KR20210118808A - 항 범종 특이적 말라리아 원충 젖산 탈수소효소의 항체 - Google Patents

항 범종 특이적 말라리아 원충 젖산 탈수소효소의 항체 Download PDF

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Abstract

범종 특이적 말라리아 원충 젖산 탈수소효소 항원 결합 도메인을 포함하는 분리된 결합 단백질 및 그 제조 방법을 제공하되, 상기 항원 결합 도메인은 한정적인 아미노산 서열로부터 선택되는 적어도 하나의 상보성 결정 영역을 포함하거나, 상기 상보성 결정 영역과 적어도 80%의 서열 동일성을 가지고 범종 특이적 말라리아 원충 젖산 탈수소효소와 KD≤1.5647×10-9 ㏖/ℓ의 친화력을 가지며, 범종 특이적 말라리아 원충 젖산 탈수소효소를 잘 식별하기에, 말라리아 원충 젖산 탈수소효소 단백질의 검출 분야에 사용될 수 있다.

Description

항 범종 특이적 말라리아 원충 젖산 탈수소효소의 항체
관련 출원의 상호 참조
본 발명은 2018년 12월 25일자로 중국 특허국에 제출한 출원 번호가 201811595399.7이고 발명의 명칭이 "항 범종 특이적 말라리아 원충 젖산 탈수소효소의 항체"인 중국 특허 출원의 우선권을 주장하는 바, 이의 모든 내용은 참조로서 본 발명에 인용된다.
기술분야
본 발명은 면역 기술 분야에 관한 것으로, 특히 항 범종 특이적 말라리아 원충 젖산 탈수소효소의 항체에 관한 것이다.
말라리아(Malaria)는 아노펠레스 모기에 물리거나 말라리아 원충을 포함하는 자의 혈액을 수혈받아 말라리아 원충 감염으로 인해 발생하는 곤충매개전염병이다. 인체에 기생하는 말라리아 원충에는 주로 4가지가 있는데 삼일열 말라리아 원충(Plasmodium vivax, pv), 열대열 말라리아 원충(Plasmodium falciparum, pf), 사일열 말라리아 원충(Plasmodium maiariae, pm) 및 난형 말라리아 원충(Plasmodium ovale, po)이다. 열대열 말라리아 원충은 가장 흔한 전염성 말라리아 원충(75%)으로서, 위해가 가장 큰 병원체이고, 전염성이 높고 빠르게 증식하며 증상이 심하고 처음 감염자의 사망률이 높으며, 이로 인한 사망이 총 사망자 수 95% 이상을 차지하고, 주로 아프리카, 남미 및 아시아의 열대 지역에서 발견된다. 삼일열 말라리아 원충은 두 번째로 흔한 말라리아 원충(20%)이며 역시 아프리카 이외의 지역에서 가장 흔한 종이다. WHO는 말라리아가 의심되는 모든 환자에게 즉시 말라리아 검사를 받을 것을 권장하며, 말라리아 예방 약물의 올바른 사용, 약물 내성 균주 생성 방지, 질병 악화 제어 및 감소를 위해서는 질병의 신속하고 정확한 진단이 필수적이다.
말라리아 진단은 말라리아 통제의 중점 과제이다. 검출 기술의 원리에 따라 현재 말라리아 원충을 검출하는 방법은 네 가지로 나눌 수 있다. 하나는 두꺼운 혈액도말과 얇은 혈액도말을 포함한 말라리아 원충을 직접 현미경으로 검출하는 것인데, 이는 현재 말라리아의 임상 진단을 위한 황금 표준이기도 하다. 그러나 시간이 많이 걸리고 힘들고 숙련된 기술자와 특정 실험 조건이 필요하다. 두 번째는 말라리아 원충 핵산 검출이다. 검출 대상은 말라리아 원충 18S 리보솜 RNA 등 특이적 뉴클레오타이드 단편이다. 일반적으로 사용되는 방법은 형광 PCR 방법 및 루프 매개 등온 증폭(loop-mediated isothermal amplification: LAMP) 기술이다. 이러한 방식은 민감도와 특이성이 높지만 더 복잡한 장비와 기술적인 조건 지원이 필요하며 말라리아 유행 지역에서 일상적인 검사 방법으로 적합하지 않으며 기층 수준에서 홍보 및 적용하기가 어렵다. 세 번째는 말라리아 원충 색소 검출인데, 일반적으로 유세포 검출 기술 또는 질량 분석법을 사용한다. 이 방법은 전문적인 검사 장비가 필요하며 일반적으로 실험실 연구에 사용되며 현장 테스트에는 적합하지 않다. 네 번째는 항원-항체 면역 반응에 의한 말라리아 원충의 검출이다. 방법론적으로는 면역 크로마토그래피 신속 진단 시약(RDT)과 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA)이 있다. 검출된 표적 항원의 대부분은 PLDH 및 HRP-II와 같은 진단 항원이다. 항원을 검출 대상으로 하는 RDT 법은 조작이 간단하고 빠르며, 결과가 직관적이고, 복잡한 장비가 필요없으며, 민감도 및 특이성이 높다는 장점이 있으며, 열대열 말라리아 원충이 유행하는 낙후 지역에서 중요한 의의가 있기에, WHO에서 권장하는 현장 진단 방법이다.
현재 RDT 방법에서 일반적으로 사용되는 말라리아 항원은 주로 열대열 말라리아 원충 특유의 히스티딘-풍부 단백질-2(Histidine-rich protein II: HRP-II) 및 말라리아 원충 젖산 탈수소효소(Plasmodium Lactate dehydrogenase: PLDH)이다. HRP-II는 열대열 말라리아 원충의 충체 특이적 항원으로서, 열대열 말라리아 검출에서 가장 흔히 사용되는 표적 항원이다. 말라리아 원충 젖산 탈수소효소(Plasmodium Lactate dehydrogenase, PLDH)은 말라리아 원충 당분해 과정의 정상적인 진행을 보장하는 중요한 효소로서 인간 적혈구 및 기타 많은 미생물의 젖산 탈수소효소와 비교할 때 물리적, 생화학적 특성이 크게 다르며, 말라리아 원충의 생체 활동 과정에서 필수적으로 발현되는 단백질이며 풍부하게 존재하기에 말라리아 원충 검출의 중요한 표적이 되었다. PLDH는 살아있는 말라리아 원충에 의해서만 생성되기 때문에 PLDH를 검출 항원으로 사용하는 방법은 환자의 원충의 생사를 식별할 수 있어 치료 효과 및 재발 상황을 평가하고 모니터링할 수 있다. 또한 4가지 말라리아 원충에 의해 생성된 PLDH는 상이한 이성질체를 구비하고, 예를 들면 종 및 속이 특이적인 항원이며, 이는 크게 두 가지로 나뉠수 있다. 하나는 pf LDH, pv LDH, pm LDH, po LDH를 포함하는 종 특이적 LDH인데 이를 표적 단백질로 하여 생성한 단클론은 특이적 종의 말라리아 원충의 LDH만 식별한다. 다른 하나는 범종 특이적 항원 말라리아 원충 젖산 탈수소효소(Pan-PLDH)인데, 이를 표적 단백질로 하여 생성한 단클론은 4가지 말라리아 원충의 LDH를 식별할 수 있다.
현재 시중에서 말라리아 원충을 검출하기 위해 Pan-PLDH를 표적 단백질로 사용하는 키트에는 CareStart 말라리아 HRP-II/PLDH 복합 키트 및 OptiMAL 진단 키트가 있다. CareStart 말라리아 HRP-II/PLDH 복합 키트는 미국 Access Bio 회사에서 생산한 것이고, 두 가지 단클론 항체를 사용하여 멤브레인에 두 개의 독립적인 검출 라인을 형성하며 이들은 각각 항 말라리아 원충 속(열대열 말라리아, 삼일열 말라리아, 난형 말라리아, 사일열 말라리아)의 젖산 탈수소효소(Pan-PLDH)의 단클론 항체 및 항-HRP-II 단클론 항체이며, 특히 열대열 말라리아 및 기타 유형의 말라리아의 감별 진단에 사용된다. OptiMAL 진단 키트는 폴란드 오레곤에서 생산되고, 크로마토그래피 스트립은 말라리아 원충 LDH 단클론 항체 2 개 균주로 코팅되어 있으며, 하나의 균주는 열대열 말라리아 종 특이정 단클론 항체이고 다른 균주는 4 가지 인간 말라리아 원충과 모두 반응하는 속 특이적 단클론 항체이기에, 이는 열대열 말라리아 원충 또는 비 열대열 말라리아 원충 감염을 구분할 수 있다. 이밖에, 유사한 키트로는 미국 NovaBios 말라리아 원충 항원(pf/pan-PLDH) 검출 키트, 한국 SD 삼일열 말라리아 항원 검출 키트 P.f/Pan(HRP-2/pLDH), 미국 Binax NOW 말라리아 신속 검출 키트, wondfo 말라리아 원충 검출 키트(Pf-LDH/Pan-PLDH) 등이 있다.
