CN105372431A - 一组结节病血清特异性标志蛋白及其检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属生物技术和医学检验领域，涉及一种用于识别结节病的检测试剂及其检测试剂盒。本发明利用蛋白芯片技术，将筛选出的差异蛋白用ELISA以及免疫组化的方法验证后，筛选其中的相关结节病与结核病的血清学差异蛋白，进行差异蛋白的血清浓度数据的统计学分析处理以及平行试验与序列实验的灵敏度及特异度分析处理，获得血清蛋白之间的差别后，基于ROC曲线对制备的诊断试剂及其试剂盒的检测效力进行评价。本发明为鉴别结节病和菌阴结核病提供了便捷的特异度及灵敏度高的检测试剂以及检测试剂盒。

Description

一组结节病血清特异性标志蛋白及其检测试剂盒

技术领域

本发明属生物技术和医学检验领域，涉及用于识别结节病的检测标志物及其检测试剂盒。尤其涉及一组结节病血清特异性标志蛋白及其检测试剂盒。

背景技术

临床研究显示，结节病病因不明，以非干酪性上皮样肉芽肿为病理特征，全身各个器官几乎均可受累，其中最为常见的受累器官是肺脏和胸内淋巴结。由于结节病临床表现多样且缺乏特异性，其确诊主要依靠排他性诊断，需要除外许多其他肉芽肿性疾病，其中最为困难的是结节病与菌阴结核病的鉴别诊断，尤其在中国这样的结核病高发国家显得更为突出。目前对于两者的鉴别诊断多集中在寻找结核杆菌的证据方面，而且多侧重于结核病的标志物的研究。有研究报道，结节病血清标志物有血清可溶性白细胞介素受体2(sIL-2R)，血清血管紧张素转化酶(SACE)和II型肺泡细胞表面抗原6(KL-6)等，但实践证实，这些标志物的敏感性和特异性并不理想，并且对于结节病和结核病的鉴别诊断方面未见后续报道。还有研究通过实时定量PCR方法检测结节病和结核病病理组织中结核分枝杆菌DNA，从病理组织角度建立结节病和菌阴结核病的鉴别诊断方法；以及通过建立临床-影像-病理综合评分系统用于二者的鉴别诊断，所述方法可以用于解决部分结节病与菌阴结核病的鉴别难题，但仍然存在假阳性和假阴性的问题，并且所述方法必须以取得病理活检为应用前提，而病理活检的方式及病理医师诊断经验常会对诊断的正确率产生很大的影响；

本申请的的发明人之前的研究中用结节病患者血清标本筛选出血清淀粉样物质A(SAA)作为诊断标志物，其诊断结节病特异度仅为52.5％，作为单一的指标用于结节病的诊断明显不足。

因此，寻找一种更为特异、敏感、简便、可靠的用于上述两种疾病的鉴别诊断的检测试剂及其检测试剂盒已成为本领域研究人员较为关注的问题。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种用于识别结节病的检测标志物及其检测试剂盒。

本发明中，所述的检测试剂含有一组或一组以上的相关结节病与结核病的血清学差异蛋白，本发明的实施例中筛选相关结节病与结核病的血清学差异蛋白瘦素(leptin)及细胞间粘附分子1(ICAM-1)。

本发明的另一目的是提供含有上述检测试剂的检测试剂盒。

所述的检测试剂盒包含固相和上述相关结节病与结核病的血清学差异蛋白，本发明的实施例中优选血清学差异蛋白leptin及ICAM-1。

本发明的另一目的是提供上述相关结节病与结核病的血清学差异蛋白leptin及ICAM-1在制备用于鉴别诊断结节病的检测试剂中的用途。

本发明通过下述技术方案实现：

利用蛋白芯片技术，将筛选出的差异蛋白用酶联免疫吸附试验(ELISA)以及免疫组化(IHC)的方法验证后，筛选其中的相关结节病与结核病的血清学差异蛋白，本发明的实施例中优选血清学差异蛋白leptin及ICAM-1；进一步的进行所述的差异蛋白的血清浓度数据的统计学分析处理以及平行试验与序列实验的灵敏度及特异度分析处理，确定相关结节病与结核病的血清学差异蛋白，尤其是差异蛋白leptin及ICAM-1联合用于检测结节病与结核病的血清浓度，为鉴别结节病和菌阴结核病提供便捷的特异度及灵敏度高的检测试剂以及检测试剂盒。

