KR20210110660A - 인간 파라인플루엔자 바이러스(piv)의 l 단백질에 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편, piv 검출을 위한 방법 및 키트 - Google Patents
인간 파라인플루엔자 바이러스(piv)의 l 단백질에 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편, piv 검출을 위한 방법 및 키트 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 인간 파라인플루엔자 바이러스(PIV)의 L 단백질을 인식하는 단일클론 항체 또는 이의 단편의 생성을 제시하며, 여기서 상기 단일클론 항체 또는 이의 단편은 중쇄의 가변 영역 및 경쇄의 가변 영역을 포함한다. 진단 키트 형태로 단일클론 항체를 사용하는, 생물학적 샘플에서 PIV에 의한 감염을 진단하기 위한 방법이 또한 제공된다.
Description
인간 파라인플루엔자 바이러스(PIV)의 키메라 단백질 L을 인식하는 단일클론 항체 또는 이의 단편이 개시되며, 여기서 상기 단일클론 항체 또는 이들의 단편은 경쇄 가변 영역으로서, 그의 CDR1(CDRLC1)은 서열번호 1에 의해 정의되고, 그의 CDR2(CDRLC2)는 서열번호 2에 의해 정의되며, 그의 CDR3(CDRLC3)은 서열번호 3에 상응하는 것인 경쇄 가변 영역, 및 중쇄 가변 영역으로서, 그의 CDR1(CDRHC1)은 서열번호 4에 의해 정의되고, 그의 CDR2(CDRHC2)는 서열번호 5에 의해 정의되며, 그의 CDR3(CDRHC3)은 서열번호 6에 상응하는 것인 중쇄 가변 영역, 또는 중쇄 가변 영역으로서, 그의 CDR1(CDRLC1)은 서열번호 7에 의해 정의되고, 그의 CDR2(CDRLC2)는 서열번호 8에 의해 정의되며, 그의 CDR3(CDRLC3)은 서열번호 9에 상응하는 것인 중쇄 가변 영역, 및 중쇄 가변 영역으로서, 그의 CDR1(CDRHC1)은 서열번호 10에 의해 정의되고, 그의 CDR2(CDRHC2)는 서열번호 11에 상응하며, 그의 CDR3(CDRHC3)은 서열번호 12에 상응하는 것인 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 항체는 검출 및/또는 포획 항체로서 사용될 수 있다. 또한 단일클론 항체를 사용하여 생물학적 샘플에서 PIV 감염을 진단하기 위한 방법, 및 이전에 기술된 바와 같이 PIV에 대한 적어도 하나의 단일클론 항체를 포함하는, PIV 검출을 위한 진단 키트가 제공된다.
인간 파라인플루엔자 바이러스는 일반 감기부터 폐렴에 이르는 다양한 임상 병태에서 그 자체로 나타나는 상부 호흡기관의 감염성 질환을 일으킨다. 후두기관 기관지염이 가장 심각하고 빈번한 임상 징후이다.
이러한 질환은 파라믹소바이러스 유형의 바이러스에 의해 초래되고 사람에서 사람으로 또는 아픈 사람의 기침 또는 재채기를 통해 배출된 소형 입자 또는 액적을 통해서 쉽게 전파되어서, 급속하게 확산되게 만드는 계절성 유행병의 일부이다.
미국에서, PIV는 소아의 호흡기 질환으로 인한 입원의 주요 원인 중 하나로서, 전체 사례의 2% 내지 17%에서 발생하며, 이것은 250,000번의 응급실 방문 및 700,000회 입원을 의미한다. 5세 미만 아동 중에서, 1.2명 아동이 매년 이러한 이유로 입원하며, 이 비율은 6개월 미만에서 더 높다1 1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5813689/.
PIV는 다른 호흡기 바이러스와 비교하여 더 다양한 영향을 미치고, 세기관지염, 폐렴 및 후두기관 기관지염에 의한 입원의 3% 내지 10%의 원인이 된다. 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)와 마찬가지로, PIV는 생애 처음 6개월 동안 심각한 질병을 초래한다. PIV 감염은 4세 내지 12세 사이에 최고조이다2 2 http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/264249/PMC2486968.pdf?sequence=1&isAllowed=y.
PIV에 의해 초래된 감염은 직접 검출 방법을 사용하여, 즉, 샘플에서 직접적으로 항체를 검출하거나, 또는 IgM 항체의 존재 또는 IgG 역가의 증가를 측정하는 것을 가능하게 만드는 혈청학적 검사에 의해 진단될 수 있다. 세포주를 사용하는 분석이 또한 임상 실험실에서 PIV의 단리에 사용된다.
세포 배양에서 바이러스 단리의 경우에, 이것은 특이적이고 민감한 방법에 상응하지만, 결과를 제공하는데 10일 내지 15일이 소요되어, 이의 더딤으로 인해 초기 진단보다는 확인 기술이라는 단점을 갖는다. 환자에서 IgM 및 IgG 항체의 존재를 측정할 수 있게 하는 혈청학적 검사의 경우에, 이들은 PIV 바이러스에 의한 감염을 특이적으로 결정할 수 없거나, 또는 PIV의 유형을 결정할 수 없는 일반 검사이다. 4개 유형의 PIV, 1형, 2형, 3형, 및 4형이 존재하고, 일반적으로 전염병으로 나타나는 것은 1형 및 2형이다.
추가로, 분자적 기술 예컨대 중합효소 연쇄 반응 (PCR)은 또한 RNA의 상보성 DNA로의 역전사로부터, 후자를 주형으로서 사용하여 PCR을 수행하여서, 바이러스에 함유된 일정 RNA 절편을 검출하기 위해 이용된다. 문헌 US6015664A는 다중 PCR 분석을 통해서 생물학적 샘플에서 다수 바이러스 감염의 존재 또는 부재를 결정하는 방법을 제출한다. 이 방법은 인간 파라인플루엔자 바이러스 1, 2, 및 3, 호흡기 세포융합 바이러스 A 및 B, 및 인플루엔자 바이러스 A 및 B의 상보성 핵산 서열의 검출을 위한 프로브와 함께 뉴클레오티드 프라이머를 포함한다.
문헌 CN102140550A에서, 한 단계로 파라인플루엔자 바이러스를 검출하기 위한 RT-PCR 키트가 개시되며, 여기서 키트는 파라인플루엔자 바이러스 A에 특이적인 프라이머를 포함한다.
이의 일부로서, 문헌 CN105441589A는 사중 PCR을 통한 파라인플루엔자 바이러스 1형, 2형, 3형 및 4형 검출 키트를 기술한다. 사중 PCR 검출 키트는 인간 파라인플루엔자 바이러스-특이적 유전자 프라이머 및 프로브를 포함한다.
파라인플루엔자를 포함하여, 다양한 호흡기 바이러스의 검출을 위한 면역형광을 기반으로 하는 다양한 키트가 또한 존재한다. 예를 들어, D3 Ultra DFA (직접 형광 항체) 키트는 다양한 호흡기 바이러스: 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 호흡기 세포융합 바이러스, 아데노바이러스, 파라인플루엔자 1, 파라인플루엔자 2, 및 파라인플루엔자 3의 정성적 확인을 가능하게 한다.
상기 언급된 배경을 기반으로, 현재 사용되는 진단 방법과 경쟁할 수 있는 파라인플루엔자 바이러스의 검출을 위한 효율적이고, 신속하며 저비용인 검출 방법을 생성시키고 만드는 것이 필수적이다. 이러한 경우에, 바이러스에 존재하는 단백질을 검출하는 단일클론 항체의 사용이 인플루엔자 바이러스의 검출을 개선시키기 위한 대안으로서 고려된다.
본 발명은 인간 파라인플루엔자 바이러스, 이하 PIV의 키메라 단백질 L에 대한 특이적 단일클론 항체 또는 이의 단편에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 하이브리도마 2E11B5 및 4D8C6에 의해 분비되는 인간 파라인플루엔자 바이러스(PIV)의 키메라 단백질 L을 인식하는 단일클론 항체 또는 이의 단편에 해당하며, 여기서 상기 단일클론 항체 또는 이들의 단편은 경쇄 가변 영역으로서, 그의 CDR1(CDRLC1)은 서열번호 1에 의해 정의되고, 그의 CDR2(CDRLC2)는 서열번호 2로 정의되며, 그의 CDR3(CDRLC3)은 서열번호 3에 상응하는 것인 경쇄 가변 영역, 및 중쇄 가변 영역으로서, 그의 CDR1(CDRHC1)은 서열번호 4에 의해 정의되고, 그의 CDR2(CDRHC2)는 서열번호 5에 의해 정의되며, 그의 CDR3(CDRHC3)은 서열번호 6에 상응하는 것인 중쇄 가변 영역, 또는 중쇄 가변 영역으로서, 그의 CDR1(CDRLC1)은 서열번호 7에 의해 정의되고, 그의 CDR2(CDRLC2)는 서열번호 8에 의해 정의되며, 그의 CDR3(CDRLC3)은 서열번호 9에 상응하는 것인 중쇄 가변 영역, 및 중쇄 가변 영역으로서, 그의 CDR1(CDRHC1)은 서열번호 10에 의해 정의되고, 그의 CDR2(CDRHC2)는 서열번호 11에 상응하며, 그의 CDR3(CDRHC3)은 서열번호 12에 상응하는 것인 중쇄 가변 영역을 포함한다. 상기 항체는 검출 및/또는 포획 항체로서 사용될 수 있다. 또한 단일클론 항체를 사용하여 생물학적 샘플에서 PIV 감염을 진단하기 위한 방법, 및 이전에 기술된 바와 같이 PIV에 대한 적어도 하나의 단일클론 항체를 포함하는, PIV의 검출을 위한 진단 키트를 제공한다.
