WO2020132774A1 - Anticuerpo monoclonal o una porción de unión a antígeno del mismo que se une a la proteína l del virus parainfluenza humano (piv); método y kit para detectar al virus piv - Google Patents

Anticuerpo monoclonal o una porción de unión a antígeno del mismo que se une a la proteína l del virus parainfluenza humano (piv); método y kit para detectar al virus piv Download PDF

Info

Publication number
WO2020132774A1
WO2020132774A1 PCT/CL2019/050157 CL2019050157W WO2020132774A1 WO 2020132774 A1 WO2020132774 A1 WO 2020132774A1 CL 2019050157 W CL2019050157 W CL 2019050157W WO 2020132774 A1 WO2020132774 A1 WO 2020132774A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
piv
antibody
detection
seq
cdr
Prior art date
Application number
PCT/CL2019/050157
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Alexis Mikes Kalergis Parra
Susan Marcela Bueno Ramírez
Original Assignee
Pontificia Universidad Católica De Chile
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pontificia Universidad Católica De Chile filed Critical Pontificia Universidad Católica De Chile
Priority to CA3125208A priority Critical patent/CA3125208A1/en
Priority to CN201980093165.9A priority patent/CN113490685A/zh
Priority to MX2021007870A priority patent/MX2021007870A/es
Priority to BR112021012788A priority patent/BR112021012788A2/pt
Priority to PE2021001089A priority patent/PE20212104A1/es
Priority to EP19903462.0A priority patent/EP3904379A4/en
Priority to KR1020217024084A priority patent/KR20210110660A/ko
Priority to US17/418,617 priority patent/US20220089697A1/en
Publication of WO2020132774A1 publication Critical patent/WO2020132774A1/es
Priority to CONC2021/0008770A priority patent/CO2021008770A2/es
Priority to ZA2021/04990A priority patent/ZA202104990B/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1027—Paramyxoviridae, e.g. respiratory syncytial virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/115—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host

