CN108697796B

CN108697796B - 对于ADV感染的检测和诊断有用的由细胞杂交瘤产生和分泌的对人腺病毒（ADV）的pIII抗原具有特异性的单克隆抗体

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Publication number: CN108697796B
Application number: CN201780007470.2A
Authority: CN
Inventors: S·M·布埃纳拉米耶; A·M·卡莱伊斯帕拉; J·E·莫拉阿拉尔孔
Original assignee: Pontificia Universidad Catolica de Chile
Current assignee: Pontificia Universidad Catolica de Chile
Priority date: 2016-01-21
Filing date: 2017-01-20
Publication date: 2023-01-10
Anticipated expiration: 2037-01-20
Also published as: ZA201804705B; BR112018014538A2; CN108697796A; US10766948B2; WO2017125892A3; US20190048065A1; ES2898068T3; MX2018008809A; EP3406262A4; EP3756685A1; EP3406262B1; EP3406262A2; AR107440A1; WO2017125892A2; CA3011569A1; PE20181498A1; UY37082A; PT3406262T; CL2016000164A1

Abstract

本发明涉及对于开发人中ADV感染的诊断方法有用的识别腺病毒(ADV)的pIII蛋白的单克隆抗体或其片段。特别是涉及单克隆抗体或其片段，其包含：重链可变区，其具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5具有至少90％、95％或99％同一性的序列，和轻链可变区，其具有与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6具有至少90％、95％或99％同一性的序列。也涉及定义所述抗体的核苷酸序列，使用所述单克隆抗体的生物学样品中ADV感染的体外和/或离体诊断方法，及用于检测ADV的诊断试剂盒，其包含至少一种如上所述的针对ADV的单克隆抗体。

Description

对于ADV感染的检测和诊断有用的由细胞杂交瘤产生和分泌的对人腺病毒（ADV）的pIII抗原具有特异性的单克隆抗体

【发明领域】

本发明涉及对于开发人ADV-感染诊断方法有用的识别腺病毒 (ADV)的pIII蛋白的单克隆抗体或其片段。

【发明背景】

被命名为人腺病毒(ADV)的病毒负责在人群中产生多样的临床图像，包括结膜炎，胃肠炎至全部类型的呼吸道疾病(诸如弱咽炎至下呼吸道急性呼吸道疾病，诸如肺炎)。研究显示，此病毒在世界上产生婴儿，军事募集和免疫缓和的人的高百分率的病态甚至死亡。已知ADV是在之前感染的个体中残留潜伏的持续性病毒，并可被多样的因素再活化，给代造成更严重的疾病。其基因组含有双链DNA，其不具有核包膜，并编码9种蛋白。覆盖其的壳体具有二十面体形状，且其由3种主要蛋白组成：六位体，五位体(高度保守)和纤维。研究报道，五位体蛋白和纤维负责攻击和进入宿主细胞，促进与细胞表面的受体相互作用的病毒最终内化。人中有超过50种ADV血清型，其被分为6组，再被亚分为A～F。在细分化内，株B，C和E-中的一些在呼吸道疾病中具有更大临床关联，其中所述疾病严重度会依赖于年龄(儿童＜4岁和成年)和感染的患者的免疫学状态。

现今，由公共健康服务实施的ADV诊断和检测方法包括在拭子或鼻咽抽吸样品、来自血样品的聚合酶链反应(PCR)和细胞培养物中基于由直接免疫荧光的病毒抗原检测的测试。在提及的技术中，基于免疫荧光的病毒板(viral panel)允许检测更大量的呼吸道病毒，在利用Luminex xTAG的呼吸道病毒板(viral panel)(RVP)PCR 的情况中是12种类型，而对于eSensor呼吸道病毒板(viral panel) 是14种类型。尽管此宽范围的检测，重要的是注意它们使用的成本和应答时间因素(在第一种情况中成本大致是USD 60～80(CLP42.000～56.000)，而应答时间在12～18小时之间)。

基于以上背景，产生和算上对于ADV检测有效和低成本(可与可利用的诊断方法的特征竞争)的离体或快速体外诊断测试是根本性的。面对该问题，本发明的单克隆抗体似乎是解决所述需求所需要的替代性方法，由于它们允许被ADV感染的患者样品中病毒抗原的特异性识别。目前，有用于研究(Thermo Scientific Cat.#MS-587)和诊断目的(

ab6982)的抗体，但是，特异性识别此病毒的pIII 蛋白的单克隆抗体尚未见报道。

单克隆抗体是特征在于特异性识别单抗原的一类均质抗体。它们由单杂交细胞(杂交瘤，其为B淋巴细胞克隆和肿瘤浆细胞的融合产物)产生。特异性和高亲和性结合抗原的性质驱动了将单克隆抗体开发为对于检测产生大的科学性、临床性价值和工业应用的分子有大的实用性的工具。现今，单克隆抗体被广泛用于基础和应用研究，由于它们的特异性和重复性(允许以更佳方式支持研究)。但是，在生物医学领域，单克隆抗体已经对于诊断和治疗多种感染性疾病有巨大的实践应用，及作为对于其他病理学的治疗。尽管单克隆抗体用于全部类型的检测和诊断技术，在设计体外诊断用试剂盒中获得了最佳结果。关于此，目前有多样的快速检测试剂盒，诸如基于使用抗hCG抗体确定尿中的绒毛膜促性腺激素(hCG)水平的怀孕测试。而且，治疗性用途的单克隆抗体获得了大的关联。目前有使用是诸如如下商购的单克隆抗体的不同病理学的治疗性治疗：阿仑珠单抗，吉妥珠单抗，奥加米星，利妥昔单抗，曲妥珠单抗等。