항원이 완전하게 보존되지 않았지만, 서열의 일부가 보존되었으므로, 새로운 서열은 보존된 부분의 조합으로 생성되었다. 그러므로, 항체는 인간 파라인플루엔자 바이러스의 키메라 단백질, 특히 키메라 단백질 L을 인식한다.
단백질 L에 대한 특이적 단일클론 항체 또는 이의 단편은 이미 존재하는 바이러스 항원을 검출하기 위한 방법 및 다른 항체에 비해서 중요하게 유리하고 주목할만한 기술적 특성을 제시한다. 첫째로, 각각의 바이러스는 특이적 표면 단백질을 가지므로, 다른 유형의 호흡기 바이러스에 대한 단일클론 항체를 기반으로 하는 다른 진단 기술은 제안된 발명과 비슷하지 않다. 다른 바이러스 항원, 예를 들어 인플루엔자 바이러스 PB2 단백질에 비해 PIV 단백질 L에 대한 항체의 검출 특이성은 본 출원의 도 1A, 및 1B에 제공된 결과에서 입증된다. 이들 결과로부터 본 출원의 범주에서 제공된 항체는 오직 PIV 단백질 L만을 인식하고, FLU 바이러스 항원에 의한 ELISA 분석에서 검출 신호가 관찰되지 않았다고 결론내리는 것이 가능하다.
둘째로, 본 발명의 범주의 일부인 항체는 그들이 항원 결합 부위에 대해 서로 경쟁하지 않거나, 또는 그들이 동시에 항원 결합 부위에 결합하는데 방해가 되지 않는 방식으로, 단백질 L 또는 이의 단편의 특이적 검출을 가능하게 한다. 추가로, 그들은 적은 항원 양을 함유하는 샘플에서 고감도로 단백질 L 또는 이의 단편의 검출을 가능하게 한다.
제안된 단일클론 항체는 보존된 단백질인, 단백질 L을 검출할 수 있다. 보존된 바이러스 단백질을 검출하기 위한 전략은 본 발명의 범주 내에 있는 항체가 파라인플루엔자 1, 2, 3, 및 4를 포함하여, 상이한 유형의 인간 파라인플루엔자 바이러스를 검출할 수 있도록 허용한다.
본 발명에서 CDR 서열을 언급할 때, 이들은 항원 검출 기능을 갖는 단백질의 가변 도메인에 존재하는 짧은 서열에 상응한다. 항체의 중쇄 (CDRHC) 및 경쇄 (CDRLC)에 대한 CDR 서열은 하이브리도마 2E11B5 및 4D8C6에 의해 분비되었다.
기술된 단일클론 항체는 PIV 감염 결정, 진단, 및/또는 검출 분석을 위해 사용될 수 있다. 이들 항체는 적은 분량 및 이용가능성의 항원이 존재하는 임상 샘플의 검출 감도를 동시에 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 또한 청구항에 따른 PIV 단백질에 대한 단일클론 항체 또는 이의 단편과 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계, 및 항원과 항체의 결합을 검출하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플에서 PIV 감염 진단 방법이 제공된다. 생물학적 샘플은 PIV에 감염된 시험관내 세포, 코 분비물, 코 세척물, 뇌척수액, 인두 분비물 및/또는 기관지 세척물 또는 분비물일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 방법의 일부로서, 항원-항체 결합의 검출에 사용되는 분석은 ELISA, 루미넥스, 면역형광, 면역조직화학, 면역크로마토그래피, 유세포 분석, 세포 분별기, 면역침전 및/또는 웨스턴 블롯으로부터 선택된다.
본 발명은 또한 PIV 단백질 L에 대한 단일클론 항체 또는 이의 단편으로서, 상기 항체는 포획 또는 검출 항체로서 작용할 수 있고, 특히, 검출 항체는 그의 검출을 위한 마커에 접합되는 것인 단일클론 항체 또는 이의 단편; 항체가 부착되는 고체 지지체; 및 검출 항체에 포함된 마커, 예컨대 형광단, 바이오틴, 방사성동위원소, 금속 및 효소를 검출을 위한 시약을 포함하는, 인간 인플루엔자 바이러스를 검출하기 위한 진단 키트를 포함한다.
본 발명에서 포획 항체를 언급할 때 이것은 항원에 특이적으로 결합하는 항체에 상응한다. 검출 항체의 경우에, 이것은 상이한 검사 예컨대 면역크로마토그래피 테스트, 루미넥스, 유세포 분석, 면역형광, 방사성면역분석, 웨스턴 블롯, 도트 플롯, ELISA, 루미넥스, 면역확산, 또는 면역침전에 의해 검출되도록 마커가 접합된 항체에 상응한다.
본 발명의 일부인 항체는 검출 마커에 커플링될 때 포획 항체 또는 검출 항체로서 이중으로 작용할 수 있다. 검출 마커는 검출 항체에 접합될 것이고, 이것은 제한없이 형광단, 바이오틴, 방사성동위원소, 금속 및 효소에 상응할 수 있다. 바람직하게, 검출 항체는 홀스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP) 효소 활성의 검출을 기반으로 하는 리포터 시스템에 접합된다.
도 1: 간접 ELISA 분석을 사용한, 2E11B5 및 4D8C6 하이브리도마에 의해 생산된 단일클론 항체에 의한 PIV 키메라 단백질 L 검출. 플레이트는 50 ng의 정제된 재조합 PIV 단백질 L, 50 ng의 Flu PB2 단백질 (특이성 대조군) 및 20 μg의 플라스미드 무함유 이. 콜라이 (E. coli) BL21 균주 (특이성 대조군으로서 사용) 및 단백질 L이 과발현된, 동일 균주의 3개 클론 (C1, C2 및 C3)으로부터의 박테리아 용해물로 활성화시켰다. 대조군 웰은 항체 부재, 1차 항체 존재, HRP 접합된, 항-마우스 IgG (비활성화/미활성화) 존재의 것 및 항원 또는 1차 항체 부재, 오직 항-마우스 IgG (HRP) 존재의 웰이고, 데이터는 그래프에 도시되지 않는다. 이후에, 웰은 170 ng 양의 2F11B1 하이브리도마 (A) 및 170 ng 양의 4D8C6 하이브리도마 (B)로부터의 항-L 항체와 인큐베이션되었다. 단백질 L에 대한 시판 항체는 사용되지 않았는데, ELISA 기술에서 사용할 수 있는 현재 이용가능한 것이 없기 때문이다. 그래프에 표시된 데이터는 하이브리도마 2F11B1 및 4D8C6에 의해 분비되는 항체에 특이적으로 결합된 2차 항-마우스 IgG 항체에 존재하는 홀스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP) 효소에 의해 촉매된, 테트라메틸벤지딘 기질의 유색 화합물로의 전환에 의해 방출된, 450 nm에서 검출된 흡광도로 표시된다. 값은 적어도 2회의 독립 실험에서 각 샘플에 의해 방출된 형광도 평균 +/- 표준 편차에 상응한다. *P < 0.05 및 **P < 0.01로서 L-PIV의 결과에 대해 PB2-Flu 단백질의 결과를 비교한 모수적 스튜던트 검정에 의하고, 다른 한편으로, 단측 ANOVA 검정이 단백질 L을 과발현하는 이. 콜라이 BL21 용해물에 대해 플라스미드 부재의 이. 콜라이 BL21 용해물을 비교하는데 사용되었다. 글자 ns는 유의한 편차가 관찰되지 않았음을 의미한다.
도 2: PIV 단백질 L의 검출에서 2E11B5 및 4D8C6 하이브리도마에 의해 생산된 단일클론 항체의 감도 결정. ELISA 플레이트는 50 ng의 단백질 L에서 시작하여 0.04 ng으로 종료되는, 1:2의 연속 희석물로 활성화시켰다. 이후에 웰은 170 ng 양의 2E11B5 하이브리도마 (A) 및 170 ng 양의 4D8C6 하이브리도마 (B)로부터의 항-L 항체와 인큐베이션되었다. 비활성화된 웰이 음성 대조군으로서 사용되었다. 그래프에 표시된 데이터는 170 ng 양의 하이브리도마 2E11B5 및 4D8C6 (A 및 B)로부터의 항-L 항체에 존재하는 홀스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP) 효소에 의해 촉매되는, 테트라메틸벤지딘 기질의 유색 화합물로의 전환에 의해 방출되는 450 nm에서의 흡광도로 표시된다. 값은 적어도 2회의 독립 실험에서 각 샘플에 의해 방출된 흡광도 평균 +/- 표준 편차에 상응한다. **P < 0.01 및 ***P < 0.001로서 단백질 L의 희석물 각각에 대해 대조군 (샘플 무함유)이라고 하는 웰의 결과를 비교하는 모수적 스튜던트 검정에 의한다.