Definitions

  • Monoclonal antibodies, or fragments thereof, are presented that recognize the human parainfluenza virus (PIV) chimera L protein, where said monoclonal antibodies or fragments thereof comprise a variable light chain region where their CDR1 (CDR LCI ) is defined by SEQ ID NO: 1, your CDR2 (CDR LC2 ) is defined by SEQ ID NO: 2, and your CDR3 (CDR LC3 ) corresponds to SEQ ID NO: 3, and a variable region of the heavy chain where your CDR1 ( CDR HCI ) is defined according to SEQ ID NO: 4, its CDR2 (CDR HC 2) corresponds to SEQ ID NO:
  • CDR HC3 corresponds to SEQ ID NO: 6
  • a light chain variable region where your CDR1 (CDR LCI ) is defined according to SEQ ID NO: 7, your CDR2 (CDR LC2 ) is defined by SEQ ID NO: 8 and its CDR3 (CDR LC3 ) corresponds to SEQ ID NO: 9, and a variable region of the heavy chain where its CDR1 (CDR HCI ) is defined according to SEQ ID NO: 10, its CDR2 (CDR HC2 ) corresponds to SEQ ID NO: 11 and its CDR3 (CDR HCS ) corresponds to SEQ ID NO: 12.
  • said antibodies can be used as detection and / or capture antibodies.
  • a method of diagnosing PIV infection in a biological sample using monoclonal antibodies is also provided, and a diagnostic kit for detecting PIV, comprising at least one monoclonal antibody against PIV as previously described.
  • the human parainfluenza virus produces an infectious disease of the upper respiratory tract that manifests itself in various clinical pictures ranging from a common cold, even pneumonia.
  • Laryngotracheobronchitis is the most frequent and serious clinical manifestation.
  • This disease is caused by a virus of the paramyxovirus type and is easily transmitted from person to person or through drops or small particles that have been expelled through the cough or sneeze of a sick person, which makes its spread fast and be part of seasonal epidemics.
  • IVP In the United States, IVP is one of the main causes of hospitalization for respiratory diseases in young children, occurring in between 2 and 17% of cases, which translates into 250,000 visits to emergency rooms and 700,000 hospitalizations. Among children under 5, 1.2 children are hospitalized for this cause annually, this rate being higher in children under 6 months 1 .
  • PIV has a more variable impact with respect to the other respiratory viruses, being responsible for 3 to 10% of hospitalizations with symptoms of bronchiolitis, pneumonia and laryngotracheobronchitis.
  • RSV respiratory syncytial virus
  • PIV infection reaches its peak between 4 and 12 years of age 2 .
  • Infection caused by PIV can be diagnosed using direct detection methods, that is, by detecting antibodies directly in the sample or by serological tests that allow the presence of IgM antibody to be measured or the increase in IgG titers.
  • Cell line assays are also used for the isolation of PIV in the clinical laboratory.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Document US6015664A presents a method to determine the presence or absence of multiple viral infections in a biological sample by means of a multiplex PCR assay. The method includes nucleotide cleavers along with probes for detection of complementary nucleic acid sequences of human parainfluenza virus 1, 2, and 3, respiratory syncytial virus A and B, and influenza virus, A and B.
  • RT-PCR kit for detecting parainfluenza virus in one step is disclosed in CN102140550A, where the kit includes specific primers for parainfluenza virus. TO.
  • document CN105441589A describes a detection kit for parainfluenza virus type 1, 2, 3 and 4, using quadruple PCR.
  • the quadruple PCR detection kit includes primers and genetic probes specific for human parainfluenza virus.
  • kits based on immunofluorescence for the detection of various respiratory viruses, including parainfluenza include parainfluenza.
  • the D3 Ultra DFA (direct fluorescent antibody) kit allows the qualitative identification of various respiratory viruses: influenza A, influenza B, respiratory syncytial virus, adenovirus, parainfluenza 1, parainfluenza 2 and parainfluenza 3.
  • the present invention relates to specific monoclonal antibodies against the L chimera protein or fragments thereof, of the human parainfluenza virus, hereinafter PIV.
  • the invention corresponds to monoclonal antibodies, or fragments thereof, that recognize the L chimera protein of human parainfluenza virus (PIV) secreted by the 2E11B5 and 4D8C6 hybridomas, where said monoclonal antibodies or fragments of these comprise a variable region light chain where your CDR1 (CDR LCI ) is defined according to SEQ ID NO: 1, your CDR2 (CDR LC2 ) is defined by SEQ ID NO: 2 and your CDR3 (CDR LCS ) corresponds to SEQ ID NO: 3 , and a variable region of the heavy chain where your CDR1 (CDR HCI ) is defined according to SEQ ID NO: 4, your CDR2 (CDR HC2 ) corresponds to SEQ ID NO: 5 and your CDR3 (CDR HCS ) corresponds to SEQ ID NO
  • Said antibodies can be used as detection and / or capture antibodies.
  • a method of diagnosing PIV infection in a biological sample using monoclonal antibodies is also provided, and a diagnostic kit for detecting PIV, comprising at least one monoclonal antibody against PIV as previously described.
  • the antibodies recognize a chimera protein, particularly the L chimera protein of the human parainfluenza virus.
  • the antibodies that are part of the scope of the invention allow specific detection of protein L or fragments thereof, so that they do not compete with each other for the antigen binding site, nor do they impede their simultaneous binding to East. Additionally, they allow detecting protein L or fragments of it with high sensitivity in samples that contain a low amount of antigen.
  • the proposed monoclonal antibodies are capable of detecting protein L, a conserved protein.
  • the detection strategy of a conserved viral protein allows the antibodies that are part of the scope of the invention to detect different types of the human parainfluenza virus, among them, parainfluenza 1, 2, 3 and 4.
  • CDR sequences When CDR sequences are referred to in the present invention, they correspond to short sequences that are found in the variable domains of proteins that have antigen detection function.
  • the CDR sequences for the heavy chain (CDR HC ) and light chain (CDRi, c) of the antibodies secreted by the 2E11B5 and 4D8C6 hybridomas are presented.
  • the described monoclonal antibodies can be used for detection, diagnosis and / or determination of PIV infection. These antibodies can be used simultaneously to increase detection sensitivity in clinical samples where there is little quantity and availability of antigen.
  • a method of diagnosing PIV infection in a biological sample which comprises contacting the biological sample with the monoclonal antibody against PIV L protein or a fragment thereof according to claim, and detect binding of the antibody to the antigen.
  • the biological sample can correspond, without limitation, to in vitro cells infected with PIV, nasal secretions, nasal lavages, cerebrospinal fluid, pharyngeal secretions and / or lavages or bronchial secretions.
  • the assay used for detection of antigen-antibody binding is selected from ELISA, luminex, immunofluorescence, immunohistochemistry, immunochromatography, flow cytometry, cell sorter, immunoprecipitation and / or Western blot.
  • the present invention also includes a diagnostic kit for detecting human influenza virus, which comprises: a monoclonal antibody against PIV L protein or a fragment thereof, where said antibody can act as a capture or detection antibody , where particularly, the detection antibody is conjugated to a marker for detection; a solid support to which the antibody is attached; and reagents for detecting the marker included in the detection antibody, such as fluorophores, biotin, radioisotopes, metals, and enzymes.
  • a diagnostic kit for detecting human influenza virus which comprises: a monoclonal antibody against PIV L protein or a fragment thereof, where said antibody can act as a capture or detection antibody , where particularly, the detection antibody is conjugated to a marker for detection; a solid support to which the antibody is attached; and reagents for detecting the marker included in the detection antibody, such as fluorophores, biotin, radioisotopes, metals, and enzymes.
  • capture antibody when referring to capture antibody, this corresponds to the antibody that specifically binds to the antigen.
  • detection antibody this corresponds to the antibody to which a marker is conjugated to be detected by different tests such as immunochromatographic test, luminex, flow cytometry, immunofluorescence, radioimmunoassay, Western blot, Dot plot, ELISA, luminex, immunodiffusion. or immunoprecipitation.
  • the antibodies part of the present invention can dual function as a capture antibody or as a detection antibody when coupled to the detection marker.
  • the detection marker will be conjugated to the detection antibody, and this can correspond, without limitation, to fluorophores, biotin, radioisotopes, metals and enzymes.
  • the detection antibody is conjugated to the reporter system based on detection of activity of horseradish peroxidase enzyme (HRP).
  • HRP horseradish peroxidase enzyme
  • Figure 1 Detection of PIV chimera L protein by monoclonal antibodies produced by hybridomas 2E11B5 and 4D8C6, by means of an indirect ELISA assay.
  • the plate was activated with 50 ng of purified recombinant PIV L protein, 50 ng of Flu PB2 protein (as a specificity control) and 20 pg of E. col ⁇ strain BL21 bacterial used without plasmid (used as a specificity control) and 3 clones (Cl, C2 and C3) of the same strain, in which protein L was over-expressed.
  • the data shown in the graph expresses the absorbance detected at 450 nm, emitted by the conversion of the substrate Tetramethylbenzidine to a colored compound, catalyzed by the enzyme Horseradish peroxidase (HRP) present in a secondary anti-mouse IgG antibody that specifically bound to the antibodies secreted by the 2F11B1 and 4D8C6 hybridomas. Values correspond to the average +/- standard deviation of absorbance emitted by each sample in at least two independent experiments.
  • the letters ns means that no significant difference is observed.
  • Figure 2 Determination of sensitivity of monoclonal antibodies produced by hybridomas 2E11B5 and 4D8C6 in the detection of L protein of PIV.
  • ELISA plates were activated with 1: 2 serial dilutions, starting with 50 ng of L protein and ending with 0.04 ng. Subsequently, the wells were incubated with anti-L antibodies from the 2E11B5 hybridoma, in the amount of 170 ng (A) and the 4D8C6 hybridoma in the amount of 170 ng (B). Unactivated wells were included as a negative control.
  • the data shown in the graph express the absorbance at 450 nm emitted by the conversion of the substrate Tetramethylbenzidine to a colored compound catalyzed by the enzyme Horseradish peroxidase (HRP) present in the anti-L antibodies from the 2E11B5 and 4D8C6 hybridomas in the amount of 170 ng (A and B). Values correspond to the average +/- standard deviation of absorbance emitted by each sample in at least two independent experiments. ** P ⁇ 0.01 and *** P ⁇ 0.001 by the parametric student test comparing the results of the well called control (without sample) versus each of the dilutions of protein L.
  • HRP horseradish peroxidase
  • Figure 3 Assay of serial dilutions of the Flu anti-L monoclonal antibodies produced by the 2E11B5 and 4D8C6 hybridomas, for the detection of purified PIV antigens.
  • ELISA plates were activated with 50 ng of recombinant PIV L protein and the antigen was detected with 11 serial dilutions 1: 2 of the anti-L antibodies 2E11B5 (A) or 4D8C6 (B), starting from a concentration of 3.4 mg / mL (170 ng per well).
  • Data are expressed as the average +/- standard deviation of the absorbance value emitted at 450 nm for each sample in duplicate, in at least two independent experiments.
  • Figure 4 Detection of PIV L protein, in infected cells, by monoclonal antibodies produced by hybridomas 2E11B5 and 4D8C6, by means of a Luminex assay.
  • the plate was activated with 50 ng of purified recombinant PIV L protein, 20 pg of uninfected MDCK cells (used as a specificity control) and infected with PIV.
  • the wells were incubated with anti-L antibodies from hybridoma 2E11B5 (conjugated to region 21 of PIV), in quantity of 50 microspheres / m ⁇ , which was used as capture antibody and the hybridoma 4D8C6 at a concentration of 4 mr / hIE used as detection antibody conjugated with biotin.
  • FIG. 5 Detection of PIV in clinical samples by Sandwich ELISA and Sandwich type Luminex, using the combination of monoclonal antibodies secreted by hybridomas 2E11B5 and 4D8C6 for PIV.
  • A) ELISA plates were activated with 170 ng of antibody secreted by the 2E11B5 hybridoma (anti-PIV), functioning as capture antibody.
  • the wells activated with the capture antibodies for each virus were incubated with 50 m ⁇ of nasopharyngeal swab (HNF) samples from patients who had viral respiratory symptoms. As negative controls, 10 samples from healthy controls were analyzed.
  • HNF nasopharyngeal swab
  • Luminex plates were activated with 50 magnetic microspheres per m ⁇ , which were conjugated with the antibody secreted by the 2E11B5 hybridoma (anti-PIV), functioning as a capture antibody.
  • the conjugated microspheres were incubated with 50 m ⁇ of nasopharyngeal swab (HNF) samples from patients presenting with viral respiratory symptoms. As negative controls, 8 samples from healthy controls were analyzed. Fourteen samples from PIV-positive patients were used and wells were added to the positive control to which was added purified L-PIV protein. For the detection of the protein captured by the 2E11B5 antibody, the antibodies produced by the 4D8C6 hybridoma, conjugated to the biotin fluorophore, were used at a concentration of 4 mg / mL.
  • HNF nasopharyngeal swab
  • the complex (microspheres conjugated with capture antibody, antigen and detection antibody) is incubated with Streptavidin / Phycoerythrin at a concentration 6 mg / mL.
  • the data shows the median value of the absorbance emitted at 450 nm (A) or the MFI (B) of each sample (** P ⁇ 0.01 and **** p ⁇ 0.0001; using the student test nonparametric comparing PIV positive patients versus healthy controls, and against the viruses used as specificity control).
  • Figure 6 Detection of L protein by indirect ELISA, using monoclonal antibodies secreted by biotin-conjugated 2E11B5 and 4D8C6 hybridomas.
  • the figure shows a graph expressing the absorbance at 450 nm emitted by the conversion of the substrate
  • Example 1 Determination of the nucleotide sequence encoding the light (VL) and heavy (VH) chains of the variable region of the anti-L PIV antibody secreted by the 2E11B5 hybridoma.
  • the 2E11B5 hybridoma was grown in DMEM-high glucose culture medium supplemented with 3.7 g / L Sodium Bicarbonate and 10% fetal bovine serum, at 37 ° C with 10% CO2, up to a cell density of 700,000 cells / mL.
  • the total RNA of 3.5 x 10 cells was obtained, carrying out a treatment with the compound Trizol (Invitrogen).
  • RNA was used to generate the cDNA by reverse transcription reaction with the PrimeScriptTM lst Strand cDNA Synthesis Kit, which uses isotype specific universal cleavers.
  • the light and heavy chain of the antibody were amplified according to the GenScript cDNA Extreme Rapid Amplification (RACE) Standard Operating Procedure (SOP). Amplified antibody fragments were cloned separately into a standard cloning vector. Colony PCR was performed to identify clones that had inserts of the correct size. At least five colonies with correct size inserts were sequenced for each fragment. The sequences of different clones were aligned and the consensus sequence of these clones was provided.
  • the nucleotide sequences of the heavy and light chains of the antibodies secreted by the 2E11B5 hybridoma correspond to those identified as SEQ ID NO. one; SEQ ID NO .2 respectively.
  • Example 2 Determination of the nucleotide sequence encoding the light (VL) and heavy (VH) chains of the variable region of the anti-L PIV antibody secreted by the 4D8C6 hybridoma.