目前有针对腺病毒的不同蛋白的单克隆抗体；但是，在几个出版的文献中高度关注了针对六位体蛋白和壳体纤维的抗体的产生。如上一个明显的例是在专利US4487829中观察到，产生了被称为抗2-Hx-2 的能检测人腺病毒的C亚组(1,2,5)中的六位体抗原的抗体。另一方面，本申请显示存在识别腺病毒(ADV)的pIII蛋白的新单克隆抗体或其片段。

此外，文献US2011/0262892A1描述检测或病毒测量方法，其中检测的病毒之一是腺病毒，但是，此文献未描述本申请中的特异性识别腺病毒pIII蛋白的单克隆抗体或其片段。

考虑到抗六位体单克隆抗体的高产力和市场竞争力，需要搜索和开发针对病毒粒子结构中的保守的和丰富的蛋白的新单克隆抗体。即本发明的针对pIII蛋白(基本五位体，ADV亚组中高度保守的蛋白) 的单克隆抗体。这些是针对此蛋白产生的第一种单克隆抗体，其展示能以高灵敏度从临床样品检测病毒粒子。

由此，本发明包含产品，诸如单克隆抗体，和使用它们在被ADV 感染的患者临床样品中以100％的特异性且能由ELISA(特定抗原的 1,5ng浓度当量)检测进行检测和快速、有效和精确的诊断的替代性方法。此允许临床专家早期测定对于遭受此病毒导致的呼吸道感染的个体适当的临床流程。

【发明概述】

本发明涉及2种针对腺病毒(ADV)的单克隆抗体。具体而言，本发明涉及由被命名为7E11和6F11的杂交瘤细胞系分泌且针对pIII ADV抗原反应的2种鼠单克隆抗体。这些抗体对于抗原的结合位点不彼此竞争，也不阻碍同时与其结合。所述单克隆抗体可用于检测检定，诊断和/或确定被ADV感染。这些抗体可同时用于增加在存在不足的量和利用度的抗原的临床样品中的检测灵敏度。例如，如图6所示，来自7E11的抗体能有效捕获临床样品中ADV的pIII蛋白。这些捕获的和固定的蛋白随后由6F11杂交瘤产生的缀合有充当发色底物的酶的抗体进行检测。此质量允许抗体与用于检测样品中以痕量发现的相同的抗原的不同标记的组合。

本发明提供开发离体或体外诊断和检测pIII病毒ADV抗原的机会，其中在检定诸如ELISA，荧光显微镜检和免疫印迹中使用由7E11 和6F11杂交瘤产生和分泌的单克隆抗体。待分析的样品可为：被ADV 感染的体外细胞，鼻分泌物，鼻洗出液，咽分泌物和/或支气管洗出液或分泌物，血清，脑脊液等。本发明提供使用之前提及的杂交瘤细胞系产生和/或分泌的单克隆抗体检测生物学样品和细胞培养物中的 ADV的能力，所述单克隆抗体偶联于任何类型的固体支持体(诸如硝酸纤维素，尼龙膜，磁球，荧光球或其他支持体)或偶联于任何其他分子(诸如酶、蛋白、荧光团、放射性同位素或任何其他化合物)。本发明可用于ADV检测试剂盒，其包含所提及的杂交瘤产生的抗体。本发明还在其范围内包含偶联有涉及化学结合的任何类型的分子或底物，诸如标记，荧光团，生物素，放射性同位素，金属，酶和/或任何化学元素的由7E11和6F11杂交瘤分泌的单克隆抗体，其中所述化学结合的分子或底物允许抗体的可视化或检测。由此，本发明还提供偶联有不同于抗体的分子、底物或标记(作为在生物学样品中检测、分析和/或诊断方法的部分)的特异性识别pIII蛋白的抗体。

【附图说明】

【图1】在间接ELISA检定中由7E11和6F11杂交瘤产生的单克隆抗体检测ADV pIII蛋白。将平板用50ng的纯化的ADV的pIII重组蛋白或用1×10⁶pfu的ADV活化。作为阴性对照，将含1×10⁶pfu的人呼吸道合胞体病毒(HRSV)或含50ng的牛类血清白蛋白(BSA) 蛋白的其他孔活化。还包括另一对照孔：无抗原(有第一抗体和HRP- 缀合的小鼠抗-IgG抗体，在实验中命名为“非-活化的”)的孔和无抗原也无第一抗体而仅有小鼠抗-IgG抗体(HRP)的孔。随后，将所述孔与170ng量的来自7E11杂交瘤的抗-pIII抗体(A)和170ng量的来自6F11杂交瘤的抗-pIII抗体(B)温育。图中显示的数据表示通过由与由7E11和6F11杂交瘤分泌的抗体特异性结合的小鼠抗-IgG第二抗体中存在的辣根过氧化物酶(HRP)酶催化而将四甲基联苯胺底物转变为着色的化合物来检测的在450nm处发出的吸光度。值对应于至少2次独立实验中由各样品发出的吸光度的平均+/-标准偏差。** P＜0.01***P＜0.0001(使用单因素ANOVA检验(相比阴性对照)，并由Dunnett氏多重比较探明)；ns，相比阴性对照无显著差异。

