CN110452871A - 一种淋巴液净化模型制作方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了生物工程领域的一种淋巴液净化模型制作方法，这种模型构建方法包括构建急性肺损伤的模型后，利用胸导管穿刺引流管建立体外淋巴液循环通路，将淋巴液引流至体外，再通过淋巴液净化装置进行净化后回输体内的医学研究模型构建。本发明意在对淋巴液作用机制阐明有助于寻找ALI治疗新靶点。本项目组在初步明确了连续性血液净化治疗ALI部分机制的基础上选取肠淋巴液作为干预目标，采用体内外实验相结合设计，研究聚砜膜为载体的滤过膜技术干预肠淋巴液从而发挥对远隔器官的保护作用，为ALI床旁淋巴液净化治疗系统研发提供基础医学研究证据，推动该技术向临床转化。

Description

一种淋巴液净化模型制作方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体是一种淋巴液净化模型制作方法。
背景技术
淋巴液又称作细胞外流体，主要由血浆构成，是血液中无色透明的成分，淋巴液通过人体大循环系统的毛细血管渗入身体组织，以便输送氧气和营养并运走废物进行排泄。“使用过后”的淋巴液经过类似静脉的淋巴系统又返回大循环系统中。
现有技术中对腹膜炎患者通常采用血液稀释和加强利尿的疗法改善人体的内循环系统。这种疗法的理论依据来源于中度血液稀释(红细胞压积减低30-35％)能引起血液的流变性质的显著改善，从而使毛细血管的血流及组织营养得到好转。在维持必要的循环血容量的条件下，提高毛细血管的灌注能代偿血氧浓度的降低，由于单位时间内红血球的流入量增高，所以在血量正常的条件下对血液进行中度稀释时，人体器官组织的局部氧合作用不产生障碍。
虽然上述方案利用血液稀释来治疗腹膜炎病人取得了喜人的效果，患者脱水症状消失且肠蠕动得到恢复，但是采用上述方法后患者电解质从尿中排放增多(主要是由于血液稀释时添加了甘露醇或山梨醇等渗透性利尿剂，帮助患者排尿)且伴随有电解质紊乱的后遗症，又因为血液被稀释后，血液的凝固性降低，在止血不完善的情况下会发生出血状况，需要长时间监测临床生化的变化，提高了治疗成本。
虽然上述方法证实了内毒素与单核-巨噬细胞结合在诱发全身炎症反应导致ALI过程中起主导作用，而肠粘膜屏障功能破坏及肠淋巴循环是该过程的核心环节。但是现有医学研究模型中缺失对寻找ALI治疗新靶点的研究模型。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种模拟制造寻找ALI治疗新靶点的研究模型。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：构建急性肺损伤的模型后，利用胸导管穿刺引流管建立体外淋巴液循环通路，将淋巴液引流至体外，再通过淋巴液净化装置进行净化后回输体内的医学研究模型构建。
采用上述方案后实现了以下有益效果：1、相对于血液稀释的现有技术，本技术方案利用净化装置净化淋巴液，降低了时间成本，同时避免了实验模型产生电解质紊乱的后遗症，维持了实验中模型参数的准确性。
2、相对于采用体内净化模型的现有技术，本技术方案中通过体外循环淋巴液，方便了学习人员或教学人员采集淋巴液样本，同时增强了直观研究淋巴液对于远隔器官损伤关系研究的有效性与潜在可能性。
3、相对于采用药物治疗模型的现有技术，本技术方案通过体外循环可以获得多种不同滤膜对缺血再灌注时产生的保护机制研究参数。
4、相对于利用白细胞去除术对内毒素血症的犬肺损伤模型，本技术方案能中断内毒素与单核-巨噬细胞发生作用环节的治疗措施，提高了模型的使用寿命，避免了重复劳动。