도 3: 정제된 PIV 항원의 검출을 위한, 2E11B5 및 4D8C6 하이브리도마로부터 생산된 항-Flu L 단일클론 항체의 연속 희석물의 분석. ELISA 플레이트는 50 ng의 PIV 재조합 단백질 L로 활성화되었고 항원은 3.4 μg/mL (웰 당 170 ng)의 농도에서 시작하여, 1:2로 항-2E11B5 L 항체 (A) 또는 4D8C6 (B) 의 11 연속 희석물로 검출하였다. 값은 적어도 2회 독립 실험에서, 각각의 이중 샘플의 450 nm에서 방출된 형광값의 평균 +/- 표준 편차로 표시된다. *P < 0.05; **P < 0.01 및 ***P < 0.001 로서, 항체의 희석물 각각에 대해서 대조군 (2E11B5 또는 4D8C6 항체 부재)이라 불린 웰의 결과를 비교하는 모수적 스튜던트 검정에 의한다.
도 4: 루미넥스 분석을 사용한, 2E11B5 및 4D8C6 하이브리도마에 의해 생산된 단일클론 항체에 의한, 감염된 세포 상에서 PIV의 단백질 L 검출. 플레이트는 50 ng의 정제된 PIV 재조합 단백질 L, 20 μg의 미감염 (특이성 대조군으로서 사용) 및 PIV-감염 MDCK 세포로 활성화시켰다. 항원 부재, 1차 항체 존재, HRP-접합된 항-마우스 IgG (NTC) 존재의 대조군 웰이 포함되었다. 이후에, 웰은 포획 항체로서 사용된, 50 미세구/μl 양의 2E11B5 하이브리도마 (PIV의 21 영역에 접합)로부터의 항-L 항체 및 바이오틴-접합된 검출 항체로서 사용된 4 μg/mL의 농도의 4D8C6 하이브리도마로부터의 항-L 항체와 인큐베이션시켰다. 이후에, 항체 및 샘플 복합체는 6 μg/mL 농도의 스트렙타비딘/파이코에리쓰린과 인큐베이션되었다. 그래프에 표시된 데이터는 평균 형광 강도 (MFI)로 표시된다. 미감염 세포 대 PIV 감염 세포, 및 재조합 단백질 L 대 음성 대조군을 비교하는 비모수적 스튜던트 검정이 수행되었다 (**P < 0.01 및 ****P < 0.0001).
도 5: PIV에 대한 2E11B5 및 4D8C6 하이브리도마에 의해 분비된 단일클론 항체의 조합을 사용한, ELISA 샌드위치 및 샌드위치형 루미넥스에 의한 임상 샘플에서 PIV 검출. A) ELISA 플레이트는 포획 항체로서 기능하는 170 ng의 2E11B5 하이브리도마에 의해 분비된 항체 (항-PIV)로 활성화되었다. 각 바이러스에 대한 포획 항체로 활성화된 웰은 바이러스 호흡기 증상을 갖는 환자로부터의 50 μL의 비인두 면봉 (NPS) 샘플과 인큐베이션되었다. 음성 대조군으로서, 건강한 대조군의 10개 샘플을 분석하였다. PIV-양성 환자의 16개 샘플이 사용되었고 특이성 대조군으로서, 인플루엔자 바이러스 (Flu)-양성 환자의 3개 샘플이 포함되었다. 양성 대조군으로서, 정제된 L-PIV 단백질이 첨가된 웰이 포함되었다. 2E11B5 항체에 의해 포획된 단백질의 검출을 위해서, 4D8C6 하이브리도마에 의해 생산되고, 홀스래디쉬 퍼옥시다제 효소에 접합된 항체는 1:2000 희석물 (웰 당 1.8 ng/L)로 사용되었다. B) 루미넥스 플레이트는 포획 항체로서 기능하는, 2E11B5 하이브리도마에 의해 분비된 항체 (항-PIV)와 접합된, μl 당 50 자성 미세구로 활성화되었다. 접합된 미세구는 바이러스 호흡기 증상을 갖는 환자로부터의 50 μL의 비인두 면봉 (NPS) 샘플과 인큐베이션되었다. 음성 대조군으로서, 건강한 대조군의 8개 샘플이 분석되었다. 14개의 PIV-양성 환자 샘플을 사용하였고 정제된 L-PIV 단백질이 첨가된 웰이 양성 대조군으로서 포함되었다. 2E11B5 항체에 의해 포획된 단백질의 검출을 위해서, 4D8C6 하이브리도마에 의해 생산되고, 바이오틴 형광단에 접합된 항체는 4 μg/mL의 농도로 사용되었다. 복합체 (포획 항체, 항원, 및 검출 항체와 접합된 미세구)는 6 μg/mL의 농도로 스트렙타비딘/파이코에리쓰린과 인큐베이션된다. 데이터는 각 샘플의 450 nm에서 방출된 흡광도 (A) 또는 MFI (B) 의 중간값을 표시한다 (**P < 0.01 및 ****P < 0.0001; PIV-양성 환자 대 건강한 대조군, 및 특이성 대조군으로서 사용된 바이러스에 대해 비교된 비모수적 스튜던트 검정을 사용).
도 6: 바이오틴-접합된 2E11B5 및 4D8C6 하이브리도마에 의해 분비된 단일클론 항체를 사용한, 간접 ELISA에 의한 단백질 L 검출. 이 도면은 홀스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP) 효소에 의해 촉매된 테트라메틸벤지딘 기질의 유색 화합물로의 전환에 의해 방출된 450 nm에서의 흡광도가 표시된 그래프를 도시한다. 검은색 및 흰색 샘플은 각각 2E11B5 및 4D8C6 하이브리도마에 의해 분비된 항체 단편으로 수행된 분석에 상응하는 한편, 회색에서 2E11B5 및 4D8C6 하이브리도마에 의해 분비된 완전한 단일클론 항체로 수행된 분석이 도시된다. 각 샘플의 450 nm에서 방출된 흡광도의 평균값이 표시된다 (여기서 b는 a와 비교된 p < 0.0001과 동등하고 d는 c와 비교된 p < 0.0001과 동등하며; 샘플 부재의 웰 대 모든 항체와 단백질 존재의 웰을 비교한 2-측 ANOVA 검정에 의한다).
도 2: PIV 단백질 L의 검출에서 2E11B5 및 4D8C6 하이브리도마에 의해 생산된 단일클론 항체의 감도 결정. ELISA 플레이트는 50 ng의 단백질 L에서 시작하여 0.04 ng으로 종료되는, 1:2의 연속 희석물로 활성화시켰다. 이후에 웰은 170 ng 양의 2E11B5 하이브리도마 (A) 및 170 ng 양의 4D8C6 하이브리도마 (B)로부터의 항-L 항체와 인큐베이션되었다. 비활성화된 웰이 음성 대조군으로서 사용되었다. 그래프에 표시된 데이터는 170 ng 양의 하이브리도마 2E11B5 및 4D8C6 (A 및 B)로부터의 항-L 항체에 존재하는 홀스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP) 효소에 의해 촉매되는, 테트라메틸벤지딘 기질의 유색 화합물로의 전환에 의해 방출되는 450 nm에서의 흡광도로 표시된다. 값은 적어도 2회의 독립 실험에서 각 샘플에 의해 방출된 흡광도 평균 +/- 표준 편차에 상응한다. **P < 0.01 및 ***P < 0.001로서 단백질 L의 희석물 각각에 대해 대조군 (샘플 무함유)이라고 하는 웰의 결과를 비교하는 모수적 스튜던트 검정에 의한다.
도 3: 정제된 PIV 항원의 검출을 위한, 2E11B5 및 4D8C6 하이브리도마로부터 생산된 항-Flu L 단일클론 항체의 연속 희석물의 분석. ELISA 플레이트는 50 ng의 PIV 재조합 단백질 L로 활성화되었고 항원은 3.4 μg/mL (웰 당 170 ng)의 농도에서 시작하여, 1:2로 항-2E11B5 L 항체 (A) 또는 4D8C6 (B) 의 11 연속 희석물로 검출하였다. 값은 적어도 2회 독립 실험에서, 각각의 이중 샘플의 450 nm에서 방출된 형광값의 평균 +/- 표준 편차로 표시된다. *P < 0.05; **P < 0.01 및 ***P < 0.001 로서, 항체의 희석물 각각에 대해서 대조군 (2E11B5 또는 4D8C6 항체 부재)이라 불린 웰의 결과를 비교하는 모수적 스튜던트 검정에 의한다.
도 4: 루미넥스 분석을 사용한, 2E11B5 및 4D8C6 하이브리도마에 의해 생산된 단일클론 항체에 의한, 감염된 세포 상에서 PIV의 단백질 L 검출. 플레이트는 50 ng의 정제된 PIV 재조합 단백질 L, 20 μg의 미감염 (특이성 대조군으로서 사용) 및 PIV-감염 MDCK 세포로 활성화시켰다. 항원 부재, 1차 항체 존재, HRP-접합된 항-마우스 IgG (NTC) 존재의 대조군 웰이 포함되었다. 이후에, 웰은 포획 항체로서 사용된, 50 미세구/μl 양의 2E11B5 하이브리도마 (PIV의 21 영역에 접합)로부터의 항-L 항체 및 바이오틴-접합된 검출 항체로서 사용된 4 μg/mL의 농도의 4D8C6 하이브리도마로부터의 항-L 항체와 인큐베이션시켰다. 이후에, 항체 및 샘플 복합체는 6 μg/mL 농도의 스트렙타비딘/파이코에리쓰린과 인큐베이션되었다. 그래프에 표시된 데이터는 평균 형광 강도 (MFI)로 표시된다. 미감염 세포 대 PIV 감염 세포, 및 재조합 단백질 L 대 음성 대조군을 비교하는 비모수적 스튜던트 검정이 수행되었다 (**P < 0.01 및 ****P < 0.0001).
