CN110437322B

CN110437322B - 一种用于结核病诊断的标记物及其应用

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Publication number: CN110437322B
Application number: CN201910817382.XA
Authority: CN
Inventors: 戈宝学; 杨华; 刘忠华; 黄晓辰; 王洁
Original assignee: Shanghai Pulmonary Hospital
Current assignee: Shanghai Pulmonary Hospital
Priority date: 2019-08-30
Filing date: 2019-08-30
Publication date: 2021-11-30
Anticipated expiration: 2039-08-30
Also published as: CN110437322A

Abstract

本发明涉及结核分枝杆菌Rv0859蛋白在诊断结核病中作为诊断标记物，所述Rv0859蛋白是SEQ ID No.1所示的氨基酸序列或为该序列的变体且与其具有相同功能的蛋白质；本发明还涉及抗Rv0859蛋白的抗体的制备，以及以抗Rv0859抗体为活性成分的诊断结核病的检测应用。本发明通过定量蛋白组学的方法，验证后发现Rv0859蛋白在厌氧培养条件下分泌水平显著提高，可作为标识物用于结核病的诊断；并对Rv0859进行了体外重组表达，利用重组蛋白作为抗原免疫动物，获得了高浓度的纯化抗Rv0859抗体，且验证该抗体可以特异性检测出结核分枝杆菌的Rv0859蛋白；且在获得有效抗体的基础上，建立了以Rv0859为检测标识物的免疫组化检测方法，其提示可以应用抗Rv0859抗体，建立结核病的免疫组化检测新方法。

Description

一种用于结核病诊断的标记物及其应用

技术领域

本发明涉及结核病技术领域，尤其涉及一种用于结核病诊断的标记物及其应用，该标记物为Rv0859蛋白。

背景技术

结核病是WHO重点控制的传染性疾病，目前仍是严重危害人民健康的公共卫生问题。据有关资料统计，全球约有1/3的人口感染结核分枝杆菌，现有结核病人约2000万，每年新发病800万～1000万人，每年约有200万人死于结核病，是其它所有传染病死亡人数的总和。我国的结核病疫情极其严峻，现有结核感染者5亿，占全球的1/4，每年有13万人死于结核病，为其它各类传染病和寄生虫病死亡人数总和的2倍。

目前结核病控制存在的最主要问题是病人发现率低，治愈率低。临床上诊断结核病使用X线、病理切片、抗酸染色等方法。但X线影像仪器复杂，成本高，且准确率不高，常会出现误诊或漏诊。PPD试验虽为检测该疾病的常用方法，但其假阳性较高。痰标本抗酸染色法，培养或分子生物学检测手段只能应用于排痰的肺结核病人。在面对无痰病人，以及肺部结节鉴别诊断、肺外结核的诊断问题时，现有的检查方法均存在着一定的局限性，难以达到快速、准确的结核病诊断。因此，加大结核分枝杆菌的基础研究，寻找快速、灵敏、简便、实用的结核病诊断新方法，提高结核病人的检出率，是目前结核病研究需要迫切解决的问题。

病理学诊断作为肺结核、肺外结核确诊及鉴别诊断的重要手段，主要采用苏木素一伊红(HE)染色及抗酸染色进行诊断。结核病的主要组织病理学特征是肉芽肿性炎症，病变内可见类上皮细胞、郎罕巨细胞及干酪样坏死等。但由于其他感染性或非感染性疾病，如结节病也可能会出现类似病理变化，因此仅靠形态学无法进行确诊，必须要在病灶中找到病原学依据。抗酸染色是寻找病原学依据的重要途径，但其敏感度低，寻找抗酸杆菌费时费力。在肿瘤等多种疾病的病理学诊断中，免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)检测是进行疾病诊断、疾病分型及制定个体化治疗方案的重要手段，但在结核病诊断中的应用较少。IHC检测在高倍镜下即可获得明确信号，而抗酸染色法因为菌量少，大多数情况下需要使用油镜才能找到抗酸杆菌或确定为抗酸杆菌。因此，IHC检测相比抗酸染色法可以大幅度提高阅片诊断速度。IHC检测的是蛋白，与检测菌体本身相比具有更好的敏感度，且观察更为便捷，但如何提高IHC特异性显色信号强度与范围，提高检测敏感度与特异性是目前急需解决的主要难点，主要原因是难以得到高敏感性、高特异性的检测标识物。