각각의 상기 키트는 모두 항 Pan-PLDH 단클론 항체를 사용하였다. 현재 시중에서 진단용 단클론 항체를 제조하는 통상적인 방법은 유전 공학 기술을 이용하여 범종 특이적 항원 말라리아 원충 젖산 탈수소효소(Pan-PLDH) 단백질을 발현시켜 마우스를 면역시키는 하이브리도마 기술이다. 면역된 마우스 비장 세포와 종양 세포를 융합시켜 하이브리도마세포를 얻고, 마지막으로 표적 항체를 분비하는 하이브리도마 세포를 선별하여 항체를 생산한다. 지금까지 전통적인 하이브리도마 기술은 저렴한 비용, 지속 가능한 생산, 우수한 조작성 및 임상 진단 방면의 이점으로 인해 여전히 단클론 항체를 제조하는 주요 방법 중 하나이다. 그러나 전통적인 하이브리도마 기술을 사용하면 하이브리도마 세포의 배양 또는 냉동 보존, 소생 과정에서 일부 세포가 항체를 분비하는 능력을 잃어 일부 귀중한 세포주가 손실된다. 또한 다량의 항체를 생산하는 경우 체외에서 대량의 하이브리도마 세포가 배양되어 수율이 낮으며 일반적으로 배양액의 항체 함량은 10-60 mg/L이다. 대량 생산 시 비용이 높아지고; 마우스 복강 유도 과정에서 마우스 개체 크기의 영향, 항체의 생성 불안정성, 배치 간의 큰 차이 및 마우스 자가 항체 포함으로 인해 정제 난이도가 크다.
본 발명은 기존 하이브리도마 기술의 단점을 극복하기 위해 항 범종 특이적 항원 말라리아 원충 젖산 탈수소효소(Pan-PLDH) 단클론 항체의 발현 벡터를 설계하고, 항 범종 특이적 항원 말라리아 원충 젖산 탈수소효소(Pan-PLDH) 단클론 항체, 재조합 기술로 항 범종 특이적 항원 말라리아 원충 젖산 탈수소효소(Pan-PLDH) 단클론 항체를 발현시키는 숙주세포, 및 말라리아 진단 방법을 제공한다.
본 발명은 범종 특이적 항원 말라리아 원충 젖산 탈수소효소의 항원 결합 도메인을 포함하는 신규 분리된 결합 단백질에 관한 것이고, 상기 결합 단백질의 제조, 응용 등 측면에서 연구한 것이다.
상기 항원 결합 도메인은 하기 아미노산 서열의 상보성 결정 영역으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하거나, 하기 아미노산 서열의 상보성 결정 영역과 적어도 80%의 서열 동일성을 가지고 범종 특이적 말라리아 원충 젖산 탈수소효소와 KD≤1.5647×10-9 ㏖/ℓ의 친화력을 가지며,
상보성 결정 영역 CDR-VH1은 G-X1-S-F-T-N-Y-X2-M-N이되,
X1은 S, Y 또는 T이고, X2는 W 또는 F이며;
상보성 결정 영역 CDR-VH2는 I-X1-P-S-X2-S-E-T-R-X3-N-Q이되,
X1은 H 또는 N이고, X2는 E 또는 D이며, X3은 I, V 또는 L이고;
상보성 결정 영역 CDR-VH3은 A-X1-S-G-X2-F-Y-T-X3-Y-X4-D-Y이되,
X1은 K 또는 R이고, X2는 D 또는 E이며, X3은 S, Y 또는 T이고, X4는 F 또는 W이며;
상보성 결정 영역 CDR-VL1은 R-G-X1-G-N-X2-H-N-Y-X3-A이되,
X1은 S 또는 T이고, X2는 I, V 또는 L이며, X3은 I 또는 L이고;
상보성 결정 영역 CDR-VL2는 N-A-X1-T-X2-A-D이되,
X1은 R 또는 K이고, X2는 I, V 또는 L이며;
상보성 결정 영역 CDR-VL3은 Q-X1-F-W-S-X2-Y-T이되,
X1은 S, Y 또는 T이고, X2는 S 또는 T이다.
하나의 중요한 장점은 상기 결합 단백질의 활성이 강하고 범종 특이적 항원 말라리아 원충 젖산 탈수소효소와 아주 높은 친화력을 가진다는 것이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서:
상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서, X2는 W이고;
상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서, X1은 H이며;
상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서, X4는 F이고;
상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서, X3은 L이며;
상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서, X2는 T이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서, X1은 S이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서, X1은 Y이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서, X1은 T이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서, X2는 E이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서, X2는 D이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서, X3은 I이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서, X3은 V이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서, X3은 L이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서, X1은 K이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서, X1은 R이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서, X2는 D이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서, X2는 E이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서, X3은 S이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서, X3은 Y이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서, X3은 T이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서, X1은 S이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서, X1은 T이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서, X2는 I이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서, X2는 V이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서, X2는 L이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서, X1은 R이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서, X1은 K이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서, X2는 I이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서, X2는 V이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서, X2는 L이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서, X1은 S이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서, X1은 Y이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서, X1은 T이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 각 상보성 결정 영역의 돌연변이 부위는 하기 돌연변이 조합 중 어느 하나로부터 선택된다.
Figure pct00001
Figure pct00002
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 결합 단백질은 적어도 3개의 CDR을 포함하거나; 상기 결합 단백질은 적어도 6개의 CDR을 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 결합 단백질은 나노 항체, F(ab')2, Fab', Fab, Fv, scFv, 이중 특이성 항체 및 항체 최소 인식 단위 중 하나이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 결합 단백질은 서열이 순차적으로 서열번호 1 내지 4로 표시되는 경쇄 골격 영역 FR-L1, FR-L2, FR-L3 및 FR-L4, 및/또는, 서열이 순차적으로 서열번호 5 내지 8로 표시되는 중쇄 골격 영역 FR-H1, FR-H2, FR-H3 및 FR-H4를 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 바람직하게, 상기 결합 단백질은 항체 불변 영역 서열을 더 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 불변 영역 서열은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, IgD 중 어느 하나의 불변 영역의 서열로부터 선택된다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 불변 영역의 종속 유래는 소, 말, 젖소, 돼지, 면양, 염소, 래트, 마우스, 개, 고양이, 토끼, 낙타, 당나귀, 사슴, 담비, 닭, 오리, 거위, 칠면조, 게임콕(game cock) 또는 인간이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 불변 영역은 마우스로부터 유래된다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 경쇄 불변 영역 서열은 서열번호 9로 표시된다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 중쇄 불변 영역 서열은 서열번호 10으로 표시된다.
본 발명은 분리된 핵산 분자를 제공하고, 상기 핵산 분자는 DNA 또는 RNA이고, 본 발명에 따른 결합 단백질을 코딩한다.
본 발명은 본 발명에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 본 발명에 따른 벡터에 의해 형질전환되는 숙주세포를 제공한다.
본 발명은 적합한 배양 조건에서 배지에서 본 발명에 따른 숙주세포를 배양하고, 생성된 결합 단백질을 배지 또는 배양된 숙주세포로부터 회수하는 단계를 포함하는 본 발명에 따른 결합 단백질의 생성 방법을 제공한다.
본 발명은 말라리아 진단을 위한 진단제의 제조에서의 본문에 따른 결합 단백질의 응용을 제공한다.
본 발명은 시험 샘플 중의 범종 특이적 항원 말라리아 원충 젖산 탈수소효소의 검출 방법을 제공하고, 이는
a) 항체/항원 결합 반응을 충분히 일으키는 조건에서, 상기 시험 샘플 중 범종 특이적 항원 말라리아 원충 젖산 탈수소효소 항원을 본 발명에 따른 결합 단백질과 접촉시켜 면역 복합체를 형성하는 단계; 및
b) 상기 시험 샘플 중 상기 범종 특이적 항원 말라리아 원충 젖산 탈수소효소의 존재를 지시하는 상기 면역 복합체의 존재를 검출하는 단계를 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 단계 a)에서 상기 면역 복합체는 상기 결합 단백질과 결합되는 제2 항체를 더 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 단계 a)에서, 상기 면역 복합체는 상기 범종 특이적 항원 말라리아 원충 젖산 탈수소효소와 결합되는 제2 항체를 더 포함한다.
본 발명은 본 발명에 따른 결합 단백질을 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명은 말라리아 진단에서의 본문에 따른 결합 단백질의 응용을 더 제공한다.
본 발명은 말라리아 진단 방법을 더 제공하고, 이는
A) 결합 반응을 충분히 일으키는 조건에서, 피험자의 샘플을 본 발명에 따른 결합 단백질과 접촉시켜 결합 반응을 진행하는 단계; 및
B) 결합 반응을 통해 생성된 면역 복합체를 검출하는 단계를 포함하고,
상기 면역 복합체의 존재는 말라리아의 존재를 지시한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 방법은 형광 면역 기술, 화학 발광 기술, 콜로이드 금 면역 기술, 방사성 면역 분석 및/또는 효소 결합 면역 기술에 기초한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 샘플은 전혈, 외주혈, 혈청 또는 혈장 중 적어도 하나에서 선택된다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 피험자는 포유 동물이고, 바람직하게 영장류 동물이며, 더 바람직하게 인간이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 말라리아는 삼일열 말라리아, 열대열 말라리아, 사일열 말라리아, 난형 말라리아 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 말라리아는 말라리아 원충 속(Plasmodium)에 의한 말라리아이다.
