RU2256916C1

RU2256916C1 - Способ дифференциальной диагностики туберкулеза и саркоидоза органов дыхания

Info

Publication number: RU2256916C1
Application number: RU2004106113/15A
Authority: RU
Inventors: А.И. Макинский (RU); А.И. Макинский; С.Е. Борисов (RU); С.Е. Борисов; Л.Ю. Петрова (RU); Л.Ю. Петрова
Priority date: 2004-03-03
Filing date: 2004-03-03
Publication date: 2005-07-20

Abstract

Изобретение относится к медицине, в частности к фтизиатрии и пульмонологии, и может быть использовано в противотуберкулезных учреждениях и в учреждениях общей лечебной сети. Способ дифференциальной диагностики туберкулеза и саркоидоза органов дыхания характеризуется тем, что определяют активность миелопероксидазы (МП) и содержание катионных белков (КБ) в фагоцитах крови, и при содержании КБ более 105 усл.ед. и нормальной и повышенной активности МП диагностируют саркоидоз, а при содержании КБ менее 105 усл.ед и пониженной активности МП - туберкулез легких. Способ по изобретению позволяет повысить точность диагностики и упростить ее. 2 табл.

Description

Изобретение относится к медицине, в частности к фтизиатрии и пульмонологии, и может быть использовано в противотуберкулезных учреждениях и в учреждениях общей лечебной сети.

Известен способ диагностики саркоидоза с помощью антигена Квейма. Проба Квейма считается положительной при появлении в месте внутрикожного введения антигена папулы, состоящей из эпителиоидных и лимфоидных клеток. Эффективность данного метода диагностики саркоидоза составляет от 60 до 84% (А.Г.Хоменко и соавт. / Пробл. туберкулеза. - 1991. - №11. - С.33-37).

Недостатком метода является необходимость введения специфического антигена, что может привести к нежелательным последствиям, обусловленным сенсибилизацией организма.

Известен способ дифференциальной диагностики туберкулеза и саркоидоза органов дыхания, заключающийся в определении макрофагально-моноцитарных элементов бронхо-альвеолярной жидкости (БАЛЖ). Для активного туберкулеза характерно преобладание малых, резко базофильных макрофагов с высоким содержанием кислой фосфатазы, а для саркоидоза - светлых клеток крупного размера без включений (молодые эпителиоидные клетки), моноцитов и вакуолизированных макрофагов с мелкими включениями в цитоплазме и низкой активностью кислой фосфатазы (Г.М.Николаева и соавт. // Пробл. туберкулеза. -1989. - №11. - С.33-37).

Недостатком данного способа является необходимость получения БАЛЖ у больных и отсутствие четких данных об эффективности метода.

Известен способ диагностики саркоидоза, заключающийся в иммунологическом исследовании, включающим, в частности, определение уровня противотуберкулезных антител в реакциях непрямой гемагглютинации, потребления комплемента, пассивного гемолиза, в реакции бласттрансформации лимфоцитов с туберкулином и фитогемагглютинином. Характерным для саркоидоза является резкое снижение специфического клеточного ответа и числа Т-лимфоцитов (менее 500 клеток в 1 мкл крови). При отсутствии специфических антител эти показатели имеют место у 68,2% больных саркоидозом. У больных туберкулезом и раком легких это наблюдается лишь в 9,1% случаев (Б.Е.Кноринг и соавт. // Пробл. туберкулеза. - 1991. - №7. - С.53-56).

Недостатком данного способа является необходимость подкожного введения туберкулина и фитогемагглютинина, что может привести к известным реакциям (местная, очаговая, общая) и к обострению заболевания.

Известен способ дифференциальной диагностики туберкулеза и саркоидоза органов дыхания, заключающийся в определении уровня общего липидного фосфора (ОЛФ) в бесклеточной фракции БАЛЖ. В сомнительных случаях, когда содержание ОЛФ в БАЛЖ превышает характерную для туберкулеза границу (21,36 мкмоль Р/л), можно утверждать с вероятностью 98,3%, что у пациента нет туберкулеза (А.Д.Таганович, И.Л.Котович, Г.Л.Бородина // Пробл. туберкулеза. - 2002. - №8. - С.23-26).

Недостатком метода является необходимость получения БАЛЖ, а также наличие дорогостоящей аппаратуры для выполнения двухмерной тонкослойной хроматографии с целью получения отдельной фракции дипальмитоилфосфатидилхолина.