도 5: PIV에 대한 2E11B5 및 4D8C6 하이브리도마에 의해 분비된 단일클론 항체의 조합을 사용한, ELISA 샌드위치 및 샌드위치형 루미넥스에 의한 임상 샘플에서 PIV 검출. A) ELISA 플레이트는 포획 항체로서 기능하는 170 ng의 2E11B5 하이브리도마에 의해 분비된 항체 (항-PIV)로 활성화되었다. 각 바이러스에 대한 포획 항체로 활성화된 웰은 바이러스 호흡기 증상을 갖는 환자로부터의 50 μL의 비인두 면봉 (NPS) 샘플과 인큐베이션되었다. 음성 대조군으로서, 건강한 대조군의 10개 샘플을 분석하였다. PIV-양성 환자의 16개 샘플이 사용되었고 특이성 대조군으로서, 인플루엔자 바이러스 (Flu)-양성 환자의 3개 샘플이 포함되었다. 양성 대조군으로서, 정제된 L-PIV 단백질이 첨가된 웰이 포함되었다. 2E11B5 항체에 의해 포획된 단백질의 검출을 위해서, 4D8C6 하이브리도마에 의해 생산되고, 홀스래디쉬 퍼옥시다제 효소에 접합된 항체는 1:2000 희석물 (웰 당 1.8 ng/L)로 사용되었다. B) 루미넥스 플레이트는 포획 항체로서 기능하는, 2E11B5 하이브리도마에 의해 분비된 항체 (항-PIV)와 접합된, μl 당 50 자성 미세구로 활성화되었다. 접합된 미세구는 바이러스 호흡기 증상을 갖는 환자로부터의 50 μL의 비인두 면봉 (NPS) 샘플과 인큐베이션되었다. 음성 대조군으로서, 건강한 대조군의 8개 샘플이 분석되었다. 14개의 PIV-양성 환자 샘플을 사용하였고 정제된 L-PIV 단백질이 첨가된 웰이 양성 대조군으로서 포함되었다. 2E11B5 항체에 의해 포획된 단백질의 검출을 위해서, 4D8C6 하이브리도마에 의해 생산되고, 바이오틴 형광단에 접합된 항체는 4 μg/mL의 농도로 사용되었다. 복합체 (포획 항체, 항원, 및 검출 항체와 접합된 미세구)는 6 μg/mL의 농도로 스트렙타비딘/파이코에리쓰린과 인큐베이션된다. 데이터는 각 샘플의 450 nm에서 방출된 흡광도 (A) 또는 MFI (B) 의 중간값을 표시한다 (**P < 0.01 및 ****P < 0.0001; PIV-양성 환자 대 건강한 대조군, 및 특이성 대조군으로서 사용된 바이러스에 대해 비교된 비모수적 스튜던트 검정을 사용).
도 6: 바이오틴-접합된 2E11B5 및 4D8C6 하이브리도마에 의해 분비된 단일클론 항체를 사용한, 간접 ELISA에 의한 단백질 L 검출. 이 도면은 홀스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP) 효소에 의해 촉매된 테트라메틸벤지딘 기질의 유색 화합물로의 전환에 의해 방출된 450 nm에서의 흡광도가 표시된 그래프를 도시한다. 검은색 및 흰색 샘플은 각각 2E11B5 및 4D8C6 하이브리도마에 의해 분비된 항체 단편으로 수행된 분석에 상응하는 한편, 회색에서 2E11B5 및 4D8C6 하이브리도마에 의해 분비된 완전한 단일클론 항체로 수행된 분석이 도시된다. 각 샘플의 450 nm에서 방출된 흡광도의 평균값이 표시된다 (여기서 b는 a와 비교된 p < 0.0001과 동등하고 d는 c와 비교된 p < 0.0001과 동등하며; 샘플 부재의 웰 대 모든 항체와 단백질 존재의 웰을 비교한 2-측 ANOVA 검정에 의한다).
본 발명의 단일클론 항체의 상이한 적용을 입증하는 것을 가능하게 하는 실시예.
실시예 1: 2E11B5 하이브리도마에 의해 분비된 항-L PIV 항체의 가변 영역의 경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 결정.
2E11B5 하이브리도마는 3.7 g/L의 중탄산나트륨 및 10% 태아 소 혈청이 보충된 DMEM-고포도당 배양 배지 중에, 37℃ (98.6℉)에 10% CO2 존재에서, 700,000 세포/mL의 세포 밀도까지 성장시켰다. 3.5 x 106 세포의 총 RNA를 수득하였고, Trizol 화합물 (Invitrogen) 처리를 수행하였다. 0.5 μg의 RNA는 이소타입-특이적 유니버설 프라이머를 사용하는 PrimeScript™ 1st Strand cDNA 합성 키트에 의한 역전사 반응을 통해 cDNA를 생성시키는데 사용되었다. 항체 중쇄 및 경쇄는 GenScript의 cDNA 말단의 신속 증폭 (rapid amplification of cDNA ends) (RACE) 표준 운영 절차 (SOP)에 따라서 증폭시켰다. 증폭된 항체 단편은 표준 클로닝 벡터에 개별적으로 클로닝시켰다. PCR 콜로니를 수행하여서 올바른 크기의 삽입물을 갖는 클론을 확인하였다. 올바른 크기의 삽입물이 존재하는 적어도 5개 콜로니를 각 단편에 대해 서열분석하였다. 상이한 클론의 서열을 정렬하였고, 이들 클론의 공통 서열을 제공하였다. 2E11B5 하이브리도마에 의해 분비된 항체의 중쇄 및 경쇄의 뉴클레오티드 서열은 각각 서열번호 1; 서열번호 2로서 식별되는 것에 상응한다.
실시예 2: 4D8C6 하이브리도마에 의해 분비된 항-L PIV 항체의 가변 영역의 경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 결정.
4D8C6 하이브리도마는 3.7 g/L의 중탄산나트륨 및 10% 태아 소 혈청이 보충된 DMEM-고포도당 배양 배지 중에, 37℃ (98.6℉)에 10% CO2 존재에서, 700,000 세포/mL의 세포 밀도까지 성장시켰다. 3.5 x 106 세포의 총 RNA를 수득하였고, Trizol 화합물 (Invitrogen) 처리를 수행하였다. 0.5 μg의 RNA는 이소타입-특이적 유니버설 프라이머를 사용하는 PrimeScript™ 1st Strand cDNA 합성 키트에 의한 역전사 반응을 통해 cDNA를 생성시키는데 사용되었다. 항체 중쇄 및 경쇄는 GenScript의 cDNA 말단의 신속 증폭 (RACE) 표준 운영 절차 (SOP)에 따라서 증폭시켰다. 증폭된 항체 단편은 표준 클로닝 벡터에 개별적으로 클로닝시켰다. PCR 콜로니를 수행하여서 올바른 크기의 삽입물을 갖는 클론을 확인하였다. 올바른 크기의 삽입물이 존재하는 적어도 5개 콜로니를 각 단편에 대해 서열분석하였다. 상이한 클론의 서열을 정렬하였고, 이들 클론의 공통 서열을 제공하였다. 4D8C6 하이브리도마에 의해 분비된 항체의 중쇄 및 경쇄의 뉴클레오티드 서열은 각각 서열번호 3; 서열번호 4로서 식별되는 것에 상응한다.
실시예 3: 간접 ELISA 분석에 의한, PIV 항원 검출 분석, PIV의 정제된 항원에 대한 PIV 항-단일클론 항체 L의 특이성 결정.