【图2】确定在ADV的pIII蛋白的检测中由7E11和6F11杂交瘤产生的单克隆抗体的灵敏度。将ELISA平板用始于50ng的pIII 蛋白并结束于0.04ng的1:2系列稀释(A)和始于1:2至1:5120稀释的接种物1×10⁵pfu的ADV的系列稀释(B)活化。包括未活化的孔作为阴性对照。图中显示的数据表示通过由存在于170ng量的来自 7E11和6F11的抗-pIII抗体(A和B)的辣根过氧化物酶(HRP)酶催化而将四甲基联苯胺底物转变为着色的化合物来在450nm处发出的吸光度。值对应于在至少2次独立实验中由各样品发出的吸光度的平均。

【图3】用于检测ADV的纯化的抗原的由7E11和6F11杂交瘤产生的ADV的抗-pIII单克隆抗体的系列稀释检定法。将ELISA平板用50ng的ADV的pIII重组蛋白活化，并用始于3.4μg/ml的浓度(170 ng)的7E11或6F11抗-pIII抗体的1:2系列稀释检测抗原。数据表示为在至少2次独立实验中各样品(一式两份)的在450nm处发出的吸光度的值的平均。

【图4】使用点印迹确认由7E11和6F11杂交瘤分泌的单克隆抗体的特异性。将由7E11和6F11杂交瘤产生的ADV的抗-pIII抗体与含有如下固定的样品(以染色形式或“点”)的硝酸纤维素膜温育1小时：HRSV(1×10⁶pfu)，ADV(1×10⁶pfu)，BSA(1μg)，ADV 的pIII蛋白(1μg，500ng和50ng)，和20μg非ADV-感染的和被 ADV感染的A549细胞的提取物。在温育后，将膜洗涤，并用缀合有 HRP蛋白的小鼠抗-IgG第二抗体温育1小时。在温育后，与抗原结合的单克隆抗体的可视化通过捕获由商购的底物“增强的化学发光蛋白印迹检测系统”(ECL，Amersham，Uppsala，瑞典)的催化产生的化学发光来实施。观察到，由7E11和6F11杂交瘤产生的抗体仅结合于发现存在ADV的pIII蛋白，ADV病毒和被ADV感染的细胞的“点”，确认这些抗体的特异性。

【图5】由免疫荧光检测被ADV感染的A549细胞中的ADV的 pIII蛋白。使A549细胞体外生长而直到达到70～90％汇合，以用ADV 感染48小时。随后，将这些细胞用多聚甲醛固定，并制备用于间接免疫荧光。关于此，使用来源于7E11杂交瘤或6F11杂交瘤的单克隆第一抗体及商购的抗-ADV(Abcam)抗体。作为第二抗体，使用缀合有 Alexa Fluor 488荧光团(在519nm处发荧光(强信号))的商购的小鼠抗-IgG抗体或缀合有相同的荧光团的兔抗-IgG。将细胞核用 TOPRO-3碘化物荧光团(在661nm处发荧光)染色(实心圆形)。当使用任何2种第一抗体时，仅在感染的细胞的细胞质中观察到强反应性(白色箭标)。

【图6】由夹层ELISA，使用由7E11和6F11杂交瘤分泌的单克隆抗体的组合检测临床样品中的ADV。将ELISA平板用170ng的由 7E11杂交瘤分泌的抗体作为捕获抗体而活化。将用捕获抗体活化的孔与50μL的呈现病毒呼吸道病情的患者鼻咽拭子(HNF)样品温育。作为阴性对照，分析10个对照患者样品(对于呼吸道病毒是阴性)。使用20个ADV阳性患者样品作为特异性对照，包括20个RSV阳性患者样品。作为阳性对照，包括添加了纯化的ADV的pIII蛋白的孔。为了检测由7E11抗体捕获的蛋白，以1:2000稀释(每孔75ng)使用缀合有HRP酶的由6F11杂交瘤产生的抗体。显示的数据是各样品在 450nm处发出的吸光度值的平均+/-标准偏差(***P＜0.001，使用单因素ANOVA检验(与HRSV阳性患者或健康患者比较))。

【发明详述】

本发明涉及2种特异性识别腺病毒(ADV)的pIII蛋白的IgG1 同种型的单克隆抗体或其片段(还在本文中命名为抗-pIII抗体)。这些抗体是由7E11和6F11杂交瘤产生的。由7E11杂交瘤产生的抗体链的可变区的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:1(重链可变区)和SEQID NO:2(轻链可变区)。编码它们的核苷酸序列分别显示于SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。以相同的方式，将由6F11杂交瘤产生的抗体的重链和轻链可变区的氨基酸序列显示于SEQ IDNO:5(重链可变区)和SEQ ID NO:6(轻链可变区)。编码它们的核苷酸序列分别显示于SEQID NO:7和SEQ ID NO:8。

从这些可变序列构建包含它们的嵌合抗体，包括这些可变区中的仅一个或以全部可能的组合将它们混合。全部这些实施方式包括在本发明的范围内。即，本发明包括抗体，其包含下列序列中的至少一个： SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，及与任何所述氨基酸序列比较而具有达90％、95％或99％同源性或同一性的类似序列。本发明也包括核苷酸序列，其包含下列序列中的至少一个：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:7和SEQ ID NO: 8；以及它们的反向互补体和与任何所述核苷酸序列比较而具有达80％、85％、90％、95％和99％的同源性或同一性的类似序列。核苷酸序列中认为的最高程度的同源性基于遗传密码简并性。由此，本发明也包括编码特异性识别(如果ADV)的pIII蛋白的单克隆抗体或其片段的一组核苷酸序列。