Известен способ дифференциальной диагностики туберкулеза и саркоидоза легких, заключающийся в определении миграционной способности нейтрофилов при воздействии на них туберкулином. Миграционная способность нейтрофильных гранулоцитов больных туберкулезом повышается в присутствии специфического антигена. У больных саркоидозом, как и у здоровых лиц, туберкулин не оказывает действия на спонтанную миграцию клеток. Для верификации диагноза вычисляют индекс миграции (ИМ) по формуле: ИМ=опыт/контроль. При туберкулезе ИМ больше 1, составляя в среднем 1,3±0,07. При саркоидозе ИМ не превышает 1 (Н.А.Тышко, Л.П.Кадан // Лабор. дело. - 1991. - №4. - С.25-27).

Недостатком данного способа является необходимость при каждом исследовании забирать кровь из вены у практически здоровых людей (доноров).

Имеется способ дифференциальной диагностики туберкулеза и саркоидоза органов дыхания, заключающийся в определении у больных в сыворотке крови общей антирадикальной активности (АРА) и диеновых коньюгатов (ДК), отражающих интенсивность процессов перекисного окисления липидов и уровень антиоксидантной защиты. У больных саркоидозом органов дыхания уровень ДК и АРА был достоверно более высоким, чем у больных туберкулезом. У первых уровень ДК в сыворотку крови составлял 8,7±0,35 мкмоль в пробе. При этом повышенный уровень ДК в сыворотке был отмечен у 96,3% больных. При туберкулезе легких повышение уровня ДК было отмечено у 83% больных; средний уровень их был достоверно ниже (6,52±0,28 мкмоль в пробе; Р<0,001), чем у больных саркоидозом (З.И.Костина, Т.В.Котенко, Т.И.Обросова // Пробл. туберкулеза. - 1988. - №7. - С.21-25).

Недостатком способа является отсутствие четких критериев, позволяющих установить диагноз.

Наиболее эффективным методом диагностики саркоидоза органов дыхания является чрезбронхиальная биопсия легких, слизистой оболочки бронхов, внутригрудных лимфатических узлов (ВГЛУ). Эффективность метода составляет 80-85% (А.Г.Хоменко и соавт. // Пробл. туберкулеза. - 1996. - №6. - С.64-68; С.Е.Борисов и соавт. // Пробл. туберкулеза. - 2003. - №11. - С.42-55).

Недостатком данного способа является его инвазивность.

Имеется способ дифференциальной диагностики туберкулеза и саркоидоза органов дыхания, заключающийся в определении активных форм кислорода хемилюминисцентным методом в альвеолярных макрофагах и макрофагах из биоптата ткани легкого (Н.Е.Араблинская: Дис.... канд. мед. наук. М. - 2001. - 117 с.). Ведущим критерием для нозологической диагностики этих заболеваний является время возникновения индуцированной хемилюминисценции альвеолярных макрофагов в ответ на стимуляцию микобактериями штамма BCG (4,4±1,1 мин при активном туберкулезе и 18,8±3,3 мин при активном саркоидозе).

Недостатками являются сравнительно невысокая точность и определенные технические сложности (необходимость получения БАЛЖ и альвеолярных макрофагов путем фильтрования лаважной жидкости через капроновый фильтр, дальнейшее центрифугирование, добавление к осадку раствора Хенкса, подсчет в камере Горяева количества выделенных альвеолярных макрофагов) и необходимость наличия дорогостоящей аппаратуры для исследования хемилюминисценции.

Задачей изобретения является повышение точности дифференциальной диагностики туберкулеза и саркоидоза органов дыхания и ее упрощение.

Эта задача решается путем определения в фагоцитах крови уровня неферментных катионных белков (КБ) и активности миелопероксидазы (МП) и при содержании КБ более 105 усл.ед. и нормальной и повышенной активности МП в клетках диагностируют саркоидоз органов дыхания, а при содержании КБ менее 105 усл.ед. и пониженной активности МП диагностируют туберкулез легких.

Практически метод осуществляется следующим способом.

Для определения в фагоцитах крови КБ и МП из локтевой вены в пробирку с 0,1 мл гепарина и 0,9 мл физиологического раствора отбирают 5 мл крови. Затем добавляют 1 мл 10% раствора желатина и помещают в термостат при 37°С на 30-40 минут для оседания эритроцитов. Плазму отбирают и центрифугируют 10 минут при 1000 об/мин, надосадочную жидкость забирают, а к осадку добавляют 2 мл физиологического раствора, ресуспензируют и подсчитывают количество лейкоцитов в камере Горяева. Затем лейкоцитарную взвесь разводят физиологическим раствором до концентрации клеток в 2 млн/мл.

