CN113702639A - 产气荚膜梭菌β2毒素抗体的间接ELISA方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种产气荚膜梭菌β2毒素抗体间接ELISA检测方法，包括步骤一、产气荚膜梭菌β2毒素抗体的间接ELISA方法的建立，步骤二、结果判定标准的确定。本发明属于病原微生物检测技术领域，具体是提供了一种特异性好、灵敏度高、重复性好的检测产气荚膜梭菌β2毒素抗体的间接ELISA体系，为动物的产气荚膜梭菌感染情况提供了有效的检测手段，在临床血清流行病学调查和疫苗免疫效果评价方面具有广泛应用前景，可快速检测的产气荚膜梭菌β2毒素抗体间接ELISA检测方法。
Description
技术领域
本发明属于病原微生物检测技术领域，具体是指一种产气荚膜梭菌β2毒素抗体间接ELISA检测方法。
背景技术
产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)所引起的人及动物的食物中毒、肠毒血症、坏死性肠炎和气性坏疽等疾病，是一类世界性的人兽共患传染病，一直受到国内外研究者的普遍关注。
该菌的致病因子主要是菌体分泌的18种外毒素和酶；1997年，法国巴斯德研究所的Gibert在一株仔猪肠炎所分离的产气荚膜梭菌中发现了一种致死性的外毒素，定名为β2毒素；该毒素蛋白分子量为28kD，等电点为5.4～5.5，对蛋白酶敏感。2015年，Fisher等利用PCR检测方法对该毒素的编码基因— cpb2在动物消化道中的存在情况进行调查中发现，在引起食物中毒，抗生素相关性腹泻和散发性腹泻的产气荚膜梭菌A型分离株中，携带cpb2的菌株中有 15％可检出同时携带肠毒素(cpe)基因，而在携带cpe基因的菌株中有超过 75％可同时检出cpb2基因，利用该毒素的多克隆抗体的检测的Western Blotting 技术表明，这些共同携带cpb2和cpe的AAD/SD分离株中有超过97％的菌株可以产生β2毒素。
目前多项研究均认为，与健康动物相比，在患有肠炎的人和动物粪便中， cpb2基因存在的阳性率更高，因此β2毒素经常被用作产气荚膜梭菌的诊断性生物标志物进行检测。另外的测序研究显示当cpb2和cpe在相同的质粒上时，菌株分泌上清对人结肠腺癌细胞的毒性是cpb2和cpe在不同质粒菌株所产生毒素上清的10倍，这些结果表明β2毒素可能是产气荚膜梭菌肠毒素(CPE)相关的AAD/SD中的辅助毒素。
目前，对该毒素的检测尚缺乏相关的检测产品，临床上亟需一种操作方便，敏感性高，特异性好，稳定可靠的方法进行养殖场动物中产气荚膜梭菌的流行病学调查和抗体水平的检测，因此，建立一种针对产气荚膜梭β2毒素菌单克隆抗体的间接ELISA检测方法非常有必要。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种动物血清中产气荚膜梭菌β2毒素抗体的水平的检测方法和材料，适用于产气荚膜梭菌β2毒素所引起的临床血清流行病学调查和疫苗免疫效果评价，具有特异性强、灵敏度高、稳定性良好的产气荚膜梭菌β2毒素抗体间接ELISA检测方法。
本发明采取的技术方案如下：本发明一种产气荚膜梭菌β2毒素抗体间接 ELISA检测方法，包括以下步骤：
步骤一、产气荚膜梭菌β2毒素抗体的间接ELISA方法的建立：
(1)以包被液稀释包被抗原至0.5μg/mL，96孔酶标板中以100μL/孔进行包被，4℃过夜，所述包被抗原为可溶性重组产气荚膜梭菌β2毒素蛋白；
所述步骤(1)中包被液为0.85M碳酸盐缓冲液，pH值为9.6，所述 0.85M碳酸盐缓冲液的包被液制备方法为称取NaHCO3 2.93g以及Na2CO3 1.59g，加蒸馏水定容至1L；