本发明中，还提供了采用所述的检测试剂以及检测试剂盒对于结节病以及菌阴结核病进行检测的方法及其模型。

本发明通过检测血清中差异表达的蛋白，联合采用统计学的方法分析处理，在不需取得活检组织的情况下，仅仅通过检测患者的血清蛋白，既能在一定程度上获得两种疾病的血清蛋白之间的差别后，基于受试者工作特征曲线(ROCcurve)对制备的诊断试剂及其试剂盒的检测效力进行评价。

本发明中将上述的相关结节病与结核病的血清学差异蛋白，尤其是差异蛋白leptin及ICAM-1运用ROC曲线、逻辑回归(logisticregression)及平行序列实验分析等统计学方法建立一组鉴别模型，对所述的差异蛋白的血清浓度数据以及平行试验与序列实验的灵敏度及特异度分析处理，确定相关结节病与结核病的血清学差异蛋白表达的差异，尤其是差异蛋白leptin及ICAM-1联合或单独使用的差异，分析结果有利于鉴别诊断参考。

本发明中，采用所述的检测试剂盒通过下述步骤对结节病以及菌阴结核病进行检测：

1)包被

取所要包被的商品化leptin和ICAM-1抗体，设计所需浓度，根据各包被孔数计算所需包被物的量，用包被液稀释至所需体积，分加至各孔中：

包被条件：ELISA板直接置4℃过夜；或先置37℃孵育2小时再转入4℃过夜；

2洗涤

包被结束后弃掉包被液，用PBST进行洗涤，方法为PBST加满每孔，静置5-10min，弃掉洗液，重新加满，重复洗涤3-5次，最后拍干ELISA板等待下一步封闭；

3封闭

常用10％小牛血清，取步骤2的ELISA板加封闭液至每孔，体积至少为所加包被液的两倍；封闭条件：置于4℃过夜，或置于37℃温育2-4h；

4洗涤

封闭结束的ELISA板进行洗涤，方法同步骤2，排干ELISA板；

5加入待检样品(血清)

按实验所需稀释倍数用包被液稀释进行稀释，至所需浓度后加入相应孔中，反应条件为37℃孵育2h；

6洗涤

具体同步骤4；

7加相应HRP-标记的商品化二抗

加相应的商品化HRP-标记的二抗(如一抗为鼠源物质则对应加抗鼠二抗)，一般也用封闭液稀释，稀释倍数参考二抗说明书；将稀释好的二抗加入各孔，37℃反应1-1.5h；

8再洗涤

具体同步骤4；

9显色

用商品化TMB显色液作为底物，显色液分加至ELISA各孔中；然后将ELISA板置于37℃反应约10min；

10终止：

取出ELISA板，每孔加终止液(2mol/L硫酸溶液)终止反应，立即到酶标仪上读数(波长为450nm)，根据cutoff值判断对结节病鉴别效力程度。

本发明的一个实施例中，ICAM-1的cutoff值为57740pg/ml，Leptin的cutoff值为1193.186pg/ml。

本发明实验研究结果表明，通过蛋白芯片技术发现差异表达蛋白，经ELISA及免疫组化鉴定的leptin及ICAM-1两种因子经过统计学模型的建立，为两者的鉴别诊断提供有意义的辅助。该模型并不仅限于所述的差异蛋白leptin及ICAM-1，还可以用于验证存在差异表达的所有可能的差异蛋白，分别分析不同联合组合的鉴别效力。

本发明的优点在于：

本发明进行了免疫组化实验，验证了所述的差异蛋白Leptin、ICAM-1在结节病肺组织及纵膈淋巴结中表达阳性率明显高于结核病组，两者表达有明显差异；并进行了两种差异蛋白-细胞因子的血清浓度数据的统计学分析处理以及平行试验与序列实验的灵敏度及特异度分析处理，结果显示，所述的相关结节病与结核病的血清学差异蛋白，尤其是差异蛋白leptin及ICAM-1联合用于检测结节病与结核病的血清后，特异度为73.1％，敏感度为86.5％。

附图说明

图1为单因素方差分析及事后比较检验(PostHocTests)分析组间差异因子，

其中显示，结节病分别与结核病和健康对照组间Leptin、ICAM-1差异均有显著意义；结核病与健康组间两种因子均无统计学差异(p＞0.05)；血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)在三组间均无差异。

图2为免疫组化验证活检组织中差异蛋白的表达，

其中显示，Leptin在结节病肺组织中呈强阳性表达，弥漫性分布在肉芽肿及周围，而结核病肺组织中肉芽肿为非特异性染色；Leptin在结节病淋巴结肉芽肿中央较浓聚，表达呈强阳性，而其在结核病淋巴结肉芽肿中央有弱阳性表达，两者表达有明显差异。