Лейкоцитарную суспензию с концентрацией клеток 2 млн/мл вносят в лунки плоскодонного планшета по 100 мкл в лунку, в триплетах на каждого больного (в одной лунке - 200 тысяч клеток). После 60 минут инкубации при температуре 37°С надосадок забирают, а оставшийся клеточный монослой дважды отмывают физиологическим раствором.

Для определения содержания неферментных КБ к адгезированным на плашке и отмытым лейкоцитам добавляют 0,1% раствор зеленого прочного (100 мг зеленого прочного растворяют в 100 мл метанолового трис-буфера, рН 8,0-8,2) по 0,05 мл в лунку. После 30 минут инкубации при 37°С не фагоцитированный и не связанный с катионными белками краситель удаляют и дважды отмывают пробу физиологическим раствором. Внутриклеточно расположенный краситель растворяют диметилсульфоксидом (ДМСО), добавляя последний по 100 мкл в лунку. Затем измеряют оптическую плотность проб на иммуноферментном анализаторе Micro Reader 4 фирмы Hyperion (США) при длине волны 620 нм. Полученную цифру умножают на 100. Содержание неферментных КБ в фагоцитирующих клетках крови выражают в условных единицах (усл. ед.).

Для определения содержания МП в фагоцитах крови к адгезированным на плашке и отмытым лейкоцитам добавляют раствор ортофенилендиамина (ОФД) с перекисью водорода по 100 мкл в лунку. Последний получают, растворяя 4 мг ОФД в 10 мл фосфатно-цитратного буфера (рН 5,0) и добавляя 500 мкл 0,33% раствора перекиси водорода. После 10 минут инкубации при комнатной температуре реакцию останавливают добавлением 10% раствора серной кислоты по 100 мкл в лунку.

Оптическую плотность проб измеряют на иммуноферментном фотоэлектрическом анализаторе Lincey (Россия) при длине волны 492 нм. Полученное значение умножают на 100. Содержание МП в фагоцитирующих клетках крови выражают в усл.ед.

При содержании КБ в фагоцитах крови более 105 усл.ед. и нормальной и повышенной активности МП в клетках диагностируют саркоидоз органов дыхания в активной фазе. При содержании КБ в фагоцитах крови менее 105 усл.ед. и пониженной активности МП в клетках диагностируют активный туберкулез легких (таблица 1).

Таблица 1
	Характеристика патологического процесса
Показатели	Активный туберкулез легких	Саркоидоз органов дыхания, активная фаза
Неферментные КБ	<105 усл.ед.	>105 усл.ед.
МП	Пониженная активность	Повышенная или нормальная активность

Пример 1

Больная Г., 23 лет, госпитализирована в клинику НИИ фтизиопульмонологии ММА им. И.М.Сеченова для проведения лечения. Туберкулезные изменения в легких выявлены в начале апреля 2003 года при флюорографическом обследовании. При поступлении состояние больной удовлетворительное, жалобы на небольшую слабость. Кожные покровы и видимые слизистые нормальной окраски, чистые. Периферические лимфоузлы не увеличены. Тоны сердца ясные, пульс ритмичный, 80 уд/мин. Артериальное давление 110/70 мм рт.ст. Грудная клетка обычной формы.

Перкуторно-легочный звук; аускультативно - дыхание везикулярное, хрипы не выслушиваются. Частота дыхательных движений 14 в минуту. Язык чистый, живот мягкий, при пальпации безболезненный. Печень не выступает из-под края реберной дуги. Общий анализ крови: СОЭ - 8 мм/ч; лейк. - 5,6·10⁹ л^-1; эр. - 4,5·10¹² л^-1; Нв - 132 г/л; эоз. - 1%; лимф. - 31%; мон - 9%; с/я - 59%; п/я - 1%.

Биохимические показатели крови в пределах нормальных значений.

Общий анализ мочи без патологии. В мокроте микобактерии туберкулеза (МБТ) не найдены.

Рентгенологически в S2 правого легкого определяются множественные очаги с нечеткими контурами, большинство из которых мелкие. На остальном протяжении правого легкого и в левом легком патологических изменений не выявлено.

Диагноз: очаговый туберкулез легких в фазе инфильтрации, МБТ - (не обнаружены).

При обследовании активность МП в фагоцитах крови - 27 усл.ед., содержание КБ - 76 усл.ед. Полученные данные (пониженная активность МП при КБ менее 105 усл.ед.) характерны для активного туберкулеза легких.