所述重组产气荚膜梭菌β2毒素蛋白，其制备方法为：重组表达菌株 BL21(DE3)(pTIG-cpb2)冻存菌株划线在含氨苄青霉素的LB固体培养基上，过夜培养，挑取单菌落摇瓶培养，菌液培养至OD600为0.6-0.8时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导表达，取菌体裂解上清，以AKTA纯化系统用钴亲和层析柱进行蛋白纯化，收集100mM咪唑峰，所得蛋白经透析后，经SDS- PAGE、肽段质谱鉴定并进行BCA定量后分装保存于4℃；
(2)PBST溶液洗板3次，每次5分钟，加入封闭液，以200μL/孔进行封闭，37℃保温2小时；
所述PBST溶液为1L的PBS溶液中加入2‰Tween-20混匀制得；
所述步骤(2)中封闭液为5％脱脂奶粉，所述5％脱脂奶粉的制备方法为称取脱脂奶粉5g,，加PBS溶液定容至100mL；
(3)PBST溶液洗板3次，每次5分钟，加入待检血清样品，以阳性对照为产气荚膜梭菌β2毒素单克隆抗体91/E23，阴性对照为产气荚膜梭菌β1毒素单克隆抗体，100μL/孔，37℃保温1小时；
该步骤中所使用的阳性对照为产气荚膜梭菌β2毒素单克隆抗体91/E23，其制备方法为：将冻存于液氮罐中的91/E23杂交瘤细胞复苏，进行细胞传代培养，待细胞状态良好后按1:100的比例将细胞分传于75cm2的培养瓶中，并置于CO2培养箱中直至细胞过度生长以富积抗体，约5天后，待培养液变黄后，将细胞培养液转移到50mL的离心管中，室温下1500g离心10min，收集上清，用0.22μm的滤器进行过滤除菌，采用AKTA纯化系统使用Protein G纯化获得McAb，对纯化样品进行SDS-PAGE、鉴定后并经BCA定量后用加入甘油保存于﹣80℃冰箱中备用；
所述步骤(3)中阳性对照为产气荚膜梭菌β2毒素单克隆抗体91/E23，以 PBS稀释1024倍；
(4)PBST溶液洗板3次，每次5分钟，阳性对照孔和阴性对照孔加入 HRP-山羊抗小鼠IgG为二抗，待测血清样品孔加入相应的HRP标记二抗， 100μL/孔，室温1小时；
所述步骤(4)中HRP-山羊抗小鼠IgG二抗为HRP-山羊抗小鼠IgG稀释2000倍，所述HRP标记相应二抗为HRP标记的山羊抗待检动物IgG二抗稀释 2000倍；
(5)PBST溶液洗板3次，每次5分钟，加入邻苯二胺溶液100μL/孔，室温下避光10分钟，加入终止液H2SO4溶液终止反应，测定OD450nm数值检测吸光度值；
所述步骤(5)中邻苯二胺溶液为5％邻苯二胺溶液，所述5％邻苯二胺溶液的制备方法包括称取OPD(邻苯二胺)5mg，量取10mL底物缓冲液进行溶解，加入3％H2O2 0.15mL，现配现用，其中，所述底物缓冲液为柠檬酸缓冲液，pH值为5.0，所述柠檬酸缓冲液的制备方法包括称取柠檬酸1.92g， Na2HPO4称取2.84g，并加蒸馏水定容至100mL；
所述步骤(5)中终止液为2mol/L的H2SO4，所述终止液的制备方法包括量取蒸馏水178.3mL，逐滴加入浓度为98％的浓硫酸21.7mL；
步骤二、结果判定标准的确定：
当样品OD450nm值>X+3SD时，判定为阳性；OD450nm值<X+2SD时，判定为阴性；介于二者之间时，判为可疑；
通过统计学分析，其中阴性对照总体平均值为0.064，标准差SD为 0.019，故阳性临界值为0.121，阴性临界值为0.102。