본 발명의 구체적인 실시형태 또는 선행기술의 기술적 해결수단을 보다 명확하게 설명하기 위하여, 아래, 구체적인 실시형태 또는 선행기술에서 사용하고자 하는 도면을 간단히 설명하고, 아래에서 설명되는 도면은 본 발명의 일부 실시예일 뿐, 본 기술분야의 통상의 기술자에게 있어서, 진보성 창출에 힘 쓸 필요없이 이러한 도면으로부터 다른 도면을 얻을 수 있는 것은 자명한 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예 중 항 범종 특이적 항원 말라리아 원충 젖산 탈수소효소의 단클론 항체 전기영동도이다.
본 발명은 본 발명의 일부 실시형태에 대한 후속적인 설명 및 여기에 포함된 실시예의 상세한 내용을 통해 더 용이하게 이해될 것이다.
본 발명을 더 설명하기 전에, 상기 특정 실시형태는 필연적으로 다양하므로, 본 발명은 이러한 실시형태에 한정되지 않음을 이해해야 한다. 또한 본 명세서에서 사용된 용어는 특정 실시형태를 설명하기 위한 것일 뿐 한정하기 위한 것이 아닌데, 이는 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에만 의해 한정되기 때문이다.
명사 정의
용어 "항원 결합 도메인을 포함하는 분리된 결합 단백질"은 일반적으로 CDR 영역을 포함하는 모든 단백질/단백질 단편을 의미한다. 용어 "항체"는 다클론 항체, 단클론 항체 및 이들 항체의 항원 화합물 결합 단편을 포함하는데, Fab, F(ab')2, Fd, Fv, scFv, 이중 특이성 항체 및 항체 최소 인식 단위, 및 이들 항체 및 단편의 단일 가닥 유도체를 포함한다. 항체의 유형은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, IgD로부터 선택될 수 있다. 이 밖에, 용어 "항체"는 천연 항체 및 비천연 항체를 포함하는데, 예를 들어, 키메라(chimeric) 항체, 이중 기능성(bifunctional) 항체 및 인간화(humanized) 항체, 및 관련된 합성 이소형(isoforms)를 포함한다. 용어 "항체"는 "면역 글로불린"과 호환하여 사용될 수 있다.
항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노 말단기 도메인을 의미한다. 중쇄의 가변 도메인은 "VH"로 지칭될 수 있다. 경쇄의 가변 도메인은 "VL"로 지칭될 수 있다. 이러한 도메인은 일반적으로 항체의 가장 가변적인 부분이고, 항원 결합 부위를 포함한다. 경쇄 또는 중쇄 가변 영역(VL 또는 VH)은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"의 초가변 영역 및 이 3개의 상보성 결정 영역을 분리하는 골격 영역으로 불리우는 3개로 구성된다. 골격 영역은 및 CDR의 범위는 예를 들어 Kabat("면역에 중요한 단백질의 서열"(Sequences of Proteins of Immunological Interest를 참조), E.Kabat 등, 미국 보건복지부(U.S.Department of Health and Human Services), (1983)) 및 Chothia에서 이미 정확하게 정의되었다. 항체의 골격 영역은 위치를 결정하고 CDR을 정렬하는 작용을 하고, 상기 CDR은 주로 항원과의 결합을 담당한다.
본문에서 사용될 경우, "골격 영역", "프레임워크 영역" 또는 "FR"은 항체 가변 도메인의, CDR로 정의된 영역을 제외한 영역을 의미한다. 각각의 항체 가변 도메인 프레임워크는 또한 CDR에 의해 분리된 인접 영역(FR1, FR2, FR3 및 FR4)으로 세분화될 수 있다.
일반적으로, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 VL/VH는 CDR 및 FR을 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4와 같은 조합으로 배열하고 연결하여 얻을 수 있다.
본문에서 사용될 경우, 폴리펩타이드 또는 핵산과 관련된 용어 "정제된" 또는 "분리된"은 폴리펩타이드 또는 핵산이 이의 천연 매체 또는 천연 형태가 아닌 것을 의미한다. 따라서, 용어 "분리된"은 예를 들어 천연적으로 존재하는 것이면, 이의 원시 환경인 천연적 환경으로부터 추출된 폴리펩타이드 또는 핵산을 포함한다. 예를 들어, 분리된 폴리펩타이드는 일반적으로 이와 결합되거나 일반적으로 이와 혼합되거나 용액에서의 적어도 일부 단백질 또는 다른 세포 조성성분을 일반적으로 함유하지 않는다. 분리된 폴리펩타이드는 세포 분해물에 포함된 천연적으로 생성된 상기 폴리펩타이드, 정제 또는 부분 정제된 형태의 상기 폴리펩타이드, 재조합 폴리펩타이드, 세포에 의해 발현 또는 분비된 상기 폴리펩타이드, 및 이종 숙주세포 또는 배양물에서의 상기 폴리펩타이드를 포함한다. 핵산과 관련하여, 분리된 또는 정제된 등 용어는 예를 들어 상기 핵산이 이의 천연적인 게놈 배경에 존재하지 않음을 의미한다(예를 들어, 벡터에서, 발현 카세트로서, 프로모터에 연결하거나, 수동으로 이종 숙주세포에 인입함).
본문에서 사용된 바와 같이, 용어 "이중 특이성 항체" 또는 "이중 기능성 항체"는 두 쌍의 상이한 중쇄/경괘 및 2개의 상이한 결합 부위를 가지는 인조 이형접합성 결합 단백질을 의미한다. 이중 특이성 결합 단백질은 하이브리도마의 융합 또는 Fab'단편의 연결을 포함한 다양한 방법을 통해 생성될 수 있다.
본문에서 사용된 바와 같이, 용어 "서열 동일성"은 적어도 두 가지 상이한 서열 사이의 유사성을 의미한다. 이 백분율 동일성은 예를 들어 블라스트(Basic Local Alignment Search Tool, BLAST); Needleman 등 알고리즘; 또는 Meyers 등 알고리즘과 같은 표준 알고리즘을 통해 결정될 수 있다. 하나 또는 다수의 실시형태에서, 한 그룹의 파라미터는 Blosum 62 평점 매트릭스 및 갭 패널티 12, 갭 확장 패널티 4 및 프레임시프트 갭 패널티 5일 수 있다. 하나 또는 다수의 실시형태에서, 두 가지 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열 사이의 백분율 동일성은 Meyers 및 Miller((1989)CABIOS 4: 11-17)의 알고리즘을 사용하여 결정될 수도 있는데, 상기 알고리즘에 ALIGN 프로그램(2.0버전)을 도입하였고, PAM120 가중 잔기 리스트, 갭 길이 패널티 12, 및 갭 패널티 4를 사용하였다. 백분율 동일성은 일반적으로 길이가 비슷한 서열을 비교하여 계산한다.
본문에서 사용된 바와 같이, 용어 "친화력"은 결합 단백질 또는 항체의 항원 결합 도메인과 항원 또는 항원 에피토프의 결합 강도를 의미한다. 친화력은 KD 값을 사용하여 측정할 수 있고, KD 값이 작을수록, 친화력이 크다.
본문에서 사용된 바와 같이, 용어 "범종 특이적 항원 말라리아 원충 젖산 탈수소효소"와 "범종 특이적 말라리아 원충 젖산 탈수소효소"는 호환하여 사용될 수 있고, 상기 젖산 탈수소효소는 말라리아 원충 속(Plasmodium) 병원체의 범종 특이적 항원일 수 있으며, 예를 들면 삼일열 말라리아 원충(Plasmodium vivax, pv), 열대열 말라리아 원충(Plasmodium falciparum, pf), 사일열 말라리아 원충(Plasmodium maiariae, pm) 및 난형 말라리아 원충(Plasmodium ovale, po)의 범종 특이적 항원일 수 있다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 항 범종 특이적 항원 말라리아 원충 젖산 탈수소효소의 항체 또는 그 결합 단백질은 말라리아 원충 속 병원체의 LDH에 특이적으로 결합하거나 식별할 수 있기에, 말라리아 원충 속(Plasmodium) 병원체에 의한 말라리아를 특이적으로 진단할 수 있다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 항 범종 특이적 항원 말라리아 원충 젖산 탈수소효소의 항체 또는 그 결합 단백질은 삼일열 말라리아 원충(Plasmodium vivax, pv), 열대열 말라리아 원충(Plasmodium, falciparum, pf), 사일열 말라리아 원충(Plasmodium maiariae, pm)및 난형 말라리아 원충(Plasmodium ovale, po)의 LDH에 특이적으로 결합하거나 식별할 수 있기에, 삼일열 말라리아 원충(Plasmodium vivax, pv), 열대열 말라리아 원충(Plasmodium falciparum, pf), 사일열 말라리아 원충(Plasmodium maiariae, pm) 및/또는 난형 말라리아 원충(Plasmodium ovale, po)에 의한 말라리아를 진단할 수 있고, 열대열 말라리아, 삼일열 말라리아, 난형 말라리아 및 사일열 말라리아를 포함한다.