이 분석은 2E11B5 및 4D8C6 하이브리도마에 의해 생산된 항체의 PIV 단백질 L에 대한 특이성을 입증하려는 것이다. 항원 검출은 간접 ELISA 기술을 사용해 수행되었는데, 여기서 ELISA 플레이트는 50 ng의 정제된 항원으로 1시간 동안 37℃ (98.6℉)에서 활성화되었다. 동일한 방식으로, 플레이트는 20 μg의 플라스미드 부재의 이. 콜라이 BL21 균주 (특이성 대조군으로서 사용) 및 단백질 L이 과발현된, 동일 균주의 3개 클론 (C1, C2 및 C3)으로부터의 박테리아 용해물로 활성화되었다. 포함된 다른 음성 대조군은 별도 웰에 Flu 유래 50 ng의 PB2 단백질이었다. 이후에, 플레이트는 1X/Tween20 0.05% 포스페이트 완충 염수 (PBS)로 2회 세척되었다. 다음으로 플레이트는 2시간 동안 37℃ (98.6℉)에서 1X PBS/10% 태아 소 혈청 (FBS)으로 차단되었다. 이후에, 세척을 반복하고 나서 각각의 항체 (2E11B5 및 4D8C6)는 1X PBS/10% FBS에 희석된 3.4 μg/mL (웰 당 170 ng)의 최종 농도로, 1시간 동안 37℃ (98.6℉)에서 인큐베이션되었다 (별도 플레이트 상에 각각의 항체). 인큐베이션 시간 이후에, 세척을 반복하였고 1:2000 (웰 당 0.5 ng/μl)으로 희석된 홀스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP)가 표지된 2차 항-마우스 IgG 항체를 1X PBS/10% FBS 중 각 웰에, 1시간 동안, 실온 (
25℃ (77℉))에 암실에서 첨가되었다. 마지막으로, 세척을 수행하였고 50 μL의 시트레이트/테트라메틸벤지딘 (TMB, 3-3'-5-5'-테트라메틸벤지딘, 1 mg/mL, Becton Dickinson) 완충액으로 발생시켰다. 반응을 중지시키기 위해서, 50 μL의 H2SO4 2N을 첨가하였고 결과는 ELISA 판독기 상에, 450 nm에서 판독하였다. 2차 항체의 반응이 1차 항체를 인식하는데 특이적이었고 또한 수득된 신호가 바이러스 항원에 대한 2차 항체의 비특이적 결합으로 초래되지 않았다는 것을 결정하기 위해서, 1차 항체 또는 샘플없이 (비활성화 웰) 2차 항체만을 사용한 대조군을 수행하였다. 1차 항체 반응이 항원에 특이적임을 결정하기 위한 다른 대조군은 항원으로 활성화되지 않은 ELISA 플레이트 (항원 부재) 상에서 항체의 사용 또는 플라스미드 없는 이. 콜라이 BL21 균주 용해물 또는 Flu 유래의 PB2 단백질 50 ng을 보유하는 ELISA 플레이트 상에서 항체의 사용으로 이루어진다. 결과는 본 발명의 단일클론 항체가 50 ng의 정제된 항원을 인식할 수 있다는 것을 보여주는데, 특히 그들은 단백질 L을 과발현하는 3개 클론의 경우에서 관찰된 바와 같이, 높은 신호로 Flu의 PB2 단백질, 또는 박테리아 용해물 단백질을 인식하지 않기 때문이다 (도 1A 및 1B). 비교를 위해 시판 항체를 사용하지 않았는데, 시판 파라인플루엔자 항-L 항체가 존재하지 않기 때문이고, 상업화된 대부분을 만들었고 포스포단백질 (P), 핵단백질 (NP) 또는 헤마글루티닌-뉴라미니다제 (HN)에 대한 것이었다. 파라인플루엔자 항-L 항체를 생성시킨, Nishio 등 (2000 및 2011)의 연구를 확인하였다. 이들 항체는 오직 PIV 혈청형, 혈청형 2에 대해서만 유도되고, 이들 항체에 의한 경우에서 처럼, 호흡기 질환에서 가장 우세한 3개 혈청형 (PIV 1, 2, 및 3)에 대해서는 아니었다. 다른 한편으로, 공개된 항-L 항체는 지금까지 상업화되지 않았다. 사용된 모든 음성 대조군은 예상되는 결과를 제공하였다 (데이터는 도면에 미도시).
실시예 4: PIV 항-L 바이러스 항원의 검출을 위한 단일클론 항체 감도를 결정하기 위한 분석.
분석은 2E11B5 및 4D8C6 하이브리도마 유래의 PIV 항-단일클론 항체 L이 간접 ELISA에 의해 검출할 수 있는 최대 단백질 희석율을 결정하기 위해 수행되었다. 이를 위해서, 실시예 3에 기술된 동일 기술이 사용되었다. 플레이트는 50 ng의 정제된 항원으로 시작하여, PIV 단백질 L의 1:2로 11개 연속 희석물로 활성화시켰다. 항-L 2E11B5 및 4D8C6 항체는 3.4 μg/mL (170 ng/웰)의 최종 농도로 사용되었고 1X PBS/10% FBS에 희석되었다. 이후에, 항-마우스 IgG 검출 항체는 1:2,000 (웰 당 0.5 ng/μL)의 희석으로 첨가되었고 1시간 동안 실온 (
25℃ (77℉))에 암실에서 인큐베이션되었다. 마지막으로, 세척을 수행하였고 50 μL의 시트레이트/테트라메틸벤지딘 (TMB, 3-3'-5-5'-테트라메틸벤지딘, 1 mg/mL, Becton Dickinson) 완충액으로 발색시켰다. 반응을 중지시키기 위해서, 50 μL의 H2SO4 2N을 첨가하였고 결과는 ELISA 판독기 상에, 450 nm에서 판독하였다. 결과는 항-L 2E11B5 항체가 최대 390 피코그램 (pg)의 PIV 재조합 키메라 단백질 L을 검출할 수 있다는 것을 보여주었다 (도 2A). 4D8C6 하이브리도마로부터의 항-L 항체는, 최대 190 피코그램의 순수 단백질을 검출할 수 있었으므로, 항-L 항체 2E11B5에 비해 더 큰 감도를 보였다 (도 2B). 샘플을 제외하고 모든 검사 성분을 함유시킨, 양쪽 항체의 비특이적 반응을 배제시킬 수 있는 대조군을 모든 검사에 포함시켰다 (PIV 단백질 L, 그래프에 데이터 미도시).
실시예 5: 간접 ELISA에 의한, PIV 바이러스 항원을 검출하기 위한 단일클론 항체 효율을 결정하기 위한 분석.
분석은 바이러스 항원의 검출을 가능하게 하는 2E11B5 및 4D8C6 하이브리도마로부터의 PIV 항-단일클론 항체 L의 최대 희석율을 결정하기 위해 수행되었다. ELISA 플레이트는 50 ng의 정제된 항원 (단백질 L)으로 활성화시켰고 그 다음으로 플레이트를 2시간 동안 37℃ (98.6℉)에서 1X PBS/10% 태아 소 혈청 (FBS)으로 차단시켰다. 항-L 2E11B5 및 4D8C6 항체는 작동 농도 (170 ng)로부터 시작하여 1X PBS/10% FBS 중에 희석 11 (0.15 ng) 까지, 1:2 희석에 사용하였다. 이후에, 항-마우스 IgG 검출 항체를 1:2000 희석 (웰 당 0.5 ng/μL)으로 첨가하였고, 1시간 동안 실온 (
25℃ (77℉))에 암실에서 인큐베이션시켰다. 마지막으로, 세척을 수행하였고, 50 μL의 시트레이트/테트라메틸벤지딘 (TMB, 3-3'-5-5'-테트라메틸벤지딘, 1 mg/mL, Becton Dickinson) 완충액으로 발색시켰다. 반응을 중지시키기 위해서, 50 μL의 H2SO4 2N을 첨가하였고 결과는 ELISA 판독기 상에, 450 nm에서 판독하였다. 도 3 (A 및 B)에서, 양쪽 항-L 항체 (2E11B5 및 4D8C6)는 높은 효율로 50 ng의 정제된 항원을 검출할 수 있는 것으로 관찰되는데, 만들어진 희석물에서 높은 신호로 항원의 검출이 관찰되었기 때문이다. 이 분석에 포함된 음성 대조군은 샘플 (단백질 L)을 함유하지 않고, 1X PBS/10% FBS로 차단시키고, 1차 항체 (항-L 2E11B5 또는 항-L 4D8C6)가 첨가되고, 또한 HRP-접합된 항-마우스 IgG 항체를 함유하는 웰에 상응한다.
실시예 6: 루미넥스 샌드위치 기술에 의한, PIV 항-L 단일클론 항체를 사용한, PIV-감염 세포에서 PIV 단백질 L의 검출.
환자 샘플에서 처럼, 바이러스 단백질의 이용가능성 및 농도는 일반적으로 감염된 세포에서 매우 낮아서, 우리는 PIV-감염 세포에서 관심 항체의 검출을 평가하고 싶었다 (도 4). 이 분석을 위해서, 포획 항체로서 항-L 2E11B5 항체 및 검출 항체로서 항-L 4D8C6을 사용하여, 샌드위치형 루미넥스 분석을 수행하였다. PIV 항-L 4D8C6 검출 항체는 형광단 바이오틴에 접합되었다. 루미넥스 플레이트는 포획 항체로서 기능하는, 2E11B5 하이브리도마 (항-PIV)에 의해 분비된 항체와 접합된, μL 당 50 자성 미세구 (상이한 강도의 적외선 또는 근적외선 형광단으로 내부 표지됨)로 활성화되었다 (2.5 μM의 최종 농도). 접합된 미세구는 50 μL의 PIV 미감염 및 감염된 MDCK 세포와 2시간 동안 실온 (23℃ (73.4℉))에서, 400 rpm으로 교반하면서 암실 (알루미늄 호일로 덮음)에서, 인큐베이션시켰다. 음성 대조군으로서, 샘플없이 웰을 인큐베이션시켰고 50 ng의 단백질 L이 양성 대조군으로서 사용되었다. 2시간 후에, 100 μL의 1X-Tween20 PBS 0.05%으로 30초 동안 수동 자성 스크러버를 사용해 2회 세척을 수행하였다. 2E11B5 항체에 의해 포획된 단백질의 검출을 위해서, 바이오틴 형광단에 접합된, 4D8C6 하이브리도마에 의해 생성된 항체는 1X PBS-1% BSA에 희석되어 4 μg/mL의 농도로 사용되었고, 웰은 50 μL이 인큐베이션되었다. 인큐베이션은, 400 rpm으로 교반하면서, 암실에, 실온에서 1시간 동안 수행된다. 수동 자성 스크러버를 사용하여 30초 동안 100 μL의 1X-Tween20 PBS 0.05%로 다시 2회 세척을 수행한다. 항원이 더해진 포획 항체 및 검출 항체와 접합된 미세구에 의해 형성된 복합체는 6 μg/mL의 최종 농도로 50 μL의 스트렙타비딘/파이코에리쓰린과 인큐베이션된다. 400 rpm에서 교반하면서, 암실에, 실온에서, 30분 동안 인큐베이션을 수행한다. 마지막으로, 2회 더 세척 단계를 수행하고 웰은 100 μL의 시트 (Sheat) 유체 시약 (샘플을 판독하기 위한 장비를 위해 루미넥스 장비에서 사용되는 시약)과, 5분간 400 rpm으로, 암실에서 교반하면서, 인큐베이션된다. 다음으로 평균 형광 강도 (MFI)의 결과는 적색 레이저 (621 nm)를 통해서, 미세구의 인식 영역을 검출하고, 녹색 레이저 (511 nm)는 피분석물에 대한 검출 항체의 결합을 인식하는, 루미넥스 200 장비에서 판독된다.
