Die Affinität ist jedoch geringer als die einer kompletten Bindungsstelle. Siehe Ladner et al., U.S. Patent Nr. 4,946,778 , und Bird, R.E. et al., Science, 242: 423–426 (1988).
Der Begriff "monoklonaler Antikörper", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf einen Antikörper, der aus einer, im Wesentlichen homogenen, Population von Antikörpern gewonnen wurde. Dies bedeutet, dass die individuellen Antikörper, aus denen sich die Population zusammensetzt, identisch sind, abgesehen von natürlich auftretenden Mutationen, die in kleinen Mengen vorkommen können. Da monoklonale Antikörper gegen eine einzige Antigenstruktur gerichtet sind, sind sie hochspezifisch. Konventionelle (polyklonale) Antikörperpräparationen beinhalten typischerweise verschiedene Antikörper, die auch gegen verschiedene Determinanten (Epitope) gerichtet sind. Im Gegensatz dazu ist darüber hinaus jeder monoklonale Antikörper gegen eine einzige Determinante auf dem Antigen gerichtet. Zusätzlich zu ihrer Spezifität sind monoklonale Antikörper auch vorteilhaft, da sie von einer Hybridomkultur produziert werden, die nicht durch andere Immunglobuline kontaminiert ist. Der Zusatz „monoklonal" bezeichnet den Charakter des Antikörpers als von einer im Wesentlichen homogenen Population von Antikörpern erhalten. Er darf nicht als Aufforderung zur Produktion des Antikörpers durch eine bestimmte Methode ausgelegt werden. Zum Beispiel können die monoklonalen Antikörper, die in Übereinstimmung mit der gegenwärtigen Erfindung verwendet werden sollen, durch die Hybridom-Methode, zuerst beschrieben durch Kohler und Milstein, Nature 256: 495 (1975), oder durch rekombinante DNA-Methoden (z.B. Cabilly et al., U.S. Patent Nr. 4,816,567 ) hergestellt werden.
Herstellung von immunisierendem Antigen und Herstellung polyklonaler oder monoklonaler Antikörper können entweder wie hierin beschrieben durchgeführt werden, oder durch andere passende Methoden. Eine Vielzahl von Methoden wurde beschrieben (siehe z.B. Kohler et al., Nature 256: 495–497 (1975) und Eur. J. Immunol. 6: 511–519 (1976); Milstein et al., Nature 266: 550–552 (1977); Koprowski et al., U.S. Patent Nr. 4,172,124 ; Harlow, E. und D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N.Y. 1988); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Bd. 2 (Ergänzung 27, 1994), Ausubel, F.M. et al., John Wiley & Sons, Hrsg., New York, N.Y., Kapitel 11, (1991)). Generell kann ein Hybridom durch die Fusion einer geeigneten unsterblichen Zelllinie (z.B. eine Myelom-Zelllinie wie SP2/0) mit Antikörper produzierenden Zellen hergestellt werden. Die Antikörper produzierenden Zellen, vorzugsweise jene der Milz oder Lymphknoten, erhält man von Tieren, die mit dem Ziel-Antigen immunisiert wurden. Die fusionierten Zellen (Hybridome) können mittels selektiver Kulturbedingungen isoliert werden und durch limitierende Verdünnung kloniert werden. Zellen, welche Antikörper mit den gewünschten Bindungseigenschaften produzieren, können mit Hilfe geeigneter Versuche (z. B. ELISA) selektiert werden.
Der Begriff „Antikörper" inkludiert auch chimäre, humanisierte oder primatisierte (CDR-grafted) Antikörper und auch chimäre, oder CDR-grafted einzelkettige Antikörper und dergleichen, die von unterschiedlichen Spezies abstammende Teile umfassen. „Chimäre" Antikörper (Immunglobuline) besitzen einen Teil der schweren und/oder leichten Kette, der identisch mit oder homolog zu entsprechenden Sequenzen in Antikörpern ist, die von einer bestimmten Spezies abstammen oder zu einer bestimmten Antikörperklasse oder -subklasse gehören. Der Rest der Kette(n) ist hingegen identisch mit oder homolog zu entsprechenden Sequenzen in Antikörpern, die von einer anderen Spezies abstammen oder zu einer anderen Antikörperklasse oder -subklasse gehören. Auch Fragmente solcher Antikörper zählen dazu, solange sie nur die erwünschte biologische Aktivität aufweisen (Cabilly et al., U.S. Patent Nr. 4,816,567 ; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851–6855 (1984)). Die verschiedenen Teile solcher Antikörper können miteinander chemisch durch konventionelle Methoden verbunden oder unter Benutzung von Gentechnik als zusammenhängendes Protein produziert werden. Zum Beispiel können Nucleinsäuren, die eine chimäre oder humanisierte Kette kodieren, exprimiert werden, um ein zusammenhängendes Protein zu produzieren. Sehe z.B. Cabilly et al., U.S. Patent Nr. 4,816,567 ; Cabilly et al., EP 0 125 0 23 B1 ; Boss et al., U.S. Patent Nr. 4,816,397 ; Boss et al., EP 0120694 B1 ; Neuberger, M.S. et al., WO 86/01533 ; Neuberger M.S. et al., EP 0194276 B1 ; Winter, U.S. Patent Nr. 5,225,539 ; Winter, EP 0239400 B1 ; und Queen et al., U.S. Patent Nrn. 5,585,089 , 5,698,761 und 5,698,762 . Siehe auch Newman, R. et al., Bio-Technology 10: 1455–1460 (1992), bezüglich primatisierter Antikörper.
Mit „agonistischem Antikörper" werden Antikörper bezeichnet, die an CLEVER-1 binden können und die Adhäsion von Lymphozyten (und malignen Tumorzellen) an das Endothel unterstützen können. Mit „antagonistischem Antikörper" sind Antikörper gemeint, die an CLEVER-1 binden können und die Adhäsion von Lymphozyten (und malignen Tumorzellen) an das Endothel behindern.
Anti-idiotypische Antikörper sind auch bereitgestellt. Anti-idiotypische Antikörper erkennen antigene Determinanten, die mit der Antigenbindungsstelle eines anderen Antikörpers assoziiert sind. Anti-idiotypische Antikörper können gegen zweite Antikörper hergestellt werden, indem ein Tier derselben Spezies immunisiert wird. Vorzugsweise sollte das Tier von demselben Stamm sein, wie das Tier, das zur Produktion des zweiten Antikörpers verwendet wurde. Siehe z.B. U.S. Patent Nr. 4,699,880 .