본 발명의 예시적 해결 수단
본 발명은 항원 결합 도메인을 포함하는 분리된 결합 단백질에 관한 것이고, 상기 항원 결합 도메인은 하기 아미노산 서열의 상보성 결정 영역으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하거나, 하기 아미노산 서열의 상보성 결정 영역과 적어도 80%의 서열 동일성을 가지고 범종 특이적 말라리아 원충 젖산 탈수소효소와 KD≤1.5647×10-9 ㏖/ℓ의 친화력을 가지며;
상보성 결정 영역 CDR-VH1은 G-X1-S-F-T-N-Y-X2-M-N이되,
X1은 S, Y 또는 T이고, X2는 W 또는 F이며;
상보성 결정 영역 CDR-VH2는 I-X1-P-S-X2-S-E-T-R-X3-N-Q이되,
X1은 H 또는 N이고, X2는 E 또는 D이며, X3은 I, V 또는 L이고;
상보성 결정 영역 CDR-VH3은 A-X1-S-G-X2-F-Y-T-X3-Y-X4-D-Y이되,
X1은 K 또는 R이고, X2는 D 또는 E이며, X3은 S, Y 또는 T이고, X4는 F 또는 W이며;
상보성 결정 영역 CDR-VL1은 R-G-X1-G-N-X2-H-N-Y-X3-A이되,
X1은 S 또는 T이고, X2는 I, V 또는 L이며, X3은 I 또는 L이고;
상보성 결정 영역 CDR-VL2는 N-A-X1-T-X2-A-D이되,
X1은 R 또는 K이고, X2는 I, V 또는 L이며;
상보성 결정 영역 CDR-VL3은 Q-X1-F-W-S-X2-Y-T이되,
X1은 S, Y 또는 T이고, X2는 S 또는 T이다.
상기 항체는 샘플 중의 범종 특이적 말라리아 원충 젖산 탈수소효소(panLDH)를 정성, 정량 검출할 수 있기에, 말라리아 의심 환자의 보조 진단 또는 말라리아 지역 병례 선별 검사에 적용될 수 있다.
열대열 말라리아 원충, 삼일열 말라리아 원충, 사일열 말라리아 원충 또는 난형 말라리아 원충의 젖산 탈수소효소는 아주 높은 보존성을 가지고, 본 발명이 제공하는 항체는 범 특이적이기에, 상기 4가지 말라리아 원충의 젖산 탈수소효소와 결합할 수 있다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 항원 결합 도메인은 하기 아미노산 서열의 상보성 결정 영역과 적어도 50%, 또는 적어도 55%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 65%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 75%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가지고 범종 특이적 항원 말라리아 원충 젖산 탈수소효소와 KD≤1.5647×10-9 ㏖/ℓ의 친화력을 가지며, 예를 들면 l×10-9 ㏖/ℓ, 2×10-9 ㏖/ℓ, 3×10-9 ㏖/ℓ, 4×10-9 ㏖/ℓ, 4.5×10-9 ㏖/ℓ, 5×10-9 ㏖/ℓ, 6×10-9 ㏖/ℓ, 7×10-9 ㏖/ℓ, 8×10-9 ㏖/ℓ, 9×10-9 ㏖/ℓ, l×10-10 ㏖/ℓ, 3×10-10 ㏖/ℓ, 5×10-10 ㏖/ℓ > 7×10-10 ㏖/ℓ, 9×10-10 ㏖/ℓ 또는 1×10-11 ㏖/ℓ, 2×10-11, 3×10-11, 4×10-11, 5×10-11, 6×10-11, 7×10-11, 810-11, 9×10-11의 친화력을 가지거나, 또는 KD는 1×10-9 ㏖/ℓ, 2×10-9 ㏖/ℓ, 3×10-9 ㏖/ℓ, 4×10-9 ㏖/ℓ, 4.5×10-9 ㏖/ℓ, 5×10-9 ㏖/ℓ, 6×10-9 ㏖/ℓ, 7×10-9 ㏖/ℓ, 8×10-9 ㏖/ℓ, 9×10-9 ㏖/ℓ, 1×10-10 ㏖/ℓ, 3×10-10 ㏖/ℓ, 5×10-10 ㏖/ℓ, 7×10-10 ㏖/ℓ, 9×10-10 ㏖/ℓ 또는 1×10-11 ㏖/ℓ, 2×10-11, 3×10-11, 4×10-11, 5×10-11, 6×10-11, 7×10-11, 8×10-11 또는 9×10-11보다 작거나 같거나;
또는 8.7941×10-11 ㏖/ℓ≤KD≤1.5647×10-9 ㏖/ℓ이다.
여기서, 친화력은 본 발명의 명세서에 따른 방법으로 측정한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서:
상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서, X2는 W이고;
상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서, X1은 H이며;
상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서, X4는 F이고;
상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서, X3은 L이며;
상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서, X2는 T이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서, X1은 S이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서, X1은 Y이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서, X1은 T이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서, X2는 E이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서, X2는 D이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서, X3은 I이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서, X3은 V이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서, X3은 L이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서, X1은 K이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서, X1은 R이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서, X2는 D이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서, X2는 E이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서, X3은 S이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서, X3은 Y이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서, X3은 T이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서, X1은 S이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서, X1은 T이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서, X2는 I이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서, X2는 V이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서, X2는 L이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서, X1은 R이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서, X1은 K이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서, X2는 I이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서, X2는 V이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서, X2는 L이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서, X1은 S이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서, X1은 Y이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서, X1은 T이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 각 상보성 결정 영역의 돌연변이 부위는 하기 돌연변이 조합 중 어느 하나로부터 선택된다.
Figure pct00003
Figure pct00004
하나 또는 다수의 실시형태에서, 본 발명에 따른 결합 단백질의 6개의 CDR 영역에서 나타난 X1은 각각 서로 독립적으로 본 발명에서 한정된 아미노산을 의미하고; 본 발명에 따른 결합 단백질의 6개의 CDR 영역에서 나타난 X2는 각각 서로 독립적으로 본 발명에서 한정된 아미노산을 의미하며; 본 발명에 따른 결합 단백질의 6개의 CDR 영역에서 나타난 X3은 각각 서로 독립적으로 본 발명에서 한정된 아미노산을 의미하고; 본 발명에 따른 결합 단백질의 6개의 CDR 영역에서 나타난 X4는 각각 서로 독립적으로 본 발명에서 한정된 아미노산을 의미한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 결합 단백질은 적어도 3개의 CDRs(예를 들면 3개의 경쇄 CDR 또는 3개의 중쇄 CDR)를 포함하거나; 상기 결합 단백질은 적어도 6개의 CDR을 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 결합 단백질은 가변 영역 및 불변 영역을 포함하는 완전 항체이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 결합 단백질은 나노 항체, F(ab')2, Fab', Fab, Fv, scFv, 이중 특이성 항체 및 항체 최소 인식 단위 중 하나이다.
scFv(sc = 단일 가닥), 이중 특이성 항체(diabodies)이다.
본 발명에 따른 "기능 단편"은 범종 특이적 항원 말라리아 원충 젖산 탈수소효소에 대해 모체 항체와 동일한 특이성을 가지는 항체 단편을 특별히 의미한다. 상기 기능 단편 이외에, 반감기에 이미 증가된 임의의 단편을 더 포함한다.
이러한 기능 단편은 일반적으로 이들이 유래되는 항체와 동일한 결합 특이성을 가진다. 본 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명의 설명에 기재된 내용에 따라, 본 발명의 항체 단편은 예를 들어 효소 소화법(펩신 또는 파파인을 포함) 및/또는 화학적 환원으로 이황화 결합을 분열시키는 방법을 통해 상기 기능 단편을 얻을 수 있음을 추정한다.
항체 단편은 본 기술분야의 통상의 기술자가 알고 있는 재조합 유전학 기술 또는 예를 들어 Applied BioSystems 등에서 판매하는 자동 펩타이드 합성 기기를 통해, 펩타이드 합성을 통해 얻을 수도 있다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 결합 단백질은 서열이 순차적으로 서열번호 1 내지 4로 표시되는 경쇄 골격 영역 FR-L1, FR-L2, FR-L3 및 FR-L4, 및/또는, 서열이 순차적으로 서열번호 5 내지 8로 표시되는 중쇄 골격 영역 FR-H1, FR-H2, FR-H3 및 FR-H4를 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 결합 단백질은 항체 불변 영역 서열을 더 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 불변 영역 서열은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, IgD 중 어느 하나의 불변 영역의 서열로부터 선택된다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 불변 영역의 종속 유래는 소, 말, 젖소, 돼지, 면양, 염소, 래트, 마우스, 개, 고양이, 토끼, 낙타, 당나귀, 사슴, 담비, 닭, 오리, 거위, 칠면조, 게임콕 또는 인간이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 불변 영역은 마우스로부터 유래되고;
경쇄 불변 영역 서열은 서열번호 9로 표시되며;
중쇄 불변 영역 서열은 서열번호 10으로 표시된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 또한 상술한 결합 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA인 분리된 핵산 분자에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 또한 상술한 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 핵산 분자를 코딩하는 적어도 하나의 핵산 구조물, 예를 들어, 플라스미드, 나아가 발현 플라스미드를 더 포함하되, 본 발명의 일 실시예에서 상기 벡터의 구축 방법을 설명할 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 또한 상술한 벡터에 의해 형질전환되는 숙주세포에 관한 것이다.