因此，发现敏感性和特异性均较好的检测蛋白标志物，制备高亲和力高特异性检测一抗，对于开发有效的病理免疫组化检测方法具有重要意义。

发明内容

为了克服现有技术中的缺陷，本发明应用蛋白组学，鉴定获得可以用于结核病诊断的高灵敏度及高特异性标识分子，并进一步用于病理标本的免疫组化检测。

相应研究已表明，厌氧环境是结核分枝杆菌在宿主体内存活面对的主要不利条件之一。结核分枝杆菌可以通过分泌特定蛋白，适应宿主体内不利的厌氧条件，进而干扰宿主的免疫应答，在感染病灶长期定植并存活下去。应用定量蛋白组学的方法，对结核分枝杆菌在体外有氧、厌氧培养条件下的培养滤过上清的蛋白成分进行鉴定及相对定量分析，发现某些蛋白在厌氧条件下分泌水平显著上升。这些高水平分泌的蛋白，不仅可能在体内作为毒力因子调控宿主的免疫应答，也有可能作为结核分枝杆菌在体内定植并存活的标识物用于结核病的诊断。

为了实现上述目的，本发明采取的技术措施包括：

本发明的第一个方面是提供一种用于结核病诊断的标记物，所述标记物为Rv0859蛋白。

进一步地，所述Rv0859蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或者所述Rv0859蛋白为SEQ ID No.1序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与该序列具有相同功能的蛋白质。

上述SEQ ID No.1所示序列具体如下：

MSEEAFIYEAIRTPRGKQKNGSLHEVKPLSLVVGLIDELRKRHPDLDENLISDVILGCVSPVGDQGGDIARAAVLASGMPVTSGGVQLNRFCASGLEAVNTAAQKVRSGWDDLVLAGGVESMSRVPMGSDGGAMGLDPATNYDVMFVPQSIGADLIATIEGFSREDVDAYALRSQQKAAEAWSGGYFAKSVVPVRDQNGLLILDHDEHMRPDTTKEGLAKLKPAFEGLAALGGFDDVALQKYHWVEKINHVHTGGNSSGIVDGAALVMIGSAAAGKLQGLTPRARIVATATSGADPVIMLTGPTPATRKVLDRAGLTVDDIDLFELNEAFASVVLKFQKDLNIPDEKLNVNGGAIAMGHPLGATGAMILGTMVDELERRNARRALITLCIGGGMGVATIIERV。

进一步地，所述Rv0859蛋白在厌氧条件下分泌水平显著上升，促进结核分枝杆菌在体内定植并存活，且在体内作为毒力因子调控宿主的免疫应答。

本发明的第二个方面是提供一种用于检测任一上述Rv0859蛋白的特异性抗体，所述抗体为抗Rv0859多克隆抗体。

进一步地，所述抗Rv0859多克隆抗体的制备步骤如下：

步骤A.大肠杆菌中进行Rv0859蛋白原核表达：以结核分枝杆菌基因组DNA为模板通过PCR克隆获得蛋白Rv0859的基因编码片段，将片段连接到载体，转化到大肠杆菌中扩增，获得纯度达到免疫要求的原核表达的Rv0859蛋白；

步骤B.抗Rv0859多克隆抗体的制备：将步骤A获得的原核表达的Rv0859蛋白，免疫动物；免疫周期结束后，采血，分离血清，进行血清中抗体效价的检测；将检测结果满足纯化要求的血清进行抗原亲和纯化，得到浓缩后的抗Rv0859多克隆抗体。