  • the 4D8C6 hybridoma was grown in DMEM-high glucose culture medium supplemented with 3.7 g / L Sodium Bicarbonate and 10% fetal bovine serum, at 37 ° C with 10% CO2, up to a cell density of 700,000 cells / mL.
  • Total RNA of 3.5 was obtained xlO 6 cells, carrying out a treatment with the compound Trizol (Invitrogen).
  • 0.5 pg of RNA was used to generate the cDNA by reverse transcription reaction with the PrimeScriptTM lst Strand cDNA Synthesis Kit, which uses isotype-specific universal cleavers.
  • the light and heavy chain of the antibody were amplified according to the GenScript cDNA Extreme Rapid Amplification (RACE) Standard Operating Procedure (SOP).
  • RACE GenScript cDNA Extreme Rapid Amplification
  • SOP Standard Operating Procedure
  • Amplified antibody fragments were cloned separately into a standard cloning vector. Colony PCR was performed to identify clones that had inserts of the correct size. At least five colonies with correct size inserts were sequenced for each fragment. The sequences of different clones were aligned and the consensus sequence of these clones was provided.
  • the nucleotide sequences of the heavy and light chains of the antibodies secreted by the 4D8C6 hybridoma correspond to those identified as SEQ ID NO. 3; SEQ ID NO .4 respectively.
  • Example 3 PIV Antigen Detection Assay, Determination of Specificity of PIV Anti-L Monoclonal Antibodies for Purified PIV Antigens by Indirect ELISA Assay.
  • This assay aims to demonstrate the specificity for the PIV L protein of the antibodies produced by the 2E11B5 and 4D8C6 hybridomas.
  • Antigen detection was carried out using the indirect ELISA technique, where the ELISA plate was activated with 50 ng of purified antigen for 1 hour at 37 ° C. In the same way, the plate was activated with 20 pg of E. col ⁇ bacterial strain strain BL21 without plasmid (used as a specificity control) and 3 clones (Cl, C2 and C3) of the same strain, in which it was over-expressed protein L. Other control Negative included was 50 ng of Flu2 PB2 protein in a separate well.
  • the plate was washed twice with phosphate buffered saline (PBS) lX / Tween20 0.05%. The plate was then blocked for 2 hours at 37 ° C with PBS IX / 10% Fetal Bovine Serum (FBS). Subsequently, the washes were repeated and each of the antibodies (2E11B5 and 4D8C6) were then incubated at a final concentration of 3.4 pg / mL (170 ng per well), diluted in PBS 1X / 10% FBS, for 1 hour at 37 ° C (each antibody on a separate plate).
  • PBS phosphate buffered saline
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • Example 4 Assay to determine the sensitivity of monoclonal antibodies for detection of PIV anti-L viral antigens.
  • the assay was performed to determine the maximum protein dilution that PIV anti-L monoclonal antibodies from 2E11B5 and 4D8C6 hybridomas are capable of detecting by indirect ELISA. For this, the same technique described in example 3 was used. The plate was activated with 11 serial dilutions 1: 2 of PIV protein L, starting with 50 ng of purified antigen. Anti-L antibodies 2E11B5 and 4D8C6 were used in a final concentration of 3.4 mr / hIE (170 ng / well), and were diluted in PBS 1X / 10% FBS.
  • the anti-mouse IgG detection antibody was added in a dilution of 1: 2,000 (0.5 ng ⁇ L per well) and incubated for 1 hour at room temperature (25 ° C), in the dark.
  • I know washes were performed and developed with 50 pL of citrate / tetramethylbenzidine buffer (TMB, 3-3 '-5- 5' tetramethylbenzidine, lmg / mL, Becton Dickinson).
  • TMB citrate / tetramethylbenzidine buffer
  • H2SO4 2N were added and the result was read in an ELISA reader, at 450nm.
  • the anti-L 2E11B5 antibody is capable of detecting up to 390 picograms (pg) of the recombinant PIV L-chimera protein (Figure 2A).
  • the anti-L antibody from the 4D8C6 hybridoma showed higher sensitivity than the anti-L 2E11B5 antibody ( Figure 2B), since it was able to detect up to 190 picograms of pure protein. Controls were included in all the tests that allowed to rule out nonspecific reactions of both the antibodies, which contained all components of the test except the sample (L PIV protein, data not shown in the graphs).
  • Example 5 Assay to determine the efficiency of monoclonal antibodies to detect viral antigens of PIV, by indirect ELISA.
  • the assay was performed to determine the maximum dilution of PIV anti-L monoclonal antibodies from 2E11B5 and 4D8C6 hybridomas, which allow detection of viral antigen.
  • An ELISA plate was activated with 50 ng of purified antigen (L protein) and then the plate was blocked for 2 hours at 37 ° C with PBS IX / 10% Fetal Bovine Serum (FBS).
  • the anti-L 2E11B5 and 4D8C6 antibodies were used in 1: 2 dilutions, starting from the working concentration (170 ng) up to the 11 dilution (0.15 ng) in PBS 1X / 10% FBS.
  • the anti-mouse IgG detection antibody was added in a dilution of 1: 2,000 (0.5 ng / pL per well) and it was incubated 1 hour at room temperature (25 ° C), in the dark. Finally, the washes were carried out and it was developed with 50 pL of citrate / Tetramethylbenzidine buffer (TMB, 3- 3 '-5-5' tetramethylbenzidine, lmg / mL, Becton Dickinson). To stop the reaction, 50 m ⁇ of H2SO4 2N were added and the result was read in an ELISA reader, at 450nm.
  • TMB citrate / Tetramethylbenzidine buffer
  • both anti-L antibodies (2E11B5 and 4D8C6) can detect 50 ng of the purified antigen with high efficiency, since detection of the antigen with high signal was observed in all the dilutions carried out.
  • the negative control included in this assay corresponds to a well that does not contain a sample (L protein), was blocked with PBS 1X / 10% FBS, primary antibody was added (anti-L 2E11B5 or anti-L 4D8C6) and also contains HRP-conjugated anti-mouse IgG antibody.
  • Example 6 Detection of PIV L protein in cells infected with PIV, using monoclonal anti-L PIV antibodies, by means of the Sandwich Luminex technique.
  • Luminex plates were activated with 50 magnetic microspheres by (internally marked with red or near-infrared fluorophore of different intensities) by mR, which were conjugated with the antibody secreted by the 2E11B5 hybridoma (anti-PIV), functioning as a capture antibody (at a final concentration of 2.5 mM).
  • the conjugated microspheres were incubated with 50 mR of uninfected and PIV-infected MDCK cell, for 2 hours at room temperature ( «23 ° C), with stirring at 400 rpm and in the dark (covered with aluminum foil).
  • As a negative control no sample was incubated in a well and as a positive control, 50 ng of L protein was used.
  • the complex consisting of microspheres conjugated with capture antibody plus antigen and detection antibody, is incubated with 50 mE of Streptavidin / Fi-coeritrin at a final concentration of 6 mr / ihE. Incubation is carried out for 30 minutes at room temperature, in the dark, shaking at 400 rpm. Finally, two more washing steps are carried out and the wells are incubated with 100 mE of the Sheat fluid reagent (reagent used by the Luminex team for the team to read the samples), shake for 5 minutes at 400 rpm, in the dark.
  • Sheat fluid reagent reagent used by the Luminex team for the team to read the samples
  • Example 7 Clinical diagnosis of samples from patients infected with PIV, using PIV anti-L monoclonal antibodies, using the sandwich ELISA technique.
  • a sandwich ELISA was performed, using the anti-L 2E11B5 antibody and the anti-L 4D8C6 as the detection antibody as capture antibody.
  • PIV anti-L 4D8C6 detection antibody was conjugated to HRP.
  • wells of an ELISA plate were activated with 3.4 mr / h ⁇ (170 ng / well) of the anti-L antibody from the PIV 2E11B5 hybridoma, diluted in PBS IX, for 1 hour at 37 ° C.
  • the plate was then washed 2 more times, developed with 50m] 0 of TMB solution and incubated for 15 minutes in the dark.
  • the reaction was stopped with 50 mB of H2SO4 2N and the plate was read at 450 nm in an ELISA reader (Epoch model), certified for clinical diagnosis.
  • Figure 5A The results obtained for this assay are shown in Figure 5A, where it can be seen that the sandwich ELISA technique using the antibody (anti-L) from the 2E11B5 hybridoma, as the capture antibody and the antibody from the 4D8C6-HRP hybridoma As a detection antibody, it allows the antigen to be detected in samples from patients infected with PIV (Figure 5A), which were previously confirmed by direct immunofluorescence in a certified clinical laboratory using the viral panel.
  • Figure 5A shows the results obtained with the anti-L antibodies to PIV, where 43 samples from patients diagnosed as positive PIV were used and as a control of specificity, 3 samples from patients positive for the Influenza virus were included. How Positive control included wells to which purified L-PIV protein was added.
  • Example 8 Clinical diagnosis of samples from patients infected with PIV, using PIV anti-L monoclonal antibodies, using the Sandwich-type Luminex technique.
  • Luminex plates were activated with 50 magnetic microspheres (internally marked with red or near-infrared fluorophore of different intensities) per mL, which were conjugated with the antibody secreted by the 2E11B5 hybridoma (anti-PIV), functioning as a capture antibody ( at a final concentration of 2.5 mM).
  • the conjugated microspheres were incubated with 50 mL of nasopharyngeal swab (HNF) samples from patients presenting with viral respiratory conditions, for 2 hours at room temperature ("23 ° C), shaking at 400 rpm and in the dark (covered with tissue paper). aluminum) .
  • HNF nasopharyngeal swab
  • Incubation is carried out for 1 hour at room temperature, in the dark, shaking at 400 rpm. 2 washes are again performed with 100 mL 0.05% PBS lX-Tween20 for 30 seconds using the manual magnetic scrubber.
  • the complex consisting of microspheres conjugated with capture antibody plus antigen and detection antibody, is incubated with 50 m] 0 of Streptavidin / Fi-coeritrin at a final concentration of 6 mr / pi. Incubation is carried out for 30 minutes at room temperature, in the dark, shaking at 400 rpm.
  • FIG. 5B shows the results obtained for this assay.
  • the Luminex technique like that obtained by the ELISA technique, using the antibody (anti-L) from the 2E11B5 hybridoma, as a Capture and the antibody from the 4D8C6-HRP hybridoma as a detection antibody, allows the antigen to be detected in samples from patients infected with PIV (Figure 5B) with high intensity, which were previously confirmed by direct immunofluorescence in a certified clinical laboratory using the panel viral.
  • Figure 5B shows the results obtained with the anti-L antibodies to PIV, where 38 samples from patients diagnosed as positive PIV and 8 healthy control samples were used. In addition, wells to which purified L-PIV protein was added were used as a positive control. The results show that anti-PIV antibodies are specific in detecting only positive patients. for PIV and not the control subjects. All samples detected as positive by Luminex are those showing an MFI above two standard deviations from the average MFI of healthy controls.
  • This assay demonstrates the versatility of antibodies from PIV 2E11B5 and 4D8C6 hybridomas, as they are capable of simultaneously binding to the antigen without competing for the binding site or interfere with each other and detect the low availability of the antigen in the nasopharyngeal swab sample.
  • protein L which is a chimera protein, could be detected, which was constructed in the laboratory from three conserved fragments of the three most prevalent serotypes of human PIV (1, 2 and 3). .
  • Example 9 Blind study for the detection of L-PIV antigen in clinical samples, obtained from patients carrying an infection, using monoclonal anti-L PIV antibodies, which are part of the multiple respiratory virus detection kit.
  • sandwich ELISA tests were performed where the previous diagnosis of the samples to be evaluated was known. Subsequent to these trials, a blind study was performed, where nearly 150 samples of nasopharyngeal swabs were evaluated, without knowing the microbiological diagnosis.
  • Sandwich ELISA were performed where anti-L 2E11B5 antibody and anti-L 4D8C6 were used as the capture antibody as HRP-conjugated detection antibody. For all the tests, wells of a plate were activated.
  • FIG. 5A The results are shown in figure 5A, where the ability of the antibodies to detect protein L in clinical samples is observed, since they were designed from a chimera protein. 5 out of 7 positive IVP patients were detected, and from these results it was possible to determine the diagnostic accuracy of the antibodies, which is shown in Table 1.
  • Table 1 The table shows the two concepts that define the diagnostic accuracy, where we have specificity, that is, the ability of antibodies to diagnose negative as negative samples, without detecting false positives, and on the other hand, we have sensitivity, that is, the ability of antibodies to diagnose as positive those samples that They really are, without diagnosing false negatives.
  • Example 10 Detection of L protein by indirect ELISA assay, using monoclonal antibodies secreted by biotin-conjugated 2E11B5 and 4D8C6 hybridomas.
  • ELISA plates were activated with 50 ⁇ m of 50 ng protein L and BSA. Specific sites blocked with 10% FBS diluted in PBS IX. 170 ng (3.4 pg / mL) of the Fab fragments of the antibodies secreted by the hybridomas 2E11B5 (anti-PIV) and 4D8C6 (anti-PIV), both previously conjugated biotin. Incubation of biotin-binding molecules (Streptavidin), which is conjugated with HRP (1: 2000 dilution, 75 ng per well) ( Figure 6, dark gray bar, 2E11B5 antibody and light gray bar, 4D8C6 antibody) .
  • Example 10 PIV antigen detection assay, using F (ab ') 2 fragments of the anti-L monoclonal antibodies to PIV by indirect ELISA assay.
  • the objective of this assay is to demonstrate the ability to detect fragments of anti-PIV antibodies, produced by hybridomas 2E11B5 and 4D8C6, by the protein chimera L.
  • fragmentation of the IgG molecule from each anti PIV antibody Fragmentation was performed using the "Thermo Scientific TM F (ab ') 2 Pierce TM Fragment Preparation Kits" kit (# 10381214, Thermo Scientific), which separates the F (ab') 2 fragment and Fe from the of interest, by using the enzyme pepsin that digests the Fe fragment and subsequently purification steps are performed to separate the F (ab ') 2 fragment from the digested Fe fragment.
  • F (ab ') 2 fraction was verified by the SDS-PAGE technique stained with coomassie blue.
  • F (ab ') 2 fractions were conjugated to biotin molecules using the Lightning-Link rapid biotin type A rapid conjugation kit (# 370-0010, Expedeon). Having all the reagents ready, the detection of the antigen was carried out using the indirect ELISA technique, where the ELISA plate was activated with 50 ng of purified L antigen for 1 hour at 37 ° C. Two negative controls were included, one without a sample and the other incubating the well with 50 ng of BSA protein.
  • the plate was washed twice with phosphate buffered saline (PBS) lX / Tween20 0.05%. The plate was then blocked for 2 hours at 37 ° C with PBS IX / 10% Fetal Bovine Serum (FBS). Subsequently, the washes were repeated and then each of the antibodies, unfractionated and biotin-conjugated F (ab ') 2 (2E11B5 and 4D8C6) fractions, were incubated at a final concentration of 3.4 pg / mL (170 ng per well ), diluted in 1X PBS / 10% FBS, for 1 hour at 37 ° C (each antibody on a separate plate).
  • PBS phosphate buffered saline
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • the washes were repeated and a biotin-binding protein (Streptavidin) labeled with the horseradish peroxidase enzyme (Horseradish peroxidase, HRP) in dilution 1 in 2000 (25 ng) was added to each well. / pL per well) in PBS 1X / FBS 10%, for 1 hour at room temperature (25 ° C), in the dark. Finally, the washes were performed and revealed with 50 pL of citrate / Tetramethylbenzidine buffer (TMB, 3-3 '-5-5' tetramethylbenzidine, lmg / mL, Becton Dickinson).
  • TMB citrate / Tetramethylbenzidine buffer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

