ES2898068T3 - Anticuerpos monoclonales específicos para el antígeno pIII de Adenovirus humano (ADV), producidos y secretados por hibridomas celulares, útiles para la detección y el diagnóstico de la infección causada por ADV - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales, o fragmentos de los mismos, que reconocen la proteína pIII del Adenovirus (ADV), útiles para el desarrollo de métodos de diagnóstico de infección por ADV en humanos. En particular se refiere a un anticuerpo monoclonal o un fragmento de él que comprende una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia con al menos un 90%, 95% o 99% de identidad con la SEQ ID No: o SEQ ID No: 5 y una región variable de la cadena liviana que tiene una secuencia con al menos un 90%, 95% o 99% de identidad con la SEQ ID No: 2 o SEQ ID No: 6. También se dirige a las secuencias nucleotídicas que definen dichos anticuerpos, métodos in vitro y/o ex vivo de diagnóstico de infección por ADV en una muestra biológica que utilizan dichos 10 anticuerpos monoclonales, y kits de diagnóstico para detectar ADV, que comprenden al menos un anticuerpo monoclonal contra ADV de acuerdo a lo descrito anteriormente.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos monoclonales específicos para el antígeno pIII de Adenovirus humano (ADV), producidos y secretados por hibridomas celulares, útiles para la detección y el diagnóstico de la infección causada por ADV

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un método de diagnóstico de infección causada por ADV in vitro y/o ex vivo que comprende poner en contacto anticuerpos monoclonales, o fragmentos de los mismos, que reconocen la proteína pIII del Adenovirus (ADV), y una muestra biológica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El virus denominado Adenovirus humano (ADV) es responsable de producir diversos cuadros clínicos en la población, que incluyen desde conjuntivitis, gastroenteritis hasta enfermedades respiratorias de todo tipo (como faringitis leves hasta enfermedades respiratorias agudas del tracto respiratorio bajo, como neumonía). Estudios han demostrado que este virus produce un alto porcentaje de morbilidad e incluso la muerte en infantes, reclutas militares y personas inmunocomprometidas a nivel mundial. ADV se conoce por ser un virus persistente, permaneciendo latente en individuos previamente infectados y pudiéndose reactivar por diversos factores, llevando a la generación una enfermedad más severa. Su genoma contiene ADN de doble hebra, el que no posee envoltura nuclear y codifica para 9 proteínas. La cápside que lo recubre tiene forma icosaedra y está compuesta por 3 proteínas principales: Hexón, Pentón (altamente conservado) y la fibra. Estudios han reportado que la proteína pentón y la fibra son las que se encargan del ataque y entrada a la célula hospedera, promoviendo esta última la internalización del virus al interactuar con receptores en la superficie celular. Existen más de 50 serotipos de ADV en humanos, los cuales se agrupan en 6 especies que se subdividen de la A-F. Dentro de la subdivisión algunas cepas -la B, C y E- tienen mayor relevancia clínica en enfermedades respiratorias, donde el grado de severidad de la enfermedad dependerá de la edad (niños <4 años y adultos) y del estado inmunológico de los pacientes infectados.

En la actualidad los métodos de diagnósticos y detección de ADV realizados por los servicios de Salud Pública incluyen un test basado en la detección de antígenos virales por Inmunofluorescencia directa en muestras de hisopado o aspirado nasofaríngeo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y cultivo celular, a partir de muestra de sangre. De las técnicas mencionadas, es el panel viral basado en Inmunofluorescencia el que permiten detectar un mayor número de virus respiratorios, siendo 12 tipos en el caso de Respiratory Viral Panel (RVP) PCR utilizing Luminex xTAg y 14 tipos para el eSensor Respiratory Viral Panel. Pese a este amplio rango de detección, es importante notar los factores de costo y tiempo de respuesta que estos utilizan (en el caso del primero el costo es aproximadamente USD 60-80 (CLP 42.000 -56.000) y un tiempo de respuesta entre 12 a 18 horas).

Con base en los antecedentes previos, se hace fundamental generar y contar con un test de diagnóstico ex vivo o in vitro rápido, eficaz y de bajo costo para la detección de ADV que pueda competir contra las características de los métodos de diagnóstico disponibles. Ante tal problemática, los anticuerpos monoclonales de la invención aparecen como una alternativa necesaria para suplir dicha necesidad, puesto que permiten el reconocimiento específico de antígenos virales en muestras de pacientes infectados con ADV. Actualmente existen anticuerpos utilizados para fines de investigación (Thermo Scientific Cat. #MS-587) y diagnóstico (abcam© ab6982), sin embargo no se han reportado anticuerpos monoclonales que reconocen específicamente la proteína pIII de este virus.