进一步地，所述步骤A中，所述载体为pET-28a-SUMO载体，所述大肠杆菌为大肠杆菌DH5-Alpha或大肠杆菌Rosetta。

进一步地，所述步骤B中，所述动物采用大白兔，其免疫流程如下：

第一次免疫1天，免疫剂量：0.6mg；免疫佐剂：完全弗氏佐剂；

第二次免疫12天，免疫剂量：0.3mg；免疫佐剂：不完全弗氏佐剂；

第三次免疫26天，免疫剂量：0.3mg；免疫佐剂：不完全弗氏佐剂；

第四次免疫40天，免疫剂量：0.3mg；免疫佐剂：不完全弗氏佐剂。

进一步地，所述步骤B中，采用pET-28a-SUMO-Rv0859蛋白作抗原亲和纯化。

本发明为了验证这些厌氧高水平分沁蛋白在结核病诊断中的应用价值，对这些蛋白进行原核重组表达，获得高纯度的可溶性重组蛋白，进一步利用重组蛋白作为抗原免疫动物，经过亲和纯化后，获得特异性针对这些抗原的高亲和力多克隆抗体，定量后利用ELISA、WB等方法验证抗体的亲和力和特异性。

本发明的第三个方面是提供一种含有任一上述抗Rv0859多克隆抗体的试剂盒，其用于辅助诊断结核病。

本发明的第四个方面是一种基于非诊断目的(例如仅用作研究或检测Rv0859蛋白含量等)的Rv0859蛋白免疫组化检测方法，其包括如下步骤：切片标本脱蜡至水；抗原修复；阻断内源性过氧化物酶；血清封闭；加一抗，所述一抗任一上述的抗Rv0859多克隆抗体；加二抗，所述二抗为与一抗相应种属的抗体；DAB显色；复染细胞核；脱水封片；观察结果：光学显微镜下观察DAB染色结果，判断是否出现黄色或棕色颗粒。

本发明利用特异性针对结核分枝杆菌特征蛋白的高亲和力抗体，建立免疫组化检测方法，其采用的一抗为制备的特异性多抗，其余步骤参考标准的免疫组化检测方法。进而对不同疾病来源的病理切片标本，进行免疫组化检测，判断该方法的检测效果。

与现有技术相比，本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：

1.本发明通过定量蛋白组学的方法，对结核分枝杆菌在体外有氧、厌氧培养条件下的培养滤过上清的蛋白成分进行鉴定及相对定量分析，发现了22个在厌氧条件下表达水平上调的分泌蛋白，进一步验证后发现Rv0859蛋白在厌氧培养条件下分泌水平显著提高，有可能参与结核分枝杆菌的厌氧适应性反应并调控宿主的免疫应答，也有可能作为结核分枝杆菌在体内厌氧环境定植并存活的标识物用于结核病的诊断。

2.本发明对Rv0859进行了体外重组表达，获得了高纯度，高浓度的可溶性重组蛋白。利用重组蛋白作为抗原，免疫了两只实验级日本大耳白兔，对免疫后血清进行了亲和纯化，获得了高浓度的纯化抗体，ELISA检测血清的效价达到1：512K，WB检测两种抗体1：1000稀释可检测到500pg抗原，抗体可以特异性检测出结核分枝杆菌的Rv0859蛋白，而Rv0859基因敲除后，抗体没有杂交条带，提示了抗Rv0859抗体的高亲和力以及高特异性。

3.在获得有效抗体的基础上，本发明建立了以Rv0859为检测标识物的免疫组化检测方法，并对确诊的结核病人，结节病人的病理切片进行了检测，结果在显微镜下观察，可以发现结核病人病理标本病变部位的胞质内出现典型的黄色或棕色颗粒，结果为阳性，而结节病未发现相似颗粒，结果为阴性，提示可以应用抗Rv0859抗体，建立结核病的免疫组化检测新方法。