5、采用体内外实验相结合设计，研究聚砜膜为载体的滤过膜技术干预肠淋巴液从而发挥对远隔器官的保护作用，建立了以寻找ALI治疗新靶点的研究模型，为ALI床旁淋巴液净化治疗系统研发提供基础医学研究证据。
进一步，包括以下步骤；
S1、利用大鼠作为模型基础进行肠道缺血模型制备；
S2、以肠道缺血模型为基础建立体外淋巴液循环通路进行净化干预模型的制备；
S3、将净化干预模型中的淋巴细胞分离液取出，进行单核细胞的分离与活化；
S4、进行单核细胞的培养与功能性检测。
1、相对于血液净化模型，本技术方案通过体外循环淋巴液，不直接进行血液循环解决了抗凝问题，降低了出血与血栓形成的风险。
2、相对于血液净化模型，本技术方案解决了稀释或过滤血液对内环境稳态的影响(对水、电解质及酸碱平衡的影响)。
3、相对于其他引流净化模型，本技术方案避免了营养成分的丢失：如葡萄糖、氨基酸及游离脂肪酸等。
4、相对于血液净化或血液稀释的现有技术，本技术方案改善了外循环对血流动力学影响：避免了对血流动力学不稳定的患者而言，导致的加剧血流动力学不稳定现象。
5、本研究实验模型减少了参与外循环的组织液质量(血液净化中的血容量5000ml左右，占体重的8％)，降低了治疗剂量要求高，提升了清除炎性介质的效果。
进一步，所述步骤1中对大鼠进行腹腔注射0.8-1.3％戊巴比妥钠(60mg/kg)，麻醉显效后，大鼠取仰卧位固定于手术台上，随后通过夹闭肠系膜上动脉(SMA)技术50-70min，培养大鼠肠道缺血模型；优选的，对大鼠肠道缺血模型再灌注生理盐水115-130min建立肠道缺血再灌注损伤大鼠模型。
1、相对于采用隆朋进行麻醉的现有技术，本技术方案中根据小鼠的自身特点选取戊巴比妥钠进行麻醉，提升了麻醉效果，同时缩短了麻醉对小鼠的影响时间，也降低了毒副作用。
2、本技术方案通过夹闭肠系膜上动脉技术诱导小鼠造成小肠缺血现象，也直接为小鼠造成肺损伤提供了条件，缩短了获得模型的时间。
相对于夹闭肠系膜上动脉技术诱导小鼠造成小肠缺血的现有技术，本方案的优选实施例对大鼠肠道缺血模型再灌注生理盐水，从而建立肠道缺血再灌注损伤大鼠模型。
进一步，所述步骤3的建立流程如下，
首先，医护人员对大鼠模型进行腹部正中切口，切口长3-5cm，随后人为将全肠道及网膜组织向大鼠左侧掀起，暴露大鼠肠系膜上动脉及肠淋巴干，此时医护人员从大鼠近腹主动脉处剪开浆膜，钝性分离肠系膜上动脉及肠淋巴干；
其次，医护人员利用穿刺针沿淋巴管至淋巴干进行穿刺，直至穿刺针没入淋巴干3-4mm后保持穿刺针与导管之间固定；
再次，医护人员以大鼠侧胸锁连线的中点为起点沿大鼠颈部垂直作10-17mm切口，对颈部皮肤逐层钝性分离直至看见颈静脉，此时医护人员以血管夹分别夹住颈静脉的近心端和颈静脉的远心端，使颈静脉充血膨起，医护人员在充血膨起的颈静脉中间段剪出一截直径小于硅胶导管外径的小口，医护人员将硅胶导管一端剪一个45度斜面，硅胶导管的斜面部分插入已剪好的颈静脉的小口内部,此时松去血管夹，缝扎固定硅胶导管，缝合结缔组织和皮肤；
最后，肠淋巴干穿刺成功后，无菌条件下将硅胶导管一端插入EP管盖上较小孔，插至EP管底，硅胶管另一端连接已填充oXiris的吸附柱，吸附柱另一端由硅胶管连接，通过微量泵后置入大鼠右侧颈静脉，完成体外淋巴液循环通路的建设。
进一步，所述oXiris的吸附柱与微量泵之间设有过滤膜；优选的所述过滤膜采用高分子聚砜膜，随后医护人员通过体内实验阐述高分子聚砜膜肠淋巴液净化干预肠淋巴液对远隔器官肺脏肺泡Ⅱ型细胞凋亡的影响，优选的通过体外实验解析高分子聚砜膜肠淋巴液净化在调控AECII细胞凋亡过程的机制。