在本发明的特定实施方式中，所述抗体或其片段缀合有允许它们的检测的标记，诸如，生物素、金属、酶、蛋白、荧光团、放射性同位素或任何其他化合物。

如在图1和4中所示，这些抗体不与存在于相关的病毒的其他蛋白或分子或含有与呼吸道感染关联的其他病毒的患者样品反应。当在诊断方法中使用它们时，此显著地降低假阴性的可能性。

本发明也提供生物学样品中的pIII病毒ADV抗原的离体或体外诊断方法和检测，其中将由7E11和6F11杂交瘤产生和分泌的单克隆抗体用于检测与所述抗原结合的抗体的检定。

本发明的方法包括使选自下列的生物学样品与由7E11和6F11分泌的针对ADV的单克隆抗体或其片段接触：被ADV感染的体外细胞、鼻分泌物、鼻洗出液、脑脊液、咽分泌物和/或支气管洗出液或分泌物等，然后用选自下列的检定法检测所述抗体与所述抗原的结合：ELISA，免疫印迹，免疫荧光，免疫组织化学，免疫组织化学，流式细胞术，细胞分选器，免疫沉淀和/或蛋白印迹。

本发明的方法还包含由以上提及的杂交瘤细胞系产生和/或分泌的抗体或其片段，所述抗体或其片段偶联于任何类型的固体支持体，诸如硝酸纤维素，尼龙膜，磁球，荧光球或其他支持体。在本发明的另一特定实施方式中，所述方法中使用的抗体或其片段缀合有允许它们的检测的标记，诸如生物素、金属、酶、蛋白、荧光团、放射性同位素或任何其他化合物。

本发明也涉及ADV检测试剂盒，其包含由提及的杂交瘤产生的至少一种抗体。在本发明的特定实施方式中，在所述试剂盒中使用由上述杂交瘤细胞系产生和/或分泌的抗体或其片段，所述抗体或其片段偶联于任何类型的固体支持体，诸如硝酸纤维素，尼龙膜，磁球，荧光球或另外的支持体。而且，在本发明的特定实施方式中，试剂盒中使用的抗体或其片段缀合有允许它们的检测的标记，诸如生物素、金属、酶、蛋白、荧光团、放射性同位素或任何其他化合物。

在本发明的另一特定实施方式中，诊断试剂盒对应于免疫层析检定，Luminex，流式细胞术，免疫荧光，放射免疫测定，蛋白印迹，点印记，ELISA，免疫扩散或免疫沉淀。

由此，本发明也提供特异性识别pIII蛋白的抗体，其偶联有不同于所述抗体的分子或底物或标记作为在生物学样品中检测方法，分析和/或诊断的部分。

【实施例】

以下描述允许展示本发明的单克隆抗体的不同应用的实施例。

【实施例1：编码由7E11杂交瘤分泌的ADV抗-pIII抗体和6F11 杂交瘤分泌的ADV抗-pIII抗体的可变区的轻链(VL)和重链(VH) 的核苷酸序列的确定】

针对7E11和6F11杂交瘤独立地使用如下流程。使杂交瘤在37℃、 10％CO₂中、在补充了3.7g/L碳酸氢钠和10％胎牛血清的DMEM- 高葡萄糖培养基中生长，直到达到700,000细胞/ml的细胞密度。获得 3.5×10⁶细胞的总RNA，用Trizol化合物(Invitrogen)实施处理。使用0.5μg的RNA通过用Impron II试剂盒(Promega)的反转录的反应来产生cDNA。通过PCR扩增编码免疫球蛋白的κ和λ链的基因的可变区。为此，使用Ig试剂盒第一套Novagen(catalog n°69831-3) 的通用引物，且遵循生产商的使用说明。用MuIgκVL5'-B引物： 5’GGGAATTCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT 3'(SEQ ID NO:9)和MuIgκVL5'-C： 5’ACTAGTCGACATGGAGWCAGACACACTSCTGYTATGGGT3’ (SEQ ID NO:10)扩增轻链的可变区，及用MuIgVH5'-A引物： 5’GGGAATTCATGRASTTSKGGYTMARCTKGRTTT3’(SEQ ID NO:11)和MuIgVH5'-F： 5’ACTAGTCGACATGAACTTYGGGYTSAGMTTGRTTT3’(SEQ ID NO:12)扩增重链的可变区。根据生产商使用说明在pTOPO-TA 克隆载体(Invitrogen)中克隆PCR产物，及由智利PontificiaUniversidad Católica的测序服务在AbI prism 3130x1测序仪(Applied Biosystem)中进行测序。使用Vector NTI生物信息学软件(Invitrogen) 获得推导的氨基酸序列(对应于7E11杂交瘤的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2及对应于6F11杂交瘤的SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6)。