附图说明

图1是本发明一实施例中结核分枝杆菌在体外有氧、厌氧培养条件下培养滤过蛋白表达水平显著变化数量的结果示意图；

图2是本发明一实施例中22种结核分枝杆菌培养滤过蛋白在厌氧条件下显著上调比例的结果示意图；

图3是本发明一实施例中Rv0859蛋白在不同培养条件下的转录水平检测结果示意图；

图4是本发明一实施例中Rv0859诱导表达鉴定结果示意图；

图5是本发明一实施例中Rv0859重组蛋白大量表达及纯化鉴定结果示意图；

图6是本发明一实施例中2种抗血清的ELISA检测结果示意图；

图7是本发明一实施例中2种抗血清的WB检测结果示意图；其中，图中各泳道分别为10ng、5ng、1ng、500pg抗原；抗体稀释比例为1：1000。

图8是本发明一实施例中Rv0859抗体的特异性检测结果示意图；

图9是本发明一实施例中Rv0859蛋白在不同培养条件下的分泌水平检测结果示意图；

图10是本发明一实施例中结核病人抗Rv0859抗体免疫组化检测结果示意图；

图11是本发明一实施例中结节病人抗Rv0859抗体免疫组化检测结果示意图。

具体实施方式

本发明涉及结核分枝杆菌Rv0859蛋白在诊断结核病中作为诊断标记物的用途，所述Rv0859蛋白是SEQ ID No.1所示的氨基酸序列或为该序列的变体且与其具有相同功能的蛋白质；本发明还涉及抗Rv0859蛋白的抗体的制备，以及以抗Rv0859抗体为活性成分的诊断结核病的检测应用。

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例1

本实施例为结核分枝杆菌在体外有氧、厌氧培养条件下培养滤过上清蛋白成分的鉴定及相对定量分析，及进一步验证Rv0859在厌氧培养条件的转录表达水平检测，其包括下述步骤：

1、结核分枝杆菌在体外有氧、厌氧培养条件下培养滤过上清蛋白的制备：

利用国际公认的Wayne模型建立结核分枝杆菌的体外厌氧培养模型，详见文献。具体如下：取Wheaton公司生产的带侧臂锥形螺旋盖烧瓶2个，有氧培养瓶加入200ml培养液(米氏7H9液体培养基+10％营养添加剂+0.4％吐温80)，厌氧培养瓶加入400ml培养液。培养至对数生长期的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis H37Rv)，磨菌比浊至OD590≈0.4,，约为2.5×10⁸CFU/mL，分别按1％的比例加入有氧或厌氧培养瓶中，置于37℃进行培养，其中有氧培养瓶于180rpm摇床上进行充氧培养，厌氧培养瓶瓶口密封后，于70rpm摇床上进行厌氧培养。利用培养瓶的侧臂每天检测细菌的生长情况，至14天结束培养。高速离心沉淀细菌后，分别收集有氧、厌氧培养条件下的上清液，用0.22μm直径的滤膜过滤除菌后，获得培养滤过上清，利用ProteoMiner^TM试剂盒纯化富集上清中蛋白质，测定蛋白浓度后，用于相对定量蛋白质组学检测。

2、培养滤过上清定量蛋白组学检测：

上述富集定量后蛋白质用DTT在37℃还原1小时，并在室温下用IAA烷基化45分钟，用预冷的丙酮在-20℃下沉淀过夜，用丙酮洗涤三次，然后用TEAB再溶解。每种样品大约200μg蛋白质用胰蛋白酶在37℃下消化过夜。胰酶酶解的肽段用Strata X C18(Phenomenex)除盐后真空冷冻干燥，用TEAB溶解肽段，并根据6标TMT试剂盒生产商提供的操作说明标记肽段。将肽段溶解，直接加载到反相柱上，并在EASY-nLC 1000高效液相色谱系统上进行洗脱。肽段经由超高效液相系统分离后，注入NSI离子源中进行电离，然后用Q ExactiveTM Plus质谱仪进行检测分析。质谱数据合并转换为MGF文件后，应用Mascot搜索软件进行肽段和蛋白的鉴定和分析。经过培养滤过上清定量蛋白组学检测，鉴定获得597个蛋白，其中328个蛋白可以进行定量比较。经过相对定量比较分析，有51个培养滤过上清蛋白在体外有氧或厌氧培养条件下的分泌水平显著上调或下调，其中29个蛋白在有氧条件下分泌水平显著上调，22个蛋白在厌氧条件下显著上调(见图1)。图2为22种培养滤过蛋白在厌氧条件下显著上调比例的结果示意图，其中Rv0859蛋白在厌氧条件下分泌上调的比例达到1.565。

3、Rv0859蛋白在厌氧培养条件的转录表达水平检测：

同上，获得H37Rv在体外有氧、厌氧培养0天以及14天的培养菌液，高速离心沉淀细菌后，把细菌沉淀转移至2mL螺口离心管中，加入1mL的TRIzol及破碎用玻璃粉，拧紧管口后于三维振荡器中震荡2min，3次，彻底破碎细菌释放RNA。然后按照标准RNA提取方法进行操作。提取的RNA用分光光度计检测浓度及纯度后，用TaKaRa公司的细菌RNA反转录试剂盒，制备cDNA，方法见操作说明书。用TaKaRa公司的SYBR GREEN荧光定量试剂盒，进行荧光定量PCR反应。