Un anticuerpo monoclonal es un tipo de anticuerpo homogéneo que se caracteriza por reconocer específicamente un solo antígeno. Son producidos por una única célula híbrida (hibridoma), que es producto de la fusión de un clon de linfocito B y una célula plasmática tumoral. La propiedad de unirse específicamente y con alta afinidad a un antígeno ha impulsado el desarrollo de los anticuerpos monoclonales como una herramienta de gran utilidad para la detección de moléculas que generan un gran interés científico, clínico y de uso industrial. En la actualidad, los anticuerpos monoclonales son ampliamente utilizados, tanto en investigación básica como aplicada, debido a su especificidad y reproducibilidad, lo que permite fundamentar de mejor manera la investigación. Sin embargo, es en el área de la biomedicina donde los anticuerpos monoclonales han tenido enormes aplicaciones prácticas, ya sea para diagnóstico y tratamiento de múltiples enfermedades infecciosas, y como terapia para otras patologías. Si bien es cierto que los anticuerpos monoclonales se utilizan en todo tipo de técnicas de detección y diagnóstico, es en el diseño de kits para diagnóstico in vitro donde se han obtenido los mejores resultados. Para ello, existen en la actualidad diversos kits de detección rápida, tal como el test de embarazo, que se basa en la determinación de los niveles de gonadotrofina coriónica (hCG) en la orina utilizando anticuerpo anti hCG. Además, los anticuerpos monoclonales para uso terapéutico han cobrado gran relevancia. En la actualidad existen tratamientos terapéuticos para distintas patologías, mediante el uso de anticuerpos monoclonales comerciales como: Alemtuzumad, Gemtuzumab ozogamicina, Rituximab, Trastumab, entre otros.

En la actualidad existen anticuerpos monoclonales frente a diferentes proteínas del adenovirus; sin embargo se destaca la producción de anticuerpos contra la proteína del hexón y la fibra de la cápside en varios de los trabajos publicados. Un ejemplo claro de lo anterior, se observa en la patente US4487829, donde logran generar anticuerpos llamados anti 2-Hx-2 capaces de detectar el antígeno del hexón en el subgrupo C (1,2,5) de adenovirus humano. Por otro lado, la presente solicitud muestra la existencia de nuevos anticuerpos monoclonales, o fragmentos de los mismos, que reconocen la proteína pIII del Adenovirus (ADV).

Adicionalmente, el documento US20110262892A1 describe métodos de detección o medición de virus, en donde uno de los virus detectados es Adenovirus, sin embargo este documento no habla de anticuerpos monoclonales específicos o fragmentos de los mismos que reconocen la proteína pIII de Adenovirus como si lo hace la presente solicitud.

Teniendo en cuenta la alta producción y competitividad en el mercado de anticuerpos monoclonales anti hexón, se requiere de la búsqueda y desarrollo de nuevos anticuerpos monoclonales dirigidos contra proteínas conservadas y abundantes en la estructura del virión. Tal es el caso de los anticuerpos monoclonales de esta invención, los cuales están dirigidos contra la proteína pIII (pentón base), una proteína altamente conservada entre subgrupos de ADV. Estos son los primeros anticuerpos monoclonales producidos contra esta proteína, los cuales demostraron ser capaces de detectar partículas virales a partir de muestras clínicas con alta sensibilidad.

El documento WO 02/04522 A2 divulga moléculas bifuncionales para el suministro de genes seleccionados como diana en terapia génica basada en vector adenoviral. Se describe un anticuerpo monoclonal de base de pentona, DAV-1, que reconoce el sitio de unión a integrina en tipos 2/5 de partículas de Adenovirus.

Stewart P et al. (1997) divulga el anticuerpo monoclonal de base anti-pentona DAV-1. Este anticuerpo reconoce varios serotipos de Adenovirus humano diferentes, base de pentona recombinante purificada y la secuencia de unión a integrina (RGD) en la proteína de base de pentona.

El documento WO 2005/023848 A2 divulga epítopos adenovirales, en particular epítopos del Adenovirus de base de pentona, reconocido por anticuerpos neutralizantes humanos.

El documento US 6.248.514 B1 divulga un método de cuantificación de partículas virales infecciosas en una población, basado en análisis de citometría de flujo de células infectadas usando anticuerpos que tienen especificidad por un polipéptido expresado por el virus.

De este modo, la presente invención comprende métodos que usan anticuerpos monoclonales para detección y diagnóstico rápido, eficaz y certero en pacientes infectados con ADV con un 100% de especificidad en muestras clínicas y capaces de detectar por ELISA concentraciones equivalentes a 1,5 ng del antígeno específico. Esto permitirá a los profesionales clínicos determinar de manera temprana un protocolo clínico adecuado para individuos que sufran de una infección respiratoria causada por este virus.

RESUMEN DEL INVENTO

La presente invención se refiere al objeto de las reivindicaciones adjuntas.

La invención se refiere a un método de diagnóstico de infección causada por ADV in vitro y/o ex vivo en una muestra biológica que comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo monoclonal frente a ADV o fragmento del mismo y detectar la unión del anticuerpo al antígeno, donde el anticuerpo monoclonal frente a ADV o fragmento del mismo se une a la proteína de base de pentona de Adenovirus (ADV) y comprende una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia SEQ ID NO:1 y una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia SEQ ID NO:2.