进一步地，所述可溶性重组产气荚膜梭菌β2毒素蛋白的包被抗原表达菌株的构建方法为：根据文献报道的产气荚膜梭菌β2毒素基因序列，设计引物 cpb2-PF：5`CggAATTCTAATgAAAgAAATCgACgCTTAT3`及cpb2-RF： 5`GAATgCggCCgCT gCACAATACCCTTCACC 3`，
从产气荚膜梭菌C型标准株中扩增cpb2基因，构建至pTIG-Trx载体，转化至BL21(DE3)菌株中，标记为BL21(DE3)pTIG-cpb2。
进一步地，所述包被抗原为重组产气荚膜梭菌β2毒素蛋白；表达菌株的诱导方法为：BL21(DE3)pTIG-cpb2菌株37℃振荡培养3小时后，加入IPTG 至终浓度为1mmol/L，37℃诱导表达3h，8000rpm离心收获菌体。
进一步地，所述包被抗原为重组产气荚膜梭菌β2毒素蛋白，所述可溶性重组蛋白的纯化方法包括以下步骤：
步骤a：离心收集800mL诱导后重组表达菌体，用PBS清洗一次，菌体沉淀加入原体积的1/10PBS重悬，超声破碎10min后，以8000r/min离心5分钟，取上清样品用0.22μm孔径的滤器除去粗悬浮物，即可作为AKTA蛋白纯化系统的上样样品；
步骤b：加入处理好的菌体裂解液上样至5mL Co-NTA凝胶柱中，样品全部加完后，加入500mM咪唑洗脱液进行洗脱His标签蛋白，收获100mM咪唑洗脱峰蛋白，加入透析袋中，置于PBS溶液中4℃透析过夜。
进一步地，所述包被抗原为重组产气荚膜梭菌β2毒素蛋白；可溶性重组蛋白的质谱鉴定方法为：重组产气荚膜梭菌β2毒素蛋白经SDS-PAGE电泳，切取PAGE凝胶上的28kDa处目的条带，肽段质谱检测拼接后氨基酸序列经在 NCBI数据库进行Protein BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对，结果显示，目的蛋白氨基酸序列具有与产气荚膜梭菌β2毒素最相似的匹配度，表明BL21(DE3)(pTIG-cpb2)表达并纯化所获得的目的蛋白为重组产气荚膜梭菌β2毒素蛋白。
进一步地，所述阳性对照为产气荚膜梭菌β2毒素单克隆抗体91/E23，为根据NCBI所提供的β2毒素氨基酸序列，对蛋白序列进行分析和抗原预测，去除可能发生交叉识别的大肠杆菌和产气荚膜梭菌β1毒素、α毒素，ε毒素的位点，从目标蛋白中挑选出抗原表位指数最高的一段具有10个氨基酸的肽段，以此作为抗原注射至BalB/C小鼠，三次免疫后，取小鼠脾脏与骨髓瘤细胞进行融合，经限制性梯度稀释后获得阳性克隆细胞株，并经过筛选获得。
采用上述结构本发明取得的有益效果如下：本方案为一种产气荚膜梭菌β2 毒素抗体间接ELISA检测方法，具有以下优点：
1、特异性强，利用本方法对实验室保留的产气荚膜梭菌阳性血清和采集的健康牛血清进行检测，结果显示，只有产气荚膜梭菌阳性血清为阳性，而健康牛血清均为阴性，表明所建立的检测体系具有良好的特异性；
2、灵敏度高，将McAb 91/E23按照倍比稀释，对建立并优化好的间接 ELISA检测方法进行敏感性测试，实验结果显示在McAb 91/E23稀释到 0.12ng/μL时OD450为0.244，仍在阳性临界值0.121以上，说明建立并优化好的间接ELISA检测方法敏感性较高；
3、稳定性良好，利用建立好的间接ELISA检测方法，对产气荚膜梭菌β2 毒素阳性抗体(McAb 91/E23)、阴性抗体进行批次和批间检测，计算变异系数，验证该方法的稳定性，试验结果显示3次批内检测变异系数为1.317％- 2.556％，3次批间检测变异系数为0.223％-4.673％，批间和批内重复的变异系数均小于5％，表明建立的该方法具有良好的稳定性。
附图说明