Rv0859引物序列如下：

Rv0859-RT-F：TTCCCGACGAGAAGCTCAAC(SEQ ID No.2)；

Rv0859-RT-R：GATGCACAGCGTGATGAGTG(SEQ ID No.3)；

内参引物序列如下：

16sRNA-F：CCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGT(SEQ ID No.4)；

16sRNA-R：GTAGTTGGCCGGTGCTTCTTCTCC(SEQ ID No.5)。

以0天有氧培养管为参考，获得厌氧条件下Rv0859转录表达水平的变化结果。如图3所示，Rv0859在厌氧条件下的转录表达水平显著上调。

实施例2

本实施例为结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0859及抗Rv0859多克隆抗体的制备，其包括下述步骤：

1、大肠杆菌中进行Rv0859原核表达：

首先利用提取的H37Rv基因组DNA，通过PCR克隆获得蛋白Rv0859的基因编码片段，通过Invitrogen公司的连接酶将片段连接到pET-28a-SUMO载体(购自Invitrogen)上，转化到大肠杆菌DH5-Alpha中扩增，提取质粒测序鉴定正确，将载体转化到大肠杆菌Rosetta中扩增，待其OD600为0.5-0.6时，加入0.8mM IPTG 37℃诱导4小时，4000rpm离心收集菌，蛋白电泳鉴定表达情况。由图4的结果证明，所制备的Rv0859蛋白大小正确。图5为大量表达纯化后的鉴定结果，pET-28a-SUMO-Rv0859(1-403aa)表达在包涵体和上清2中。上清2蛋白浓度为2mg/mL，纯度达到免疫要求。

2、抗Rv0859多克隆抗体的制备：

1)实验级日本大耳白兔免疫流程

将上述原核表达的Rv0859蛋白，免疫两只实验级日本大耳白兔，具体流程如下：

免疫次数	免疫周期	免疫剂量	免疫佐剂
				第一次免疫	1天	0.6mg	完全弗氏佐剂
第二次免疫	12天	0.3mg	不完全弗氏佐剂
				第三次免疫	26天	0.3mg	不完全弗氏佐剂
第四次免疫	40天	0.3mg	不完全弗氏佐剂
				免疫动物采血	52天

2)抗血清ELISA检测

免疫周期结束后，动物处死后采血，分离血清，进行血清中抗体效价的检测，发现2种血清对Rv0859抗原的检测下限均达到1：512K，满足进一步纯化的要求，结果见图6。

3)抗血清亲和纯化

抗血清用pET-28a-SUMO-Rv0859蛋白作抗原亲和纯化后，得到浓缩后的抗体：E8172：浓度2.31mg/ml；E8173：浓度1.71mg/ml。

4)抗原WB检测

E8172、E8173抗体检测抗原条带大小在62KD左右；两种抗体1：1000稀释可检测到500pg抗原，详见图7。又利用E8173抗体检测了结核分枝杆菌标准株H37Rv，及Rv0859基因敲除株(ΔRv0859)表达Rv0859蛋白的情况，结果发现在内参蛋白sigA表达水平一致的情况下，E8173抗体可以特异性检测出H37Rv的Rv0859蛋白，而Rv0859基因敲除后的菌株，抗体没有杂交出相应条带(见图8)，提示了抗Rv0859抗体的高特异性。

实施例3

本实施例为应用实施例2制备的抗Rv0859多克隆抗体检测Rv0859蛋白在厌氧培养条件的分泌水平，其包括下述步骤：

同实施例1，收集H37Rv在厌氧/有氧条件下的培养滤过上清蛋白，利用实施例2制备的抗Rv0859多克隆抗体，Western Blot检测发现，厌氧条件下Rv0859蛋白的水平明显上调(见图9)，验证了蛋白质组学检测的结果，证明Rv0859在厌氧条件下分泌水平显著提高。