La invención presenta la generación de anticuerpos monoclonales, o fragmentos de los mismos, que reconocen la proteína L del virus parainfluenza humano (PIV), donde dichos anticuerpos monoclonales o fragmentos de estos comprenden una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena liviana. Se proporciona además, un método de diagnóstico de infección por PIV en una muestra biológica, que utiliza los anticuerpos monoclonales en formato de kit de diagnóstico.

Description

ANTICUERPO MONOCLONAL O UNA PORCIÓN DE UNIÓN A ANTÍGENO DEL MISMO QUE SE UNE A LA PROTEÍNA L DEL VIRUS PARAINFLUENZA HUMANO (PIV); MÉTODO Y KIT PARA DETECTAR AL VIRUS PIV
MEMORIA DESCRIPTIVA Descripción de la invención
Se presentan anticuerpos monoclonales , o fragmentos de los mismos, que reconocen la proteina quimera L del virus parainfluenza humano (PIV), donde dichos anticuerpos monoclonales o fragmentos de estos comprenden una región variable de cadena ligera donde su CDR1 (CDRLCI) se define según la SEQ ID NO: 1, su CDR2 (CDRLC2) se define por la SEQ ID NO: 2 y su CDR3 (CDRLC3) corresponde a la SEQ ID NO: 3, y una región variable de la cadena pesada donde su CDR1 (CDRHCI) se define según la SEQ ID NO: 4, su CDR2(CDRHC2) corresponde a la SEQ ID
NO: 5 y su CDR3 (CDRHC3) corresponde a la SEQ ID NO: 6, o una región variable de cadena ligera donde su CDR1 (CDRLCI) se define según la SEQ ID NO: 7, su CDR2 (CDRLC2) se define por la SEQ ID NO: 8 y su CDR3 (CDRLC3) corresponde a la SEQ ID NO: 9, y una región variable de la cadena pesada donde su CDR1 (CDRHCI) se define según la SEQ ID NO: 10, su CDR2 (CDRHC2) corresponde a la SEQ ID NO: 11 y su CDR3 (CDRHCS) corresponde a la SEQ ID NO: 12. Donde dichos anticuerpos pueden ser utilizados como anticuerpo de detección y/o de captura. Se proporciona también un método de diagnóstico de infección por PIV en una muestra biológica que utiliza los anticuerpos monoclonales, y un kit de diagnóstico para detectar PIV, que comprenden al menos un anticuerpo monoclonal contra PIV de acuerdo a lo descrito previamente. Antecedentes de la invención
El virus parainfluenza humano produce una enfermedad infectocontagiosa de las vias respiratorias superiores que se manifiesta en diversos cuadros clínicos que van desde un resfriado común, hasta una neumonía. La laringotraqueobronquitis es la manifestación clínica más grave y frecuente.
Esta enfermedad es producida por un virus del tipo paramixovirus y se transmite con facilidad de persona a persona o a través de gotas o pequeñas partículas que han sido expulsadas a través de la tos o estornudos de una persona enferma, lo cual hace que su propagación sea rápida y forme parte de epidemias estacionales .
En Estados Unidos, el PIV es una de las principales causas de hospitalización por enfermedades respiratorias en niños pequeños, presentándose ente el 2 y 17% de los casos, lo que se traduce en 250.000 visitas a las salas de emergencia y 700.000 hospitalizaciones. Entre los menores de 5 años, 1,2 niños son hospitalizados por esta causa anualmente, siendo esta tasa mayor en los menores de 6 meses1. El PIV tiene un impacto más variable con respecto a los otros virus respiratorios, siendo el responsable del 3 al 10% de las hospitalizaciones con cuadros de bronquiolitis , neumonía y laringotraqueobronquitis. Al igual que el virus respiratorio sincicial (VRS), el PIV causa enfermedades graves los primeros seis meses de vida. La infección por PIV alcanza su pico entre los 4 y 12 años de edad2.
La infección causada por PIV, puede ser diagnosticada mediante el uso de métodos de detección directos, es decir por detección de anticuerpos directamente en la muestra o mediante pruebas serológicas que permiten medir la presencia de anticuerpo IgM o el aumento de los títulos de IgG. También se emplean ensayos con lineas celulares para el aislamiento de PIV en el laboratorio clínico .
1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5813689/
2 http://apps.who.mt/ms/bitstream/handle/10665/264249/PMC2486968.pdf?sequence=l&isAllowed=y En el caso del aislamiento del virus en cultivos celulares, éste corresponde a un método especifico y sensible, sin embargo presenta la desventaja que demora de entre 10-15 dias en conferir un resultado, siendo más bien una técnica de confirmación que de diagnóstico inicial por su lentitud. En el caso de las pruebas serológicas que permiten medir la presencia de anticuerpos IgM e IgG en el paciente, éstas son pruebas genéricas que no permiten determinar especif eamente la infección por virus PIV, ni determinar el tipo de PIV. Existen 4 tipos de PIV, tipo 1, 2, 3 y 4, siendo los de tipo 1 y 2 los que suelen aparecer de forma epidémica .
Adicionalmente, también se utilizan técnicas moleculares como la reacción de polimerasa en cadena (PCR) para detectar ciertos segmentos de ARN contenidos en el virus, a partir de una retrotranscripción del ARN a ADN complementario, utilizando este último como molde para realizar el PCR. En el documento US6015664A presenta un método para determinar la presencia o ausencia de infecciones virales múltiples en una muestra biológica por medio de un ensayo de PCR múltiplex. El método incluye partidores nucleotidicos junto con sondas para la detección de secuencias de ácido nucleico complementarias del virus parainfluenza humano 1, 2 y 3, virus sincicial respiratorio A y B y virus de la gripe, A y B.
En el documento CN102140550A se divulga un kit de RT-PCR para detectar el virus parainfluenza en un paso, donde el kit incluye partidores especificos para el virus parainfluenza. A.
Por su parte, el documento CN105441589A describe un kit de detección del virus parainfluenza tipo 1, 2, 3 y 4, por medio un PCR cuádruple. El kit de detección de PCR cuádruple comprende cebadores y sondas genéticas especificas del virus parainfluenza humano . Existen también diversos kits basados en inmunofluorescencia para la detección de diversos virus respiratorios, entre ellos parainfluenza. Por ejemplo, el kit D3 Ultra DFA (direct fluorescent antibody) permite la identificación cualitativa de diversos virus respiratorios: influenza A, influenza B, virus respiratorio sincicial, adenovirus, parainfluenza 1, parainfluenza 2 y parainfluenza 3.
En base a los antecedentes previos, se hace fundamental generar y contar con un método de detección eficaz, rápido y de bajo costo, para la detección del virus de parainfluenza que pueda competir con los métodos de diagnósticos utilizados actualmente. En este caso, el uso de anticuerpos monoclonales que detectan proteínas presentes en el virus, son considerados como una alternativa para mejorar la detección del virus de influenza.
Descripción de la invención
La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales específicos contra la proteina quimera L o fragmentos de ésta, del virus de parainfluenza humano, en adelante PIV. De forma particular, la invención corresponde a anticuerpos monoclonales, o fragmentos de los mismos, que reconocen la proteina quimera L del virus parainfluenza humano (PIV) secretaos por los hibridomas 2E11B5 y 4D8C6, donde dichos anticuerpos monoclonales o fragmentos de estos comprenden una región variable de cadena ligera donde su CDR1 (CDRLCI) se define según la SEQ ID NO: 1, su CDR2 ( CDRLC2 ) se define por la SEQ ID NO: 2 y su CDR3 (CDRLCS) corresponde a la SEQ ID NO: 3, y una región variable de la cadena pesada donde su CDR1 (CDRHCI) se define según la SEQ ID NO: 4, su CDR2 (CDRHC2 ) corresponde a la SEQ ID NO: 5 y su CDR3 (CDRHCS) corresponde a la SEQ ID NO: 6, o una región variable de cadena ligera donde su CDR1 (CDRLCI) se define según la SEQ ID NO: 7, su CDR2 ( CDRLC2 ) se define por la SEQ ID NO: 8 y su CDR3 (CDRLCS) corresponde a la SEQ ID NO: 9, y una región variable de la cadena pesada donde su CDR1 (CDRHCI) se define según la SEQ ID NO: 10, su CDR2 (CDRHC2 ) corresponde a la SEQ ID NO: 11 y su CDR3 (CDRHCS) corresponde a la SEQ ID NO: 12. Dichos anticuerpos pueden ser utilizados como anticuerpo de detección y/o de captura. Se proporciona también un método de diagnóstico de infección por PIV en una muestra biológica que utiliza los anticuerpos monoclonales , y un kit de diagnóstico para detectar PIV, que comprenden al menos un anticuerpo monoclonal contra PIV de acuerdo a lo descrito previamente.
Debido a que el antigeno no era completamente conservado, sino que partes de la secuencia eran las que se conservaban, se generó una nueva secuencia a partir de la unión de las partes conservadas. Por lo que, los anticuerpos reconocen una proteina quimera, particularmente la proteina quimera L del virus de la parainfluenza humana.
Los anticuerpos monoclonales específicos contra la proteina L o fragmentos de ésta presentan importantes características técnicas ventajosas y destacables con respecto a otros anticuerpos y métodos de detección de antigenos virales ya existentes. En primer lugar, cada virus tiene proteínas de superficie especificas, por tanto, otras técnicas de diagnóstico basadas en anticuerpos monoclonales para otros tipos de virus respiratorios no son comparables a la invención propuesta. La especificidad de detección de los anticuerpos contra la proteina L de PIV respecto de otros antigenos virales, por ejemplo contra la proteina PB2 del virus influenza, se demuestra en los resultados provistos en las figuras 1A y IB de la presente solicitud. A partir de estos resultados es posible concluir que los anticuerpos provistos en el alcance de la presente solicitud sólo reconocen a la proteina L de PIV, y que en ensayos de ELISA con antigenos del virus FLU no se observó señal de detección. En segundo lugar, los anticuerpos parte del alcance de la invención permiten detectar de forma especifica a la proteina L o fragmentos de ésta, de tal forma que no compiten entre si por el sitio de unión al antigeno, ni ejercen un impedimento para unirse simultáneamente a este. Adicionalmente, permiten detectar la proteina L o fragmentos de ésta con alta sensibilidad en muestras que contengan escasa cantidad de antigeno.
Los anticuerpos monoclonales propuestos son capaces de detectar a la proteina L, una proteina conservada. La estrategia de detección de una proteina viral conservada permite que los anticuerpos parte del alcance de la invención detecten diferentes tipos del virus parainfluenza humano, entre ellos, parainfluenza 1, 2, 3 y 4.
Cuando en la presente invención se hace referencia a secuencias CDR estas corresponden a secuencias cortas que se encuentran en los dominios variables de las proteínas que presentan función de detección de antigenos . Se presentan las secuencias CDR para la cadena pesada (CDRHC) y la cadena liviana (CDRi,c)de los anticuerpos secretados por los hibridomas 2E11B5 y 4D8C6.
Los anticuerpos monoclonales descritos pueden ser utilizados para ensayos de detección, diagnóstico y/o determinación de infección por PIV. Estos anticuerpos pueden ser utilizados simultáneamente para incrementar la sensibilidad de detección en muestras clínicas donde existe escasa cantidad y disponibilidad de antigeno. Al respecto, se proporciona también un método de diagnóstico de infección de PIV en una muestra biológica, el que comprende poner en contacto la muestra biológica con el anticuerpo monoclonal contra la proteina L de PIV o un fragmento de él de acuerdo a la reivindicación, y detectar la unión del anticuerpo con el antigeno. La muestra biológica puede corresponder, sin limitarse, a células in vitro infectadas con PIV, secreciones nasales, lavados nasales, liquido cefalorraquídeo, secreciones faríngeas y/o lavados o secreciones bronquiales. Como parte del método, el ensayo utilizado para la detección de la unión antigeno-anticuerpo se selecciona de ELISA, luminex, inmunofluorescencia, inmunohistoquimica, inmunocromatografla, citometria de flujo, cell sorter, inmunoprecipitación y/o Western blot .
La presente invención incluye también un kit de diagnóstico para detectar al virus de la influenza humana, el que comprende: un anticuerpo monoclonal contra la proteina L de PIV o un fragmento de la misma, donde dicho anticuerpo puede actuar como anticuerpo de captura o de detección, donde particularmente, el anticuerpo de detección se encuentra conjugado a un marcador para su detección; un soporte sólido al cual se adosa el anticuerpo; y reactivos para detectar el marcador incluido en el anticuerpo de detección, tales como fluoróforos, biotina, radioisótopos, metales y enzimas .
En la presente invención cuando se refiere a anticuerpo de captura, éste corresponde al anticuerpo que se une específicamente al antigeno. En el caso del anticuerpo de detección este corresponde al anticuerpo al cual se le conjuga un marcador para ser detectado por diferentes test tales como test inmunocromatográfico, luminex, citometria de flujo, inmunofluorescencia, radioinmunoanálisis , Western blot, Dot plot, ELISA, luminex, inmunodifusión o inmunoprecipitación.
Los anticuerpos parte de la presente invención pueden actuar de forma dual como anticuerpo de captura o como anticuerpo de detección cuando se acopla a marcador de detección. El marcador de detección estará conjugado al anticuerpo de detección, y éste puede corresponder, sin limitarse, a fluoróforos, biotina, radioisótopos, metales y enzimas. De forma preferente, el anticuerpo de detección se conjuga al sistema reportero basado en la detección de la actividad de la enzima peroxidasa de rábano picante (HRP, por sus siglas en inglés) .
Descripción de las figuras de la invención
Figura 1 : Detección de proteina quimera L de PIV por los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas 2E11B5 y 4D8C6, mediante un ensayo de ELISA indirecto. La placa fue activada con 50 ng de proteina L de PIV recombinante purificada, 50 ng de proteina PB2 de Flu (como control de especificidad) y 20 pg de Usado bacteriano de E. colí cepa BL21 sin plásmido (utilizadas como control de especificidad) y 3 clones (Cl, C2 y C3) de la misma cepa, en las cuales se sobre-expresó la proteina L. Se incluyeron pocilios control sin antigeno, con anticuerpo primario, con anti-IgG de ratón conjugado con HRP (sin activar) y pocilios sin antigeno ni anticuerpo primario, solo con anticuerpo anti-IgG de ratón (HRP) , datos no mostrados en el gráfico. Posteriormente, los pocilios se incubaron con los anticuerpos anti-L provenientes del hibridoma 2F11B1, en cantidad de 170 ng (A) y el hibridoma 4D8C6 en cantidad de 170 ng (B) . No se utilizó anticuerpo comercial contra la proteina L, ya que no se encuentra disponible ninguno en la actualidad, que puedan ser utilizados en la técnica de ELISA. Los datos mostrados en el gráfico expresan la absorbancia detectada a 450 nm, emitida por la conversión del sustrato Tetrametilbenzidina a un compuesto coloreado, catalizada por la enzima Horseradish peroxidase (HRP) presente en un anticuerpo secundario anti-IgG de ratón que se unió específicamente a los anticuerpos secretados por los hibridomas 2F11B1 y 4D8C6. Los valores corresponden al promedio +/- la desviación estándar de la absorbancia emitida por cada muestra en al menos dos experimentos independientes. * P<0,05 y ** P<0,01 por el test de student paramétrico comparando los resultados de la proteina PB2-Flu versus los de L-PIV, y por otro se utilizó el test de ANOVA de una via comparando Usado de E. colí BL21 sin plásmido versus Usado de E. colí BL21 que sobreexpresaban la proteina L. Las letras ns, significa que no se observa diferencia significativa.
Figura 2 : Determinación de sensibilidad de anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas 2E11B5 y 4D8C6 en la detección de la proteina L de PIV. Placas de ELISA se activaron con diluciones seriadas 1:2, iniciando con 50 ng de proteina L y finalizando con 0,04 ng. Posteriormente, los pocilios se incubaron con los anticuerpos anti-L provenientes del hibridoma 2E11B5, en cantidad de 170 ng (A) y el hibridoma 4D8C6 en cantidad de 170 ng (B) . Se incluyeron pocilios sin activar como control negativo. Los datos mostrados en el gráfico expresan la absorbancia a 450 nm emitida por la conversión del sustrato Tetrametilbenzidina a un compuesto coloreado catalizada por la enzima Horseradish peroxidase (HRP) presente en los anticuerpos anti-L provenientes de los hibridomas 2E11B5 y 4D8C6 en cantidad de 170 ng (A y B) . Los valores corresponden al promedio +/- la desviación estándar de la absorbancia emitida por cada muestra en al menos dos experimentos independientes. ** P<0,01 y *** P<0,001 por el test de student paramétrico comparando los resultados del pocilio denominado control (sin muestra) versus cada una de las diluciones de la proteina L.
Figura 3: Ensayo de diluciones seriadas de los anticuerpos monoclonales anti-L de Flu producidos por los hibridomas 2E11B5 y 4D8C6, para la detección de antigenos purificados de PIV. Se activaron placas de ELISA con 50 ng de proteina recombinante L de PIV y se detectó el antigeno con 11 diluciones seriadas 1:2 de los anticuerpos anti-L 2E11B5 (A) ó 4D8C6 (B) , partiendo desde una concentración de 3,4 mg/mL (170 ng por pocilio). Los datos se expresan como el promedio +/- la desviación estándar del valor de la absorbancia emitida a 450 nm de cada muestra en duplicado, en al menos dos experimentos independientes. * P<0,05; ** P<0,01 y *** p<o, ooi por el test de student paramétrico comparando los resultados del pocilio denominado control (sin anticuerpo 2E11B5 o 4D8C6) versus cada una de las diluciones de los anticuerpos.