图1为本发明一种产气荚膜梭菌β2毒素抗体间接ELISA检测方法的β2毒素重组蛋白的表达、纯化及鉴定结果图；A图为BL21(DE3)(pTIG-cpb2)重组菌株表达蛋白纯化结果，B图为表达蛋白纯化结果SDS-PAGE及Western blot检测结果。
图2为本发明一种产气荚膜梭菌β2毒素抗体间接ELISA检测方法的β2毒素重组蛋白质谱分析后肽段拼接序列图；
图3为本发明一种产气荚膜梭菌β2毒素抗体间接ELISA检测方法的间接 ELISA反应条件的优化结果中最佳抗原包被浓度的确定图；
图4为本发明一种产气荚膜梭菌β2毒素抗体间接ELISA检测方法的间接 ELISA反应条件的优化结果中抗体稀释倍数的确定图；
图5为本发明一种产气荚膜梭菌β2毒素抗体间接ELISA检测方法的间接 ELISA反应条件的优化结果中酶标二抗最佳稀释度的确定结果图；
图6为本发明一种产气荚膜梭菌β2毒素抗体间接ELISA检测方法的优化后的间接ELISA检测方法敏感性试验结果图。
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如图1-6所示，本发明一种产气荚膜梭菌β2毒素抗体间接ELISA检测方法，包括以下实施例：
实施例1：可溶性重组产气荚膜梭菌β2毒素蛋白的表达；
根据文献报道的的产气荚膜梭菌β2毒素基因序列，设计引物
cpb2-PF：5`CggAATTCTAATgAAAgAAATCgACgCTTAT3`及
cpb2-RF：5`GAATgCggCCgCT gCACAATACCCTTCACC 3`，
从产气荚膜梭菌C型标准株中扩增cpb2基因，构建至pTIG-Trx载体，转化至BL21(DE3)菌株中，标记为BL21(DE3)pTIG-cpb2。
取BL21(DE3)(pTIG-cpb2)冻存菌株划线在含氨苄青霉素的LB固体培养基上，过夜培养，挑取单菌落摇瓶培养，菌液培养至OD600为0.6-0.8时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导表达，37℃诱导表达3h，8000rpm离心收获菌体。
实施例2：可溶性重组产气荚膜梭菌β2毒素蛋白的纯化；
可溶性产气荚膜梭菌β2毒素重组蛋白的纯化方法为：离心收集800mL诱导后重组表达菌体，用PBS清洗一次，菌体沉淀加入原体积的1/10体积的 PBS重悬，超声破碎10min后，以8000r/min离心5分钟，取上清样品用 0.22μm孔径的滤器除去粗悬浮物，即可作为AKTA蛋白纯化系统的上样样品；加入处理好的菌体裂解液上样至5mL Co-NTA凝胶柱中，样品全部加完后，加入500mM咪唑洗脱液进行洗脱His标签蛋白，收获100mM咪唑洗脱峰蛋白，加入透析袋中，置于PBS溶液中4℃透析过夜。
实施例3：可溶性重组产气荚膜梭菌β2毒素蛋白的质谱鉴定；
纯化后的重组产气荚膜梭菌β2毒素蛋白经SDS-PAGE电泳，切取PAGE 凝胶上的28kDa处目的条带，进行了质谱分析，肽段质谱检测拼接后氨基酸序列经在NCBI数据库进行Protein BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对，结果显示，目的蛋白氨基酸序列具有与产气荚膜梭菌β2毒素最相似的匹配度，表明BL21(DE3)(pTIG-cpb2)表达并纯化所获得的目的蛋白为重组产气荚膜梭菌β2毒素蛋白。
实施例4：可溶性产气荚膜梭菌β2毒素蛋白抗原包被条件的确定；
采用方阵滴定法，以β2毒素重组蛋白为包被抗原，将β2毒素重组蛋白用包被缓冲液作稀释，按每孔浓度分别为0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、 1.5μg/mL稀释，酶标板每孔加100μL，4℃包被过夜；以5％脱脂奶粉，以纯化的McAb91/E23为一抗，HRP-山羊抗小鼠IgG为二抗，OPD为显色液，2M H2SO4溶液为终止液，测定OD450nm数值检测吸光度值。