实施例4

本实施例为应用实施例2制备的抗Rv0859多克隆抗体应用免疫组化方法辅助诊断结核病，其包括下述步骤：

(一)免疫组化检测方法

1.石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯I15min-二甲苯II 15min-二甲苯III 15min-无水乙醇I 5min-无水乙醇II 5min-85％酒精5min-75％酒精5min-蒸馏水洗。

2.抗原修复：组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复缓冲液(PH6.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，中火8min至沸，停火8min保温再转中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

3.阻断内源性过氧化物酶：切片放入3％双氧水溶液，室温避光孵育25min，将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

4.血清封闭：在组化圈内滴加3％BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。(一抗是山羊来源的用兔血清封闭，其他来源的用BSA封闭)

5.加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗(为实施例2制备的抗Rv0859多克隆抗体)，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜。(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)

6.加二抗：玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗(HRP标记)覆盖组织，室温孵育50min。

7.DAB显色：玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。

8.复染细胞核：苏木素复染3min左右，自来水洗，苏木素分化液分化数秒，自来水冲洗，苏木素返蓝液返蓝，流水冲洗。

9.脱水封片：将切片依次放入75％酒精5min-85％酒精5min-无水乙醇15min-无水乙醇15min-二甲苯15min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。

10.观察结果：光学显微镜下观察DAB染色结果，在显微镜下观察到标本的病变部位的胞质内出现棕色颗粒。

(二)结核病和结节病病理切片检测结果

分别选取了2例结核病和结节病患者的病理切片，进行抗Rv0859抗体的免疫组化检测，在显微镜下观察，可以发现结核病人病理标本病变部位的胞质内出现典型的黄色或棕色颗粒，结果为阳性，而结节病未发现相似颗粒，结果为阴性，见图10，11。提示可以应用抗Rv0859抗体，建立结核病的免疫组化检测新方法。

由上述实施例可知，本发明通过定量蛋白组学的方法，验证后发现Rv0859蛋白在厌氧培养条件下分泌水平显著提高，可作为标识物用于结核病的诊断；并对Rv0859进行了体外重组表达，利用重组蛋白作为抗原免疫动物，获得了高浓度的纯化抗Rv0859抗体，且验证该抗体可以特异性检测出结核分枝杆菌的Rv0859蛋白；且在获得有效抗体的基础上，建立了以Rv0859为检测标识物的免疫组化检测方法，其提示可以应用抗Rv0859抗体，建立结核病的免疫组化检测新方法。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 上海市肺科医院

<120> 一种用于结核病诊断的标记物及其应用

<130> IPI193370

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 403

<212> PRT

<213> H37Rv|Rv0859(Mycobacterium tuberculosis)