In-Vitro-Adhäsionstest und diagnostische Verwendung desselben
In einer weiteren Ausführungsform zielt die gegenwärtige Erfindung auf einen Bindungstest bzw. Adhäsionstest ab. Dabei wird CLEVER-1 Bindung verwendet, um auf das Vorkommen von Leukozyten oder malignen Zellen zu testen, die an das Endothel von HEV und Lymphgefäßen binden. Sowohl statische als auch nicht-statische Tests sind möglich. Der Bindungstest wird in Beispiel 4 beispielhaft erläutert. Sowohl statische als auch nicht-statische Tests können verwendet werden, um die Bindung von Leukozyten an das Blutgefäßsystem zu untersuchen.
Im statischen Versuch wird ein Gewebeschnitt für eine gewünschte Zeitspanne Leukozyten oder malignen Zellen ausgesetzt ohne dabei das Präparat während der Exposition kontinuierlich zu bewegen oder zu rotieren. Statische Versuche werden bevorzugt, um die Fähigkeit von Leukozyten und malignen Zellen zu untersuchen, an lymphatisches Endothel, speziell efferente Lymphgefäße, zu binden.
Im nicht-statischen Test werden die CLEVER-1-enthaltende Gewebeprobe und Leukozyten während der Zeitspanne, in der die Leukozyten an CLEVER-1 binden, konstant rotiert. Nicht-statische Versuche werden bevorzugt, um die Bindung von Leukozyten und malignen Zellen an CLEVER-1 in HEV zu untersuchen. Der nicht-statische Versuch imitiert Bindung an das Blutgefäßsystem.
In einer anderen Ausführungsform bezieht sich die gegenwärtige Erfindung auf ein Verfahren zur Detektion maligner Tumorzellen. Wie in Beispiel 1 in detaillierter Form erklärt wird, reduzieren CLEVER-1-Antikörper die Bindung maligner Tumorzellen an das vaskuläre und lymphoides Endothel und demonstrieren damit, dass CLEVER-1 ein Rezeptor für derartige maligne Tumorzellen ist. Folgende Stoffe können in quantitativen und qualitativen Tests zur Detektion des Vorhandenseins von malignen Tumorzellen in einer Probe, wobei die Probe Gewebe oder Blut von Mensch oder Tier ist, verwendet werden: CLEVER-1-Protein oder Fragmente davon oder CLEVER-1-bindende Komponenten, inklusive, jedoch nicht beschränkt auf monoklonale und polyklonale Antikörper gegen CLEVER-1, Antikörper, sowohl monoklonal als auch polyklonal, gegen antigene Fragmente von CLEVER-1, antigene Polypeptide, Inhibitoren und Wirkstoffe mit kleiner Molekülgröße.
CLEVER-1-Protein oder Fragmente desselben oder die oben erwähnten CLEVER-1-Bindungsverbindungen können an eine feste Trägermatrix gebunden werden. Matrices inkludieren, sind jedoch nicht limitiert auf, Mikrotiterplatten, Agarosesäulen oder magnetische Kugeln. Die oben erwähnte Probe kann der festen Trägermatrix ausgesetzt werden und die Prozentzahl der durch die Matrix zurückgehaltenen Zellen bestimmt werden. Zum Beispiel: Eine Probe eines normalen, gesunden Individuums, wobei das Individuum entweder Mensch oder Tier sein kann, hätte eine statisch vorhergesagte Anzahl an Leukozyten, die an CLEVER-1 binden. Eine Probe, die sowohl Leukozyten, als auch maligne Zellen enthält, hätte eine detektierbar höhere Anzahl an CLEVER-1-bindenden Zellen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Blut- oder Gewebeprobe als Quelle der CLEVER-1-bindenden Zellen im In-vitro-Adhäsionsversuch verwendet, die von einem behandlungsbedürftigen Patienten, speziell behandlungsbedürftig für Krebs, stammt. Mögliche Patien ten sind Patienten, die auf Grund einer vorhergehend diagnostizierten Malignität behandelt werden, oder Patienten, die im Verdacht stehen, einen bösartigen Tumor zu haben, oder aber Patienten, die von einem bösartigen Tumor geheilt zu sein scheinen, wegen möglichem Wiederauftauchen desselben aber Überwachung benötigen. Vorzugsweise stammt eine derartige Blut- oder Gewebeprobe von einem Patienten, der auf das Vorkommen von malignen Zellen, die an CLEVER-1 in der Probe binden, untersucht werden soll.
Die im In-vitro-Versuch der Erfindung zu untersuchende Blut- oder Gewebeprobe kann, wenn gewünscht, mit Hilfe von dem Fachmann bekannten Methoden verarbeitet werden. Dazu können CLEVER-1 bindende Zellen die möglicherweise in der Probe vorhanden sind, vor Verwendung der Probe im In-vitro-Versuch der Erfindung weiter extrahiert oder konzentriert werden.
Sobald der In-vitro-Bindungstest abgeschlossen ist, können weiterhin die anhaftenden Zellen mit Hilfe anderer Methoden untersucht werden. Im statischen Versuch zum Beispiel, bei dem die gebundenen Zellen fixiert wurden, können die gebundenen Zellen auf die Eignung, durch einen monoklonalen Antikörper erkannt zu erden, der für den Tumortyp diagnostisch ist, untersucht werden.
Die Detektion der Bindung von malignen Zellen an CLEVER-1-enthaltendes lymphatisches Endothel indiziert eine Notwendigkeit zur Behandlung des Patienten gegen derartige maligne Zellen, speziell um eine Metastase derartiger maligner Zellen zu verhindern.
Die gegenwärtige Erfindung liefert für diesen Aspekt einen neuen, effizienten und praktischen Test zur Identifizierung von Antagonisten. Diese Antagonisten inkludieren, sind jedoch nicht limitiert auf, monoklonale und polyklonale Antikörper, Peptide, Proteinfragmente, kleine inhibitorische Moleküle, Medikamente bzw. Wirkstoffe und andere Stoffe, welche die Bindung von Leukozyten und malignen Zellen an vaskuläres und lymphatisches Endothel inhibieren können.
Beispielsweise können CLEVER-1-enthaltende Proben von Lymphknotenschnitten mit oder ohne den Stoff inkubiert und die Zahl der gebundenen Lymphozyten und/oder malignen Zellen bestimmt werden. Die Antagonisten können vorher mit dem Lymphknotenschnitten präinkubiert werden (ein nicht-kompetitiver Test) oder zugleich mit Lymphozyten zu den Lymphknotenschnitten gegeben werden (ein kompetitiver Test).
Ein solcher Versuch kann auch dazu verwendet werden, um eine Anti-Metastasierungs-Behandlung individuell an einen Patienten anzupassen. Dadurch erlaubt er dem Anwender bzw. Arzt jene Stoffe, oder Kombinationen davon, zu identifizieren und auszuwählen, die die CLE VER-1-Bindung maligner Zellen an vaskuläres und/oder lymphatisches Endothel bei einem solchen Patienten am effizientesten inhibieren. Damit wird der Nutzen der Behandlung für einen derartigen Patienten mit solchen Stoffen maximiert.