【实施例2.ADV抗原检测检定，由间接ELISA检定来确定ADV 的抗-pIII单克隆抗体对ADV的纯化的抗原的特异性】。

此检定的目的是展示由7E11和6F11杂交瘤产生的抗体对ADV 的pIII蛋白的特异性。由间接ELISA技术进行抗原的检测，其中将所述ELISA平板于37℃用50ng的纯化的抗原活化1小时。以相同的方式，将平板用ADV的1×10⁶噬斑形成单元(PFU)活化。作为阴性对照，在对ADV进行温育的相同的条件下包括人呼吸道合胞体病毒 (HRSV)，且在独立的孔中包括50ng的BSA蛋白。随后，将平板用磷酸盐缓冲液(PBS)/吐温0.05％洗涤两次。然后，将平板于37℃用PBS/FBS 10％封闭2小时。随后，重复洗涤，然后对各抗体(7E11 和6F11)进行温育至终浓度3.4μg/ml，在PBS/FBS 10％中于室温稀释1小时(在独立平板中的各抗体)。由于在市场中尚未发现针对pIII 蛋白的单克隆或多克隆抗体，未使用商购的抗体对照。在温育时间后，重复洗涤，及向各孔中添加小鼠抗-IgG第二抗体，用在PBS/FBS 10％中以1/2,000稀释(每孔25ng)的辣根过氧化物酶酶(辣根过氧化物酶，HRP)于室温标记1小时。最后，实施洗涤，并将其用50μL的柠檬酸缓冲剂/四甲基联苯胺(TMB，3-3'-5-5’四甲基联苯胺，1mg/ml，Becton Dickinson)展示。为了结束反应，添加50μL的2N的H₂SO₄，并在ELISA lector中读取在450nm处的结果。为了确定第二抗体的反应在识别第一抗体中有特异性，且所获得的信号非由第二抗体与病毒抗体的非特异性结合导致，实施仅使用第二抗体而不使用第一抗体、也不使用样品的对照(灭活的孔)。用于确定第一抗体的反应对于抗原是特异性的另一对照，组成为使用尚未用抗原(不用抗原)活化的 ELISA平板上的抗体或使用之前用50ng的BSA蛋白或不同病毒 (HRSV)活化的ELISA平板上的抗体。结果显示，本发明的单克隆抗体能以特异性方式识别50ng的纯化的抗原，由于它们不识别BSA 蛋白，也不识别另一相关的病毒的蛋白(图1A和1B)。

【实施例3.用于确定用于检测病毒抗原的单克隆抗体的灵敏度的检定】

实施检定而确定来自7E11和6F11杂交瘤的ADV的抗-pIII单克隆抗体能由间接ELISA检测的蛋白和病毒的最大稀释。为此，使用实施例2中描述的相同的技术。将平板用11个ADV的pIII蛋白的1:2 系列稀释(起始于50ng的纯化的抗原)活化。关于病毒，将平板用自1×10⁵pfu的病毒的1:2的系列稀释活化。以在PBS/FBS 10％中稀释的3.4μg/ml(170ng/孔)的浓度使用7E11或6F11抗-pIII抗体。随后，添加以1:2,000的稀释的小鼠抗-IgG检测抗体(25ng/孔)。结果显示，7E11抗-pIII抗体能识别达1.56ng的ADV的pIII蛋白。来自6F11杂交瘤的抗-pIII抗体能检测达3.12ng的pIII ADV蛋白(图 2A)。

关于以检测高稀释的ADV的能力表示的抗体灵敏度，可观察到来自7E11杂交瘤的抗-pIII抗体可以来自6F11杂交瘤的抗体的相同的方式检测所述病毒的全部实施的稀释，其相当于大致390个病毒粒子。已知以往不存在任何检测pIII蛋白的商购的抗体，而直到现在才知道2种单克隆抗体会在病毒的检测中有效和敏感(图2B)。

在全部检定中包括允许去除抗体的非特异性反应的对照，其除了样品(pIII蛋白或ADV病毒)之外，含有检定的全部组分。

【实施例4.确定单克隆抗体检测病毒抗原的效率的检定】

实施确定来自7E11和6F11杂交瘤的ADV的抗-pIII单克隆抗体的允许病毒抗原的检测的最大稀释的检定。为此，使用与实施例2的间接ELISA技术相同的技术。将平板用50ng的纯化的抗原活化，及实施起始于3.4μg/ml的浓度的11个1:2的稀释(使用PBS/FBS 10％的溶液作为稀释液)而使用7E11或6F11抗-pIII抗体。在图3中观察到，对于检定中使用的全部稀释而言，7E11和6F11抗-pIII抗体能检测ADV的pIII蛋白。

包括在此检定中的阴性对照对应于不含有样品(pIII蛋白)的孔，将其用PBS/FBS10％、第一抗体(抗-pIII 7E11或抗-pIII 6F11)封闭，且其仅含有缀合有HRP的小鼠抗-IgG抗体。