Figura 4: Detección de proteina L de PIV, en células infectadas, por los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas 2E11B5 y 4D8C6, mediante un ensayo de Luminex. La placa fue activada con 50 ng de proteina L de PIV recombinante purificada, 20 pg de células MDCK no infectadas (utilizadas como control de especificidad) e infectadas con PIV. Se incluyó un pocilio control sin antigeno, con anticuerpo primario, con anti-IgG de ratón conjugado con HRP (NTC. Posteriormente, los pocilios se incubaron con los anticuerpos anti-L provenientes del hibridoma 2E11B5 (conjugados a la región 21 de PIV), en cantidad de 50 microesferas/mΐ , el cual fue utilizado como anticuerpo de captura y el hibridoma 4D8C6 a una concentración de 4 mr/hIE utilizado como anticuerpo de detección conjugado con biotina. Posteriormente, el complejo de anticuerpos y muestra fue incubado con Streptavidina/Ficoeritrina a una concentración de 6 mr/hΐΐ. Los datos mostrados en el gráfico expresan la intensidad media de fluorescencia (MFI, por sus siglas en inglés) . Se realizó el test de student no paramétrico comparando las células no infectadas versus las infectadas con PIV, y la proteina L recombinante versus el control negativo (**P<0,01 y **** p <0, 0001) .
Figura 5: Detección de PIV en muestras clínicas mediante ELISA en Sándwich y Luminex tipo Sándwich, utilizando la combinación de los anticuerpos monoclonales secretados por los hibridomas 2E11B5 y 4D8C6 para PIV. A) Placas de ELISA fueron activadas con 170 ng de anticuerpo secretado por el hibridoma 2E11B5 (anti- PIV) , funcionando como anticuerpo de captura. Los pocilios activados con los anticuerpos de captura para cada virus se incubaron con 50 mΐ de muestras de hisopado nasofaríngeo (HNF) de pacientes que presentaban cuadros respiratorios virales . Como controles negativos se analizaron 10 muestras de controles sanos. Se utilizaron 16 muestras de pacientes positivos para PIV y como control de especificidad, se incluyeron 3 muestras de pacientes positivos para el virus Influenza (Flu+) . Como control positivo se incluyeron pocilios a los que se añadió proteina L- PIV purificada. Para la detección de la proteina capturada por el anticuerpo 2E11B5, se utilizaron los anticuerpos producidos por el hibridoma 4D8C6, conjugados a la enzima Horseradish Peroxidase, en una dilución 1:2000 (1, 8 ng/ mΐ por pocilio) . B) Placas de Luminex fueron activadas con 50 microesferas magnéticas por mΐ, las cuales estaban conjugadas con el anticuerpo secretado por el hibridoma 2E11B5 (anti-PIV) , funcionando como anticuerpo de captura. Las microesferas conjugadas se incubaron con 50 mΐ de muestras de hisopado nasofaríngeo (HNF) de pacientes que presentaban cuadros respiratorios virales. Como controles negativos se analizaron 8 muestras de controles sanos. Se utilizaron 14 muestras de pacientes positivos para PIV y como control positivo se incluyeron pocilios a los que se añadió proteina L-PIV purificada. Para la detección de la proteina capturada por el anticuerpo 2E11B5, se utilizaron los anticuerpos producidos por el hibridoma 4D8C6, conjugados al fluoróforo biotina, a una concentración de 4 mg/mL. El complejo (microesferas conjugadas con anticuerpo de captura, antigeno y anticuerpo de detección) es incubado con Streptavidina/Ficoeritrina a una concentración de 6 mg/mL. Los datos muestran la mediana del valor de la absorbancia emitida a 450 nm (A) o de MFI (B) de cada muestra (**P<0,01 y **** p <0,0001; mediante el test de student no paramétrico comparando pacientes positivos de PIV versus controles sanos, y frente a los virus usados como control de especificidad) .
Figura 6: Detección de proteina L mediante ensayo de ELISA indirecto, utilizando los anticuerpos monoclonales secretados por los hibridomas 2E11B5 y 4D8C6 conjugados con biotina. En la figura se presenta un gráfico donde se expresan la absorbancia a 450 nm emitida por la conversión del sustrato
Tetrametilbenzidina a un compuesto coloreado catalizada por la enzima Horseradish peroxidase (HRP) . Las muestras en negro y blanco corresponden al ensayo realizado con fragmentos del anticuerpo secretados por los hibridomas 2E11B5 y 4D8C6 respectivamente, mientras que en gris se presentan los ensayos realizados con los anticuerpos monoclonales completos secretados por los hibridomas 2E11B5 y 4D8C6. Se muestra el promedio del valor de la absorbancia emitida a 450 nm de cada muestra (donde b es igual a p<0,0001 comparado con a y d es igual a p<0,0001 comparando con c; mediante la prueba de ANOVA de 2 vias comparando el pocilio sin muestra versus el pocilio con proteina con todos los anticuerpos) .
Ejemplos que permiten demostrar las distintas aplicaciones de los anticuerpos monoclonales de la invención. Ejemplo 1: Determinación de la secuencia nucleotidica que codifica las cadenas livianas (VL) y pesadas (VH) de la región variable del anticuerpo anti L PIV secretado por el hibridoma 2E11B5. El hibridoma 2E11B5 se creció en medio de cultivo DMEM-high glucose suplementado con 3,7 g/L de Bicarbonato de Sodio y 10% de suero fetal bovino, a 37° C con 10% CO2, hasta una densidad celular de 700.000 células/mL. Se obtuvo el RNA total de 3,5 xlO6 células, realizando un tratamiento con el compuesto Trizol (Invitrogen) . Se utilizó 0,5 mg de RNA para generar el cDNA mediante reacción de retrotranscripción con el kit PrimeScriptTM lst Strand cDNA Synthesis, el cual utiliza partidores universales específicos del isotipo. La cadena liviana y pesada del anticuerpo se amplificaron de acuerdo con el procedimiento operativo estándar (SOP) de amplificación rápida de los extremos de cDNA (RACE) de GenScript. Los fragmentos de anticuerpo amplificados se clonaron por separado en un vector de clonación estándar. Se realizó una PCR de colonias para identificar clones que tuvieran insertos con el tamaño correcto. Al menos cinco colonias con insertos de tamaños correctos se secuenciaron por cada fragmento. Se alinearon las secuencias de diferentes clones y se proporcionó la secuencia de consenso de estos clones . Las secuencias nucleotidicas de las cadenas pesada y liviana de los anticuerpos secretados por el hibridoma 2E11B5 corresponden a las identificadas como SEQ ID NO. 1; SEQ ID NO .2 respectivamente.
Ejemplo 2 : Determinación de la secuencia nucleotidica que codifica las cadenas livianas (VL) y pesadas (VH) de la región variable del anticuerpo anti L PIV secretado por el hibridoma 4D8C6.
El hibridoma 4D8C6 se creció en medio de cultivo DMEM-high glucose suplementado con 3,7 g/L de Bicarbonato de Sodio y 10% de suero fetal bovino, a 37° C con 10% CO2, hasta una densidad celular de 700.000 células/mL. Se obtuvo el RNA total de 3,5 xlO6 células, realizando un tratamiento con el compuesto Trizol (Invitrogen) . Se utilizó 0,5 pg de RNA para generar el cDNA mediante reacción de retrotranscripción con el kit PrimeScriptTM lst Strand cDNA Synthesis, el cual utiliza partidores universales específicos del isotipo. La cadena liviana y pesada del anticuerpo se amplificaron de acuerdo con el procedimiento operativo estándar (SOP) de amplificación rápida de los extremos de cDNA (RACE) de GenScript. Los fragmentos de anticuerpo amplificados se clonaron por separado en un vector de clonación estándar. Se realizó una PCR de colonias para identificar clones que tuvieran insertos con el tamaño correcto. Al menos cinco colonias con insertos de tamaños correctos se secuenciaron por cada fragmento. Se alinearon las secuencias de diferentes clones y se proporcionó la secuencia de consenso de estos clones . Las secuencias nucleotidicas de las cadenas pesada y liviana de los anticuerpos secretados por el hibridoma 4D8C6 corresponden a las identificadas como SEQ ID NO. 3; SEQ ID NO .4 respectivamente.
Ejemplo 3: Ensayo de detección de antigenos de PIV, determinación de especificidad de los anticuerpos monoclonales anti-L de PIV para antigenos purificados de PIV mediante ensayo de ELISA indirecto.
Este ensayo tiene como objetivo demostrar la especificidad por la proteina L de PIV de los anticuerpos producidos por los hibridomas 2E11B5 y 4D8C6. La detección del antigeno se llevó a cabo mediante la técnica de ELISA indirecto, donde la placa de ELISA se activó con 50 ng de antigeno purificado por 1 hora a 37°C. De igual manera se activó la placa con 20 pg de Usado bacteriano de E. colí cepa BL21 sin plásmido (utilizadas como control de especificidad) y 3 clones (Cl, C2 y C3) de la misma cepa, en las cuales se sobre-expresó la proteina L. Otro control negativo incluido fue 50 ng de proteina PB2 de Flu en un pocilio independiente. Posteriormente, la placa se lavó dos veces con buffer fosfato salino (PBS) lX/Tween20 0,05%. Luego la placa se bloqueó por 2 horas a 37°C con PBS IX/ Suero Fetal Bovino (FBS) 10%. Posteriormente se repitieron los lavados y a continuación se incubaron cada uno de los anticuerpos (2E11B5 y 4D8C6) a una concentración final de 3,4 pg/mL (170 ng por pocilio), diluidos en PBS 1X/FBS 10%, por 1 hora a 37°C (cada anticuerpo en una placa independiente). Transcurrido el tiempo de incubación, se repitieron los lavados y se agregó a cada uno de los pocilios un anticuerpo secundario anti-IgG de ratón marcado con la enzima peroxidasa de rábano (Horseradish peroxidase, HRP) en dilución 1 en 2000 (0,5 ng/mΐ por pocilio) en PBS 1X/FBS 10%, por 1 hora a temperatura ambiente ( 25°C) , en oscuridad. Finalmente, se realizaron los lavados y se reveló con 50 pL de buffer citrato/Tetrametilbenzidina (TMB, 3-3' -5- 5 ' tetramethylbenzidine , lmg/mL, Becton Dickinson) . Para detener la reacción se adicionaron 50 pL de H2SO4 2N y el resultado se leyó en un lector de ELISA, a 450nm. Para determinar que la reacción del anticuerpo secundario era especifica en reconocer al anticuerpo primario y además que la señal obtenida no sea provocada por unión inespecifica del anticuerpo secundario al antigeno viral, se realizaron controles en los cuales se utilizó solamente el anticuerpo secundario sin anticuerpo primario ni muestra (pocilio sin activar) . Otro control para determinar que la reacción del anticuerpo primario es especifica para el antigeno, consistió en el uso de los anticuerpos sobre una placa de ELISA que no ha sido activada con el antigeno (sin antigeno) o usando los anticuerpos sobre una placa de ELISA que poseía 50 ng de la proteina PB2 de Flu ó Usado de E. colí cepa BL21 sin plásmido . Los resultados muestran que los anticuerpos monoclonales de la invención son capaces de reconocer 50 ng de antigeno purificado, de manera especifica, ya que no reconocen la proteina PB2 de Flu, ni proteínas de lisado bacteriano con alta señal (Figura 1A y IB) , como se observa en el caso de los 3 clones que sobreexpresan la proteína L. No se utilizó un anticuerpo comercial para comparar, porque en el comercio no existen anticuerpos anti-L de Parainfluenza, la gran mayoría comercializados han sido realizados y contra la fosfoproteína (P), la nucleoproteína (NP) ó la Hemaglutinina- Neuraminidasa ( HN) . Se encontró un estudio, donde Machiko Nishio y colaboradores (2000 y 2011), en el cual se generaron anticuerpos anti-L de Parainfluenza. Estos anticuerpos sólo son dirigidos contra un serotipo de PIV, serotipo 2 y no para los 3 serotipos más prevalente en enfermedades respiratorias (PIV 1, 2 y 3), como es el caso de estos anticuerpos. Por otro lado, los anticuerpos anti-L publicados no han sido comercializados hasta el momento. Todos los controles negativos utilizados entregaron resultados esperados (datos no mostrados en la figuras).
Ejemplo 4 : Ensayo para determinar la sensibilidad de los anticuerpos monoclonales para la detección de antigenos virales anti-L de PIV.
El ensayo se realizó para determinar la máxima dilución de proteína que los anticuerpos monoclonales anti-L de PIV provenientes de los hibridomas 2E11B5 y 4D8C6 son capaces de detectar mediante ELISA indirecto. Para esto, se ocupó la misma técnica descrita en el ejemplo 3. Se activó la placa con 11 diluciones seriadas 1:2 de proteína L de PIV, partiendo con 50 ng de antígeno purificado. Los anticuerpos anti-L 2E11B5 y 4D8C6, se utilizaron en una concentración final de 3,4 mr/hIE (170 ng/pocillo), y fueron diluidos en PBS 1X/FBS 10%. Posteriormente se adicionó el anticuerpo de detección anti-IgG de ratón en una dilución de 1:2.000 (0,5 ng^L por pocilio) y se incubo 1 hora a tempertura ambiente ( 25°C) , en oscuridad. Finalmente, se realizaron los lavados y se reveló con 50 pL de buffer citrato/Tetrametilbenzidina (TMB, 3-3' -5- 5 ' tetramethylbenzidine , lmg/mL, Becton Dickinson) . Para detener la reacción se adicionaron 50pL de H2SO4 2N y el resultado se leyó en un lector de ELISA, a 450nm. Los resultados mostraron que el anticuerpo anti-L 2E11B5 es capaz de detectar hasta 390 picogramos (pg) de la proteina recombinante quimera L de PIV (Figura 2A) . El anticuerpo anti-L proveniente del hibridoma 4D8C6, mostró mayor sensibilidad, que el anticuerpo anti-L 2E11B5 (Figura 2B) , ya que fue capaz de detectar hasta 190 picogramos de proteina pura. Se incluyeron en todos los ensayos controles que permitieran descartar reacciones inespecificas tanto de los anticuerpos, los cuales contenían todos componentes del ensayo exceptuando la muestra (proteina L PIV, datos no mostrados en los gráficos).
Ejemplo 5: Ensayo para determinar la eficiencia de los anticuerpos monoclonales para detectar antigenos virales de PIV, mediante ELISA indirecto.
El ensayo se realizó para determinar la máxima dilución de los anticuerpos monoclonales anti-L de PIV provenientes de los hibridomas 2E11B5 y 4D8C6, que permiten la detección del antigeno viral. Se activó una placa ELISA con 50 ng de antigeno purificado (proteina L) y luego la placa fue bloqueada por 2 horas a 37 °C con PBS IX/ Suero Fetal Bovino (FBS) 10%. Los anticuerpos anti- L 2E11B5 y 4D8C6 se utilizaron en diluciones 1:2, partiendo de la concentración de trabajo (170 ng) hasta la dilución 11 (0,15 ng) en PBS 1X/FBS 10%. Posteriormente se adicionó el anticuerpo de detección anti-IgG de ratón en una dilución de 1:2.000 (0,5 ng/pL por pocilio) se incubo 1 hora a temperatura ambiente ( 25°C) , en oscuridad. Finalmente, se realizaron los lavados y se reveló con 50 pL de buffer citrato/Tetrametilbenzidina (TMB, 3- 3' -5-5' tetramethylbenzidine, lmg/mL, Becton Dickinson) . Para detener la reacción se adicionaron 50 mΐ de H2SO4 2N y el resultado se leyó en un lector de ELISA, a 450nm. En la figura 3 (A y B) se observa que ambos anticuerpos anti-L (2E11B5 y 4D8C6) pueden detectar 50 ng del antigeno purificado con alta eficiencia, ya que en todas las diluciones realizadas se observó detección del antigeno con alta señal. El control negativo incluido en este ensayo, corresponde a un pocilio que no contiene muestra (proteina L) , fue bloqueado con PBS 1X/FBS 10%, se le adicionó anticuerpo primario (anti-L 2E11B5 ó anti-L 4D8C6) y contiene además anticuerpo anti-IgG de ratón conjugado con HRP .
Ejemplo 6: Detección de proteina L de PIV en células infectadas con PIV, utilizando anticuerpos monoclonales anti-L de PIV, mediante la técnica de Luminex tipo Sándwich.
Al igual que en muestras de pacientes, la disponibilidad y la concentración de las proteínas viral generalmente es muy escasa en células infectadas, por lo que se quiso evaluar la detección del antigeno de interés en células infectadas con PIV (figura 4) . Para este ensayo se realizó un ensayo de luminex tipo Sandiwch, usando como anticuerpo de captura el anticuerpo anti- L 2E11B5 y el anti-L 4D8C6 como anticuerpo de detección. El anticuerpo de detección anti-L 4D8C6 de PIV, se conjugó con el fluorósforo biotina. Placas de Luminex fueron activadas con 50 microesferas magnéticas por (marcadas internamente con fluoróforo rojo o cercano al infrarrojo de diferentes intensidades) por mR, las cuales estaban conjugadas con el anticuerpo secretado por el hibridoma 2E11B5 (anti-PIV) , funcionando como anticuerpo de captura (a una concentración final de 2,5 mM) . Las microesferas conjugadas se incubaron con 50 mR de célula MDCK no infectadas e infectadas con PIV, durante 2 horas a temperatura ambiente (« 23 °C) , en agitación a 400 rpm y en oscuridad (tapados con papel de aluminio) . Como control negativo no se incubó muestra en un pocilio y como control positivo se utilizó 50 ng de proteina L. Pasada las 2 horas, se realizan 2 lavados con 100 m]0 PBS lX-Tween20 al 0,05% durante 30 segundos utilizando el lavador magnético manual. Para la detección de la proteina capturada por el anticuerpo 2E11B5, se utilizaron los anticuerpos producidos por el hibridoma 4D8C6, conjugados al fluoróforo biotina, a una concentración de 4 mg/mL diluidos en PBS 1X-BSA 1%, incubándose los pocilios con 50 m]0. La incubación se realiza durante 1 hora a temperatura ambiente, en oscuridad, agitando a 400 rpm. Se realizan nuevamente 2 lavados con 100 mB PBS lX-Tween20 al 0,05% durante 30 segundos utilizando el lavador magnético manual. El complejo formado por microesferas conjugadas con anticuerpo de captura más antigeno y anticuerpo de detección, es incubado con 50 mE de Streptavidina/Fi-coeritrina a una concentración final de 6 mr/ihE. La incubación se realiza durante 30 minutos a temperatura ambiente, en oscuridad, agitando a 400 rpm. Finalmente, se realizan dos pasos de lavados más y se incuban los pocilios con 100 mE del reactivo Sheat fluid (reactivo utilizado por equipo Luminex para que el equipo lea las muestras), agitar 5 minutos a 400 rpm, en oscuridad. Los resultados de la intensidad media de fluorescencia (MFI, por sus siglas en inglés) son entonces lerdos en el equipo Luminex 200, el cual a través de un láser color rojo (621 nm) , detecta la región de reconocimiento de la microesfera y el láser de color verde (511 nm) detecta la unión del anticuerpo de detección al analito .
Los resultados obtenidos para este ensayo se muestran en la figura 4 , donde se puede observar que por la técnica de Luminex, utilizando el anticuerpo (anti-L) proveniente del hibridoma 2E11B5, como anticuerpo de captura y el anticuerpo proveniente del hibridoma 4D8C6-HRP como anticuerpo de detección, permite detectar el antígeno en células infectadas con PIV (Figura 4), sin detectar inespecíficamente antígenos de las células no infectadas, es decir los anticuerpos son capaces de discriminar entre muestras infectadas y no infectadas . Todas las muestras de células infectadas detectadas como positivas por Luminex son aquellas que muestran un MFI por encima de dos desviaciones estándar del promedio de MFI de las células no infectadas. Las células infectadas y no infectadas se procesaron igual que las muestras clínica mostradas en el ejemplo 7.