Пример 2

Больной С., 39 лет, в марте 2003 года перенес “острое респираторное заболевание”. При рентгенологическом обследовании выявлены изменения в легких. Для уточнения диагноза и лечения госпитализирован в клинику НИИ фтизиопульмонологии ММА им. И.М.Сеченова. При поступлении состояние относительно удовлетворительное, жалобы на редкий кашель, одышку при физической нагрузке. Кожные покровы и видимые слизистые нормальной окраски, чистые. Периферические лимфоузлы не увеличены. Тоны сердца ясные, пульс ритмичный, 76 уд/мин. Артериальное давление 120/80 мм рт.ст. Грудная клетка обычной формы. Перкуторно - легочный звук; аускультативно - дыхание везикулярное, хрипы не выслушиваются. Частота дыхательных движений 16 в минуту. Язык чистый, живот мягкий, при пальпации безболезненный. Печень не выступает из-под края реберной дуги. Общий анализ крови: СОЭ - 7 мм/ч; лейк - 7,5·10⁹ л^-1; эр. - 5,14·10¹² л^-1; Нв - 155 г/л; эоз. - 3%; лимф. - 27%; мон - 10%; с/я - 60%; п/я - 1%.

Общий анализ мочи без патологии.

Рентгенологически в обоих легких определяются немногочисленные средней интенсивности очаговоподобные тени с нечеткими контурами. Корни расширены за счет увеличения внутригрудных лимфатических узлов.

Бронхоскопия: компрессионная деформация трахеи и стенозы левого язычкового бронха и левого нижнедолевого бронха 1-3 ст. Произведена трансбронхиальная биопсия легкого. Морфологически верифицирован саркоидоз.

Диагноз: саркоидоз внутригрудных лимфатических узлов, легких, активная фаза.

При обследовании активность МП в фагоцитах крови 49 усл.ед., содержание КБ-119 усл.ед. Полученные данные (нормальные значения МП при КБ более 105 усл.ед.) характерны для активного саркоидоза органов дыхания.

Способ апробирован в клинике НИИ фтизиопульмонологии ММА им. И.М.Сеченова на 20 больных туберкулезом легких с процессами преимущественно продуктивного характера и торпидным течением заболевания и 34 больных саркоидозом органов дыхания в активной фазе без сопутствующих заболеваний (отличить саркоидоз от острых деструктивных форм туберкулеза легких не представляет затруднений). Результаты исследований представлены в таблице 2.

Таблица 2
Показатели	Характеристика патологического процесса
	Активный туберкулез легких (n=20)	Саркоидоз органов дыхания, активная фаза (n=34)
Неферментные КБ, усл.ед.	76±3,5*	93±5,7*
МП, усл.ед.	68±5,2*(n=15)	52±3,0*
	25±2,8*(n=5)
Примечание: нормальные значения МП - 40±2,2 усл.ед., КБ - 64±3,6 усл.ед.; n - число больных; * - достоверные изменения (Р<0,05) по сравнению с нормой; Различия в значениях КБ и МП больных активным туберкулезом легких и больных саркоидозом органов дыхания в активной фазе достоверны (Р<0,05).

Использование предлагаемого метода с помощью одновременного измерения активности МП и содержания КБ в фагоцитирующих клетках крови позволяет в 33,3% случаев установить диагноз туберкулеза или саркоидоза органов дыхания, что повышает точность дифференциальной диагностики и упрощает ее. Метод диагностики, взятый в качестве прототипа, более сложен в техническом исполнении и требует наличия дорогостоящей аппаратуры (автоматизированная система для исследования хемилюминисценции “Люцифер-Б”). Кроме того, авторы не указывают в каком проценте случаев можно установить диагноз с помощью данного метода.

Своевременное установление диагноза дает возможность уменьшить неоправданно частую терапию ex juvantibus, начать адекватное специализированное лечение больного в максимально ранние сроки, что обеспечит повышение эффективности терапии, исключит развитие “второй” - ятрогенной болезни. Таким образом, своевременное установление диагноза больным туберкулезом и саркоидозом органов дыхания обеспечивает экономический эффект, повышая эффективность лечения. Предложенный способ может найти применение в клинической практике фтизиатрии и пульмонологии. Способ информативен, воспроизводим.

Claims

Способ дифференциальной диагностики туберкулеза и саркоидоза органов дыхания, включающий исследование биосубстрата, отличающийся тем, что определяют в фагоцитах крови содержание неферментных катионных белков (КБ) и активность миелопероксидазы (МП) и при содержании КБ более 105 усл.ед. и нормальной и повышенной активности МП диагностируют саркоидоз, а при содержании КБ менее 105 усл.ед и пониженной активности МП - туберкулез легких.