Zusätzlich erlauben solche In-vitro-Tests dem Anwender auf Stoffe mit positiver Auswirkung auf die Zerstörung maligner Zellen zu selektieren: jedoch minimieren CLEVER-1-enthaltende endotheliale Interaktionen, wo möglich, den Effekt einer solchen Behandlung auf CLEVER-1-vermittelte Bindung von Leukozyten.
Ein Antagonist kann die Migration von Lymphozyten oder malignen Zellen in oder aus Lymphknoten hemmen. In einer bevorzugten Ausführungsform würden Antagonisten sowohl Eintritt als auch Austritt einer unerwünschten Zelle in beziehungsweise aus Lymphknoten inhibieren. Als solche würden maligne Tumorzellen bevorzugt am Eindringen und Festsetzen in einem Lymphknoten gehindert werden. Jede maligne Tumorzelle, die die Lymphknoten mit Hilfe eines von afferenten Lymphgefäßen unabhängigen Mechanismus betreten würde, würde zurückgehalten werden und die Metastasierung somit verlangsamt werden.
In weiterer Folge kann dieser Test verwendet werden, um die Effizienz von Chemotherapien, verabreicht an Individuen, die einer solchen Behandlung bedürfen, wobei besagtes Individuum sowohl Mensch als auch Tier sein kann, zu kontrollieren. Proben können vor, während und nach der Chemotherapie auf Vorkommen von CLEVER-1-bindenden malignen Tumorzellen, antigenen Fragmenten davon oder CLEVER-1-bindenden Verbindungen untersucht werden.
In einer weiteren Ausführungsform können gereinigtes CLEVER-1-Protein oder Fragmente davon für Testen im großen Maßstab auf Antagonisten mit der Fähigkeit, die Bindung von Leukozyten oder malignen Zellen an Endothelzellen-CLEVER-1 zu vermindern oder zu unterbinden, verwendet werden. CLEVER-1-Protein oder Fragmente davon können mit Hilfe von dem Fachmann bekannten Standardmethoden an eine feste Trägermatrix gebunden werden. Matrices inkludieren, sind jedoch nicht limitiert auf, Mikrotiterplatten, Agarosesäulen oder magnetische Kugeln. Antagonisten können sowohl in An- als auch in Abwesenheit von Leukozyten auf Interaktionen mit CLEVER-1 oder Fragmenten desselben getestet werden. Leukozyten oder maligne Zellen können mit fluoreszierenden Farbstoffen wie zum Beispiel Biscarboxyethylcarboxyfluorescein oder Fluoresceinisothiocyanat markiert werden und die Zahl gebundener Zellen kann in An- oder Abwesenheit der Antagonisten mit Hilfe eines Fluoroimagers analysiert werden.
Die Tests im großen Maßstab dieses Aspekts der Erfindung können verwendet werden, um kombinatorische Datenbanken auf Moleküle zu untersuchen, welche die Bindung von Leu kozyten oder malignen Tumorzellen an CLEVER-1 oder Fragmente desselben inhibieren. Jene Antagonisten, welche eine hohe Affinität für gereinigtes CLEVER-1 aufweisen, können nachfolgend mit Hilfe des oben beschriebenen In-vitro-Bindungsversuches weiter getestet werden.
Antikörper, die in den Verfahren der Erfindung als CLEVER-1-bindende Verbindungen verwendet werden, sind vorzugsweise Antikörper mit einer Spezifität für CLEVER-1 oder ein antigenes Fragment desselben. Solche Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein.
Ein anderer potentieller CLEVER-1-Antagonist sind Peptidderivats des CLEVER-1-Polypeptides, die natürlich oder künstlich modifizierte Analoge des Polypeptides sind, welche ihre biologische Funktion verloren haben, den Liganden des Polypeptides jedoch noch immer erkennen und binden. Dadurch blockieren sie effektiv die Interaktion des besagten Liganden mit CLEVER-1. Beispiele von Peptidderivaten inkludieren, sind jedoch nicht limitiert auf, kleine Peptide oder Peptid-ähnliche Moleküle.
Ein weiterer potentieller menschlicher CLEVER-1-Antagonist ist ein Peptidderivat der Liganden-Polypeptide, die natürlich oder künstlich modifizierte Analoge des Polypeptides sind, welche ihre biologische Funktion verloren haben, CLEVER-1 jedoch noch immer erkennen und binden und CLEVER-1 somit effektiv blockieren. Beispiele von Peptidderivaten inkludieren, sind jedoch nicht limitiert auf, kleine Peptide oder Peptid-ähnliche Moleküle.
Die gegenwärtige Erfindung bezieht sich auf ein diagnostisches Verfahren zum Nachweis bzw. zur Detektion von Zellen, die CLEVER-1 enthalten, das heißt CLEVER-1 positive Zellen, in Proben von menschlichen oder tierischen Körpern. Ein derartiges Verfahren würde die Verwendung von CLEVER-1-bindenden Verbindungen einschließen. Jene CLEVER-1-bindenden Verbindungen inkludieren, sind jedoch nicht limitiert auf, monoklonale und polyklonale Antikörper mit einer Spezifität für CLEVER-1. Um einen schnellen und einfachen Nachweis der Bindung der Verbindung an CLEVER-1 exprimierende Zellen zu gewährleisten, können die Verbindungen mit Substanzen wie kolometrischen Farbstoffen oder radioaktiven Molekülen markiert werden.
Therapeutische Verwendungen von CLEVER-1 Antagonisten
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die gegenwärtige Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von malignen Karzinomen. Karzinome metastasieren normalerweise zuerst in die regionalen Lymphknoten (Sleeman, J.P., Recent Results Cancer Res. 157: 55–81 (2000)). Wie hier beschrieben, ist CLEVER-1 beim Ein- und Austritt von malignen Zellen in die bzw. aus den Lymphknoten involviert. Als solche sind Antagonisten, wie monoklonale oder polyklonale Antikörper und Peptide, die die Bindung maligner Tumorzellen an CLEVER-1 inhibieren, in der Lage Metastasierung zu vermindern und als effektive chemotherapeutische Stoffe zu dienen.
In einem anderen Aspekt betrifft die gegenwärtige Erfindung ein Verfahren, um Funktionsstörungen zu behandeln, bei denen die Bindungsreaktion von Leukozyt an endotheliale Zelle mit akut oder chronisch entzündlichen Krankheiten wie zum Beispiel Diabetes, Erkrankungen des Bindegewebes (wie Lupus, rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis), obstruktive und restriktive Erkrankungen der Lunge (wie Asthma, ARDS, Sarkoidose, idiopathische Lungenfibrose), entzündliche Darmerkrankungen (wie Colitis ulcerosa, Morbus Crohn), verschiedene Nephritisarten, nicht-virale Hepatitis, Zirrhose, Cholangitis, Arteriosklerose, Gefäßentzündung, Schilddrüsenentzündung, multiple Sklerose, Myositis, ischämische Reperfusionsverletzungen und Abstoßung von Transplantaten assoziiert ist.