进一步，所述体内实验中包括建立普通滤膜对照组和高分子聚砜膜滤过组，通过正交实验分别选取造模后0h、6h、12h、24h和48h处死的大鼠的肺脏标本，分别检测临床水平(以氧合指数和呼吸指数为主)、器官水平(左肺下叶测定肺湿/干比重)、组织水平(左肺上叶行光镜检测及病理评分)、细胞水平右肺分离纯化(AECⅡ、TEM、FCM、DNA和Ladder检测细胞凋亡)、分子水平(实时定量PCR检测bcl-2、bax、Fas、和FasL凋亡基因表达水平)和蛋白水平(Westernblot检测凋亡蛋白bcl-2、bax、Fas、FasL表达水平)统计两组动物死亡率：分析上述指标间是否存在相关性，并比较两组动物相关指标是否存在显著差异。
进一步，所述体外实验包括建立普通滤膜对照组和高分子聚砜膜滤过组，通过正交实验分别选取造模后0h、6h、12h、24h和48h处死的大鼠的肺脏标本，检测内容包括观察细胞凋亡形态(TEM)、检测细胞早期凋亡率(FCM)、检测细胞晚期凋亡(DNA Ladde)、实时定量PCR检测凋亡基因表达水平和检测凋亡蛋白表达水平(Westernblot)以分析高分子聚砜膜净化后肠淋巴液刺激后不同时间点大鼠AECⅡ功能状态及凋亡情况以及与凋亡蛋白表达之间的相关性，统计各指标间的时效关系。
进一步，所述步骤5中分离方式如下
取新鲜肝素抗凝血5ml与PBS液1:1混匀后，4000r/min离心20分钟，祛除上清后使用PBS洗涤2次；
以含乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)的PBS悬浮血细胞，置于淋巴细胞分离液上，2000r/min离心30分钟；
吸出膜样单个核细胞成分，PBS冲洗3次后将单个核细胞悬浮于含乙二胺四乙酸EDTA的血清中，孵育20分钟，PBS洗涤2次后与培养液中孵育20分钟，再以Hank's液洗去不附壁的淋巴细胞；
将悬浮附壁的单个核细胞吹打成细胞悬液，Hank's液冲洗3次后即可得到单核细胞，并置于37℃、5％的CO2培养箱中培养2小时，将上清吸到另一无菌的培养皿中，培养48小时。
进一步，所述步骤5中的培养法包括酶联免疫吸附法(ELISA)、Annexin V-FITC染色法和MTT方法。
进一步，所述单核细胞抗原递呈功能检测包括以下步骤，采用荧光素单克隆抗体及同型对照；2支falcon管分别标记为T管(检测管)和C管(对照管)，分别加入大鼠CD14-FITC单克隆抗体20ul，T管加入DLA-PE 20ul，C管加入IgG1-PE 20ul；每管加乙二胺四乙酸抗凝静脉血100ul，混合后于室温避光环境下放置；染色15min，然后加入溶血素2ml，旋涡混合后置于室温避光下溶血10min：3000r/min离心5min后弃去上层清液；生理盐水2ml洗涤1次；3000r/min离心5min，弃掉上清液；加入500ul 1％多聚甲醛，震荡混匀后置于暗处保存，1h内用流式细胞仪检测有核细胞中CD14阳性细胞中DLA的阳性率，使用Cell Quest软件分析。
附图说明
图1为肠淋巴发病机制；
图2为本发明实施流程图；
图3为实施一的实物操作流程图；
图4为实施例一和实施例二中大鼠模型建立的对照流程图；
图5为实施例五中高分子聚砜膜肠淋巴液净化对远隔器官肺脏肺泡Ⅱ型细胞凋亡的影响流程图；
图6为实施例六中体内实验阐述高分子聚砜膜肠淋巴液净化干预与外周单核细胞的作用机制流程图；
图7为实施例七中医护人员通过体外实验解析高分子聚砜膜肠淋巴液净化在调控AECII细胞凋亡过程的机制流程图；
图8为实施例十二中Cell Quest软件分析后的参数图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
现有技术：请参考附图1为肠淋巴发病机制，肠道作为机体最大的细菌“贮存库”，被认为是导致MODS发生的“启动器官”。