图3为免疫组化验证活检组织中差异蛋白的表达，

其中显示，ICAM-1在结节病肺组织及淋巴结中强阳性表达，呈弥漫性和簇状分布，结核病肺组织中肉芽肿周围为非特异性染色或者弱阳性表达。

图4为ROC曲线模型，

其中分别显示了BMI、leptin、ICAM-1三者单独检测结节病和结核的ROC曲线与运用logstic回归联合形成联合因子检测结节病和结核病的ROC曲线。

具体实施方式

实施例1

1)蛋白芯片血清差异蛋白分析

收集结节病以及健康献血者的外周血血清各3例，首先用蛋白芯片技术(RayBiotechHumanCytokineAntibodyArrayGSeries1000)初筛比较3例结节病患者及3例健康人血清中120种重要的炎症细胞因子水平，根据结果及文献报道定制了包括30种重要分子的蛋白芯片(RayBiotechQAH-CUST)；运用生物芯片系统分析所述细胞因子在结节病(20例)及对照组(结核病组20例、正常对照组20例)外周血血清中的含量；

所用试剂盒为广州RayBiotech公司定制的抗体芯片，扫描仪为美国Axon公司Genepix荧光扫描仪；实验步骤按其说明书进行，采用Genepix荧光扫描仪Cy3通道扫描信号，QAH-CUST-G数据分析软件进行数据分析；

蛋白芯片血清差异蛋白分析结果如表1所示，筛选出结节病与结核病组之间3个差异蛋白分别为ICAM-1，Leptin，PDGF-BB，P＜0.05。

表1蛋白芯片筛选结果

*a、SA结节病，TB结核病，HC健康对照

*b、p＜0.05，/表示未检测到浓度。

2)用ELISA验证蛋白芯片初筛出血清中的差异蛋白

将蛋白芯片的初筛结果扩大样本量运用ELISA验证，ICAM-1、Leptin、PDGF-BBELISA试剂盒购自上海欣奥盛公司(NeobioscienceTechnologyCompanyLimited)，实验所用酶标仪为BioTekInstruments公司ELX808，操作步骤按试剂盒说明书进行；在450nm波长下测定吸光度值，计算各样品浓度；

相关分析结果显示，leptin在血清中含量与BMI成正相关(p＜0.0001)，r＝0.549(Pearson相关系数)，显示两者显著相关；回归分析显示BMI与leptin含量存在直线回归关系(P＜0.001)，即leptin随着BMI的增加而升高；这与leptin表达与体重有关的报道一致，为了排除体重对leptin的影响，以BMI为协变量，做结节病组与结核病组对leptin血清浓度影响的协方差分析，经校正后的结节病和结核病组leptin血清浓度统计分析结果P＝0.013，表明去除BMI的影响后，结节病和结核病组间leptin血清浓度仍存在显著差异。

3)免疫组化验证活检组织中差异蛋白的表达

运用免疫组化SABC法验证差异蛋白在结节病及结核病肉芽肿肺组织和淋巴结中的表达情况，其中结节病组活检淋巴结14例，肺组织4例，结核病组淋巴结9例，肺组织3例，均为石蜡包埋组织，切片厚度5um，使用表面经正电荷处理的粘附载玻片(AdhesionMicroscopeSlides)承载组织切片以防止脱片；

试验采用的ABC免疫组化试剂盒试剂盒购自美国Vectorlabs公司，DAB显色液购自上海欣博盛生物科技有限公司，anti-leptin购自英国Abcam公司，anti-ICAM-1购自美国ePitomics公司；实验步骤按ABC免疫组化试剂盒说明书进行；

上述肉芽肿组织标本免疫组化方法验证结果表明，Leptin、ICAM-1在结节病肺组织及纵膈淋巴结中表达阳性率明显高于结核病组(如图2，图3所示)，证明所述的两个细胞因子可作为血清标志物制备诊断结节病的诊断试剂及其试剂盒。