상기 숙주세포는 포유 동물 세포와 같은 진핵세포일 수 있다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 숙주세포는 CHO 세포이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 또한 적합한 배양 조건에서 배지에서 본 발명에 따른 숙주세포를 배양하고, 생성된 결합 단백질을 배지 또는 배양된 숙주세포로부터 회수하는 단계를 포함하는 상술한 결합 단백질의 생성 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 또한 말라리아 진단을 위한 진단제의 제조에서의 상술한 결합 단백질의 응용에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 또한 시험 샘플 중의 범종 특이적 항원 말라리아 원충 젖산 탈수소효소의 검출 방법에 관한 것이고, 이는
a) 항체/항원 결합 반응을 충분히 일으키는 조건에서, 상기 시험 샘플 중 범종 특이적 항원 말라리아 원충 젖산 탈수소효소 항원을 본 발명에 따른 결합 단백질과 접촉시켜 면역 복합체를 형성하는 단계; 및
b) 상기 시험 샘플 중 상기 범종 특이적 항원 말라리아 원충 젖산 탈수소효소의 존재를 지시하는 상기 면역 복합체의 존재를 검출하는 단계를 포함한다.
이 실시형태에서, 상기 결합 단백질은 신호 강도를 표시하는 지시약을 표지하여 상기 복합체가 용이하게 검출되도록 할 수 있다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 단계 a)에서 상기 면역 복합체는 상기 결합 단백질과 결합되는 제2 항체를 더 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 단계 a)에서, 상기 면역 복합체는 상기 범종 특이적 항원 말라리아 원충 젖산 탈수소효소와 결합되는 제2 항체를 더 포함한다.
이 실시형태에서, 상기 결합 단백질은 1차 항체의 형태로 상기 2차 항체와 함께 항체 쌍을 형성하여 상기 범종 특이적 항원 말라리아 원충 젖산 탈수소효소의 상이한 항원 에피토프에 결합된다.
상기 제2 항체는 신호 강도를 표시하는 지시약을 표지하여 상기 복합체가 용이하게 검출되도록 할 수 있다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 단계 a)에서, 상기 면역 복합체는 상기 범종 특이적 항원 말라리아 원충 젖산 탈수소효소 항원과 결합되는 제2 항체를 더 포함한다.
이 실시형태에서, 상기 결합 단백질은 상기 제2 항체의 항원이고, 상기 제2 항체는 신호 강도를 표시하는 지시약을 표지하여 상기 복합체가 용이하게 검출되도록 할 수 있다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 신호 강도를 표시하는 지시약은 형광 물질, 양자점, 디곡시게닌 라벨링 프로브, 바이오틴, 방사성 동위 원소, 방사성 조영제, 상자성 이온 형광 비드, 전자밀도 물질, 광학 발광 마커, 초음파 조영제, 감광제, 금콜로이드 또는 효소 중 어느 하나를 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 형광 물질은 Alexa 350, Alexa 405, Alexa 430, Alexa 488, Alexa 555, Alexa 647, AMCA, 아미노아크리딘, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, 5-카르복시-4′, 5′-디클로로-2′, 7′-디메톡시플루오레세인, 5-카르복시-2′, 4′, 5′, 7′-테트라클로로플루오레세인, 5-카르복시플루오레세인, 5-카르복시로다민, 6-카르복시로다민, 6-카르복시테트라메틸로다민, Cascade Blue, Cy2, Cy3, Cy5, Cy7, 6-FAM, 단실클로라이드, 플루오레세인, HEX, 6-JOE, NBD(7-니트로벤조-2-옥사-1, 3-디아졸), Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green514, Pacific Blue, 프탈산, 테레프탈산, 이소프탈산, 크레실 패스트 바이올렛, 크레실 블루 바이올렛, 브릴리안트 크레실 블루, P-아미노벤조산, 에리트로신, 프탈로시아닌, 아조메틴, 시아닌, 크산틴, 숙시닐플루오레세인, 희토류 금속 크립테이트, 유로퓸 트리비스 피리딜디아민, 유로퓸 크립테이트 또는 킬레이트, 디아민, 디시아닌, La Jolla 블루 염료, 알로피코시아닌, allococyanin B, 피코시아닌 C, 피코시아닌 R, 티아민, 피코에리트린 B, 피코에리트린 R, REG, 로다민 그린, 로다민 이소티오시아네이트, 로다민 레드, ROX, TAMRA, TET, TRIT(테트라메틸로다민 이소티올), 테트라메틸로다민 및 텍사스 레드 중 어느 하나를 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 방사성 동위 원소는 110In, 111In, 177Lu, 18F, 52Fe, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 86Y, 90Y, 89Zr, 94mTc, 94Tc, 99mTc, 120I, 123I, 124I, 125I, 131I, 154-158Gd, 32P, 11C, 13N, 15O, 186Re, 188Re, 51Mn, 52mMn, 55Co, 72As, 75Br, 76Br, 82mRb 및 83Sr 중 어느 하나를 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 효소는 겨자무과산화효소, 알칼리 포스파타아제 및 글루코스산화효소 중 어느 하나를 포함한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 형광 비드는 내부에 희토류 형광 이온 유로퓸이 감싸져 있는 폴리스티렌 형광 비드이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 또한 상술한 결합 단백질을 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 발명은 말라리아 진단에서의 본문에 따른 결합 단백질의 응용을 더 제공한다.
본 발명은 말라리아 진단 방법을 더 제공하고, 이는
A) 결합 반응을 충분히 일으키는 조건에서, 피험자의 샘플을 본 발명에 따른 결합 단백질과 접촉시켜 결합 반응을 진행하는 단계; 및
B) 결합 반응을 통해 생성된 면역 복합체를 검출하는 단계를 포함하고,
상기 면역 복합체의 존재는 말라리아의 존재를 지시한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 방법은 형광 면역 기술, 화학 발광 기술, 콜로이드 금 면역 기술, 방사성 면역 분석 및/또는 효소 결합 면역 기술에 기초한다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 샘플은 전혈, 외주혈, 혈청 또는 혈장 중 적어도 하나에서 선택된다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 피험자는 포유 동물이고, 바람직하게 영장류 동물이며, 더 바람직하게 인간이다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 말라리아는 삼일열 말라리아, 열대열 말라리아, 사일열 말라리아, 난형 말라리아 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
하나 또는 다수의 실시형태에서, 상기 말라리아는 말라리아 원충 속(Plasmodium)에 의한 말라리아이다.
아래, 실시예와 결부시켜 본 발명의 실시형태를 상세하게 설명하지만, 본 기술분야의 통상의 기술자는 아래 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 한정하지 않음을 이해해야 한다. 실시예에서 구체저인 조건을 주명하지 않았으면, 통상적인 조건, 또는 제조업체에서 권장하는 조건을 따를 수 있다. 사용되는 시약 또는 기기의 생산 업체를 주명하지 않았으면, 모두 시중에서 구매한 통상적인 제품을 사용할 수 있다.
실시예 1
본 실시예는 항 범종 특이적 항원 말라리아 원충 젖산 탈수소효소의 재조합 항체의 예시적 제조 방법을 제공한다.
S1, 발현 플라스미드의 구축:
본 실시예에서 제한 엔도뉴클레아제, Prime Star DNA 폴리메라아제는 Takara 회사에서 구매하였고;
MagExtractor-RNA 추출 키트는 TOYOBO 회사에서 구매하였으며;
BD SMART™ RACE cDNA Amplification Kit 키트는 Takara 회사에서 구매하였고;
pMD-18T 벡터는 Takara 회사에서 구매하였으며;
플라스미드 추출 키트는 TIANGEN 회사에서 구매하였고;
프라이머 합성 및 유전자 시퀀싱(gene sequencing)은 Invitrogen 회사에서 완성하였으며;
Anti-PAN-PLDH 단클론 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주는 기존의 하이브리도마 세포주이므로, 소생시켜 사용을 위해 준비한다.