当肠道的细菌、毒素、炎性介质或细胞因子透过肠道的粘膜屏障进入肠组织间隙，被肠道内的淋巴系统吸收汇集至胸导管释放入血，进而激活血液中的单核-巨噬细胞系统，释放TNF-α、IL-6等炎性介质。而这些炎性介质进一步作用于肠道，导致肠道的通透性进一步增加，更多的细菌或内毒素等致病因子进入肠道粘膜的组织间隙被肠淋巴系统吸收释放入血，从而进入炎症反应级联放大瀑布反应的恶性循环(vicious circle,VC)，进而损伤原发疾病的远隔器官(肺、心、肾等),导致MODS的发生。
模型研究与制备的电器元件器材清单与型号：
超净工作台(Heto，Demark)
CO2培养箱(Forma3141，USA)
台式高速冷冻离心机(1580-Eppendorf，Germany)
-80℃超低温冰箱(Czech，Germany)
纯水制备系统(Milliporre，USA)
超纯水制备系统(Elga，UK)
液氮罐(ICI，USA)
荧光显微镜(Leica M165 FC，Germany)
透射电子显微镜(H-7500，Japan)
流式细胞仪(Beckman，USA)
荧光定量PCR仪(ICycler iQ，USA)
荧光分光光度计(RF-5301PC,PerkinElmer，Japan)
电泳系统(Bio-Band，USA)
全波长荧光酶标仪(TECAN Safire，Austria)
全自动数码成像与分析系统(GenGenius，Syngene，USA)
实施例一：
请参考图2和附图3，附图3中的A-F流程如下：
首先，对大鼠进行腹腔注射0.8-1.3％戊巴比妥钠(60mg/kg)，麻醉显效后，大鼠取仰卧位固定于手术台上，随后通过夹闭肠系膜上动脉(SMA)技术50-70min，培养大鼠肠道缺血模型。
随后，医护人员对大鼠模型进行腹部正中切口，切口长3-5cm，随后人为将全肠道及网膜组织向大鼠左侧掀起，暴露大鼠肠系膜上动脉及肠淋巴干，此时医护人员从大鼠近腹主动脉处剪开浆膜，钝性分离肠系膜上动脉及肠淋巴干。
其次，医护人员利用穿刺针沿淋巴管至淋巴干进行穿刺，直至穿刺针没入淋巴干3-4mm后保持穿刺针与导管之间固定；
再次，医护人员以大鼠侧胸锁连线的中点为起点沿大鼠颈部垂直作10-17mm切口，对颈部皮肤逐层钝性分离直至看见颈静脉，此时医护人员以血管夹分别夹住颈静脉的近心端和颈静脉的远心端，使颈静脉充血膨起，医护人员在充血膨起的颈静脉中间段剪出一截直径小于硅胶导管外径的小口，医护人员将硅胶导管一端剪一个45度斜面，硅胶导管的斜面部分插入已剪好的颈静脉的小口内部,此时松去血管夹，缝扎固定硅胶导管，缝合结缔组织和皮肤；
再次，肠淋巴干穿刺成功后，无菌条件下将硅胶导管一端插入EP管盖上较小孔，插至EP管底，硅胶管另一端连接已填充oXiris的吸附柱，吸附柱另一端由硅胶管连接，通过微量泵后置入大鼠右侧颈静脉，完成体外淋巴液循环通路的建设。
最后，将净化干预模型中的淋巴细胞分离液取出，进行单核细胞的分离与活化，进行单核细胞的培养与功能性检测。
实施例二
请参考图4，本实施例与上述实施例的区别在于对大鼠肠道缺血模型再灌注生理盐水130min建立肠道缺血再灌注损伤大鼠模型。
实施例三
本实施例与上述实施例的区别在于oXiris的吸附柱与微量泵之间粘接有聚四氟乙烯过滤膜。
实施例四
本实施例与上述实施例的区别在于在于oXiris的吸附柱与微量泵之间粘接有高分子聚砜膜。
实施例五
请参考图5，本实施例与上述实施例的区别在于医护人员通过体内实验阐述高分子聚砜膜肠淋巴液净化干对远隔器官肺脏肺泡Ⅱ型细胞凋亡的影响。