Ejemplo 7: Diagnóstico clínico de muestras de pacientes infectados con PIV, utilizando anticuerpos monoclonales anti-L de PIV, mediante la técnica de ELISA en Sándwich.
La disponibilidad y la concentración de las proteínas viral generalmente es muy escasa en muestras clínicas de hisopados nasofaríngeos, por lo que fue necesario modificar el ensayo de ELISA indirecto que se realizó previamente. Para este ensayo se realizó un ELISA en Sándwich, usando como anticuerpo de captura el anticuerpo anti-L 2E11B5 y el anti-L 4D8C6 como anticuerpo de detección. El anticuerpo de detección anti-L 4D8C6 de PIV, se conjugó con HRP. Para el ensayo se activaron pocilios de una placa de ELISA con 3,4 mr/hΐΐ (170 ng/pocillo) del anticuerpo anti-L proveniente del hibridoma 2E11B5 de PIV, diluido en PBS IX, durante 1 hora a 37°C. Se realizaron 2 lavados con PBS IX- Tween20 al 0,05% y posteriormente se bloqueó la placa con 200 mB de PBS 1X/FBS al 10% durante 1 hora a 37 °C. Se lavó nuevamente y se incubó durante 1 hora a 37°C cada pocilio con 50 mE de hisopados nasofaríngeos de pacientes positivos para PIV de acuerdo al método de diagnóstico "D3 Ultra DFA Respiratory Virus Screening and ID Kit de DHI (Diagnostics Hibryds ) USA", denominado de manera rutinaria como "panel viral", y que fueron tratadas como se describe posteriormente. Como controles se incluyeron: 1) control de especificidad: se utilizaron 50 m]I de muestra de pacientes diagnosticados con Flu mediante el panel viral para los anticuerpos anti-PIV; 2) control positivo: 50 ng de proteina L-PIV recombinante; 3) Control negativo: correspondiente a muestras de controles sanos. Posteriormente, se realizaron los 2 lavados correspondientes con PBS ÍX-Tween20 0,05% y cada pocilio se incubó por 1 hora a temperatura ambiente ( 25°C, en oscuridad) con 50 mΐ del anticuerpo anti-L proveniente del hibridoma 4D8C6, conjugado con HRP (1,8 ng/mR de concentración final) . A continuación, se lavó la placa 2 veces más, se reveló con 50 m]0 de solución TMB y se incubó durante 15 minutos en oscuridad. La reacción se detuvo con 50 mB de H2SO4 2N y la lectura de la placa se realizó a 450 nm en un lector de ELISA (modelo Epoch) , certificado para diagnóstico clínico.
Los resultados obtenidos para este ensayo se muestran en la figura 5A, donde se puede observar que la técnica de ELISA en Sándwich utilizando el anticuerpo (anti-L) proveniente del hibridoma 2E11B5, como anticuerpo de captura y el anticuerpo proveniente del hibridoma 4D8C6-HRP como anticuerpo de detección, permite detectar el antigeno en muestras de pacientes infectados con PIV (Figura 5A) , los cuales fueron previamente confirmados por Inmunofluorescencia directa en un laboratorio clínico certificado utilizando el panel viral. La figura 5A, muestra los resultados obtenidos con los anticuerpos anti-L de PIV, donde se utilizaron 43 muestras de pacientes diagnosticados como PIV positivo y como control de especificidad, se incluyeron 3 muestras de pacientes positivos para el virus Influenza. Como control positivo se incluyeron pocilios a los que se añadió proteína L-PIV purificada. Como control negativo se utilizaron 10 controles sanos. Los resultados muestran que los anticuerpos anti-PIV son específicos en detectar sólo los pacientes positivos para PIV y no los controles sanos o aquellos infectados con otro virus (Flu). Todas las muestras detectadas positivas por ELISA son aquellas que muestran una densidad óptica (OD) por encima de 0,1. Tratamiento de muestras clínicas. Las muestras que se utilizaron para los ensayos fueron obtenidas a partir de hisopados nasofarígeos contenidos en medio de transporte universal (UTM) . Se centrifugaron las muestras a 14.000 rpm durante 4 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente se separó el sobrenadante (SN1) del pellet; este último fue incubado con 100 mR de Buffer
RIPA (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5%
Deoxicolato de Sodio, 0,1%, SDS y un coctel de inhibidores de proteasas IX) durante 15 minutos a 4°C, agitando por vortex cada 5 minutos. A continuación se centrifugó a 14.000 rpm durante 4 minutos a temperatura ambiente. Al finalizar se tomó el sobrenadante obtenido (SN2) y se mezcló con el SN1, se realizó vortex .
Ejemplo 8: Diagnóstico clínico de muestras de pacientes infectados con PIV, utilizando anticuerpos monoclonales anti-L de PIV, mediante la técnica de Luminex tipo en Sándwich.
Al igual que en la técnica de ELISA, la disponibilidad y la concentración de las proteínas viral generalmente es muy escasa en muestras clínicas de hisopados nasofaríngeos, por lo que se quiso evaluar por otra técnica más sensible lo obtenido en los resultados por la técnica de ELISA (figura 5A) . Para este ensayo se realizó un ensayo de luminex tipo Sandiwch, usando como anticuerpo de captura el anticuerpo anti-L 2E11B5 como anticuerpo de captura y el anti-L 4D8C6 como anticuerpo de detección. El anticuerpo de detección anti-L 4D8C6 de PIV, se conjugó con el fluorósforo biotina. Placas de Luminex fueron activadas con 50 microesferas magnéticas (marcadas internamente con fluoróforo rojo o cercano al infrarrojo de diferentes intensidades) por mL, las cuales estaban conjugadas con el anticuerpo secretado por el hibridoma 2E11B5 (anti-PIV) , funcionando como anticuerpo de captura (a una concentración final de 2,5 mM) . Las microesferas conjugadas se incubaron con 50 mL de muestras de hisopado nasofaríngeo (HNF) de pacientes que presentaban cuadros respiratorios virales, durante 2 horas a temperatura ambiente (« 23 °C) , en agitación a 400 rpm y en oscuridad (tapados con papel de aluminio) . Como controles negativos se analizaron 8 muestras de controles sanos . Se utilizaron 14 muestras de pacientes positivos para PIV (de acuerdo al método de diagnóstico "D3 Ultra DFA Respiratory Virus Screening and ID Kit de DHI (Diagnostics Hibryds ) USA", denominado de manera rutinaria como "panel viral", las cuales se trataron de la misma manera mencionada anteriormente, y como control positivo se incluyeron pocilios a los que se añadió proteina L-PIV purificada (50 ng) . Pasada las 2 horas, se realizan 2 lavados con 100 mE PBS lX-Tween20 al 0,05% durante 30 segundos utilizando el lavador magnético manual. Para la detección de la proteina capturada por el anticuerpo 2E11B5, se utilizaron los anticuerpos producidos por el hibridoma 4D8C6, conjugados al fluoróforo biotina, a una concentración de 4 mg/mL diluidos en PBS 1X-BSA 1%, incubándose los pocilios con 50 mE . La incubación se realiza durante 1 hora a temperatura ambiente, en oscuridad, agitando a 400 rpm. Se realizan nuevamente 2 lavados con 100 mL PBS lX-Tween20 al 0,05% durante 30 segundos utilizando el lavador magnético manual. El complejo formado por microesferas conjugadas con anticuerpo de captura más antigeno y anticuerpo de detección, es incubado con 50 m]0 de Streptavidina/Fi-coeritrina a una concentración final de 6 mr/pi . La incubación se realiza durante 30 minutos a temperatura ambiente, en oscuridad, agitando a 400 rpm. Finalmente, se realizan dos pasos de lavados más y se incuban los pocilios con 100 mE del reactivo Sheat fluid (reactivo utilizado por equipo Luminex para que el equipo lea las muestras), agitar 5 minutos a 400 rpm, en oscuridad. Los resultados de la intensidad media de fluorescencia (MFI, por sus siglas en inglés) son entonces lerdos en el equipo Luminex 200, el cual a través de un láser color rojo (621 nm) , detecta la región de reconocimiento de la microesfera y el láser de color verde (511 nm) detecta la unión del anticuerpo de detección al analito .
Los resultados obtenidos para este ensayo se muestran en la figura 5B, donde se puede observar que la técnica de Luminex, al igual que lo obtenido por la técnica de ELISA, utilizando el anticuerpo (anti-L) proveniente del hibridoma 2E11B5, como anticuerpo de captura y el anticuerpo proveniente del hibridoma 4D8C6-HRP como anticuerpo de detección, permite detectar el antigeno en muestras de pacientes infectados con PIV (Figura 5B) con alta intensidad, los cuales fueron previamente confirmados por Inmunofluorescencia directa en un laboratorio clínico certificado utilizando el panel viral. La figura 5B, muestra los resultados obtenidos con los anticuerpos anti-L de PIV, donde se utilizaron 38 muestras de pacientes diagnosticados como PIV positivo y 8 muestras controles sanos. Además, se utilizó como control positivo pocilios a los que se añadió proteina L-PIV purificada. Los resultados muestran que los anticuerpos anti- PIV son específicos en detectar sólo los pacientes positivos para PIV y no los sujetos controles. Todas las muestras detectadas como positivas por Luminex son aquellas que muestran un MFI por encima de dos desviaciones estándar del promedio de MFI de los controles sanos.
Este ensayo, al igual que en el ensayo de ELISA con muestras de pacientes, demuestra la versatilidad que presentan los anticuerpos provenientes de los hibridomas 2E11B5 y 4D8C6 de PIV, ya que son capases de unirse simultáneamente al antigeno sin competir por el sitio de unión o interferir entre si y detectar la poca disponibilidad del antigeno en la muestra de hisopado nasofaríngeo. Lo más interesante en estos resultados es que se pudo detectar la proteina L, que es una proteina quimera, la cual se construyó en el laboratorio a partir de tres fragmentos conservados de los tres serotipos más prevalente de PIV humano (1, 2 y 3) .
Ejemplo 9: Estudio ciego para la detección del antigeno L-PIV en muestras clínicas, obtenidas de pacientes cursando una infección, utilizando anticuerpos monoclonales anti-L de PIV, los cuales forman parte del kit de detección múltiple de virus respiratorios . Previamente se realizaron ensayos de ELISA en Sándwich donde se conocía el diagnóstico previo de las muestras a evaluar. Posterior a estos ensayos, se realizó un estudio ciego, donde se evaluaron cerca de 150 muestras de hisopados nasofaríngeos, sin conocer el diagnóstico microbiológico . Para todos los ensayos del estudio ciego, se realizaron ELISA en Sándwich donde se utilizó como anticuerpo de captura el anticuerpo anti-L 2E11B5 y el anti-L 4D8C6 como anticuerpo de detección conjugado con HRP . Para todos los ensayo se activaron pocilios de una placa de ELISA con 3,4 mg/mL (170 ng/pocillo) del anticuerpo anti-L proveniente del hibridoma 2E11B5 de PIV, diluido en PBS IX, durante 30 minutos a 37°C. Se realizaron 2 lavados con PBS IX- Tween20 al 0,05% y posteriormente se bloqueó la placa con 200 mE de PBS 1X/FBS al 10% durante 30 min a 37°C. Se lavó nuevamente y se incubó durante 1 hora a 37°C cada pocilio con 50 mE de hisopados nasofaríngeos de pacientes, los cuales se evaluaron en paralelo por el método de diagnóstico estándar (PCR), denominado de manera rutinaria como "panel viral", y que fueron tratadas como se describe previamente en el ejemplo 6. Como controles se incluyeron: 1) control de especificidad: se utilizaron 50 mE de la proteina BSA (50 ng) ; 2) control positivo: 50 ng de proteina L-PIV recombinante; 3) Controles negativos: pocilios sin muestra y pocilios bloqueados e incubados con anticuerpo de detección. Posteriormente, se realizaron los 2 lavados correspondientes con PBS lX-Tween20 0,05% y cada pocilio se incubó por 30 min a temperatura ambiente ( 25°C, en oscuridad) con 50 mE del anticuerpo anti-L proveniente del hibridoma 4D8C6, conjugado con HRP (1,8 ng/mE de concentración final) . A continuación, se lavó la placa 2 veces más, se reveló con 50 mΐ de solución TMB y se incubó durante 15 minutos en oscuridad. La reacción se detuvo con 50 mL de H2SO4 2N y la lectura de la placa se realizó a 450 nm en un lector de ELISA (modelo Epoch) , certificado para diagnóstico clinico.
Los resultados se muestran en la figura 5A, donde se observa la capacidad de los anticuerpos de detectar la proteina L en muestras clinicas, siendo que fueron diseñados a partir de una proteina quimera. Se detectaron 5 de 7 pacientes PIV positivos, y a partir de estos resultados se pudo determinar la exactitud diagnóstica de los anticuerpos, la cual se muestra en la tabla 1. En la tabla se observan los dos conceptos que definen a la exactitud diagnóstica, donde tenemos la especificidad, es decir la capacidad de los anticuerpos de diagnosticar muestras negativas como negativas, sin detectar falsos positivos, y por otro lado, tenemos la sensibilidad, es decir la capacidad de los anticuerpos de diagnosticar como positivas aquellas muestras que realmente lo son, sin diagnosticar falsos negativos. Los resultados expuestos en la tabla muestran un alto porcentaje de especificidad (100%) de los anticuerpos frente a la técnica estándar (PCR) y un bajo porcentaje de sensibilidad (71%), la cual a su vez es alta teniendo en cuenta que los anticuerpos se diseñaron contra una proteina quimérica y no contra la proteina completa que expresa el virus, ya que ésta en su totalidad no es conservada . Tabla 1. Exactitud diagnóstica de los anticuerpos anti-L-PIV
Figure imgf000028_0001
Ejemplo 10: Detección de proteina L mediante ensayo de ELISA indirecto, utilizando los anticuerpos monoclonales secretados por los hibridomas 2E11B5 y 4D8C6 conjugados con biotina.
En este ejemplo de aplicación se demuestra que el anticuerpo monoclonal especifico contra la proteina PB2 puede ser detectado mediante ELISA indirecto.
Para la detección de la proteina L, placas de ELISA se activaron con 50 mΐ de de 50 ng de proteina L y BSA. Los sitios específicos se bloquearon con FBS al 10% diluido en PBS IX. 170 ng (3,4 pg/mL) de los fragmentos Fab de los anticuerpos secretados por los hibridoma 2E11B5 (anti-PIV) y 4D8C6 (anti-PIV) , ambos previamente conjugados biotina. Incubación de moléculas de unión a biotina (Estreptavidina) , la cual está conjugada con HRP (dilución 1:2000, 75 ng por pocilio) (figura 6, barra de color gris oscuro, anticuerpo 2E11B5 y barra de color gris claro, anticuerpo 4D8C6) . Ejemplo 10: Ensayo de detección de antigenos de PIV, utilizando fragmentos F(ab')2 de los anticuerpos monoclonales anti-L de PIV mediante ensayo de ELISA indirecto.
Este ensayo tiene como objetivo demostrar la capacidad de detección de fragmentos de los anticuerpos anti-PIV, producidos por los hibridomas 2E11B5 y 4D8C6, por la proteina quimera L. Previamente al ensayo de ELISA indirecto, se realizó la fragmentación de la molécula de IgG de cada anticuerpo anti PIV. La fragmentación se realizó utilizando el kit "Thermo Scientific™ Kits de preparación de fragmentos F(ab')2 Pierce™" (#10381214, Thermo Scientific), el cual separa el fragmento F(ab')2 y el Fe del anticuerpo de interés, mediante el uso de la enzima pepsina que digiere el fragmento Fe y posteriormente se realizan pasos de purificación para separar el fragmento F(ab')2 del fragmento Fe digerido. Posterior a la fragmentación del anticuerpo, la fracción F(ab')2 purificada fue comprobada por la técnica de SDS-PAGE teñido con azul de coomassie. Fracciones F(ab')2 fueron conjugadas con moléculas de biotina utilizando el kit de conjugación rápida, Lightning-Link rapid biotin type A (#370-0010, Expedeon) . Teniendo todos los reactivos listos, se llevó a cabo la detección del antigeno mediante la técnica de ELISA indirecto, donde la placa de ELISA se activó con 50 ng de antigeno L purificado por 1 hora a 37 °C. Se incluyeron dos controles negativos, uno sin muestra y otro incubando el pocilio con 50 ng de proteina BSA. Posteriormente, la placa se lavó dos veces con buffer fosfato salino (PBS) lX/Tween20 0,05%. Luego la placa se bloqueó por 2 horas a 37°C con PBS IX/ Suero Fetal Bovino (FBS) 10%. Posteriormente se repitieron los lavados y a continuación se incubaron cada uno de los anticuerpos, sin fraccionar y fracciones F(ab')2 (2E11B5 y 4D8C6) conjugados con biotina, a una concentración final de 3,4 pg/mL (170 ng por pocilio), diluidos en PBS 1X/FBS 10%, por 1 hora a 37°C (cada anticuerpo en una placa independiente) . Transcurrido el tiempo de incubación, se repitieron los lavados y se agregó a cada uno de los pocilios con una proteina de unión a biotina (Estreptavidina) marcada con la enzima peroxidasa de rábano (Horseradish peroxidase, HRP) en dilución 1 en 2000 (25 ng/pL por pocilio) en PBS 1X/FBS 10%, por 1 hora a temperatura ambiente ( 25°C) , en oscuridad. Finalmente, se realizaron los lavados y se reveló con 50 pL de buffer citrato/Tetrametilbenzidina (TMB, 3-3' -5-5' tetramethylbenzidine, lmg/mL, Becton Dickinson) . Para detener la reacción se adicionaron 50 pL de H2S04 2N y el resultado se leyó en un lector de ELISA, a 450nm. Para determinar que la reacción del anticuerpo secundario era especifica en reconocer al anticuerpo primario y además que la señal obtenida no sea provocada por unión inespecifica del anticuerpo secundario al antigeno, se realizaron controles en los cuales se utilizó solamente el anticuerpo secundario sin anticuerpo primario ni muestra (pocilio sin activar) . Otro control para determinar que la reacción del anticuerpo primario es especifica para el antigeno, consistió en el uso de los anticuerpos sobre una placa de ELISA que no ha sido activada con el antigeno (sin muestra) o usando los anticuerpos sobre una placa de ELISA que poseía 50 ng de la proteina BSA. Los resultados muestran que los anticuerpos monoclonales de la invención son capaces de reconocer 50 ng de antigeno purificado, de manera especifica, independiente de que se utilice el anticuerpo completo o un fragmento del mismo (Figura 6, barra de color negro, anticuerpo 2E11B5 y barra de color blanco, anticuerpo 4D8C6) .