이 검사에서 수득된 결과는 도 4에 도시되며, 여기서 포획 항체로서, 2E11B5 하이브리도마로부터의 항체 (항-L) 및 검출 항체로서 4D8C6-HRP 하이브리도마로부터의 항체를 사용한, 루미넥스 기술이 미감염 세포로부터의 항원을 비특이적으로 검출하지 않으면서, PIV-감염 세포에서 항원을 검출할 수 있게 한다 (도 4)는 것을 확인할 수 있는데, 즉, 이들 항체는 감염 및 미감염 샘플을 구별할 수 있다. 루미넥스에 의해 양성으로 검출된 모든 감염 세포 샘플은 미감염 세포의 평균 MFI로부터 2 표준 편차 이상인 MFI를 나타내는 것들이다. 감염 및 미감염 세포는 실시예 7에 표시된 임상 샘플과 동일하게 처리되었다.
실시예 7: ELISA 샌드위치 기술을 사용한, PIV 항-L 단일클론 항체를 사용한, PIV-감염 환자 유래 샘플의 임상 진단.
바이러스 단백질의 이용가능성 및 농도는 비인두 면봉의 임상 샘플 중에서 일반적으로 매우 낮으므로, 이전에 수행된 간접 ELISA를 변형시키는 것이 필요하였다. 이러한 분석을 위해서, 포획 항체로서 항-L 2E11B5 항체 및 검출 항체로서 항-L 4D8C6을 사용하여, 샌드위치 ELISA를 수행하였다. PIV 항-L 4D8C6 검출 항체는 HRP에 접합되었다. ELISA 플레이트의 웰은 1X PBS에 희석된, 3.4 μg/mL (170 ng/웰)의 PVI 2E11B5 하이브리도마로부터의 항-L 항체로, 1시간 동안 37℃ (98.6℉)에서 활성화시켰다. 2회 세척을 1X-Tween20 PBS 0.05%를 사용해 수행하였고 그 이후에 플레이트를 200 μL의 1X PBS/10% FBS로 1시간 동안 37℃ (98.6℉)에서 차단시켰다. 다시 세척하였고 1시간 동안 37℃ (98.6℉)에서 각 웰을, 일반적으로 "바이러스 패널"이라고 하고, 이후 기술된 대로 처리된, 진단 방법 "D³ Ultra DFA Respiratory Virus Screening and ID Kit de DHI (Diagnostics Hibryds) USA"에 따라 PIV 양성인 환자로부터의 50 μL의 비인두 면봉과 인큐베이션시켰다. 대조군으로서 다음을 포함시켰다: 1) 특이성 대조군: Flu 진단된 환자의 50 μL 샘플이 항-PIV 항체에 대한 바이러스 패널에 의해 사용됨; 2) 양성 대조군: 50 ng의 재조합 L-PIV 단백질; 3) 음성 대조군: 건강한 대조군 샘플에 상응. 이후에, 2회의 상응하는 세척을 1X-Tween20 PBS 0.05%를 사용해 수행하였고, 각 웰을 1시간 동안 실온 (
25℃(
77℉), 암실)에서, HRP (1.8 ng/μL의 최종 농도)가 접합된, 50 μl의 4D8C6 하이브리도마로부터의 항-L 항체와 인큐베이션시켰다. 다음으로 플레이트를 2회 더 세척하였고, 50 μL의 TMB 용액으로 발색시켰으며 15분 동안 암실에서 인큐베이션시켰다. 50 μL의 H2SO4 2N로 반응을 중지시켰고 플레이트는 임상 진단을 위해 보증된, ELISA 판독기 (Epoch model)에 450 nm에서 판독하였다.
이 검사에서 수득된 결과는 도 5A에 도시되어 있는데, 여기서 포획 항체로서, 2E11B5 하이브리도마로부터의 항체 (항-L) 및 검출 항체로서 4D8C6-HRP 하이브리도마로부터의 항체를 사용하는 ELISA 샌드위치 기술은 바이러스 패널을 사용하여 보증된 임상 실험실에서 직접 면역형광으로 이전에 확인된, PIV-감염 환자의 샘플에서 항원의 검출을 가능하게 한다 (도 5A). 도 5A 는 PIV 항-L 항체를 사용해 수득된 결과를 도시하는데, 양성 PIV로 진단된 환자로부터의 43개 샘플이 사용되었고 특이성 대조군으로서, 인플루엔자 바이러스에 양성인 환자로부터의 3개 샘플이 포함되었다. 양성 대조군으로서, 정제된 L-PIV 단백질이 첨가된 웰이 포함되었다. 음성 대조군으로서, 10개의 건강한 대조군이 평가되었다. 결과는 항-PIV 항체가 오직 PIV-양성 환자만을 검출하는데 특이적이고 건강한 대조군이나 또는 다른 바이러스 (Flu)로 감염된 경우에는 그렇지 않음을 보여준다. ELISA에 의해 양성으로 검출된 모든 샘플은 0.1 이상의 광학 밀도 (OD)를 보이는 것들이다.
임상 샘플의 처리. 검사에 사용된 샘플은 UTM (universal transport medium)에 함유된 비인두 면봉으로부터 수득되었다. 샘플은 14,000 rpm으로 4분 동안 실온에서 원심분리하였다. 이후에, 상등액 (SN1)을 펠렛으로부터 분리하였고, 후자를 100 μL 의 RIPA 완충액 (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트, 0.1%, SDS 및 1X 프로테아제 억제제 칵테일)과 15분 동안 4℃ (39.2℉)에서 인큐베이션시켰으며, 5분마다 와류시켰다. 다음으로 14,000 rpm으로 4분 동안 실온에서 원심분리시켰다. 마지막으로, 수득된 상등액 (SN2)을 취하였고 SN1과 혼합하였으며, 와류를 수행하였다.
실시예 8: 샌드위치형 루미넥스에 의한 PIV 항-L 단일클론 항체를 사용한 PIV-감염 환자로부터의 샘플의 임상 진단.
ELISA 기술에서 처럼, 바이러스 단백질의 이용가능성 및 농도는 일반적으로 비인두 면봉의 임상 샘플에서 매우 낮아서, 다른 보다 민감한 기술에 대해서 ELISA 기술에 의해 수득된 결과를 평가하기를 원하였다 (도 5A). 이 분석을 위해서, 샌드위치형 루미넥스 분석이 포획 항체로서 항-L 2E11B5 항체 및 검출 항체로서 항-L 4D8C6을 사용하여 수행되었다. PIV 항-L 4D8C6 검출 항체는 형광단 바이오틴에 접합되었다. 루미넥스 플레이트는 포획 항체 (2.5 μM의 최종 농도)로서 기능하는 2E11B5 하이브리도마 (항-PIV)에 의해 분비된 항체가 접합된, μL 당 50 자성 미세구 (상이한 강도의 적외선 또는 근적외선 형광단으로 내부 표지됨)로 활성화되었다. 접합된 미세구는 바이러스 호흡기 증상이 있는 환자로부터의 50 μL의 비인두 면봉 (NPS) 샘플과 2시간 동안 실온 (23℃ (73.4℉))에서, 400 rpm에서 교반되면서, 암실 (알루미늄 호일로 덮음)에서 인큐베이션되었다. 음성 대조군으로서, 건강한 대조군의 8개 샘플을 분석하였다. 상기 언급된 동일 방식으로 처리된, "바이러스 패널"이라고 통상 언급되는, 진단 방법 "D³ Ultra DFA Respiratory Virus Screening and ID Kit de DHI (Diagnostics Hibryds) USA"에 따라, PIV 양성인 환자의 14개 샘플이 사용되었고, 양성 대조군으로서, 정제된 L-PIV 단백질 (50 ng)이 첨가된 웰이 포함되었다. 2시간 후에, 수동 자성 스크러버를 사용하여 30초 동안 다시 100 μL의 1X-Tween20 PBS 0.05%를 사용해 2회 세척을 수행하였다. 2E11B5 항체에 의해 포획된 단백질의 검출을 위해서, 4D8C6 하이브리도마에 의해 생산되고, 바이오틴 형광단이 접합된 항체가 1X PBS - 1%BSA에 희석된, 4 μg/mL의 농도로 사용되었고, 웰을 50 μL와 인큐베이션시켰다. 400 rpm로 교반하면서, 암실에, 실온에서, 1시간 동안 인큐베이션을 수행하였다. 수동 자성 스크러버를 사용해 30초 동안 100 μL의 1X-Tween20 PBS 0.05%를 사용하여 다시 2회 세척을 수행하였다. 항원이 더해진 포획 항체 및 검출 항체와 접합된 미세구에 의해 형성된 복합체는 6 μg/mL의 최종 농도로 50 μL의 스트렙타비딘/파이코에리쓰린과 인큐베이션된다. 400 rpm에서 교반하면서, 암실에, 실온에서 30분 동안 인큐베이션을 수행한다. 마지막으로, 2회 더 세척 단계를 수행하고 웰은 암실에서, 400 rpm에서 5분간 교반하면서, 100 μL의 시트 (Sheat) 유체 시약 (샘플을 판독하기 위한 장비를 위한 루미넥스 장비에서 사용되는 시약)과 인큐베이션시킨다. 평균 형광 강도 (MFI)의 결과는 적색 레이저 (621 nm)를 통해서, 미세구의 인식 영역을 검출하고, 녹색 레이저 (511 nm)는 피분석물에 대한 검출 항체의 결합을 검출하는, 루미넥스 200 장비 상에서 판독된다.