体内实验中包括建立普通滤膜对照组和高分子聚砜膜滤过组，通过正交实验分别选取造模后0h、6h、12h、24h和48h处死的大鼠的肺脏标本，分别检测临床水平(以氧合指数和呼吸指数为主)、器官水平(左肺下叶测定肺湿/干比重)、组织水平(左肺上叶行光镜检测及病理评分)、细胞水平右肺分离纯化(AECⅡ、TEM、FCM、DNA和Ladder检测细胞凋亡)、分子水平(实时定量PCR检测bcl-2、bax、Fas、和FasL凋亡基因表达水平)和蛋白水平(Westernblot检测凋亡蛋白bcl-2、bax、Fas、FasL表达水平)。
统计两组动物死亡率：分析上述指标间是否存在相关性，并比较两组动物相关指标是否存在显著差异。
实施例六
请参考图6，本实施例与上述实施例的区别在于医护人员通过体内实验阐述高分子聚砜膜肠淋巴液净化干预与外周单核细胞的作用机制。
实施例七
请参考图7，本实施例与上述实施例的区别在于医护人员通过体外实验解析高分子聚砜膜肠淋巴液净化在调控AECII细胞凋亡过程的机制。
体外实验包括建立普通滤膜对照组和高分子聚砜膜滤过组，通过正交实验分别选取造模后0h、6h、12h、24h和48h处死的大鼠的肺脏标本，检测内容包括观察细胞凋亡形态(TEM)、检测细胞早期凋亡率(FCM)、检测细胞晚期凋亡(DNA Ladde)、实时定量PCR检测凋亡基因表达水平和检测凋亡蛋白表达水平(Westernblot)以分析高分子聚砜膜净化后肠淋巴液刺激后不同时间点大鼠AECⅡ功能状态及凋亡情况以及与凋亡蛋白表达之间的相关性，统计各指标间的时效关系。
实施例八
本实施例与上述实施例的区别在于利用单核细胞进行分离活化，具体实施方式如下：
取新鲜肝素抗凝血5ml与PBS液1:1混匀后，4000r/min离心20分钟，祛除上清后使用PBS洗涤2次；
以含乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)的PBS悬浮血细胞，置于淋巴细胞分离液上，2000r/min离心30分钟；
吸出膜样单个核细胞成分，PBS冲洗3次后将单个核细胞悬浮于含乙二胺四乙酸EDTA的血清中，孵育20分钟，PBS洗涤2次后与培养液中孵育20分钟，再以Hank's液洗去不附壁的淋巴细胞；
将悬浮附壁的单个核细胞吹打成细胞悬液，Hank's液冲洗3次后即可得到单核细胞，并置于37℃、5％的CO2培养箱中培养2小时，将上清吸到另一无菌的培养皿中，培养48小时。
实施例九
本实施例与上述实施例的区别在于单核细胞的培养方法采用酶联免疫吸附法(ELISA)取单核细胞培养液，用抗人IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α酶联免疫试剂盒测定。
具体方法：加0.1ml离心后的细胞培养上清液于反应空中，置于37℃孵育60分钟。然后洗板5次。同时设有空白孔和标准孔。在各反应孔中，加入新鲜稀释的生物素化抗体工作液0.1ml，37℃避光孵育30分钟，洗板5次。加入0.1ml显色底物液，37℃避光孵育15分钟后，于各反应孔中加入终止液0.1ml，混匀后10分钟内测量OD值。
实施例十
本实施例与上述实施例的区别在于单核细胞的培养方法采用Annexin V-FITC染色法。具体实施方式如下：制备单核细胞悬液，1000r/min离心10分钟，弃上清。将细胞悬于标记缓冲液中。然后加入Annexin V-FIT，避光室温反应15分钟。加入标记缓冲液，用荧光显微镜或流式细胞仪观察细胞凋亡情况。
实施例十一
本实施例与上述实施例的区别在于单核细胞的培养方法采用MTT方法，具体实施方法如下：
用培养液配成单个细胞悬液，以每孔500-5000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul。培养3-5天后，每孔加MTT溶液20ul。继续孵育4小时，终止培养，离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ulDMSO，选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