S11, 프라이머의 설계와 합성:
증폭 중쇄 및 경쇄의 5'RACE 업스트림 프라이머:
SMARTER II A 올리고뉴클레오타이드:
5'> AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACXXXXX <3';
5'-RACE CDS 프라이머(5'-CDS):
5'>(T)25VN<3'(N=A,C,G 또는 T; V=A,G 또는 C);
범용 프라이머 A 혼합물(UPM):
5'>CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT<3'
둥지 범용 프라이머 A(nested universal primer, NUP):
5'>AAGC AGTGGTATC AACGC AGAGT<3';
mkR: 5'> CGCCTAACACTCATTCCTGTTGAAGC <3';
mHR: 5'> CCGCTCATTTACCCGGAGACCG <3
S12, 항체 가변 영역 유전자 클론 및 시퀀싱:
Anti-PAN-PLDH 9G7 단클론 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주로부터 RNA을 추출하고, SMARTERTM RACE cDNA Amplification Kit 키트 및 키트 중의 SMARTER II A 올리고뉴클레오타이드 및 5'-CDS 프라이머를 사용하여 제1 가닥 cDNA 합성을 진행하여 얻은 제1 가닥 cDNA 산물을 PCR 증폭 템플릿으로 사용한다. 범용 프라이머 A 혼합물(UPM), 둥지 범용 프라이머 A(NUP) 및 mkR 프라이머로 경쇄 유전자를 증폭하고, 범용 프라이머 A 혼합물(UPM), 둥지 범용 프라이머 A(NUP) 및 mHR 프라이머로 중쇄 유전자를 증폭한다. 여기서, 경쇄의 프라이머 쌍은 0.7 KB 정도의 목적 스트라이프를 증폭해내고, 중쇄의 프라이머 쌍은 1.5 KB 정도의 목적 스트라이프를 증폭해낸다. 아가로스 겔 전기영동으로 정제하여 회수하고, rTaq DNA 폴리메라아제를 사용하여 산물을 A추가 반응시켜 pMD-18T 벡터에 삽입하여, DH5α 컴피턴트 세포에 형질전환시키며, 콜로니가 자란 후 중쇄 및 경쇄 유전자 클론을 10개씩 취하여 Invitrogen 회사에 보내 시퀀싱을 진행한다.
S13, Anti-PAN-PLDH 9G7 항체 가변 영역 유전자의 서열 분석:
상기 시퀀싱하여 얻은 유전자 서열을 IMGT 항체 데이터베이스에 넣어 분석하되, VNTI11.5 소프트웨어를 이용하여 분석하여, 중쇄 및 경쇄 프라이머 쌍이 증폭해낸 유전자가 모두 정확한 것을 확정하며, 여기서, 경쇄 프라이머 쌍이 증폭해낸 유전자 단편에서, VL 유전자 서열은 375 bp이고, VkII 유전자 패밀리에 속하며, 이의 앞에는 57 bp의 선도펩타이드 서열이 있고; 중쇄 프라이머 쌍이 증폭해낸 유전자 단편에서, VH 유전자 서열은 417 bp이며, VH1 유전자 패밀리에 속하고, 이의 앞에는 57 bp의 선도펩타이드 서열이 있다.
S14, 재조합 항체 발현 플라스미드의 구축:
pcDNA™ 3.4 TOPO® 벡터는 구축된 재조합 항체 진핵 발현 벡터이고, 상기 발현 벡터는 HindIII, BamHI, EcoRI 등 다클론 효소 절단 부위를 이미 인입하여 pcDNA 3.4A 발현 벡터로 명명하되, 후속적으로는 3.4A 발현 벡터로 약칭하며; 상기 pMD-18T 중 항체 가변 영역 유전자 시퀀싱 결과에 따라, 양단에 각각 HindIII, EcoRI 효소 절단 부위 및 보호 염기가 구비된, Anti-PAN-PLDH 9G7 항체의 VL 및 VH 유전자 특이성 프라이머를 설계하되, 프라이머는 하기와 같다.
Pan-9G7-HF:
5'> CCCAAGCTTGCCGCCACCATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCTGGGGT <3';
Pan-9G7-HR:
5'> GGGGAATTCTCATTTACCCGGAGACCGGGAGATGGTCTTC <3';
Pan-9G7-LF:
5'> CCCAAGCTTGCCGCCACCATGAAGTCACAGACCCAGGTCTTCGTA 3';
Pan-9G7-LR:
5'> CCCGAATTCTCAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACGATG <3';
PCR 증폭 방법을 통해 723 bp의 경쇄 유전자 단편 및 1.452 kb의 중쇄 유전자 단편을 증폭해낸다. 중쇄 및 경쇄 유전자 단편은 각각 HindIII/EcoRI 이중 효소 절단을 적용하고, 3.4A 벡터는 HindIII/EcoRI 이중 효소 절단을 적용하여, 단편 및 벡터를 정제하여 회수한 후 중쇄 유전자 및 경쇄 유전자를 각각 3.4A 발현 벡터에 연결하여, 중쇄 및 경쇄의 재조합 발현 플라스미드를 각각 얻는다.
S2. 항체 제조
S21, 재조합 플라스미드 순간적 형질전환(transient transfection) CHO 세포
초순수를 사용하여 플라스미드를 400 ng/㎖까지 희석하고, CHO 세포를 1.43×107개 세포/㎖로 조절하여 원심분리관에 넣으며, 100㎕의 플라스미드와 700㎕의 세포를 혼합하고, 전기 회전 컵에 이동하여 전기 회전시키고, CD CHO AGT를 함유한 10㎖의 배지에 이동하여, 37℃의 진탕기에서 배양하며(8%의 CO2, 115 내지 200 rpm의 진폭); 매일 샘플링하여 세포 생존율을 검출하되, 세포 생존율이 50%보다 낮을 때, 세포 배양 상청액을 원심분리한다.
S22, 상청액 발현 항체 활성 검정
코팅액으로 Pan-PLDH를 지정된 농도까지 희석하여, 각 웰에 100㎕씩 넣고, 4℃에서 하룻밤 지나며, 다음날, 세척액으로 2번 세척하여 두드려 건조시키고; 각 웰에 120㎕의 차단액(20%의 BSA + 80%의 PBS)을 넣고, 37℃에서 1시간 후, 두드려 건조시키며, 100㎕/웰의 희석된 후의 세포 상청액을 넣고, 37℃에서 30분(일부 상청액은 1시간 동안 적용함) 후, 세척액으로 5번 세척하여 두드려 건조시키며, 각 웰에 100㎕의 양-항-마우스 IgG-HRP를 넣고, 37℃에서 30분 후, 세척액으로 5번 세척하여 두드려 건조시키며, 현색액 A액(50㎕/웰)을 넣고 현색액 B액(50㎕/웰)을 넣으며, 10분 후, 50㎕/웰의 정지액을 넣으며, 마이크로 플레이트 리더의 450㎚(참조 630㎚) 위치에서 OD 값을 읽는다. 검정 결과, 발현 플라스미드 순간적으로 형질감염 후 생성된 항체가 Pan-PLDH 단백질에 대해 모두 활성을 가지는 것을 설명한다.
Protein A 친화층 크로마토그래피 컬럼 발현 상청
발효액의 상청액을 취하여 0.22㎚ 멤브레인으로 여과하고 상청액을 일정한 유속으로 Mab Slelect SuReLX(GE Healthcare) 친화성 충전제의 컬럼에 통과시켜 컬럼에 매달리게(Hanging) 한 다음 20 mM NaAc (pH 3.4) 용액으로 용출하고, 사전 중화를 위해 소정량의 1M Tris 용액을 샘플 수집 튜브에 첨가하였다. 용출된 샘플을 PBS(pH 7.4) 용액에서 3 회 투석하고 용액을 교체하여 정제된 항체를 얻었다. 정제된 항체를 취하여 환원성 SDS-PAGE를 진행한다. 결과는 도 1에 도시된 바와 같은 바, 제1 레인은 0.5 ㎎/㎖이고 제2 레인은 1 ㎎/㎖이며, 분자량이 큰 것이 중쇄이고, 분자량이 작은 것이 경쇄이다.
실시예 2
항체 친화력 분석 및 활성 검정
실시예 1에서 얻은 항체(서열이 서열번호 11로 표시되는 경쇄 및 서열번호 12로 표시되는 중쇄를 구비함)를 분석하였다.
서열번호 1 내지 12의 서열은 아래와 같다.
Figure pct00005
분석 결과, 중쇄의 상보성 결정 영역(WT)은 하기와 같은 바,
CDR-VH1은 G-S(X1)-S-F-T-N-Y-F(X2)-M-N이고;
CDR-VH2는 I-N(X1)-P-S-E(X2)-S-E-T-R-I(X3)-N-Q이며;
CDR-VH3은 A-K(X1)-S-G-D(X2)-F-Y-T-S(X3)-Y-W(X4)-D-Y이다.
경쇄의 상보성 결정 영역은 하기와 같은 바,
CDR-VL1은 R-G-S(X1)-G-N-L(X2)-H-N-Y-I(X3)-A이고;
CDR-VL2는 N-A-R(X1)-T-I(X2)-A-D이며;
CDR-VL3은 Q-S(X1)-F-W-S-S (X2)-Y-T이고;
여기서, X1, X2, X3은 모두 돌연변이 부위이다.
Figure pct00006
발명자는 활성이 보다 우수한 항체를 얻기 위해 WT 중의 CDR 부위에 대해 상기 돌연변이를 진행하였다.