实施例5：封闭条件的确定；
采用方阵滴定法，以0.5μg/mL的β2毒素重组蛋白为包被抗原；以5％ BSA或5％脱脂奶粉分别孵育30min、60min、90min和120min为封闭液，纯化的McAb91/E23为一抗，HRP-山羊抗小鼠IgG为二抗，OPD为显色液，2M H2SO4溶液为终止液，测定OD450数值检测吸光度值。
实施例6：产气荚膜梭菌β2毒素单克隆抗体91/E23的制备；
根据NCBI所提供的β2毒素氨基酸序列，对蛋白序列进行分析和抗原预测，去除可能发生交叉识别的大肠杆菌和产气荚膜梭菌β1毒素、α毒素，ε毒素的位点，从目标蛋白中挑选出抗原表位指数最高的一段具有10个氨基酸的肽段，以此作为抗原注射至BalB/C小鼠，三次免疫后，取小鼠脾脏与骨髓瘤细胞进行融合，经限制性梯度稀释后获得阳性克隆细胞株，并经过筛选获得。
实施例7：产气荚膜梭菌β2毒素单克隆抗体91/E23的纯化；
将冻存于液氮罐中的91/E23杂交瘤细胞复苏，接种至含有体积含量为1％的青链霉素、1％的谷氨酰胺以及10％的胎牛血清的RPMI Medium 1640中进行细胞传代培养，待细胞状态良好后按1:100的比例将细胞分传于75cm2的培养瓶中，并置于CO2培养箱中直至细胞过度生长以富积抗体，约5天后，待培养液变黄色后，收集91/E23培养上清，用0.22μm的滤器进行过滤除菌，采用 AKTA纯化系统使用Protein G纯化，纯化所用结合缓冲液为20mM磷酸钠， pH 7.0，洗脱缓冲液为0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液，pH 2.7，中和缓冲液为1M Tris-Cl，pH 9.0，收获蛋白洗脱峰获得纯化的McAb 91/E23。
实施例8：单克隆抗体91/E23的稀释比的确定；
采用方阵滴定法，以0.5μg/mL的β2毒素重组蛋白为包被抗原；以5％脱脂奶粉孵育120min为封闭条件，纯化的McAb91/E23为一抗，分别作1:256、 1:512、1:1024、1:2048、1：4096、1:8192、1:16384稀释，设PBS为空白对照，HRP-山羊抗小鼠IgG为二抗，OPD为显色液，2M H2SO4溶液为终止液，测定OD450数值检测吸光度值。
实施例9：HRP-山羊抗小鼠IgG稀释度的确定；
采用方阵滴定法，以0.5μg/mL的β2毒素重组蛋白为包被抗原，以5％脱脂奶粉孵育120min为封闭条件，纯化的McAb91/E23稀释1024倍为一抗， HRP-山羊抗小鼠IgG按照1:1000、1:2000、1:4000、1:8000梯度进行稀释为二抗，OPD为显色液，2M H2SO4溶液为终止液，测定OD450数值检测吸光度值。
实施例10：间接ELISA检测方法临界值的确定；
利用建立好的间接ELISA检测方法，对30份阴性抗体进行了ELISA测定，并计算这些样品的平均OD450值(X)和标准方差(SD)。当样品OD450 值>X+3SD时，判定为阳性；OD450值<X+2SD时，判定为阴性；介于二者之间时，判为疑似。
通过统计学分析，其中阴性对照总体平均值为0.064，标准差SD为 0.019，故阳性临界值为0.121，阴性临界值为0.102。