Die Antagonisten können auch verwendet werden, um Histamin-vermittelte allergische Reaktionen und immunologische Funktionsstörungen, inklusive allergische Reaktionen der späten Phase, chronische Urtikaria und atopische Dermatitis, zu behandeln. IgE-vermittelte allergische Reaktionen wie allergisches Asthma, Rhinitis und Ekzeme können ebenfalls behandelt werden.
Die Antagonisten können auch verwendet werden, um chronische und akute Entzündungen zu behandeln, indem die Auswanderung von Leukozyten zu einem verwundeten Gebiet verhindert wird. Sie können weiters dazu verwendet werden, um normale, pulmonale Makrophagenpopulationen zu regulieren, da chronische und akute entzündliche pulmonale Erkrankungen mit der Sequestration der mononukleären Phagozyten in der Lunge assoziiert sind.
Antagonisten können auch verwendet werden, um rheumatoide Arthritis zu behandeln, indem die Auswanderung von Leukozyten in die Gelenksflüssigkeit in den Gelenken von Patienten verhindert wird. Der Zufluss und die Aktivierung von Monozyten spielt eine wichtige Rolle bei der Pathogenese von sowohl degenerativen als auch entzündlichen Gelenkserkrankungen.
Die Antagonisten können auch zur Behandlung von Asthma und Allergie verwendet werden, indem eine Ansammlung von Eosinophilen in der Lunge verhindert wird. Die Antagonisten können weiters zur Behandlung von Fibrose der subepithelialen Basalmembran, die ein markantes Merkmal asthmatischer Lungen ist, verwendet werden.
Die Antagonisten können auch verwendet werden, um Arteriosklerose zu behandeln, indem das Eindringen von Monozyten in die Arterienwand verhindert wird.
Die Antagonisten können auch in Verbindung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger verwendet werden, z.B. wie hier folgend beschrieben wird.
Formulierungen der Verbindungen
Die CLEVER-1-Antagonisten können als therapeutische Zusammensetzungen verwendet werden. Die CLEVER-1-Antagonisten können entweder als einzelne Dosis oder in mehrfachen Dosen verabreicht werden. Die Antagonisten der gegenwärtigen Erfindung können entweder als unabhängiges therapeutisches System verabreicht werden oder aber in Verbindung mit anderen therapeutischen Stoffen. Die Antagonisten können mit konventionellen Therapien kombiniert werden, welche gleichzeitig oder aufeinanderfolgend verabreicht werden können.
Solche therapeutischen Zusammensetzungen können aus dem CLEVER-1-Antagonisten allein bestehen, vorzugsweise beinhalten die Zusammensetzungen jedoch den Antagonisten zu CLEVER-1 in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger/Vehikel als Beimischung. Passende Vehikel und ihre Formulierung, inklusive anderer humaner Proteine, wie z.B. humanes Serumalbumin, werden beispielsweise in Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, Alfonso, 20. Aufl. (2000) beschrieben. Um eine pharmazeutisch akzeptable Zusammensetzung zu formen, welche sodann Patienten, die sie benötigen, effektiv verabreicht werden kann, werden diese Zusammensetzungen eine effektive Menge des CLEVER-1-Antagonisten zusammen mit einer passenden Menge des Trägervehikels enthalten.
Verbindungen, die Antagonisten von CLEVER-1 enthalten, können oral, intravenös, intramuskulär oder subkutan in der passenden Dosierung verabreicht werden. Die angemessene Dosierung hängt von der Schwere des Zustandes des Patienten und von Kriterien wie Größe, Gewicht, Geschlecht, Alter und medizinische Vorgeschichte des Patienten ab. Die Dosis hängt weiters davon ab, ob die Verbindung der Erfindung einem Menschen oder in einer veterinären Situation einem Tier verabreicht wird, welche derselben bedürfen.
Zum Zwecke der parenteralen Administration werden Antagonisten gegen CLEVER-1 enthaltende Zusammensetzungen vorzugsweise in destilliertem Wasser aufgelöst und der pH-Wert wird vorzugsweise auf 6 bis 8 eingestellt. Um den Prozess der Lyophilisation, welcher in einem passenden Produkt resultiert, zu vereinfachen, kann der Lösung Lactose beigemengt werden. Vorzugsweise wird die Lösung dann sterilfiltriert, in Phiolen abgefüllt und lyophilisiert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Verbindung der Erfindung dem Patienten oral während der Zeit des Essens oder kurz danach verabreicht. Die Konzentration des Antagonisten gegen CLEVER-1 in diesen Verbindungen kann, ob oral oder parenteral, von 10^–12 M bis 10^–3 M variieren.
Zusätzliche pharmazeutische Methoden können angewandt werden, um die Dauer der Wirkung zu kontrollieren. Präparationen zur gesteuerten Freisetzung können durch die Verwendung von Polymeren zur Komplexierung oder Adsorption der Antagonisten gegen CLEVER-1 erreicht werden. Die kontrollierte Abgabe kann durch Selektion von geeigneten Makromolekülen (zum Beispiel, Polyester, Polyaminosäuren, Polyvinylpyrrolidon, Ethylenvinylacetat, Methylcellulose, Carboxymethylcellulose und Protaminsulfat) und der Konzentration derselben, sowie der Methoden der Aufnahme, um die Freisetzung zu kontrollieren, durchgeführt werden. Eine andere mögliche Methode zur Kontrolle der Dauer der Wirkung durch Präparationen zur kontrollierten Freisetzung ist der Einbau von Antagonisten gegen CLEVER-1 in Partikel aus polymerem Material wie Polyester, Polyaminosäuren, Hydrogele, Poly(milchsäure) oder Ethylenvinylacetat-Copolymere. Alternativ zum Einbau der Antagonisten gegen CLEVER-1 in diese polymeren Partikel, können diese Derivate in Mikrokapseln eingeschlossen werden. Diese Mikrokapseln können beispielsweise durch Koazervationstechniken oder Grenzflächen-Polymerisierung, z.B. Hydroxymethylcellulose- oder Gelatine-Mikrokapseln bzw. Poly(methylmethacrylat)-Mikrokapseln, hergestellt werden. Weitere Einschlussmethoden des Antagonisten in kolloidalen Medikamentenzuführungssystemen sind beispielsweise Liposomen, Albumin-Mikrosphären, Mikroemulsionen, Nanopartikel und Nanokapseln oder Makroemulsionen. Derartige Lehren werden in Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, Alfonso, 20. Aufl. (2000) offenbart.
Das folgende Beispiel dient ausschließlich zur Illustration der Erfindung und darf nicht als in irgendeiner Weise die Erfindung limitierend ausgelegt werden.