实施例十二
本实施例与上述实施例的区别在于单核细胞抗原递呈功能检测包括以下步骤：
采用荧光素单克隆抗体及同型对照；2支falcon管分别标记为T管(检测管)和C管(对照管)，分别加入大鼠CD14-FITC单克隆抗体20ul，T管加入DLA-PE 20ul，C管加入IgG1-PE 20ul；每管加乙二胺四乙酸抗凝静脉血100ul，混合后于室温避光环境下放置。
染色15min，然后加入溶血素2ml，旋涡混合后置于室温避光下溶血10min：3000r/min离心5min后弃去上层清液；生理盐水2ml洗涤1次；3000r/min离心5min，弃掉上清液；加入500ul 1％多聚甲醛，震荡混匀后置于暗处保存，1h内用流式细胞仪检测有核细胞中CD14阳性细胞中DLA的阳性率，使用Cell Quest软件分析。分析后的参数请参考图8。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (10)

1.一种淋巴液净化模型制作方法，其特征在于：构建急性肺损伤的模型后，利用胸导管穿刺引流管建立体外淋巴液循环通路，将淋巴液引流至体外，再通过淋巴液净化装置进行净化后回输体内的医学研究模型构建。
2.根据权利要求1所述的一种淋巴液净化模型制作方法，其特征在于：包括以下步骤；
S1、利用大鼠作为模型基础进行肠道缺血模型制备；
S2、以肠道缺血模型为基础建立体外淋巴液循环通路进行净化干预模型的制备；
S3、将净化干预模型中的淋巴细胞分离液取出，进行单核细胞的分离与活化；
S4、进行单核细胞的培养与功能性检测。
3.根据权利要求2所述的一种淋巴液净化模型制作方法，其特征在于：所述步骤1中对大鼠进行腹腔注射0.8-1.3％戊巴比妥钠(60mg/kg)，麻醉显效后，大鼠取仰卧位固定于手术台上，随后通过夹闭肠系膜上动脉(SMA)技术50-70min，培养大鼠肠道缺血模型；优选的，对大鼠肠道缺血模型再灌注生理盐水115-130min建立肠道缺血再灌注损伤大鼠模型。
4.根据权利要求3所述的一种淋巴液净化模型制作方法，其特征在于：所述步骤3的建立流程如下，
首先，医护人员对大鼠模型进行腹部正中切口，切口长3-5cm，随后人为将全肠道及网膜组织向大鼠左侧掀起，暴露大鼠肠系膜上动脉及肠淋巴干，此时医护人员从大鼠近腹主动脉处剪开浆膜，钝性分离肠系膜上动脉及肠淋巴干；
其次，医护人员利用穿刺针沿淋巴管至淋巴干进行穿刺，直至穿刺针没入淋巴干3-4mm后保持穿刺针与导管之间固定；
再次，医护人员以大鼠侧胸锁连线的中点为起点沿大鼠颈部垂直作10-17mm切口，对颈部皮肤逐层钝性分离直至看见颈静脉，此时医护人员以血管夹分别夹住颈静脉的近心端和颈静脉的远心端，使颈静脉充血膨起，医护人员在充血膨起的颈静脉中间段剪出一截直径小于硅胶导管外径的小口，医护人员将硅胶导管一端剪一个45度斜面，硅胶导管的斜面部分插入已剪好的颈静脉的小口内部,此时松去血管夹，缝扎固定硅胶导管，缝合结缔组织和皮肤；
最后，肠淋巴干穿刺成功后，无菌条件下将硅胶导管一端插入EP管盖上较小孔，插至EP管底，硅胶管另一端连接已填充oXiris的吸附柱，吸附柱另一端由硅胶管连接，通过微量泵后置入大鼠右侧颈静脉，完成体外淋巴液循环通路的建设。
5.根据权利要求4所述的一种淋巴液净化模型制作方法，其特征在于：所述oXiris的吸附柱与微量泵之间设有过滤膜；优选的所述过滤膜采用高分子聚砜膜，随后医护人员通过体内实验阐述高分子聚砜膜肠淋巴液净化干预肠淋巴液对远隔器官肺脏肺泡Ⅱ型细胞凋亡的影响，优选的，体内实验阐述高分子聚砜膜肠淋巴液净化干预与外周单核细胞的作用机制，优选的通过体外实验解析高分子聚砜膜肠淋巴液净化在调控AECII细胞凋亡过程的机制。