4)统计学处理及建立ROC曲线模型

有关实验均重复三次，Graphpadprism5及spss19.0处理数据，数据表示为均值(mean)±标准差(standarddeviation，SD)；统计分析：结节病及对照组蛋白芯片及ELISA各组数据比较采用方差齐性的独立样本T-检验(independent-samplesTtestsassumingequalvariance)和单因素方差分析(One-WayANOVA)，单因素方差分析的事后检验(PostHocTests)采用方差齐性的LSD(Least-significantdifference)和S-N-K(N-K，Student-Newman-Keuls)检验，以及方差不齐时的Tamhane检验，相关分析(correlationanalysis)和回归分析(Regressionanalysis)用于BMI和leptin血清浓度的分析，协方差分析(Analysisofcovariance)用于排除BMI对于leptin浓度的影响进行结节病及结核病组的leptin血清浓度分析，ELISA部分的数据运用spss19.0绘制ROC曲线，取约登指数(约登指数＝灵敏度+特异度-1)最大时的最佳临界拷贝数(Cutoff值)为定量标准，联合检测效力运用logistic回归构建预测方程进行评价，并将两种指标进行序列实验(serialtest)和平行试验(paralleltest)初步验证检测效力；p＜0.05认为具有统计学差异。

基于ROC曲线对制备的诊断试剂及其试剂盒的检测效力的评价：

将ELISA方法所检测的血清ICAM-1和leptin含量，用于建立判断结节病(n＝89)与结核病(n＝89)ROC(受试者工作特征曲线)，均取约登指数(如表2，表3所示)为最大时确定cutoff值，ICAM-1(cutoff值57740pg/ml)曲线下面积(AUC)、敏感性和特异性为0.672、87.6％和62.6％，Leptin(cutoff值1193.186pg/ml)曲线下面积、敏感性和特异性为0.742、60.7％和70.3％，将两者用logistic回归形成联合预测因子构建方程，运用联合预测因子诊断时曲线下面积、敏感性和特异性分别为0.760、88.8％和62.6％，基于BMI在两种疾病中差异显著，将BMI构建入回归方程建立预测因子，诊断预测概率的曲线下面积、敏感性和特异性分别为0.837、90.9％和64.4％，加入BMI后曲线下面积大于其它情况，即诊断价值最大；拒绝无效假设(AUC＝0.5)；

表2.leptin及ICAM-1鉴别诊断结节病及结核病的ROC曲线下面积及其95％置信区间：

a.非参数假设条件b.无效假设：AUC＝0.5

曲线下面积AUCleptin(0.763)＞ICAM-1(0.718)，表示两者相比较，leptin对于两种疾病的鉴别诊断诊断价值高于ICAM-1，当将BMI与Leptin两者或BMI、leptin与ICAM-1三者构建logistic回归方程鉴别诊断时AUC(0.821、0.837)均高于三者单独诊断(0.801、0.763、0.718)，说明两者联合运用logistic回归方程鉴别诊断两种疾病的价值高于单个指标。

表3..ROC曲线鉴别诊断结节病与结核病的cutoff值、灵敏度、特异度

其中，*aPRE＝Predictionprobability；

*b.将BMI及leptin的值带入构建的logistic方程，如果PRE-BMIandleptin预测值大于0.5076，此例患者倾向于考虑为结节病的可能性，反之则倾向于考虑为结核的可能性；

*c.将leptin及ICAM-1的值带入构建的logistic方程，如果PRE-leptinandICAM-1预测值大于等于0.4080，此例患者倾向于考虑为结节病的可能性，反之则倾向于考虑为结核病的可能性；

*d.将BMI、leptin及ICAM-1的值带入构建的logistic方程，如果PRE-leptinandICAM-1预测值大于等于0.3651，则该患例倾向于考虑为结节病的可能性，反之则倾向于考虑为结核病的可能性；

5)平行试验与序列实验

基于临床实践中常用的将多种指标进行指标联合的平行和序列实验，平行试验(paralleltest)又称为并列实验，当两个指标其中之一为阳性时即可判断为阳性，可以提高敏感性，降低漏诊率；序列实验(serialtest)又称为串联实验，必须两个或多个指标均为阳性时才可判断为阳性，可提高特异性，降低误诊率；

本实施例中，进一步进行了平行试验与序列实验，

由于BMI在结节病和结核病组中差异同leptin浓度呈正相关，本实施例中将BMI与leptin两者联合进行序列实验(serialtest)，取BMI＞21.6和leptin＞1193.186时视为leptin单独鉴别诊断的指标，特异度可达到92.0％，敏感度为64.2％，将两种因子进行序列实验BMI＞21.6和leptin＞1193.186和ICAM-1＞57740时特异度为96.9％，但敏感度仅为40％；本实施例中优选将BMI和leptin串联联合后再将其与ICAM-1并联用于检测所述蛋白在结节病和结核病中表达的差异，特异度为73.1％，而敏感度为86.5％(如表4所示)。