BEISPIEL 1
Produktion monoklonaler Antikörper
Balb/c Mäuse wurden 4-mal in einwöchigen Abständen mit einer Suspension, enthaltend unvollständiges Freund's Adjuvans, hergestellt aus Lymphgefäßen, die aus menschlichen Lymphknoten unter einem Stereomikroskop herausgeschnitten worden waren, über die Pfote immunisiert. Die Suspension wurde hergestellt, indem die Gefäße mit Scheren in kleine Stücke geschnitten wurden und sodann in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung wiederholt durch eine 21 q Nadel in eine Spritze aufgezogen und wieder ausgespritzt wurden. Lymphozyten aus poplitealen Lymphknoten von den immunisierten Mäusen wurden mit einem Glashomogenisator isoliert. Die Lymphozyten der poplitealen Lymphknoten der immunisierten Mäuse wurden mit Sp2/0-Myelomzellen fusioniert. Hybridom-Überstände wurden primär auf gefrorenen Schnitten von menschlichen Lymphknoten mittels Immunoperoxidasefarbung getestet. Die Testbedingungen waren dieselben für die Antikörper 3–266 und 3–372, produziert von zwei der Hybridome.
Immunoperoxidasefärbungen wurden wie beschrieben (Salmi, Science 257: 1407–1409 (1992)) durchgeführt. In Kürze, Aceton-fixierte 6 μm dicke gefrorene Schnitte von unterschiedlichen menschlichen Geweben (Lymphknoten, Appendix, Bronchie, Zerebellum, Nebenhoden, Speiseröhre, Herz, Dickdarm und Dünndarm, Niere, Leber, Lunge, normale und psoriatische Haut, Synovium, Hoden und Tonsillen) wurden mit den Antikörpern 3–266, 3–372 oder 3G6, ein der Klasse angepasster negativer Kontrollantikörper für 3–266 und 3–372 (Maus-IgG1), gefärbt und 3,3-Diaminobenzidin wurde als Substrat verwendet. Die Vorgangsweisen zur Sammlung der Gewebe wurden von den Lokalen und Nationalen Behörden für gerichtsmedizinische Angelegenheiten in Finnland genehmigt.
Zwei der Hybridome produzierten Antikörper (3–266 (DSM ACC2519) und 3–372 (DSM ACC2590)), welche eindeutig lymphatisches Endothel in afferenten und efferenten Lymphsystemen und vaskulärem Endothel an HEV anfärbten, während andere Strukturen ungefärbt verblieben. Die Färbung des lymphatischen Endothels wird in 1 dargestellt. 1 ist eine indirekte Immunoperoxidasefärbung, die zeigt, dass die monoklonalen Antikörper 3–266 und 3–372 Endothel sowohl in afferenten als auch efferenten Lymphsystemen und auch in HEV erkennen. Die 1a–1c stammen von der Haut. Die 1d–1i sind von einem Lymphknoten. 1a, 1d und 1g zeigen die Färbung mit monoklonalem Antikörper 3–266, 1b, 1e und 1h zeigen die Färbung mit monoklonalem Antikörper 3–372 und 1c, 1f und 1i zeigen die Färbung mit dem negativen Kontrollantikörper 3G6. In den 1a, 1b und 1c weisen die Pfeile auf das Epithel und die Pfeilspitzen auf afferente Lymphbahnen. In den 1d und 1e zeigen die Pfeile auf Lymphgefäße (lymphatische Sinusoide, die zum efferenten Lymphsystem gehören) im Lymphknoten. In den 1g und 1h weisen die Pfeile auf HEV.
BEISPIEL 2
Bestimmung des Molekulargewichts von CLEVER-1
Die Bestimmung des Molekulargewichts wurde mittels Immunoblotting ausgeführt. 1% NP-40-Lysate, enthaltend menschliche Lymphknoten, wurden mit Hilfe einer 5–12,5% Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) analysiert. SDS-PAGE wurde unter nicht-reduzierenden Bedingungen durchgeführt. Die Moleküle im Gel wurden über Nacht auf Nitrocelluloseblätter bzw. -folien geblottet und mit 3–266, 3–372 oder einem negativen Kontrollantikörper (3G6) getestet (Salmi, M. et al., J. Exp. Med. 183: 569–579 (1996)). Peroxidasegekoppelte Kaninchen-anti-Maus-Ig wurden als Reagens der zweiten Stufe verwendet. Der Nachweis wurde mit Hilfe eines verbesserten chemilumineszenten Systems entsprechend den Instruktionen des Produzenten (Amersham) durchgeführt.
Beide Antikörper erkannten ein Molekül derselben Größe (circa 270–300 kDa; 2). Auf Grund dessen und eines identischen Färbemusters wurde angenommen, dass diese Antikörper dasselbe Antigen erkennen und dieses Antigen wurde als CLEVER-1 bezeichnet.
BEISPIEL 3
Reinigung und molekulare Charakterisierung von CLEVER-1
Das Molekül, das vom Antikörper 3–372 erkannt wurde, wurde über Nacht aus humanem Lymphknotenlysat (Lysepuffer: 150 mM NaCl, 10 mM Tris-Base, pH 7,2, 1,5 mM MgCl₂, 1% NP-40, 1% Aprotinin und 1 mM PMSF), wie in Smith D.J. et al., J. Exp. Med. 188: 17–27 (1998) beschrieben, gereinigt. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand des Lysats aufeinander folgend auf Immunoaffinitätssäulen aufgetragen, die CnBr-aktivierte Sepharosekugeln, beladen mit irrelevanten mAbs und 3–372 (3 mg/ml Kugeln), enthielten. Nach Waschen mit dem Lysepuffer wurden die Antigene, die von 3–372 erkannt wurden, mit 50 mM Triethylamine eluiert, gefroren und darauffolgend lyophilisiert. Das eluierte Material wurde dann SDS-PAGE-Analyse und Silberfärbung unterzogen (O'Connell, K.L. und Stults, J.T., Electrophoresis 18: 349–359 (1997)). Die spezifische Bande wurde ausgeschnitten, reduziert, alkyliert und mit Trypsin (Promega) über Nacht bei +37°C verdaut, wie beschrieben (Shevchenko, A. et al., Anal. Chem. 68: 850–855 (1996); O'Connell, K.L. und Stults, J.T., Electrophoresis 18: 349–359 (1997)). Die Peptide wurden unter Verwendung eines PerSeptive BioSystems Voyager DE-PRO Massenspektrometers, betrieben im Reflektron/verzögerte Extraktion-Modus, analysiert. Kalibrierung des Spektrums wurde intern mittels Autolyseprodukten von Trypsin oder mit beigefügter Kalibrierungsmixtur 2 (PerSeptive BioSystems) durchgeführt. Datenbanksuche wurde mit dem MS-Fit-Algorithmus (http://prospector.ucsf.edu/_ucsfhtm13.2/msfit.htm) der Universität von Kalifornien, San Francisco, Massenspektrometrie-Einrichtung durchgeführt.