코팅액으로 재조합 MA 단백질(자체 생산 150520-1)을 1 μg/㎖까지 희석하여 마이크로 웰판 코팅을 진행하되, 각 웰에 100㎕씩 넣고, 4℃에서 하룻밤 지나며, 다음날, 세척액으로 2번 세척하여 두드려 건조시키고; 37℃에서 1 h 동안 각 웰에 120㎕의 차단액(20%의 BSA + 80%의 PBS)을 넣고, 두드려 건조시키며, 37℃에서 30 min 동안 100㎕/웰의 희석된 후의 MA 단클론 항체를 넣고, 세척액으로 5번 세척하여 두드려 건조시키며; 37℃에서 30 min 동안 100㎕/웰의 양-항-마우스 IgG-HRP를 넣고; 세척액으로 5번 세척하여 두드려 건조시키며; 10 min 동안 현색액 A액(50㎕/웰)을 넣고 현색액 B액(50㎕/웰)을 넣으며; 50㎕/웰의 정지액을 넣고; 마이크로 플레이트 리더의 450㎚(참조 630㎚) 위치에서 OD 값을 읽는다.
Figure pct00007
상기 표로부터 알 수 있는 바, 돌연변이 1의 활성 효과가 가장 우수하므로, 돌연변이 1을 골격 서열로 사용하여 역가(titre)가 비교적 우수한 돌연변이 부위(선별하여 얻은 항체 활성이 돌연변이 1과 비슷하도록 보장하고, 항체 활성±10%)를 선별한 일부 결과는 하기와 같다.
Figure pct00008
Figure pct00009
친화력 분석
효소 면역 검정 간접 방법을 사용하여 활성 식별과 동일한 방식으로 데이터를 얻고, 0.5 ug/㎖, 0.25 ug/㎖, 0.125 ug/㎖, 0.0625 ug/㎖의 4 가지 구배 코팅을 준비한다. 항체는 100 ng/㎖에서 시작하여 2 배 구배로 0.195 ng/㎖까지 희석하여 로딩한다. 코팅 농도없이 상이한 항체 농도에 대응되는 OD 값을 얻는다. 동일한 코팅 농도에서 항체 농도를 가로 좌표로, OD 값을 세로 좌표로 하여 로그 좌표계를 그린다. 피팅 방정식에 따라 최대 OD 값의 50%에서 항체 농도를 계산하고 공식 k = (n-1)/(2×(n×Ab'-Ab))에 대입하여 친화성 상수의 역수를 계산한다. 여기서 Ab와 Ab'는 각각 해당 코팅 농도 (Ag, Ag')에서 최대 OD 값의 50%에서 항체 농도를 나타낸다. n = Ag/Ag'에 따라 두개의 코팅 농도마다 조합하여 K 값을 계산할 수 있고, 마지막으로 6 개의 K 값을 얻을 수 있다. 평균값을 취한 다음 역수를 구하면 친화성 상수 KD가 된다.
Figure pct00010
표 4로부터 알 수 있는 바, 표 3에 열거된 돌연변이 부위가 항체에 대한 친화력 영향이 크지 않다.
상기 결과를 검증하기 위해, WT를 골격 서열로 사용하여 상기 실험을 반복하여 돌연변이 부위의 친화력 검증을 진행한 일부 결과는 하기와 같다.
Figure pct00011
Figure pct00012
상기 표 5 및 표 6의 데이터 분석으로부터 알 수 있는 바, 항체 활성을 가지도록 보장하는 전제 하에, 상기 돌연변이 부위와 다른 부위의 연관도 크지 않다.
출원인은 표 4에 언급된 상기 항체를 다른 내부 항체(Pan-PLDH 항체와 쌍을 이룬 항체)와 함께 항체 쌍 실험 검증을 수행하여, 항체의 성질과 WT 항체가 유의적인 변화가 발생하였는지를 검사하였다. 이중 항체 샌드위치 법으로 항체 쌍 실험 검증을 수행한 결과, 특이성은 유의적인 변화없이 원래의 높은 수준을 유지하였으며, 이는 상기 항체가 돌연변이 이전의 WT 항체와 동일한 에피토프를 인식함을 나타낸다. 돌연변이 1의 친화력이 WT보다 높기 때문에 키트 적용시 돌연변이 1의 검출률도 WT보다 높다. 또한, 상기 항체의 특이성은 면역 진단 플랫폼에서 98% -100%에 도달할 수 있으며 테스트된 100개 샘플의 일관성은 95% ~ 98%에 도달할 수 있다.
또한, WT, 돌연변이 1, 무작위로 선택된 8 개의 돌연변이 항체의 안정성을 테스트하였다. 상기 항체는 37℃에서 72 시간 동안 보관하고 꺼낸 후, 4℃에서 72 시간 보관한 동일한 배치의 항체와 함께 동일한 테스트 조건에서 동일한 음성, 양성 품질 제어 샘플을 테스트하였다. 테스트 방법은 상기 실시예에서 사용된 항체 활성 분석 방법과 같다. 각 항체 그룹의 선형성은 모두 99.90% 이상에 도달할 수 있고 CV 값은 8% 미만이며, 상이한 온도에서 보관한 항체의 활성에는 통계적 차이가 없었다. 이는 상기 항체가 모두 우수한 안정성을 가지고 있으며, 부위의 돌연변이가 안정성에 영향을 미치지 않음을 보여준다.
마지막으로 설명해야 할 것은, 이상의 각 실시예는 단지 본 발명의 기술적 해결수단을 설명하기 위한 것일 뿐, 이를 한정하려는 것이 아니며, 전술한 각 실시예를 참조하여 본 발명을 상세하게 설명하였지만, 본 기술분야의 통상의 기술자는, 여전히 전술한 각 실시에 기재된 기술적 해결수단을 수정할 수 있거나 그 중 부분 또는 전부 기술특징에 대해 등가적 대체를 진행할 수 있으며, 이러한 수정 또는 대체는 대응되는 기술적 해결수단의 본질이 본 발명의 각 실시예의 기술적 해결수단의 범위를 벗어나지 않도록 함을 이해해야 한다.
본 발명의 항 범종 특이적 항원 말라리아 원충 젖산 탈수소효소(Pan-PLDH)의 항체 또는 그 결합 단백질은 4가지 말라리아 원충의 LDH에 특이적으로 결합하거나 식별할 수 있기에, 4가지 말라리아 원충에 의한 말라리아의 진단에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 항 범종 특이적 항원 말라리아 원충 젖산 탈수소효소(Pan-PLDH)의 항체 또는 그 결합 단백질의 검출 방법, 예를 들어 면역 크로마토그래피 신속 진단 시약법은 조작이 간단하고 빠르며 결과가 직관적이고 복잡한 장비가 필요없으며 민감도 및 특이성이 높으며 말라리아 현장 진단에 적합하다.