Concretamente, la presente divulgación involucra dos anticuerpos monoclonales murinos, secretados por líneas celulares de hibridomas denominados 7E11 y 6F11, y que reaccionan contra el antígeno pIII de ADV. Estos anticuerpos no compiten entre sí por el sitio de unión al antígeno, ni ejercen un impedimento para unirse simultáneamente a este. Dichos anticuerpos monoclonales pueden ser utilizados para ensayos de detección, diagnóstico y/o determinación de infección por ADV. Estos anticuerpos pueden ser utilizados simultáneamente para incrementar la sensibilidad de detección en muestras clínicas donde existe escasa cantidad y disponibilidad de antígeno. Por ejemplo, como se muestra en la figura 6, anticuerpos provenientes de hibridoma 7E11 son capaces de capturar eficientemente la proteína pIII de ADV en muestras clínicas. Estas proteínas capturadas e inmovilizadas fueron detectadas posteriormente por el anticuerpo generado por el hibridoma 6F11, el cual se encontraba conjugado a una enzima que actúa sobre un sustrato cromógeno. Esta cualidad permite la combinación de ambos anticuerpos con diferente marca para detectar el mismo antígeno en muestras donde éste se encuentre en escasa cantidad.

La invención proporciona la oportunidad de desarrollar métodos de diagnóstico ex vivo o in vitro y detección del antígeno viral pIII de ADV, en los cuales se utiliza el anticuerpo monoclonal producido y secretado por el hibridoma 7E11 en ensayos como ELISA, microscopía de fluorescencia e inmunotransferencia. Las muestras a analizar pueden ser: células in vitro infectadas con ADV, secreciones nasales, lavados nasales, secreciones faríngeas y/o lavados o secreciones bronquiales, suero, líquido cefalorraquídeo, entre otras. La invención proporciona la capacidad de detectar ADV en muestras biológicas y cultivos celulares, utilizando los anticuerpos monoclonales producidos y/o secretados por la línea celular del hibridoma antes mencionado, acoplados en cualquier tipo de soporte sólido, como nitrocelulosa, membrana de nylon, esferas magnéticas, esferas fluorescentes u otro soporte; o acoplado a cualquier otra molécula, como enzimas, proteínas, fluoróforos, isótopos radiactivos o cualquier otro compuesto químico. Además la presente invención comprende dentro de su alcance incorporar cualquier tipo de molécula o sustrato unido químicamente, tales como marcadores, fluoróforos, biotina, radioisótopos, metales, enzimas y/o cualquier elemento químico acoplado al anticuerpo monoclonal secretado por el hibridoma 7E11, donde dicha molécula o sustrato unido químicamente permite visualizar o detectar al anticuerpo. De esta manera la invención también provee anticuerpos que reconocen específicamente la proteína pIII acoplada a moléculas, sustratos o marcadores diferentes del anticuerpo, como parte del método de detección, análisis y/o diagnóstico en muestras biológicas.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Detección de proteína pilI de ADV por los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas 7E11 y 6F11, mediante un ensayo de ELISA indirecto. La placa fue activada con 50 ng de proteína recombinante pIII de ADV purificada, o con 1x106 ufp de ADV. Como controles negativos, se activaron otros pocillos con 1x106 ufp de Virus Respiratorio Sincicial humano (hVRS) o con 50 ng de proteína albúmina de suero bovino (BSA). Se incluyeron además otros pocillos control: sin antígeno (con anticuerpo primario y anticuerpo anti-IgG de ratón conjugado con HRP, denominados en el experimento como “sin activar”) y pocillos sin antígeno ni anticuerpo primario, solo con anticuerpo anti-IgG de ratón (HRP). Posteriormente, los pocillos se incubaron con los anticuerpos anti-pI 11 provenientes del hibridoma 7E11, en cantidad de 170 ng (A) y el hibridoma 6F11 en cantidad de 170 ng (B). Los datos mostrados en el gráfico expresan la absorbancia detectada a 450 nm, emitida por la conversión del sustrato Tetrametilbenzidina a un compuesto coloreado, catalizada por la enzima Horseradish peroxidase (HRP) presente en un anticuerpo secundario anti-IgG de ratón que se unió específicamente a los anticuerpos secretados por los hibridomas 7E11 y 6F11. Los valores corresponden al promedio /- la desviación estándar de la absorbancia emitida por cada muestra en al menos dos experimentos independientes. ** P <0,01 *** P <0,0001 por el test de ANOVA de una vía comparado al control negativo y comprobación mediante comparaciones múltiples de Dunnett's; ns, no hay diferencia significativa comparado con el control negativo.

Figura 2. Determinación de sensibilidad de anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas 7E11 y 6F11 en la detección de la proteína piII de ADV. Placas de ELISA fueron activadas con diluciones seriadas 1:2, iniciando con 50 ng de proteína pIII y finalizando con 0,04 ng (A) y diluciones seriadas de un inóculo 1x105 ufp de ADV partiendo de 1:2 hasta la dilución 1:5120 (B). Se incluyeron pocillos sin activar como control negativo. Los datos mostrados en el gráfico expresan la absorbancia a 450 nm emitida por la conversión del sustrato Tetrametilbenzidina a un compuesto coloreado catalizada por la enzima Horseradish peroxidase (HRP) presente en los anticuerpos anti-pI 11 provenientes de los hibridomas 7E11 y 6F11 en cantidad de 170 ng (A y B). Los valores corresponden al promedio de la absorbancia emitida por cada muestra en al menos dos experimentos independientes.