Nach Spaltung mit Trypsin erbrachte die Analyse mittels Massenspektrometrie 27 Peptide. 21 (77%) davon hatten identische Nucleotidsequenzen mit zwei Genbank-Einträgen: AJ 275213, eine Einreichung bzw. ein Eintrag für einen cDNA-Klon, genannt Stabilin-1, und D87433, ein cDNA-Klon KIAA0246, isoliert aus der Zelllinie KG-1. Die Peptidsequenzen deckten insgesamt 268 Aminosäuren ab (10% der 2570 Aminosäuren von Stabilin-1) und erstreckten sich über Aminosäuren zwischen 53 und 2301.
Als Nächstes wurden Primer basierend auf der Peptidsequenz konstruiert, das 5' Ende der cDNA für Stabilin-1 und das 3' Ende der cDNA von KIAA0246. Diese Primer wurden be nutzt um mehrere RT-PCR-Fragmente zu produzieren, die dann zusammenligiert wurden, um die cDNA mit der vollen Länge von 7879 bp (SEQ ID NO:1) zu klonieren. Sequenzierung des gesamten Konstrukts zeigte eine starke Homologie mit der existierenden 3'-Ende-KIAA0246-Sequenz, die in der Datenbank abrufbar war. Verglichen mit der Stabilinsequenz, enthielt es jedoch 4 unterschiedliche Nucleotide. Alle diese Nucleotide führen zu einer Änderung auf der Aminosäureebene. Zwei dieser Änderungen sind identisch mit den genomischen Sequenzdaten, die vom HUGO-Projekt (AC 006208) abrufbar sind. Da aber der genomische Klon nur etwa die Hälfte des Gens für diese cDNA abdeckt, muss die Art der restlichen zwei Änderungen erst noch bestimmt werden.
Sequenzierung mehrerer unterschiedlicher CLEVER-1-cDNA-Klone legte auch die Existenz von mindestens zwei alternativ gespleißten Isoformen des Moleküls offen: die Regionen abgedeckt durch Exons 23 (Nucleotide 2377–2562) und 27 (Nucleotide 2914–3009) können herausgespleißt werden. Wir konnten die Existenz einer dieser Spleißvarianten (ohne Exon 27) auch auf mRNA-Level nachweisen (7). Die zweite (ohne Exon 23) jedoch, die wir aus einer Datenbank humaner peripherer Lymphknoten klonierten, war im System nicht sichtbar. Dies weist auf eine geringe Abundanz/Umsatz der mRNA, die diese Form codiert, hin.
Die Sequenzvergleiche zeigten signifikante Homologien mit Proteoglycan-Link-Protein-Sequenzen, epidermale Wachstumsfaktoren-ähnliche Wiederholungen und zwei RGD Motive. Dies stimmt gut mit den adhäsiven Eigenschaften von CLEVER-1 überein.
BEISPIEL 4
In-Vitro-Bindungstest bzw. -Adhäsionstest
Lymphknotenschnitte wurden zuerst mit 3–266, 3–372 oder Kontrollantikörpern gegen humanes HLA ABC (HB95, ATCC und 3G6 (gegen Hühner-T-Zellen)) inkubiert. Anschließend wurden sie mit mononukleären Zellen aus peripherem Blut, gereinigt mittels Ficoll-Gradienten (Pharmacia), oder verschiedenen menschlichen Tumorzelllinien (lymphoblastoide Zelllinien, KCA und IBW4; Burkitt-Lymphom CRL-1648; Plattenepithelkarzinom-Linien NA und NU) überschichtet. Darauffolgend wurden die Schnitte zwei unterschiedlichen Typen von Tests unterzogen: 1. Ein nicht-statischer Test, welcher die Bindung von Zellen an HEV optimal misst und unter rotierenden Bedingungen (60 UpM auf einem Orbital-Schüttler für 30 min bei +7°C) durchgeführt wird. 2. Ein statischer Test, bei dem die mit Zellen überschichteten Schnitte unter statischen Bedingungen für 15 min belassen wurden, gefolgt von 5 min Rotation mit 60 UpM und dann wieder 15 min ohne Rotation bei +7°C. (Statische Bedingungen wurden benötigt, um optimal an lymphytisches Endothel zu binden). Die gebundenen bzw. anhaftenden Zellen wur den in 1% Glutaraldehyd fixiert. Die Anzahl der an HEV und sinusoidale (lymphytisches) Endothel gebundenen Lymphozyten wurde unter einfach blinden Bedingungen mit einem Dunkelfeldmikroskop gezählt. In dieser Einstellung sind sinusoidale Gefäße leicht erkennbar. Die Resultate der Inhibitionstests werden als Prozent der Kontrollbindung bzw. Bindung der Kontrolle (die Anzahl der gebundenen Zellen/Gefäß in Gegenwart des Kontroll-mAb definiert 100% Anhaftung) angegeben.
Wenn der Test unter nicht-statischen Bedingungen unter Imitation des Blutstromes durchgeführt wurde, war die Bindung von Lymphozyten an HEV um 43,6% und 45,2% durch 3–266 und 3–372, respektive, reduziert (3A). Zum Zwecke der Imitation von Bedingungen an Stellen von Lymphozytenaustritt wurde der Test unter statischen Bedingungen durchgeführt. In diesen Versuchen war die Bindung von Lymphozyten an lymphatisches Endothel um 46,4% und 64% durch 3–266 und 3–372, respektive, reduziert (3B). Diese Daten indizieren, dass das Molekül, erkannt durch 3–266 und 3–372, tatsächlich die Bindung von Lymphozyten sowohl an HEV als auch an lymphytisches Endothel vermittelt.
Um die Rolle dieses Moleküls bei der Migration von malignen Zellen zu untersuchen, wurden die Tests mit drei Lymphomzelllinien (CRL 1648, KCA und IBW4) und zwei Plattenepithelkarzinom-Zelllinien (NA und NU) durchgeführt. Für diese Versuche wurde der Antikörper 3–372 auf Grund seines höheren Inhibierungsvermögens ausgewählt (3). Die Resultate dieser Tests zeigen eindeutig, dass CLEVER-1 an der Bindung von malignen Zellen an Endothel sowohl bei Eintrittsstellen als auch bei Austrittsstellen in Lymphknoten involviert ist (4A und 3).