Claims

RE IVIND I CAC I ONE S
1. Anticuerpo monoclonal o una porción de unión a antigeno del mismo que se une a la proteina L del virus parainfluenza humano (PIV) para su uso en la detección de la presencia y/o localización de la proteina CARACTERIZADO porque comprende una región variable de cadena ligera donde su CDR1 (CDRLCI) se define según la SEQ ID NO: 1, su CDR2 (CDRLC2) se define por la SEQ ID NO: 2 y su CDR3 (CDRLC3) corresponde a la SEQ ID NO: 3, y una región variable de la cadena pesada donde su CDR1 (CDRHCI) se define según la SEQ ID NO: 4, su CDR2(CDRHC2) corresponde a la SEQ ID NO: 5 y su CDR3 (CDRHC3) corresponde a la SEQ ID NO: 6, o una región variable de cadena ligera donde su CDR1 (CDRLCI) se define según la SEQ ID NO: 7, su CDR2 (CDRLC2) se define por la SEQ ID NO: 8 y su CDR3 (CDRLCS) corresponde a la SEQ ID NO: 9, y una región variable de la cadena pesada donde su CDR1 (CDRHCI) se define según la SEQ ID NO: 10, su CDR2 (CDRHC2) corresponde a la SEQ ID NO: 11 y su CDR3 (CDRHCS) corresponde a la SEQ ID NO: 12.
Donde, el anticuerpo puede ser usado como anticuerpo de detección o anticuerpo de captura.
2. Método para detectar al virus PIV en una muestra biológica
CARACTERIZADO porque el método comprende poner en contacto la muestra biológica con el anticuerpo monoclonal o una porción de unión a antigeno del mismo que se une a la proteina quimérica L de PIV de acuerdo a la reivindicación 1 y detectar la unión del anticuerpo con el antigeno, detectando asi el virus PIV en la muestra .
3. Método para detectar al virus PIV en una muestra biológica de acuerdo a la reivindicación 2, CARACTERIZADO porque la muestra biológica se selecciona del grupo compuesto por células in vi tro infectadas con PIV, secreciones nasales, lavados nasales, liquido cefalorraquídeo, secreciones faríngeas y/o lavados o secreciones bronquiales.
4. Método para detectar al virus PIV en una muestra biológica de acuerdo a la reivindicación 2 de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3, CARACTERIZADO porque el ensayo utilizado para la detección de la unión del anticuerpo con el antigeno se selecciona de: ELISA, inmunofluorescencia, inmunohistoquimica, inmunocromatografia, citometria de flujo, cell sorter, inmunoprecipitación y/o Western blot .
5. Método para detectar al virus PIV en una muestra biológica de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, CARACTERIZADO porque el anticuerpo o una porción de unión a antigeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, se encuentra conjugado con un marcador que permite su detección.
6. Método para detectar al virus PIV en una muestra biológica de acuerdo a la reivindicación 5, CARACTERIZADO porque el anticuerpo se encuentra unido a un marcador seleccionado del grupo compuesto por fluoróforos, biotina, radioisótopos, metales y enzimas.
7. Kit para la detección de virus PIV CARACTERIZADO porque comprende :
un anticuerpo monoclonal o una porción de unión a antigeno del mismo que se une a la proteina quimérica L de PIV de acuerdo a la reivindicación 1, el que actúa como anticuerpo de captura o de detección, donde el anticuerpo de detección se encuentra conjugado a un marcador para su detección; un soporte sólido al cual se adosa el anticuerpo; y - reactivos para detectar el marcador incluido en el anticuerpo de detección, tales como fluoróforos, biotina, radioisótopos, metales y enzimas.
8. Kit para la detección de virus PIV de acuerdo con la reivindicación 7, CARACTERIZADO porque el soporte sólido es una membrana formada por uno de los compuestos seleccionados del grupo compuesto por nitrocelulosa, celulosa, polietileno y nylon .
9. Kit para la detección cualitativa y/o cuantitativa de virus PIV de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 7 y 8, CARACTERIZADO porque corresponde a un test inmunocromatográfico , luminex, citometria de flujo, inmunofluorescencia, radioinmunoanálisis , Western blot, Dot plot, ELISA, inmunodifusión o inmunoprecipitación, para detectar PIV.
10. Uso de un anticuerpo monoclonal o una porción de unión a antigeno del mismo que se une a la proteina quimérica L de PIV de acuerdo con la reivindicación 1 CARACTERIZADO porque sirve como anticuerpo de captura y/o detección.
PCT/CL2019/050157 2018-12-28 2019-12-27 Anticuerpo monoclonal o una porción de unión a antígeno del mismo que se une a la proteína l del virus parainfluenza humano (piv); método y kit para detectar al virus piv WO2020132774A1 (es)