Figura 3. Ensayo de diluciones seriadas de los anticuerpos monoclonales anti-piII de ADV producidos por los hibridomas 7E11 y 6F11, para la detección de antígenos purificados de ADV. Se activaron placas de ELISA con 50 ng de proteína recombinante pIII de ADV y se detectó el antígeno con diluciones seriadas 1:2 de los anticuerpos anti-pIII 7E11 o 6F11, partiendo de una concentración de 3,4 |ig/ml (170 ng). Los datos se expresan como el promedio del valor de la absorbancia emitida a 450 nm de cada muestra en duplicado, en al menos dos experimentos independientes.

Figura 4. Confirmación de especificidad de anticuerpos monoclonales secretados por los hibridomas 7E11 y 6F11, mediante dot blot. Los anticuerpos anti-pI 11 de ADV producidos por los hibridomas 7E11 o 6F11 se incubaron por 1 hora con una membrana de nitrocelulosa que contenía las siguientes muestras inmovilizadas (en forma de manchas o “dots”): hVRS (1x106 ufp), ADV (1x106 ufp), BSA (1 |jg), proteína pIII de ADV (1|jg, 500 ng y 50 ng), y 20 |ig de extracto de células A549 sin infectar e infectadas con ADV. Tras la incubación, la membrana se lavó y se incubó por 1 hora con un anticuerpo secundario anti-IgG de ratón conjugado con la proteína HRP. Tras la incubación, la visualización de la unión de los anticuerpos monoclonales al antígeno se realizó mediante la captura de la quimioluminiscencia producida por la catálisis del sustrato comercial “enhanced chemiluminescence Western blot detection system” (ECL, Amersham, Uppsala, Sweden). Se observa que los anticuerpos producidos por los hibridoma 7E11 o 6F11 se unen sólo a los “dots” donde se encuentra presente la proteína pIII de ADV, el virus ADV y células infectadas con ADV, confirmando la especificidad de estos anticuerpos.

Figura 5. Detección de la proteína piII de ADV por immunofluorescencia en células A549 infectadas con ADV. Células A549 fueron crecidas in vitro hasta alcanzar una confluencia de 70-90%, para ser infectadas por 48 horas con ADV. Posteriormente, estas fueron fijadas con paraformaldehido y preparadas para inmunofluorescencia indirecta. Para ello se utilizó como un anticuerpo primario monoclonal derivado del hibridoma 7E11 ó del hibridoma 6F11, además de un anticuerpo comercial anti-ADV (Abcam). Como anticuerpo secundario se utilizó un anticuerpo comercial anti-IgG de ratón conjugado al fluoróforo Alexa Fluor 488 ó un anti-IgG de conejo conjugado con el mismo fluoóforo, que emite fluorescencia a 519 nm (señal intensa). Los núcleos de las células se tiñeron con el flouróforo TOPRO-3 iodide, que emite fluorescencia a 661 nm (círculos rellenos). Se observa una fuerte reactividad en el citoplasma (flechas blancas) solo en células infectadas cuando se utiliza cualquiera de los dos anticuerpos primarios.

Figura 6. Detección de ADV en muestras clínicas mediante ELISA en sándwich, utilizando la combinación de los anticuerpos monoclonales secretados por los hibridomas 7E11 y 6F11. Placas de ELISA fueron activadas con 170 ng de anticuerpo secretado por el hibridoma 7E11, funcionando como anticuerpo de captura. Los pocillos activados con el anticuerpo de captura se incubaron con 50 |il de muestras de hisopado nasofaríngeo (HNF) de pacientes que presentaban cuadros respiratorios virales. Como controles negativos se analizaron 10 muestras de pacientes controles (negativos para virus respiratorios). Se utilizaron 20 muestras de pacientes positivos para ADV y como control de especificidad, se incluyeron 20 muestras de pacientes positivos para el VRS. Como control positivo se incluyeron pocillos a los que se adicionó proteína pIII de ADV purificada. Para la detección de la proteína capturada por el anticuerpo 7E11, se utilizaron los anticuerpos producidos por el hibridoma 6F11, conjugados a la enzima HRP, en una dilución 1:2000 (75 ng por pocilio). Los datos mostrados son el promedio /- la desviación estándar del valor de la absorbancia emitida a 450 nm de cada muestra (***p <0,001 mediante el test de ANOVA de una vía comparados con pacientes positivos a hVRS o pacientes sanos).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DEL INVENTO

La presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal, o fragmento del mismo, del isotipo IgG1, que reconoce específicamente la proteína pIII (también aquí denominados como anticuerpos anti-pIII), del Adenovirus (ADV) en un método de diagnóstico de infección causada por ADV in vitro y /o ex vivo en una muestra biológica que comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo monoclonal frente a ADV o fragmento del mismo y detectar la unión del anticuerpo al antígeno. Este anticuerpo se produce por el hibridoma 7E11. Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de ambas cadenas del anticuerpo producido por el hibridoma 7E11 se describen en las SEQ ID No: 1 para la cadena pesada y SEQ ID No: 2 para la cadena liviana. Las secuencias nucleotídicas que las codifican están descritas en las SEQ ID No: 3 y SEQ ID No: 4 , respectivamente. También se divulga en el presente documento las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de ambas cadenas del anticuerpo producido por el hibridoma 6F11, se describen en las SEQ ID No: 5 para la cadena pesada y SEQ ID No: 6 para la cadena liviana. Las secuencias nucleotídicas que las codifican están descritas en las SEQ ID No: 7 y SEQ ID No: 8, respectivamente.