表4..平行试验与序列实验检测的灵敏度及特异度

其中，*a.paralleltest：leptin和ICAM-1中的一项大于等于前文所列cutoff值即考虑为结节病的可能性。

*b.serialtest：三个参数不同组合，需组合中的全部参数均各自大于等于cutoff值才可考虑结节病可能，反之则考虑为结核病的可能。

*c：serialandparalleltest：将BMI与leptin组合进行序列实验后与ICAM-1进行平行试验，取BMI＞＝21.6且leptin＞＝1193.186或者ICAM-1＞＝57740时考虑结节病的可能。

本发明中，有关名词定义及参数定义的中英文对照如表5所示。

表5

BMI	体重指数
		sIL-2R	血清可溶性白细胞介素受体2
SACE	血清血管紧张素转化酶
		KL-6	II型肺泡细胞表面抗原6
SAA	血清淀粉样物质A
		leptin	瘦素
ICAM-1	细胞间粘附分子1
		ELISA	酶联免疫吸附试验
IHC	免疫组化
		ROC curve	受试者工作特征曲线
logistic regression	逻辑回归分析
		Post Hoc Tests	事后比较检验
PDGF-BB	血小板衍生生长因子BB
		standard deviation，SD	标准差
correlation analysis	相关分析
		serial test	序列实验
parallel test	平行试验
		Area Under The Curve，AUC	曲线下面积
Prediction probability，PRE	预测概率

Sarcoidosis，SA	结节病
		Tuberculosis，TB	结核病
Helath Control，HC	健康对照

Claims (7)

1.一种用于识别结节病的检测试剂，其特征在于，所述的检测试剂含有一组或一组以上的相关结节病与结核病的血清学差异蛋白。

2.按权利要求1所述的用于鉴别诊断结节病的检测试剂，其特征在于，所述的相关结节病与结核病的血清学差异蛋白是leptin及ICAM-1。

3.一种含有权利要求1所述的检测试剂的检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒包含固相和所述的相关结节病与结核病的血清学差异蛋白。

4.按权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的相关结节病与结核病的血清学差异蛋白是leptin及ICAM-1。

5.相关结节病与结核病的血清学差异蛋白leptin及ICAM-1在制备用于鉴别诊断结节病的检测试剂中的用途。

6.按权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的检测试剂以及检测试剂盒用过下述方法对结节病以及菌阴结核病进行检测：

通过检测血清中差异表达的蛋白，联合采用统计学的方法分析处理，获得结节病以及菌阴结核病的血清蛋白之间的差别后，基于ROC曲线对制备的诊断试剂及其试剂盒的检测效力进行评价，包括下述步骤：

1)包被：取所要包被的leptin和ICAM-1抗体，设计所需浓度，根据各包被孔数计算所需包被物的量，用包被液稀释至所需体积，分加至各孔中：

包被条件：ELISA板直接置4℃过夜；或先置37℃孵育2小时再转入4℃过夜；

2)洗涤：包被结束后弃掉包被液，用PBST进行洗涤，方法为PBST加满每孔，静置5-10min，弃掉洗液，重新加满，重复洗涤3-5次，最后拍干ELISA板等待下一步封闭；

3)封闭：用10％小牛血清，取步骤2的ELISA板加封闭液至每孔，体积至少为所加包被液的两倍；封闭条件：置于4℃过夜，或置于37℃温育2-4h；

4)洗涤：封闭结束的ELISA板进行洗涤，方法同步骤2，排干ELISA板；

5)加入待检样品血清，按实验所需稀释倍数用包被液稀释进行稀释，至所需浓度后加入相应孔中，反应条件为37℃孵育2h；

6)洗涤：具体同步骤4；

7)加相应HRP-标记的商品化二抗：加相应的HRP-标记的二抗，用封闭液稀释，将稀释好的二抗加入各孔，37℃反应1-1.5h；

8)再洗涤，同步骤4；

9)显色：用TMB显色液作为底物，显色液分加至ELISA各孔中；然后将ELISA板置于37℃反应约10min；

10)终止：取出ELISA板，每孔加终止液2mol/L硫酸溶液终止反应，到酶标仪上读数，波长为450nm，根据cutoff值判断对结节病鉴别效力程度。

7.按权利要求6的用途，其特征在于，所述的检测步骤中，所述的ICAM-1的cutoff值为57740pg/ml，Leptin的cutoff值为1193.186pg/ml。