이 검사에서 수득된 결과는 도 5B에 도시되는데, 여기서는 포획 항체로서, 2E11B5 하이브리도마로부터의 항체 (항-L) 및 검출 항체로서, 4D8C6-HRP 하이브리도마로부터의 항체를 사용하는 ELISA 기술에 의해 수득된 바와 같이, 루미넥스 기술은 높은 강도로 PIV-감염 환자의 샘플에서 항원의 검출을 가능하게 한다는 것을 관찰할 수 있고 (도 5B), 이것은 바이러스 패널을 사용하여 보증된 임상 실험실에서 직접 면역형광으로 이전에 확인되었다. 도 5B 는 PIV 항-L 항체를 사용해 수득된 결과를 도시하는데, 여기서 양성 PIV로서 진단된 환자로부터의 38개 샘플을 사용하였고 8개 건강한 대조군 샘플이 사용되었다. 더 나아가서, 양성 대조군으로서, 정제된 L-PIV 단백질이 첨가된 웰을 사용하였다. 결과는 항-PIV 항체는 오직 PIV-양성 환자에서 검출에 특이적이고 대조군 대상체에서는 그렇지 않음을 보여준다. 루미넥스에 의해 양성으로 검출된 모든 샘플은 건강한 대조군의 평균 MFI로부터의 2개 표준 편차 이상인 MFI를 나타내는 것들이다.
환자 샘플을 사용한 ELISA 분석에서 처럼, 이 분석은 PIV의 2E11B5 및 4D8C6 하이브리도마로부터의 항체의 다재다능성을 입증하는데, 그들이 결합 부위에 대해 경쟁하지 않거나 또는 서로 방해하지 않고 항원에 동시에 결합할 수 있고 비인두 면봉 샘플에서 불충분한 항원 이용가능성을 검출하기 때문이다. 이들 결과에서 가장 흥미로운 점은 인간 PIV의 가장 우세한 3개 혈청형 (1, 2 및 3)의 3개의 보존된 단편으로부터 실험실에서 구축된, 키메라 단백질인, 단백질 L을 검출하는 것이 가능하였다는 점이다.
실시예 9: 호흡기 바이러스 다중 검출 키트의 일부인, 항-PIV 단일클론 항체를 사용한, 감염 환자로부터 수득된, 임상 샘플에서 L-PIV 항원의 검출을 위한 맹검 시험.
이전에, ELISA 검사는 평가하려는 샘플의 이전 진단이 알려진 것이 샌드위치로 수행되었다. 이들 검사 후에, 맹검 시험을 수행하였는데, 여기서 미생물학적 진단이 알려지지 않은, 약 150개 비인두 면봉 샘플을 평가하였다. 맹검 시험의 모든 분석 경우에, 항-L 2E11B5 항체가 포획 항체로서 사용되었고 항-L 4D8C6 항체가 HRP-접합된 검출 항체로서 사용된 ELISA의 샌드위치를 수행하였다. ELISA 플레이트의 웰은 1X PBS에 희석된, PIV 2E11B5 하이브리도마로부터의 3.4 μg/mL (170 ng/웰)의 항-L 항체로 30시간 동안 37℃ (98.6℉)에서 활성화되었다. 1X-Tween20 PBS 0.05%로 2회 세척을 수행하였고 이후에 플레이트는 200 μL의 1X PBS/10% FBS로 30분 동안 37℃ (98.6℉)에서 차단되었다. 환자로부터의 50 μL의 비인두 면봉이 존재하는 각각의 웰은 다시 세척하였고 1시간 동안 37℃ (98.6℉)에서 인큐베이션하였고, 통상 "바이러스 패널"이라고 하고, 실시예 6에 이전에 기술된 바와 같이 처리된, 표준 진단 방법 (PCR)을 통해 동시에 평가되었다. 대조군으로서 다음을 포함하였다: 1) 특이성 대조군: 50 μL의 BSA 단백질 (50 ng)이 사용됨; 2) 양성 대조군: 50 ng의 L-PIV 재조합 단백질; 3) 음성 대조군: 샘플 부재 웰로서 웰을 차단시키고 검출 항체와 인큐베이션시킴. 이후에, 2회의 상응하는 세척이 1X-Tween20 PBS 0.05%를 사용해 수행되었고 각 웰은 30분 동안 실온 (
25℃ (
77℉), 암실)에서 HRP가 접합된, 50 μl의 4D8C6 하이브리도마로부터의 항-L 항체 (1.8 ng/μL의 최종 농도)와 인큐베이션되었다. 다음으로 플레이트를 2회 더 세척하였고, 50 μL의 TMB 용액으로 발색시켰으며 15분 동안 암실에서 인큐베이션시켰다. 반응은 50 μL의 H2SO4 2N로 중지시켰고 웰은 임상 진단에 보증된, ELISA 판독기 (Epoch model)에서, 450 nm에서 판독하였다.
결과는 도 5A에 도시되어 있고, 여기서 임상 샘플에서 단백질 L을 검출하는 항체의 능력이 관찰되는데, 그들이 키메라 단백질로부터 디자인되었기 때문이다. 7명 PIV 양성 환자 중 5명이 검출되었고, 이들 결과로부터 항체의 진단 정확도를 결정할 수 있었고, 표 1에 표시되어 있다. 표는 진단 정확도를 정의한 2개 개념을 보여주는데, 우리가 특이성을 갖는 경우에, 즉, 거짓 양성 검출없이, 음성으로서 음성 샘플을 진단하는 항체의 능력, 및 다른 한편으로, 감도를 갖는 경우, 즉, 거짓 음성 진단없이, 실제로 샘플을 양성으로 진단하는 항체의 능력이다. 표에 기재된 결과는 표준 기술 (PCR)에 비해 항체의 높은 특이성 백분율 (100%) 및 낮은 감도 백분율 (71%)을 보여주고, 그리하여 항체가 그들 단백질이 보존된 것이 아니므로, 바이러스에 의해 발현되는 완전한 단백질이 아니라 키메라 단백질로 디자인되는 것을 매우 고려하게 되었다.
실시예 10: 바이오틴-접합된 2E11B5 및 4D8C6 하이브리도마에 의해 분비된 단일클론 항체를 사용한, 간접 ELISA에 의한 단백질 L 검출.
이 실시예에서, PB2 단백질에 대한 특이적 단일클론 항체가 간접 ELISA에 의해 검출될 수 있다는 것을 입증한다.
단백질 L의 검출을 위해서, ELISA 플레이트는 50 μL의 단백질 L 및 BSA 50 ng으로 활성화시켰다. 특이적 부위는 1X PBS에 희석된 10% FBS로 차단시켰다. 2E11B5 (항-PIV) 및 4D8C6 (항-PIV) 하이브리도마에 의해 분비된 항체의 170 ng (3.4 μg/mL)의 Fab 단편은 이전에 바이오틴 접합되었다. HRP-접합된 바이오틴-결합 분자 (스트렙타비딘)의 인큐베이션 (1:2,000 희석, 웰 당 75 ng) (도 6, 진회색 막대, 2E11B5 항체, 및 연회색 막대, 4D8C6 항체).
실시예 10: 간접 ELISA 분석에 의한 PIV 항-L 단일클론 항체의 F(ab')2 단편을 사용한, PIV 항원 검출 분석
이 분석의 목표는 키메라 단백질 L에 의한, 2E11B5 및 4D8C6 하이브리도마에 의해 생산된, 항-PIV 항체의 단편을 검출하는 능력을 입증하는 것이다. 간접 ELISA 분석 전에, 각 항-PIV 항체의 IgG 분자의 단편화를 수행하였다. 단편화는 "Thermo Scientific™ Pierce™ F(ab')2 Fragment Preparation Kits" 키트 (# 10381214, Thermo Scientific)를 사용해 수행하였는데, Fc 단편을 분해하는 펩신 효소를 사용하여 관심 항체로부터 F(ab')2 단편 및 Fc를 분리시키고, 이후에 정제 단계를 수행하여 분해된 Fc 단편으로부터 F(ab')2 단편을 분리시킨다. 항체 단편화 이후에, 정제된 F(ab')2 분획은 쿠마시 블루를 사용하는 SDS-PAGE 염색 기술을 통해 검증하였다. F(ab')2 분획은 신속 접합 키트, Lightning-Link 신속 바이오틴 A형 (#370-0010, Expedeon)을 사용하여 바이오틴 분자에 접합시켰다. 모든 시약이 준비되면, 항원 검출은 간접 ELISA 기술을 통해 수행되었는데, 여기서 ELISA 플레이트는 50 ng의 정제된 L 항원으로 1시간 동안 37℃ (98.6℉)에서 활성화되었다. 2개 음성 대조군이 포함되었는데, 하나는 샘플이 부재하고 나머지는 50 ng의 BSA 단백질로 웰을 인큐베이션시켰다. 이후에 플레이트는 1X/Tween20 0.05% 포스페이트 완충 염수 (PBS)로 2회 세척되었다. 다음으로 플레이트는 2시간 동안 37℃ (98.6℉)에서 1X PBS/10% 태아 소 혈청 (FBS)으로 차단되었다. 이후에, 세척을 반복하고 나서 각각의 항체를 바이오틴과 접합시켰고, 미분획화 및 F(ab')2 분획 (2E11B5 및 4D8C6)을 1X PBS/10% FBS로 희석시켜, 3.4 μg/mL (웰 당 170 ng)의 최종 농도로, 1시간 동안 37℃ (98.6℉)에서 인큐베이션시켰다 (개별 플레이트 상에 각 항체). 인큐베이션 시간 이후에, 세척을 반복하였고, 홀스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP) 효소로 표지된 바이오틴-결합 단백질 (스트렙타비딘)을 1X PBS/10% FBS에 1:2000으로 희석하여 각 웰에, 1시간 동안 실온 (25℃(77℉))에 암실에서 첨가하였다. 마지막으로, 세척을 수행하였고, 50 μL의 시트레이트/테트라메틸벤지딘 (TMB, 3-3'-5-5'-테트라메틸벤지딘, 1 mg/mL, Becton Dickinson) 완충액으로 발색시켰다. 반응을 중지시키기 위해서, 50 μL의 H2SO4 2N을 첨가하였고 결과는 ELISA 판독기 상에서, 450 nm에서 판독하였다. 2차 항체의 반응이 1차 항체의 인식에 특이적이었고 또한 수득된 신호가 항원에 대한 2차 항체의 비특이적 결합에 의해 초래된 것이 아님을 결정하기 위해서, 1차 항체 또는 샘플 없이 (비활성화 웰) 2차 항체만을 사용한 대조군을 수행하였다. 1차 항체 반응이 항원에 특이적임을 결정하기 위한 다른 대조군은 항원으로 활성화되지 않은 ELISA 플레이트 (샘플 없음) 상에서 항체를 사용하거나 또는 50 ng의 PB2를 보유하는 ELISA 플레이트 상에서 항체를 사용하는 것으로 이루어졌다.