【实施例5.使用ADV的抗-pIII单克隆抗体，由夹层ELISA技术进行被ADV感染的患者样品的临床诊断】

由于从鼻咽拭子获得的临床样品中病毒蛋白的利用度和浓度低，必需使用夹层ELISA方法，将来自7E11杂交瘤的抗-pIII抗体用作捕获抗体，且将缀合有HRP的6F11抗-pIII克隆用作检测抗体来修饰检测方法。为检定，将ELISA平板的孔用在PBS中稀释的3.4μg/ml(170 ng/孔)的来自7E11杂交瘤的抗-pIII抗体于37℃活化1小时。用含 0.05％吐温20的PBS洗涤2次，随后将平板用200μL的PBS/10％FBS 于37℃封闭2小时。将其再次洗涤，并将其于4℃温育过夜，各孔含 50μL的ADV患者阳性的鼻咽抽吸物，根据诊断方法—“DHI(Diagnostics Hibryds)USA的D³超DFA呼吸道病毒筛选和ID试剂盒”(通常被称为“病毒板(viral panel)”)，并如后所述处理*。包括如下对照：(1)特异性对照(50μL的由病毒板(viral panel)被诊断有HRSV的患者样品)，(2)阳性对照(50ng的ADV的pIII 重组蛋白)及(3)对应于健康患者样品的阴性对照(由病毒板(viral panel)检测病毒为阴性)。次日进行洗涤，并将各孔用50μL的缀合有HRP的来自6F11杂交瘤的抗-pIII抗体于室温温育1小时。将平板再洗涤2次，并将其用50μL的TMB溶液展示，将其避光温育10～ 15分钟。将反应用50μL的2N的H2SO4停止。在被认证可用于临床诊断的Epoch ELISA平板读数仪中实施平板读取。此检定获得的结果显示于图6，在其中可观察到，使用来自7E11杂交瘤的抗体作为捕获抗体且使用来自6F11-HRP杂交瘤的抗体作为检测抗体的夹层ELISA 技术允许检测被ADV感染的患者样品中的抗原，这之前在被认证的临床实验室使用病毒板(viral panel)由直接免疫荧光确认。检定中包括的患者数是20人，其中的17人由ELISA检测为阳性(0.1以上的光密度(OD))。此检定也展示来自7E11和6F11杂交瘤的抗体的多功能性，由于它们均能无彼此竞争也不彼此干扰地同时结合于抗原，允许患者样品中pIII蛋白的捕获和随后检测。图还显示，产生的抗体是特异性的，由于它们不识别被其他病毒(HRSV)感染的患者细胞。

*：临床样品的处理。用于检定的样品从智利Pontificia Universidad Católicade的医疗研究中心从通用荷载培养基中含有的鼻咽拭子获得。将样品于4℃以2,000rpm离心10分钟。随后，将上清(SN1)与沉淀分离；将后者与100μL的缓冲剂RIPA(50mMTris-HClpH 8.0，150mM NaCl，1％NP-40，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％， SDS和蛋白酶抑制物混剂)于4℃温育15分钟，每5分钟涡旋搅拌。随后，将其于4℃以2,000rpm离心10分钟。当结束时，取获得的上清(SN2)，并将其与SN1混合。

【实施例6.由免疫荧光，使用ADV抗-PIII单克隆抗体检测A549 细胞被ADV感染】

使用描述的发明实施此检定来扩增允许检测被ADV感染的技术系列。检定由荧光显微镜检进行，其中将被ADV感染的或非-感染的 A549细胞与来源于杂交瘤7E11或6F11的ADV的抗-pIII单克隆抗体及商购的抗-ADV多克隆抗体(Abcam，#ab1039)温育。使用的流程如下：将细胞用在PBS中稀释的4％多聚甲醛于25℃固定10分钟。然后，将细胞用PBS洗涤，并将它们用在PBS/FBS 10％中稀释的0.2％皂苷于25℃渗透化30分钟。于25℃添加在PBS/FBS10％中稀释的 3.4μg/ml的浓度的来源于7E11或6F11杂交瘤的单克隆抗体和商购的抗-ADV抗体1小时。随后用PBS洗涤2次，并为检测抗-ADV多克隆抗体，于25℃避光添加在PBS/FBS10％中1/200稀释的缀合有Alexa 氟488(Life Technologies)荧光团的小鼠抗-IgG第二抗体和缀合有 Alexa氟488(ThermoFisher)荧光团的兔抗-IgG第二抗体1小时。重复洗涤，并将核用1:5,000稀释的TOPRO-3碘化物642/661 (Invitrogen，#T3605)于25℃避光染色15分钟。最后，将其用PBS 洗涤，并设置盖玻片组件，以随后在落射荧光显微镜检中观察。获得的结果显示，本发明的抗体成分也对于由免疫荧光特异性识别感染的细胞(不以非特异性方式结合于非-感染的细胞)有用(图5)。

【实施例7.使用点印迹检定的ADV抗-pIII单克隆抗体对于ADV 的纯化的抗原的特异性的检定】

此检定的目的是使用免疫印迹方法确认由7E11和6F11杂交瘤产生的抗体对于ADV的pIII蛋白的特异性。抗原的检测由点印迹技术进行，其中将硝酸纤维素膜用作用于固定悬浮的滴中存在的抗原的固体支持体。为此，向硝酸纤维素膜沉积2μL各含有下列成分的液： 1×10⁶pfu的HRSV，1×10⁶pfu的ADV，纯化的ADV的pIII蛋白(1μg， 500ng和50ng)，20μg的被ADV感染的A549细胞提取物和20μg 的非-感染的A549细胞提取物。作为阴性对照，应用2μL中含有的1μg 的BSA。使应用到膜上的溶液风干15分钟。最后，将膜用含有0.05％吐温-20的PBS中的5％BSA于25℃封闭1小时。然后，用PBS-吐温 -20 0.05％于25℃洗涤3次来去除过量的非-粘附于抗原的抗体。由缀合有HRP(Invitrogen，Life Technologies#62-6520)的小鼠抗-IgG 抗体(在封闭溶液中于25℃稀释1小时，以通过用PBS-吐温-20 0.05％于25℃洗涤3次来去除过量的未结合的抗体)实施结合于抗原的抗体的检测。单克隆抗体与抗原的结合的可视化通过捕获通过由结合于小鼠抗-IgG抗体的HRP酶介导的商购的底物“增强的化学发光蛋白印迹检测系统”(ECL，Amersham，Uppsala，瑞典)的催化产生的化学发光来实施。化学发光的捕获用光记录系统MyECL(Thermo Fisher) 实施。如在图4中观察到的一样，来自7E11和6F11杂交瘤的抗体仅结合于含有ADV，pIII蛋白或被ADV感染的细胞的“点”，而不以非特异性方式结合于含有非-相关的蛋白，其他病毒或非-感染的细胞的“点”。