A partir de estas secuencias variables, se contruyen anticuerpos quiméricos que las comprendan, incluyendo ya sea sólo una de las regiones variables, o mezclándolas en todas las combinaciones posibles. Todas esas realizaciones se divulgan en el presente documento. Es decir, la presente divulgación incluye anticuerpos que comprendan al menos una de las secuencias SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 5 y SEQ ID No: 6 y secuencias similares con hasta un 90%, 95% o 99% de homología o identidad respecto a cualquier de dichas secuencias de aminoácidos. Así como las secuencias nucleotídicas que comprendan al menos una de las secuencias SEQ ID No: 3 o SEQ ID No: 4, así como sus reversos complementarios y secuencias similares con hasta un 80%, 85%, 90%, 95% y 99% de homología o identidad respecto a cualquiera de dichas secuencias nucleotídicas. El mayor grado de homología considerado en las secuencias nucleotídicas se basa en la degeneración del código genético. De esta manera, la presente invención también incluye un conjunto de secuencias nucleotídicas que codifican para un anticuerpo monoclonal, o fragmento del mismo, que reconoce específicamente la proteína pIII de ADV.

En una realización específica de la divulgación, dichos anticuerpos o fragmentos de los mismos están conjugados con un marcador que permite su detección, tales como, biotina, metales, enzimas, proteínas, fluoróforos, isótopos radiactivos o cualquier otro compuesto químico.

Como se muestra en las figuras 1 y 4, estos anticuerpos no reaccionan con otras proteínas o moléculas presentes en virus relacionados o muestras de pacientes con otros virus asociados a infecciones respiratorias. Esto disminuye notablemente la posibilidad de falsos negativos al utilizarlos en métodos de diagnóstico.

La invención proporciona métodos de diagnóstico ex vivo o in vitro y detección del antígeno viral pIII de ADV en una muestra biológica, en los cuales se utiliza el anticuerpo monoclonal producido y secretado por el hibridoma 7E11 en ensayos de detección de unión del anticuerpo con el antígeno.

El método comprende poner en contacto una muestra biológica seleccionada de: células in vitro infectadas con ADV, secreciones nasales, lavados nasales, líquido cefalorraquídeo, secreciones faríngeas y/o lavados o secreciones bronquiales, entre otras, con el anticuerpo monoclonal contra ADV o un fragmento del mismo secretado por el hibridoma 7E11, y luego detectar la unión del anticuerpo con el antígeno con un ensayo seleccionado de: ELISA, inmunotransferencia, inmunofluorescencia, inmunohistoquímica, inmunocromatografía, citometría de flujo, cell sorter, inmunoprecipitación y/o Western blot.

Además, el método de la presente invención comprende anticuerpos o fragmentos de los mismos producidos y/o secretados por las líneas celulares de los hibridomas antes mencionados, acoplados con cualquier tipo de soporte sólido, como nitrocelulosa, membrana de nylon, esferas magnéticas, esferas fluorescentes u otro soporte. En otra realización específica de la invención, los anticuerpos o fragmentos de los mismos usados en el método están conjugados con un marcador que permite su detección, tales como biotina, metales, enzimas, proteínas, fluoróforos, isótopos radiactivos o cualquier otro compuesto químico.

Además, en el método de la presente invención se selecciona la muestra biológica del grupo que consiste en secreciones nasales, lavados nasales, líquido cefalorraquídeo, secreciones faríngeas y/o lavados y secreciones bronquiales.

En una realización preferida, en el método de diagnóstico de la invención, el anticuerpo o fragmento del mismo está conjugado con un marcador que permite su detección. En una realización más preferida, el marcador se selecciona del grupo que consiste en biotina, metales, enzimas, proteínas, fluoróforos e isótopos radiactivos o cualquier otro compuesto químico.

En otra realización preferida, el anticuerpo está unido a un soporte sólido. En una realización más preferida, el soporte sólido es nitrocelulosa, membrana de nylon, esferas magnéticas, esferas fluorescentes u otro soporte.

De esta manera, la divulgación también provee anticuerpos que reconocen específicamente la proteína pIII acoplada a moléculas o sustratos o marcadores diferentes del anticuerpo, como parte del método de detección, análisis y/o diagnóstico en muestras biológicas.

EJEMPLOS DE APLICACIÓN

A continuación se describen ejemplos que permiten demostrar las distintas aplicaciones de los anticuerpos monoclonales de la invención.