需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种产气荚膜梭菌β2毒素抗体间接ELISA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、产气荚膜梭菌β2毒素抗体的间接ELISA方法的建立：
(1)以包被液稀释包被抗原至0.5μg/mL，96孔酶标板中以100μL/孔进行包被，4℃过夜，所述包被抗原为可溶性重组产气荚膜梭菌β2毒素蛋白；
(2)PBST溶液洗板3次，每次5分钟，加入封闭液，以200μL/孔进行封闭，37℃保温2小时；
(3)PBST溶液洗板3次，每次5分钟，加入待检血清样品，以阳性对照为产气荚膜梭菌β2毒素单克隆抗体91/E23，阴性对照为产气荚膜梭菌β1毒素单克隆抗体，100μL/孔，37℃保温1小时；
(4)PBST溶液洗板3次，每次5分钟，阳性对照孔和阴性对照孔加入HRP-山羊抗小鼠IgG为二抗，待测血清样品孔加入相应的HRP标记二抗，100μL/孔，室温1小时；
(5)PBST溶液洗板3次，每次5分钟，加入邻苯二胺溶液100μL/孔，室温下避光10分钟，加入终止液H2SO4溶液终止反应，测定OD450nm数值检测吸光度值；
步骤二、结果判定标准的确定：
当样品OD450nm值>X+3SD时，判定为阳性；OD450nm值<X+2SD时，判定为阴性；介于二者之间时，判为疑似。
2.根据权利要求1所述的一种产气荚膜梭菌β2毒素抗体间接ELISA检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中包被液为0.85M碳酸盐缓冲液，pH值为9.6，所述0.85M碳酸盐缓冲液的包被液制备方法为称取NaHCO3 2.93g以及Na2CO3 1.59g，加蒸馏水定容至1L；所述PBST溶液为1L的PBS溶液中加入2‰Tween-20混匀制得；所述步骤(2)中封闭液为5％脱脂奶粉，所述5％脱脂奶粉的制备方法为称取脱脂奶粉5g,，加PBS溶液定容至100mL；所述步骤(3)中阳性对照为产气荚膜梭菌β2毒素单克隆抗体91/E23，以PBS稀释1024倍；所述步骤(4)中HRP-山羊抗小鼠IgG二抗为HRP-山羊抗小鼠IgG稀释2000倍，所述HRP标记相应二抗为HRP标记的山羊抗待检动物IgG二抗稀释2000倍；所述步骤(5)中邻苯二胺溶液为5％邻苯二胺溶液，所述5％邻苯二胺溶液的制备方法包括称取OPD(邻苯二胺)5mg，量取10mL底物缓冲液进行溶解，加入3％H2O20.15mL，现配现用，其中，所述底物缓冲液为柠檬酸缓冲液，pH值为5.0，所述柠檬酸缓冲液的制备方法包括称取柠檬酸1.92g，Na2HPO4称取2.84g，并加蒸馏水定容至100mL；所述步骤(5)中终止液为2mol/L的H2SO4，所述终止液的制备方法包括量取蒸馏水178.3mL，逐滴加入浓度为98％的浓硫酸21.7mL。
3.根据权利要求1所述的一种产气荚膜梭菌β2毒素抗体间接ELISA检测方法，其特征在于：
所述可溶性重组产气荚膜梭菌β2毒素蛋白的包被抗原表达菌株的构建方法为：根据文献报道的产气荚膜梭菌β2毒素基因序列，设计引物cpb2-PF：
5`CggAATTCTAATgAAAgAAATCgACgCTTAT3`及cpb2-RF：
5`GAATgCggCCgCT gCACAATACCCTTCACC 3`，
从产气荚膜梭菌C型标准株中扩增cpb2基因，构建至pTIG-Trx载体，转化至BL21(DE3)菌株中，标记为BL21(DE3)pTIG-cpb2。
4.根据权利要求1所述的一种产气荚膜梭菌β2毒素抗体间接ELISA检测方法，其特征在于：所述包被抗原为重组产气荚膜梭菌β2毒素蛋白；表达菌株的诱导方法为：BL21(DE3)pTIG-cpb2菌株37℃振荡培养3小时后，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃诱导表达3h，8000rpm离心收获菌体。