Priority Applications (10)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA3125208A CA3125208A1 (en) 2018-12-28 2019-12-27 Monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof that binds to the l protein of the human parainfluenza virus (piv); method and kit for detecting piv
CN201980093165.9A CN113490685A (zh) 2018-12-28 2019-12-27 与人副流感病毒(piv)的l蛋白相结合的单克隆抗体或其抗原结合部分；用于检测piv病毒的方法和试剂盒
MX2021007870A MX2021007870A (es) 2018-12-28 2019-12-27 Anticuerpos monoclonales especificos para la proteina quimerica l del virus de la parainfluenza humana (piv), secuencias nucleotidicas; metodo y kit de diagnostico de infeccion producida por piv.
BR112021012788A BR112021012788A2 (pt) 2018-12-28 2019-12-27 Anticorpo monoclonal ou uma porção de união a antígeno do mesmo que se une à proteína l do vírus parainfluenza humano (piv), método e kit para detectar o vírus piv
PE2021001089A PE20212104A1 (es) 2018-12-28 2019-12-27 Anticuerpos monoclonales especificos para la proteina quimerica l del virus de la parainfluenza humana (piv), secuencias nucleotidicas, metodo y kit de diagnostico de infeccion producida por piv
EP19903462.0A EP3904379A4 (en) 2018-12-28 2019-12-27 HUMAN PARAINFLUENCE VIRUS (PIV) L-PROTEIN BINDING MONOCLONAL ANTIBODY OR ANTIGEN-BINDING FRAGMENT THEREOF, METHODS AND KIT FOR THE DETECTION OF PIV
KR1020217024084A KR20210110660A (ko) 2018-12-28 2019-12-27 인간 파라인플루엔자 바이러스(piv)의 l 단백질에 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편, piv 검출을 위한 방법 및 키트
US17/418,617 US20220089697A1 (en) 2018-12-28 2019-12-27 Monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof that binds to the l protein of the human parainfluenza virus (piv); method and kit for detecting piv
CONC2021/0008770A CO2021008770A2 (es) 2018-12-28 2021-07-01 Anticuerpos monoclonales específicos para la proteína quimérica l del virus de la parainfluenza humana (piv), secuencias nucleotídicas; método y kit de diagnóstico de infección producida por piv
ZA2021/04990A ZA202104990B (en) 2018-12-28 2021-07-15 Monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof that binds to the l protein of the human parainfluenza virus (piv); method and kit for detecting piv

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CL3869-2018 2018-12-28
CL2018003869A CL2018003869A1 (es) 2018-12-28 2018-12-28 Anticuerpos monoclonales específicos para la proteína quimérica l del virus de la parainfluenza humana (piv), secuencias nucleotídicas; método y kit de diagnóstico de infección producida por piv

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020132774A1 true WO2020132774A1 (es) 2020-07-02

Family

ID=71125643

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/CL2019/050157 WO2020132774A1 (es) 2018-12-28 2019-12-27 Anticuerpo monoclonal o una porción de unión a antígeno del mismo que se une a la proteína l del virus parainfluenza humano (piv); método y kit para detectar al virus piv

Country Status (14)

Country Link
US (1) US20220089697A1 (es)
EP (1) EP3904379A4 (es)
KR (1) KR20210110660A (es)
CN (1) CN113490685A (es)
AR (1) AR117548A1 (es)
BR (1) BR112021012788A2 (es)
CA (1) CA3125208A1 (es)
CL (1) CL2018003869A1 (es)
CO (1) CO2021008770A2 (es)
MX (1) MX2021007870A (es)
PE (1) PE20212104A1 (es)
UY (1) UY38534A (es)
WO (1) WO2020132774A1 (es)
ZA (1) ZA202104990B (es)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113736920A (zh) * 2021-09-15 2021-12-03 丹娜(天津)生物科技股份有限公司 一种九项呼吸道病原体分子检测试剂盒及其使用方法和应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6015664A (en) 1995-11-03 2000-01-18 Mcw Research Foundation Multiplex PCR assay using unequal primer concentrations to detect HPIV 1,2,3 and RSV A,B and influenza virus A, B
AU2003256823B9 (en) * 2002-07-25 2009-01-08 Medimmune, Llc Methods of treating and preventing RSV, hMPV, and PIV using anti-RSV, anti-hMPV, and anti-PIV antibodies
US20110076268A1 (en) * 2009-08-13 2011-03-31 Robert Anthony Williamson Antibodies against human respiratory syncytial virus (RSV) and methods of use
CN102140550A (zh) 2011-03-25 2011-08-03 武汉大学 副流感病毒一步rt-pcr检测试剂盒
US20130177573A1 (en) * 2010-07-09 2013-07-11 Robert Anthony Williamson Anti-human respiratory syncytial virus (rsv) antibodies and methods of use
WO2013112720A1 (en) * 2012-01-24 2013-08-01 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Parainfluenza virus 5 based vaccines
CN105441589A (zh) 2015-12-21 2016-03-30 深圳市生科源技术有限公司 人副流感病毒ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ型四重pcr检测试剂盒及其检测方法
WO2017021815A2 (en) * 2015-07-31 2017-02-09 Pontificia Universidad Católica De Chile Monoclonal antibodies specifically for the antigen p of the human respiratory syncytial virus, produced and secreted by the cells hybridomas, useful for detection and diagnostic of the infection caused by rsv

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100233674A1 (en) * 2002-04-25 2010-09-16 University Hospitals Of Cleveland Cells for detection and production of influenza and parainfluenza viruses
US8492097B2 (en) * 2006-04-24 2013-07-23 Diagnostic Hybrids, Inc. Compositions and methods for human metapneumovirus monoclonal antibodies
US8003314B2 (en) * 2007-04-16 2011-08-23 Diagnostic Hybrids, Inc. Methods for direct fluorescent antibody virus detection in liquids
CL2016000164A1 (es) * 2016-01-21 2016-07-29 Pontificia Universidad Católica De Chile Anticuerpos monoclonales específicos para el antígeno piii de adenovirus humano (adv), producidos y secretados por hibridomas celulares, útiles para la detección y el diagnóstico de la infección causada por adv.

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6015664A (en) 1995-11-03 2000-01-18 Mcw Research Foundation Multiplex PCR assay using unequal primer concentrations to detect HPIV 1,2,3 and RSV A,B and influenza virus A, B
US20100278813A1 (en) * 2001-01-19 2010-11-04 Medimmune, Inc. Methods of treating and preventing RSV, hMPV, and PIV using anti-RSV, anti-hMPV, and anti-PIV antibodies
AU2003256823B9 (en) * 2002-07-25 2009-01-08 Medimmune, Llc Methods of treating and preventing RSV, hMPV, and PIV using anti-RSV, anti-hMPV, and anti-PIV antibodies
US20110076268A1 (en) * 2009-08-13 2011-03-31 Robert Anthony Williamson Antibodies against human respiratory syncytial virus (RSV) and methods of use
US20130177573A1 (en) * 2010-07-09 2013-07-11 Robert Anthony Williamson Anti-human respiratory syncytial virus (rsv) antibodies and methods of use
CN102140550A (zh) 2011-03-25 2011-08-03 武汉大学 副流感病毒一步rt-pcr检测试剂盒
WO2013112720A1 (en) * 2012-01-24 2013-08-01 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Parainfluenza virus 5 based vaccines
WO2017021815A2 (en) * 2015-07-31 2017-02-09 Pontificia Universidad Católica De Chile Monoclonal antibodies specifically for the antigen p of the human respiratory syncytial virus, produced and secreted by the cells hybridomas, useful for detection and diagnostic of the infection caused by rsv
CN105441589A (zh) 2015-12-21 2016-03-30 深圳市生科源技术有限公司 人副流感病毒ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ型四重pcr检测试剂盒及其检测方法

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BRANCHE, A. R. ET AL.: "Parainfluenza virus infection", EN SEMINARS IN RESPIRATORY AND CRITICAL CARE MEDICINE, vol. 37, no. 4, 2016, pages 538 - 554, XP055828994 *
HIERHOLZER, J. C. ET AL.: "Comparison of monoclonal antibody time-resolved fluoroimmunoassay with monoclonal antibody capture-biotinylated detector enzyme immunoassay for respiratory syncytial virus and parainfluenza virus antigen detection", JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, vol. 27, no. 6, 1989, pages 1243 - 1249, XP055723421 *
MATSUNAGA, S. ET AL.: "Wheat germ cell -free system-based production of hemagglutinin-neuraminidase glycoprotein of human parainfluenza virus type 3 for generation and characterization of monoclonal antibody", FRONTIERS IN MICROBIOLOGY, vol. 5, 2014, pages 208, XP055828993 *
NISHIO, M. ET AL.: "Human parainfluenza virus type 2 L protein regions required for interaction with other viral proteins and mRNA capping", JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 85, no. 2, 2011, pages 725 - 732, XP055723412 *
NISHIO, M. ET AL.: "Mapping of domains on the human parainfluenza type 2 virus P and NP proteins that are involved in the interaction with the L protein", VIROLOGY, vol. 273, no. 2, 2000, pages 241 - 247, XP004436227, DOI: 10.1006/viro.2000.0429 *
See also references of EP3904379A4
STARK, S. E. ET AL.: "Antibodies that are specific for a single amino acid interchange in a protein epitope use structurally distinct variable regions", THE JOURNAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE, vol. 174, no. 3, 1991, pages 613 - 624, XP003003582, DOI: 10.1084/jem.174.3.613 *
WANER, J. L. ET AL.: "Production of monoclonal antibodies against parainfluenza 3 virus and their use in diagnosis by immunofluorescence", JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, vol. 22, no. 4, 1985, pages 535 - 538, XP055723414 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113736920A (zh) * 2021-09-15 2021-12-03 丹娜(天津)生物科技股份有限公司 一种九项呼吸道病原体分子检测试剂盒及其使用方法和应用
CN113736920B (zh) * 2021-09-15 2023-09-01 丹娜(天津)生物科技股份有限公司 一种九项呼吸道病原体分子检测试剂盒及其使用方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
ZA202104990B (en) 2023-01-25
CA3125208A1 (en) 2020-07-02
BR112021012788A2 (pt) 2021-11-16
MX2021007870A (es) 2021-12-10
EP3904379A4 (en) 2022-08-17
EP3904379A1 (en) 2021-11-03
PE20212104A1 (es) 2021-11-04
CO2021008770A2 (es) 2021-07-19
CL2018003869A1 (es) 2021-01-15
CN113490685A (zh) 2021-10-08
AR117548A1 (es) 2021-08-11
UY38534A (es) 2020-07-31
US20220089697A1 (en) 2022-03-24
KR20210110660A (ko) 2021-09-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2784888T3 (es) Anticuerpo monoclonal específico para la proteína P del Virus Respiratorio Sincicial humano y uso del mismo para la detección y diagnóstico de infección por VRS
WO2021169664A1 (zh) 新型冠状病毒抗原及其检测用途
US9273122B2 (en) Monoclonal antibodies specific for the M2-1 antigen of respiratory syncytial virus (RSV)
ES2898068T3 (es) Anticuerpos monoclonales específicos para el antígeno pIII de Adenovirus humano (ADV), producidos y secretados por hibridomas celulares, útiles para la detección y el diagnóstico de la infección causada por ADV
WO2020132774A1 (es) Anticuerpo monoclonal o una porción de unión a antígeno del mismo que se une a la proteína l del virus parainfluenza humano (piv); método y kit para detectar al virus piv
WO2020132772A1 (es) Anticuerpos monoclonales específicos para el antígeno pb2 del virus de la influenza humana (flu), secuencias nucleotídicas; método y kit de diagnóstico de infección producida por flu
US9995747B2 (en) Specific monoclonal antibodies of the antigen M of the human metapneumovirus (HMPV) and use thereof in a diagnostic method
WO2020047683A1 (es) Anticuerpo monoclonal específico contra el antígeno n del virus respiratorio sincicial humano (vrsh), útiles para el tratamiento de la infección, su detección y diagnóstico

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19903462

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 3125208

Country of ref document: CA

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112021012788

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20217024084

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019903462

Country of ref document: EP

Effective date: 20210728

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01E

Ref document number: 112021012788

Country of ref document: BR

Free format text: APRESENTE O COMPLEMENTO DO TEXTO EM PORTUGUES, ADAPTADO A NORMA VIGENTE, DO PEDIDOCONFORME DEPOSITO INTERNACIONAL INICIAL (RELATORIO DESCRITIVO E DESENHO, SE HOUVER), CONFORMEDETERMINA A RESOLUCAO INPI PR NO 77/2013 DE 18/03/2013, ART. 5O E 7O.

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112021012788

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20210628