Ejemplo 1: Determinación de la secuencia nucleotídica que codifica las cadenas ligerass (VL) y pesadas (VH) de la región variable del anticuerpo anti-piII ADV secretado por el hibridoma 7E11 y del anticuerpo anti-piII ADV secretado por el hibridoma 6F11.

El siguiente protocolo fue utilizado para los hibridomas 7E11 y 6F11 por separado. Se creció el hibridoma en medio de cultivo DMEM-high glucose suplementado con 3,7 g/L de Bicarbonato de Sodio y 10% de suero fetal bovino, a 37° C con 10% CO2, hasta una densidad celular de 700.000 células/ml. Se obtuvo el RNA total de 3,5 x106 células, realizando un tratamiento con el compuesto Trizol (Invitrogen). Se utilizó 0,5 |ig de RNA para generar el cDNA mediante reacción de retrotranscripción con el kit Impron II (Promega). Mediante PCR se amplificó la región variable de los genes que codifican las cadenas kappa y lambda de las inmunoglobulinas. Para esto se utilizaron los partidores universales del kit Ig Primer set de Novagen (n° catálogo 69831-3) y se siguieron las instrucciones del fabricante. La región variable de la cadena liviana se amplificó con los partidores MuIgKVL5'-B: 5'GGGAATTCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT 3' (SEQ ID NO: 9) y MuIgKVL5'-C: 5'ACTAGTCGACATGGAGWCAGACACACTSCTGYTATGGGT3' (SEQ ID NO: 10) y la cadena pesada se amplificó con los partidores MuIgVH5'-A: 5'GGGAATTCATGRASTTSKGGYTMARCTKGRTTT3' (SEQ ID NO: 11) y MuIgVH5'-F: 5'ACTAGTCGACATGAACTTYGGGYTSAGMTTGRTTT3' (SEQ ID NO: 12). Los productos de PCR fueron clonados en el vector de clonamiento pTOPO-TA (Invitrogen) de acuerdo a las instrucciones del fabricante y secuenciado por el servicio de secuenciación de la Pontificia Universidad Católica de Chile en un secuenciador AbI prism 3130xl (Applied Biosystem). Las secuencias de aminoácidos deducidas (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 para el hibridoma 7E11 y SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 para el hibridoma 6F11) se obtuvieron utilizando el programa bioinformático Vector NTI (Invitrogen).

Ejemplo 2: Ensayo de detección de antígenos de ADV, determinación de especificidad de los anticuerpos monoclonales anti-piII de ADV para antígenos purificados de ADV mediante ensayo de ELISA indirecto.

Este ensayo tiene como objetivo demostrar la especificidad por la proteína pIII de ADV de los anticuerpos producidos por los hibridomas 7E11 y 6F11. La detección del antígeno se llevó a cabo mediante la técnica de ELISA indirecto, donde la placa de ELISA se activó con 50 ng de antígeno purificado por 1 hora a 37°C. De igual manera se activó la placa con 1x106 unidades formadoras de placas (ufp) del ADV. Como controles negativos se incluyó Virus Sincicial Respiratorio humano (hVRS) bajo las mismas condiciones en que se incubó el ADV, y además se incluyeron 50 ng de proteína de BSA en un pocillo independiente. Posteriormente, la placa se lavó dos veces con buffer fosfato salino (PBS) /Tween 0,05%. Luego la placa se bloqueó por 2 horas a 37° C con PBS /FBS 10%. Posteriormente se repitieron los lavados y a continuación se incubaron cada uno de los anticuerpos (7E11 y 6F11) a una concentración final de 3,4 |ig/ml, diluidos en PBS/FBS 10%, por 1 hora a temperatura ambiente (cada anticuerpo en una placa independiente). No se utilizó control de anticuerpo comercial, debido a que en el comercio no se han encontrado anticuerpos monoclonales o policlonales contra la porteína pIII. Transcurrido el tiempo de incubación, se repitieron los lavados y se agregó a cada uno de los pocillos un anticuerpo secundario anti-IgG de ratón marcado con la enzima peroxidasa de rábano (Horseradish peroxidase, HRP) en dilución 1 en 2000 (25 ng por pocillo) en PBS/FBS 10%, por 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, se realizaron los lavados y se reveló con 50 |jl de buffer citrato/Tetrametilbenzidina (TMB, 3-3'-5-5'tetramethylbenzidine, 1mg/ml, Becton Dickinson). Para detener la reacción se adicionaron 50 j l de H2SO42N y el resultado se leyó en un lector de ELISA, a 450nm. Para determinar que la reacción del anticuerpo secundario era especifica en reconocer al anticuerpo primario y además que la señal obtenida no sea provocada por unión inespecífica del anticuerpo secundario al antígeno viral, se realizaron controles en los cuales se utilizó solamente el anticuerpo secundario sin anticuerpo primario ni muestra (pocillo sin activar). Otro control para determinar que la reacción del anticuerpo primario es específica para el antígeno, consistió en el uso de los anticuerpos sobre una placa de ELISA que no ha sido activada con el antígeno (sin antígeno) o usando los anticuerpos sobre una placa de ELISA activada previamente con 50 ng de la proteína BSA ó un virus diferente (hVRS). Los resultados muestran que los anticuerpos monoclonales de la invención son capaces de reconocer 50 ng de antígeno purificado, de manera específica, ya que no reconocen la proteína BSA, ni proteínas de otro virus relacionado (Figura 1A y 1 B).