결과는 본 발명의 단일클론 항체가, 특히 완전한 항체 또는 이의 단편을 사용하는지 여부와 무관하게, 50 ng의 정제된 항원을 인식할 수 있다는 것을 보여준다 (도 6, 검은색 막대, 2E11B5 항체 및 흰색 막대, 4D8C6 항체).
SEQUENCE LISTING
<110> Pontificia Universidad Cat처lica de Chile
<120> Monoclonal antibodies specific for human parainfluenza virus L antigen (PIV)
<130> N째 PCT
<150> Priority Document
<160> 12
<170> Patent Application.
SEQ ID No 1.
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> Synthetic ?? Hybridoma 2E1B5?? Anti L PIV CDRLC 1
<400> 1
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Leu Asn
1 5 10 15
SEQ ID No 2.
<210> 2
<211> 7
<212> DNA
<213> Synthetic ?? Hybridoma 2E1B5?? Anti L PIV CDRLC 2
<400> 2
Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser
1 5
SEQ ID No 3.
<210> 3
<211> 9
<212> DNA
<213> Synthetic ?? Hybridoma 2E1B5?? Anti L PIV CDRLC 3
<400> 3
Trp Gln Ser Thr His Phe Pro Gln Thr
1 5
SEQ ID No 4.
<210> 4
<211> 5
<212> DNA
<213> Synthetic ?? Hybridoma 2E1B5?? Anti L PIV CDRHC 1
<400> 4
Gly Tyr Tyr Met His
1 5
SEQ ID No 5.
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> Synthetic ?? Hybridoma 2E1B5?? Anti L PIV CDRHC 2
<400> 5
Arg Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Ala Thr Arg Tyr Asn Gln Asn Phe
1 5 10 15
Lys Asp
SEQ ID No 6.
<210> 6
<211> 3
<212> DNA
<213> Synthetic ?? Hybridoma 2E1B5?? Anti L PIV CDRHC 3
<400> 6
Gly Ala Tyr
1
SEQ ID No 7.
<210> 7
<211> 15
<212> DNA
<213> Synthetic ?? Hybridoma 4D8C6?? Anti L PIV CDRLC 1
<400> 7
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Leu Asn
1 5 10 15
SEQ ID No 8.
<210> 8
<211> 7
<212> DNA
<213> Synthetic ?? Hybridoma 4D8C6?? Anti L PIV CDRLC 2
<400> 8
Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser
1 5
SEQ ID No 9.
<210> 9
<211> 9
<212> DNA
<213> Synthetic ?? Hybridoma 4D8C6?? Anti L PIV CDRLC 3
<400> 9
Trp Gln Ser Thr His Phe Pro Gln Thr
1 5
SEQ ID No 10.
<210> 10
<211> 5
<212> DNA
<213> Synthetic ?? Hybridoma 4D8C6?? Anti L PIV CDRHC 1
<400> 10
Gly Tyr Tyr Met His
1 5
SEQ ID No 11.
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> Synthetic ?? Hybridoma 4D8C6?? Anti L PIV CDRHC 2
<400> 11
Arg Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe
1 5 10 15
Lys Asp
SEQ ID No 12.
<210> 12
<211> 3
<212> DNA
<213> Synthetic ?? Hybridoma 4D8C6?? Anti L PIV CDRHC 3
<400> 12
Gly Ala Tyr
1
Claims (10)
- 인간 파라인플루엔자 바이러스(PIV) 단백질 L에 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분으로서, 상기 단백질의 존재 및/또는 위치의 검출에서 사용되며,
경쇄 가변 영역으로서, 그의 CDR1(CDRLC1)이 서열번호 1에 의해 정의되고, 그의 CDR2(CDRLC2)가 서열번호 2에 의해 정의되며, 그의 CDR3(CDRLC3)이 서열번호 3에 상응하는 것인 경쇄 가변 영역, 및 중쇄 가변 영역으로서, 그의 CDR1(CDRHC1)이 서열번호 4에 의해 정의되고, 그의 CDR2(CDRHC2)가 서열번호 5에 의해 정의되며, 그의 CDR3(CDRHC3)이 서열번호 6에 상응하는 것인 중쇄 가변 영역, 또는
경쇄 가변 영역으로서, 그의 CDR1(CDRLC1)이 서열번호 7에 의해 정의되고, 그의 CDR2(CDRLC2)가 서열번호 8에 의해 정의되며, 그의 CDR3(CDRLC3)이 서열번호 9에 상응하는 것인 경쇄 가변 영역, 및 중쇄 가변 영역으로서, 그의 CDR1(CDRHC1)이 서열번호 10에 의해 정의되고, 그의 CDR2(CDRHC2)가 서열번호 11에 상응하며, 그의 CDR3(CDRHC3)이 서열번호 12에 상응하는 것인 중쇄 가변 영역
을 포함하는 것을 특징으로 하고, 상기 항체는 검출 또는 포획 항체로서 사용될 수 있는 것인 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분. - 생물학적 샘플에서 PIV 바이러스를 검출하기 위한 방법으로서, 제1항에 따른 PIV 키메라 단백질 L에 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분과 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계, 및 항원에 대한 항체의 결합을 검출하여 샘플에서 PIV 바이러스를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 생물학적 샘플에서 PIV 바이러스를 검출하기 위한 방법.
- 제2항에 있어서, 생물학적 샘플은 PIV에 감염된 시험관내 세포, 코 분비물, 코 세척물, 뇌척수액, 인두 분비물 및/또는 기관지 세척물 또는 분비물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 생물학적 샘플에서 PIV 바이러스를 검출하기 위한 방법.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 항원에 대한 항체의 결합을 검출하기 위해 이용되는 분석이 ELISA, 면역형광, 면역조직화학, 면역크로마토그래피, 유세포 분석, 세포 분별기, 면역침전 및/또는 웨스턴 블롯으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 생물학적 샘플에서 PIV 바이러스를 검출하기 위한 방법.
- 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 그의 검출을 가능하게 하는 마커와 접합되어 있는 것을 특징으로 하는, 생물학적 샘플에서 PIV 바이러스를 검출하기 위한 방법.
- 제5항에 있어서, 항체는 형광단, 바이오틴, 방사성 동위원소, 금속 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 마커에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는, 생물학적 샘플에서 PIV 바이러스를 검출하기 위한 방법.
- PIV 바이러스의 검출을 위한 키트로서,
- 포획 또는 검출 항체로서 작용하는, 제1항에 따른 PIV 키메라 단백질 L에 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분으로서, 검출 항체는 그의 검출을 위해 마커에 접합되어 있는 것인 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분;
- 항체가 부착되는 고체 지지체; 및
- 검출 항체에 포함된 마커, 예컨대 형광단, 바이오틴, 방사성 동위원소, 금속 및 효소를 검출하기 위한 시약
을 포함하는 것을 특징으로 하는, PIV 바이러스의 검출을 위한 키트. - 제7항에 있어서, 고체 지지체는 니트로셀룰로스, 셀룰로스, 폴리에틸렌 및 나일론으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 중 하나로 형성된 막인 것을 특징으로 하는, PIV 바이러스의 검출을 위한 키트.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, PIV를 검출하기 위한, 면역크로마토그래피 테스트, 루미넥스, 유세포 분석, 면역형광, 방사성면역분석, 웨스턴 블롯, 도트 플롯, ELISA, 면역확산 또는 면역침전에 해당하는 것을 특징으로 하는, 정성적 및/또는 정량적 PIV 바이러스 검출을 위한 키트.
- 포획 및/또는 검출 항체의 역할을 하는 것을 특징으로 하는 제1항에 따른 PIV 키메라 단백질 L에 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 용도.
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