此说明书中描述的实施例展示由7E11和6F11杂交瘤细胞系分泌的这些ADV抗-pIII单克隆抗体具有的特异性，效率，灵敏度和多功能性。本文提供的实施例构成ADV抗-pIII单克隆抗体的应用的一些展示，但它们不以任何方式限制本发明的范围。

序列表

<110> PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATOLICA DE CHILE

<120> 对于ADV感染的检测和诊断有用的由细胞杂交瘤产生和分泌的对人腺病毒（ADV）的pIII抗原具有特异性的单克隆抗体

<130> W 2017/9447

<150> CL 201600164

<151> 2016-01-21

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 203

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的 - 杂交瘤7E11 - 抗pIII VH

<400> 1

Met Glu Cys Ser Trp Val Ile Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly

1 5 10 15

Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Glu Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Gln Ser Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Arg Tyr Asn

65 70 75 80

Gln Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Val Tyr Tyr Cys

100 105 110

Ala Arg Leu Gly Gln Gly Asp Val Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly

115 120 125

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser

130 135 140

Val Tyr Pro Leu Ala Leu Lys Thr Leu Gly Glu Phe Phe Phe Phe Gly

145 150 155 160

Trp Gly Gly Gly Gly Gly Ala Asn Pro Pro Leu Arg Gly Pro Ala Pro

165 170 175

Arg His Arg Arg Thr Ser Thr Arg Pro Leu Val Gln Ser Cys Thr Ile

180 185 190

Ile Asp Phe Arg Cys Gln Ala Ala Glu Leu Met

195 200

<210> 2

<211> 128

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的 - 杂交瘤7E11 - 抗pIII VL

<400> 2

Met Glu Ser Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala

20 25 30

Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser

35 40 45

Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser

65 70 75 80

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

100 105 110

Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Ser Trp Lys

115 120 125

<210> 3

<211> 612

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的 - 杂交瘤7E11 - 抗pIII VH

<400> 3

atggaatgca gctgggtcat cctctttctc ctgtcaggaa ctgcaggtgt cctctctgag 60

gtccagctgc aacagtctgg acctgagctg gtgaagcctg gggcttcagt gaagatatcc 120

tgcaagactt ctggatacac attcactgaa tacaccatgc actgggtgaa gcagagccat 180

ggacagagcc ttgagtggat tggaggtatt aatcctaaca atggtggtac taggtacaac 240

cagaacttca agggcaaggc cacattgact gtagacaagt cctccagcac agcctacatg 300

gagctccgca gcctgacatc tgaagtctat tactgtgcaa gactgggaca aggggacgtg 360

tactggttct tcgatgtctg gggcgcaggg accacggtca ccgtctcctc agccaaaacg 420

acacccccat ccgtttatcc cttggccctg aaaactttgg gggaattttt tttttttggg 480

tggggggggg gggggggggc taaccccccc ctacgtggtc ctgcgcccag acatcgaaga 540

accagtacac gtccccttgt ccagtcttgc acaataatag acttcagatg tcaggctgcg 600

gagctcatgt ag 612

<210> 4

<211> 387

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的 - 杂交瘤7E11 - 抗pIII VL

<400> 4

atggagtcag acacactgct gttatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60

gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 120

atctcataca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttatat gcactggaac 180

caacagaaac caggacagcc acccagactc ctcatctatc ttgtatccaa cctagaatct 240

ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 300

cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acattaggga gcttacacgt 360

tcggaggggg gaccaagctg gaaataa 387

<210> 5

<211> 180

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的 - 杂交瘤6F11 - 抗pIII VH

<400> 5

Met Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys

1 5 10 15

Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Thr Ile His

20 25 30

Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Gly Ile

35 40 45

Tyr Pro Asn Asn Gly Gly Thr Lys Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys

50 55 60

Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu

65 70 75 80

Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu

85 90 95

Gly Gln Gly Asp Val His Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr

100 105 110

Thr Val Ile Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro

115 120 125

Leu Ala Leu Lys Asn Leu Gly Lys Lys Gly Leu Ser Ala Trp Ala Pro

130 135 140

Gly Thr Leu Gly Lys Pro Ile Thr Trp Val Leu Arg Pro Lys His Gln

145 150 155 160

Lys Pro Met His Val Pro Leu Ser His Leu Ala Gln Ile Ile Asp Cys

165 170 175

Lys Ser Ser Met

180

<210> 6

<211> 145

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的 - 杂交瘤6F11 - 抗pIII VL

<400> 6

Met Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln

1 5 10 15

Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly

20 25 30

Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg

35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg

50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro

65 70 75 80

Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg Glu

85 90 95

Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Ser Trp Lys Arg Ala Asp Ala Ala