Ejemplo 3: Ensayo para determinar la sensibilidad de los anticuerpos monoclonales para la detección de antígenos virales.

El ensayo se realizó para determinar la máxima dilución de proteína y virus que los anticuerpos monoclonales anti-pI 11 de ADV provenientes de los hibridomas 7E11 y 6F11 son capaces de detectar mediante ELISA indirecto. Para esto, se ocupó la misma técnica descrita en el ejemplo 2. Se activó la placa con 11 diluciones seriadas 1:2 de proteína pIII de ADV, partiendo con 50 ng de antígeno purificado. Respecto al virus, se activó la placa con diluciones seriadas de 1:2, a partir de 1x105 ufp de virus. Los anticuerpos anti-pIII 7E11 o 6F11, se utilizaron en una concentración de 3,4 |ig/ml (170 ng/pocillo), diluidos en PBS/FBS 10%. Posteriormente se adicionó el anticuerpo de detección anti-IgG de ratón en una dilución de 1:2.000 (25 ng/pocillo). Los resultados mostraron que el anticuerpo anti-pIII 7E11 es capaz de reconocer hasta 1,56 nanógramos (ng) de la proteína pIII de ADV. El anticuerpo anti-pIII proveniente del hibridoma 6F11, fue capaz de detectar hasta 3,12 ng de proteína pIII de ADV (Figura 2A).

En cuanto a la sensibilidad de los anticuerpos representada en su capacidad de detectar el ADV en altas diluciones, se pudo observar que los anticuerpos anti-pIII provenientes del hibridoma 7E11 pueden detectar todas las diluciones realizadas del virus, de igual manera que el anticuerpo proveniente del hibridoma 6F11, lo que sería equivalente a 390 particulas virales aproximadamente. Los dos anticuerpos monoclonales serían eficiencientes y sensibles en la detección del virus, conociendose que no existe algún anticuerpo comercial hasta el momento que detecte la proteína pIII (Figura 2B).

Se incluyeron en todos los ensayos controles que permitieran descartar reacciones inespecíficas de los anticuerpos, los cuales contenían todos los componentes del ensayo exceptuando la muestra (proteína pIII o virus ADV).

Ejemplo 4: Ensayo para determinar la eficiencia de los anticuerpos monoclonales para detectar antígenos virales.

El ensayo se realizó para determinar la máxima dilución de los anticuerpos monoclonales anti-pIII de ADV provenientes de los hibridomas 7E11 y 6F11, que permiten la detección del antígeno viral. Para esto, se ocupó la misma técnica de ELISA indirecto del ejemplo 2. Se activó la placa con 50 ng de antígeno purificado y los anticuerpos anti-pIII 7E11 o 6F11 se utilizaron realizando 11 diluciones 1:2 iniciando con una concentración de 3,4 |ig/ml, utilizando como diluyente una solución de PBS/FBS 10%. En la figura 3 se observa que a todas las diluciones que se utilizaron en el ensayo, los anticuerpos anti-pIII 7E11 y 6F11 son capaces de detectar la proteína pIII de ADV.

El control negativo incluido en este ensayo, corresponde a un pocillo que no contiene muestra (proteína pIII), fue bloqueado con PBS/FBS 10%, no se le adicionó anticuerpo primario (anti-pIII 7E11 ó anti-pIII 6F11) y sólo contiene anticuerpo anti-IgG de ratón conjugado con HRP.

Ejemplo 5: Diagnóstico clínico de muestras de pacientes infectados con ADV, utilizando anticuerpo monoclonal anti-piII de ADV mediante la técnica de ELISA en Sándwich.