BEISPIEL 5
CLEVER-1 ist an entzündeten Stellen in HEV-ähnlichen Gefäßen hochreguliert
Synoviale Proben von 18 Patienten, die an chronischer Arthritis leiden und sich Synovektomien unterzogen, Hautproben von erkrankter Haut von Patienten, leidend an Psoriasis (n=5), Flechte (n=1), Mycosis fungoides (n=1), Erythrodermie (n=2), Exanthem (n=1), Folliculitis (n=3) und gesunde Hautproben von 15 Individuen wurden auf die Expression von CLEVER-1 mit Hilfe der Immunoperoxidase-Methode, wie oben beschrieben, untersucht. Wie in normalen, nicht-lymphoiden Geweben, war CLEVER-1 in afferenten lymphatischen Gefäßen in entzündeten synovialen Proben und auch in gesunden und Proben erkrankter Haut vorhanden. Zusätzlich war CLEVER-1-Expression in HEV-ähnlichen Gefäßen, welche an entzündeten Stellen auftreten und von starken Infiltrationen entzündlicher Zellen umgeben sind, induziert (5). Tabelle 2 illustriert die vollständige Korrelation zwischen dem Ausmaß an inflammatori scher Infiltration und Hochregulierung von CLEVER-1-Expression in synovialen Proben. Dasselbe Phänomen wurde in Hautproben beobachtet: alle Proben erkrankter Haut hatten inflammatorische Infiltrate, die CLEVER-1-positive HEV-ähnliche Gefäße enthielten. Diese Gefäße waren in Proben gesunder Haut nicht vorhanden.
BEISPIEL 6
CLEVER-1 vermittelt außerdem Bindung von Monozyten und Granulozyten an HEV-ähnliche Gefäße
Menschliche Monozyten aus peripherem Blut wurden aus mittels Ficoll-Gradienten (Pharmacia) isolierten mononukleären Zellen gereinigt, indem sie sich eine Stunde lang bei +37°C an Plastikoberflächen anheften gelassen wurden. Granulozyten wurden aus Leukozytenreichen Leukozytenfilmen aus humanem Blut mittels Percoll-Gradienten (Pharmacia)-Zentrifugation isoliert. Ihre Bindung an HEV-ähnlichen Gefäßen in entzündetem Synovium wurde getestet. Zusätzlich wurde die Bindung von Granulozyten an HEV in Tonsillen getestet, welche CLEVER-1 stark exprimieren. (Wenn Tonsillen entfernt werden, sind sie immer in unterschiedlichem Ausmaß entzündet, obwohl sie als lymphoides Organ auch ohne Entzündung HEV besitzen). Sowohl Granulozyten als auch Monozyten banden effizient an HEV-ähnliche Gefäße in entzündetem Synovium und Granulozyten hafteten stark an HEV in Tonsillen. Ihre Bindung an diese Organe wurde durch den Antikörper-Pool, der 3–372 und 3–266 enthielt, nicht aber durch den Kontrollantikörper signifikant inhibiert (6).
BEISPIEL 7
CLEVER-1 kontrolliert Wanderung von Lymphozyten in vivo
Um zu verifizieren, dass CLEVER-1 eine funktionelle Rolle in vivo spielt, wurde zuerst durch intravenöse Injektion von 3–372-Antikörper bestätigt, dass Kaninchen CLEVER-1 in vivo an der Oberfläche des Endothels exprimieren. Die Anwesenheit von CLEVER-1 auf HEV wurde nachgewiesen bzw. detektiert, nachdem der Antikörper 3–372 5 Minuten in vivo zirkuliert war. Der Nachweis erfolgte mittels gefrorener Schnitte und FITC-markiertem, anti-Maus-IgG-Sekundärantikörper nach Tötung (8a). In diesem Zeitrahmen hat das intravenös verabreichte 180 kDa Immunglobulinmolekül keine Möglichkeit auszutreten und ins Gewebe zu diffundieren. Basierend auf diesen Ergebnissen wurden die Antikörper 3–372 (und ein der Klasse angepasster negativer Kontrollantikörper) den mit Keyhole-Limpet-Hämocyanin über die Pfoten immunisierten Kaninchen verabreicht. Die Effekte der Antikörperbehandlung auf die Größe und Zellularität der Lymphknoten, welche die Pfoten drainieren, wurde untersucht.
Antikörperbehandlung gegen CLEVER-1 verhinderte signifikant die Vergrößerung der poplitealen Lymphknoten (8c). Dies zeigt, dass CLEVER-1 eine funktionelle Rolle bei der Wanderung von Lymphozyten in vivo hat. Höchstwahrscheinlich übt es seine Effekte sowohl beim Eintritt von Lymphozyten in HEV als auch bei deren Austritt in lymphatische Sinusoide aus, da die Kaninchen, die mit 3–372 Antikörper behandelt wurden, nur wenige Lymphozyten in ihren lymphatischen Sinusoiden hatten, wenn mittels histologischer Schnitte analysiert (8d). Wenn bei der Tötung 3 Tage nach der letzten 3–372-Dosis getestet, wurde intravenös verabreichter 3–372-Antikörper auch bei der Bindung an CLEVER-1 in lymphatischen Sinusen nachgewiesen. In Kaninchen, die einen Kontrollantikörper verabreicht bekamen, wurde kein Signal entdeckt (Daten nicht gezeigt).
Alle Dokumente, z.B. wissenschaftliche Publikationen, Patente und Patentpublikationen, die hier zitiert werden, werden hiermit durch Referenz in ihrer Gesamtheit im selben Ausmaß inkorporiert, als ob jedes einzelne Dokument spezifisch und individuell als durch Referenz in seiner Gesamtheit zu inkorporieren angezeigt wäre. Wo das zitierte Dokument nur die erste Seite des Dokumentes liefert, wird auf das gesamte Dokument, inklusive der verbleibenden Seiten des Dokumentes, Bezug genommen.
Tabelle 1. Übereinstimmungen mit CLEVER-1 und Stabilin-1

1. 21/27 Übereinstimmungen (77%). 275350,0 Da, pI = 6,04. Eingangs-Nr. 6469374. HOMO SAPIENS. (AJ275213) Stabilin-1.