6.根据权利要求5所述的一种淋巴液净化模型制作方法，其特征在于：所述体内实验中包括建立普通滤膜对照组和高分子聚砜膜滤过组，通过正交实验分别选取造模后0h、6h、12h、24h和48h处死的大鼠的肺脏标本，分别检测临床水平(以氧合指数和呼吸指数为主)、器官水平(左肺下叶测定肺湿/干比重)、组织水平(左肺上叶行光镜检测及病理评分)、细胞水平右肺分离纯化(AECⅡ、TEM、FCM、DNA和Ladder检测细胞凋亡)、分子水平(实时定量PCR检测bcl-2、bax、Fas、和FasL凋亡基因表达水平)和蛋白水平(Westernblot检测凋亡蛋白bcl-2、bax、Fas、FasL表达水平)统计两组动物死亡率：分析上述指标间是否存在相关性，并比较两组动物相关指标是否存在显著差异。
7.根据权利要求5所述的一种淋巴液净化模型制作方法，其特征在于：所述体外实验包括建立普通滤膜对照组和高分子聚砜膜滤过组，通过正交实验分别选取造模后0h、6h、12h、24h和48h处死的大鼠的肺脏标本，检测内容包括观察细胞凋亡形态(TEM)、检测细胞早期凋亡率(FCM)、检测细胞晚期凋亡(DNA Ladde)、实时定量PCR检测凋亡基因表达水平和检测凋亡蛋白表达水平(Westernblot)以分析高分子聚砜膜净化后肠淋巴液刺激后不同时间点大鼠AECⅡ功能状态及凋亡情况以及与凋亡蛋白表达之间的相关性，统计各指标间的时效关系。
8.根据权利要求2所述的一种淋巴液净化模型制作方法，其特征在于：所述步骤5中分离方式如下：
取新鲜肝素抗凝血5ml与PBS液1:1混匀后，4000r/min离心20分钟，祛除上清后使用PBS洗涤2次；
以含乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)的PBS悬浮血细胞，置于淋巴细胞分离液上，2000r/min离心30分钟；
吸出膜样单个核细胞成分，PBS冲洗3次后将单个核细胞悬浮于含乙二胺四乙酸EDTA的血清中，孵育20分钟，PBS洗涤2次后与培养液中孵育20分钟，再以Hank's液洗去不附壁的淋巴细胞；
将悬浮附壁的单个核细胞吹打成细胞悬液，Hank's液冲洗3次后即可得到单核细胞，并置于37℃、5％的CO2培养箱中培养2小时，将上清吸到另一无菌的培养皿中，培养48小时。
9.根据权利要求2所述的一种淋巴液净化模型制作方法，其特征在于：所述步骤5中的培养法包括酶联免疫吸附法(ELISA)、Annexin V-FITC染色法和MTT方法。
10.根据权利要求9所述的一种淋巴液净化模型制作方法，其特征在于：所述单核细胞抗原递呈功能检测包括以下步骤，采用荧光素单克隆抗体及同型对照；2支falcon管分别标记为T管(检测管)和C管(对照管)，分别加入大鼠CD14-FITC单克隆抗体20ul，T管加入DLA-PE 20ul，C管加入IgG1-PE 20ul；每管加乙二胺四乙酸抗凝静脉血100ul，混合后于室温避光环境下放置；染色15min，然后加入溶血素2ml，旋涡混合后置于室温避光下溶血10min：3000r/min离心5min后弃去上层清液；生理盐水2ml洗涤1次；3000r/min离心5min，弃掉上清液；加入500ul 1％多聚甲醛，震荡混匀后置于暗处保存，1h内用流式细胞仪检测有核细胞中CD14阳性细胞中DLA的阳性率，使用Cell Quest软件分析。
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