5.根据权利要求4所述的一种产气荚膜梭菌β2毒素抗体间接ELISA检测方法，其特征在于：所述包被抗原为重组产气荚膜梭菌β2毒素蛋白，所述可溶性重组蛋白的纯化方法包括以下步骤：
步骤a：离心收集800mL诱导后重组表达菌体，用PBS清洗一次，菌体沉淀加入原体积的1/10PBS重悬，超声破碎10min后，以8000r/min离心5分钟，取上清样品用0.22μm孔径的滤器除去粗悬浮物，即可作为AKTA蛋白纯化系统的上样样品；
步骤b：加入处理好的菌体裂解液上样至5mL Co-NTA凝胶柱中，样品全部加完后，加入500mM咪唑洗脱液进行洗脱His标签蛋白，收获100mM咪唑洗脱峰蛋白，加入透析袋中，置于PBS溶液中4℃透析过夜。
6.根据权利要求1所述的一种产气荚膜梭菌β2毒素抗体间接ELISA检测方法，其特征在于：所述包被抗原为重组产气荚膜梭菌β2毒素蛋白；可溶性重组蛋白的质谱鉴定方法为：重组产气荚膜梭菌β2毒素蛋白经SDS-PAGE电泳，切取PAGE凝胶上的28kDa处目的条带，肽段质谱检测拼接后氨基酸序列经在NCBI网站上进行Protein BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对，结果显示，目的蛋白氨基酸序列具有与产气荚膜梭菌β2毒素最相似的匹配度，表明BL21(DE3)(pTIG-cpb2)表达并纯化所获得的目的蛋白为重组产气荚膜梭菌β2毒素蛋白。
7.根据权利要求1所述的一种产气荚膜梭菌β2毒素抗体间接ELISA检测方法，其特征在于：所述阳性对照为产气荚膜梭菌β2毒素单克隆抗体91/E23，为根据NCBI所提供的β2毒素氨基酸序列，对蛋白序列进行分析和抗原预测，去除可能发生交叉识别的大肠杆菌和产气荚膜梭菌β1毒素、α毒素，ε毒素的位点，从目标蛋白中挑选出抗原表位指数最高的一段具有10个氨基酸的肽段，以此作为抗原注射至BalB/C小鼠，三次免疫后，取小鼠脾脏与骨髓瘤细胞进行融合，经限制性梯度稀释后获得阳性克隆细胞株，并经过筛选获得。
8.根据权利要求1所述的一种产气荚膜梭菌β2毒素抗体间接ELISA检测方法，其特征在于：所述阳性对照为产气荚膜梭菌β2毒素单克隆抗体91/E23的纯化方法为：将冻存于液氮罐中的91/E23杂交瘤细胞复苏，进行细胞传代培养，待细胞状态良好后按1:100的比例将细胞分传于75cm2的培养瓶中，并置于CO2培养箱中直至细胞过度生长以富积抗体，4～5天后，待培养液变黄色后，收集91/E23培养上清，用0.22μm的滤器进行过滤除菌，采用AKTA纯化系统使用Protein G纯化，获得McAb 91/E23。
9.根据权利要求1所述的一种产气荚膜梭菌β2毒素抗体间接ELISA检测方法，其特征在于：所述McAb91/E23纯化所用结合缓冲液为20mM磷酸钠，pH7.0，洗脱缓冲液为0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液，pH2.7，中和缓冲液为1M Tris-Cl，pH 9.0。
10.根据权利要求1所述的一种产气荚膜梭菌β2毒素抗体间接ELISA检测方法，其特征在于：所述完全培养基含有体积含量为10％的胎牛血清的RPMI Medium 1640，所述完全培养基含有体积含量为1％的青链霉素以及1％的谷氨酰胺。
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