m/z	MH*	Delta	Start	Ende	Peptidsequenz	Modifikationen
					(Klicken für Fragmentionen)
eingereicht	übereinstimmend	ppm
775.488	775.483	6.4034	372	377	(R)VFLOLR(V)
787.36	787.3739	–17.6253	1299	1305	(R)SGFSFSR(G)
799.495	799.5042	–11.4617	1585	1591	(R)VGLELLR(D)
812.495	812.4994	–54309	1047	1053	(R)TLPNLVR(A)
917.502	917.4997	2.4556	1040	1046	(R)AFWLOPR(T)
1017.44	1017.425	14.4862	2295	2301	(R)WDAYCFR(V)
1104.54	1104.526	12.6406	53	61	(K)OTCPSGWLR(E)
1212.7	1212.695	3.9482	1021	1032	(R)VTALVPSEAAVR(Q)
1284.65	1284.622	21.4530	1678	1688	(R)EGSIYLNDFAR(V)
1291.79	1291.774	12.5434	613	624	(R)ILLGPEGVPLOR(V)
1330.63	1330.575	41.7401	953	965	(R)AGNGGCHGLATRC(A)
1330.63	1330.633	–1.9754	1873	1882	(R)CDHFETRPLR(L)
1374.66	1374.632	20.1117	62	72	(R)ELPDOITODCR(Y)
1456.79	1456.776	9.6229	1069	1082	(R)LGGOEVATLNPTTR(W)
1493.8	1493.796	2.4215	508	521	(R)TIGOILASTEAFSR(F)
1555.7	1555.663	23.5678	219	231	(R)CLPGYTOOGSECR(A)
1678.94	1678.913	16.1953	1802	1817	(R)NVEALASDLPNLGPLR(T)
1730.89	1730.887	1.9674	1054	1068	(R)AHFLOGALFEEELAR(L)
1912.82	1912.832	–6.3742	936	952	(K)LGFAGDGYOCSPIDPCR(A)
2057.05	2057.03	9.5484	1655	1673	(R)SEDLLEOGYATALSGHPLR(F)
2165.11	2165.14	–13.6320	1707	1725	(R)VLLPPEALHWEPDDAPIPR(R)
2295.22	2295.224	–1.5853	389	410	(R)EILTTAGPFTVLVPSVSSFSSR(T)

6 nicht übereinstimmende Massen: 871,5410 949,4800 1360,6500 1538,6900 1787,9200 2008,1400

Die übereinstimmenden Peptide decken 10% (168/2570 AAs) des Proteins ab. Abdeckungskarte für diesen Treffer (MS-Verdau Index Nr.): 427477 Tabelle 2. Expression von CLEVER-1 ist hauptsächlich in Gefäßen induziert, die von Lymphozyten-Infiltrationen in entzündeten Synovien umgeben sind

Grad inflammatorischer

Infiltration²

Expression von CLEVER-1 in HEV-ähnlichen Gefäßen¹ 0/1 (n=9) 2/3 (n=9)

–/+ 100% 0

++/+++ 0 100%

¹ Intensität wurde ausgewertet als –, ±, + negativ oder schwach, ++, +++ mittel oder stark.
² Grad der inflammatorischen Zellinfiltration in 18 synovialen Proben wurde ausgewertet als: 0/1, keine oder wenige Lymphozyten rund um die Gefäße, 2/3 merkliche oder massive lymphozytische Infiltrationen.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum In-vitro-Diagnostizieren von Entzündungserkrankungen bei einem Patienten, wobei das Verfahren umfasst: (a) Exponieren einer Blut- oder Gewebeprobe von einem Patienten gegenüber einem gemeinsamen Lymphendothel- und Gefäßendothel-Glycoprotein (CLEVER-1) in vitro, wobei das Glycoprotein ein Molekulargewicht von 270 bis 300 kD in einer SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen hat und durch einen monoklonalen Antikörper, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus (i) monoklonaler Antikörper 3–266 (DSM ACC 2519); und (ii) monoklonaler Antikörper 3–372 (DSM ACC 2590), erkennbar ist, für eine Zeitdauer und unter Bedingungen, die ausreichend sind, um das Binden von Leukozyten, falls in der Probe vorhanden, zu ermöglichen, und (b) Detektieren von Leukozyten, die an das Glycoprotein in der Blut- oder Gewebeprobe gebunden sind.
Verfahren zum In-vitro-Detektieren maligner Zellen bei einem Patienten, wobei das Verfahren umfasst: (a) Exponieren einer Blut- oder Gewebeprobe von einem Patienten gegenüber dem Glycoprotein, wie in Anspruch 2 definiert, in vitro für eine Zeitdauer und unter Bedingungen, die ausreichend sind, um das Binden der malignen Zellen, falls in der Probe vorhanden, zu ermöglichen, und (b) Detektieren, ob irgendwelche malignen Zellen in der Blut- oder Gewebeprobe an das Glycoprotein gebunden haben.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Glycoprotein auf einem festen Träger ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Glycoprotein auf lymphoidem Gewebe bereitgestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Glycoprotein in der Membran von Endothelzellen vorhanden ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Glycoprotein in einer löslichen Form vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Detektionsschritt mittels Bildgebung durchgeführt wird.
Verfahren zum Entfernen von malignen Zellen aus einer Probe, wobei das Verfahren umfasst: (a) Exponieren der malignen Zellen gegenüber dem Glycoprotein, wie in Anspruch 1 definiert, in vitro für eine Zeitdauer und unter Bedingungen, die ausreichend sind, um die Bindung maligner Zellen, falls in der Probe vorhanden, zu ermöglichen, und (b) Abtrennen des Glycoproteins und der malignen Zellen, die daran haften, aus der Probe.
Verwendung eines Mittels, das die Glycoprotein-vermittelte Leukozytenbindung inhibiert, wobei das Glycoprotein in Anspruch 1 definiert ist, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die in einem Verfahren zum Behandeln von Entzündung bei einem Patienten, der dessen bedarf, zweckmäßig ist, wobei das inhibierende Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: (a) Antikörpern oder Fragmenten davon, erzeugt gegen das Glycoprotein; und (b) dem Glycoprotein oder Fragmenten davon in löslicher Form.
Verwendung eines Mittels, das die Bindung maligner Zellen, vermittelt durch das Glycoprotein, wie in Anspruch 1 definiert, inhibiert, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die in einem Verfahren zum Verhindern von Metastase bei einem Patienten, der dessen bedarf, zweckmäßig ist, wobei das inhibierende Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: (a) Antikörpern oder Fragmenten davon, erzeugt gegen das Glycoprotein; und (b) dem Glycoprotein oder Fragmenten davon in löslicher Form.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei die Glycoprotein-vermittelte Zellbindung Leukozytenbindung inhibiert.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei die Glycoprotein-vermittelte Zellbindung Lymphozytenbindung inhibiert.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei die Glycoprotein-vermittelte Zellbindung Monozytenbindung inhibiert.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei die Glycoprotein-vermittelte Zellbindung Granulozytenbindung inhibiert.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei die Glycoprotein-vermittelte Zellbindung die Bindung maligner Zellen inhibiert.
Verwendung nach Anspruch 9 oder 10, wobei das Glycoproteinbindungsmittel an einen Patienten verabreicht wird, der einer Inhibierung von Glycoprotein-vermittelter Zellbindung bedarf.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei der Patient einer Behandlung von Entzündung bedarf.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei der Patient einer Behandlung für eine Malignität oder eine mögliche Malignität bedarf.
Verfahren zum In-vitro-Diagnostizieren von Entzündungserkrankungen bei einem Patienten, wobei das Verfahren das Exponieren einer Blut- oder Gewebeprobe von dem Patienten gegenüber einem Antikörper umfasst, der entweder – monoklonaler Antikörper 3–266 (DSM ACC 2519); oder – monoklonaler Antikörper 3–372 (DSM ACC 2590) ist.