100 105 110

Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Tyr Ser Lys Ala Trp Glu Lys Gly

115 120 125

Ala Ala Leu Val Leu Arg Asn Arg Arg Lys Thr Lys Arg Pro Pro Pro

130 135 140

Pro

145

<210> 7

<211> 543

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的 - 杂交瘤6F11 - 抗pIII VH

<400> 7

atgcaacagt ctggacctga gctggtgaag cctggggctt cagtgaagat atcctgcaag 60

acttctggat acacattcac tgaatacacc atacactggg tgaagcagag ccatggaaag 120

agccttgagt ggattggagg tatttatcct aacaatggtg gtactaagta caaccagaag 180

ttcaagggca aggccacatt gactgtagac aagtcttcca gcacagccta catggagctc 240

cgcagcctta catctgagga ttctgcagtc tattattgtg caagactggg acaaggggac 300

gtgcattggt tcttcgatgt ctggggcgca gggaccacgg tcatcgtctc ctcagccaaa 360

acgacacccc catccgttta tcccttggcc ctgaaaaacc ttgggaaaaa aggtttatcc 420

gcctgggccc ctggaacctt gggaaaaccc attacgtggg tcctgcgccc caaacatcaa 480

aaaccaatgc acgtcccctt gtcccatctt gcacaaataa tagactgcaa atcctcaatg 540

taa 543

<210> 8

<211> 438

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的 - 杂交瘤6F11 - 抗pIII VL

<400> 8

atggtgctga cacagtctcc tgcttcctta gctgtatctc tggggcagag ggccaccatc 60

tcatacaggg ccagcaaaag tgtcagtaca tctggctata gttatatgca ctggaaccaa 120

cagaaaccag gacagccacc cagactcctc atctatcttg tatccaacct agaatctggg 180

gtccctgcca ggttcagtgg cagtgggtct gggacagact tcaccctcaa catccatcct 240

gtggaggagg aggatgctgc aacctattac tgtcagcaca ttagggagct tacacgttcg 300

gaggggggac caagctggaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 360

tacagtaaag cttgggaaaa gggggcggca ttggttctga ggaaccggcg taaaaccaaa 420

aggccccccc ccccttaa 438

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的 - 引物MulgkVL5'-B的核苷酸序列

<400> 9

gggaattcat ggagacagac acactcctgc tat 33

<210> 10

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的 - 引物 MuIgkVL5'-C的核苷酸序列

<400> 10

actagtcgac atggagwcag acacactsct gytatgggt 39

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的 - 引物MuIgVH5'-A的核苷酸序列

<400> 11

gggaattcat grasttskgg ytmarctkgr ttt 33

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的 - 引物MuIgVH5'-F的核苷酸序列

<400> 12

actagtcgac atgaacttyg ggytsagmtt grttt 35

Claims

1.结合于腺病毒(ADV)的pIII蛋白的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体是：

由杂交瘤7E11产生的单克隆抗体，其具有：

SEQ ID NO:1的重链可变区序列，及

SEQ ID NO:2的轻链可变区序列；和/或

由杂交瘤6F11产生的单克隆抗体，其具有：

SEQ ID NO:5的重链可变区序列，及

SEQ ID NO:6的轻链可变区序列。

2.权利要求1的单克隆抗体，其中所述抗体也结合于选自下列的标记：荧光团、生物素、放射性同位素、金属、蛋白、酶或任何其他化合物。

3.权利要求1或2的结合于腺病毒(ADV)的pIII蛋白的单克隆抗体在制造检测生物学样品中的腺病毒(ADV)的pIII蛋白的诊断试剂盒中的用途。

4.权利要求3的用途，其中所述生物学样品选自：被ADV感染的体外细胞、鼻分泌物、鼻洗出液、脑脊液、咽分泌物和/或支气管洗出液或分泌物。

5.权利要求3或4的用途，其中用于用抗原检测抗体的技术选自：ELISA、免疫荧光、免疫组织化学、免疫层析、流式细胞术、细胞分选器、免疫沉淀和/或蛋白印迹。

6.权利要求5的用途，其中权利要求1或2的结合于腺病毒(ADV)的pIII蛋白的单克隆抗体缀合有允许其检测的标记。

7.权利要求6的用途，其中所述结合于腺病毒(ADV)的pIII蛋白的单克隆抗体结合于选自下列的标记：生物素、金属、酶、蛋白、荧光团、放射性同位素或任何其他化合物。

8.权利要求7的用途，其中所述结合于腺病毒(ADV)的pIII蛋白的单克隆抗体附接于固体支持体。

9.权利要求8的用途，其中所述固体支持体是硝酸纤维素、尼龙膜、磁球、荧光球或其他支持体。

10.诊断试剂盒，其包含至少一种权利要求1或2的结合于腺病毒(ADV)的pIII蛋白的单克隆抗体。

11.权利要求10的诊断试剂盒，其中所述结合于腺病毒(ADV)的pIII蛋白的单克隆抗体附接于固体支持体。

12.权利要求11的诊断试剂盒，其中所述固体支持体是硝酸纤维素、尼龙膜、磁球、荧光球或其他支持体。

13.权利要求10～12之任一项的诊断试剂盒，其对应于用于检测ADV的免疫层析测试、Luminex、流式细胞术、免疫荧光、放射免疫测定、蛋白印迹、点印记、ELISA、免疫扩散或免疫沉淀测试。