Debido a que la disponibilidad y concentración de las proteínas virales en muestras clínicas obtendidas de hisopados nasofarígeos es baja, fue necesario modificar el método de detección y utilizar el método de ELISA en sandwich, usando como anticuerpo de captura el anticuerpo anti-pI 11 proveniente del hibridoma 7E11 y como anticuerpo de detección el clon anti-pI 116F11, conjugado con HRP. Para el ensayo se activaron pocillos de una placa de ELISA con 3,4 |ig/ml (170 ng /pocillo) del anticuerpo anti-pI 11 proveniente del hibridoma 7E11, diluido en PBS, durante 1 hora a 37°C. Se realizaron 2 lavados con PBS-Tween20 al 0,05% y posteriormente se bloqueó la placa con 200 |iL de PBS/FBS al 10% durante 2 horas a 37°C. Se lavó nuevamente y se incubó toda la noche a 4°C cada pocillo con 50 |iL de aspirados nasofaríngeos de pacientes positivos para ADV de acuerdo al método de diagnóstico “-D3 Ultra DFA Respiratory Virus Screening and ID Kit de DHI (Diagnostics Hibryds) USA”, denominado de manera rutinaria como “panel viral”, y que fueron tratadas como se describe posteriormente*. Como controles se incluyeron: 1) control de especificidad (50 |iL de muestra de pacientes diagnosticados con hVRS mediante el panel viral), 2) control positivo (50 ng de proteína recombinante pIII de ADV) y 3) Control negativo correspondiente a muestras de pacientes sanos (negativos para virus mediante el panel viral). Al día siguiente se realizaron los lavados y cada pocillo se incubó por 1 hora a temperatura ambiente con 50 |iL del anticuerpo anti-pI 11 proveniente del hibridoma 6F11 conjugado con HRP. Se lavó la placa 2 veces más y se reveló con 50 |iL de solución TMB, se incubó de 10 a 15 minutos en oscuridad. La reacción se detuvo con 50 |iL de H2SO42N. La lectura de la placa se realizó en un lector de ELISA Epoch, certificado para diagnóstico clínico. Los resultados obtenidos para este ensayo se muestran en la figura 6 , donde se puede observar que la técnica de ELISA en sandwich utilizando el anticuerpo proveniente del hibridoma 7E11 como anticuerpo de captura y el anticuerpo proveniente del hibridoma 6F11-HRP como anticuerpo de detección, permite detectar el antígeno en muestras de pacientes infectados con ADV, los cuales fueron previamente confirmados por Inmunofluorescencia directa en un laboratorio clínico certificado utilizando el panel viral. El número de pacientes incluidos en el ensayo fue de 20, de los cuales 17 fueron detectados como positivo por ELISA con una densidad óptica (OD) por encima de 0,1. Este ensayo demuestra además la versatilidad que presentan los anticuerpos provenientes de los hibridomas 7E11 y 6F11, ya que son capases de unirse simultáneamente al antígeno sin competir ni interferir entre sí, permitiendo la captura y posterior detección de la proteína pIII en muestras de pacientes. Además en la figura se muestra que los anticuerpos producidos son específicos ya que no reconocen células de pacientes infectados con otros virus (hVRS).

*: Tratamiento de muestras clínicas. Las muestras que se utilizaron para los ensayos fueron obtenidas a partir de hisopados nasofarígeos contenidos en medio de transporte universal, desde el Centro de Investigaciones Médicas de la Pontificia Universidad Católica de Chile. Se centrifugaron las muestras a 2.000 rpm durante 10 minutos a 4°C. Posteriormente se separó el sobrenadante (SN1) del pellet; este último fue incubado con 100 |iL de Buffer RIPA (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% Deoxicolato de Sodio, 0,1%, SDS e un coctel de inhibidores de proteasas) durante 15 minutos a 4°C, agitando por vortex cada 5 minutos. A continuación se centrifugó a 2.000 rpm durante 10 minutos a 4°C. Al finalizar se tomó el sobrenadante obtenido (SN2) y se mezcló con el SN1.

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Método de diagnóstico de infección causada por ADV in vitro y/o ex vivo en una muestra biológica que comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo monoclonal frente a ADV o fragmento del mismo y detectar la unión del anticuerpo al antígeno, donde el anticuerpo monoclonal frente a ADV o fragmento del mismo se une a la proteína de base de pentona de Adenovirus (ADV) y comprende una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia SEQ ID NO:1 y una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia SEQ ID NO:2.

2. Método de diagnóstico in vitro y/o ex vivo de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal frente a ADV o fragmento del mismo además se encuentra unido a un marcador seleccionado del grupo compuesto por fluoróforos, biotina, radioisótopos, metales, proteínas y enzimas, o cualquier otro compuesto químico.

3. Método de diagnóstico in vitro y/o ex vivo de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde la muestra biológica se selecciona del grupo compuesto por secreciones nasales, lavados nasales, líquido cefalorraquídeo, secreciones faríngeas y/o lavados o secreciones bronquiales.

4. Método de diagnóstico in vitro y/o ex vivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la técnica utilizada para la detección del anticuerpo con el antígeno se selecciona de ELISA, inmunofluorescencia, inmunohistoquimica, inmunocromatografía, citometría de flujo, cell sorter, inmunoprecipitación y/o Western blot.

5. Método de diagnóstico in vitro y/o ex vivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el anticuerpo o fragmento del mismo, de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, se encuentra conjugado con un marcador que permite su detección.

6. Método de diagnóstico in vitro y/o ex vivo de acuerdo con la reivindicación 5, donde el anticuerpo se encuentra unido a un marcador seleccionado del grupo compuesto por biotina, metales, enzimas, proteínas, fluoróforos e isótopos radiactivos o cualquier otro compuesto químico.

7. Método de diagnóstico in vitro y/o ex vivo de acuerdo con la reivindicación 5, donde el anticuerpo se encuentra unido a un soporte sólido.

8. Método de diagnóstico in vitro y/o ex vivo de acuerdo con la reivindicación 5, donde el soporte sólido es nitrocelulosa, membrana de nylon, esferas magnéticas, esferas fluorescentes u otro soporte.