<400> 1

Met Ser Glu Glu Ala Phe Ile Tyr Glu Ala Ile Arg Thr Pro Arg Gly

1 5 10 15

Lys Gln Lys Asn Gly Ser Leu His Glu Val Lys Pro Leu Ser Leu Val

20 25 30

Val Gly Leu Ile Asp Glu Leu Arg Lys Arg His Pro Asp Leu Asp Glu

35 40 45

Asn Leu Ile Ser Asp Val Ile Leu Gly Cys Val Ser Pro Val Gly Asp

50 55 60

Gln Gly Gly Asp Ile Ala Arg Ala Ala Val Leu Ala Ser Gly Met Pro

65 70 75 80

Val Thr Ser Gly Gly Val Gln Leu Asn Arg Phe Cys Ala Ser Gly Leu

85 90 95

Glu Ala Val Asn Thr Ala Ala Gln Lys Val Arg Ser Gly Trp Asp Asp

100 105 110

Leu Val Leu Ala Gly Gly Val Glu Ser Met Ser Arg Val Pro Met Gly

115 120 125

Ser Asp Gly Gly Ala Met Gly Leu Asp Pro Ala Thr Asn Tyr Asp Val

130 135 140

Met Phe Val Pro Gln Ser Ile Gly Ala Asp Leu Ile Ala Thr Ile Glu

145 150 155 160

Gly Phe Ser Arg Glu Asp Val Asp Ala Tyr Ala Leu Arg Ser Gln Gln

165 170 175

Lys Ala Ala Glu Ala Trp Ser Gly Gly Tyr Phe Ala Lys Ser Val Val

180 185 190

Pro Val Arg Asp Gln Asn Gly Leu Leu Ile Leu Asp His Asp Glu His

195 200 205

Met Arg Pro Asp Thr Thr Lys Glu Gly Leu Ala Lys Leu Lys Pro Ala

210 215 220

Phe Glu Gly Leu Ala Ala Leu Gly Gly Phe Asp Asp Val Ala Leu Gln

225 230 235 240

Lys Tyr His Trp Val Glu Lys Ile Asn His Val His Thr Gly Gly Asn

245 250 255

Ser Ser Gly Ile Val Asp Gly Ala Ala Leu Val Met Ile Gly Ser Ala

260 265 270

Ala Ala Gly Lys Leu Gln Gly Leu Thr Pro Arg Ala Arg Ile Val Ala

275 280 285

Thr Ala Thr Ser Gly Ala Asp Pro Val Ile Met Leu Thr Gly Pro Thr

290 295 300

Pro Ala Thr Arg Lys Val Leu Asp Arg Ala Gly Leu Thr Val Asp Asp

305 310 315 320

Ile Asp Leu Phe Glu Leu Asn Glu Ala Phe Ala Ser Val Val Leu Lys

325 330 335

Phe Gln Lys Asp Leu Asn Ile Pro Asp Glu Lys Leu Asn Val Asn Gly

340 345 350

Gly Ala Ile Ala Met Gly His Pro Leu Gly Ala Thr Gly Ala Met Ile

355 360 365

Leu Gly Thr Met Val Asp Glu Leu Glu Arg Arg Asn Ala Arg Arg Ala

370 375 380

Leu Ile Thr Leu Cys Ile Gly Gly Gly Met Gly Val Ala Thr Ile Ile

385 390 395 400

Glu Arg Val

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Rv0859-RT-F 引物(Artificial Sequence)

<400> 2

ttcccgacga gaagctcaac 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Rv0859-RT-R 引物(Artificial Sequence)

<400> 3

gatgcacagc gtgatgagtg 20

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 16sRNA-F 内参引物(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgcggccta tcagcttgtt ggt 23

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 16sRNA-R 内参引物(Artificial Sequence)

<400> 5

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Claims

1.Rv0859蛋白在制备结核病诊断试剂中的应用，其特征在于，所述诊断试剂包括针对Rv0859蛋白的特异性抗体；所述特异性抗体为抗Rv0859多克隆抗体；所述Rv0859蛋白在厌氧条件下分泌水平显著上升，促进结核分枝杆菌在体内定植并存活，且在体内作为毒力因子调控宿主的免疫应答；所述Rv0859蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗Rv0859多克隆抗体的制备步骤如下：

步骤A. 大肠杆菌中进行Rv0859蛋白原核表达：以结核分枝杆菌基因组DNA为模板通过PCR克隆获得蛋白Rv0859的基因编码片段，将片段连接到载体，转化到大肠杆菌中扩增，获得纯度达到免疫要求的原核表达的Rv0859蛋白；

步骤B. 抗Rv0859多克隆抗体的制备：将步骤A获得的原核表达的Rv0859蛋白，免疫动物；免疫周期结束后，采血，分离血清，进行血清中抗体效价的检测；将检测结果满足纯化要求的血清进行抗原亲和纯化，得到浓缩后的抗Rv0859多克隆抗体。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤A中，所述载体为pET-28a-SUMO载体，所述大肠杆菌为大肠杆菌DH5-Alpha或大肠杆菌Rosetta。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤B中，所述动物采用大白兔，其免疫流程如下：

第一次免疫 1天，免疫剂量：0.6mg；免疫佐剂：完全弗氏佐剂；

第二次免疫 12天，免疫剂量：0.3mg；免疫佐剂：不完全弗氏佐剂；

第三次免疫 26天，免疫剂量：0.3mg；免疫佐剂：不完全弗氏佐剂；

第四次免疫 40天，免疫剂量：0.3mg；免疫佐剂：不完全弗氏佐剂。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤B中，采用pET-28a-SUMO-Rv0859蛋白作抗原亲和纯化；所述pET-28a-SUMO-Rv0859 蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。