SEQUENCE LISTING <110> FAPON BIOTECH INC. <120> ANTIBODY AGAINST PAN-SPECIES-SPECIFIC PLASMODIUM LACTATE DEHYDROGENASE <130> WO2020/134306 <140> PCT/CN2019/109790 <141> 2019-10-01 <150> CN2018115953997 <151> 2018-12-25 <160> 12 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 23 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val Tyr 1 5 10 15 <210> 3 <211> 32 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser 1 5 10 15 Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 5 <211> 25 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser 20 25 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Met 1 5 10 15 <210> 7 <211> 34 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr 1 5 10 15 Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ala Glu Asp Ser Ala Val Tyr 20 25 30 Tyr Cys <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 9 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg 35 40 45 Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu 65 70 75 80 Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 100 105 <210> 10 <211> 335 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10 Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Cys Gly 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Ser Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser 35 40 45 Ser Val His Thr Phe Pro Ala Leu Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Met 50 55 60 Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val 65 70 75 80 Thr Cys Ser Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Thr Val Asp Lys Lys 85 90 95 Leu Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Lys Glu Cys His Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Glu Gly Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu 130 135 140 Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro 145 150 155 160 Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala 165 170 175 Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Ile Arg Val Val 180 185 190 Ser Thr Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe 195 200 205 Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr 210 215 220 Ile Ser Lys Ile Lys Gly Leu Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Ile Leu 225 230 235 240 Pro Pro Pro Ala Glu Gln Leu Ser Arg Lys Asp Val Ser Leu Thr Cys 245 250 255 Leu Val Val Gly Phe Asn Pro Gly Asp Ile Ser Val Glu Trp Thr Ser 260 265 270 Asn Gly His Thr Glu Glu Asn Tyr Lys Asp Thr Ala Pro Val Leu Asp 275 280 285 Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr Ser Lys Leu Asn Met Lys Thr Ser 290 295 300 Lys Trp Glu Lys Thr Asp Ser Phe Ser Cys Asn Val Arg His Glu Gly 305 310 315 320 Leu Lys Asn Tyr Tyr Leu Lys Lys Thr Ile Ser Arg Ser Pro Gly 325 330 335 <210> 11 <211> 213 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Gly Ser Gly Asn Leu His Asn Tyr 20 25 30 Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Arg Thr Ile Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln Ser Phe Trp Ser Ser Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro 100 105 110 Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn 130 135 140 Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn 145 150 155 160 Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr 180 185 190 Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Asn Glu Cys 210 <210> 12 <211> 455 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ser Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Met Ile Asn Pro Ser Glu Ser Glu Thr Arg Ile Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ala Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Gly Asp Phe Tyr Thr Ser Tyr Trp Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val 115 120 125 Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Ser Val Thr Val Thr 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Ser Val His Thr Phe Pro Ala Leu 165 170 175 Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Met Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Ser Val Ala His Pro Ala 195 200 205 Ser Ser Thr Thr Val Asp Lys Lys Leu Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser 210 215 220 Thr Ile Asn Pro Cys Pro Pro Cys Lys Glu Cys His Lys Cys Pro Ala 225 230 235 240 Pro Asn Leu Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Ile 245 250 255 Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val 260 265 270 Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val 275 280 285 Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp 290 295 300 Tyr Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Gln His Gln 305 310 315 320 Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp 325 330 335 Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ile Lys Gly Leu Val 340 345 350 Arg Ala Pro Gln Val Tyr Ile Leu Pro Pro Pro Ala Glu Gln Leu Ser 355 360 365 Arg Lys Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Val Gly Phe Asn Pro Gly 370 375 380 Asp Ile Ser Val Glu Trp Thr Ser Asn Gly His Thr Glu Glu Asn Tyr 385 390 395 400 Lys Asp Thr Ala Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr 405 410 415 Ser Lys Leu Asn Met Lys Thr Ser Lys Trp Glu Lys Thr Asp Ser Phe 420 425 430 Ser Cys Asn Val Arg His Glu Gly Leu Lys Asn Tyr Tyr Leu Lys Lys 435 440 445 Thr Ile Ser Arg Ser Pro Gly 450 455

Claims (17)

  1. 항원 결합 도메인을 포함하는 분리된 결합 단백질로서,
    상기 항원 결합 도메인은 하기 아미노산 서열의 상보성 결정 영역으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하거나, 하기 아미노산 서열의 상보성 결정 영역과 적어도 80%의 서열 동일성을 가지고 범종 특이적 말라리아 원충 젖산 탈수소효소와 KD≤1.5647×10-9 ㏖/ℓ의 친화력을 가지며, 범종 특이적 말라리아 원충 젖산 탈수소효소를 잘 식별할 수 있고;
    상보성 결정 영역 CDR-VH1은 G-X1-S-F-T-N-Y-X2-M-N이되,
    X1은 S, Y 또는 T이고, X2는 W 또는 F이며;
    상보성 결정 영역 CDR-VH2는 I-X1-P-S-X2-S-E-T-R-X3-N-Q이되,
    X1은 H 또는 N이고, X2는 E 또는 D이며, X3은 I, V 또는 L이고;
    상보성 결정 영역 CDR-VH3은 A-X1-S-G-X2-F-Y-T-X3-Y-X4-D-Y이되,
    X1은 K 또는 R이고, X2는 D 또는 E이며, X3은 S, Y 또는 T이고, X4는 F 또는 W이며;
    상보성 결정 영역 CDR-VL1은 R-G-X1-G-N-X2-H-N-Y-X3-A이되,
    X1은 S 또는 T이고, X2는 I, V 또는 L이며, X3은 I 또는 L이고;
    상보성 결정 영역 CDR-VL2는 N-A-X1-T-X2-A-D이되,
    X1은 R 또는 K이고, X2는 I, V 또는 L이며;
    상보성 결정 영역 CDR-VL3은 Q-X1-F-W-S-X2-Y-T이되,
    X1은 S, Y 또는 T이고, X2는 S 또는 T이며;
    바람직하게,
    상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서, X2는 W이고;
    상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서, X1은 H이며;
    상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서, X4는 F이고;
    상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서, X3은 L이며;
    상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서, X2는 T이고;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서, X1은 S이며;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서, X1은 Y이고;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH1에서, X1은 T이며;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서, X2는 E이고;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서, X2는 D이며;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서, X3은 I이고;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서, X3은 V이며;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH2에서, X3은 L이고;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서, X1은 K이며;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서, X1은 R이고;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서, X2는 D이며;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서, X2는 E이고;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서, X3은 S이며;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서, X3은 Y이고;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VH3에서, X3은 T이며;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서, X1은 S이고;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서, X1은 T이며;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서, X2는 I이고;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서, X2는 V이며;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL1에서, X2는 L이고;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서, X1은 R이며;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서, X1은 K이고;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서, X2는 I이며;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서, X2는 V이고;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL2에서, X2는 L이며;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서, X1은 S이고;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서, X1은 Y이며;
    바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR-VL3에서, X1은 T이고;
    바람직하게, 각 상보성 결정 영역의 돌연변이 부위는 하기 돌연변이 조합 중 어느 하나로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항원 결합 도메인을 포함하는 분리된 결합 단백질:
    Figure pct00013

    Figure pct00014
    .
  2. 제1항에 있어서,
    상기 결합 단백질은 적어도 3개의 CDR을 포함하거나; 상기 결합 단백질은 적어도 6개의 CDR을 포함하고;
    바람직하게, 상기 결합 단백질은 나노 항체, F(ab')2, Fab', Fab, Fv, scFv, 이중 특이성 항체 및 항체 최소 인식 단위 중 하나이며;
    바람직하게, 상기 결합 단백질은 서열이 순차적으로 서열번호 1 내지 4로 표시되는 경쇄 골격 영역 FR-L1, FR-L2, FR-L3 및 FR-L4, 및/또는, 서열이 순차적으로 서열번호 5 내지 8로 표시되는 중쇄 골격 영역 FR-H1, FR-H2, FR-H3 및 FR-H4를 포함하는 것을 특징으로 하는 항원 결합 도메인을 포함하는 분리된 결합 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    바람직하게, 상기 결합 단백질은 항체 불변 영역 서열을 더 포함하며;
    바람직하게, 상기 불변 영역 서열은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, IgD 중 어느 하나의 불변 영역의 서열로부터 선택되고;
    바람직하게, 상기 불변 영역의 종속 유래는 소, 말, 젖소, 돼지, 면양, 염소, 래트, 마우스, 개, 고양이, 토끼, 낙타, 당나귀, 사슴, 담비, 닭, 오리, 거위, 칠면조, 게임콕(game cock) 또는 인간이며;
    바람직하게, 상기 불변 영역은 마우스로부터 유래되고;
    경쇄 불변 영역 서열은 서열번호 9로 표시되며;
    중쇄 불변 영역 서열은 서열번호 10으로 표시되는 것을 특징으로 하는 항원 결합 도메인을 포함하는 분리된 결합 단백질.
  4. 분리된 핵산 분자로서,
    상기 핵산 분자는 DNA 또는 RNA이고, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
  5. 제4항에 따른 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  6. 제5항에 따른 벡터에 의해 형질전환되는 것을 특징으로 하는 숙주세포.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질의 생성 방법으로서,
    적합한 배양 조건에서 배지에서 제6항에 따른 숙주세포를 배양하고, 생성된 결합 단백질을 배지 또는 배양된 숙주세포로부터 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 결합 단백질의 생성 방법.
  8. 말라리아 진단을 위한 진단제의 제조에서의 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질의 응용.
  9. 시험 샘플 중의 범종 특이적 항원 말라리아 원충 젖산 탈수소효소의 검출 방법으로서,
    a) 항체/항원 결합 반응을 충분히 일으키는 조건에서, 상기 시험 샘플 중 범종 특이적 항원 말라리아 원충 젖산 탈수소효소 항원을 제3항에 따른 결합 단백질과 접촉시켜 면역 복합체를 형성하는 단계; 및
    b) 상기 시험 샘플 중 상기 범종 특이적 항원 말라리아 원충 젖산 탈수소효소의 존재를 지시하는 상기 면역 복합체의 존재를 검출하는 단계를 포함하고,
    바람직하게, 단계 a)에서 상기 면역 복합체는 상기 결합 단백질과 결합되는 제2 항체를 더 포함하고;
    바람직하게, 단계 a)에서, 상기 면역 복합체는 상기 범종 특이적 항원 말라리아 원충 젖산 탈수소효소와 결합되는 제2 항체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 시험 샘플 중의 범종 특이적 항원 말라리아 원충 젖산 탈수소효소의 검출 방법.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질을 포함하는 키트.
  11. 말라리아 진단에서의 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질의 응용.
  12. 말라리아 진단 방법으로서,
    A) 결합 반응을 충분히 일으키는 조건에서, 피험자의 샘플을 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질과 접촉시켜 결합 반응을 진행하는 단계; 및
    B) 결합 반응을 통해 생성된 면역 복합체를 검출하는 단계를 포함하고,
    상기 면역 복합체의 존재는 말라리아의 존재를 지시하는 말라리아 진단 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 방법은 형광 면역 기술, 화학 발광 기술, 콜로이드 금 면역 기술, 방사성 면역 분석 및/또는 효소 결합 면역 기술에 기초하는 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서,
    상기 샘플은 전혈, 외주혈, 혈청 또는 혈장 중 적어도 하나에서 선택되는 방법.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 피험자는 포유 동물이고, 바람직하게 영장류 동물이며, 더 바람직하게 인간인 방법.
  16. 제11항 및 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 말라리아는 삼일열 말라리아, 열대열 말라리아, 사일열 말라리아, 난형 말라리아 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 응용 또는 방법.
  17. 제11항 및 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 방법에 있어서,
    상기 말라리아는 말라리아 원충 속(Plasmodium)에 의한 말라리아인 응용 또는 방법.
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